ES2334741A1 - Proteina crioprotectora con actividad quitinasa a bajas temperaturas, procedimiento para su obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Proteína crioprotectora con actividad quitinasa a bajas temperaturas, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones. La presente invención describe una nueva proteína quitinasa biológicamente activa a bajas temperaturas, estable en un amplio rango de pH y altamente crioprotectora. Además, se incluye el método para la producción, el aislamiento y purificación de dicha proteína y su uso en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y en procesos de degradación o modificación de materiales que contienen quitina en condiciones que requieran bajas temperaturas. Esta proteína quitinasa puede utilizarse en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación para su almacenamiento y distribución en forma congelada o liofilizada, así como para la degradación o modificación de materiales que contienen quitina en condiciones que requieran bajas temperaturas o inactivación a moderada-alta temperatura.
Description
Proteína crioprotectora con actividad quitinasa
a bajas temperaturas, procedimiento para su obtención y sus
aplicaciones.
La presente invención se encuadra en el sector
Biotecnológico, más concretamente en la crioprotección de proteínas
sensibles a la congelación-descongelación y su
aplicación en la industria alimentaria (proteínas estructurales o
solubles), médica (crioconservación de células y tejidos vivos) y
farmacéutica (proteínas con actividad biológica), así como en
biocatálisis, biorremediación, biocontrol y conservación de
alimentos.
Las proteínas quitinasas hidrolizan quitina, un
polisacárido lineal que consiste en unidades de
N-acetil-D-glucosamina
(GIcNAc) unidas por enlaces \beta (I-4)
glucosídicos. Cuando la quitina está desacetilada recibe el nombre
de quitosan.
La quitina es el polímero más abundante que
contiene nitrógeno y el segundo biopolímero más abundante de la
tierra, siendo una fuente vital de nitrógeno esencial para el
crecimiento y supervivencia de ecosistemas marinos y terrestres. Es
un polímero natural constituyente principal de la pared celular de
los hongos, del exoesqueleto de insectos y otros artrópodos, y en
algunos otros animales. Por tanto las quitinasas, son esenciales
para los organismos que contienen en sus estructuras quitina
(hongos, insectos, crustáceos, etc.) y así mismo son utilizadas por
muchas bacterias que utilizan la quitina como una fuente de carbono
y de energía (Neuhaus J. 1999. Plant chitinases
(PR-3, PR-4, PR-8,
PR-11),In: Pathogenesis-related
Proteins in Plants. Datta,S.K., Muthukrishnan, S. (Eds.).
Boca-Raton, Florida, CRC Press, pp.
77-105).
Existen múltiples formas de quitinasas en la
naturaleza producidas con el fin de degradar el polímero de quitina
para su completa degradación en
N-acetil-D-glucosamina. En el
caso de las bacterias, éstas cuando se encuentran en presencia de
quitina producen y secretan enzimas quitinolíticas que digieren la
quitina reduciéndola en azúcares simples y amonio. Las bacterias
contienen receptores específicos para los azúcares simples
procedentes de la degradación de la quitina, de tal manera que
éstas proliferan en aquellos lugares donde hay quitina, por lo que
al descender su concentración o los organismos que la producen
disminuyen por tanto su carga bacteriana.
Las plantas a su vez producen enzimas
quitinolíticas como proteínas de defensa frente a patógenos,
especialmente frente a hongos. Las enzimas quitinolíticas con
conocida actividad antifúngica son mayoritariamente endoquitinasas
(Kasprzewska, A. 2003. Plant chitinases. Regulation and function.
Cellular and Molecular Biology Letters, 8,
809-824).
Además de su interés académico y fisiológico,
las quitinasas son ampliamente utilizadas en procesos de
biorremediación y son frecuentemente consideradas críticas, junto
con proteasas, glucanasas y celulasas, en el biocontrol de hongos
fitopatógenos (Deshpande MV. 1986. Enzymatic degradation of chitin
& its biological applications. Journal of Scientific and
Industrial Research, 45, 273-281., 1986; Fuglsang
CC, Johansen C, Christgau S, Adler-Nissen J. 1995.
Antimicrobial enzymes: applications and future potential in the
food industry. Trends in Food Science & Technology, December, 6,
390-396. et al., 1995). Las quitinasas
ocupan una posición única en la agricultura biotecnológica por su
acción antifúngica ya que su actividad lítica inhibe el desarrollo
de hongos al degradar componentes clave de la pared celular.
Por todo lo anteriormente expuesto las
quitinasas juegan una función vital en la industria relacionada con
la agricultura y en el campo médico, además, también son
fundamentales en la industria de alimentos marinos para la
degradación de desechos quitinosos de crustáceos o ejerciendo su
efecto sobre hongos y bacterias que contaminan y deterioran
alimentos conservados a bajas temperaturas.
Por tanto, la actividad y estabilidad de estas
enzimas en diferentes condiciones de pH y temperatura son
parámetros esenciales que determinan su viabilidad económica en
procesos industriales. Así, una alta estabilidad está generalmente
considerada como una ventaja económica porque reduce la cantidad de
enzima mínima catalíticamente útil (turnover). Con el fin de
aumentar la estabilidad de las quitinasas se han empleado múltiples
y diferentes estrategias tales como: mutaciones, modificación
química del centro activo, introducción de puentes disulfuro,
inmovilizaciones de las enzimas, estabilización entrópica, cambio
de condiciones del pH y el uso de diferentes sales. Conocer los
datos termodinámicos de las enzimas y su reacción de catálisis es
esencial para predecir el ámbito de la reacción y la posición de
cualquier proceso en el cual la reacción se produce.
Para conocer la estabilidad de una enzima es
esencial previamente determinar su actividad residual y el valor de
energía libre de estabilización a una temperatura definida, a fin
de asegurar la viabilidad económica y técnica para su uso en
procesos industriales. Recientemente se están estudiando un nuevo
grupo de enzimas llamadas "enzimas adaptadas al frío"
(cold-adapted enzymes) las cuales son muy
interesantes para la industria porque muestran una alta eficiencia
catalítica a bajas temperaturas presentando además un valor bajo de
energía de activación (E_{a}). Otra peculiaridad que tienen
es que se encuentran en general, si no siempre, asociadas a una
alta termosensibilidad, lo que permite el control de la reacción
enzimática a través de su inactivación por calor fácilmente, a
relativa moderada temperatura. Así mismo, este nuevo grupo de
enzimas ofrecen un considerable espectro de aplicación en diferentes
procesos industriales, como por ejemplo, en la elaboración de
detergentes, en la industria alimentaria, en la síntesis de
productos químicos de alta pureza y en biorremediación (Gerday C,
Aittaleb M, Bentahir M, Chessa J, Claverie P, Collins T, D'Amico S,
Dumont J, Garsoux G, Georlette D, Hoyoux A, Lonhienne T, Meuwis M,
Feller G. 2000. Cold-adapted enzymes: from
fundamentals to biotechnology. Trends in Biotechnology, 18,
103-107 et al., 2000).
A pesar de su potencial aplicación
biotecnológica, muy pocas enzimas activas a baja temperatura están
siendo utilizadas comercialmente, tan sólo una lipasa, una
lisozima, una celulasa, varias proteasas, entre otras (Cavicchioli
R, Siddiqui KS, Andrews D, Sowers KR. 2002.
Low-temperature extremophiles and their
applications. Current Opinion in Biotechnology, 13,
253-261).
