ES2332173T3 - Acidos nucleicos reguladores transcripcionales, polipeptidos y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Acidos nucleicos reguladores transcripcionales, polipeptidos y metodos de uso de los mismos. Download PDF

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Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que tiene actividad CHD (modificadora de la organización de la cromatina-helicasa-de unión a ADN), y que comprende: (a) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia de polinucleótidos que tiene como se muestra en el SEQ ID NO: 1; o (c) una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 1, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa del SEQ ID NO: 1 y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando los parámetros por defecto.

Description

Ácidos nucleicos reguladores transcripcionales, polipéptidos y métodos de uso de los mismos.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a la biología molecular de las plantas. Más específicamente, se refiere a ácidos nucleicos y métodos para modular su expresión en plantas.
Antecedentes de la invención
Los principales avances en la transformación vegetal han tenido lugar a lo largo de los últimos años. No obstante, en las principales plantas de cultivo, tales como el maíz y la soja, todavía existen serias limitaciones en el genotipo. La transformación de líneas de cría de maíz agronómicamente importantes continúa siendo difícil y requiere mucho tiempo. Tradicionalmente, el único modo de lograr una respuesta en el cultivo ha sido mediante la optimización de los componentes del medio y/o el material y la fuente del explante. Esto ha conducido al éxito en algunos genotipos, pero la mayoría de los híbridos selectos no logran producir una respuesta en el cultivo favorable. Si bien la transformación de genotipos modelo es eficaz, el proceso de introgresión de transgenes en las endogamias de producción es laborioso, costoso y requiere mucho tiempo. Se ahorraría considerable tiempo y dinero si los genes pudieran ser introducidos y evaluados directamente en líneas endogámicas de producción o en híbridos comerciales.
Los métodos actuales para el diseño genético en el maíz requieren un tipo de célula específica como receptora del ADN foráneo. Estas células se encuentran en células de callo relativamente indiferenciadas, que crecen rápidamente o en la superficie escutelar del embrión inmaduro (que da lugar al callo). Con independencia del método de liberación utilizado actualmente, el ADN es introducido literalmente en miles de células, todavía se recuperan transformantes a frecuencias de 10^{-5} con respecto a las células que se expresan transitoriamente. Agravando este problema, el trauma que acompaña a la introducción del ADN dirige a las células receptoras a la detención del ciclo celular y la evidencia acumulada sugiere que muchas de estas células son dirigidas a apoptosis o muerte celular programada. (Referencia Bowen et al., Third International Congress of the International Society for Plant Molecular Biology, 1991, Resumen 1093). Por lo tanto sería deseable proporcionar métodos mejorados capaces de incrementar la eficacia de transformación en numerosos tipos celulares.
Típicamente se utiliza un marcador seleccionable para recuperar las células transformadas. Los esquemas de selección tradicionales exponen todas las células a un agente fitotóxico y se basan en la introducción de un gen de resistencia para recuperar los transformantes. Desafortunadamente, la presencia de células moribundas puede reducir la eficacia de la transformación estable. Por lo tanto sería útil proporcionar un sistema de selección positiva para recuperar los transformantes.
A pesar de los incrementos en el rendimiento y el área cosechada en todo el mundo, se prevé que en los próximos diez años, satisfacer la demanda de maíz requerirá un incremento del 20% adicional sobre la producción actual (Dowswell, C.R., Paliwal, R.L., Cantrell, R.P., 1996, Maize in the Third World, Westview Press, Boulder, CO).
En los cultivos híbridos, incluyendo cereales, semillas oleosas, forrajes, frutas y hortalizas, existen problemas asociados con el desarrollo y la producción de semillas híbridas. El proceso de polinización cruzada de plantas es laborioso y costoso. En el proceso de polinización cruzada, se debe evitar que la planta femenina sea fertilizada por su propio polen. Se han desarrollado muchos métodos a lo largo de los años, tales como el despenachado en el caso del maíz, y desarrollo y mantenimiento de líneas masculinas estériles, y el desarrollo de plantas que son incompatibles con su propio polen, por nombrar unos pocos. Puesto que los híbridos no se reproducen en realidad, el proceso debe ser repetido para la producción de cada lote de semillas híbridas.
Para complicar adicionalmente el proceso, las líneas endogámicas se cruzan. Por ejemplo en el caso del maíz, las líneas puras pueden tener un bajo rendimiento. Esto ofrece un serio desafío en la producción de maíz de semilla híbrida. De hecho, ciertos híbridos no pueden ser comercializados en absoluto debido al comportamiento de las líneas puras. La producción de semillas híbridas es por consiguiente costosa, lleva mucho tiempo y proporciona riesgos conocidos y desconocidos. Por lo tanto sería valioso desarrollar nuevos métodos que contribuyan al incremento de la eficacia de producción de la semilla híbrida.
A medida que se añaden nuevos rasgos a los cultivos comerciales por medio de ingeniería genética, surgen problemas con la "acumulación" de rasgos. Con el fin de desarrollar rasgos acumulados heredables, los rasgos deben estar ligados debido a las poblaciones segregantes. Los métodos mejorados de desarrollo de semillas híbridas que no requerirían el ligamiento de los rasgos acortarían significativamente el tiempo de desarrollo de semillas híbridas comerciales.
El silenciamiento génico es otro problema en el desarrollo de rasgos heredables con ingeniería genética. Frecuentemente se observa silenciamiento génico después de las divisiones meióticas. La eliminación o la reducción de este problema adelantarían el estado de la ciencia y la industria en esta área.
Compendio de la invención Descripción detallada de la invención Definiciones
El término "aislado" hace referencia a material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está: (1) sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan o interaccionan con el material encontrado en su entorno natural o (2) si el material está en su entorno natural, el material ha sido alterado por la intervención humana deliberada hacia una composición y/o situado en un locus en la célula distinto del locus nativo del material.
Según se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" representa un polinucleótido e incluye un polímero de cadena sencilla o doble de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas. Los ácidos nucleicos también pueden incluir fragmentos y nucleótidos modificados.
Según se utiliza en la presente memoria, "polinucleótido CHD" representa una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido CHD.
Según se utiliza en la presente memoria, "polipéptido" representa proteínas, fragmentos de proteínas, proteínas modificadas, secuencias de aminoácidos y secuencias de aminoácidos sintéticas. El polipéptido puede estar glicosilado o no.
Según se utiliza en la presente memoria, "polipéptido CHD" representa un polipéptido que contiene 3 dominios, un modificador de la organización de la cromatina, un dominio relacionado con la helicasa SNF-2/ATP, y un dominio de unión a ADN.
Según se utiliza en la presente memoria, "planta" incluye plantas y partes de plantas incluyendo pero no limitada a células vegetales, tejidos vegetales tales como hojas, tallos, raíces, flores, y semillas.
Según se utiliza en la presente memoria, "promotor" incluye la referencia a una región de ADN aguas arriba del inicio de la transcripción e implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción.
"Fragmento" quiere decir una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y por consiguiente la proteína codificada de ese modo. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que conservan la actividad biológica del ácido nucleico nativo. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación pueden no codificar fragmentos de proteína que conservan su actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos son generalmente mayores de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o 700 nucleótidos y hasta e incluyendo la secuencia de nucleótidos completa que codifica las proteínas de la invención. Generalmente las sondas tienen menos de 1.000 nucleótidos y preferiblemente menos de 500 nucleótidos. Los fragmentos de la invención incluyen secuencias antisentido utilizadas para disminuir la expresión de los polinucleótidos de la invención. Tales fragmentos antisentido pueden tener una longitud variable que oscila entre 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o 700 nucleótidos y hasta e incluyendo la secuencia codificante completa.
"Equivalente funcional" según se aplica a un polinucleótido o una proteína, quiere decir un polinucleótido o una proteína de longitud suficiente para modular el nivel de actividad de la proteína CHD en una célula vegetal. Un equivalente funcional polinucleotídico puede estar en orientación efectora o antisentido.
"Variantes" quiere decir secuencias sustancialmente similares. Generalmente, las variantes de las secuencias de ácido nucleico de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos
90%, 95% o 98% con la secuencia de nucleótidos nativa, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia de la invención completa y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando los parámetros por defecto. Generalmente, las variantes de la secuencia de polipéptidos de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos aproximadamente
90%, 95% o 98% con la proteína nativa, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando los parámetros por defecto. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453,1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios.
Según se utiliza en la presente memoria una "célula sensible" hace referencia a una célula que muestra una respuesta positiva a la introducción del polipéptido CHD o al polinucleótido CHD en comparación con una célula en la que no se ha introducido el polipéptido CHD o el poli nucleótido CHD. La respuesta puede ser para intensificar la respuesta en cultivo de tejidos, inducir embriogénesis somática, inducir apomixis, aumentar la eficacia de transformación o aumentar la recuperación de plantas regeneradas.
Según se utiliza en la presente memoria una "célula vegetal recalcitrante" es una célula vegetal que muestra una respuesta no satisfactoria en cultivo de tejidos, en eficacia de transformación o en recuperación de plantas regeneradas en comparación con los sistemas modelo. En maíz semejante sistema modelo es GS3. Las líneas puras de maíz selectas son típicamente recalcitrantes. En la soja tales sistemas modelo son Peking o Jack.
Según se utiliza en la presente memoria "Transformación" incluye la transformación estable y la transformación transitoria a menos que se indique de otro modo.
Según se utiliza en la presente memoria "Transformación Estable " hace referencia a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo anfitrión (esto incluye genomas tanto nucleares como de orgánulos) dando como resultado una herencia genéticamente estable. Además de los métodos tradicionales, la transformación estable incluye la alteración de la expresión génica mediante cualquier método incluyendo quimeroplastia o inserción de transposones.
Según se utiliza en la presente memoria "Transformación Transitoria" hace referencia a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico o proteína al núcleo (u orgánulo que contenga ADN) de un organismo anfitrión dando como resultado una expresión génica sin integración ni herencia estable.
Según se utiliza en la presente memoria, un constructo "silenciador de CHD" es una casete de expresión cuyo ARNm transcrito o proteína traducida disminuirá la expresión funcional de CHD activa en la célula. Semejante silenciamiento se puede lograr a través de la expresión de un constructo antisentido dirigido contra el gen estructural de CHD, un vector en el que el gen estructural de CHD o una porción de esta secuencia se utiliza para elaborar una horquilla de silenciamiento (o donde la horquilla de silenciamiento se une simultáneamente a la secuencia de CHD de alguna manera), o donde se utiliza una casete de expresión al alza de CHD para suprimir simultáneamente los niveles de CHD endógena. La actividad reductora de la proteína CHD endógena también se puede lograr a través de la expresión de un transgén que codifica un anticuerpo (incluyendo anticuerpos de cadena sencilla) dirigido contra un dominio funcional crítico de una molécula de CHD (por ejemplo, un anticuerpo que se originó contra el cromo-dominio de CHD).
Ácidos nucleicos
La expresión de genes de CHD y su localización dentro de la célula modulan su función de organización de la cromatina. Se han encontrado varios sitios de unión a CHD1 en la región de anclaje de la matriz nuclear de cromosomas de ratón, sugiriendo que esta proteína se une a los cromosomas, al menos durante ciertas fases del ciclo celular. Cuando las células entran en la mitosis, se ha demostrado en células de ratón que CHD1 es liberada en el citoplasma.
En un esfuerzo por dilucidar el efecto del ácido giberélico sobre el desarrollo de raíz de Arabidopsis, un grupo de científicos de UC Berkely (laboratorio de Sung) y de Carnegie Institute de Washington (laboratorio de Sommerville) descubrieron un mutante de Arabidopsis denominado pickle (pkl). El meristemo de la raíz primaria de la planta pkl tiene características embrionarias. Los tejidos de la raíz de las plantas pickle pueden regenerar nuevos embriones y plantas sin inducción hormonal (Ogas et al., Science 277: 91-94, 1997). Esta observación sugirió que el gen pkl sirve como represor clave para la embriogénesis vegetal. El gen fue cartografiado en una posición próxima a 48,4 en el cromosoma 2. La secuencia de AtPickle fue publicada después (Ogas et al., PNAS 96: 13839-13844, 1999) y se encontró que era un homólogo de CHD3. De modo interesante, se encontró recientemente que el mutante Arabidopsis gymnos (gym) era alélico con respecto a pkl. GYM (PKL) actúa como supresor para reprimir los genes que promueven actividades meristemáticas (Eshed et al., Cell 99: 199-209, 1999).
Desde que la identificación del primer gen CHD (MmCHD1, Delmas et al., PNAS 90:2414-2418, 1993), se han aislado hasta el momento un total de 13 genes altamente conservados. Los genes AtPKL y relacionados con AtPKL son los únicos genes CHD aislados de plantas.
Los genes CHD son requeridos para una inhibición apropiada de la transcripción de genes importantes durante el desarrollo. Muy probablemente, también se requiere que no sean funcionales durante la embriogénesis y/o la división celular. Para aquellas células en las que los represores clave todavía están presentes, la expresión el exceso de genes estimuladores, aguas abajo puede no ser capaz de superar la represión y por consiguiente, no se observaría aumento de la transformación. De este modo, la manipulación de los genes represores clave de manera que la actividad represora sea inhibida transitoriamente (antisentido, co-supresión, anticuerpo, etc.) puede ser un enfoque para establecer un entorno de embriogénesis y/o organogénesis. Trabajando solo o junto con LEC1, RepA o CycD, este enfoque puede mejorar la transformación.
Además, se puede utilizar la modulación de aspectos específicos de las rutas evolutivas tales como la embriogénesis para crear cultivos con alto contenido de aceite. Por otra parte, se puede utilizar la familia de genes CHD para apagar específicamente la expresión génica mediante diseño de dominios de unión a ADN específicos.
En muchos casos de apomixis, los tejidos maternos tales como el nucelo o integumento interno "dejan de brotar" produciendo embriones somáticos. Estos embriones se desarrollan después normalmente a semillas. Puesto que la meiosis y la fertilización se evitan, las plantas que se desarrollan a partir de tales semillas son genéticamente idénticas a la planta materna. Se espera que la supresión de la expresión del gen CHD en el integumento del nucelo, o en la célula madre de la megaespora desencadene la formación del embrión a partir de los tejidos maternos.
La producción de una semilla idéntica al parental tiene muchas ventajas. Por ejemplo se podrían utilizar híbridos de alto rendimiento en la producción de semillas para multiplicar copias idénticas de semillas híbridas de alto rendimiento. Esto reduciría enormemente el coste de las semillas tanto como aumentaría el número de genotipos que están disponibles en el mercado. Los genes pueden ser evaluados directamente en híbridos comerciales puesto que la progenie no se segregaría. Esto ahorraría años de cruzamiento recurrente.
La apomixis también proporcionaría un método de contención de transgenes cuando se uniera a la esterilidad masculina. La construcción de agamospermia autónoma estéril masculina evitaría la hibridación de rasgos diseñados genéticamente con plantas dañinas relacionadas.
La acumulación de genes sería relativamente fácil con la apomixis. Los híbridos serían re-transformados sucesivamente con diferentes nuevos rasgos y propagados por medio de apomixis. No sería necesario que los rasgos estuvieran ligados puesto que la apomixis evita los problemas asociados con la segregación.
