ES2334743B1 - CRYOPROTECTING PROTEIN WITH ACTIVITY 1-3 B - LOW TEMPERATURE GLUCANASE, PROCEDURE FOR OBTAINING AND APPLICATIONS. - Google Patents
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Abstract
Proteína crioprotectora con actividad 1-3-\beta-glucanasa a bajas temperaturas, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.Cryoprotective protein with activity 1-3-? -Glucanase at low temperatures, procedure for obtaining it and its Applications.
La presente invención describe una nueva proteína 1-3-\beta-glucanasa biológicamente activa a bajas temperaturas, en un rango de pH ácido-neutro, estable a pH ácidos y altamente crioprotectora. Además, se incluye el método para la producción, el aislamiento y purificación de dicha proteína y su uso en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y en procesos de degradación o modificación de materiales que contienen \beta-glucanos en condiciones que requieran bajas temperaturas. Esta proteína glucanasa puede utilizarse en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación para su almacenamiento y distribución en forma congelada o liofilizada, así como para la degradación o modificación de materiales que contienen glucanos en condiciones que requieran bajas temperaturas o inactivación a moderada-alta temperatura.The present invention describes a new protein 1-3-? -Glucanase biologically active at low temperatures, in a pH range acid-neutral, stable at acidic pH and highly cryoprotectant In addition, the method for production, the isolation and purification of said protein and its use in the cryoprotection of proteins sensitive to freeze-thaw and in processes of degradation or modification of materials containing β-glucans in conditions that require low temperatures This glucanase protein can be used in the cryoprotection of proteins sensitive to freeze-thaw for storage and distribution in frozen or lyophilized form, as well as for degradation or modification of materials containing glucans in conditions that require low temperatures or inactivation at Moderate-high temperature.
Description
Proteína crioprotectora con actividad 1,3-\beta-glucanasa a bajas temperaturas, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.Cryoprotective protein with activity 1,3-? -Glucanase at low temperatures, procedure for obtaining it and its Applications.
La presente invención se encuadra en el sector Biotecnológico, más concretamente en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y su aplicación en la industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica (crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica (proteínas con actividad biológica), así como en biocatálisis, bioremediación, biocontrol, fermentación y conservación de alimentos.The present invention falls within the sector Biotechnology, more specifically in protein cryoprotection sensitive to freeze-thaw and its application in the food industry (structural proteins or soluble), medical (cryopreservation of living cells and tissues) and pharmaceutical (proteins with biological activity), as well as in biocatalysis, bioremediation, biocontrol, fermentation and food preservation
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Las 1,3-\beta-glucanasas incluyen el grupo de proteínas glucano 1,3-\beta-D-glucosidasas también llamadas laminarinasas. Estas proteínas catalizan la ruptura hidrolítica de enlaces 1,3-\beta-D-glucosídicos entre residuos de D-glucosa de los homopolímeros 1,3-\beta-glucanos. Las 1,3-\beta-glucanasas son proteínas abundantes y altamente reguladas presentes en especies de plantas con semillas e implicadas en diferentes procesos metabólicos como estrés, infección y procesos de desarrollo. Existen múltiples isoenzimas estructurales que difieren en su tamaño, punto isoeléctrico, estructura primaria, localización celular y patrón de regulación. Las 1,3-\beta-glucanasas de clase I son básicas y están localizadas en la vacuola. Las clases II y III son ácidas, con ausencia de la extensión C-terminal presente en la clase I y son secretadas al espacio intracelular (Leubner-Metzger G, Meins F. 1999. Functions and regulation of plant \beta-1,3-glucanases (PR-2),In: Pathogenesis-related Proteins in Plants. Datta, S.K., Muthukrishnan, S. (Eds.). Boca-Raton, Florida, CRC Press, pp. 49-76.).The 1,3-? -Glucanases include the glucan protein group 1,3-? -D-glucosidases also called laminarinases. These proteins catalyze the hydrolytic bond breakage 1,3-? -D-glycosides between homopolymer D-glucose residues 1,3-? -Glucans. The 1,3-? -Glucanases are proteins abundant and highly regulated present in plant species with seeds and involved in different metabolic processes such as stress, infection and development processes. There are multiple structural isoenzymes that differ in size, point isoelectric, primary structure, cell location and pattern of regulation. The 1,3-? -Glucanases class I They are basic and are located in the vacuole. Classes II and III they are acidic, with the absence of the C-terminal extension present in class I and are secreted into the intracellular space (Leubner-Metzger G, Meins F. 1999. Functions and regulation of plant β-1,3-glucanases (PR-2), In: Pathogenesis-related Proteins in Plants. Datta, S.K., Muthukrishnan, S. (Eds.). Boca-Raton, Florida, CRC Press, pp. 49-76.).
Las glucanasas con conocida actividad antifúngica son mayoritariamente endo-1,3-glucanasas de clase I capaces de hidrolizar enlaces \beta-1,3-glicosídicos. Estas proteínas muestran, además, un significativo efecto sinérgico junto a endoquitinasas o exoglucanasas sobre la degradación de la pared celular de hongos.Glucanases with known activity antifungal are mostly endo-1,3-glucanases class I able to hydrolyze bonds β-1,3-glycosides. These proteins also show a significant synergistic effect together to endoquitinases or exoglucanases on wall degradation fungal cell.
Los \beta-glucanos son la clase más abundante de polisacáridos, siendo componentes estructurales esenciales de la pared celular de plantas, principalmente en el endospermo de cereales, de la de hongos y bacterias, así como material de reserva citoplásmico, vacuolar y extracelular.The β-glucans are the most abundant class of polysaccharides, being components Essential structural cell wall of plants, mainly in the endosperm of cereals, fungi and bacteria, as well as cytoplasmic, vacuolar and reserve material extracellular
Un hecho importante referente al uso de \beta-glucanasas en productos alimenticios es que la mayor parte del material derivado de plantas contiene diferentes tipos de \beta-glucanos. Éstos pueden ser importantes en el mantenimiento de las propiedades organolépticas tales como textura, viscosidad y apariencia de los alimentos conteniendo paredes celulares vegetales.An important fact regarding the use of β-glucanases in food products is that most of the plant-derived material contains different types of β-glucans. These might be important in maintaining organoleptic properties such as texture, viscosity and appearance of food containing plant cell walls.
Las proteínas 1,3-\beta-glucanasas son aplicadas en procesos de biorremediación para degradar o modificar materiales conteniendo 1,3-\beta-glucanos. Así mismo, las glucanasas junto con proteasas, quitinasas y celulasas son frecuentemente consideradas críticas en el biocontrol de hongos fitopatógenos (Fuglsang CC, Johansen C, Christgau S, Adler-Nissen J. 1995. Antimicrobial enzymes: applications and future potential in the food industry. Trends in Food Science & Technology, December, 6, 390-396). Las glucanasas ocupan una posición única en la agricultura biotecnológica por su acción antifúngica ya que su actividad lítica inhibe el desarrollo de hongos puesto que degrada componentes clave de la pared celular. Por todo lo anterior las glucanasas juegan una función vital en la industria relacionada con la agricultura, en el campo médico y en la composición de los detergentes. Asimismo, son fundamentales en la industria alimentaria para mejorar la textura y digestibilidad de los alimentos frescos y procesados, ejerciendo su efecto sobre hongos y bacterias que contaminan y deterioran alimentos conservados a bajas temperaturas y en la producción de alimentos fermentados, como cerveza y vino, así como en la elaboración de piensos de animales. En la industria de alimentos fermentados el uso de tales proteínas p.e. disminuye la viscosidad causada por los compuestos \beta-glucanos incrementando la obtención de extracto, acelerando la clarificación natural y disminuyendo el número de filtraciones, evitando precipitados gelatinosos en el producto final. Para su aplicación en estos procesos se requieren 1,3-\beta-glucanasas termoestables, pero también es necesario que retengan un alto porcentaje de su actividad en un rango de pH de 4 a 5, y que sean estables durante la incubación a estos pH ácidos característicos de la etapa de trituración. Por tanto se requieren proteínas biológicamente activas adecuadas para su uso en los procedimientos industriales, ampliando así su gama de aplicación.Proteins 1,3-? -Glucanases are applied in bioremediation processes to degrade or modify materials containing 1,3-? -glucans. Likewise, glucanases together with proteases, chitinases and Cellulases are often considered critical in biocontrol of phytopathogenic fungi (Fuglsang CC, Johansen C, Christgau S, Adler-Nissen J. 1995. Antimicrobial enzymes: applications and future potential in the food industry. Trends in Food Science & Technology, December, 6, 390-396). Glucanases occupy a unique position in biotech agriculture for its antifungal action since its lithic activity inhibits the development of fungi since degrades key components of the cell wall. All of the above glucanases play a vital role in the related industry with agriculture, in the medical field and in the composition of detergents They are also fundamental in the industry food to improve the texture and digestibility of fresh and processed foods, exerting their effect on fungi and bacteria that pollute and spoil canned foods at low temperatures and in the production of fermented foods, such as beer and wine, as well as in the elaboration of animal feed. In the fermented food industry the use of such proteins e.g. decreases the viscosity caused by the compounds β-glucans increasing the obtaining of extract, accelerating natural clarification and decreasing the number of leaks, avoiding jelly precipitates in the Final product. For application in these processes are required 1,3-? -Glucanases thermostable, but they also need to retain a high percentage of their activity in a pH range of 4 to 5, and that are stable during the incubation at these acidic pHs characteristic of The crushing stage. Therefore proteins are required Biologically active suitable for use in procedures industrial, thus expanding its range of application.
Por tanto, la actividad y estabilidad de estas enzimas en diferentes condiciones de pH y temperatura son parámetros esenciales que determinan su viabilidad económica en procesos industriales. Así, una alta estabilidad está generalmente considerada como una ventaja económica porque reduce la cantidad de enzima mínima catalíticamente útil (turnover).Therefore, the activity and stability of these enzymes in different conditions of pH and temperature are essential parameters that determine its economic viability in industrial processes. Thus, high stability is generally considered as an economic advantage because it reduces the amount of catalytically useful minimum enzyme (turnover).
Con el fin de aumentar la estabilidad de las enzimas se han empleado múltiples y diferentes estrategias tales como: mutaciones, modificación química del centro activo, introducción de puentes disulfuro, inmovilizaciones, estabilización entrópica, cambio de condiciones del pH y el uso de diferentes sales. Por otro lado, el conocer los datos termodinámicos de las enzimas y su reacción de catálisis es esencial para predecir el ámbito de la reacción y la posición de cualquier proceso en el cual la reacción se produce. Por lo que para conocer la estabilidad un paso previo es determinar su actividad residual y el valor de energía libre de estabilización a una temperatura definida, a fin de asegurar la viabilidad económica y técnica para su uso en procesos industriales.In order to increase the stability of enzymes have used multiple and different strategies such as: mutations, chemical modification of the active center, introduction of disulfide bridges, immobilizations, stabilization entropic, change of pH conditions and the use of different you go out. On the other hand, knowing the thermodynamic data of the enzymes and their catalysis reaction is essential to predict the scope of the reaction and the position of any process in which The reaction occurs. So to know the stability a previous step is to determine its residual activity and the value of stabilization-free energy at a defined temperature, in order to ensure economic and technical feasibility for use in processes Industrial
Recientemente se están estudiando un nuevo grupo de enzimas llamadas "enzimas adaptadas al frío" (cold-adapted enzymes), las cuales muestran una alta eficiencia catalítica a bajas temperaturas, presentan un valor bajo de energía de activación (E_{a}) y se encuentran en general, si no siempre, asociadas a una alta termosensibilidad, lo que permiten el control de la reacción enzimática a través de su inactivación por calor. Esta propiedad ofrece la ventaja adicional de poder ser inactivadas fácilmente durante el proceso, a relativa moderada temperatura, y de esa manera ejercer un control sobre el mismo. Estas enzimas ofrecen un considerable potencial para su aplicación en diferentes procesos industriales relacionados con la formulación de detergentes, en industrias alimentarias, en la síntesis de productos químicos de alta pureza y en biorremediación (Gerday C, Aittaleb M, Bentahir M, Chessa J, Claverie P, Collins T, D'Amico S, Dumont J, Garsoux G, Georlette D, Hoyoux A, Lonhienne T, Meuwis M, Feller G. 2000. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology. Trends in Biotechnology,18, 103-107).Recently a new group of enzymes called "cold-adapted enzymes" are being studied, which show high catalytic efficiency at low temperatures, have a low activation energy value ( E a) and they are in general, if not always, associated with high thermosensitivity, which allow the control of the enzymatic reaction through its inactivation by heat. This property offers the additional advantage of being able to be easily inactivated during the process, at a relatively moderate temperature, and thus exercise control over it. These enzymes offer considerable potential for application in different industrial processes related to detergent formulation, in food industries, in the synthesis of high purity chemicals and in bioremediation (Gerday C, Aittaleb M, Bentahir M, Chessa J, Claverie P, Collins T, D'Amico S, Dumont J, Garsoux G, Georlette D, Hoyoux A, Lonhienne T, Meuwis M, Feller G. 2000. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology Trends in Biotechnology, 18, 103 -107).