En relación a las solicitudes de patentes sobre
estas enzimas hay tres documentos sobre proteasas adaptadas a bajas
temperaturas: una proteasa alcalina para su uso como detergente
procedente de un actinomiceto (WO 9,743,406; 1996) y dos proteasas
procedentes de bacterias CP-58 (WO 9,730,172; 1997)
y CP-70 (U.S. 6,200,793; 1998), y una
\beta-galactosidasa activa por debajo de 8ºC
procedente de una bacteria Antártica (Patente U.S. 6,727,084;
2001). Este tipo de proteínas son producidas, hasta ahora, por
microorganismos adaptados al frío u organismos psicrofílicos,
capaces de vivir a temperaturas por debajo de los 5ºC,
encontrándose su temperatura óptima de desarrollo entre 4ºC y 15ºC
y las estrategias utilizadas hasta ahora para la obtención de este
tipo de enzimas han sido el clonaje y la expresión en E.
coli, creciendo a baja temperatura, de genes que codifican
enzimas adaptadas al frío procedente de bacterias Antárticas.
La utilización de microorganismos psicrófilos en
los alimentos podría reemplazar a los conservantes químicos al
disminuir o eliminar aquellos metabolitos requeridos por otros
microorganismos no deseables. La presencia de los microorganismos
en alimentos no es aceptable, por lo que una alternativa a este
problema sería la adición de enzimas activas a baja temperatura de
origen natural y debido al gran interés industrial que despierta
este tipo de proteínas con alta actividad a bajas temperaturas, ha
dado lugar a la búsqueda de nuevas fuentes naturales de proteínas
más resistentes a la inactivación por bajas temperaturas.
Sin embargo, estas enzimas adaptadas al frío son
un caso excepcional dentro de las proteínas, ya que en general
todas las clases de proteínas, y especialmente las enzimas, pierden
su actividad biológica fuera de un relativamente estrecho rango de
temperatura.
Las enzimas son polipéptidos producidos por las
células de los seres vivos que catalizan una específica reacción
bioquímica a la temperatura del cuerpo. Las proteínas no sólo son
importantes para la función y regulación de los organismos vivos
sino que también son útiles agentes farmacéuticos, por lo que es
necesaria su refrigeración en forma soluble para mantener su
actividad biológica hasta el momento de ser administrada a los
pacientes o para pruebas de diagnóstico clínico. Sin embargo, un
problema que plantea la refrigeración de las proteínas es que se
vuelven inestables y llegan a perder alguna de sus actividades. La
opción de congelación y posterior descongelación para dotarlas de
una más extensa vida útil normalmente disminuye la actividad
biológica de las mismas.
Para solucionar el problema de pérdida de
actividad biológica de las proteínas debido a su refrigeración o
congelación los esfuerzos se han dirigido hacia la búsqueda de vías
de protección después de ser congeladas o liofilizadas. En la
actualidad se utilizan varios tipos de sustancias crioprotectoras
como: dimetilsulfóxido, glicerol, soluciones salino/glucosadas
(glucosa, manitol, sorbitol), hidroxietilalmidón y proteínas (como
seroalbúmina). Entre las patentes relacionadas con el tema existe
una patente americana U.S. 4,806,343 que describe un método para
proteger la actividad de biológica de proteínas después de la
congelación exponiéndola previamente a carbohidratos y cationes no
metálicos. Por otro lado, la patente japonesa JP 2001139599
reivindica una sustancia crioprotectora procedente de un
microorganismo.
Las proteínas crioprotectoras, de forma
individual o mezclada con otros crioprotectores, son empleadas en
la crioconservación de material biológico vivo a bajas
temperaturas. En la patente WO 2007/033488 se describe el uso de un
extracto vegetal conteniendo proteínas para la crioconservación de
moléculas, orgánulos, células, tejidos y órganos. Además, las
proteínas con actividad crioprotectora pueden ser de gran utilidad
al proteger a otras proteínas sensibles de la desnaturalización en
el proceso de congelación-descongelación dentro de
los alimentos. En este campo, el principal inconveniente derivado
del uso de nuevas proteínas crioprotectoras en alimentos congelados
está relacionado con el origen de las mismas. Los requerimientos de
seguridad y de aceptación por el consumidor, apuntan hacia
productos naturales u orgánicos, en contra de aditivos y productos
químicos o materiales modificados genética-
mente.
mente.
En general son escasas las fuentes conocidas de
proteínas con actividad crioprotectora. En vegetales, son pocas las
clases de proteínas que presentan esta actividad, siendo
principalmente proteínas inducidas por frío, sin actividad
biológica, mayoritariamente dehidrinas coma P-80 y
DHN5 en hojas de cebada, PCA60 en tejidos de la corteza de
melocotón, CuCOR19 en hojas de cítricos, etc. y alguna proteína de
la familia de proteínas PRs como una taumatina (PR5) en hojas de
cacahuete (Bravo L.A, Gallardo J, Navarrete A, Olave N, Martínez J,
Alberdi M, Close TJ, Corcuera LJ. 2003. Cryoprotective activity of a
cold-induced dehydrin purified from barley.
Physiologia Plantarum, 118, 262-269.), siendo todas
ellas del orden de 4 a 30 veces más activas como proteínas
crioprotectoras que la seroalbúmina bovina (BSA) utilizada como
proteína crioprotectora control. También, se han descrito dos
1,3-\beta-glucanasas (PR2) básica
de clase I, una recombinate procedente de uvas con una actividad
crioprotectora similar al BSA (Romero I,
Fernández-Caballero C, Goñi O, Escribano MI,
Merodio C, Sanchez-Ballesta MT. 2008. Functionality
of class I beta-1,3-glucanase from
skin of table grapes berries. Plant Science, 174,
641-648.) y la otra, procedente de cultivos de
hojas de tabaco, crioactiva en ensayos in vitro con
tilacoides (Hincha DK, Meins F, Schmitt JM 1997.
\beta-1,3-Glucanase is
cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during
cold acclimation. Plant Physiology,
114:1077-1083.).
Consecuentemente, hay una creciente demanda de
proteínas crioprotectoras efectivas que sean, o que pueda
considerarse que son, naturales. Si tales materiales derivan de
fuentes que históricamente han sido consumidas por el ser humano,
hay credibilidad razonable de que, muy probablemente, son seguros y
además se permite reducir la necesidad de ensayos extensos y caros
de toxicidad.