La apomixis puede proporcionar una reducción del silenciamiento de los genes. El silenciamiento de los genes se observa frecuentemente tras las divisiones meióticas. Puesto que nunca se producen divisiones meióticas, puede ser posible eliminar o reducir la frecuencia de silenciamiento de genes. La apomixis también se puede utilizar para estabilizar los fenotipos deseables con rasgos complejos tales como el vigor híbrido. Tales rasgos se podrían mantener fácilmente y multiplicar indefinidamente por medio de la apomixis.
La supresión del gen CHD en células transformadas parece iniciar el desarrollo del embrión y estimular el desarrollo de los embriones pre-existentes. La expresión reducida del gen CHD debería estimular el crecimiento de las células transformadas, pero también asegurar que los embriones somáticos transformados se desarrollan de una manera normal, viable (aumentando la capacidad de los embriones somáticos transformados para germinar vigorosamente).
La supresión del gen CHD estimulará el crecimiento en células con el potencial de iniciar o mantener el crecimiento embriogénico. Las células de los meristemos establecidos o los linajes celulares derivados de meristemo pueden ser menos propensos a experimentar la transición a embriones.
Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden elaborar utilizando (a) métodos recombinantes convencionales, (b) técnicas sintéticas, o sus combinaciones. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención serán clonados, amplificados, o construidos de otro modo a partir de monocotiledóneas o dicotiledóneas. Los ejemplos típicos de las monocotiledóneas son maíz, sorgo, cebada, trigo, mijo, arroz, o agrostis. Las dicotiledóneas típicas incluyen sojas, girasol, canola, alfalfa, patata, o yuca.
Los fragmentos funcionales incluidos en la invención se pueden obtener utilizando cebadores que hibridan selectivamente en condiciones restrictivas. Los cebadores tienen generalmente al menos 12 bases de longitud y pueden tener tanto como 200 bases, pero generalmente tendrán de 15 a 75, preferiblemente de 15 a 50 bases. Los fragmentos funcionales pueden ser identificados utilizando una variedad de técnicas tales como el análisis de restricción, el análisis Southern, el análisis de prolongación de cebadores y el análisis de la secuencia del ADN.
La presente invención incluye una pluralidad de polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos idéntica. La degeneración del código genético permite que "las variaciones silenciosas" que se pueden utilizar, por ejemplo, hibriden selectivamente y detecten variantes alélicas de los polinucleótidos de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención incluye ácidos nucleicos aislados que comprenden variantes alélicas. El término "alelo" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un ácido nucleico relacionado del mismo gen.
Las variantes de ácidos nucleicos incluidas en la invención se pueden obtener, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido, mutagénesis de barrido con conectores, mutagénesis utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, y similares. Véase, por ejemplo, Ausubel, páginas 8.0.3-8.5.9. Véase también generalmente, McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A Practical Approach, (IRL Press, 1991). De este modo, la presente invención también abarca moléculas de ADN que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen una similitud de secuencia sustancial con las secuencias de la invención.
Las variantes incluidas en la invención pueden contener sustituciones, deleciones o adiciones individuales en las secuencias de ácido nucleico o polipéptido que alteran, añaden o suprimen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada son "variantes modificadas conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera sintéticamente, se puede sacar un beneficio de las preferencias codónicas conocidas del anfitrión pretendido.
La presente invención también incluye "shufflents" producidos mediante barajado de las secuencias de los polinucleótidos de la invención para obtener una característica deseada. El barajado de la secuencia se describe en la publicación PCT Núm. 96/19256. Véase también, Zhang, J. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509 (1997).
La presente invención también incluye el uso de regiones UTR 5' y 3' para la modulación de la traducción de secuencias codificantes heterólogas. Los motivos de secuencia positivos incluyen secuencias consenso de inicio de la traducción (Kozak, Nucleic Acids Res.15:8125 (1987)) y la estructura de protección terminal 7-metilguanosina (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)). Los elementos negativos incluyen estructuras en forma de asa ("stem-loop") UTR 5' intramoleculares estables (Muesing et al., Cell 48:691 (1987)) y secuencias AUG o marcos de lectura abiertos cortos precedidos por un AUG apropiado en la UTR 5' (Kozak, supra, Rao et al., Mol. y Cell. Biol. 8:284 (1988)).
Adicionalmente, los segmentos de polinucleótidos codificantes de polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados para alterar el uso codónico. Se puede emplear el uso codónico alterado para alterar la eficacia traduccional. El uso codónico en las regiones de polinucleótidos codificantes de la presente invención se puede analizar estadísticamente utilizando paquetes de soporte lógico disponibles en el mercado tales como "Codon Preference" asequible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (véase Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984)) o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.).
Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser optimizados para aumentar su expresión en plantas de interés. Véanse, por ejemplo, los documentos EPA0359472; WO91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res.17:477-498. De esta manera, los polinucleótidos pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos por la planta. Véase, por ejemplo, Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
La presente invención proporciona subsecuencias que comprenden ácidos nucleicos aislados que contienen al menos 20 bases contiguas de las secuencias de la invención. Por ejemplo el ácido nucleico aislado incluye aquellos que comprenden al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, o 500 nucleótidos contiguos de las secuencias de la invención. Las subsecuencias del ácido nucleico aislado se pueden utilizar para modular o detectar la expresión génica introduciendo en las subsecuencias compuestos que se unen, intercalan, escinden y/o entrecruzan con los ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender convenientemente un sitio de multiclonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasas insertados en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleótido. Asimismo, se pueden insertar secuencias traducibles para ayudar al aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un método conveniente para purificar las proteínas de la presente invención.
Un polinucleótido de la presente invención puede ser anclado a un vector, adaptador, promotor, péptido de tránsito o conector para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Se pueden añadir secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y conectores es bien conocido y se describe ampliamente en la técnica. Para una descripción de tales ácidos nucleicos véanse, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); y, Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo '97 (Arlington Heights, IL).
Las composiciones de ácido nucleico aisladas de esta invención, tales como ARN, ADNc, ADN genómico, o uno de sus híbridos, pueden ser obtenidas de fuentes biológicas vegetales utilizando cualquiera de las numerosas metodologías de clonación conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, se utilizan sondas oligonucleotídicas que hibridan selectivamente, en condiciones restrictivas, con los polinucleótidos de la presente invención para identificar la secuencia deseada en la genoteca de ADNc o ADN genómico.
Los protocolos ilustrativos de aislamiento de ARN y ARNm total se describen en Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997); y, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995). Los kits de aislamiento de ARN y ARNm total son asequibles comercialmente de proveedores tales como Stratagene (La Jolla, CA), Clonetech (Palo Alto, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), y 5'-3' (Paoli, PA). Véanse también las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.614.391; y, 5.459.253.
Los protocolos típicos de síntesis de ADNc son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en referencias normalizadas tales como: Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997); y, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995). Los kits de síntesis de ADNc son asequibles de una variedad de proveedores comerciales tales como Stratagene o Pharmacia.
Un método ilustrativo de construcción de una genoteca de ADNc completos con una pureza de más del 95% se es descrito por Caminci et al., Genomics, 37:327-336 (1996). Otros métodos para producir genotecas completas son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Edery et al., Mol. Cell Biol.15(6):3363-3371 (1995); y la Solicitud PCT WO 96/34981.
A menudo es conveniente normalizar una genoteca de ADNc para crear una genoteca en la que cada clon esté representado más equitativamente. Se conocen en la técnica numerosos enfoques para normalizar genotecas de ADNc. La construcción de genotecas normalizadas es descrita por Ko, Nucl. Acids. Res. 18(19):5705-5711 (1990); Patanjali et al., Proc. Natl. Acad. U.S.A. 88:1943-1947 (1991); Patentes de los Estados Unidos 5.482.685 y 5.637.685; y Soares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9228-9232 (1994).
Las genotecas sustractivas de ADNc son otro método para incrementar la proporción de especies de ADNc menos abundantes. Véanse, Foote et al. in, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997); Kho y Zarbl, Technique 3(2):58-63 (1991); Sive y St. John, Nucl. Acids Res. 16(22):10937 (1988); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995); y, Swaroop et al., Nucl. Acids Res. 19(8):1954 (1991). Los kits de sustracción de ADNc se encuentran disponibles en el mercado. Véase, p. ej., PCR-Select (Clontech).
Para construir genotecas genómicas, se generan grandes segmentos de ADN genómico mediante fragmentación al azar. Los ejemplos de las técnicas e instrucciones biológicas moleculares apropiadas se encuentran en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Vols. 1-3 (1989), Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger y Kimmel, Eds., San Diego: Academic Press, Inc. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997). Los kits para la construcción de genotecas genómicas también se encuentran disponibles en el mercado.
La genoteca de ADNc o genómica puede ser escrutada utilizando una sonda basada en las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención tales como los descritos en la presente memoria. Las sondas se pueden utilizar para hibridar con secuencias de ADN genómico o ADNc para aislar polinucleótidos homólogos en la misma o diferente especie vegetal. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden emplear en el análisis diferentes grados de restricción de la hibridación; y que el medio de hibridación o lavado puede ser restrictivo. El grado de restricción se puede controlar por medio de la temperatura, fuerza iónica, pH y por medio de la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida.
Típicamente, las condiciones de hibridación restrictivas serán aquellas en las que la concentración de sal sea una concentración de iones Na menor de aproximadamente 1,5 M, típicamente una concentración de iones Na de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30ºC para las sondas cortas (p. ej., 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para las sondas largas (p. ej., más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones restrictivas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.
Las condiciones ilustrativas de una baja restricción incluyen hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1% a 37ºC, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50ºC. Las condiciones ilustrativas de restricción moderada incluyen hibridación en formamida del 40 al 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55ºC. Las condiciones ilustrativas de restricción elevada incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1 X SSC a 60ºC. Típicamente el tiempo de hibridación es de 4 a 16 horas.
Una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995). A menudo, las genotecas de ADNc pueden ser normalizadas para incrementar la representación de ADNc relativamente raros.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser amplificados a partir de muestras de ácido nucleico utilizando técnicas de amplificación. Por ejemplo, se puede utilizar la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y polinucleótidos relacionados directamente a partir de genotecas de ADN genómico y ADNc. La PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas que se van a expresar, para elaborar ácidos nucleicos para utilizarlos como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para la secuenciación de ácido nucleico, o con otros fines.
Los ejemplos de las técnicas útiles para los métodos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullis et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.202 (1987); y, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los kits disponibles en el mercado para la amplificación mediante PCR genómica son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Se puede utilizar la proteína del gen 32 de T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de la PCR largos. También se han descrito métodos de escrutinio basados en la PCR. Wilfinger et al. describen un método basado en la PCR en el que el ADNc más largo es identificado en la primera etapa de manera que se pueden eliminar del estudio los clones incompletos. BioTechniques,
22(3):481-486 (1997).
En un aspecto de la invención, se pueden amplificar los ácidos nucleicos de una genoteca de ácido nucleico vegetal. La genoteca de ácido nucleico puede ser una genoteca de ADNc, una genoteca genómica, o una genoteca construida generalmente a partir de transcritos nucleares en cualquier fase del procesamiento del intrón. Las genotecas se pueden elaborar a partir de una variedad de tejidos vegetales. Se han obtenido buenos resultados utilizando tejidos mitóticamente activos tales como meristemos de la raíz, cultivos de meristemo de raíz, embriones, callo y cultivos en suspensión, espigas y borlas inmaduras, y plántulas jóvenes. Los ADNc de la presente invención se obtuvieron de genotecas de embriones zigóticos inmaduros y callos en regeneración.
Alternativamente, las secuencias de la invención se pueden utilizar para aislar las correspondientes secuencias en otros organismos, concretamente otras plantas, más concretamente, otras monocotiledóneas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como la PCR, la hibridación, y similares para identificar tales secuencias que tienen una similitud de secuencia sustancial con las secuencias de la invención. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). e Innis et al. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York). Las secuencias codificantes aisladas basándose en su identidad de secuencia con las secuencias codificantes de la invención completas expuestas en la presente memoria o sus fragmentos están incluidas en la presente invención.
Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden preparar mediante síntesis química directa por métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); el método del fosfodiester de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981); el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862 (1981), p. ej., utilizando un sintetizador automático, p. ej., como describen Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984); y, el método en soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.458.066. La síntesis química produce generalmente un oligonucleótido de hebra sencilla. Esta se puede convertir en un ADN de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como molde. Un experto en la técnica reconocerá que si bien la síntesis química de ADN está limitada a las secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de secuencias más cortas.
Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria incluyen aquellos amplificados utilizando los siguientes pares de cebadores: SEQ ID NOS: 3 y 4; 7 y 8; 11 y 12; 15 y 16; 19 y 20; 23 y 24; 27 y 28; 31 y 32; 35 y 36; y 39 y 40.
Casetes de expresión
En otra realización se proporcionan casetes de expresión que comprenden ácidos nucleicos aislados de la presente invención. Una casete de expresión comprenderá típicamente un polinucleótido de la presente invención conectado operablemente a secuencias reguladoras del inicio de la transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula anfitriona pretendida, tales como los tejidos de una planta transformada.
La construcción de tales casetes de expresión que se pueden emplear junto con la presente invención es bien conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Véanse, p. ej., Sambrook, et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, Nueva York; (1989); Gelvin, et al.; Plant Molecular Biology Manual (1990); Plant Biotechnology: Commercial Prospects and Problems, eds. Prakash, et al.; Oxford & IBH Publishing Co.; Nueva Delhi. India; (1993); y Heslot, et al.; Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts; CRC Press, Inc., USA; (1992).
Por ejemplo, los vectores de expresión vegetales pueden incluir (1) un gen vegetal clonado bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión vegetales también pueden contener, si se desea, una región reguladora del promotor (p. ej., una que confiere una expresión inducible, constitutiva, regulada medioambientalmente o evolutivamente, o específica/selectiva de una célula o un tejido), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación.
Se pueden emplear promotores constitutivos preferidos por el tejido o inducibles. Los ejemplos de los promotores constitutivos incluyen la región de inicio de la transcripción del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1' o 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor de la actina, el promotor de la ubiquitina, el promotor H2B de la histona (Nakayama et al., 1992, FEBS Lett 30:167-170), el promotor Smas, el promotor de la cinamil-alcohol deshidrogenasa (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.683.439), el promotor Nos, el promotor pEmu, el promotor de la rubisco, el promotor GRP1-8, y otras regiones de inicio de la transcripción de diferentes genes vegetales conocidos en la técnica.
Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adh1 que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70 que es inducible por el estrés por calor, el promotor PPDK que es inducible por la luz, el promotor In2 que es inducido por antídoto, el promotor ERE que es inducido por estrógeno y el promotor de Pepcarboxilasa que es inducido por la luz.