A pesar de su potencial aplicación biotecnológica, pocas enzimas activas a baja temperatura están siendo utilizadas comercialmente, entre ellas una lipasa, una lisozima, una celulasa y varias proteasas (Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrews D, Sowers KR. 2002. Low-temperature extremophiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 13, 253-261.). En relación a las patentes sobre estas enzimas hay tres documentos sobre proteasas: una proteasa alcalina para su uso como detergente procedente de un actinomiceto (WO 9,743,406; 1996), dos proteasas procedentes de bacterias CP-58 (WO 9,730,172; 1997) y CP-70 (U.S. 6,200,793; 1998), y una \beta-galactosidasa activa por debajo de 8ºC procedente de una bacteria Antártica (Patente U.S. 6,727,084; 2001). Este tipo de proteínas son producidas, hasta ahora, por microorganismos adaptados al frío u organismos psicrofílicos, capaces de vivir a temperaturas por debajo de los 5ºC, encontrándose su temperatura óptima de desarrollo entre 4ºC y 15ºC y las estrategias utilizadas hasta ahora para al obtención de este tipo de enzimas han sido el clonaje y la expresión en E. coli creciendo a baja temperatura de genes que codifican enzimas adaptadas al frío procedente de bacterias Antárticas.Despite its potential biotechnological application, few active enzymes at low temperature are being used commercially, including a lipase, a lysozyme, a cellulase and several proteases (Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrews D, Sowers KR. 2002. Low-temperature extrephiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 13, 253-261.). In relation to patents on these enzymes there are three documents on proteases: an alkaline protease for use as a detergent from an actinomycete (WO 9,743,406; 1996), two proteases from bacteria CP-58 (WO 9,730,172; 1997) and CP- 70 (US 6,200,793; 1998), and an active β-galactosidase below 8 ° C from an Antarctic bacterium (US Patent 6,727,084; 2001). These types of proteins are produced, until now, by cold-adapted microorganisms or psychrophilic organisms, capable of living at temperatures below 5ºC, finding their optimum development temperature between 4ºC and 15ºC and the strategies used so far to obtain These types of enzymes have been cloning and expression in E. coli growing at low temperature genes that encode cold-adapted enzymes from Antarctic bacteria.
Además de sus enzimas, la utilización de microorganismos psicrófilos en los alimentos podría reemplazar a los conservantes químicos al disminuir o eliminar aquellos metabolitos requeridos por otros microorganismos. Al no ser aceptable la presencia de éstos en los alimentos, una alternativa a este problema sería la adición de enzimas activas a baja temperatura de origen natural, procedentes de un alimento como son los frutos, como es la proteína de la invención. Así mismo, la proteína de la invención puede ser utilizada como agente fitopatógeno, evitando enfermedades en las plantas y cultivos a baja temperatura ya que son enzimas digestivas de la pared celular y el producto de su hidrólisis induce resistencia.In addition to its enzymes, the use of psychrophilic microorganisms in food could replace chemical preservatives by decreasing or eliminating those metabolites required by other microorganisms. Not being acceptable their presence in food, an alternative to this problem would be the addition of active enzymes to low temperature of natural origin, coming from a food such as the fruits, as is the protein of the invention. Likewise, the protein of the invention can be used as an agent phytopathogen, avoiding diseases in plants and crops to low temperature since they are digestive enzymes of the cell wall and the product of its hydrolysis induces resistance.
El gran interés industrial que despierta este tipo de proteínas con alta actividad a bajas temperaturas, las llamadas enzimas adaptadas al frío, ha dado lugar a la búsqueda de nuevas fuentes naturales de proteínas más resistentes a la inactivación por bajas temperaturas.The great industrial interest that awakens this type of proteins with high activity at low temperatures, the called enzymes adapted to cold, has led to the search for new natural sources of proteins more resistant to inactivation due to low temperatures.
Sin embargo, estas enzimas adaptadas al frío son un caso excepcional dentro de las proteínas, ya que en general todas las clases de proteínas, y especialmente las enzimas, pierden su actividad biológica fuera de un relativamente estrecho rango de temperatura.However, these cold-adapted enzymes are an exceptional case within proteins, since in general all kinds of proteins, and especially enzymes, lose its biological activity outside a relatively narrow range of temperature.
Las enzimas son polipéptidos producidos por las células de los seres vivos y que catalizan una específica reacción bioquímica a la temperatura del cuerpo. Las proteínas no sólo son importantes para la función y regulación de los organismos vivos si no que también son útiles agentes farmacéuticos, por lo que es necesario su refrigeración en forma soluble para mantener su actividad biológica hasta el momento de ser administrada a los pacientes o para pruebas de diagnóstico clínico. Sin embargo, un problema que plantea la refrigeración de las proteínas es que se vuelven inestables y llegan a perder alguna de sus actividades. La opción de congelación y posterior descongelación para dotarlas de una más extensa vida útil normalmente disminuye la actividad biológica de las mismas.Enzymes are polypeptides produced by cells of living beings that catalyze a specific reaction Biochemistry at body temperature. Proteins are not only important for the function and regulation of living organisms if not that pharmaceutical agents are also useful, so it is its cooling needed in a soluble way to maintain its biological activity until the moment of being administered to patients or for clinical diagnostic tests. However, a problem with protein cooling is that it they become unstable and lose some of their activities. The freezing and subsequent defrosting option to provide them with longer service life usually decreases activity biological of them.
Para solucionar el problema de pérdida de actividad biológica de las proteínas debido a su refrigeración o congelación los esfuerzos se han dirigido hacia la búsqueda de vías de protección después de ser congeladas o liofilizadas. En la actualidad se utilizan varios tipos de sustancias crioprotectoras como: dimetilsulfóxido, glicerol, soluciones salino/glucosadas (glucosa, manitol, sorbitol), hidroxietilalmidón y proteínas (como seroalbúmina). En la patente U.S. 4,806,343 se describe un método para proteger la actividad biológica de proteínas después de la congelación exponiéndola previamente a carbohidratos y cationes no metálicos. Por otro lado se ha patentado una sustancia crioprotectora procedente de un microorganismo (JP 2001139599; 2001). Las proteínas crioprotectoras, de forma individual o mezcladas con otros crioprotectores, son empleadas en la crioconservación de material biológico vivo a bajas temperaturas. En la patente WO 2007/033488 se describe el uso de un extracto vegetal conteniendo proteínas para la crioconservación de moléculas, orgánulos, células, tejidos y órganos. Además, las proteínas con actividad crioprotectora pueden ser de gran utilidad al proteger a otras proteínas sensibles de la desnaturalización en el proceso de congelación-descongelación dentro de los alimentos. En este campo, el principal inconveniente derivado del uso de nuevas proteínas crioprotectoras en alimentos congelados está relacionado con el origen de las mismas. Los requerimientos de seguridad y de aceptación por el consumidor, apuntan hacia productos naturales u orgánicos, en contra de aditivos y productos químicos o materiales modificados genéticamente.To solve the problem of loss of biological activity of proteins due to their refrigeration or freezing efforts have been directed towards finding ways of protection after being frozen or lyophilized. In the Several types of cryoprotective substances are currently used as: dimethylsulfoxide, glycerol, saline / glucosated solutions (glucose, mannitol, sorbitol), hydroxyethyl starch and proteins (such as serum albumin). In U.S. Patent 4,806,343 a method is described to protect the biological activity of proteins after freezing by previously exposing it to carbohydrates and cations not metallic On the other hand a substance has been patented cryoprotectant from a microorganism (JP 2001139599; 2001). Cryoprotectant proteins, individually or mixed with other cryoprotectants, they are used in the cryopreservation of living biological material at low temperatures. WO 2007/033488 describes the use of an extract vegetable containing proteins for cryopreservation of molecules, organelles, cells, tissues and organs. In addition, the proteins with cryoprotective activity can be very useful by protecting other sensitive proteins from denaturation in the freeze-thaw process within the food. In this field, the main drawback derived of the use of new cryoprotective proteins in frozen foods It is related to their origin. The requirements of security and acceptance by the consumer, point towards natural or organic products, against additives and products Genetically modified chemicals or materials.
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Son escasas las fuentes conocidas de proteínas con actividad crioprotectora. En vegetales, son pocas las clases de proteínas que presentan actividad crioprotectora, siendo principalmente proteínas inducidas por frío, sin actividad biológica, mayoritariamente dehidrinas como P-80 y DHN5 en hojas de cebada, PCA60 en tejidos de la corteza de melocotón, CuCOR19 en hojas de cítricos, etc. y alguna proteína de la familia de proteínas PRs como una taumatina (PR5) en hojas de cacahuete (Bravo LA, Gallardo J, Navarrete A, Olave N, Martínez J, Alberdi M, Close TJ, Corcuera LJ. 2003. Cryoprotective activity of a cold-induced dehydrin purified from barley. Physiolia Plantarum, 118, 262-269), siendo todas ellas del orden de 4 a 30 veces más activas como proteínas crioprotectoras que la seroalbúmina bovina (BSA) utilizada como proteína crioprotectora control. También se han descrito dos 1,3-\beta-glucanasas (PR2) básicas de clase I, una recombinante procedente de uvas con una actividad crioprotectora similar al BSA (Romero I, Fernández-Caballero C, Goñi O, Escribano MI, Merodio C, Sánchez-Ballesta MT. 2008. Functionality of class I beta-1,3-glucanase from skin of table grapes berries. Plant Science, 174, 641-648) y la otra procedente de cultivos de hojas de tabaco crioactiva en ensayos in vitro con tilacoides (Hincha DK, Meins F, Schmitt JM 1997. \beta-1,3-Glucanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold acclimation. Plant Physiology, 114:1077-1083).The known sources of proteins with cryoprotective activity are scarce. In vegetables, there are few kinds of proteins that have cryoprotective activity, mainly cold-induced proteins, without biological activity, mostly dehydrins such as P-80 and DHN5 in barley leaves, PCA60 in peach bark tissues, CuCOR19 in leaves of citrus, etc. and some protein from the family of PRs proteins such as a thaumatine (PR5) in peanut leaves (Bravo LA, Gallardo J, Navarrete A, Olave N, Martínez J, Alberdi M, Close TJ, Corcuera LJ. 2003. Cryoprotective activity of a cold-induced dehydrin purified from barley, Physiolia Plantarum , 118, 262-269), all of which are in the order of 4 to 30 times more active as cryoprotective proteins than bovine serum albumin (BSA) used as a control cryoprotective protein. Two basic 1,3-β-glucanases (PR2) of class I have also been described, a recombinant from grapes with a cryoprotective activity similar to BSA (Romero I, Fernández-Caballero C, Goñi O, Escribano MI, Merodio C , Sánchez-Ballesta MT. 2008. Functionality of class I beta-1,3-glucanase from skin of table grapes berries. Plant Science, 174, 641-648) and the other from cryoactive tobacco leaf cultures in in vitro assays with thylakoids (Hincha DK, Meins F, Schmitt JM 1997. β-1,3-Glucanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold acclimation. Plant Physiology, 114: 1077-1083).
Consecuentemente, hay una creciente demanda de proteínas crioprotectoras efectivas que sean, o que pueda considerarse que son, naturales. Si tales materiales derivan de fuentes que históricamente han sido consumidas por el ser humano, hay credibilidad razonable de que, muy probablemente, son seguros. Esto puede reducir la necesidad de ensayos extensos y caros de toxicidad.Consequently, there is a growing demand for effective cryoprotective proteins that are, or that can considered to be natural. If such materials derive from sources that historically have been consumed by the human being, There is reasonable credibility that, most likely, they are safe. This can reduce the need for extensive and expensive trials of toxicity.
Actualmente es muy difícil proporcionar a la Industria alimentaria, médica y farmacéutica nuevas fuentes naturales de proteínas que actúen a muy baja concentración como crioprotector para, por ejemplo, el almacenamiento y distribución de proteínas con actividad biológica en forma congelada o liofilizada y que una vez descongelada o rehidratada la proteína pueda ser administrada directamente a un animal o paciente sin remover el crioprotector. Además, en biocatálisis, bioremediación, biocontrol y conservación de alimentos sanos en condiciones que requieran bajas temperaturas son requeridas proteínas que desarrollen una alta actividad hidrolítica a bajas temperaturas y con control de su inactivación a moderada-alta temperatura.It is currently very difficult to provide the Food, medical and pharmaceutical industry new sources natural proteins that act at a very low concentration such as cryoprotectant for, for example, storage and distribution of proteins with biological activity in frozen form or lyophilized and once the protein has been thawed or rehydrated can be administered directly to an animal or patient without remove the cryoprotectant. In addition, in biocatalysis, bioremediation, biocontrol and conservation of healthy foods in conditions that require low temperatures are required proteins that develop high hydrolytic activity at low temperatures and with control of its inactivation at moderate-high temperature.