Actualmente es muy difícil proporcionar a la
Industria alimentaria, médica y farmacéutica de nuevas fuentes
naturales de proteínas que actúen a muy baja concentración como
crioprotector para por ejemplo el almacenamiento y distribución de
proteínas con actividad biológica en forma congelada o liofilizada
y que una vez descongelada o rehidratada la proteína pueda ser
administrada directamente a un animal o paciente sin remover el
crioprotector. Además, en biocatálisis, biorremediación, biocontrol
y conservación de alimentos sanos en condiciones que requieran
bajas temperaturas son requeridas proteínas que desarrollen una
alta actividad hidrolítica a bajas temperaturas, que sean estables
en un amplio rango de pH y con control de su inactivación a moderada
alta temperatura.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto de la invención lo constituye una
proteína quitinasa con actividad crioprotectora, en adelante
proteína de la invención, aislada de la pulpa de chirimoya
(Annona cherimola Mill) constituida por una proteína
monomérica con una masa molecular de 14.500 Da, y un punto
isoeléctrico (p/) mayor o igual a 8,26, de naturaleza endoquitinasa
con una constante catalítica (k_{cat}) mayor de 5,
preferentemente mayor de 6,8 s^{-1} y una eficiencia catalítica
(k_{cat}/K_{m}) mayor de 35 preferentemente mayor 38,7
s^{-1} mM^{-1}, catalíticamente activa en un rango de pH de 4 a
9, estable en un amplio rango de pH, de 2,0 a 11,0, termosensible a
temperaturas superiores a 45ºC y con una energía de activación
(E_{a}) de 11,32 kJ\cdotmol^{-1}, además de ser
quitinolíticamente activa a bajas temperaturas y presentando un
valor C_{50} de actividad crioprotectora de 6,4
\mug\cdotml^{-1}.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
procedimiento de aislamiento y purificación de la proteína de la
invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende
las siguientes etapas:
a) pretratamiento gaseoso del material vegetal
de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales,
subtropicales y/o subproductos agrícolas, como por ejemplo sin que
ello suponga un límite del alcance de la invención la pulpa de
chirimoyas (Annona cherimola Mill.), es conservado en una
atmósfera enriquecida con 10% a 30% de CO_{2}, entre 60 y 75 horas
a bajas temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido
a condiciones atmosféricas durante un periodo de 6 a 10 días,
b) extracción y ultrafiltración, de las
proteínas (Ejemplo 1) del material vegetal, se tritura y
homogeneiza en un medio acuoso constituido por una disolución
acuosa salina, opcionalmente tamponada en un pH comprendido entre
3,0 y 10,0, preferentemente a pH 5,0 y a una temperatura entre 4 y
30ºC, preferentemente a una temperatura de 4ºC, y opcionalmente
adicionando secuestradores de fenoles, por ejemplo
polivinilpirrolidona soluble al medio acuoso.
c) etapa de separación de la proteína de la
invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el
fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:
- -
- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad quitinolítica,
- -
- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,
- -
- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,
y
d) purificación mediante cualquier técnica
convencional de purificación de proteínas.
Así, una realización particular de la invención
es el procedimiento de la invención en el que la extracción de b)
se realiza mediante la adición de antioxidantes y agentes quelantes
de cationes, preferentemente, a título ilustrativo y sin que limite
el alcance de la invención, ácido ascórbico y ácido
etilendiamino-tetraacético sal disódica
2-hidrato (EDTA).
Una realización particular de la invención es el
procedimiento de la invención en el que la purificación de d) se
realiza mediante técnicas cromatográficas (Ejemplo 1), más
concretamente mediante cromatografía de intercambio aniónico, y
mediante cromatoenfoque en un rango de pH de 9,0 a 7,0.
El procedimiento de aislamiento de la proteína
de la invención descrito manifiesta un alto rendimiento reflejado
en una recuperación del 3,29% y un factor de purificación de 36,21,
de manera que partiendo de una pequeña cantidad de material vegetal
(250 gramos) se obtienen alrededor de 0,2 mg de una proteína pura a
homogeneidad y con elevada actividad específica. Si se extrapolan
estos datos a escala industrial supone la obtención de una gran
cantidad de quitinasa a partir un material desechable y económico
como el caso de un subproducto procedente de Cooperativas Agrarias
o empresas de transformación de frutos, valorizando un residuo
suponiendo una salida comercial del mismo.
Por último, la proteína de la invención puede
ser utilizada en cualquier aplicación propia de las proteínas con
actividad quitinasa, incluso en reacciones que requieran una alta
eficiencia catalítica puesto que presenta una constante catalítica
70 veces superior a otras quitinasas.
Debido a sus características cinéticas (alto
valor para la constante catalítica a 5ºC) y termodinámicas (bajos
valores de energía de activación) la enzima de la invención puede
presentar aplicaciones en biocatálisis cuando las reacciones
requieran bajas temperaturas como en el caso de la utilización de
solventes orgánicos muy volátiles; en biorremediación y biocontrol y
conservación de alimentos sanos en condiciones que requieran bajas
temperaturas. En todos los casos además de ser una enzima
hidrolítica estable a bajas temperaturas, tiene la ventaja añadida
de su inactivación a moderada-alta temperatura.
La proteína de la invención puede utilizarse, de
manera soluble o inmovilizada, por ejemplo inmovilizada mediante
distintos procedimientos como el enlace a soportes sólidos, el
atrapamiento en geles, la encapsulación en vesículas, el
entrecruzamiento entre moléculas de enzima y el confinamiento en
birreactores de membranas, acoplados por ejemplo a sistemas de
filtración, intercambio iónico o pH.
Otra aplicación de la proteína de la invención
es su empleo en la crioprotección de proteínas sensibles a la
congelación-descongelación y su aplicación en la
industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica
(crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica
(proteínas con actividad biológica).
Por todo lo anterior la proteína de la invención
puede ser utilizada sola o mezclada con otros crioprotectores, en
diferentes matrices para la conservación de alimentos u otras
proteínas con actividad biológica de uso terapéutico, siendo
factible de ser ingerida por los pacientes al ser de origen natural
y activo a muy bajas concentraciones. Además, su aislamiento es
compatible con su inocuidad como aditivo alimentario.
Más concretamente, otro aspecto de la invención
lo constituye el uso de la proteína de la invención en la
elaboración de una composición biotecnológica o farmacéutica útil
para la criopreservación de principios activos.
La presente invención proporciona una proteína
de origen natural biológicamente activa a bajas temperaturas,
estables en un amplio rango de pH y altamente crioprotectora.
La presente invención se basa en que los
inventores han identificado una proteína quitinasa con actividad
crioprotectora de pulpa de chirimoya (Annona cherimola
Mill), que mediante técnicas electroforéticas, cromatográficas y
espectrométricas han sido estimadas sus propiedades tanto cinéticas
como termodinámicas, de tal manera que se trata de una proteína
monomérica con una masa molecular de 14.500 Da, y un punto
isoeléctrico (p/) mayor o igual a 8,26, aproximadamente.
Asimismo, la naturaleza quitinasa de la proteína
de la invención ha sido determinada por inmunodetección con
anticuerpos policlonales frente a proteínas PR-Q de
tabaco viéndose que está serológicamente ligada a quitinasas del
tabaco y posteriormente ha sido identificada mediante el análisis
del mapa de la huella peptídica utilizando para ello espectrometría
de masas.
La proteína de la invención presenta una
constante de afinidad similar a otras quitinasas de la bibliografía
pero sin embargo su valor para la constante catalítica
(k_{cat}) es mucho mayor, siendo del orden de más de 70
veces superior (6,93 s^{-1}). El valor estimado de su
k_{cat} a una temperatura de 5ºC es del orden del 70% del
valor estimado en el ensayo estándar in vitro a 37ºC siendo
por ello una enzima quitinolíticamente activa a bajas
temperaturas.
Adicionalmente la proteína de la invención
muestra una alta eficiencia catalítica (38,7 s^{-1} mM^{-1}) y
tiene como ventajas adicionales que es catalíticamente activa en un
amplio margen de pH (4,0 a 9,0), altamente estable a: pH básicos,
bajas temperaturas y termosensible a temperaturas moderadamente
altas (superiores a 45ºC) presentando un valor bajo de energía de
activación (E_{a}) de aproximadamente 11,32
kJ\cdotmol^{-1}, aunque las condiciones óptimas de la proteína
de la invención son un pH de 7,0 y una temperatura de 35ºC.