Los ejemplos de los promotores bajo control evolutivo incluyen aquellos que inician la transcripción preferentemente en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, frutos, semillas, o flores. Un promotor ilustrativo es el promotor específico de las anteras 5126 (Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.689.049 y 5.689.051). Los ejemplos de los promotores preferidos para las semillas incluyen, pero no están limitados a, el promotor de zeína gamma de 27 kD y el promotor ceroso, Boronat, A., Martinez, M.C., Reina, M., Puigdomenech, P. y Palau, J.; Isolation and sequencing of a 28 kD glutelin-2 gene from maize: Common elements in the 5' flanking regions among zein and glutelin genes; Plant Sci. 47:95-102 (1986) y Reina, M., Ponte, I., Guillen, P., Boronat, A. y Palau, J., Sequence analysis of a genomic clone encoding a Zc2 protein from Zea mays W64 A, Nucleic Acids Res. 18(21):6426 (1990). Véase el siguiente sitio referente al promotor ceroso: Kloesgen, R.B., Gierl, A., Schwarz-Sommer, Z.S. y Saedier, H., Molecular analysis of the waxy locus of Zea mays, Mol. Gen. Genet. 203:237-244 (1986).
Se puede utilizar el promotor Nuc1 de cebada o maíz, el promotor Cim 1 de maíz o el promotor LTP2 de maíz para expresar preferentemente en el nucelo. Véase por ejemplo el documento US Núm. de Serie 60/097.233 presentado el 20 de Agosto de 1998 cuya descripción se incorpora a la presente memoria como referencia. Se pueden emplear promotores heterólogos o no heterólogos (esto es, endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. Estos promotores también se pueden utilizar, por ejemplo, en casetes de expresión para dirigir la expresión de ácidos nucleicos antisentido para reducir, aumentar, o alterar la concentración y/o composición de las proteínas de la presente invención en un tejido deseado.
Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante de polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de genes vegetales distintos, o de ADN-T. La secuencia del extremo 3' que se va a añadir puede derivar, por ejemplo, de los genes de la nopalina sintasa o la octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.
Se puede añadir una secuencia intrónica a la región no traducida 5' o a la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula. Véanse por ejemplo Buchman y Berg, Mol. Cell Biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). Se conoce el uso de los intrones de maíz Adh1-S 1, 2, y 6, el intrón Bronze-1. Véase en general, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, Nueva York (1994).
El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención comprenderá típicamente un gen marcador que confiera un fenotipo seleccionable a las células vegetales. Normalmente, el gen marcador seleccionable codificará la resistencia a antibióticos o herbicidas. Los genes adecuados incluyen aquellos que codifican la resistencia a los antibióticos espectinomicina y estreptomicina (p. ej., el gen aada), el gen de la estreptomicin-fosfotransferasa (SPT) que codifica la resistencia a estreptomicina, el gen de la neomicin-fosfotransferasa (NPTII) que codifica la resistencia a kanamicina o geneticina, el gen de la higromicin-fosfotransferasa (HPT) que codifica la resistencia a higromicina.
Los genes adecuados que codifican la resistencia a herbicidas incluyen aquellos que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (p. ej., el gen de la acetolactato sintasa (ALS) gene contiene mutaciones que conducen a semejante resistencia en particular las mutaciones S4 y/o Hra), aquellos que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (p. ej., el gen bar), u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida Basta y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorsulfuron.
Si bien es útil junto con los marcadores selectivos de resistencia a antibióticos y herbicidas anteriores (esto es, el uso del gen CHD puede aumentar las frecuencias de transformación cuando se utiliza selección química), el uso del gen CHD confiere una ventaja de crecimiento para las células transformadas sin la necesidad de compuesto inhibidores para retardar el crecimiento de los no transformados. De este modo, los transformantes para CHD se recuperan basándose solamente en su ventaja de crecimiento diferencial.
Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et al., Meth. In Enzymol. 153:253-277 (1987). Los vectores de A. tumefaciens ilustrativos útiles en la presente memoria son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl et al., Gene, 61:1-11 (1987) y Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8402-8406 (1989). Otro vector útil en la presente memoria es el plásmido pBl101.2 que es asequible de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA).
Se conocen en la técnica una variedad de virus vegetales que se pueden emplear como vectores e incluyen el virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el geminivirus, el virus del mosaico del bromo, y el virus del mosaico del
tabaco.
Un polinucleótido de la presente invención puede ser expresado en orientación efectora o antisentido según se desee. En las células vegetales, se ha demostrado que el ARN antisentido inhibe la expresión génica evitando la acumulación de ARNm que codifica la enzima de interés, véanse, p. ej., Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8805-8809 (1988); y Hiatt et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.801.340.
Otro método de supresión es la supresión efectora. Se ha demostrado que la introducción de ácido nucleico configurado en orientación efectora es un método eficaz por medio del cual se bloquea la transcripción de genes diana. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de genes endógenos véanse, Napoli et al., The Plant Cell 2:279-289 (1990) y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.034.323. Un trabajo reciente ha mostrado la supresión con el uso de ARN de doble hebra. Semejante trabajo es descrito por Tabara et al., Science 282:5388:430-431 (1998). Se describen enfoques de horquillas de supresión de genes en los documentos WO 98/53083 y WO 99/53050.
Las moléculas de ARN catalíticas o ribozimas también se pueden utilizar para inhibir la expresión de genes vegetales. La inclusión de secuencias de ribozimas en los ARN antisentido les confiere actividad de escisión del ARN, incrementando de ese modo la actividad de los constructos. El diseño y uso de ribozimas específicas de ARN diana es descrito por Haseloff et al., Nature 334:585-591 (1988).
Se pueden utilizar una variedad de agentes de entrecruzamiento, agentes alquilantes y especies generadoras de radicales como grupos pendientes en los polinucleótidos de la presente invención para unir, marcar, detectar, y/o escindir ácidos nucleicos. Por ejemplo, Vlassov, V. V., et al., Nucleic Acids Res (1986) 14:4065-4076, describen la unión covalente de un fragmento de ADN de hebra sencilla con derivados alquilantes de nucleótidos complementarios a secuencias diana. Un informe de un trabajo similar por el mismo grupo es el de Knorre, D. G., et al., Biochimie (1985) 67:785-789. Iverson y Dervan también mostraron una escisión específica de la secuencia de ADN de hebra sencilla mediada por la incorporación de un nucleótido modificado que era capaz de activar la escisión (J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:1241-1243). Meyer, R. B., et al., J. Am. Chem. Soc. (1989) 111:8517-8519, efectuaron el entrecruzamiento covalente a un nucleótido diana utilizando un agente alquilante complementario a la secuencia de nucleótidos diana de hebra sencilla. Un entrecruzamiento fotoactivado con oligonucleótidos de hebra sencilla por psoraleno fue descrito por Lee, B. L., et al., Biochemistry (1988) 27:3197-3203. Home, et al., J. Am. Chem. Soc. (1990) 112:2435-2437 también describieron el uso de entrecruzamiento en sondas formadoras de triple hélice. El uso de N4,N4-etanocitosina como agente alquilante para entrecruzar con oligonucleótidos de hebra sencilla también ha sido descrito por Webb y Matteucci, J. Am. Chem. Soc. (1986) 108:2764-2765; Nucleic Acids Res (1986) 14:7661-7674; Feteritz et al., J. Am. Chem. Soc. 113:4000 (1991). Se conocen en la técnica diferentes compuestos para unir, detectar, marcar, y/o escindir ácidos nucleicos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.543.507; 5.672.593; 5.484.908; 5.256.648; y, 5.681.941.
Proteínas
Las proteínas CHD se denominan por los tres dominios funcionales que contienen. Estos incluyen: un modificador de la organización de la cromatina, un dominio helicasa/ATPasa (similar al factor remodelador de la cromatina (SNF2) encontrado primero en la levadura, denominado después mutante "no fermentador de sacarosa", y un dominio de unión a ADN. Se sugiere que las proteínas CHD están implicadas en una gama de procesos básicos incluyendo la modificación de la estructura de la cromatina, la reparación de ADN, la regulación de la transcripción, etc. En particular, las proteínas CHD inhiben la transcripción probablemente uniéndose a extensiones de AT relativamente largas en el ADN de doble hebra por medio de interacciones con el surco menor. Las proteínas CHD están formadas por dos sub-familias. CHD1 y CHD2 pertenecen a la primera sub-familia mientras CHD3 y CHD4 pertenecen a la segunda sub-familia. Una diferencia principal entre estas dos sub-familias es que la CHD de la segunda sub-familia tiene un dominio en dedo de cinc en el extremo N terminal que se pensaba que interaccionaba con las histona desacetilasas. Otra característica es que las regiones de unión al ADN de los miembros de la segunda sub-familia son más divergentes que los miembros de la primera sub-familia.
Las proteínas de la presente invención incluyen proteínas que tienen las secuencias descritas como también las proteínas codificadas por los polinucleótidos descritos. Además las proteínas de la presente invención incluyen proteínas derivadas de la proteína nativa mediante deleción (también denominada truncamiento), adición o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa. Tales variantes pueden resultar, por ejemplo, del polimorfismo genético o de la manipulación humana. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica.
Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido se pueden preparar mediante mutaciones en la secuencia de ADN clonado que codifica la proteína nativa de interés. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York): Patente de los Estados Unidos Núm. 4.873.192; y las referencias allí citadas. Las pautas en cuanto a las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés se pueden encontrar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Se pueden preferir sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares.
Al construir variantes de las proteínas de interés, generalmente se realizarán modificaciones en las secuencias de nucleótidos que codifican las variantes de manera que las variantes continúen teniendo la actividad deseada.
Las proteínas aisladas de la presente invención incluyen un polipéptido que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos codificados por uno cualquiera de los ácidos nucleicos de la presente invención, o polipéptidos que son variantes modificadas conservativamente del mismo. Las proteínas de la presente invención o sus variantes pueden comprender cualquier número de restos aminoácido contiguos de un polipéptido de la presente invención, donde ese número se selecciona del grupo de números enteros que consisten en 25 al número de restos de un polipéptido completo de la presente invención. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoácidos contiguos tiene al menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 aminoácidos de longitud.
La presente invención incluye polipéptidos catalíticamente activos (esto es, enzimas). Los polipéptidos catalíticamente activos tendrán generalmente una actividad específica de al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% la del polipéptido endógeno nativo (no sintético). Adicionalmente, la especificidad de sustrato (k_{cat}/K_{m}) es esencialmente similar a la del polipéptido endógeno nativo (no sintético). Típicamente, la K_{m} será de al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% la del polipéptido endógeno nativo (no sintético). Los métodos de análisis y cuantificación de las medidas de la actividad enzimática y la especificidad de sustrato (k_{cat}/K_{m}), son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La presente invención incluye modificaciones que se pueden realizar en una proteína de la invención. En particular, puede ser deseable disminuir la actividad del gen. Se pueden realizar otras modificaciones para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de la molécula diana a una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida al extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (p. ej., poli His) situados en cualquier extremo para crear sitios de restricción o codones de terminación o secuencias de purificación convenientemente localizados.
Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteína de la presente invención en células diseñadas recombinantemente tales como células de bacteria, levadura, insecto, mamífero, o vegetales. Las células producen la proteína en una condición no natural (p. ej., en una cantidad, composición, localización, y/o momento), debido a que han sido alteradas genéticamente por medio de la intervención humana para que sea así.
Típicamente, se utilizará una célula anfitriona intermedia en la práctica de esta invención para incrementar el número de copias del vector de clonación. Con un incremento del número de copias, el vector que contiene el gen de interés puede ser aislado en cantidades significativas para su introducción en las células vegetales deseadas.
Las células anfitrionas que se pueden utilizar en la práctica de esta invención incluyen procariotas y eucariotas. Los procariotas incluyen anfitriones bacterianos tales como Escherichia coli, Salmonella typhimurium, y Serratia marcescens. Los anfitriones eucarióticos tales como levaduras u hongos filamentosos también pueden ser utilizados en esta invención. Puesto que estos anfitriones también son microorganismos, será esencial asegurarse de que se utilizan en el vector los promotores vegetales que no causan la expresión del polipéptido en bacterias.
Las secuencias de control procariótico comúnmente utilizadas incluyen promotores comúnmente utilizados tales como los sistemas promotores de la beta lactamasa (penicilinasa) y la lactosa (lac) (Chang et al., Nature 198:1056 (1977)), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) y el promotor P L y el sitio de unión al ribosoma del gen N derivados de lambda (Shimatake et al., Nature 292:128 (1981)). La inclusión de marcadores de selección en vectores de ADN transfectados en E. coli también es útil. Los ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican resistencia a ampicilina, tetraciclina, o cloranfenicol.
El vector se selecciona para permitir la introducción en la célula anfitriona apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen plasmídico de de fagos. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención son asequibles utilizando Bacillus sp. y Salmonella (Palva, et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach, et al., Nature 302:543-545 (1983)).
La síntesis de proteínas heterólogas en levaduras es bien conocida. Véase Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas, y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia son conocidos en la técnica y asequibles de proveedores comerciales (p. ej., Invitrogen). Los vectores adecuados tienen normalmente secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo la 3-fosfoglicerato quinasa o la alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.
Una proteína de la presente invención, una vez expresada, puede ser aislada de levaduras lisando las células y aplicando técnicas de aislamiento de proteínas convencionales a los productos lisados. El control del procedimiento de purificación se puede completar utilizando técnicas de transferencia Western o radioinmunoanálisis de otras técnicas de inmunoanálisis convencionales.
Las proteínas de la presente invención también se pueden construir utilizando métodos sintéticos no celulares. La síntesis en fase sólida de proteínas de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud se puede completar anclando el aminoácido C terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido de la adición sucesiva de los aminoácidos restantes de la secuencia. Las técnicas para la síntesis en fase sólida son descritas por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A.; Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Las proteínas de mayor longitud pueden ser sintetizadas mediante condensación de los extremos amino y carboxi de fragmentos más cortos. Los métodos de formación de enlaces peptídicos mediante activación de un extremo carboxi terminal (p. ej., mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-diciclohexilcarbodiimida)) es conocida por los expertos.
Las proteínas de esta invención, recombinantes o sintéticas, pueden ser purificadas hasta una pureza sustancial mediante mecanismos convencionales bien conocidos en la técnica, incluyendo solubilización con detergente, precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio, cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación, y otros. Véanse, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: Nueva York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990). Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos para las proteínas como se describe en la presente memoria. La purificación a partir de E. coli se puede lograr siguiendo los procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.511.503. La detección de la proteína expresada se logra mediante métodos conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, radioinmunoanálisis, técnicas de transferencia Western o inmunoprecipitación.
La presente invención proporciona adicionalmente un método para modular (esto es, aumentar o disminuir) la concentración o composición de los polipéptidos de la presente invención en una planta o una de sus partes. La modulación se puede efectuar aumentando o disminuyendo la concentración y/o la composición (esto es, la razón de los polipéptidos de la presente invención) en una planta.
El método comprende transformar una célula vegetal con una casete de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención para obtener una célula vegetal transformada, hacer crecer la célula vegetal transformada en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido en la célula vegetal en una cantidad suficiente para modular la concentración y/o composición en la célula vegetal vegetal.