Por ello la presente invención pretende solucionar estos problemas como son proporcionar nuevas fuentes naturales de proteínas biológicamente activas a bajas temperaturas, estables en un rango de pH ácido-neutro y crioprotectoras. La solución proporcionada por esta invención se concreta en la identificación de una nueva 1,3-\beta-glucanasa ácida, de baja masa molecular, con una alta actividad hidrolítica a bajas temperaturas, funcional en un rango de pH ácido-neutro y que actúa como crioprotector a muy baja concentración, de origen natural, en un método para producir dicha proteína, particularmente inducida en la pulpa de chirimoya por un corto tratamiento gaseoso a bajas temperaturas, junto con el procedimiento para el aislamiento y purificación de dicha proteína y al empleo de dicha proteína crioprotectora con actividad 1,3-\beta-glucanasa activa a bajas temperaturas y preparaciones proteicas que contienen dicha proteína en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación para su almacenamiento y distribución en forma congelada o liofilizada, así como para la degradación o modificación de materiales que contienen 1,3-\beta-glucanos en condiciones que requieran bajas temperaturas o inactivación a moderada-alta temperatura.Therefore the present invention aims to solve these problems such as providing new sources natural biologically active proteins at low temperatures, stable in a acid-neutral pH range and cryoprotectants The solution provided by this invention is concrete in the identification of a new 1,3-? Acid glucanase, low molecular mass, with high hydrolytic activity at low temperatures, functional in a pH range acid-neutral and that acts as a cryoprotectant at very low concentration, of natural origin, in a method to produce said protein, particularly induced in cherimoya pulp for a short gas treatment at low temperatures, along with the procedure for the isolation and purification of said protein and to the use of said cryoprotective protein with activity 1,3- active beta-glucanase at low temperatures and protein preparations containing said protein in the cryoprotection of proteins sensitive to freeze-thaw for storage and distribution in frozen or lyophilized form, as well as for degradation or modification of materials containing 1,3-? -Glucans in conditions that require low temperatures or inactivation at Moderate-high temperature.
Un aspecto de la invención lo constituye una proteína 1,3-\beta-glucanasa con actividad crioprotectora, en adelante proteína de la invención, aislada de la pulpa de chirimoya (Annona cherimola Mill) constituida por una proteína monomérica con una masa molecular de 19.200 Da, y un punto isoeléctrico (pI) mayor o igual a 5,25, siendo una glicoproteína endo-1,3-\beta-glucanasa con una constante catalítica (k_{cat}) mayor de 2, preferentemente mayor de 3,1 s^{-1}, una constante de afinidad (K_{m}) mayor de 70, preferentemente de 80 \muM, una eficiencia catalítica (k_{cat}/K_{m}) mayor de 35 preferentemente mayor 38,3 s^{-1} mM^{-1}, catalíticamente activa en un rango de pH ácido-neutro, de 3,0 a 7,0, y estable en un rango de pH ácido, de 2,0 a 6,0, termosensible a temperaturas superiores a 50ºC y con una energía de activación (E_{a}) de 7,0 kJ\cdotmol^{-1} además de ser hidrolíticamente activa a bajas temperaturas con un valor para la k_{cat} de 2,5 s^{-1} a 5ºC y presentando un valor C_{50} de actividad crioprotectora de 8,7 \mug\cdotml^{-1}.One aspect of the invention is a 1,3-? -Glucanase protein with cryoprotective activity, hereinafter protein of the invention, isolated from cherimoya pulp ( Annona cherimola Mill) consisting of a monomeric protein with a molecular mass of 19,200 da, and an isoelectric point (p I) greater than or equal to 5.25, being a beta-glucanase endo-1,3- glycoprotein \ with a catalytic constant (k cat {}) greater than 2, preferably greater than 3 , 1 s -1, an affinity constant (K m) greater than 70, preferably 80 µM, a catalytic efficiency ( k cat / K m) greater than 35 preferably greater 38 , 3 s <-1> mM <-1>, catalytically active in a acid-neutral pH range, from 3.0 to 7.0, and stable in an acidic pH range, from 2.0 to 6 , 0, thermosensitive at temperatures above 50 ° C and with an activation energy ( E a) of 7.0 kJ • -1 in addition to being hydrolytically active at low temperatures with a value for k k cat from 2.5 s -1 to 5th C and presenting a C 50 value of cryoprotective activity of 8.7 ½ cup -1.
Otro aspecto de la invención lo constituye un procedimiento de aislamiento y purificación de la proteína de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende las siguientes etapas:Another aspect of the invention is constituted by a Isolation and purification procedure of the protein invention, hereinafter method of the invention, comprising the following stages:
a) pretratamiento gaseoso del material vegetal de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales, subtropicales y/o subproductos agrícolas, como por ejemplo, sin que ello suponga un límite del alcance de la invención la pulpa de chirimoyas (Annona cherimola Mill.), es conservado en una atmósfera enriquecida con 10% a 30% de CO_{2}, entre 60 y 75 horas a bajas temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido a condiciones atmosféricas durante un periodo de 3 a 10 días,a) gaseous pretreatment of the starting plant material, preferably tissues of tropical fruits, subtropical and / or agricultural by-products, such as, without limiting the scope of the invention, the pulp of custard apples ( Annona cherimola Mill.), is preserved in an atmosphere enriched with 10% to 30% CO2, between 60 and 75 hours at low temperatures, about 5 to 7 ° C, being subsequently maintained at atmospheric conditions for a period of 3 to 10 days,
b) extracción de las proteínas (Ejemplo 1) del material vegetal, se tritura y homogeneiza en un medio acuoso constituido por una disolución acuosa salina, opcionalmente tamponada en un pH comprendido entre 3,0 y 10,0, preferentemente pH 5,0, y a una temperatura entre 4 y 30ºC, preferentemente a una temperatura de 4ºC, y opcionalmente adicionando secuestradores de fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidona soluble al medio acuoso. La fracción soluble resultante es fraccionada y concentrada mediante ultrafiltración,b) protein extraction (Example 1) of plant material, crushed and homogenized in an aqueous medium constituted by an aqueous saline solution, optionally buffered at a pH between 3.0 and 10.0, preferably pH 5.0, and at a temperature between 4 and 30 ° C, preferably at temperature of 4 ° C, and optionally adding sequestrants of phenols, for example water-soluble polyvinylpyrrolidone. The resulting soluble fraction is fractionated and concentrated. by ultrafiltration,
c) etapa de separación de la proteína de la invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:c) stage of separation of the protein from the invention of the rest of the soluble fraction proteins by means of fractionation with ammonium sulfate by progressive saturation:
- --
- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad glucanasa,He fractionation begins with a first protein precipitation at low concentration of ammonium sulfate between 10% and 30%, preferably with 20%, obtaining an enriched supernatant in glucanase activity,
- --
- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,gradually saturating with sulfate ammonium until reaching a concentration of 80% and 90%, preferably 85%,
- --
- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,washed and ultrafiltrate of the precipitate, for example, by a membrane of 10,000 MW,
yY
d) purificación mediante cualquier técnica convencional de purificación de proteínas.d) purification by any technique Conventional protein purification.
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Así, una realización particular de la invención es el procedimiento de la invención en el que la extracción de b) se realiza mediante la adición de antioxidantes y agentes quelantes de cationes, preferentemente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, ácido ascórbico y ácido etilendiamino-tetraacético sal disódica 2-hidrato (EDTA).Thus, a particular embodiment of the invention it is the process of the invention in which the extraction of b) It is done by adding antioxidants and chelating agents of cations, preferably by way of illustration and without limitation The scope of the invention, ascorbic acid and acid ethylenediamine tetraacetic disodium salt 2-hydrate (EDTA).
Una realización particular de la invención es el procedimiento de la invención en el que la purificación de d) se realiza mediante técnicas cromatográficas (Ejemplo 1), más concretamente cromatografía de intercambio aniónico, se realiza a un pH comprendido entre 7,0 y 9,0, preferentemente a pH 8,0 debido a la naturaleza aniónica de la proteína de la invención, cromatoenfoque realizado en un gradiente de pH de 6,0 a 4,0 y un segundo cromatoenfoque realizado en un gradiente de pH de 6,0 a 5,0.A particular embodiment of the invention is the method of the invention in which the purification of d) is performed by chromatographic techniques (Example 1), more specifically anion exchange chromatography, is performed at a pH between 7.0 and 9.0, preferably at pH 8.0 because to the anionic nature of the protein of the invention, Chromato-focus performed on a pH gradient of 6.0 to 4.0 and a second chromato-focus performed on a pH gradient of 6.0 to 5.0.
El procedimiento de aislamiento de la proteína de la invención descrito manifiesta un alto rendimiento reflejado en una recuperación del 1,5% y un factor de purificación de 18, de manera que partiendo de una pequeña cantidad de material vegetal (250 gramos) se obtienen alrededor de 0,2 mg de una proteína pura a homogeneidad y con elevada actividad específica. Si se extrapolan estos datos a escala industrial supone la obtención de una gran cantidad de 1-3-\beta-glucanasa a partir de un material desechable y económico como el caso de un subproducto procedente de Cooperativas Agrarias o empresas de transformación de frutos, valorizando un residuo suponiendo una salida comercial del mismo.The protein isolation procedure of the described invention manifests a high reflected performance in a 1.5% recovery and a purification factor of 18, of so that starting from a small amount of plant material (250 grams) about 0.2 mg of a pure protein is obtained at homogeneity and with high specific activity. If they extrapolate These data on an industrial scale means obtaining a large amount of 1-3-? -Glucanase from a disposable and economical material as the case of a by-product from Agricultural Cooperatives or companies of fruit transformation, valuing a residue assuming a commercial exit of the same.
Por último, la proteína de la invención puede ser utilizada en cualquier aplicación propia de las proteínas con actividad 1-3-\beta-glucanasa.Finally, the protein of the invention can be used in any application of proteins with activity 1-3-? -Glucanase.
Debido a sus características cinéticas (alto valor para la constante catalítica a 5ºC) y termodinámicas (bajos valores de energía de activación) la enzima de la invención puede presentar aplicaciones en biocatálisis cuando las reacciones requieran bajas temperaturas como en el caso de la utilización de solventes orgánicos muy volátiles; en biorremediación y biocontrol y conservación de alimentos sanos en condiciones que requieran bajas temperaturas. En todos los casos además de ser una enzima hidrolítica estable a bajas temperaturas, tiene la ventaja añadida de su inactivación a moderada-alta temperatura.Due to its kinetic characteristics (high value for the catalytic constant at 5ºC) and thermodynamics (low activation energy values) the enzyme of the invention can present applications in biocatalysis when reactions require low temperatures as in the case of using highly volatile organic solvents; in bioremediation and biocontrol and preservation of healthy foods in conditions that require low temperatures In all cases besides being an enzyme stable hydrolytic at low temperatures, has the added advantage of its inactivation at moderate-high temperature.
La proteína de la invención puede utilizarse, de manera soluble o inmovilizada, por ejemplo inmovilizada mediante distintos procedimientos como el enlace a soportes sólidos, el atrapamiento en geles, la encapsulación en vesículas, el entrecruzamiento entre moléculas de enzima y el confinamiento en birreactores de membranas, acoplados por ejemplo a sistemas de filtración, intercambio fónico o pH.The protein of the invention can be used, of soluble or immobilized manner, for example immobilized by different procedures such as the link to solid supports, the gel entrapment, vesicle encapsulation, crosslinking between enzyme molecules and confinement in membrane bi-reactors, coupled for example to systems of filtration, phonic exchange or pH.
Otra aplicación de la proteína de la invención es su empleo en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y su aplicación en la industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica (crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica (proteínas con actividad biológica).Another application of the protein of the invention is its use in the cryoprotection of proteins sensitive to freeze-thaw and its application in the food industry (structural or soluble proteins), medical (cryopreservation of living cells and tissues) and pharmaceutical (proteins with biological activity).
Por todo lo anterior la proteína de la invención puede ser utilizada sola o mezclada con otros crioprotectores, en diferentes matrices para la conservación de alimentos u otras proteínas con actividad biológica de uso terapéutico, siendo factible de ser ingerida por los pacientes al ser de origen natural y activa a muy bajas concentraciones. Además, su aislamiento es compatible con su inocuidad como aditivo alimentario.For all the above the protein of the invention it can be used alone or mixed with other cryoprotectants, in different matrices for food preservation or other proteins with biological activity for therapeutic use, being feasible to be ingested by patients to be of natural origin and active at very low concentrations. In addition, its isolation is compatible with its safety as a food additive.
Más concretamente, otro aspecto de la invención lo constituye el uso de la proteína de la invención en la elaboración de una composición biotecnológica o farmacéutica útil para la criopreservación de principios activos.More specifically, another aspect of the invention it is constituted by the use of the protein of the invention in the development of a useful biotechnological or pharmaceutical composition for the cryopreservation of active ingredients.