Otra característica de la proteína de la
invención es la actividad crioprotectora que presenta, ya que
protege a otras proteínas sensibles a la congelación durante dos
ciclos de congelación-descongelación. Su actividad
crioprotectora muy superior a la de azúcares osmoprotectores como la
sacarosa y a otras proteínas crioprotectoras como la seroalbúmina
(BSA), ya que es activa a concentraciones más bajas. La
concentración de la proteína de la invención necesaria para
proteger un 50% de la actividad de la enzima lactato deshidrogenada
(LDH) en el ciclo congelación-descongelación (valor
C_{50}) es 13 veces menor que la concentración requerida de BSA,
6,4 \mug\cdotml^{-1} frente a 80,3
\mug\cdotml^{-1}.
Así, un aspecto de la invención lo constituye
una proteína quitinasa, en adelante proteína de la invención, con
actividad crioprotectora aislada de la pulpa de chirimoya
(Annona cherimola Mill) constituida por una proteína
monomérica con una masa molecular de 14.500 Da, y un punto
isoeléctrico (p/) mayor o igual a 8,26, que es una endoquitinasa
con una constante catalítica (k_{cat}) mayor de 5,
preferentemente mayor de 6,8 s^{-1} y una eficiencia catalítica
mayor de 35 preferentemente mayor 38,7 s^{-1}
mM-1, catalíticamente activa en un rango de pH de 4
a 9, estable en un amplio rango de pH, de 2,0 a 11,0, termosensible
a temperaturas superiores a 45ºC y con una energía de activación
(E_{a}) de 11,32 kJ\cdotmol^{-1}, además de ser
quitinolíticamente activa a bajas temperaturas presentando un valor
C_{50} de actividad crioprotectora de 6,4
\mug\cdotml^{-1}.
Asimismo, la presente invención describe un
procedimiento de aislamiento de la proteína de la invención con una
recuperación del 3,29% y un factor de purificación de 36,21 de la
proteína, de manera que si se parte de una pequeña cantidad de
material vegetal (250 gramos) se obtienen alrededor de 0,2 mg de
una proteína pura a homogeneidad y con elevada actividad
específica.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
procedimiento de aislamiento y purificación de la proteína de la
invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende
las siguientes etapas:
a) pretratamiento gaseoso del material vegetal
de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales,
subtropicales y/o subproductos de la manipulación y
comercialización de frutos, como por ejemplo si que ello suponga un
límite del alcance de la invención la pulpa de chirimoyas (Annona
cherimola Mill.), es conservado en una atmósfera enriquecida
con 10% a 30% de CO_{2}, entre 60 y 75 horas a bajas
temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido a
condiciones atmosféricas durante un periodo de 6 a 10 días,
b) extracción de las proteínas (Ejemplo 1) del
material vegetal, se tritura y homogeneiza en un medio acuoso
constituido por una disolución acuosa salina, opcionalmente
tamponada en un pH comprendido entre 3,0 y 10,0 preferentemente a
pH 5,0 y a una temperatura entre 4 y 30ºC, preferentemente a una
temperatura de 4ºC, y opcionalmente adicionando secuestradores de
fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidona soluble, al medio
acuoso,
c) etapa de separación de la proteína de la
invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el
fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:
- -
- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad quitinolítica,
- -
- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,
- -
- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,
y
d) purificación mediante cualquier técnica
convencional de purificación de proteínas.
Tras la homogeneización se separa la parte
soluble del residuo sólido por medio de cualquier técnica
convencional de separación de sólido-líquido, como
por ejemplo sin que limite el alcance de la invención, por
centrifugación. La fracción soluble resultante o extracto crudo que
es la que contiene la actividad quitinasa, se ultrafiltra por medio
de discos de membrana de 100.000 MW con el fin de eliminar los
polímeros de naturaleza coloidal presentes en estos tejidos de
dicha fracción soluble. Posteriormente, el filtrado proteico es
fraccionado y concentrado mediante ultrafiltración empleando discos
de membrana de 10.000 MW obteniendo finalmente más del 92% de las
unidades de enzima con actividad quitinasa contenido en esta
fracción.
Durante la etapa de extracción b) del
procedimiento de la invención se observaron inicialmente por parte
de los inventores dificultades para obtener altos rendimientos de
la proteína quitinasa de la invención, por lo que se añadió
antioxidantes y agentes quelantes de cationes al medio acuoso que
facilitaron una extracción más eficaz de la proteína de la
invención debido a que solubilizan y despolimerizan las pectinas de
la matriz vegetal. Así, una realización particular de la invención
es el procedimiento de la invención en el que la extracción de b)
se realiza mediante la adición de antioxidantes, preferentemente, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
ácido ascórbico y de agentes quelantes de cationes, por ejemplo,
ácido etilendiamino-tetraacético sal disódica
2-hidrato (EDTA).
Tras la etapa de extracción (b) se lleva a cabo
la etapa de separación (c) de la proteína de la invención del resto
de proteínas de la fracción soluble ya que en las plantas en
general, y en el caso de la pulpa de chirimoya en particular,
existen otras muchas proteínas que interfieren en la purificación de
la proteína de la invención. Para ello, el extracto proteico
obtenido en la etapa (b) se somete a fraccionamiento con sulfato
amónico por saturación puesto que las proteínas con actividad
quitinasa son estables a bajas concentraciones de dicha sal y
precipitan. Por lo tanto se va aumentando las concentraciones de
saturación con sulfato amónico para su separación del resto de las
proteínas presentes. El fraccionamiento comienza con una primera
precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico
entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, con lo que al precipitar
otras proteínas no quitinasas obtenemos un sobrenadante enriquecido
en actividad quitinolítica. Esta fracción de proteínas soluble, que
contiene actividad quitinasa, se lleva a saturación con sulfato
amónico entre 80% y 90%, preferentemente a 85%, obteniéndose un
precipitado que, lavado y ultrafiltrado por la membrana de 10.000
MW, tiene actividad quitinasa y comprende una mezcla de isoenzimas
con actividad quitinasa que contiene más del 73% de las unidades
iniciales.
Adicionalmente el extracto obtenido se puede
someter a un proceso de purificación (d) para obtener la proteína
de la invención purificada parcialmente o a homogeneidad, o bien
dicho extracto se puede desecar o liofilizar y mantenerlo como
fuente de enzima con actividad
quitinasa-crioprotectora para ensayos que no
requieran el empleo de dicha proteína con elevada pureza.
Para la purificación de la proteína de la
invención (d), se puede usar cualquier técnica convencional de
purificación de proteínas, como diálisis, técnicas de
ultrafiltración, cromatográficas, cromatografía de intercambio
iónico (DEAE-Celulosa,
DEAE-Sepharosa, Mono S; Mono Q; Source S; Source Q;
CM-Sepharose) y de cromatoenfoque (Mono P).
Una realización particular de la invención es el
procedimiento de la invención en el que la purificación de d) se
realiza mediante técnicas cromatográficas (Ejemplo 1), más
concretamente mediante cromatografía de intercambio aniónico debido
a la naturaleza catiónica de la proteína de la invención y una
segunda etapa mediante cromatoenfoque realizado en un gradiente de
pH de 9,0 a 7,0.
El procedimiento de aislamiento de la proteína
de la invención descrito manifiesta un alto rendimiento reflejado
en una recuperación del 3,29% y un factor de purificación de 36,21.
Concretamente se pueden obtener valores de alrededor de
0,8-1,0 mg de proteína pura a homogeneidad y con
elevada actividad específica por kg de material vegetal. Si se
extrapolan estos datos a escala industrial supone la obtención de
una gran cantidad de quitinasa a partir un material desechable y
económico como el caso de un subproducto procedente de Cooperativas
Agrarias o empresas de transformación de frutos, valorizando un
residuo suponiendo una salida comercial del mismo.