En algunas realizaciones, el contenido y/o la composición de los polipéptidos de la presente invención de una planta puede ser modulado alterando, in vivo o in vitro, el promotor de un gen no aislado de la presente invención para regular al alza o a la baja la expresión del gen. En algunas realizaciones, las regiones codificantes de los genes nativos de la presente invención pueden ser alteradas por medio de sustitución, adición, inserción, o deleción para disminuir la actividad de la enzima codificada. Véanse, p. ej., Kmiec, Patente de los Estados Unidos 5.565.350; Zarling et al., documento PCT/US93/03868 (WO 93/22443). Un método de regulación a la baja de la proteína implica utilizar secuencias PEST que proporcionan una diana para la degradación de la proteína.
En algunas realizaciones, se transfecta a una célula vegetal un ácido nucleico aislado (p. ej., un vector) que comprende una secuencia promotora. Con posterioridad, se selecciona una célula vegetal que comprende el promotor conectado operablemente a un polinucleótido de la presente invención mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica tales como, pero no limitados a, transferencia Southern, secuenciación de ADN, o análisis PCR utilizando cebadores específicos para el promotor y para el gen y detectando los amplicones producidos de allí. La planta o parte de la planta alterada o modificada mediante las realizaciones anteriores se hace crecer en condiciones de formación de plantas durante un tiempo suficiente para modular la concentración y/o composición de polipéptidos de la presente invención en la planta. Las condiciones de formación de plantas son bien conocidas en la técnica.
En general, el contenido del polipéptido aumenta o disminuye en al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% con respecto a una planta de control nativa, una parte de una planta, o una célula que carece de la casete de expresión anteriormente mencionada. En la presente invención la modulación puede ocurrir durante y/o después del crecimiento de la planta hasta la fase de desarrollo deseada. La modulación de la expresión del ácido nucleico temporalmente y/o en tejidos concretos se puede controlar empleando el promotor apropiado conectado operablemente a un polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, en orientación efectora o antisentido como se ha comentado con más detalle, supra. La inducción de la expresión de un polinucleótido de la presente invención también puede ser controlada mediante la administración exógena de una cantidad eficaz de compuesto inductor. Los promotores inducibles y los compuestos inductores que activan la expresión a partir de estos promotores son bien conocidos en la técnica. En las realizaciones preferidas, los polipéptidos de la presente invención se modulan en monocotiledóneas o dicotiledóneas, preferiblemente maíz, sojas, girasol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, arroz, cebada y mijo.
Los medios de detección de las proteínas de la presente invención no son aspectos críticos de la presente invención. En una realización preferida, las proteínas se detectan y/o cuantifican utilizando cualquiera de los numerosos análisis de unión inmunológica bien reconocidos (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoanálisis generales, véanse también Methods in Cell Biology, Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Ed., Academic Press, Inc. Nueva York (1993); Basic and Clinical Immunology 7ª Edición, Stites & Terr, Eds. (1991). Por otra parte, los inmunoanálisis de la presente invención se pueden realizar en cualquiera de las numerosas configuraciones, p. ej., aquellas revisadas en Enzyme Immunoassay, Maggio, Ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1985); Harlow y Lane, supra; Immunoassay: A Practical Guide, Chan, Ed., Academic Press, Orlando, FL (1987); Principles and Practice of Immunoassays, Price and Newman Eds., Stockton Press, NY (1991); y Non-isotopic Immunoassays, Ngo, Ed., Plenum Press, NY (1988).
Los métodos típicos incluyen el análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), los métodos bioquímicos analíticos tales como electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, y similares, y diferentes métodos inmunológicos tales como reacciones con precipitina en fluido o gel, inmunodifusión (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoanálisis (RIA), análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), análisis de inmunofluorescencia, y similares.
A menudo se anclan marcas no radiactivas mediante métodos indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (p. ej., biotina) se une covalentemente a la molécula. Después se une el ligando a una molécula de anti-ligando (p. ej., estreptavidina) que es detectable inherentemente o se une covalentemente a un sistema señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Se pueden utilizar numerosos ligandos y anti-ligandos. Cuando un ligando tiene un anti-ligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina, y cortisol, éste se puede utilizar junto con los anti-ligandos de origen natural, marcados. Alternativamente, se puede utilizar cualquier compuesto hapténico o antigénico combinado con un anticuerpo.
Las moléculas también pueden ser conjugadas directamente con compuestos generadores de señal, p. ej., mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como marcas serán principalmente hidrolasas, concretamente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas, concretamente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalazinodionas, p. ej., luminol. Para una revisión de los diferentes sistemas de marcaje o producción de señales que se pueden utilizar véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.391.904.
Algunos formatos de análisis no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, se pueden utilizar análisis de aglutinación para detectar la presencia de los anticuerpos diana. En este caso, las partículas recubiertas con antígeno son aglutinadas por las muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, no se necesita que ninguno de los componentes esté marcado y la presencia del anticuerpo diana se detecta mediante una simple inspección visual.
Las proteínas de la presente invención se pueden utilizar para identificar compuestos que se unen a (p. ej., sustratos), y/o aumentan o disminuyen (esto es, modulan) la actividad enzimática de los polipéptidos catalíticamente activos de la presente invención. El método comprende poner en contacto un polipéptido de la presente invención con un compuesto cuya capacidad para unirse o modular la actividad enzimática está por determinar. El polipéptido empleado tendrá al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la actividad específica del polipéptido nativo, completo de la presente invención (p. ej., enzima). Los métodos para medir la cinética enzimática son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Segel, Biochemical Calculations, 2ª ed., John Wiley and Sons, Nueva York
(1976).
Se pueden originar anticuerpos para una proteína de la presente invención, incluyendo las variantes individuales, alélicas, de cepa, o de especie, y sus fragmentos, tanto en sus formas naturales (completas) como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, los anticuerpos se originan para estas proteínas en sus configuraciones nativas o en sus configuraciones no nativas. También se pueden generar anticuerpos anti-idiotípicos. Muchos métodos de elaboración de anticuerpos son conocidos por los expertos.
En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diferentes anfitriones mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentran, p. ej., en Basic and Clinical Immunology, 4ª ed., Stites et al., Eds., Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias allí citadas; Harlow y Lane, Supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., Academic Press, Nueva York, NY (1986); y Kohler y Milstein, Nature 256:495-497
(1975).
Otras técnicas adecuadas implican la selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares (véanse, p. ej., Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); y Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996)). Alternativamente, se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos de elevada avidez de ratones transgénicos que comprenden fragmentos de loci de Ig de la cadena pesada y ligera humana no reordenados (esto es, ratones transgénicos para minilocus). Fishwild et al., Nature Biotech., 14:845-851 (1996). Asimismo, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes. Véanse, Cabilly, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-10033 (1989).
Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar para la cromatografía de afinidad en el aislamiento de proteínas de la presente invención, para escrutar genotecas de expresión en busca de productos de expresión concretos tales como proteínas normales o anómalas o para originar anticuerpos anti-idiotípicos que son útiles para detectar o diagnosticas diferentes condiciones patológicas relacionadas con la presencia de los respectivos antígenos.
Frecuentemente, las proteínas y anticuerpos de la presente invención se marcarán uniendo, covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y son referidas ampliamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionucleótidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, radicales fluorescentes, radicales quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares.
Transformación de Células
El método de transformación no es crítico para la presente invención; actualmente se encuentran disponibles diferentes métodos de transformación. A medida que se encuentran disponibles métodos más modernos para transformar cultivos u otras células anfitrionas éstos se pueden aplicar directamente. Por consiguiente, se han desarrollado una amplia variedad de métodos para insertar una secuencia de ADN en el genoma de una célula anfitriona para obtener la transcripción y/o traducción de la secuencia para efectuar cambios fenotípicos en el organismo. De este modo, se puede emplear cualquier método que proporcione una transformación/transfección eficaz.
Se puede utilizar una secuencia de ADN que codifica el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un ADNc o una secuencia genómica que codifica una proteína completa, para construir una casete de expresión que puede ser introducida en la planta deseada. Se pueden introducir ácidos nucleicos aislados de la presente invención en plantas de acuerdo con mecanismos conocidos en la técnica. Generalmente, se preparan casetes de expresión como se ha descrito antes y adecuadas para la transformación de células vegetales.
Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies vegetales superiores son bien conocidas y descritas en la literatura técnicas, científica, y de patentes. Véase, por ejemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Por ejemplo, el constructo de ADN puede ser introducido directamente en el ADN genómico de la célula vegetal utilizando técnicas tales como la electroporación, la poración con PEG, el bombardeo de partículas, liberación con fibra de silicio, o microinyección de protoplastos de células vegetales o callo embriogénico. Véanse, p. ej., Tomes et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment. págs. 197-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. eds. O. L. Gamborg y G.C. Phillips. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Nueva York, 1995. Alternativamente, se pueden combinar constructos de ADN con regiones limítrofes de ADN-T adecuado e introducirlos en un vector anfitrión Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del anfitrión Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción del constructo y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula sea infectada por la bacteria. Véase, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.591.616.
La introducción de constructos de ADN utilizando la precipitación con polietilenglicol es descrita por Paszkowski et al., Embo J. 3:2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación son descritas por Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5824 (1985). Las técnicas de transformación balísitica son descritas por Klein et al., Nature 327:70-73 (1987).
Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens están bien descritas en la literatura científica. Véanse, por ejemplo Horsch et al., Science 233:496-498 (1984), y Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803 (1983). Por ejemplo, la transformación con Agrobacterium de maíz se describe en el documento US 5.981.840. La transformación con Agrobacterium de soja se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.563.055.
Otros métodos de transformación incluyen (1) la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes (véanse, p. ej., Lichtenstein y Fuller En: Genetic Engineering, Vol. 6, PWJ Rigby, Ed., Londres, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, C. P., y Draper, J,. En: DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985). La solicitud PCT/US87/02512 (documento WO 88/02405 publicado el 7 de Abril de 1988) describe el uso de la cepa A4 de A. rhizogenes y su plásmido Ri junto con los vectores de A. tumefaciens pARC8 o pARC16 (2) la absorción de ADN mediada por liposomas (véase, p. ej., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25:1353, (1984)), (3) el método del vórtice (véase, p. ej., Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1228, (1990)).
También se puede introducir ADN en plantas mediante transferencia directa de ADN al polen como describen Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988). Se puede obtener la expresión de polipéptidos que codifican polinucleótidos mediante inyección del ADN en los órganos reproductores de una planta como describen Pena et al., Nature, 325:274 (1987). También se puede inyectar el ADN directamente en las células de embriones inmaduros y rehidratación de embriones desecados como describen Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); y Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pip. 27-54 (1986).
Las células anfitrionas animales y eucarióticas inferiores (p. ej., levadura) son competentes o se vuelven competentes para la transformación mediante diferentes métodos. Existen numerosos métodos bien conocidos de introducción de ADN en células animales. Estos incluyen: precipitación con fosfato de calcio, fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, tratamiento de las células receptoras con liposomas que contienen el ADN, DEAE dextrano, electroporación, biolística, y micro-inyección del ADN directamente en las células. Las células transfectadas se cultivan mediante métodos bien conocidos en la técnica. Kuchler, R.J., Biochemical Methods in Cell Culture y Virology, Dowden, Hutchinson y Ross, Inc. (1977).
Alteración del medio de cultivo para suprimir la embriogénesis somática en células y/o tejidos vegetales no transformados para proporcionar un método de sección positivo de células vegetales transformadas
Utilizando los siguiente métodos para controlar la embriogénesis somática, es posible alterar los componentes del medio de cultivo de tejido vegetal para suprimir la embriogénesis somática en una especie vegetal de interés (que a menudo tienen múltiples componentes que se podrían ajustar potencialmente para conferir este efecto). Tales condiciones no conferirían un entorno negativo o tóxico in vitro para el tejido de tipo salvaje, sino que en su lugar simplemente no produciría una forma de crecimiento embriogénico somático. La supresión de la expresión del gen CHD estimulará la embriogénesis somática y el crecimiento en las células o tejidos transformados, proporcionando un claro escrutinio de crecimiento diferencial útil para identificar los transformantes.
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La alteración de una amplia variedad de componentes del medio puede modular la embriogénesis somática (estimulando o suprimiendo la embriogénesis dependiendo de la especie y del componente concreto del medio). Los ejemplos de los componentes del medio que, cuando se alteran, pueden estimular o suprimir la embriogénesis somática incluyen;
1.
\;
1)
el propio medio basal (macronutriente, micronutrientes y vitaminas; véase T.A. Thorpe, 1981 for review, "Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture", Academic Press, NY),
2.
\;
2)
fitohormonas vegetales tales como auxinas (ácido indolacético, ácido indolbutírico, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido naftalenoacético, picloram, dicamba y otros análogos funcionales), citoquininas (zeatina, cinetina, bencilaminopurina, 2-isopentil-adenina y compuestos funcionalmente relacionados), ácido abscísico, adenina, y ácido giberélico,
3.
\;
3)
y otros compuestos que ejercen efectos "reguladores del crecimiento" tales como agua de coco, hidrolizado de caseína, y prolina, y
4.
\;
4)
el tipo y concentración de agente gelificante, el pH y la concentración de sacarosa.
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Se ha demostrado en la literatura que los cambios en los componentes individuales enumerados antes (o en algunos casos combinaciones de componentes) modulan la embriogénesis somática in vitro a través de una amplia gama de especies dicotiledóneas y monocotiledóneas. Para una recopilación de ejemplos, véase E.F. George et al. 1987. Plant Tissue Culture Media, Vol. 1: Formulations and Uses. Exergetics, Ltd., Publ., Edington, Inglaterra.
Regeneración de Plantas Transgénicas
Las células vegetales transformadas que se obtienen mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden ser cultivadas para regenerar una planta completa que posea el genotipo transformado. Tales técnicas de regeneración a menudo dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento para el cultivo de tejidos, que depende típicamente de un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con un polinucleótido de la presente invención. Para la transformación y regeneración de maíz véase, Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, 2:603-618 (1990).
Las células vegetales transformadas con un vector de expresión vegetal pueden ser regeneradas, p. ej., a partir de células individuales, tejido de callo o discos foliares de acuerdo con las técnicas para el cultivo de tejidos vegetales convencionales. Es bien sabido en la técnica que se pueden cultivar con éxito diferentes células, tejidos, y órganos de casi cualquier planta para regenerar una planta completa. La regeneración de plantas a partir de protoplastos es descrita por Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company, Nueva York, págs. 124-176 (1983); y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, págs. 21-73 (1985).
La regeneración de plantas que contienen el gen foráneo introducido por Agrobacterium se puede lograr como describen Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985) y Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803 (1983). Este procedimiento produce típicamente brotes en dos a cuatro semanas y estos brotes transformantes se transfieren después a un medio inductor de la raíz apropiado que contiene el agente selectivo y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden ser fértiles o estériles.
La regeneración también se puede obtener a partir de callos, explantes, órganos de plantas, o sus partes. Tales técnicas de regeneración son descritas en general por Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987). La regeneración de plantas a partir de un único protoplasto vegetal o de diferentes explantes es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Para el cultivo y regeneración de células de maíz véanse en general, The Maize Handbook, Freeling y Walbot, Eds., Springer, Nueva York (1994); Com y Com Improvement, 3ª edición, Sprague y Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
Un experto en la técnica reconocerá que después de incorporar establemente la casete de expresión en las plantas transgénicas y confirmar que es operativo, éste se puede introducir en otras plantas mediante cruzamientos sexuales. Se puede utilizar cualquiera de las numerosas técnicas de reproducción convencionales, dependiendo de la especie que se vaya a cruzar.