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La presente invención proporciona una proteína de origen natural biológicamente activa a bajas temperaturas, estables en un amplio rango de pH y altamente crioprotectora.The present invention provides a protein of biologically active natural origin at low temperatures, stable in a wide pH range and highly cryoprotective.
La presente invención se basa en que los inventores han identificado una proteína 1-3-\beta-glucanasa con actividad crioprotectora de pulpa de chirimoya (Annona cherimola Mill), que mediante técnicas electroforéticas, cromatográficas y espectrométricas han sido estimadas sus propiedades tanto cinéticas como termodinámicas, de tal manera que se trata de una proteína monomérica con una masa molecular de 19.200 Da, y un punto isoeléctrico (pI) mayor o igual a 5,25, aproximadamente.The present invention is based on the fact that the inventors have identified a 1-3-? -Glucanase protein with cryoprotective activity of cherimoya pulp ( Annona cherimola Mill), which by means of electrophoretic, chromatographic and spectrometric techniques have been estimated both kinetic and thermodynamics, in such a way that it is a monomeric protein with a molecular mass of 19,200 Da, and an isoelectric point (p I ) greater than or equal to approximately 5.25.
Además la proteína de la invención es una glicoproteína determinada por tinción mediante el reactivo de Schiff y la naturaleza glucanasa de la proteína de la invención ha sido determinada por inmunodetección con anticuerpos policlonales frente a proteínas PR-2 de tabaco viéndose que está serológicamente ligada a 1,3-\beta-glucanasas del tabaco y posteriormente ha sido identificada mediante el análisis del mapa de la huella peptídica utilizando para ello espectrometría de masas.In addition the protein of the invention is a glycoprotein determined by staining by the reagent of Schiff and the glucanase nature of the protein of the invention has been determined by immunodetection with polyclonal antibodies against tobacco PR-2 proteins seeing that it is serologically linked to 1,3-? -Glucanases from tobacco and subsequently it has been identified by analyzing the map of the peptide fingerprint using spectrometry of masses.
La proteína de la invención presenta una constante de afinidad (K_{m}) de 80 \muM y un valor estimado para la constante catalítica (k_{cat}) a una temperatura de 5ºC es 2,5 s^{-1} mM^{-1}, del orden del 80% del valor estimado en el ensayo estándar in vitro a 37ºC, siendo por ello una enzima hidrolíticamente activa a bajas temperaturas. Adicionalmente la proteína de la invención muestra una alta eficiencia catalítica (38,7 s^{-1} mM^{-1}) y tiene como ventajas adicionales que es catalíticamente activa en un margen de pH ácido-neutro de 3,0 a 7,0, altamente estable a pH ácidos, y termosensible a temperaturas moderadamente altas (superiores a 50ºC) presentando un valor bajo de energía de activación (E_{a}) de aproximadamente 7,0 kJ\cdotmol^{-1}, aunque las condiciones óptimas de la proteína de la invención son un pH de 5,0 y una temperatura de 40ºC.The protein of the invention has an affinity constant (K m) of 80 µM and an estimated value for the catalytic constant ( k cat) at a temperature of 5 ° C is 2.5 s -1 mM -1, of the order of 80% of the value estimated in the standard in vitro test at 37 ° C, being therefore a hydrolytically active enzyme at low temperatures. Additionally, the protein of the invention shows a high catalytic efficiency (38.7 s -1 mM -1) and has additional advantages that it is catalytically active in a range of acid-neutral pH of 3.0 to 7.0, highly stable at acidic pH, and thermosensitive at moderately high temperatures (above 50 ° C) presenting a low activation energy value ( E a) of approximately 7.0 kJ · -1-mol, although the optimal conditions of the protein of the invention are a pH of 5.0 and a temperature of 40 ° C.
Otra característica de la proteína de la invención es la actividad crioprotectora que presenta, ya que protege a otras proteínas sensibles a la congelación durante dos ciclos de congelación-descongelación. Su actividad crioprotectora es muy superior a la de azúcares osmoprotectores como la sacarosa y a otras proteínas crioprotectoras como la seroalbúmina (BSA), ya que es activa a concentraciones más bajas. La concentración de la proteína de la invención necesaria para proteger un 50% de la actividad de la enzima lactato deshidrogenada (LDH) en el ciclo congelación-descongelación (valor C_{50}) es 9 veces menor que la concentración requerida de BSA, 8,7 \mug\cdotml^{-1} frente a 80,3 \mug\cdotml^{-1}.Another characteristic of the protein in the invention is the cryoprotective activity that it presents, since protects other proteins sensitive to freezing for two freeze-thaw cycles. Your activity cryoprotectant is far superior to that of osmoprotective sugars like sucrose and other cryoprotective proteins such as serum albumin (BSA), as it is active at lower concentrations. The concentration of the protein of the invention necessary for protect 50% of the activity of the enzyme dehydrogenated lactate (LDH) in the freeze-thaw cycle (value C 50) is 9 times lower than the required concentration of BSA, 8.7 \ mug \ cdotml <-1> versus 80.3 \ mug \ cdotml <-1>.
Así, un aspecto de la invención se refiere a una proteína 1,3-\beta-glucanasa con actividad crioprotectora, en adelante proteína de la invención, aislada de la pulpa de chirimoya (Annona cherimola Mill) constituida por una proteína monomérica con una masa molecular de 19.200 Da, y un punto isoeléctrico (pI) mayor o igual a 5,25, siendo una glicoproteína endo-1,3-\beta-glucanasa con una constante catalítica (k_{cat}) mayor de 2, preferentemente mayor de 3,1 s^{-1}, una constante de afinidad (K_{m}) mayor de 70, preferentemente de 80 \muM, una eficiencia catalítica (k_{cat}/K_{m}) mayor de 35 preferentemente mayor 38,3 s^{-1} mM^{-1}, catalíticamente activa en un rango de pH ácido-neutro, de 3,0 a 7,0, y estable a pH ácidos, de 2,0 a 6,0, termosensible a temperaturas superiores a 50ºC y con una energía de activación (E_{a}) de 7,0 kJ\cdotmol^{-1}, además de ser hidrolíticamente activa a bajas temperaturas con un valor para la k_{cat} de 2,5 s^{-1} a 5ºC y presentando un valor C_{50} de actividad crioprotectora de 8,7 \mug\cdotml^{-1}.Thus, one aspect of the invention relates to a 1,3-? -Glucanase protein with cryoprotective activity, hereinafter protein of the invention, isolated from cherimoya pulp ( Annona cherimola Mill) consisting of a monomeric protein with a mass molecular value of 19,200 Da, and an isoelectric point (p I ) greater than or equal to 5.25, being an endo-1,3-? -glucanase glycoprotein with a catalytic constant ( k cat) greater than 2, preferably greater than 3.1 s -1, an affinity constant (K m) greater than 70, preferably 80 µM, a catalytic efficiency ( k cat / K m) greater than 35 preferably greater than 38.3 s -1 mM -1, catalytically active in a range of acid-neutral pH, from 3.0 to 7.0, and stable at acidic pH, from 2.0 to 6 , 0, thermosensitive at temperatures above 50 ° C and with an activation energy ( E a) of 7.0 kJ • -1, in addition to being hydrolytically active at low temperatures with a value for k _ cat of 2.5 s -1 at 5 ° C and pr presenting a C 50 value of cryoprotective activity of 8.7 µg \ cdotml -1.
Otro aspecto de la invención lo constituye un procedimiento de aislamiento y purificación de la proteína de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende las siguientes etapas:Another aspect of the invention is constituted by a Isolation and purification procedure of the protein invention, hereinafter method of the invention, comprising the following stages:
a) pretratamiento gaseoso del material vegetal de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales, subtropicales y/o subproductos de la manipulación y comercialización de frutos, como por ejemplo, sin que ello suponga un límite del alcance de la invención la pulpa de chirimoyas (Annona cherimola Mill.), es conservado en una atmósfera enriquecida con 10% a 30% de CO_{2}, entre 60 y 75 horas a bajas temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido a condiciones atmosféricas durante un periodo de 3 a 10 días,a) gaseous pretreatment of the starting plant material, preferably tissues of tropical, subtropical fruits and / or by-products of fruit handling and marketing, as for example, without limiting the scope of the invention to the pulp of custard apples ( Annona Cherimola Mill.), is preserved in an atmosphere enriched with 10% to 30% CO2, between 60 and 75 hours at low temperatures, about 5 to 7 ° C, being subsequently maintained at atmospheric conditions for a period of 3 to 10 days,
b) extracción de las proteínas (Ejemplo 1) del material vegetal, se tritura y homogeneiza en un medio acuoso constituido por una disolución acuosa salina, opcionalmente tamponada en un pH comprendido entre 3,0 y y 10,0 preferentemente pH 5,0, y a una temperatura entre 4 y 30ºC, preferentemente a una temperatura de 4ºC, y opcionalmente adicionando secuestradores de fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidona soluble, al medio acuoso,b) protein extraction (Example 1) of plant material, crushed and homogenized in an aqueous medium constituted by an aqueous saline solution, optionally buffered at a pH between 3.0 and 10.0 preferably pH 5.0, and at a temperature between 4 and 30 ° C, preferably at a temperature of 4 ° C, and optionally adding sequestrants of phenols, for example soluble polyvinylpyrrolidone, to the medium aqueous,
c) etapa de separación de la proteína de la invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:c) stage of separation of the protein from the invention of the rest of the soluble fraction proteins by means of fractionation with ammonium sulfate by progressive saturation:
- --
- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad glucanasa,He fractionation begins with a first protein precipitation at low concentration of ammonium sulfate between 10% and 30%, preferably with 20%, obtaining an enriched supernatant in glucanase activity,
- --
- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,gradually saturating with sulfate ammonium until reaching a concentration of 80% and 90%, preferably 85%,
- --
- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,washed and ultrafiltrate of the precipitate, for example, by a membrane of 10,000 MW,
yY
d) purificación mediante cualquier técnica convencional de purificación de proteínas.d) purification by any technique Conventional protein purification.
Tras la homogeneización se separa la parte soluble del residuo sólido por medio de cualquier técnica convencional de separación de sólido-líquido, como por ejemplo sin que limite el alcance de la invención, por centrifugación. La fracción soluble resultante o extracto crudo que es la que contiene la actividad 1-3-\beta-glucanasa, se ultrafiltra por medio de discos de membrana de 100.000 MW con el fin de eliminar los polímeros de naturaleza coloidal presentes en estos tejidos de dicha fracción soluble. Posteriormente, el filtrado protéico es fraccionado y concentrado mediante ultrafiltración empleando discos de membrana de 10.000 MW obteniendo finalmente un rendimiento o factor de purificación de alrededor de 3.After homogenization the part is separated soluble solid residue by any technique conventional solid-liquid separation, such as for example without limiting the scope of the invention, for centrifugation The resulting soluble fraction or crude extract that is the one that contains the activity 1-3-? -Glucanase, it is ultrafiltered by means of 100,000 MW membrane discs with the in order to eliminate polymers of colloidal nature present in these tissues of said soluble fraction. Subsequently, the filtering Protein is fractionated and concentrated by ultrafiltration using 10,000 MW membrane disks finally obtaining a yield or purification factor of about 3.
Durante la etapa de extracción b) del
procedimiento de la invención se observaron inicialmente por parte
de los inventores dificultades para obtener altos rendimientos de
la proteína
1-3-\beta-glucanasa
de la invención, por lo que se añadió antioxidantes y agentes
quelantes de cationes al medio acuoso que facilitaron una
extracción más eficaz de la proteína de la invención debido a que
solubilizan y despolimerizan las pectinas de la matriz vegetal. Así,
una realización particular de la invención es el procedimiento de
la invención en el que la extracción de b) se realiza mediante la
adición de antioxidantes, preferentemente, a título ilustrativo y
sin que limite el alcance de la invención, ácido as-
córbico
y agentes quelantes de cationes, por ejemplo, ácido
etilendiamino-tetraacético sal disódica
2-hidrato (EDTA).During the extraction stage b) of the process of the invention, difficulties for obtaining high yields of the 1-3-? -Glucanase protein of the invention were initially observed by the inventors, whereby antioxidants and chelating agents were added. aqueous cations that facilitated more efficient extraction of the protein of the invention because they solubilize and depolymerize pectins from the plant matrix. Thus, a particular embodiment of the invention is the process of the invention in which the extraction of b) is carried out by the addition of antioxidants, preferably, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, as well as
corbic and cation chelating agents, for example ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt 2-hydrate (EDTA).