Por último, la proteína de la invención puede
ser utilizada en cualquier aplicación propia de las proteínas con
actividad quitinasa, incluso en reacciones que requieran una alta
eficiencia catalítica puesto que presenta una constante catalítica
70 veces superior a otras quitinasas.
Debido a sus características cinéticas (alto
valor para la constante catalítica a 5ºC) y termodinámicas (bajos
valores de energía de activación) la proteína de la invención puede
presentar aplicaciones en biocatálisis cuando las reacciones
requieran bajas temperaturas como en el caso de la utilización de
solventes orgánicos muy volátiles; en biorremediación y biocontrol y
conservación de alimentos sanos en condiciones que requieran bajas
temperaturas. En todos los casos además de ser una enzima
hidrolítica estable a bajas temperaturas, tiene la ventaja añadida
de su inactivación a moderada-alta temperatura.
Asimismo, la proteína de la invención puede ser
utilizada como agentes fitopatógenos, evitando enfermedades en las
plantas y cultivos a baja temperatura ya que son enzimas digestivas
de pared celular y el producto de su hidrólisis induce
resistencia.
La proteína de la invención puede utilizarse, de
manera soluble o inmovilizada, por ejemplo inmovilizada mediante
distintos procedimientos como el enlace a soportes sólidos, el
atrapamiento en geles, la encapsulación en vesículas, el
entrecruzamiento entre moléculas de enzima y el confinamiento en
biorreactores de membranas, acoplados por ejemplo a sistemas de
filtración, intercambio iónico o pH.
Otra aplicación de la proteína de la invención
es su empleo en la crioprotección de proteínas sensibles a la
congelación-descongelación y su aplicación en la
industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica
(crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica
(proteínas con actividad biológica).
Por todo lo anterior la proteína de la invención
puede ser utilizada sola o mezclada con otros crioprotectores, en
diferentes matrices para la conservación de alimentos u otras
proteínas con actividad biológica de uso terapéutico (por ejemplo,
insulina e IGF-I) o biotecnológico (por ejemplo
enzimas de restricción), siendo factible de ser ingerida por los
pacientes al ser de origen natural y activa a muy bajas
concentraciones. Además, su aislamiento es compatible con su
inocuidad como aditivo alimentario.
Así, otro aspecto de la invención lo constituye
el uso de la proteína de la invención en la elaboración de una
composición biotecnológica o farmacéutica útil para la
criopreservación de principios activos.
Figura 1 Análisis electroforético e inmunológico
de la proteína purificada de 14.500 Da con actividad
quitinasa-crioprotectora (A) Análisis
electroforético (SDS-PAGE). Las líneas 2 y 3 fueron
cargadas con 2 \mug de proteína purificada no reducida y reducida
con 1,25% (v/v) de \beta-mercaptoetanol. La línea
1 fue cargada con las proteínas de referencia de masa molecular. El
gel fue teñido con azul de Coomassie. (B) Inmunoensayo de un gel
similar al mostrado en A con la proteína de la invención
purificada, en su forma no reducida, e incubado con anticuerpos
policlonales frente a proteínas PRQ de tabaco.
Figura 2 Efecto del pH y la temperatura sobre la
actividad y estabilidad de la proteína
quitinasa-crioprotectora. El resultado obtenido fue
expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al máximo
de actividad obtenida. (A) Relación entre el pH de la reacción y la
actividad relativa de la proteína de la invención medida bajo
condiciones de ensayo estándar (37ºC, 10 min.) usando tampones 0.1
M (pH 2.0 a 13.0). (B) Estabilidad de la proteína de la invención
respecto al pH. La solución enzimática fue mezclada con tampón 0.1 M
(pH 2.0 a 13.0) y mantenida a 37ºC durante 2 h. La actividad
residual de la enzima tratada se ensayó bajo condiciones estándar.
(C) Relación entre la temperatura (5ºC a 80ºC) de la reacción y la
actividad relativa de la proteína de la invención medida tras la
incubación en tampón acetato sódico 0.1 M, pH 5.0. (D) Estabilidad
de la proteína de la invención respecto a la temperatura. El efecto
de la temperatura fue examinado después de
pre-incubar a diferentes temperaturas (5ºC a 80ºC)
en tampón acetato sódico 0.1 M, pH 5.0, durante 2 h. La actividad
residual de la enzima tratada se ensayó bajo condiciones estándar.
Las barras de error representan el ES (n = 3).
Figura 3 Actividad crioprotectora de la proteína
quitinasa purificada. La solución de LDH fue congelada en presencia
de diferentes concentraciones (C) de la proteína de la invención
(a), seroalbúmina bovina (b) o sacarosa (c). Las muestras fueron
descongeladas a temperatura ambiente y medida la actividad LDH. La
actividad relativa representa la cantidad de actividad LDH remanente
después de dos ciclos de congelación-descongelación
expresada en porcentaje con respecto a la actividad de LDH inicial.
Las barras de error representan el ES (n=3).
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados como limitativos del alcance de la
misma.
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Ejemplo
1
Se pesaron 250 g de la pulpa de chirimoya que
fueron congelados en nitrógeno líquido para favorecer la
trituración y homogeneización de este material. La homogeneización
se realizó en tampón acetato sódico 100 mM pH 5,0 conteniendo ácido
ascórbico 20 mM, 1,5% de polivinilpirrolidona soluble y ácido
etilendiaminotetra-acético sal disódica
2-hidrato (EDTA) 10 mM.
Después de la homogeneización la parte soluble
fue separada del residuo sólido por centrifugación (35.000 x
g durante 30 minutos). El residuo sólido resultante fue
sometido a dos ciclos más de lavado, homogeneización y
centrifugación en las disoluciones anteriores. Los sobrenadantes de
estas fracciones se mezclaron constituyendo el extracto crudo.
El extracto crudo obtenido en la etapa anterior
se filtró utilizando un sistema de ultrafiltración Amicon Diaflo
80200 (Millipore) con una membrana Biomax PBHK de un poro de corte
de 100.000 MW (Millipore). Los carbohidratos poliméricos,
especialmente sustancias pécticas y almidón, y otras moléculas de
gran tamaño quedaron así retenidas en la parte superior mientras
que las proteínas de interés se recuperaron en la fracción filtrada.
El material retenido fue lavado con dos fracciones de tampón
Tricina 50 mM, pH 8,0 antes de concentrar la fracción filtrada diez
veces en el mismo equipo de ultrafiltración, utilizando para ello
una membrana YM-10 con un tamaño de poro de 10.000
MW (Millipore). Después de este proceso más del 92% de las unidades
de enzima con actividad quitinasa se encuentra en esta fracción.
El filtrado proteico obtenido en la etapa
anterior fue saturado al 20% de saturación con sulfato amónico.
Después de 1 hora en agitación a 4ºC, el extracto se centrifugó a
12.000 x g durante 15 minutos y el precipitado, carente de
actividad quitinasa, fue desechado. El sobrenadante se llevó al 85%
de saturación con sulfato amónico y se dejó 1 hora en agitación a
4ºC. Después fue centrifugado a 15.000 x g durante 20
minutos a 4ºC y el precipitado obtenido se guardó como fuente de la
proteína con actividad quitinasa. Este precipitado se disolvió en
tampón Tricina 20 mM pH 8.0 conteniendo glicerol al 10%. La
disolución resultante se desaló por ultrafiltración utilizando una
membrana con un tamaño de poro de 10.000 MW a 4ºC. Este extracto
final obtenido presenta una mezcla de isoenzimas con actividad
quitinasa que contiene el 73% de las unidades de actividad
iniciales.