En los cultivos propagados vegetativamente, las plantas transgénicas maduras pueden ser propagadas tomando esquejes, por medio de producción de semillas apomícticas, o mediante técnicas de cultivo de tejidos para producir múltiples plantas idénticas. Se realiza la selección de los transgénicos deseables y se obtienen nuevas variedades y se propagan vegetativamente para uso comercial. En los cultivos propagados por semillas, las plantas transgénicas maduras se pueden autocruzar para producir una planta endogámica homozigota. La planta endogámica produce semillas que contienen el ácido nucleico heterólogo recién introducido. Estas semillas se pueden hacer crecer para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado.
Las partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, frutos, y similares están incluidas en la invención, siempre que estas partes comprendan células que incluyan el ácido nucleico aislado de la presente invención. La progenie y las variantes, y los mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos en el alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico
introducidas.
Las plantas transgénicas que expresan un marcador seleccionable pueden ser escrutadas en busca de la transmisión del ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, mediante técnicas de inmunotransferencia y detección de ADN convencionales. Las líneas transgénicas también se evalúan típicamente en cuanto a los niveles de expresión del ácido nucleico heterólogo. La expresión a nivel de ARN puede ser determinada inicialmente para identificar y cuantificar las plantas positivas para la expresión. Se pueden emplear técnicas convencionales para el análisis de ARN e incluyen análisis de amplificación por PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos diseñados para amplificar solamente los moldes de ARN heterólogo y el análisis de hibridación en solución utilizando sondas específicas del ácido nucleico heterólogo. Después se pueden analizar las plantas positivas para el ARN en busca de la expresión de la proteína mediante análisis de inmunotransferencia Western utilizando los anticuerpos específicamente reactivos de la presente invención. Además, se pueden realizar la hibridación y la inmunocitoquímica in situ de acuerdo con los protocolos convencionales utilizando sondas polinucleotídicas y anticuerpos específicos del ácido nucleico heterólogo, respectivamente, para localizar los sitios de expresión en el tejido transgénico. En general, se escrutan normalmente numerosas líneas transgénicas en busca del ácido nucleico incorporado para identificar y seleccionar plantas con los perfiles de expresión más apropiados.
Una realización preferida es una planta transgénica que es homocigota para el ácido nucleico heterólogo añadido; esto es, una planta transgénica que contiene dos secuencia de ácido nucleico añadidas, un gen en el mismo locus de cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener una planta transgénica homocigota mediante apareamiento sexual (autofertilización) de una planta transgénica heterocigota que contiene un único ácido nucleico heterólogo añadido, germinación de algunas de las semillas producidas y análisis de las plantas resultantes producidas en busca de la expresión alterada de un polinucleótido de la presente invención con respecto a una planta de control (esto es, nativa, no transgénica). Asimismo se contemplan el cruzamiento recurrente para una planta parental y el cruzamiento lejano con una planta no transgénica. Alternativamente, se podría completar la propagación de plantas transgénicas heterocigotas por medio de apomixis.
La presente invención proporciona un método de genotipaje de una planta que comprende un polinucleótido de la presente invención. El genotipaje proporciona un medio para distinguir homólogos de un par de cromosomas y se puede utilizar para diferenciar segregantes en una población de plantas. Se pueden utilizar métodos con marcadores moleculares para estudios filogenéticos, caracterización de relaciones genéticas entre variedades de cultivos, identificación de cruces o híbridos somáticos, localización de segmentos cromosómicos que afectan a rasgos monogénicos, clonación basada en mapas, y estudio de la herencia cuantitativa. Véanse, p. ej., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Capítulo 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997). Para los métodos con marcadores moleculares, véase en general, The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1996 (Capítulo 2) en: Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paterson) por Academic Press/R. G. Landis Company, Austin, Texas, páginas 7-21.
El método concreto de genotipaje de la presente invención puede emplear cualquier número de técnicas analíticas con marcadores moleculares tales como, pero no limitadas a, polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Los RFLP son el producto de las diferencias alélicas entre los fragmentos de restricción del ADN causadas por la variabilidad de la secuencia de nucleótidos. De este modo, la presente invención proporciona adicionalmente un medio para seguir la segregación de un gen o ácido nucleico de la presente invención así como las secuencias cromosómicas ligadas genéticamente a estos genes o ácidos nucleicos utilizando estas técnicas como análisis
de RFLP.
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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de una genoteca utilizada para EST de CHD de maíz A. Aislamiento de ARN Total
Se aisló el ARN total de embriones de maíz y tejidos de callo en regeneración con el Reactivo TRizol (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD) utilizando una modificación del procedimiento del isotiocianato de guanidina/fenol ácido descrito by Chomczynski y Sacchi (Chomczynski, P., y Sacchl, N. Anal. Biochem. 162,156 (1987)). En resumen, se pulverizaron muestras de tejido vegetal en nitrógeno líquido antes de la adición del Reactivo TRizol; y después se homogeneizaron adicionalmente con un mortero y una mano de mortero. Se llevó a cabo la adición de cloroformo seguida de centrifugación para la separación de una fase acuosa y una fase orgánica. Se recuperó el ARN total mediante precipitación con alcohol isopropílico de la fase acuosa.
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B. Aislamiento de ARN Poli(A)+
La selección del ARN poli (A)+ del ARN total se realizó utilizando el sistema PolyATact (Promega Corporation. Madison, WI). En resumen, se utilizaron cebadores oligo(dT) biotinilados para hibridar con las colas poli(A) 3' del ARNm. Se capturaron los híbridos utilizando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas y una base de separación magnética. El ARNm se lavó en condiciones muy restrictivas y se hizo eluir por medio de agua desionizada libre de ARNasa.
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C. Construcción de la Genoteca de ADNc
Se realizó la síntesis de ADNc y se construyeron genotecas de ADNc unidireccionales utilizando el SuperScript Plasmid System (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD). La primera cadena de ADNc se sintetizó cebando un cebador oligo(dT) que contenía un sitio NotI. La reacción se catalizó por medio de Transcriptasa Inversa II SuperScript a 45ºC. La segunda cadena de ADNc se marcó con dCTP-alfa-P^{32} y se analizó una porción de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa para determinar los tamaños de los ADNc. Las moléculas de ADNc menores de 500 pares de bases y los adaptadores no ligados se separaron mediante cromatografía en Sephacryl-S400. Las moléculas de ADNc seleccionadas se ligaron en el vector pSPORT1 entre los sitios NotI y SalI.
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D. Construcción de la Genoteca genómica en vectores BAC (Cromosoma Artificial Bacteriano)
Se construyeron genotecas BAC de acuerdo con el protocolo de Texas A&M BAC Center. Los ADN de elevado peso molecular aislados de la línea Mo17 embebida en microcuentas de agarosa LMP se digirieron parcialmente por medio de HindIII. Después de la digestión parcial, se sometió el ADN a electroforesis en gel de campo pulsado seleccionado por tamaños para separar los fragmentos de ADN más pequeños que pueden competir más eficazmente que los fragmentos de ADN más grandes por los extremos del vector. Los fragmentos de ADN seleccionados por tamaños se ligaron en pBeloBAC11 en el sitio HindIIII.
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Ejemplo 2 Procedimientos de Secuenciación y sustracción de ADNc utilizados para EST de CHD de maíz A. Preparación del Molde de Secuenciación
Se escogieron colonias individuales y se preparó ADN mediante PCR con cebadores directos de M13 y cebadores inversos de M13, o mediante aislamiento plasmídico. Todos los clones de ADNc se secuenciaron utilizando cebadores inversos de M13.
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B. Procedimiento de Sustracción Q-bot
Se cultivaron en placa las genotecas de ADNc sometidas al procedimiento de sustracción sobre una placa de agar de 22 x 22 cm^{2} a una densidad de aproximadamente 3.000 colonias por placa. Las placas se incubaron en una incubadora a 37ºC durante 12-24 horas. Se escogieron las colonias de las placas de 384 pocillos por medio de un robot seleccionador de colonias, Q-bot (GENETIX Limited). Estas placas se incubaron durante la noche a 37ºC.
Una vez que se hubieron seleccionado colonias suficientes, se pincharon sobre membranas de nailon de 22 x 22 cm^{2} utilizando Q-bot. Cada membrana contenía 9.216 colonias o 36.864 colonias. Estas membranas se colocaron sobre una placa de agar con el antibiótico apropiado. Las placas se incubaron a 37ºC durante la noche.
Una vez que se hubieron recuperado las colonias el segundo día, estos filtros se colocaron sobre papel de filtro previamente empapado con solución desnaturalizante durante cuatro minutos, después se incubaron sobre la superficie de un baño de agua hirviendo durante cuatro minutos más. Luego se colocaron los filtros sobre papel de filtro previamente empapado con solución neutralizante durante cuatro minutos. Después de separar el exceso de solución colocando los filtros sobre papeles de filtro secos durante un minuto, se colocó el lado con la colonia de los filtros en solución de Proteinasa K, se incubaron a 37ºC durante 40-50 minutos. Los filtros se colocaron sobre papeles de filtro secos para secarlos durante la noche. Después se entrecruzó el ADN a membranas de nailon mediante tratamiento con luz UV.
La hibridación de las colonias se realizó como describen Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., (en Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2ª Edición). Se utilizaron las siguientes sondas en la hibridación de colonias:
1.
\;
1.
Primera cadena de ADNc del mismo tejido del que se elabora la genoteca para separar los clones más redundantes.
\newpage
2.
\;
2.
48-192 clones de ADNc más redundantes de la misma genoteca basada en los datos de secuenciación previos.
3.
\;
3.
192 clones de ADNc más redundantes de la base de datos de secuencias de maíz completa.
4.
\;
4. Un oligonucleótido Sal-A20 oligo: TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA, separa los clones que contienen una cola poli A pero no el ADNc.
5.
\;
5.
Clones de ADNc derivados de ARNr.
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La imagen de la autorradiografía se escaneó en el ordenador y se analizó la intensidad de la señal y las localizaciones de las colonias frías de cada colonia. El re-ordenamiento de las colonias frías a partir de las placas de 384 pocillos a las placas de 96 pocillos se realizó utilizando Q-bot.
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Ejemplo 3 Identificación de EST de CHD de Maíz a partir de una Búsqueda de Homología Computarizada
Se determinaron las identidades génicas realizando búsquedas BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamientos Locales Básica; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; véase también www.ncbi.nim.nih.gov/
BLAST/) con los parámetros por defecto en busca de la similitud con las secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones de CDS de GenBank no-redundantes, secuencias derivadas del Banco de Datos de Proteínas Brookhaven de estructuras tridimensionales, el último producto principal de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT, bases de datos EMBL, y DDBJ). Las secuencias de ADNc fueron analizadas en busca de similitud con todas las secuencias de ADN disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN. Las secuencias de ADN fueron traducidas en todos los marcos de lectura y comparadas en busca de similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en las bases de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish, W. y States, D. J. (1993) Nature Genetics 3:266-272) proporcionado por NCBI. En algunos casos, se utilizaron los datos de secuenciación de dos o más clones que contenían segmentos solapantes de ADN para construir secuencias de ADN contiguas.
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Ejemplo 4 Transformación y Regeneración Callo de Maíz
Los vectores de expresión útiles para modular la expresión de CHD son aquellos que regulan a la baja los niveles o la actividad de CHD (abreviados en adelante como constructos CHD-DR). Un constructo CHD-DR es una casete de expresión en la cual el ARN transcrito da como resultado un descenso de los niveles de proteína CHD en la célula. Los ejemplos incluirían los que expresan antisentido, los que expresan una secuencia con repeticiones invertidas (que formarán una horquilla) construidos a partir de una porción de la secuencia de CHD, los que expresan la secuencia de CHD fusionada a otra de tales secuencias formadoras de "horquilla", o los que expresan CHD de una manera que favorezca la co-supresión de CHD endógena.
La transformación de un constructo CHD-DR (ya sea antisentido, en horquilla, o basado en la co-supresión) junto con un marcador-casete de expresión (por ejemplo, UBI::moPAT-GPFm::pinII) en el genotipo Hi-II sigue un protocolo de transformación por bombardeo bien establecido utilizado para introducir ADN en el escutelo de embriones de maíz inmaduros (Songstad, D.D. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 32:179-183, 1996). Se observa que se puede utilizar cualquier método adecuado de transformación, tal como la transformación mediada por Agrobacterium y muchos otros métodos. Para preparar tejidos diana adecuados para la transformación, se esterilizan en superficie espigas en blanqueante Chlorox al 50% más detergente Micro al 0,5% durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros (aproximadamente 1-1,5 mm de longitud) se extirpan y se colocan con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa. Estos se cultivan sobre medio que contiene sales N6, vitaminas de Erikkson, 0,69 g/l de prolina, 2 mg/l de 2,4-D y sacarosa al 3%. Después de 4-5 días de incubación en la oscuridad a 28ºC, se separan los embriones del primer medio y se cultivan sobre un medio similar que contiene sacarosa al 12%. Se deja que los embriones se aclimaten a este medio durante 3 h antes de la transformación. La superficie escutelar de los embriones inmaduros se elige como diana utilizando el bombardeo con partículas. Los embriones se transforman utilizando la Pistola de Helio PDS-1000 de Bio-Rad a un disparo por muestra utilizando discos de ruptura 650PSI. El ADN liberado por disparo promedia aproximadamente 0,1667 \mug. Después del bombardeo, todos los embriones se mantienen en medio de cultivo de maíz convencional (sales N6, vitaminas de Erikkson, 0,69 g/l de prolina, 2 mg/l de 2,4-D, sacarosa al 3%) durante 2-3 días y después se transfieren a medio basado en N6 que contenía 3 mg/L de Bialafos®. Las placas se mantienen a 28ºC en la oscuridad y se observan en busca de la recuperación de colonias con transferencias a medio fresco cada dos a tres semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, se tomaron muestras de los clones de callo positivos para GFP resistentes a la selección para la PCR y la actividad del polinucleótido de interés. Las líneas positivas se transfirieron a medio 288J, un medio basado en MS con niveles inferiores de sacarosa y hormona, para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de embriones somáticos (2-4 semanas), se transfirieron embriones somáticos bien desarrollados a medio para la germinación y se transfirieron a la cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas en desarrollo se transfirieron a medio en tubos durante 7-10 días hasta que las plantas estuvieron bien establecidas. Después se transfirieron las plantas a insertos en superficies planas (equivalentes a tiestos de 6,4 cm) que contenían tierra para macetas y se hicieron crecer durante 1 semana en una cámara de crecimiento, con posterioridad se hicieron crecer 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfirieron a tiestos Classic® 600 (6,048 litros) y se hicieron crecer hasta la madurez. Se controló en las plantas la expresión polinucleótido de interés. Las colonias y las plantas recuperadas se puntúan basándose en la expresión visual de GFP, la sensibilidad a la pintura en las hojas para una aplicación al 1% de herbicida Ignite®, y la caracterización molecular por medio de PCR y análisis
Southern.