Tras la etapa de extracción (b) se lleva a cabo la etapa de separación (c) de la proteína de la invención del resto de proteínas de la fracción soluble ya que en las plantas en general, y en el caso de la pulpa de chirimoya en particular, existen otras muchas proteínas que interfieren en la purificación de la proteína de la invención. Para ello, el extracto protéico obtenido en la etapa (b) se somete a fraccionamiento con sulfato amónico por saturación puesto que las proteínas con actividad 1-3-\beta-glucanasa son estables a bajas concentraciones de dicha sal y precipitan. Por lo tanto se va aumentando las concentraciones de saturación con sulfato amónico para su separación del resto de las proteínas presentes. El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, con lo que al precipitar otras proteínas no glucanasas obtenemos un sobrenadante enriquecido en actividad glucanasa. Esta fracción de proteínas soluble, que contiene actividad 1-3-\beta-glucanasa, se lleva a saturación con sulfato amónico entre 80% y 90%, preferentemente a 85%, obteniéndose un precipitado que, lavado y ultrafiltrado por la membrana de 10.000 MW, tiene actividad 1-3-\beta-glucanasa y comprende una mezcla de isoenzimas con actividad 1-3-\beta-glucanasa que contiene más del 64% de la actividad total y el 80% de la actividad específica contenida en la etapa anterior.After the extraction stage (b) it is carried out the separation step (c) of the protein of the invention from the rest of soluble fraction proteins since in plants in general, and in the case of custard apple pulp in particular, there are many other proteins that interfere with the purification of The protein of the invention. To do this, the protein extract obtained in step (b) is subjected to fractionation with sulfate saturation ammonium since proteins with activity 1-3-? -Glucanase they are stable at low concentrations of said salt and precipitate. By therefore saturation concentrations are increased with ammonium sulfate for separation from the rest of the proteins present. The fractionation begins with a first precipitation of proteins at low concentration of ammonium sulfate between 10% and 30%, preferably with 20%, so that when precipitating others non-glucanase proteins we obtain a supernatant enriched in glucanase activity This soluble protein fraction, which contains activity 1-3-? -Glucanase, it is brought to saturation with ammonium sulfate between 80% and 90%, preferably at 85%, obtaining a precipitate which, washed and ultrafiltered by the 10,000 MW membrane, it has activity 1-3-? -Glucanase and comprises a mixture of isoenzymes with activity 1-3-? -Glucanase which contains more than 64% of the total activity and 80% of the specific activity contained in the previous stage.
Adicionalmente el extracto obtenido se puede someter a un proceso de purificación (d) para obtener la proteína de la invención purificada parcialmente o a homogeneidad, o bien dicho extracto se puede desecar o liofilizar y mantenerlo como fuente de enzima con actividad glucanasa-crioprotectora para ensayos que no requieran el empleo de dicha proteína con elevada pureza.Additionally, the extract obtained can be undergo a purification process (d) to obtain the protein of the invention partially or homogeneously purified, or said extract can be dried or lyophilized and kept as enzyme source with activity glucanase-cryoprotectant for tests that do not require the use of said protein with high purity.
Para la purificación de la proteína de la invención (d), se puede usar cualquier técnica convencional de purificación de proteínas, como diálisis, técnicas de ultrafiltración, cromatográficas, cromatografía de intercambio iónico (DEAE-Celulosa, DEAE-Sepharosa, Mono S; Mono Q; Source S; Source Q; CM-Sepharose) y de cromatoenfoque (Mono P).For the purification of the protein from the invention (d), any conventional technique of protein purification, such as dialysis, techniques of ultrafiltration, chromatographic, exchange chromatography ionic (DEAE-Cellulose, DEAE-Sepharosa, Mono S; Monkey Q; Source S; Source Q; CM-Sepharose) and chromato-focus (Mono P).
Una realización particular de la invención es el procedimiento de la invención en el que la purificación de d) se realiza mediante técnicas cromatográficas (Ejemplo 1), más concretamente mediante cromatografía de intercambio aniónico realizado a un pH entre 7,0 y 9,0, preferentemente a pH 8,0 debido a la naturaleza aniónica de la proteína de la invención, cromatoenfoque realizado en un gradiente de pH de 6,0 a 4,0 y un segundo cromatoenfoque realizado en un gradiente de pH de 6,0 a 5,0.A particular embodiment of the invention is the method of the invention in which the purification of d) is performed by chromatographic techniques (Example 1), more specifically by anion exchange chromatography performed at a pH between 7.0 and 9.0, preferably at pH 8.0 due to the anionic nature of the protein of the invention, Chromato-focus performed on a pH gradient of 6.0 to 4.0 and a second chromato-focus performed on a pH gradient of 6.0 to 5.0.
El procedimiento de aislamiento de la proteína de la invención descrito manifiesta un alto rendimiento reflejado en una recuperación del 1,5% y un factor de purificación de 18. Concretamente se pueden obtener valores de alrededor de 1,2-1,5 mg de proteína pura a homogeneidad y con elevada actividad específica por kg de material vegetal. Si se extrapolan estos datos a escala industrial supone la obtención de una gran cantidad de 1-3-\beta-glucanasa a partir de un material desechable y económico como el caso de un subproducto procedente de Cooperativas Agrarias o empresas de transformación de frutos, valorizando un residuo suponiendo una salida comercial del mismo.The protein isolation procedure of the described invention manifests a high reflected performance in a 1.5% recovery and a purification factor of 18. Specifically, values of around 1.2-1.5 mg of pure protein to homogeneity and with high specific activity per kg of plant material. Whether extrapolate these data on an industrial scale means obtaining a lot of 1-3-? -Glucanase from a disposable and economical material as the case of a by-product from Agricultural Cooperatives or companies of fruit transformation, valuing a residue assuming a commercial exit of the same.
Por último, la proteína de la invención puede ser utilizada en cualquier aplicación propia de las proteínas con actividad 1,3-\beta-glucanasa.Finally, the protein of the invention can be used in any application of proteins with 1,3-? -glucanase activity.
Debido a sus características cinéticas (alto valor para la constante catalítica a 5ºC) y termodinámicas (bajos valores de energía de activación) la proteína de la invención puede presentar aplicaciones en biocatálisis cuando las reacciones requieran bajas temperaturas como en el caso de la utilización de solventes orgánicos muy volátiles; en biorremediación y biocontrol y conservación de alimentos sanos en condiciones que requieran bajas temperaturas. En todos los casos además de ser una enzima hidrolítica estable a bajas temperaturas, tiene la ventaja añadida de su inactivación a moderada- alta temperatura. Debido a que es catalíticamente activa en un rango de pH ácido-neutro y altamente estable a pH ácidos, siendo rápidamente desnaturalizada a pH básicos, es factible de ser utilizada en industrias fermentativas.Due to its kinetic characteristics (high value for the catalytic constant at 5ºC) and thermodynamics (low activation energy values) the protein of the invention can present applications in biocatalysis when reactions require low temperatures as in the case of using highly volatile organic solvents; in bioremediation and biocontrol and preservation of healthy foods in conditions that require low temperatures In all cases besides being an enzyme stable hydrolytic at low temperatures, has the added advantage of its inactivation at moderate-high temperature. Because it is catalytically active in a pH range acid-neutral and highly stable at acidic pH, being quickly denatured at basic pH, it is feasible to be Used in fermentative industries.
La proteína de la invención puede utilizarse, de manera soluble o inmovilizada, ya que debido a su carácter glicoprotéico facilita su anclaje, por ejemplo puede estar inmovilizada mediante distintos procedimientos como el enlace a soportes sólidos (magnetita o la concavalina-A), el atrapamiento en geles, la encapsulación en vesículas, el entrecruzamiento entre moléculas de enzima y el confinamiento en birreactores de membranas, acoplados por ejemplo a sistemas de filtración, intercambio iónico o pH.The protein of the invention can be used, of soluble or immobilized manner, because due to its character glycoprotein facilitates its anchoring, for example it can be immobilized by different procedures such as the link to solid supports (magnetite or concavaline-A), the gel entrapment, vesicle encapsulation, crosslinking between enzyme molecules and confinement in membrane bi-reactors, coupled for example to systems of filtration, ion exchange or pH.
Otra aplicación de la proteína de la invención es su empleo en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y su aplicación en la industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica (crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica (proteínas con actividad biológica).Another application of the protein of the invention is its use in the cryoprotection of proteins sensitive to freeze-thaw and its application in the food industry (structural or soluble proteins), medical (cryopreservation of living cells and tissues) and pharmaceutical (proteins with biological activity).
Por todo lo anterior la proteína de la invención puede ser utilizada sola o mezclada con otros crioprotectores, en diferentes matrices para la conservación de alimentos u otras proteínas con actividad biológica de uso terapéutico (por ejemplo, insulina e IGF-I) o biotecnológico (por ejemplo enzimas de restricción), siendo factible de ser ingerida por los pacientes al ser de origen natural y activa a muy bajas concentraciones. Además, su aislamiento es compatible con su inocuidad como aditivo alimentario.For all the above the protein of the invention it can be used alone or mixed with other cryoprotectants, in different matrices for food preservation or other proteins with biological activity for therapeutic use (for example, insulin and IGF-I) or biotechnology (for example restriction enzymes), being feasible to be ingested by patients being of natural origin and active at very low concentrations. In addition, your insulation is compatible with your Safety as a food additive.
Así, otro aspecto de la invención lo constituye el uso de la proteína de la invención en la elaboración de una composición biotecnológica o farmacéutica útil para la criopreservación de principios activos.Thus, another aspect of the invention constitutes it the use of the protein of the invention in the preparation of a biotechnological or pharmaceutical composition useful for cryopreservation of active ingredients.
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(A) Análisis electroforético (SDS-PAGE). Las líneas 2 y 3 fueron cargadas con 2 \mug de proteína purificada no reducida y reducida con 1,25% (v/v) de \beta-mercaptoetanol. La línea 1 fue cargada con las proteínas de referencia de masa molecular. El gel fue teñido con azul de Coomassie.(A) Electrophoretic analysis (SDS-PAGE). Lines 2 and 3 were loaded with 2 ug of purified protein not reduced and reduced with 1.25% (v / v) of β-mercaptoethanol. Line 1 was loaded with molecular mass reference proteins. The gel was dyed with Coomassie blue.
(B) Inmunoensayo de un gel similar al mostrado en A con la proteína de la invención purificada, en su forma no reducida, e incubado con anticuerpos policlonales frente a proteínas PR2 de tabaco.(B) Immunoassay of a gel similar to that shown in A with the protein of the invention purified, in its form not reduced, and incubated with polyclonal antibodies against PR2 tobacco proteins.
(C) Tinción con reactivo de Schiff (PAS) de un gel similar al mostrado en A con la proteína de la invención purificada en su forma no reducida.(C) Staining with Schiff reagent (PAS) of a gel similar to that shown in A with the protein of the invention purified in its non-reduced form.
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El resultado obtenido fue expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al máximo de actividad obtenida.The result obtained was expressed as percentage of relative activity with respect to the maximum activity obtained.
A- Relación entre el pH de la reacción y la actividad relativa de la proteína de la invención medida bajo condiciones de ensayo estándar (37ºC, 10 min.) usando tampones 0.1 M (pH 2.0 a 13.0).A- Relationship between the pH of the reaction and the relative activity of the protein of the invention measured under standard test conditions (37 ° C, 10 min.) using 0.1 buffers M (pH 2.0 to 13.0).
B- Estabilidad de la proteína de la invención respecto al pH. La solución enzimática fue mezclada con tampón 0.1 M (pH 2.0 a 13.0) y mantenida a 37ºC durante 2 h. La actividad residual de la enzima tratada se ensayó bajo condiciones estándar.B- Stability of the protein of the invention with respect to pH. The enzyme solution was mixed with buffer 0.1 M (pH 2.0 to 13.0) and maintained at 37 ° C for 2 h. Activity Residual of the treated enzyme was tested under conditions standard.
C- Relación entre la temperatura (5ºC a 80ºC) de la reacción y la actividad relativa de la proteína de la invención medida tras la incubación en tampón acetato sódico 0.1 M, pH 5.0.C- Relationship between the temperature (5ºC to 80ºC) of the reaction and the relative activity of the protein of the invention measured after incubation in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.0.
D- Estabilidad de la proteína de la invención respecto a la temperatura. El efecto de la temperatura fue examinado después de pre-incubar a diferentes temperaturas (5ºC a 80ºC) en tampón acetato sódico 0.1 M, pH 5.0, durante 2 h. La actividad residual de la enzima tratada se ensayó bajo condiciones estándar.D- Stability of the protein of the invention Regarding the temperature. The effect of temperature was examined after pre-incubating at different temperatures (5 ° C to 80 ° C) in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.0, for 2 h. The residual activity of the treated enzyme was tested under standard conditions.
Las barras de error representan el ES (n = 3).Error bars represent the ES (n = 3).
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La solución de LDH fue congelada en presencia de diferentes concentraciones (C) de la proteína de la invención (a), seroalbúmina bovina (b) o sacarosa (c). Las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente y medida la actividad LDH. La actividad relativa representa la cantidad de actividad LDH remanente después de dos ciclos de congelación-descongelación expresada en porcentaje con respecto a la actividad de LDH inicial. Las barras de error representan el ES (n=3).The LDH solution was frozen in the presence of different concentrations (C) of the protein of the invention (a), bovine serum albumin (b) or sucrose (c). The samples were thawed at room temperature and measured LDH activity. The relative activity represents the amount of remaining LDH activity after two freeze-thaw cycles expressed as a percentage with respect to the initial LDH activity. Error bars represent the ES (n = 3).