A partir del extracto obtenido en la etapa
anterior se aisló una proteína con actividad quitinasa, con un
elevado grado de pureza, mediante un protocolo que comprende las
siguientes etapas:
Se utilizó una columna Mono-Q HR
5/5 (Amersham Biosciences) acoplada a un sistema de FPLC (Amersham
Biosciences) y fue equilibrada con un tampón Tricina 20 mM pH 8.0
conteniendo glicerol al 10%.
Se aplicó la muestra una velocidad de flujo de 1
ml\cdotmin^{-1}, y la fracción no adsorbida, o volumen muerto
de la columna, se denominó fracción básica. Ésta fue concentrada y
desalada por ultrafiltración en tampón
dietanolamina-HCl 25 mM, pH 9,5 conteniendo
glicerol al 10% con un sistema Centriplus YM3 (Millipore,
EE.UU.).
La elución de quitinasas básicas se detectó por
incremento de absorbancia a 280 nm y su actividad se determinó
mediante un ensayo colorimétrico usando
CM-quitina-RBV (Loewe Biochemica)
como sustrato. Las fracciones que mostraban actividad quitinasa se
unieron y se desalaron posteriormente.
En esta etapa se utilizó una columna
Mono-P HR 5/20 (Amersham Biosciences) acoplada a un
sistema de FPLC (Amersham Biosciences) y fue equilibrada con un
tampón dietanolamina-HCl 25 mM, pH 9,5, conteniendo
glicerol al 10%. La separación de proteínas se llevó a cabo mediante
un gradiente de pH de 9 a 7 de 43 minutos utilizando tampón
Polybuffer 96-HCl (Amersham Biosciences) 10% (v/v),
pH 7,0, con una velocidad de flujo de 0,8 ml\cdotmin^{-1},
recogiendo fracciones de 1 ml y valorando su pH con un pHmetro
MicropH-2000 (Crison). Tras evaluar aquellas
fracciones que presentaban absorbancia a 280 nm, se examinó la
presencia de quitinasas básicas mediante la determinación
colorimétrica de su actividad enzimática utilizando
CM-quitina-RBV como sustrato. El
análisis electroforético e inmunológico reveló la fracción que
contenía aislada la proteína de la invención la cual se desaló y se
liofilizó. Con el procedimiento de purificación descrito se obtuvo
0,18 mg de proteína de la invención con un factor de purificación
de 36,2 y una recuperación del 3,3%.
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Ejemplo
2
La determinación de la pureza de la proteína
purificada se llevó a cabo mediante técnicas de electroforesis
sobre geles de poliacrilamida en condiciones disociantes en
presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) con
proteína no reducida y proteína reducida con 1,25% de
\beta-mercaptoetanol. La presencia de una sola
banda electroforética reveló la pureza de la proteína de la
invención purificada (Figura 1A). Los resultados muestran la
naturaleza monomérica de la proteína y revelan que presenta una
masa molecular de aproximadamente 14.500 Da
(SDS-PAGE). La masa molecular de la proteína
purificada se determinó por electroforesis desnaturalizante con un
porcentaje de acrilamida de 13,5%, utilizando un patrón preteñido
de proteínas de baja masa molecular: lisozima de huevo (18800 Da),
inhibidor de tripsina de soja (28200 Da), anhidrasa carbónica
bovina (37200 Da), ovoalbumina de huevo (52300 Da), seroalbúmina
bovina (93600 Da) y fosforilasa B de músculo de conejo (106900 Da).
Posteriormente se construyó una curva de calibrado representando
los valores del logaritmo de la masa molecular de cada proteína
frente a sus movilidades electroforéticas relativas (R_{f}).
La inmunodetección con anticuerpos policlonales
frente a proteínas PR-Q de tabaco establece que
esta proteína purificada de chirimoya está serológicamente ligada
con quitinasas de tabaco (véase Figura 1B).
El análisis por cromatoenfoque a pH
9-7 según se describe en el apartado 1.3.2. reveló
que la proteína de la invención es una proteína básica con un p/
> 8, concretamente de 8,26.
La identificación se llevó a cabo mediante el
análisis del mapa de la huella peptídica o peptide mass fingerprint
(PMF), utilizando para ello espectrometría de masas usando un
MALDI-TOF/TOF 4700 Proteomics Analyzer (Applied
Biosystems). Una vez obtenido el espectro de masas de los péptidos
trípticos de la proteína quitinasa básica purificada, se compararon
los datos de masa/carga de los péptidos resultantes con los
descritos en las bases de datos. En esta identificación de las
proteínas mediante la búsqueda de secuencias homólogas con el
algoritmo MOWSE dio lugar a una serie de parámetros que reflejan la
fiabilidad de la identificación como: el número de masas de
péptidos obtenidos con MALDI-TOF y su
correspondencia con las masas de los péptidos resultantes de
digestiones teóricas de proteínas en las bases de datos (péptidos
identificados), la probabilidad asociada a cada búsqueda
(score) de homología con el algoritmo MOWSE en la base de
datos NCBlnr (P\leq0,05) y el porcentaje de secuencia de
la proteína candidata que cubren las masas de los péptidos que se
han podido identificar (cobertura de secuencia). De acuerdo al
valor de estos parámetros, entre ellos 7 péptidos identificados,
una probabilidad de homología de 97 y un porcentaje de cobertura de
secuencia del 31%, la proteína purificada de chirimoya, con
actividad quitinasa-crioprotectora y reconocida por
anticuerpos para esta proteína fue identificada con una quitinasa
básica (p/ 9,54 y M_{r} 30.900 Da) de clase I procedente
de Arabidopsis thaliana Heynh (número de acceso base de datos
NCBI para la proteína homóloga gi:15224319).
La proteína con actividad
quitinasa-crioprotectora aislada de chirimoya,
proporcionada por esta invención, cataliza la hidrólisis de varios
compuestos.
La actividad enzimática de esta
quitinasa-crioprotectora se determinó por el
siguiente método en el que
CM-quitina-RBV se utilizó como
sustrato (Wirth SJ, Wolf GA. 1990. Dye-labelled
substrates for the assay and detection of chitinase and lysozyme
activity. Journal of Microbiological Methods, 12,
197-205.).
En primer lugar, 200 \mul de sustrato
CM-quitina-RBV 2 mg\cdotml^{-1}
y 530 \mul de tampón acetato sódico 100 mM pH 5,0 fueron llevados
a un volumen final de reacción de 730 \mul. Después de atemperar
la reacción a 37ºC, se añadieron 70 \mul de la disolución
enzimática y la reacción fue incubada 10 minutos en agitación
continua.
La reacción se paró con la adición de 200 \mul
de HCl 1N y se almacenó en hielo 10 minutos. Posteriormente, las
muestras fueron centrifugadas para precipitar la fracción no
degradada del sustrato. El sobrenadante fue diluido con agua
ultrapura (1:1) y se midió su absorbancia a 550 nm en un
espectrofotómetro convencional frente a un blanco que contenía la
muestra enzimática inactivada con HCl 1N. Una unidad (U) de
actividad quitinasa se definió como el incremento de absorbancia a
550 nm y por minuto.
La concentración de proteína
(mg\cdotml^{-1}) fue determinada con el método de Bradford. La
combinación de ambas técnicas permitió calcular los valores de
actividad específica (U\cdotmg^{-1}) de la proteína con
actividad quitinasa-crioprotectora. La proteína de
la invención purificada presenta una actividad total de 620 U y una
actividad específica de 3458,3 U\cdotmg^{-1}.