La transformación de una casete de CHD-DR junto con UBI::moPAT\simmoGFP::pinII en un genotipo de maíz tal como Hi-II (o líneas endogámicas tales como las líneas endogámicas de marca registrada Pioneer Hi-Bred International, Inc. N46 y P38) también se realiza utilizando el método de liberación de ADN mediado por Agrobacterium, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.981.840 con las siguientes modificaciones. De nuevo, se observa que se puede utilizar cualquier método adecuado de transformación, tal como la transformación mediada por partículas, así como muchos otros métodos. Las Agrobacteria se hacen crecer hasta la fase log en medio A mínimo líquido que contiene espectinomicina 100 \muM. Los embriones se sumergen en una suspensión en fase log de Agrobacteria ajustada para obtener una concentración eficaz de 5 x 10^{8} cfu/ml. Los embriones se infectan durante 5 minutos y después se co-cultivan en medio de cultivo que contiene acetosiringona durante 7 días a 20ºC en la oscuridad. Después de 7 días, los embriones se transfieren a medio de cultivo convencional (sales MS con macronutrientes N6, 1 mg/L de 2,4-D, 1 mg/L de Dicamba, 20 g/L de sacarosa, 0,6 g/L de glucosa, 1 mg/L de nitrato de plata, y 100 mg/L de carbenicilina) con 3 mg/L de Bialafos® como agente selectivo. Las placas se mantienen a 28ºC en la oscuridad y se observan en busca de la recuperación de colonias con transferencias a medio fresco cada dos a tres semanas. Las líneas positivas se transfieren a un medio basado en MS con niveles inferiores de sacarosa y hormona, para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren a medio para la germinación y se transfieren a la cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días más tarde, las plántulas desarrolladas se transfieren a medio en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Después las plantas se transfieren a insertos en superficies planas (equivalente a tiestos de 6,4 cm) que contienen tierra para macetas y se hacen crecer durante 1 semana en una cámara de crecimiento, con posterioridad se hacen crecer 1-2 semanas más en el invernadero, luego se transfieren a tiestos Classic® 600 (6,048 litros) y se hacen crecer hasta la madurez. Las colonias y las plantas recuperadas se puntúan basándose en la expresión visual de GFP, la sensibilidad de las hojas a la pintura para una aplicación al 1% de herbicida Ignite®, y la caracterización molecular por medio de PCR y análisis Southern.
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A. Introducción de CHD-DR para mejorar la frecuencia de transformación utilizando Agrobacterium o bombardeo de partículas
Se utilizan los plásmidos descritos en el Ejemplo 4 para transformar embriones Hi-II inmaduros utilizando la liberación de partículas o Agrobacterium. Se cuentan las colonias GFP+ resistentes a Bialafos utilizando un microscopio para GFP y se determinan las frecuencias de transformación (porcentaje de embriones diana iniciales de los cuales al menos se desarrolla un evento transformado multicelular, resistente a bialafos, que expresa GFP). Tanto en los experimentos con la pistola de partículas como en los experimentos con Agrobacterium, se esperan que las frecuencias de transformación aumenten con el tratamiento de CHD.
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B. Regulación a la baja de CHD para mejorar el fenotipo embriogénico y la capacidad de regeneración de las líneas endogámicas
Los embriones inmaduros de la línea endogámica P38 se aíslan, se cultivan y se transforman como se ha descrito antes, con los siguientes cambios. Los embriones se cultivan inicialmente sobre medio 601 H (un medio basado en MS con 0,1 mg/l de zeatina, 2 mg/l de 2,4-D, vitaminas MS y SH, prolina, nitrato de plata, nitrato de potasio extra, producto hidrolizado de caseína, Gelrite, 10 g/l de glucosa y 20 g/l de sacarosa). Antes del bombardeo los embriones se mueven a un medio altamente osmótico (modificado de Duncan con 2 mg/l de 2,4-D y sacarosa al 12%). Después del bombardeo, los embriones se mueven a medio 601 H con 3 mg/l de bialafos durante dos semanas. Luego los embriones se mueven a medio 601 H sin prolina ni producto hidrolizado de caseína con 3 mg/l de bialafos y se transfieren cada dos semanas. La frecuencia de transformación se determina contando el número de colonias positivas para GFP resistentes a bialafos. Las colonias también se puntúan en cuanto a si tienen un fenotipo embriogénico (regenerable) o no embriogénico. En comparación con el tratamiento de control (UBI::moPAT\simmoGFP::pinII solo), se espera que los tratamientos que incluyen la casete con marcador (UBI::moPAT\simmoGFP::pinII) + CHD-DR den como resultado frecuencias de transformación sistemáticamente superiores, teniendo los transformantes un fenotipo del callo más embriogénico y la frecuencia de regeneración satisfactoria a partir de callo transformado debe resultar sustancialmente mejorada.
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Ejemplo 5 Supresión Transitoria del Producto Polinucleotídico de CHD para Inducir Embriogénesis Somática
Puede ser deseable "arrancar" la embriogénesis somática expresando transitoriamente un producto polinucleotídico CHD-DR. Esto se puede realizar liberando ARN poli adenilado con protección terminal 5' CHD-DR o casetes de expresión que contienen ADN de CHD-DR. Estas moléculas pueden ser liberadas utilizando una pistola de partículas biolística. Por ejemplo el ARN de CHD-Dr poliadenilado con protección terminal 5' se puede elaborar fácilmente in vitro utilizando el kit mMessage mMachine de Ambion. Siguiendo el procedimiento esbozado antes se libera el ARN junto con ADN que contiene una casete de expresión agronómicamente útil. Las células que reciban el ARN formarán embriones somáticos y una porción grande de estos tendrán integrado el gen agronómico. Las plantas regeneradas a partir de estos embriones pueden ser escrutadas después en busca de la presencia del gen agronómico.
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Ejemplo 6 Uso de CHD de maíz para inducir apomixis
Se pueden construir fácilmente casetes de expresión de maíz regulando a la baja la expresión de CHD en el integumento interno o nucelo. Se elabora una casete de expresión dirigiendo la expresión del polinucleótido CHD-DR al nucelo utilizando el promotor Nuc1 de la cebada. Los embriones se bombardean simultáneamente con el marcador seleccionable PAT fusionado con el gen GFP (UBI::moPAT\simmoGFP) junto con la casete de expresión de CHD-DR específica de nucelo descrita antes. Se obtienen líneas endogámicas (P38) y transformantes y se regeneran como se describe en el ejemplo 4.
Se espera que las plantas regeneradas sean capaces de producir después embriones de novo a partir de células nucelares que expresan CHD-DR. Esto se complementa mediante polinización de espigas para promover la fertilización de células centrales normales y el desarrollo del endospermo. En otra variación de este esquema, las transformaciones nuc1:CHD-DR se podrían realizar utilizando un fondo genético nulo FIE que promovería tanto el desarrollo del embrión de novo como el desarrollo de endospermo sin fertilización (véase Ohad et al. 1999 The Plant Cell 11:407-415; también la solicitud de los Estados Unidos pendiente Núm. de Serie 60/151575 presentada el 31 de Agosto de 1999). Tras el examen microscópico de los embriones en desarrollo será evidente que se ha producido apomixis por la presencia de embriones brotando del nucelo. En otra variación más de este esquema se podría liberar el polinucleótido CHD-DR como se ha descrito antes en genotipo letal cigótico embrionario homocigoto. Solamente los embriones adventicios producidos a partir de tejido de nucelo somático se desarrollarían a semilla.
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Ejemplo 7 Expresión de Genes Quiméricos en Células Microbianas
Los ADNc que codifican los presentes factores de transcripción pueden ser insertados en el vector de expresión de E. coli T7 pBT430. Este vector es un derivado de pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56:125-135) que emplea el sistema de la ARN polimerasa del bacteriófago T7/promotor de T7. El plásmido pBT430 se construyó destruyendo primero los sitios EcoRI y HindIII de pET-3a en sus posiciones originales. Se insertó un adaptador oligonucleotídico que contenía los sitios EcoRI y HindIII en el sitio BamHI de pET-3a. Esto creó pET-3aM con sitios de clonación única adicionales para la inserción de genes en el vector de expresión. Después, el sitio NdeI de la posición de inicio de la traducción se convirtió en un sitio NcoI utilizando la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. La secuencia de ADN de pET-3aM en esta región, 5'-CATATGG, se convirtió en 5'-CCCATGG en pBT430.
El ADN plasmídico que contiene un ADNc puede ser digerido apropiadamente para liberar un fragmento de ácido nucleico que codifica la proteína. Este fragmento puede ser purificado después sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión NuSieve GTG® al 1% (FMC). Tampón y agarosa contienen 10 \mug/ml de bromuro de etidio para la visualización del fragmento de ADN. Después el fragmento puede ser purificado del gel de agarosa mediante digestión con GELase® (Epicentre Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, precipitado en etanol, secado y resuspendido en 20 \muL de agua. Se pueden ligar adaptadores oligonucleotídicos apropiados al fragmento utilizando ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). El fragmento que contiene los adaptadores ligados puede ser purificado del exceso de adaptador utilizando agarosa de bajo punto de fusión como se ha descrito antes. El vector pBT430 se digiere, se desfosforila con fosfatasa alcalina (NEB) y se desproteiniza con fenol/cloroformo como se ha descrito antes. El vector pBT430 preparado y el fragmento se pueden ligar a 16ºC durante 15 horas seguido de transformación en células DH5 electrocompetentes (GIBCO BRL). Los transformantes se pueden seleccionar sobre placas de agar que contienen medio LB y 100 \mug/mL de ampicilina. Los transformantes que contienen el polinucleótido que codifica el factor de transcripción se escrutan después en busca de la orientación correcta con respecto al promotor T7 mediante análisis con enzimas de restricción.
Para la expresión de alto nivel, se puede transformar un clon plasmídico con el inserto de ADNc en la orientación correcta con respecto al promotor de T7 en la cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). Los cultivos se hacen crecer en medio LB que contiene ampicilina (100 mg/L) a 25ºC. A una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 1, se puede añadir IPTG (isopropiltio-\beta-galactosido, el inductor) a una concentración final de 0,4 mM y la incubación se puede continuar durante 3 horas a 25ºC. Luego las células se cosechan mediante centrifugación y se re-suspenden en 50 \muL Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 que contiene DTT 0,1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM. Se puede añadir una pequeña cantidad de cuentas de vidrio de 1 mm y la mezcla se somete a sonicación 3 veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonicador de microsonda. La mezcla se centrifuga y se determina la concentración de proteína del sobrenadante. Se puede separar 1 \mug de proteína de la fracción soluble del cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se pueden observar los geles en busca de bandas de proteína que migran al peso molecular esperado.
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Ejemplo 8 Evaluación de los Compuestos por Su Capacidad para Inhibir la Actividad de los Factores de Transcripción Vegetales
Los factores de transcripción descritos en la presente memoria pueden ser producidos utilizando cualquiera de los numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, la expresión en bacterias como se describe en el Ejemplo 7, o la expresión en cultivos de células eucarióticas, in planta, y utilizando sistemas de expresión virales en organismos o líneas celulares adecuadamente infectados. Los presentes factores de transcripción pueden ser expresados como formas maduras de las proteínas conservadas in vivo o como proteínas de fusión mediante anclaje covalente a una variedad de enzimas, proteínas o etiquetas de afinidad. Los compañeros comunes de las proteínas de fusión incluyen glutation-S-transferasa ("GST"), tiorredoxina ("Trx"), proteínas de unión a maltosa, y polipéptido de hexahistidina C- y/o N-terminal ("(His)_{6}"). Las proteínas de fusión pueden ser diseñadas con un sitio de reconocimiento de proteasa en el punto de fusión de manera que los compañeros de fusión se puedan separar mediante digestión con proteasa para rendir la enzima madura intacta. Los ejemplos de tales proteasas incluyen trombina, enteroquinasa y factor Xa. Sin embargo, se puede utilizar cualquier proteasa que escinda específicamente el péptido que conecta la proteína de fusión y la enzima.
En la purificación de los presentes factores de transcripción, si se desea, se puede utilizar cualquiera de las numerosas tecnologías familiares para los expertos en la técnica de la purificación de proteínas. Los ejemplos de tales métodos incluyen, pero no están limitados a, homogeneización, filtración, centrifugación, desnaturalización térmica, precipitación con sulfato de amonio, eliminación de las sales, precipitación por pH, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de afinidad, donde el ligando de afinidad representa un sustrato, un análogo de sustrato o un inhibidor. Cuando los factores de transcripción se expresan como proteínas de fusión, el protocolo de purificación puede incluir el uso de una resina de afinidad que es específica para la etiqueta de la proteína de fusión anclada a la enzima expresada o una resina de afinidad que contiene ligandos que son específicos para la enzima. Por ejemplo, se puede expresar un factor de transcripción como una proteína de fusión acoplada al extremo C de la tiorredoxina. Además, se puede diseñar un péptido (His)_{6} en el extremo N del radical tiorredoxina fusionado para proporcionar más oportunidades para la purificación por afinidad. Se podrían sintetizar otras resinas de afinidad adecuadas uniendo ligandos apropiados a cualquier resina adecuada tal como Sepharose-4B. En una realización alternativa, se puede hacer eluir una proteína de fusión a tiorredoxina utilizando ditiotreitol; sin embargo, la elución se puede completar utilizando otros reactivos que interaccionen para desplazar la tiorredoxina de la resina. Estos reactivos incluyen \beta-mercaptoetanol u otro tiol reducido. Se puede someter la proteína de fusión eluida a métodos de purificación adicional tradicionales como se ha establecido antes, si se desea. La escisión proteolítica de la proteína de fusión con tiorredoxina y la enzima se puede completar después de purificar la proteína de fusión o mientras la proteína todavía está unida a la resina de afinidad ThioBond® u otra resina.
La enzima bruta, parcialmente purificada o purificada, ya sea sola o en forma de proteína de fusión, puede ser utilizada en análisis para la evaluación de compuestos por su capacidad para inhibir la activación enzimática de los factores de transcripción descritos en la presente memoria. Los análisis se pueden llevar a cabo en condiciones experimentales bien conocidas que permiten una actividad enzimática óptima.