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.The following examples illustrate the invention and they should not be considered as limiting the scope of the same.
Se pesaron 150 g de pulpa de chirimoya que fueron congelados en nitrógeno líquido para favorecer la trituración y homogeneización de este material. La homogeneización se realizó en tampón acetato sódico 100 mM pH 5,0 conteniendo ácido ascórbico 20 mM, 1,5% de polivinilpirrolidona soluble y ácido etilendiaminotetra-acético sal disódica 2-hidrato (EDTA) 10 mM.150 g of custard apple pulp were weighed they were frozen in liquid nitrogen to favor the crushing and homogenization of this material. Homogenization it was performed in 100 mM sodium acetate buffer pH 5.0 containing acid ascorbic 20 mM, 1.5% soluble polyvinylpyrrolidone and acid ethylenediaminetetraacetic disodium salt 10 mM 2-hydrate (EDTA).
Después de la homogeneización la parte soluble fue separada del residuo sólido por centrifugación (35.000 x g durante 30 minutos). El residuo sólido resultante fue sometido a dos ciclos más de lavado, homogeneización y centrifugación en las disoluciones anteriores. Los sobrenadantes de estas fracciones se mezclaron constituyendo el extracto crudo.After homogenization the soluble part was separated from the solid residue by centrifugation (35,000 x g for 30 minutes). The resulting solid residue was subjected to two more cycles of washing, homogenization and centrifugation in the previous solutions. The supernatants of these fractions are mixed constituting the crude extract.
El extracto crudo obtenido en la etapa anterior se filtró utilizando un sistema de ultrafiltración Amicon Diaflo 80200 (Millipore) con una membrana Biomax PBHK de un poro de corte de 100.000 MW (Millipore). Los carbohidratos poliméricos, especialmente sustancias pectídicas y almidón, y otras moléculas de gran tamaño quedaron así retenidas en la parte superior mientras que las proteínas de interés se recuperaron en la fracción filtrada. El material retenido fue lavado con dos fracciones de tampón Tricina 50 mM, pH 8,0 antes de concentrar la fracción filtrada diez veces en el mismo equipo de ultrafiltración, utilizando para ello una membrana YM-10 con un tamaño de poro de 10.000 MW (Millipore). Este proceso permite obtener un rendimiento o factor de purificación de cerca de 3 para esta proteína.The crude extract obtained in the previous stage was filtered using an Amicon Diaflo ultrafiltration system 80200 (Millipore) with a Biomax PBHK membrane with a cutting pore 100,000 MW (Millipore). Polymeric carbohydrates, especially pectidic substances and starch, and other molecules of large size were thus retained on top while The proteins of interest were recovered in the filtered fraction. He Retained material was washed with two fractions of Tricine 50 buffer mM, pH 8.0 before concentrating the filtered fraction ten times in the same ultrafiltration equipment, using a YM-10 membrane with a pore size of 10,000 MW (Millipore) This process allows to obtain a performance or factor of purification of about 3 for this protein.
El filtrado protéico obtenido en la etapa anterior se llevó al 20% de saturación con sulfato amónico. Después de 1 hora en agitación a 4ºC, el extracto se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos y el precipitado, carente de actividad 1,3-\beta-glucanasa, fue desechado. El sobrenadante se llevó al 85% de saturación con sulfato amónico y se dejó 1 hora en agitación a 4ºC. Después fue centrifugado a 15.000 x g durante 20 minutos a 4ºC y el precipitado obtenido se guardó como fuente de la proteína con actividad 1,3-\beta-glucanasa. Este precipitado se disolvió en tampón Tricina 20 mM pH 8.0 conteniendo glicerol al 10%. La disolución resultante se desaló por ultrafiltración utilizando una membrana con un tamaño de poro de 10.000 MW a 4ºC. Este extracto final obtenido presenta una mezcla de isoenzimas con actividad 1,3-\beta-glucanasa que contiene el 64% de la actividad total y el 80% de la actividad específica contenida en la etapa anterior.The protein filtrate obtained in the stage above it was brought to 20% saturation with ammonium sulfate. After After stirring for 1 hour at 4 ° C, the extract was centrifuged at 12,000 x g for 15 minutes and the precipitate, devoid of activity 1,3-? -Glucanase, was discarded The supernatant was brought to 85% saturation with ammonium sulfate and left 1 hour under stirring at 4 ° C. It was after centrifuged at 15,000 x g for 20 minutes at 4 ° C and the precipitate obtained was saved as a source of the protein with activity 1,3-? -Glucanase. This precipitate was dissolved in 20 mM Tricine buffer pH 8.0 containing 10% glycerol. The resulting solution was desalted by ultrafiltration using a pore size membrane of 10,000 MW at 4 ° C. This final extract obtained presents a mixture of isoenzymes with activity 1,3-? -Glucanase containing 64% of the total activity and 80% of the specific activity contained in the previous stage.
A partir del extracto obtenido en la etapa anterior se aisló una proteína con actividad 1,3-\beta-glucanasa, con un elevado grado de pureza, mediante un protocolo que comprende las siguientes etapas:From the extract obtained in the stage above a protein with activity was isolated 1,3-? -Glucanase, with a high degree of purity, through a protocol that includes following stages:
Se utilizó una columna Mono-Q HR 5/5 (Amersham Biosciences) acoplada a un sistema de FPLC (Amersham Biosciences) y fue equilibrada con un tampón Tricina 20 mM pH 8.0 conteniendo glicerol al 10%. Se aplicó la muestra en la columna, tras filtrarla a través de un filtro de PVDF de 0,22 \mum. Ésta fue eluída utilizando el tampón de equilibrado con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M de 25 min y una velocidad de flujo de 1 ml\cdotmin^{-1}. Se monitorizó la absorbancia del eluído a 280 nm, recogiendo fracciones de 1 ml en las que posteriormente se valoró la actividad 1,3-\beta-glucanasa utilizando como sustrato laminarina (Sigma, EE.UU.). Las fracciones que presentaron actividad hidrolítica fueron reunidas, concentradas y disueltas en tampón BisTris-HCl 20 mM, pH 6,3 conteniendo glicerol al 10% mediante ultrafiltración (membrana YM10), denominándose fracción ácida.A Mono-Q HR column was used 5/5 (Amersham Biosciences) coupled to an FPLC system (Amersham Biosciences) and was equilibrated with a 20 mM Tricine buffer pH 8.0 containing 10% glycerol. The sample was applied in the column, after filtering through a 0.22 µm PVDF filter. This was eluted using the equilibration buffer with a gradient Linear NaCl from 0 to 1 M for 25 min and a flow rate of 1 ml • -1. The absorbance of the eluate at 280 was monitored nm, collecting fractions of 1 ml in which subsequently valued the activity 1,3-? -Glucanase using as a laminarin substrate (Sigma, USA). The fractions that presented hydrolytic activity were gathered, concentrated and dissolved in 20 mM BisTris-HCl buffer, pH 6.3 containing 10% glycerol by ultrafiltration (membrane YM10), being called acid fraction.
En esta etapa se utilizó una columna Mono-P HR 5/20 (Amersham Biosciences) acoplada a un sistema de FPLC (Amersham Biosciences) y fue equilibrada con un tampón BisTris-HCL 25 mM, pH 6,3, conteniendo glicerol al 10%. La separación de proteínas se llevó a cabo mediante un gradiente de pH de 6 a 4 durante de 49 minutos utilizando tampón Polybuffer 74-HCl (Amersham Biosciences) 10% (v/v), pH 4,0, con una velocidad de flujo de 0,8 ml\cdotmin^{-1}, recogiendo fracciones de 1 ml y valorando su pH con un pHmetro MicropH-2000 (Crison). Se midió la absorbancia del eluído a 280 nm y se examinó la presencia de isoformas 1,3-\beta-glucanasa ácidas mediante la determinación de su actividad enzimática utilizando laminarina (Sigma) como sustrato y por técnicas electroforéticas e inmunológicas.In this stage a column was used Mono-P HR 5/20 (Amersham Biosciences) coupled to a FPLC system (Amersham Biosciences) and was balanced with a BisTris-HCL buffer 25 mM, pH 6.3, containing 10% glycerol. Protein separation was carried out. by a pH gradient of 6 to 4 for 49 minutes using Polybuffer 74-HCl buffer (Amersham Biosciences) 10% (v / v), pH 4.0, with a flow rate of 0.8 ml • -1, collecting fractions of 1 ml and assessing its pH with a pH meter MicropH-2000 (Crison). The absorbance of the eluate at 280 nm and the presence of 1,3-? -glucanase isoforms acids by determining their enzymatic activity using laminarin (Sigma) as a substrate and by techniques electrophoretic and immunological.
Las fracciones activas fueron reunidas y concentradas y purificada posteriormente utilizando una columna Mono P HR 5/20 (Amersham Biosciences) acoplada a un sistema de FPLC (Amersham Biosciences), equilibrada con tampón BisTris-HCl 25 mM pH 6,3, mediante un gradiente isocrático de tampón Polybuffer 74-HCl (Amersham Biosciences, Suecia) 10% (v/v), pH 5.0 de 26 min y una velocidad de flujo de 1 ml\cdotmin^{-1}. Se monitorizó la absorbancia del eluído a 280 nm, recogiendo fracciones de 1 ml en las que posteriormente se valoró la actividad 1,3-\beta-glucanasa utilizando como sustrato laminarina (Sigma, EE.UU.). El análisis electroforético e inmunológico reveló la fracción que contenía aislada la proteína de la invención la cual se desaló y se liofilizó. Con el procedimiento de purificación descrito se obtuvo 0,18 mg de proteína de la invención con un factor de purificación de 17,8 y una recuperación del 1,4%.The active fractions were collected and concentrated and subsequently purified using a column Mono P HR 5/20 (Amersham Biosciences) coupled to an FPLC system (Amersham Biosciences), balanced with buffer BisTris-HCl 25 mM pH 6.3, using a gradient isocratic of Polybuffer 74-HCl buffer (Amersham Biosciences, Sweden) 10% (v / v), pH 5.0 of 26 min and a speed of flow of 1 ml · -1. The absorbance of the eluted at 280 nm, collecting 1 ml fractions in which the activity was subsequently assessed 1,3-? -Glucanase using as a laminarin substrate (Sigma, USA). The analysis electrophoretic and immunological revealed the fraction containing isolated the protein of the invention which was desalted and lyophilized. With the purification procedure described, it was obtained 0.18 mg of protein of the invention with a purification factor of 17.8 and a recovery of 1.4%.
La determinación de la pureza de la proteína se llevó a cabo mediante técnicas de electroforesis sobre geles de poliacrilamida en condiciones disociantes en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) con proteína no reducida y proteína reducida con 1,25% de \beta-mercaptoetanol. La presencia de una sola banda electroforética revela la pureza de la proteína de la invención purificada (Figura 1A). Los resultados muestran la naturaleza monomérica de la proteína y revelan que presenta una masa molecular de aproximadamente 19.200 Da (SDS-PAGE). La masa molecular de la proteína purificada se determinó por electroforesis desnaturalizante con un porcentaje de acrilamida de 13,5%, utilizando un patrón preteñido de proteínas de baja masa molecular: lisozima de huevo (18800 Da), inhibidor de tripsina de soja (28200 Da), anhidrasa carbónica bovina (37200 Da), ovoalbúmina de huevo (52300 Da), seroalbúmina bovina (93600 Da) y fosforilasa B de músculo de conejo (106900 Da). Posteriormente se construyó una curva de calibrado representando los valores del logaritmo de la masa molecular de cada proteína frente a sus movilidades electroforéticas relativas (R_{f}).The determination of protein purity is carried out by electrophoresis techniques on gels of polyacrylamide under dissociative conditions in the presence of dodecyl sodium sulfate (SDS-PAGE) with non-reduced protein and reduced protein with 1.25% of β-mercaptoethanol. The presence of only one electrophoretic band reveals the purity of the protein in the purified invention (Figure 1A). The results show the monomeric nature of the protein and reveal that it presents a molecular mass of approximately 19,200 Da (SDS-PAGE). The molecular mass of the protein purified was determined by denaturing electrophoresis with a 13.5% acrylamide percentage, using a pretended pattern of low molecular mass proteins: egg lysozyme (18800 Da), soy trypsin inhibitor (28200 Da), carbonic anhydrase bovine (37200 Da), egg ovalbumin (52300 Da), serum albumin bovine (93600 Da) and rabbit muscle phosphorylase B (106900 Da). Subsequently a calibration curve was constructed representing the logarithm values of the molecular mass of each protein against their relative electrophoretic mobility (R f).