Una forma de distinguir entre las diferentes
clases de quitinasas es determinar su mecanismo de hidrólisis
comparando sus actividades frente a diferentes oligosacáridos
sintéticos de N-acetilglucosamina asociados a grupos
con actividad fluorescente, como el
4-metilumbelliferil (4-MU). Se
utilizaron tres sustratos muy sensibles que generan un producto
fluorescente tras su hidrólisis enzimática. Estos compuestos
funcionan como dímeros, trímeros o tetrámeros, en donde el grupo
4-MU se encuentra unido con un enlace
\beta-(1-4) a los oligosacáridos de
N-acetilglucosamina presentando únicamente el
compuesto 4-MU libre hidrolizado de los
oligosacáridos actividad fluorescente.
Se prepararon soluciones madre de los sustratos
4-MU-\beta-GlcNAc,
4-MU-\beta-(GIcNAc)_{2}
y 4-MU-\beta-(GIcNAc)_{3}
con una concentración de 50 \muM de tampón acetato sódico 50 mM a
pH 5,0. Se incubaron muestras de 5 ng de la proteína quitinasa
purificada disueltas en 2,25 ml de tampón acetato sódico 50 mM, pH
5,0 durante 30 minutos a 37ºC en agitación con 0,75 ml de la
disolución madre de sustrato.
A continuación la reacción se detuvo con 0,25 ml
de tampón carbonato/bicarbonato sódico 1M, pH 10,7 y se midió su
fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 355 nm y una
longitud de onda de emisión de 460 nm frente a un blanco que
contiene los anteriores reactivos sin la enzima.
Los datos de intensidad de fluorescencia se
tradujeron a concentraciones de 4-MU usando los
parámetros de una curva de calibración construida previamente
usando concentraciones crecientes, de 10 a 150 nM, de
4-MU disuelto en tampón carbonato/bicarbonato
sódico 100 mM, con pH 10,4.
Los datos cinéticos (K_{m}, k_{cat} y
k_{cat}/K_{m}) obtenidos frente a cada sustrato
fluorescente demostraron que la proteína de la invención es una
endoquitinasa, al hidrolizar 4-MU desde el
tetrámero (k_{cat} 6,93 s^{-1} y K_{m} 0,18 mM) y el
trímero (k_{cat} 2,87 s^{-1} y K_{m} 0,09 mM), no
teniendo actividad con el dímero. Además estos datos demostraron
que esta enzima presenta un valor de afinidad similar a otras pero
el valor de su constante catalítica es mucho mayor, del orden de más
de 70 veces superiores, teniendo por tanto una alta eficiencia
catalítica(k_{cat}/K_{m} 38,67 s^{-1} mM^{-1} para
el tetrámero y 33,23 s^{-1} mM^{-1} para el trímero) en ensayos
estándar in vitro. Además, el valor estimado de la
k_{cat} para la proteína de la invención a una temperatura
de 5ºC es del orden del 70% del valor estimado en el ensayo
estándar in vitro a 37ºC, siendo por ello una enzima
quitinolíticamente activa a bajas temperaturas.
El intervalo de pH óptimo al cual la proteína
quitinasa-crioprotectora muestra su máxima
actividad fue examinado usando el mismo medio de reacción que el
utilizado en el Ejemplo 2.3. pero se utilizaron diferentes
tampones para los diferentes intervalos de
pH:
tampón ácido fosfórico 100 mM para pH 2,0
tampón glicina-HCl 100 mM para
pH 3,0
tampón acetato sódico 100 mM para pH
4,0-6,0
tampón fosfato sódico 100 mM para pH
6,5-7,0
tampón Tris-HCl 100 mm para pH
9,0
tampón glicina-NaOH para pH
11,0-13,0
El resultado obtenido fue expresado como
porcentaje de actividad relativa respecto al máximo de actividad
obtenida. La proteína de la invención tiene un pH óptimo de 7,0
aproximadamente y una actividad relativa superior al 50% entre pH
4,0 y 9,0 aproximadamente (Figura 2A).
Para el ensayo de la estabilidad frente al pH de
la proteína purificada en la invención se midió la actividad
quitinasa residual después de la incubación durante 2 horas a
diferentes valores de pH y se utilizaron para ello los tampones
descritos en el Ejemplo 2.5, a 37ºC en tampón acetato sódico 100 mM,
pH 5,0, siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.3. El
resultado fue expresado como porcentaje de actividad relativa
respecto al máximo de actividad obtenida. La proteína de la
invención es muy estable en un amplio margen de pH, mostrando
después de 2 horas más del 80% de actividad relativa entre pH 2,0 y
11,0 aproximadamente (Figura 2B).
La actividad de la proteína de la invención se
midió en un intervalo de temperatura comprendido entre 5ºC y 80ºC
siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.3. El resultado
fue expresado como porcentaje de actividad relativa respecto al
máximo de actividad obtenida. La proteína de la invención presentó
una temperatura óptima a aproximadamente 35ºC, desarrollando una
actividad relativa superior al 50% entre 15ºC y 50ºC aproximadamente
y reteniendo más del 25% de la actividad enzimática a bajas
temperaturas, unos 5ºC (Figura 2C). La determinación del valor de
energía de activación (E_{a}) entre 5ºC y 37ºC estableció
que la proteína de la invención presenta un valor bajo, del orden
de 11,32 kJ\cdotmol^{-1} comparada con la mayor parte de las
hidrolasas (Dicko MH, Searle-van Leeuwen MJ, Traore
AS, Hilhorst R, Beldman G. 2001. Polysaccharide hydrolases from
leaves of Boscia senegalensis: properties of
endo(1,3)-beta-D-glucanase.
Applied Biochemistry and Biotechnology, 94,
225-241).
Para el ensayo de la estabilidad térmica de la
proteína purificada en la invención se midió la actividad quitinasa
residual después de la incubación durante 2 horas a diferentes
temperaturas, entre 5ºC y 80ºC, siguiendo el procedimiento descrito
en el Ejemplo 2.3. El resultado fue expresado como porcentaje de
actividad relativa respecto al máximo de actividad obtenida. La
proteína de la invención es termosensible a partir de
aproximadamente 45ºC, manteniendo una actividad relativa de más del
90% después de 2 h entre 5ºC y 45ºC (Figura 2D).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El ensayo de la actividad crioprotectora in
vitro se realizó según el método descrito por Lin y Thomashow
(Lin C, Thomashow MF. 1992. A cold-regulated
arabidopsis gen encodes a polypeptide having potent
cryoprotective activity. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 183, 1103-1108.) utilizando una
proteína sensible a la congelación-descongelación
como la enzima lactato deshidrogenasa V-S de
músculo de conejo (LDH, EC 1.1.1.23; Sigma). Para ello se preparó
una solución. madre de la enzima LDH comercial 0,02
\mug\cdot\mul^{-1} que fue dializada toda la noche frente a
20 mM de tampón fosfato sódico pH 7,5. Se utilizaron mezclas con
3,2 \mug de LDH de la solución madre y cantidades crecientes de
la proteína de la invención purificada a homogeneidad
(0,04-50 \mug\cdot\mul^{-1}) o extractos
semipurificados (20-80 \mug\cdot\mul^{-1}),
de la proteína crioprotectora control seroalbúmina bovina V
(0,04-205 \mug\cdot\mul^{-1}, Sigma) o
sacarosa (0,04-205 \mug\cdot\mul^{-1}) y un
volumen final de 250 \mul. La disolución resultante fue congelada
en nitrógeno líquido durante 30 segundos y dejada descongelar a
temperatura ambiente durante 5 minutos. El proceso de
congelación-descongelación fue llevado a cabo dos
veces, midiendo posteriormente la actividad LDH residual.