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Ejemplo 9 Regulación a la baja de CHD para incrementar las tasas de crecimiento, que se podría utilizar como criterio de escrutinio para la selección positiva de transformantes
Utilizando dos promotores de resistencia creciente para conducir la expresión de casetes de CHD-DR en maíz, parece que CHD-DR estimula el crecimiento del callo a lo largo de los tratamientos de control y el promotor más fuerte que conduce CHD-DR da como resultado un crecimiento más rápido que con el promotor de bajo nivel. Por ejemplo, se realiza un experimento para comparar los promotores ln2 y nos. Como se ha observado antes, basándose en la experiencia de los autores de la presente invención con estos dos promotores conduciendo otros genes, el promotor In2 (en ausencia de un inductor del medio distinto de auxina) conduciría la expresión a niveles muy bajos. Se ha demostrado que el promotor nos conduce niveles de expresión transgénica moderadamente bajos (aproximadamente de 10 a 30 veces más bajos que el promotor de la ubiquitina de maíz, pero todavía mayor que ln2 en las condiciones de cultivo utilizadas en este experimento). Se utiliza un tratamiento de control en este experimento, el propio constructo UBI:PAT\simGFPmo:pinII (sin CHD-DR). Se bombardean embriones inmaduros Hi-II como se ha descrito previamente, y se puntúan los eventos de crecimiento, transgénico a las 3 y 6 semanas. El tratamiento de control da como resultado una frecuencia de transformación típica, por ejemplo del 0,8%. Se espera que los tratamientos reguladores a la baja conducidos por ln2 y nos produzcan frecuencias de transformación progresivamente mayores, por ejemplo 25 y 40%, respectivamente.
En estos tratamientos también se espera un incremento en la frecuencia total de callos en crecimiento rápido, grandes, con respecto al tratamiento de control. Para estos datos, se registra el peso fresco de los callos transformados 2 meses después del bombardeo. Suponiendo que todos los eventos transgénicos comenzaron en forma de células transformadas individuales a los pocos días del bombardeo, estos pesos representan la tasa de crecimiento relativo de estos transformantes durante este período (todo el tejido es sub-cultivado y pesado para cada transformante; se calculan los pesos medios y las desviaciones típicas para cada tratamiento). Para el tratamiento de control, se espera que el peso medio de los transformantes después de dos meses sea de 37 +/-15 mg (n=6). Para los tratamientos con el regulador a la baja In2:CHD y el regulador a la baja nos:CHD, se espera que los pesos medios de los transformantes sean de 126 +/-106 y 441 +/-430 mg, respectivamente. Si el tratamiento de control se ajusta a un valor de crecimiento relativo de 1,0, esto significa que se espera que los transformantes en los tratamientos con regulador a la baja ln2:CHD y regulador a la baja nos: CHD crezcan 3,4 y 12 veces más rápido que el control. El aumento de la regulación a la baja de CHD daría como resultado un incremento concomitante de la tasa de crecimiento del callo.
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Ejemplo 10 El uso del polinucleótido CHD como sistema de selección positivo para la transformación de maíz y para mejorar la capacidad de regeneración de los tejidos del maíz Método Material Vegetal
Se siembran semillas de las líneas NH535 y BO 014 Hybrinova de maíz en tierra en bandejas de siembra de celdas pequeñas para la vernalización a 6ºC durante ocho semanas. Las plántulas vernalizadas se transfieren a tiestos de 20 cm y se hacen crecer en una cámara de entorno controlado. Las condiciones de crecimiento utilizadas son; 1) composición de la tierra: turba de primera calidad L&P al 75%, marga esterilizada tamizada al 12%, grava sin limo tamizada de 6 mm al 10%, vermiculita de calidad media al 3%, 3,5 kg de Osmocote por m^{3} de tierra (fertilizante de liberación lenta, 15-11-13 NPK más micronutrientes), 0,5 kg de mezcla PG por m^{3} (fertilizante granular 14-16-18 NPK más micronutrientes, 2) fotoperíodos de 16 h (lámparas de sodio de 400 W que proporcionan irradiación de aprox. 750 \muE s^{-1} m^{-2}), temperatura de 18 a 20ºC de día y de 14 a 16ºC de noche, humedad relativa del aire del 50 a 70% y 3) control de plagas: pulverizar azufre cada 4 a 6 semanas y control biológico de trips utilizando Amblyseius caliginosus (Novartis BCM Ltd, UK).
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Aislamiento de Explantes e Inicio del Cultivo
Se utilizan dos fuentes de explantes primarios; tejido escutelar y de inflorescencia. Para los escutelos, se cosechan granos en estado lechoso temprano-medio que contienen embriones translúcidos inmaduros y se esterilizan en superficie en etanol del 70% durante 5 minutos y solución de hipoclorito al 0,5% durante 15-30 min. Para las inflorescencias, se cosechan macollos que contienen inflorescencias de 0,5-1,0 cm cortando por debajo del nudo que porta la inflorescencia (el segundo nudo de un macollo). Los macollos se recortan a una longitud de aproximadamente 8-10 cm y se esterilizan en superficie como antes con el extremo superior sellado con Nescofilm (Bando Chemical Ind. Ltd, Japón).
En condiciones asépticas, se aíslan embriones de aproximadamente 0,5-1,0 mm de longitud y se separa el eje del embrión. Las inflorescencias se diseccionan de los macollos y se cortan en trozos de aproximadamente 1 mm. Se colocan treinta escutelos o explantes de inflorescencia de 1 mm en el centro (círculo diana 18 mm) de una placa de Petri de 90 mm que contiene medio de cultivo MD0.5 o L7D2. Los embriones se colocan con el lado del eje del embrión en contacto con el medio exponiendo el escutelo a bombardeo mientras los trozos de inflorescencia se colocan al azar. Los cultivos se incuban a 25ºC en la oscuridad durante aproximadamente 24 h antes del bombardeo. Después del bombardeo, los explantes de cada placa bombardeada se diseminan en las tres placas para la inducción del callo.
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Medio de Cultivo
El medio de inducción de callo convencional para tejidos de escutelo (MDO.5) consiste en medio MS modificado solidificado (Agargel al 0,5%, Sigma A3301) con un suplemento de sacarosa al 9%, 10 mg l^{-1} de AgNO_{3} y 0,5 mg l^{-1} de 2,4-D (Rasco-Gaunt et al., 1999). Los tejidos de inflorescencia se cultivan en L7D2 que consiste en medio L3 solidificado (Agargel al 0,5%) con un suplemento de maltosa al 9% y 2 mg l^{-1} de 2,4-D (Rasco-Gaunt y Barcelo, 1999). El medio de inducción de brotes basales, RZ contiene sales L, vitaminas e inositol, maltosa al 3% p/v, 0,1 mg l^{-1} de 2,4-D y 5 mg l^{-1} de zeatina (Rasco-Gaunt y Barcelo, 1999). Las plántulas regeneradas se mantienen en medio RO con la misma composición que RZ, pero sin 2,4-D ni zeatina.
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Procedimiento de Precipitación de ADN y Bombardeo con Partículas
Se recubren partículas de oro de una tamaño inferior a una micra (0,6 \mum Micron Gold, Bio-Rad) con un plásmido que contiene un constructo CHD-DR siguiendo el protocolo modificado a partir del procedimiento de Bio-Rad original (Barcelo y Lazzeri, 1995). La mezcla de precipitación convencional consiste en 1 mg de partículas de oro en 50 \mul de SDW, 50 \mul de cloruro de calcio 2,5 M, 20 \mul de base sin espermidina 100 mM y 5 \mul de ADN (concentración 1 \mug \mul^{-1}). Después de combinar los componentes, la mezcla se somete a vórtice y se descarta el sobrenadante. Después se lavan las partículas con 150 \mul de etanol absoluto y finalmente se resuspenden en 85 \mul de etanol absoluto. La solución de ADN/oro en etanol se mantiene sobre hielo para minimizar la evaporación de etanol. Para cada bombardeo, se cargan 5 \mul de solución de ADN/oro en etanol (aprox. 60 \mug de oro) sobre el macroportador.
Los bombardeos con partículas se llevan a cabo utilizando una pistola DuPont PDS 1000/He con una distancia diana de 5,5 cm desde la placa de parada a una presión de aceleración de 45,7103 kg/cm^{2} y una presión de vacío de la cámara de 0,96 kg/cm^{2}.
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Regeneración de Transformantes
Para la inducción de callo, se distribuyen los explantes bombardeados sobre la superficie del medio en la placa original y otras dos placas y se cultivan a 25\pm1ºC en la oscuridad durante tres semanas. Se registra periódicamente el desarrollo de embriones somáticos de cada callo. Para la inducción de brotes, se transfieren los callos a medio RZ y se cultivan con la luz durante 12 horas (250 \muE s^{-1}m^{-2}, de tubos fluorescentes blancos de luz fría) a 25\pm1ºC durante tres semanas dos rondas. Se indican todas las plantas que se regeneran a partir del mismo callo. Las plantas que crecen más vigorosamente que los cultivos de control se ponen en tiestos en tierra después de 6-9 semanas en medio R0. Las plántulas se aclimatan en un propagador durante 1-2 semanas. Después de eso, las plantas se hacen crecer en las condiciones de crecimientos descritas antes hasta la madurez.
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Aislamiento de ADN de Tejidos de Callo y Hoja
Se extrajo ADN genómico de callos u hojas utilizando una modificación del método CTAB (bromuro de cetiltrietilamonio, Sigma H5882) descrito en la cita de Stacey y Isaac (1994). Se hacen crecer aproximadamente 100-200 mg de tejidos congelados en polvo en nitrógeno líquido y se homogeneizan en 1 ml de tampón de extracción CTAB (CTAB al 2%, EDTA 0,02 M, Tris-Cl 0,1 M, pH 8, NaCl 1,4 M, DTT 25 mM) durante 30 min a 65ºC. Se deja que las muestras homogeneizadas se enfríen a la temperatura ambiente durante 15 min antes de realizar la extracción de una única proteína con aproximadamente 1 ml de cloroformo:octanol 24:1 v/v. Las muestras se centrifugan durante 7 min a 13.000 rpm y la capa superior de sobrenadante se recoge utilizando puntas de pipeta de boca ancha. El ADN se hace precipitar a partir del sobrenadante mediante incubación en etanol del 95% sobre hielo durante 1 hora. Las hebras de ADN se enrollan sobre un gancho de vidrio, se lavan en etanol del 75% que contiene acetato de sodio 0,2 M durante 10 minutos, se secan al aire durante 5 minutos y se resuspenden en tampón TE. Se añaden 5 \mul de ARNasa A a las muestras y se incuban a 37ºC durante 1 h.
Para la cuantificación del ADN genómico, se realiza una electroforesis en gel utilizando gel de agarosa al 0,8 en tampón 1x TBE. Se fracciona un microlitro de las muestras al lado de 200, 400, 600 y 800 ng \mul^{-1} de marcadores de ADN no cortados \lambda.
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Análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La presencia del polinucleótido CHD-DR de maíz se analiza mediante PCR utilizando ADN molde de 100-200 ng en 30 ml de una mezcla de reacción para PCR que contiene 1x tampón enzimático de concentración (Tris-HCl 10 mM pH 8,8, cloruro de magnesio 1,5 mM, cloruro de potasio 50 mM, Triton X-100 al 0,1%), dNTP 200 \muM, cebadores 0,3 \muM y 0,022 U de ADN polimerasa deTaq (Boehringer Mannheim). Las reacciones del ciclo térmico son las siguientes (30 ciclos): desnaturalización a 95ºC durante 30 s, hibridación a 55ºC durante 1 min y prolongación a 72ºC durante 1 min. Después de la liberación mediada por partículas de un constructo UBI::PAT\simGFPmo::pinII solo (tratamiento de control), o UBI::PAT\simGFPmo::pinII + CHD-DR, en los tratamientos que contienen el constructo CDH-DR debe haber una frecuencia superior de transformantes embriogénicos recuperados y la capacidad de regeneración de estos transformantes debe resultar sustancialmente mejorada sobre la del tratamiento de control. Además, en el tratamiento de CDH-DR se debe reducir la frecuencia de colonias de escape.
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Ejemplo 11 Expresión de Genes Quiméricos en Células Dicotiledóneas
También se puede utilizar el polinucleótido CHD-DR para mejorar la transformación de soja. Para demostrar esto, se introduce el constructo que consiste en el promotor ln2 y la secuencia CHD-DR en cultivos en suspensión embriogénicos de soja mediante bombardeo con partículas utilizando esencialmente los métodos descritos por Parrott, W.A., L.M. Hoffman, D.F. Hildebrand, E.G. Williams, y G.B. Collins, (1989) Recovery of primary transformants of soybean, Plant Cell Rep. 7:615-617. Este método con modificaciones se describe más abajo.
Se separa la semilla de las vainas cuando los cotiledones tienen entre 3 y 5 mm de longitud. Las semillas se esterilizan en una solución de Chlorox (0,5%) durante 15 minutos después de lo cual las semillas se enjuagan con agua destilada estéril. Los cotiledones inmaduros se extirpan escindiendo primero la porción de la semilla que contiene el eje del embrión. Después se separan los cotiledones de la cubierta de la semilla empujando suavemente el extremo distal de la semilla con el extremo romo de la cuchilla del escalpelo. Después se colocan los cotiledones (con el lado plano hacia arriba) en medio de iniciación SB1 (sales MS, vitaminas B5, 20 mg/L de 2,4-D, 31,5 g/l de sacarosa, 8 g/L de Agar TC, pH 5,8). Las placas de Petri se incuban con luz (día de 16 horas; 75-80 \muE) a 26ºC. Tras 4 semanas de incubación los cotiledones se transfieren a medio SB1 de nueva aportación. Pasadas dos semanas más, se extirpan los embriones somáticos en fase globular que muestran zonas proliferativas y se transfieren a medio líquido FN Lite (Samoylov, V.M., D.M. Tucker, y W.A. Parrott (1998) Soybean [Glycine max (L.) Merrill] embryogenic cultures: the role of sucrose and total nitrogen content on proliferation. In Vitro Cell Dev. Biol.- Plant 34:8-13). Se colocan aproximadamente de 10 a 12 pequeñas agrupaciones de embriones somáticos en matraces de 250 ml que contienen 35 ml de medio SB172. Los cultivos embriogénicos en suspensión de soja se mantienen en 35 mL de medio líquido sobre un aparato con movimiento oscilatorio giratorio, 150 rpm, a 26ºC con luces fluorescentes (20 \muE) en un programa de día/noche de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio líquido.
Los cultivos embriogénicos en suspensión de soja se transforman después utilizando el bombardeo con una pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327:70, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.945.050). Se utiliza un aparato BioRad Biolistic® PDS1000/HE para estas transformaciones. Un gen marcador seleccionable que se utiliza para facilitar la transformación de la soja es un gen quimérico compuesto por el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), el gen de la higromicin-fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de la nopalino sintasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.
A 50 \muL de una suspensión de 6' mg/mL de partículas de oro de 1 \mum se le añaden (por orden): 5 \muL de ADN (1 \mug/\muL), 20 \mul de espermidina (0,1 M), y 50 \muL de CaCl_{2} (2,5 M). La preparación de partículas se agita durante tres minutos, se centrifuga durante 10 segundos y se separa el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan una vez en 400 \muL de etanol del 70% y se resuspenden en 40 \muL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se somete a sonicación tres veces durante un segundo cada una. Después se cargan 5 \muL de partículas de oro recubiertas con ADN en cada disco macroportador.
Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se colocan en una placa de petri vacía de 60x15 mm y el líquido residual se separa del tejido con una pipeta. La presión de ruptura de membrana se ajusta a 77,35 kg/cm^{2} y la cámara se evacúa a un vacío de 0,03 kg/cm^{2}. El tejido se coloca aproximadamente a 8 cm del tamiz de retención, y se bombardea tres veces. Tras el bombardeo, el tejido se divide en dos mitades y se vuelve a colocar en 35 ml de medio FN Lite.
De cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido se cambia por medio de nueva aportación. Once días después del bombardeo el medio se cambia por medio de nueva aportación que contiene 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo se renueva semanalmente. De siete a ocho semanas después del bombardeo, se observa tejido transformado, verde creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se separa y se inocula en matraces individuales para generar cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados clónicamente, nuevos. Cada nueva línea se trata como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se subcultivan después y se mantienen en forma de agrupaciones de embriones inmaduros, o se regenera el tejido en plantas completas mediante maduración y germinación de embriones individuales.
Se utilizan dos genotipos diferentes en estos experimentos: 92B91 y 93B82. Las muestras de tejido se bombardean con gen de resistencia a higromicina solo o con una mezcla 1:1 del gen de resistencia a higromicina y el constructo CHD-DR. Los cultivos embriogénicos generados a partir de 92B91 producen generalmente eventos de transformación mientras los cultivos de 93B82 son mucho más difíciles de transformar. Para ambos genotipos, el constructo CHD-DR dio como resultado un incremento de las frecuencias de transformación.
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Ejemplo 12 Uso de anticuerpos originados contra CHD para estimular transitoriamente la embriogénesis y potenciar la transformación
También se pueden utilizar anticuerpos dirigidos contra CHD para mitigar la actividad de CHD, estimulando de este modo el crecimiento embriogénico somático. Los genes que codifican anticuerpos de cadena sencilla expresados detrás de un promotor adecuado, por ejemplo el promotor de la ubiquitina, podrían ser utilizados de esa manera. La expresión transitoria de un anticuerpo anti-CHD podría desorganizar temporalmente la función normal de CHD y estimular de este modo el crecimiento embriogénico somático. Alternativamente, los anticuerpos originados contra CHD podrían ser purificados y utilizados par la introducción directa en células de maíz. El anticuerpo es introducido en células de maíz utilizando métodos físicos tales como la microinyección, el bombardeo, la electroporación o los métodos con fibra de sílice.
Alternativamente, el anti-CHD de cadena sencilla es liberado de Agrobacterium tumefaciens en células vegetales en forma de fusiones con proteínas de virulencia de Agrobacterium (véanse las solicitudes co-pendientes de los Estados Unidos con el Núm. de Serie 09/316.914 presentada el 19 de Mayo de 1999 y 09/570.319 presentada el 12 de Mayo de 2000). Las fusiones se construyen entre el anticuerpo de cadena sencilla anti-CHD y las proteínas de virulencia bacterianas tales como VirE2, VirD2, o VirF que se sabe que son liberadas directamente en las células vegetales. Se construyen fusiones para que conserven tanto aquellas propiedades de las proteínas de virulencia bacteriana requeridas para mediar la liberación en las células vegetales como la actividad anti-CHD requerida para estimular el crecimiento embriogénico somático y potenciar la transformación. Este método asegura una elevada frecuencia de co-estimulación simultánea de ADN-T y proteínas anti-CHD funcional en la misma célula anfitriona. La liberación directa de anticuerpos anti-CHD empleando métodos físicos tales como el bombardeo con partículas también se puede utilizar para inhibir la actividad de CHD y estimular transitoriamente el crecimiento embriogénico somático.
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Ejemplo 13 Uso del gen CHD mutagenizado dominante negativo para estimular transitoriamente la embriogénesis y potenciar la transformación
Utilizando la mutagénesis dirigida para desorganizar los dominios funcionales críticos en gen CHD se creará un mutante dominante negativo. Por ejemplo, los cambios de un único aminoácido en los motivos helicasa/ATPasa IV y VI suprimirán la función ATPasa en esta proteína. En Arabidopsis, la secuencia de nucleótidos se puede modificar para codificar una secuencia de aminoácidos alterada, o bien cambiando LLRRVKK a LLRKVKK o bien cambiando AMARAHR a AMAKAHR. En cualquier tramo de aminoácidos, el cambio de la arginina central a un resto lisina o alanina destruye completamente la función ATPasa en esta proteína. Estas secuencias tienden a estar muy conservadas, de modo que la alteración del gen del maíz (o gen CHD de cualquier otra planta) debe tener un efecto similar. Cuando semejante gen CHD alterado es expresado en exceso en la célula vegetal, este actúa como dominante negativo dando como resultado una reducción de la actividad de CHD endógena(y en algunos casos puede dar como resultado una regulación esencialmente a la baja de CHD hasta el punto de que no haya actividad).
Las técnicas de deleción o intercambio de dominios también se pueden emplear para crear un mutante dominante negativo. Por ejemplo, una de las actividades de represión transcripcional de CHD se logra mediante desacetilación de histonas. En un sistema de mamífero, CHD3/CHD4 se une a la histona desacetilasa por medio de un motivo dedo de cinc que está presente en el extremo N de la proteína. La deleción del motivo dedo de cinc, esto es CQACGESTNLVSCNTCTYAFHAKCL de CHD3 de Arabidopsis, en esta proteína cambiará la accesibilidad a las histonas y dará como resultado una reducción de la actividad remodeladora del nucleosoma de esta proteína y conducirá a una liberación de la células transgénica de la represión transcripcional.
La expresión al alza transitoria de semejante constructo de CHD dominante negativo dará como resultado una actividad CHD reducida en las células vegetales que lo expresan transitoriamente. Los genes y/o rutas normalmente suprimidos por CHD serán activados transitoriamente. Semejante estimulación en células que reciben el ADN foráneo dará como resultado un aumento del crecimiento, y en las especies tales como el maíz en las que el crecimiento de agrupaciones de células transgénicas con respecto a las células de tipo salvaje (no transformado) puede ser limitante, esta estimulación del crecimiento se traducirá en un aumento de la recuperación de transformantes (esto es aumento de la frecuencia de transformación).
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Ejemplo 14 Incremento del contenido de aceite en semillas de cultivo mediante co-supresión del gen CHD
Se pueden construir fácilmente casetes de expresión que suprimen la expresión de CHD en semillas. Por ejemplo, se pueden utilizar el promotor de oleosina de maíz, o el promotor de gamma-zeína para co-suprimir CHD en semillas solamente. Se pueden obtener semillas transgénicas mediante transformación con Agrobacteria o mediante métodos con pistola génica como se ha comentado antes. La represión de la expresión CHD en semillas conducirá a la expresión de muchos genes embrionarios y cambiará la diferenciación celular. Esto puede incrementar la acumulación de aceite en endospermo o incrementar el tamaño del embrión. El contenido en aceite del embrión y el endospermo se pueden determinar fácilmente mediante extracción con hexano.
<110> Pioneer Hi-Bred, Intl
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E.I. du Pont de Nemours and Company 
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<120> Ácidos Nucleicos Reguladores Transcripcionales, Polipéptidos y Métodos de Uso de los Mismos
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<130> 1288-PCT
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<150> 60/251,555
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<151> 2000-12-06
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<160> 41
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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<210> 1
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<211> 1874
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<212> ADN
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<213> Zea mays 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (3)...(1656)
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<400> 1
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1
2
3 
\newpage
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<210> 2
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<211> 551
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<212> PRT
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<213> Zea mays 
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<400> 2
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4
5 
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1) ... (21)
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
acgagaatga tgaatctcgc c 
\hfill
21 
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<210> 4
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaaccatcg atttccatgt ccg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 941
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)...(941)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (425)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(22)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagctccaca ccttggatat gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatgggctc agtgattttc cgc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1913
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(1913)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
10
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
13
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgaattcaaa acctgggctc cca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttagaatgtt gggcgccctc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1463
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(1463)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (1463)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
16
17 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 486
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(486)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
18
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagaagagc ggaaccatat aag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcttctagg tggctcaatc cag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1645
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(1645)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1645)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
20
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(547)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
23
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acaggcactc ctatccaaaa cag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaatgatggt cgcccttttg agt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) ... (514)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (514)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(169)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacccgatga tctgtcgcct tca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatccagga ggacttctct caa 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (221) ... (403)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (403)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(126)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(23)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccccatggt attgaagaac aga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attttatttc atgtgtcacc cagcc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(522)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(522)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(171)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)....(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtttctggga ggaaggctca gta 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatgtatgcc actggcaacc cgt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(510)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oryza sativa 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttacaggat ttcgggggag gtg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttcacgtt taggaggtgt cag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 667
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> triticum aestivum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ... (667)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (667)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
35 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> triticum aestivum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(214)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgactgga accccattac aga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (23)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgccgttg tacaaatcaa acg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12561
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (12561)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia genómica Zmpk1
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misceláneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (12561)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
37
38
39
40

Claims (42)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que tiene actividad CHD (modificadora de la organización de la cromatina-helicasa-de unión a ADN), y que comprende:
(a)
una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;
(b)
una secuencia de polinucleótidos que tiene como se muestra en el SEQ ID NO: 1; o
(c)
una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 1, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa del SEQ ID NO: 1 y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando los parámetros por defecto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, donde el polinucleótido es de una monocotiledónea o una dicotiledónea.
3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 donde dicho porcentaje de identidad de la secuencia es de al menos 95%.
4. Un vector que comprende al menos un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Una casete de expresión que comprende al menos un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 conectado operablemente a un promotor, donde el ácido nucleico está en orientación efectora.
6. Una célula anfitriona que contiene al menos una casete de expresión, vector o ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. La célula anfitriona de la reivindicación 3 que es una célula vegetal.
8. Una planta transgénica que comprende al menos una casete de expresión de la reivindicación 5.
9. La planta transgénica de la reivindicación 8, donde la planta es maíz, soja, sorgo, trigo, arroz, alfalfa, girasol, canola, algodón, o agrostis.
10. Una semilla de la planta transgénica de la reivindicación 8 o 9 que comprende dicha casete de expresión de la reivindicación 5.
11. Una proteína aislada que tiene actividad CHD (modificadora de la cromatina-helicasa-unión a ADN) y que comprende:
(a)
un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2;
(b)
una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa del SEQ ID NO: 2 y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando parámetros por defecto; o
(c)
un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Una proteína de la reivindicación 11 donde dicho porcentaje de identidad es de al menos 95%.
13. Una ribosecuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de la reivindicación 11.
14. Un método para modular la actividad CHD (modificadora de la cromatina-helicasa-unión a ADN) en una célula anfitriona, que comprende:
(a)
transformar una célula anfitriona con al menos una casete de expresión de la reivindicación 5; y
(b)
hacer crecer la célula anfitriona transformada.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un método para modular transitoriamente el nivel de actividad CHD (modificadora de la cromatina-helicasa-unión a ADN) en células anfitrionas que comprende introducir al menos un ácido nucleico de CHD de la reivindicación 1 para producir una célula transformada y hacer crecer la célula anfitriona transformada.
\newpage
16. El uso de un constructo silenciador de CHD (modificador de la cromatina-helicasa-unión a ADN) como constructo de expresión cuyo ARNm transcrito o proteína actúa disminuyendo la expresión funcional de CHD activa, o de un anticuerpo dirigido contra un dominio funcional crítico en una molécula de CHD para reducir la actividad de la proteína CHD endógena en una planta o célula vegetal; donde la CHD cuya expresión o actividad es reducida o disminuida es una CHD como se define en la reivindicación 11 o 12.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 donde dicha disminución se logra por medio de la expresión de un constructo antisentido dirigido contra el gen estructural de CHD; por medio de un vector en el que el gen estructural de CHD o una de sus porciones se utiliza para elaborar una horquilla de silenciamiento; o donde la casete de expresión al alza de CHD que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 se utiliza para co-suprimir los niveles de CHD endógena.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para modular, opcionalmente transitoriamente, la actividad de CHD en una célula vegetal anfitriona.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para potenciar la respuesta del cultivo de tejidos.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para inducir la embriogénesis somática.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para la selección positiva de una célula vegetal transformada.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende introducir un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 en dicha célula, donde dicho constructo silenciador de CHD comprende un promotor capaz de conducir la expresión en una célula vegetal, para producir una célula transformada, hacer crecer la célula transformada para producir un embrión transformado, y seleccionar el embrión transformado.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 21 o 22 que comprende adicionalmente introducir un gen de interés en la célula transformada.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, 22 o 23 que comprende adicionalmente alterar los componentes del medio para favorecer el crecimiento de las células transformadas.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 donde los componentes del medio se alteran para reducir la embriogénesis somática en células o transformadas.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, 23, 24 o 25 donde dicho constructo silenciador de CHD es escindido.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 26 donde dicho polinucleótido está flanqueado por secuencias FRT para permitir la escisión mediada por FLP del polinucleótido.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para inducir la apomixis en una célula vegetal.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende introducir en una célula vegetal sensible un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 donde dicho constructo comprende opcionalmente un promotor inducible, para producir una célula vegetal transformada y hacer crecer la célula vegetal transformada para producir un embrión somático transformado.
30. El uso de acuerdo con la reivindicación 28 o 29 que comprende adicionalmente suprimir la expresión de un polinucleótido Polycomb FIE en la célula vegetal utilizando métodos efectores o antisentido.
31. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, 29 o 30 que comprende adicionalmente hacer crecer el embrión para producir una planta regenerada.
32. El uso de acuerdo con la reivindicación 29, 30 o 31 donde dicho constructo silenciador de CHD es expresado en el integumento o en tejido de nucelo.
33. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para incrementar la eficacia de transformación, que comprende introducir un constructo silenciador de CHD y un gen de interés en una célula anfitriona sensible.
34. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para incrementar la recuperación de plantas regeneradas, que comprende introducir un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 en una célula anfitriona sensible y hacer crecer dicha célula para producir una planta regenerada.
35. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para disminuir el silenciamiento génico que comprende transformar establemente un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 y un gen de interés en una célula anfitriona y hacer crecer la célula anfitriona transformada.
\newpage
36. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para incrementar la producción de aceite en una célula anfitriona, que comprende transformar establemente una célula anfitriona con un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 y hacer crecer la célula transformada para producir niveles elevados de aceite en comparación con una célula no transformada correspondiente.
37. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 36 donde dicha célula vegetal es de una monocotiledónea o una dicotiledónea.
38. El uso de acuerdo con la reivindicación 37 donde dicha monocotiledónea o dicotiledónea es maíz, soja, sorgo, trigo, arroz, alfalfa, girasol, canola, algodón, o agrostis.
39. Una planta en la cual la expresión funcional de CHD (modificador de la cromatina-helicasa-unión a ADN) disminuye por medio de un constructo silenciador de CHD, o en el cual un anticuerpo dirigido contra un dominio funcional crítico de CHD reduce la actividad de la proteína CHD endógena; donde la CHD cuya expresión o actividad es reducida o disminuida es una CHD como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12.
40. Una planta de acuerdo con la reivindicación 39 donde dicha disminución o reducción se logra de una manera definida en la reivindicación 17.
41. Una planta de acuerdo con la reivindicación 39 o 40 que es una monocotiledónea o dicotiledónea.
42. Una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42 donde dicha monocotiledónea o dicotiledónea es maíz, soja, sorgo, trigo, arroz, alfalfa, girasol, canola, algodón, o agrostis.
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