Los ensayos de inmunodetección con anticuerpos policlonales frente a proteínas PR-2 de tabaco establecen que la proteína de la invención purificada de chirimoya está serológicamente ligada con 1,3-\beta-glucanasas de tabaco (véase Figura 1 B). La determinación de la presencia de glicoproteínas, basado en el protocolo de tinción PAS (ácido periódico-reactivo Schiff) usando concentraciones conocidas de la enzima peroxidasa de rábano (Sigma, EE.UU) como control positivo, reveló que la proteína de la invención es una glicoproteína (véase Figura 1C).Immunodetection antibody assays polyclonal against tobacco PR-2 proteins establish that the protein of the invention purified from custard apple is serologically linked with 1,3-? Tobacco glucanases (see Figure 1 B). The determination of the presence of glycoproteins, based on the PAS staining protocol (acid Periodic reagent Schiff) using concentrations known as horseradish peroxidase enzyme (Sigma, USA) as positive control, revealed that the protein of the invention is a glycoprotein (see Figure 1C).
El análisis por cromatoenfoque a pH 6-5 según se describe en el apartado 1.3.3. reveló que la proteína de la invención es una proteína ácida con un pI < 6, concretamente de 5,25.Chromato-focus analysis at pH 6-5 as described in section 1.3.3. revealed that the protein of the invention is an acidic protein with a p I <6, specifically 5.25.
La identificación se llevó a cabo mediante el análisis del mapa de la huella peptídica o peptide mass fingerprint (PMF), utilizando para ello espectrometría de masas, usando un MALDI-TOF/TOF 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems). Una vez obtenido el espectro de masas de los péptidos trípticos de la enzima 1,3-\beta-glucanasa ácida purificada, se compararon los datos de masa/carga de los péptidos resultantes con los descritos en las bases de datos. Esta identificación de las proteínas mediante la búsqueda de secuencias homólogas con el algoritmo MOWSE dio lugar a una serie de parámetros que reflejan la fiabilidad de la identificación como: el número de masas de péptidos obtenidos con MALDI-TOF y su correspondencia con las masas de los péptidos resultantes de digestiones teóricas de proteínas en las bases de datos (péptidos identificados), la probabilidad asociada a cada búsqueda (score)de homología con el algoritmo MOWSE en la base de datos NCBInr (P\leq0,05) y el porcentaje de secuencia de la proteína candidata que cubren las masas de los péptidos que se han podido identificar (cobertura de secuencia). De acuerdo al valor de estos parámetros, entre ellos 9 péptidos identificados, una probabilidad de homología de 82 y un porcentaje de cobertura de secuencia del 36%, la proteína purificada de chirimoya, con actividad 1,3-\beta-glucanasa-crioprotectora y reconocida por anticuerpos para esta enzima fue identificada con una endo-1,3-\beta-glucanasa básica (pI 9,68 y M_{r} 38.000 Da) de clase III procedente de Solanum lycopersicum L.(número de acceso base de datos NCBI para la proteína homóloga gi:498926).The identification was carried out by analyzing the map of the peptide fingerprint or peptide mass fingerprint (PMF), using mass spectrometry, using a MALDI-TOF / TOF 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems). Once the mass spectrum of the tryptic peptides of the purified acid 1,3-? -Glucanase enzyme was obtained, the mass / charge data of the resulting peptides were compared with those described in the databases. This identification of the proteins by searching for homologous sequences with the MOWSE algorithm resulted in a series of parameters that reflect the reliability of the identification such as: the number of peptide masses obtained with MALDI-TOF and their correspondence with the masses of the peptides resulting from theoretical protein digestions in the databases (identified peptides), the probability associated with each homology search with the MOWSE algorithm in the NCBInr database ( P ≤ 0.05) and the sequence percentage of the candidate protein that covers the masses of the peptides that have been identified (sequence coverage). According to the value of these parameters, including 9 identified peptides, a homology probability of 82 and a percentage of sequence coverage of 36%, the cherimoya purified protein, with activity 1,3-? -Glucanase-cryoprotectant and Antibody recognized for this enzyme was identified with a basic endo-1,3-? -glucanase (p I 9.68 and M r {38,000 Da) class III from Solanum lycopersicum L. (base access number of NCBI data for the homologous protein gi: 498926).
La actividad de la proteína 1,3-\beta-glucanasa-crioprotectora aislada de chirimoya, proporcionada por esta invención, se determinó por el siguiente método, modificado a partir del desarrollado por Dygert et al. (Dygert S, Li LH, Florida D, Thoma JA. 1965. Determination of reducing sugar with improved precision. Analytical Biochemistry, 13, 367-74) de determinación de azúcares reductores, utilizando como sustrato laminarina, un \beta-poliglucano con enlaces \beta-(1-3) y ramificaciones \beta-(1-6) procedente de Laminarina digitata (Sigma, EE.UU.).The activity of isolated 1,3-? -Glucanase-cryoprotectant protein isolated from cherimoya, provided by this invention, was determined by the following method, modified from that developed by Dygert et al . (Dygert S, Li LH, Florida D, Thoma JA. 1965. Determination of reducing sugar with improved precision. Analytical Biochemistry, 13, 367-74) for determining reducing sugars, using as a laminar substrate, a β-polyglucan with bonds β- (1-3) and ramifications β- (1-6) from Laminarin digitata (Sigma, USA).
El sustrato se preparó en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5,0 a 0,167% (p/v), almacenando la mezcla a 4ºC. La mezcla de reacción, en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5,0, contenía 300 \mul de sustrato y 50 \mul de muestra, llevándola a un volumen total de 500 \mul. Las muestras se incubaron a 37ºC en agitación durante 6 h, deteniendo la reacción con la adición de 40 \mul de NaOH 2 N y mantenidas en hielo durante 10 min. Los azúcares reductores hidrolizados desde el sustrato fueron determinados al añadir a la mezcla 5 ml de reactivo A (4,0 g Na_{2}CO_{3}, 1,6 g glicina y 45 mg CuSO_{4}\cdot5H_{2}O disueltos en 100 ml de agua ultrapura) y 5 ml de reactivo B (0,12% [p/v] neocuproino-HCl [Sigma, EE.UU.]). La solución resultante fue hervida al baño maría durante 10 minutos, registrándose la absorbancia a 450 nm de la mezcla tras su dilución con agua ultrapura hasta un volumen total de 25 ml. La cantidad de azúcares reductores liberados se estimó a partir de una curva de calibrado realizada con cantidades crecientes de glucosa (Sigma, EE.UU.). Una unidad (U) de actividad 1,3-\beta-glucanasa fue establecida como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 \mumol de glucosa por minuto.The substrate was prepared in sodium acetate buffer 100 mM, pH 5.0 to 0.167% (w / v), storing the mixture at 4 ° C. The reaction mixture, in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.0, it contained 300 µl of substrate and 50 µl of sample, taking it at a total volume of 500 µl. The samples were incubated at 37 ° C under stirring for 6 h, stopping the reaction with the addition of 40 µL of 2 N NaOH and kept on ice for 10 min. The reducing sugars hydrolyzed from the substrate were determined by adding 5 ml of reagent A (4.0 g to the mixture) Na 2 CO 3, 1.6 g glycine and 45 mg CuSO 4 · 5H 2 O dissolved in 100 ml of ultrapure water) and 5 ml of reagent B (0.12% [p / v] neocuproino-HCl [Sigma, USA]). The solution resulting was boiled in a water bath for 10 minutes, registering the absorbance at 450 nm of the mixture after dilution with ultrapure water up to a total volume of 25 ml. The amount of reducing sugars released was estimated from a curve of Calibration performed with increasing amounts of glucose (Sigma, USA.). One unit (U) of activity 1,3-? -Glucanase was set as the amount of enzyme needed to produce 1 um of glucose per minute.
La concentración de proteína (mg\cdotml^{-1}) fue determinada con el método de Bradford. La combinación de ambas técnicas permitió calcular los valores de actividad específica (U\cdotmg^{-1}) de la enzima con actividad 1,3-\beta-glucanasa-crioprotectora. La proteína de la invención purificada presenta una actividad total de 3,5 U y una actividad específica de 19,0 U\cdotmg^{-1}.Protein concentration (mg · -1) was determined with the Bradford method. The combination of both techniques allowed to calculate the values of specific activity (U • mg) of the enzyme with activity 1,3-? -Glucanase-cryoprotectant. The purified invention protein has a total activity of 3.5 U and a specific activity of 19.0 U · -1.
Los datos cinéticos (K_{m}, k_{cat} y k_{cat}/K_{m}) obtenidos frente a laminarina mostraron que la proteína purificada de la invención presenta un valor para la constante de afinidad (K_{m}) de 80 \muM y para la constante catalítica (k_{cat}) de 3,1 s^{-1}, con un valor de eficiencia catalítica (k_{cat}/K_{m})de 38,3 s^{-1} mM^{-1} en ensayos estándar in vitro. Además, el valor estimado de la k_{cat} para la proteína de la invención a una temperatura de 5ºC es 2,5 s^{-1}mM^{-1} del orden del 80% del valor estimado en el ensayo estándar in vitro a 37ºC, siendo por ello una enzima hidrolíticamente activa a bajas temperaturas.The kinetic data (K m, k cat and k cat / K m) obtained against laminarin showed that the purified protein of the invention has a value for the affinity constant (K m ) of 80 µM and for the catalytic constant ( k cat) of 3.1 s -1, with a catalytic efficiency value ( k cat / K m) of 38, 3 s -1 mM -1 in standard in vitro assays . In addition, the estimated value of the k cat for the protein of the invention at a temperature of 5 ° C is 2.5 s -1 mM -1 on the order of 80% of the estimated value in the assay standard in vitro at 37 ° C, being therefore a hydrolytically active enzyme at low temperatures.
Una forma de distinguir entre las diferentes clases de 1,3-\beta-glucanasa es determinar su mecanismo de hidrólisis comparando sus actividades frente a diferentes sustratos como laminarina oxidada con periodato potásico, sustrato de glucanasas y p-nitrofenil-\beta-D-glucósido, sólo hidrolizado por exo-1,3-\beta-glucanasas. Además se utilizó \delta-gluconolactona, un eficaz inhibidor de ciertas exo-1,3-\beta-glucanasas y \beta-glucosidasas.One way to distinguish between the different classes of 1,3-? -Glucanase is to determine its hydrolysis mechanism by comparing its activities against different substrates such as oxidized laminarin with potassium periodate, glucanase substrate and p- nitrophenyl-? -D- glycoside, only hydrolyzed by exo-1,3-? -glucanases. In addition δ-gluconolactone, an effective inhibitor of certain exo-1,3-? -Glucanases and? -Glucosidases, was used.
El ensayo con laminarina oxidada con periodato potásico se realizó en las mismas condiciones que las reflejadas en el apartado 2.3., utilizando 50 ng de la enzima purificada. El ensayo con p-nitrofenil-\beta-D-glucósido (Sigma, EE.UU.) se efectuó incubando a 37ºC durante 6 h una mezcla de reacción que contiene 0,25% (p/v) del sustrato y 50 ng de la enzima en un volumen total de 0,5 ml de tampón acetato sódico 100 mM, pH 5,0. La reacción se paró con la adición de 200 \mul de Na_{2}CO_{3} 0,2 M, midiendo la absorbancia a 410 nm frente a preparó una curva de calibrado con p-nitrofenol (Sigma, EE.UU.) disuelto en un blanco externo con el fin de cuantificar el p-nitrofenol liberado al medio. Se tampón glicina-NaOH 100 mM, pH 11,5 para 0, 20, 40, 60, 80 y 100 \muM. Para el ensayo con \beta-gluconolactona (Sigma) tanto las condiciones de reacción como el sustrato utilizado fueron las establecidas en el ensayo estándar, añadiendo concentraciones crecientes del sustrato entre 0,5 y 30 mM.The test with oxidized laminarin with potassium periodate was carried out under the same conditions as those reflected in section 2.3., Using 50 ng of the purified enzyme. The test with p- nitrophenyl-? -D-glucoside (Sigma, USA) was carried out by incubating at 37 ° C for 6 h a reaction mixture containing 0.25% (w / v) of the substrate and 50 ng of the enzyme in a total volume of 0.5 ml of 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.0. The reaction was stopped with the addition of 200 µL of 0.2 M Na 2 CO 3, measuring absorbance at 410 nm versus preparing a calibration curve with p-nitrophenol (Sigma, USA) dissolved in an external blank in order to quantify the p- nitrophenol released into the medium. 100 mM glycine-NaOH buffer, pH 11.5 for 0.20, 40, 60, 80 and 100 µM. For the test with β-gluconolactone (Sigma) both the reaction conditions and the substrate used were those established in the standard test, adding increasing concentrations of the substrate between 0.5 and 30 mM.