La actividad LDH fue ensayada añadiendo 50
\mul de las muestras anteriores al tampón de ensayo (80 mM
Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl; 2 mM ácido pirúvico y
0,3 mM NADH) a temperatura ambiente y en un volumen final de 2 ml.
La aparición de NAD+ fue cuantificada registrando el descenso de
absorbancia a 340 nm a temperatura ambiente durante 3 minutos en un
espectrofotómetro convencional. Así mismo se midió la actividad
enzimática de dos controles con LDH en tampón 20 mM fosfato
potásico, y a pH 7,5: uno sometido al proceso de
congelación-descongelación y otro que no. Los datos
de actividad crioprotectora se mostraron como el porcentaje de
actividad residual frente al control no congelado. Cuando la LDH
fue sometida a dos procesos de
congelación-descongelación perdió aproximadamente
más del 95% de la actividad.
El ensayo con extractos semipurificados de la
proteína de la invención (20-80
\mug\cdot\mul^{-1}) obtenidos como se describe en el Ejemplo
1.2. o 1.3.1. (fracción básica) reveló que son aproximadamente 2
veces más activos como crioprotectores que la proteína control BSA,
hallándose una proporcionalidad entre la capacidad crioprotectora
del extracto semipurificado y la concentración de proteína
añadida.
Cuando el ensayo fue realizado con diferentes
concentraciones de la proteína de la invención purificada, la
actividad crioprotectora incrementó, siendo muy superior a la
actividad crioprotectora de BSA en el rango de concentraciones
ensayado (Figura 3). La determinación de la concentración de
proteína crioprotectora necesaria para alcanzar un porcentaje de
actividad LDH residual del 50% (valor C_{50}) se obtuvo con la
representación semilogarítmica del porcentaje de actividad LDH
residual frente a la concentración de la proteína de la invención
con actividad crioprotectora. Usando este procedimiento, LDH
retiene un 50% de sus propiedades catalíticas cuando 6,4
\mug\cdot\mul^{-1} de la proteína
quitinasa-crioprotectora de la invención fue añadida
frente a los 80,3 \mug\cdot\mul^{-1} de BSA necesarios.
Siendo del orden de 13 veces más crioprotectora la proteína de la
invención que la proteína crioprotectora control BSA.
Claims (13)
1. Proteína quitinasa caracterizada
porque presenta actividad crioprotectora, aislada de la pulpa de
chirimoya (Annona cherimola Mill), constituida por una
proteína monomérica con una masa molecular de 14.500 Da, y un punto
isoeléctrico (p/) mayor o igual a 8,26, es una endoquitinasa con
una constante catalítica (k_{cat}) mayor de 5,
preferentemente mayor de 6,8 s^{-1} y una eficiencia catalítica
mayor de 35 preferentemente mayor 38,7 s^{-1} mM^{-1},
catalíticamente activa en un rango de pH de 4 a 9, estable en un
rango de pH de 2,0 a 11,0, termosensible a temperaturas superiores
a 45ºC y con una energía de activación (E_{a}) de 11,32
kJ\cdotmol^{-1}, además de ser quitinolíticamente activa a
bajas temperaturas, presentando un valor C_{50} de actividad
crioprotectora de 6,4 \mug\cdotml^{-1}.
2. Procedimiento de obtención de la proteína
quitinasa según la reivindicación 1 caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
a) pretratamiento gaseoso del material vegetal
de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales,
subtropicales y/o subproductos agrícolas, como por ejemplo sin que
ello suponga un límite del alcance de la invención la pulpa de
chirimoyas (Annona cherimola Mill.), es conservado en una
atmósfera enriquecida con 10% a 30% de CO_{2}, entre 60 y 75 horas
a bajas temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido
a condiciones atmosféricas durante un periodo de 6 a 10 días,
b) extracción y ultrafiltración de las proteínas
del material vegetal, se tritura y homogeneiza en un medio acuoso
constituido por una disolución acuosa salina, opcionalmente
tamponada en un pH comprendido entre 3,0 y 10,0, preferentemente a
pH 5,0, y a una temperatura entre 4 y 30ºC, preferentemente a una
temperatura de 4ºC, y opcionalmente adicionando antioxidantes,
agentes quelantes de cationes y secuestradores de fenoles,
c) etapa de separación de la proteína de la
invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el
fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:
- -
- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad quitinolítica,
- -
- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,
- -
- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,
y opcionalmente
d) purificación mediante cualquier técnica
convencional de purificación de proteínas.
3. Procedimiento según la reivindicación 2
caracterizado porque la extracción de b) se realiza mediante
la adición de antioxidantes y/o agentes quelantes de cationes.
4. Procedimiento según la reivindicación 3
caracterizado porque el antioxidante pertenece al siguiente
grupo: ácido ascórbico, y/o secuestradores de fenoles, por ejemplo
polivinilpirrolidona soluble.
5. Procedimiento según la reivindicación 3
caracterizado porque el agente quelante de cationes es, por
ejemplo ácido etilendiamino-tetraacético sal
disódica 2-hidrato (EDTA).
6. Procedimiento según la reivindicación 2
caracterizado porque la purificación de d) se realiza
mediante técnicas cromatográficas.
7. Procedimiento según la reivindicación 6
caracterizado porque las técnicas cromatográficas son
cromatografía de intercambio aniónico y/o cromatoenfoque.
8. Procedimiento según la reivindicación 7
caracterizado porque el cromatoenfoque se realiza a un
gradiente de pH de 9,0 a 7,0.
9. Uso de la proteína según la reivindicación 1
en procedimientos de biocatálisis, bioremediación o como agentes
biocontrol y conservación de alimentos que requieran actividad
quitinasa.
10. Uso de la proteína según la reivindicación 1
en la industria alimentaria, médica y farmacéutica como conservante
o aditivo alimentario o en la protección de proteínas, células,
tejidos u órganos a bajas temperaturas, refrigerados, congelados o
liofilizados.
11. Uso de la proteína según la reivindicación 1
en la elaboración de una composición biotecnológica o farmacéutica
útil para la criopreservación de principios activos.
12. Uso de la proteína según las
reivindicaciones 9 a 11 en forma soluble y/o inmovilizada.
13. Uso de la proteína según las
reivindicaciones 9 a 11, sola o acompañada con otros
crioprotectores.
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|---|---|---|---|
| ES200801914A ES2334741B1 (es) | 2008-06-26 | 2008-06-26 | Proteina crioprotectora con actividad quitinasa a bajas temperaturas,procedimiento para su obtencion y sus aplicaciones. |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102119720A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-07-13 | 张胜勇 | 一种含萝卜双功能酶的果蔬保鲜剂 |
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|---|---|---|---|---|
| WO1999006565A2 (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-11 | Ice Biotech Inc. | Antifreeze proteins, dna and expression systems |
-
2008
- 2008-06-26 ES ES200801914A patent/ES2334741B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999006565A2 (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-11 | Ice Biotech Inc. | Antifreeze proteins, dna and expression systems |
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| HINCHA, D.K. et al. "Beta-1,3-glucanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold acclimation". PLANT PHYSIOL. 1997. Vol. 114, Nº. 3, páginas 1077-1083; resumen. * |
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| CN102119720A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-07-13 | 张胜勇 | 一种含萝卜双功能酶的果蔬保鲜剂 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2334741B1 (es) | 2011-02-17 |
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