Los datos obtenidos en los que se determinó que la actividad específica presentada por la proteína purificada de la invención era del orden del 98% de la obtenida con laminarina para laminarina oxidada y del 0,2% para p-nitrofenil-\beta-D-glucósido, no siendo inhibida por \beta-gluconolactona, permiten concluir que la proteína de la invención degrada moléculas que contienen enlaces 1,3-\beta-glicosídicos mediante un mecanismo endohidrolítico.The data obtained in which it was determined that the specific activity presented by the purified protein of the invention was of the order of 98% of that obtained with laminarin for oxidized laminarin and 0.2% for p- nitrophenyl-? -D- glycoside, not being inhibited by β-gluconolactone, allows us to conclude that the protein of the invention degrades molecules containing 1,3-? -glycosidic bonds by an endohydrolytic mechanism.
El intervalo de pH óptimo al cual la proteína 1,3-\beta-glucanasa-crioprotectora muestra su máxima actividad fue examinado usando el mismo medio de reacción que el utilizado en el Ejemplo 2.3. pero se utilizaron diferentes tampones para los diferentes intervalos de pH:The optimum pH range at which the protein 1,3-? -Glucanase-cryoprotectant shows its maximum activity was examined using the same means of reaction as used in Example 2.3. but they were used Different buffers for different pH ranges:
tampón ácido fosfórico 100 mM para pH 2,0100 mM phosphoric acid buffer for pH 2.0
tampón glicina-HCl 100 mM para pH 3,0100 mM glycine-HCl buffer for pH 3.0
tampón acetato sódico 100 mM para pH 4,0-6,0100 mM sodium acetate buffer for pH 4.0-6.0
tampón fosfato sódico 100 mM para pH 6,5-7,0100 mM sodium phosphate buffer for pH 6.5-7.0
tampón Tris-HCl 100 mm para pH 9,0100 mm Tris-HCl buffer for pH 9.0
tampón glicina-NaOH para pH 11,0-13,0glycine-NaOH buffer for pH 11.0-13.0
El resultado obtenido fue expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al máximo de actividad obtenida. La proteína de la invención tiene un pH óptimo de 5,0 aproximadamente, una actividad relativa superior al 50% entre pH 3,0 y 7,0 aproximadamente, reteniendo más de un 20% de su actividad máxima a pH 2 (Figura 2A).The result obtained was expressed as percentage of relative activity with respect to the maximum activity obtained. The protein of the invention has an optimum pH of 5.0 approximately, a relative activity greater than 50% between pH 3.0 and 7.0 approximately, retaining more than 20% of its activity maximum at pH 2 (Figure 2A).
Para el ensayo de la estabilidad frente al pH de la proteína purificada en la invención se midió la actividad 1,3-\beta-glucanasa residual después de la incubación durante 2 horas a diferentes valores de pH y se utilizaron para ello los tampones descritos en el Ejemplo 2.5, a 37ºC en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5,0, siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.3. El resultado fue expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al máximo de actividad obtenida. La proteína de la invención es muy estable a valores de pH ácidos-neutros, mostrando después de 2 horas más del 80% de actividad relativa entre pH 2,0 y 6,0 aproximadamente (Figura 2B).For the pH stability test of the purified protein in the invention activity was measured 1,3-? Residual glucanase after incubation for 2 hours at different pH values and the buffers described in Example 2.5 were used for this, at 37 ° C in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.0, following the procedure described in Example 2.3. The result was expressed as a percentage of relative activity with respect to the maximum of activity obtained. The protein of the invention is very stable at acid-neutral pH values, showing after 2 hours over 80% relative activity between pH 2.0 and 6.0 approximately (Figure 2B).
La actividad de la proteína de la invención se midió en un intervalo de temperatura comprendido entre 5ºC y 80ºC siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.3. El resultado fue expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al máximo de actividad obtenida. La proteína de la invención presenta una temperatura óptima a aproximadamente 40ºC y una actividad relativa superior al 40% entre 5ºC y 50ºC aproximadamente, siendo inactivada rápidamente a moderada-alta temperatura (Figura 2C). La determinación del valor de energía de activación (E_{a}) entre 5 y 37ºC estableció que la proteína de la invención presenta un valor muy bajo, del orden de 6,99 kJ\cdotmol^{-1}, comparada con la mayor parte de las hidrolasas (Dicko MH, Searle-van Leeuwen MJ, Traore AS, Hilhorst R, Beldman G. 2001. Polysaccharide hydrolases from leaves of Boscia senegalensis: properties of endo(1,3)-beta-D-glucanase. Applied Biochemistry and Biotechnology, 94, 225-241).The activity of the protein of the invention was measured in a temperature range between 5 ° C and 80 ° C following the procedure described in Example 2.3. The result was expressed as a percentage of relative activity with respect to the maximum activity obtained. The protein of the invention has an optimum temperature at about 40 ° C and a relative activity greater than 40% between about 5 ° C and 50 ° C, being rapidly inactivated at moderate-high temperature (Figure 2C). The determination of the activation energy value ( E a) between 5 and 37 ° C established that the protein of the invention has a very low value, of the order of 6.99 kJ • -1, compared with the most hydrolases (Dicko MH, Searle-van Leeuwen MJ, Traore AS, Hilhorst R, Beldman G. 2001. Polysaccharide hydrolases from leaves of Boscia senegalensis : properties of endo (1,3) -beta-D-glucanase. Applied Biochemistry and Biotechnology, 94, 225-241).
Para el ensayo de la estabilidad térmica de la proteína purificada en la invención se midió la actividad 1,3-\beta-glucanasa residual después de la incubación durante 2 horas a diferentes temperaturas, entre 5ºC y 80ºC, siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.3. El resultado fue expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al máximo de actividad obtenida. La proteína de la invención mantiene una actividad relativa de más del 80% después de 2 h entre 5ºC y 60ºC, perdiendo rápidamente su estabilidad a temperaturas superiores (Figura 2D).For the thermal stability test of the purified protein in the invention activity was measured 1,3-? Residual glucanase after incubation for 2 hours at different temperatures, between 5 ° C and 80 ° C, following the procedure described in the Example 2.3. The result was expressed as a percentage of activity. relative to the maximum activity obtained. Protein the invention maintains a relative activity of more than 80% after 2 h between 5ºC and 60ºC, quickly losing its stability at higher temperatures (Figure 2D).
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El ensayo de la actividad crioprotectora in vitro se realizó según el método descrito por Lin y Thomashow (Lin C, Thomashow MF. 1992. A cold-regulated arabidopsis gen encodes a polypeptide having potent cryoprotective activity. Biochemical and Biophysical Research Communications, 183, 1103-1108.) utilizando una proteína sensible a la congelación-descongelación como la enzima lactato deshidrogenasa V-S de músculo de conejo (LDH, EC 1.1.1.23; Sigma). Para ello se preparó una solución madre de la enzima LDH comercial 0,02 \mug\cdot\mul^{-1} que fue dializada toda la noche frente a 20 mM de tampón fosfato sódico pH 7,5. Se utilizaron mezclas con 3,2 \mug de LDH de la solución madre y cantidades crecientes de la proteína de la invención purificada a homogeneidad (0,04-50 \mug\cdot\mul^{-1}) o extractos semipurificados (20-80 \mug\cdot\mul^{-1}), de la proteína crioprotectora control seroalbúmina bovina V (0,04-205 \mug\cdot\mul^{-1}, Sigma) o sacarosa (0,04-205 \mug\cdot\mul^{-1}) y un volumen final de 250 \mul. La disolución resultante fue congelada en nitrógeno líquido durante 30 segundos y dejada descongelar a temperatura ambiente durante 5 minutos. El proceso de congelación-descongelación fue llevado a cabo dos veces, midiendo posteriormente la actividad LDH residual.The in vitro cryoprotective activity assay was performed according to the method described by Lin and Thomashow (Lin C, Thomashow MF. 1992. A cold-regulated arabidopsis gene encodes a polypeptide having potent cryoprotective activity. Biochemical and Biophysical Research Communications, 183, 1103 -1108.) Using a freeze-thaw sensitive protein such as rabbit lactate dehydrogenase enzyme VS (LDH, EC 1.1.1.23; Sigma). For this purpose, a stock solution of the commercial LDH enzyme 0.02 µg? -1 was prepared which was dialyzed overnight against 20 mM pH 7.5 sodium phosphate buffer. Mixtures with 3.2 µl of LDH of the stock solution and increasing amounts of the protein of the invention purified to homogeneity (0.04-50 µg mul -1) or semi-purified extracts (20) were used -80? Mug \ mul <-1>), of the bovine seroalbumin control cryoprotectant protein V (0.04-205? Mug \ mul -1, Sigma) or sucrose (0.04- 205 \ mug \ cdot \ mul -1) and a final volume of 250 µl. The resulting solution was frozen in liquid nitrogen for 30 seconds and allowed to defrost at room temperature for 5 minutes. The freeze-thaw process was carried out twice, subsequently measuring residual LDH activity.
La actividad LDH fue ensayada añadiendo 50 \mul de las muestras anteriores al tampón de ensayo (80 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl; 2 mM ácido pirúvico y 0,3 mM NADH) a temperatura ambiente y en un volumen final de 2 ml. La aparición de NAD^{+} fue cuantificada registrando el descenso de absorbancia a 340 nm a temperatura ambiente durante 3 minutos en un espectrofotómetro convencional. Así mismo se midió la actividad enzimática de dos controles con LDH en tampón 20 mM fosfato potásico, y a pH 7,5: uno sometido al proceso de congelación-descongelación y otro que no. Los datos de actividad crioprotectora se mostraron como el porcentaje de actividad residual frente al control no congelado. Cuando la LDH fue sometida a dos procesos de congelación-descongelación perdió aproximadamente más del 95% de la actividad.LDH activity was assayed by adding 50 µl of the samples before the test buffer (80 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl; 2 mM pyruvic acid and 0.3 mM NADH) at room temperature and in a final volume of 2 ml. The appearance of NAD + was quantified by recording the decrease absorbance at 340 nm at room temperature for 3 minutes in a conventional spectrophotometer. The activity was also measured Two controls enzyme with LDH in 20 mM phosphate buffer potassium, and at pH 7.5: one undergoing the process of freeze-thaw and another that doesn't. The data of cryoprotective activity were shown as the percentage of residual activity versus non-frozen control. When the LDH was subjected to two processes of freeze-thaw lost approximately more than 95% of the activity.
El ensayo con extractos semipurificados de la proteína de la invención (20-80 \mug\cdot\mul^{-1}) obtenidos como de describe en el Ejemplo 1.2. o 1.3.1. (fracción ácida) reveló que son aproximadamente 2 veces más activos como crioprotectores que la proteína control BSA, hallándose una proporcionalidad entre la capacidad crioprotectora del extracto semipurificado y la concentración de proteína añadida.The test with semi-purified extracts of the protein of the invention (20-80 \ mug \ cdot \ mul -1) obtained as described in the Example 1.2. or 1.3.1. (acid fraction) revealed that they are approximately 2 times more active as cryoprotectants than the BSA control protein, finding a proportionality between the cryoprotective capacity of semi-purified extract and protein concentration added.
Cuando el ensayo fue realizado con diferentes concentraciones de la proteína de la invención purificada, la actividad crioprotectora incrementó, siendo muy superior a la actividad crioprotectora de BSA en el rango de concentraciones ensayado (Figura 3). La determinación de la concentración de proteína crioprotectora necesaria para alcanzar un porcentaje de actividad LDH residual del 50% (valor C_{50}) se obtiene con la representación semilogarítmica del porcentaje de actividad LDH residual frente a la concentración de la proteína de la invención con actividad crioprotectora. Usando este procedimiento, LDH retiene un 50% de sus propiedades catalíticas cuando 8,7 \mug\cdot\mul^{-1} de la proteína 1,3-\beta-glucanasa-crioprotectora de la invención fue añadida frente a los 80,3 \mug\cdot\mul^{-1} de BSA necesarios. Siendo del orden de 9 veces más crioprotectora la proteína de la invención que la proteína crioprotectora control BSA.When the trial was performed with different concentrations of the protein of the purified invention, the cryoprotective activity increased, being much higher than the BSA cryoprotective activity in the concentration range tested (Figure 3). The determination of the concentration of cryoprotective protein necessary to reach a percentage of 50% residual LDH activity (C50 value) is obtained with the semi-logarithmic representation of the percentage of LDH activity residual against the concentration of the protein of the invention with cryoprotective activity. Using this procedure, LDH retains 50% of its catalytic properties when 8.7 \ mug \ cdot \ mul -1 of the protein 1,3-? -Glucanase-cryoprotectant of the invention was added against 80.3 BSA \ mug \ cdot \ mul - 1 needed. Being of the order of 9 times the cryoprotectant the protein of the invention than the protein BSA control cryoprotectant.
Claims (14)
- --
- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad 1-3-\beta-glucanasa,He fractionation begins with a first protein precipitation at low concentration of ammonium sulfate between 10% and 30%, preferably with 20%, obtaining an enriched supernatant in activity 1-3-? -Glucanase,
- --
- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,gradually saturating with sulfate ammonium until reaching a concentration of 80% and 90%, preferably 85%,
- --
- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,washed and ultrafiltrate of the precipitate, for example, by a membrane of 10,000 MW,
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
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-
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