ES2330182B1

ES2330182B1 - VACCINE AGAINST THE HUMAN PAPILOMA VIRUS.

Info

Publication number: ES2330182B1
Application number: ES200703070A
Authority: ES
Inventors: Felix Rueda Palacio; Joan Carles Domingo Pedrol; Maria Africa De Madariaga De Las Heras
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2010-10-26
Anticipated expiration: 2027-11-14
Also published as: ES2330182A1

Abstract

Vacuna contra el virus del papiloma humano.Vaccine against human papillomavirus.

La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es considerada la principal enfermedad de transmisión sexual y ha sido asociada causalmente al cáncer cervical. Los inventores proporcionan una construcción de fórmula AVPH-[L-X]_{n}, donde AVPH es un radical de un antígeno de un virus del papiloma humano; L es un conector de masa molecular entre 3400-20000 Da, X es un radical de la porción Fc de una inmunoglobulina o de un fragmento de la misma; y n es un entero entre 1 y 60. La construcción es útil como inmunógeno y para la fabricación de composiciones farmacéuticas para la prevención y/o tratamiento del cáncer cervical o de verrugas genitales en humanos.Human papillomavirus infection (HPV) is considered the main sexually transmitted disease and has been causally associated with cervical cancer. The inventors provide a formula construction AVPH- [L-X] n, where AVPH is a radical of an antigen from a human papillomavirus; L is a connector of molecular mass between 3400-20000 Da, X is a radical of the Fc portion of an immunoglobulin or a fragment of the same; and n is an integer between 1 and 60. The construction is useful as immunogen and for the manufacture of pharmaceutical compositions for the prevention and / or treatment of cervical cancer or Genital warts in humans.

Description

Vacuna contra del virus del papiloma humano.Vaccine against human papillomavirus.

Esta invención se refiere al campo de la medicina y específicamente a las vacunas contra el virus del papiloma humano (VPH). Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN tumorales, los cuales son altamente específicos de especie.This invention relates to the field of medicine and specifically to vaccines against the virus human papilloma (HPV). Papillomavirus are small virus Tumor DNA, which are highly species specific.

Prior art

La infección por el virus del papiloma humano (VPH) está considerada la principal enfermedad de transmisión sexual y se ha ligado casualmente al cáncer de cuello uterino. Es sobrepasada sólo por el cáncer de mama como la principal causa mundial de muerte por cáncer en mujeres. Se han identificado más de 100 tipos de VPH, 35 de los cuales infectan el tracto genital. De estos, los tipos de alto riesgo se hallan en >90% de los cánceres de cuello uterino invasivos, mientras que los tipos de bajo riesgo se asocian a lesiones cervicales benignas o verrugas genitales.Human papillomavirus infection (HPV) is considered the main disease of transmission sexual and has been casually linked to cervical cancer. Is surpassed only by breast cancer as the main cause World Death from Cancer in Women. They have identified more than 100 types of HPV, 35 of which infect the genital tract. From these, high-risk types are found in> 90% of cancers invasive cervix while low-risk types They are associated with benign cervical lesions or genital warts.

Conceptualmente, hay tres enfoques para el desarrollo de una vacuna VPH. El primer enfoque busca bloquear la neoplasia inducida por VPH previniendo el establecimiento de la infección en el epitelio, principalmente a través de la inducción de anticuerpos neutralizantes contra las proteínas de la cápside viral. Una vacuna profiláctica debería estimular la completa neutralización de los virus libres tras su exposición antes que la infección pueda producirse.Conceptually, there are three approaches to development of an HPV vaccine. The first approach seeks to block the HPV-induced neoplasm preventing the establishment of infection in the epithelium, mainly through induction of neutralizing antibodies against capsid proteins viral. A prophylactic vaccine should stimulate complete neutralization of free viruses after exposure before infection may occur.

El desarrollo de vacunas preventivas contra VPH se ha complicado por la falta de modelos animales para los tipos VPH genitales mucosa-trópicos y por la dificultad de propagar el virus en cultivo. Estos problemas han sido parcialmente superados utilizando como modelos virus del papiloma animal cutáneos y de mucosa y por el desarrollo de partículas semejantes a virus ("virus-like particles", VLPs) y pseudoviriones. La expresión de L1, la proteína mayor de la cápside del virus, en sistemas de baculovirus, resulta en el auto-ensamblaje de las proteínas para formar partículas víricas vacías, indistinguibles de los viriones nativos. La utilidad de las VLPs de VPH en el desarrollo de vacunas ha promovido su generación para los tipos más comunes de VPH. La proteína menor de la cápside L2, la cual se co-ensambla con L1 para formar los viriones naturales, no es esencial para la formación de las VLPs. Además, cuando VLPs L1/L2 han sido usadas para la inmunización, la mayoría de los anticuerpos obtenidos reconocen epítopos de L1.The development of preventive vaccines against HPV it has been complicated by the lack of animal models for types HPV mucous-tropic genitals and by difficulty of spreading the virus in culture. These problems have been partially overcome using papillomavirus models cutaneous and mucosal animal and particle development virus-like ("virus-like particles", VLPs) and pseudovirions. The expression of L1, the major protein of the virus capsid, in baculovirus systems, results in the self-assembly of proteins to form empty viral particles, indistinguishable from native virions. The usefulness of HPV VLPs in vaccine development has promoted its generation for the most common types of HPV. The L2 capsid minor protein, which is co-assemble with L1 to form the virions natural, it is not essential for the formation of VLPs. Further, when L1 / L2 VLPs have been used for immunization, most of the antibodies obtained recognize epitopes of L1.

Una vacuna que ha demostrado ser un 100% efectiva previniendo el pre-cáncer cervical de alto grado y el cáncer cervical no invasivo asociado a los tipos 16 y 18 de VPH en ensayos clínicos fase III es Gardasil® de Merck. Esta es una vacuna tetravalente (esto es, cuatro antígenos) conteniendo VLPs de proteína LI recombinante de VPH de los tipos 6, 11, 16 y 18.A vaccine that has proven to be 100% effective preventing high cervical pre-cancer grade and non-invasive cervical cancer associated with types 16 and 18 HPV in phase III clinical trials is Gardasil® from Merck. This is a tetravalent vaccine (that is, four antigens) containing VLPs of recombinant HPV LI protein types 6, 11, 16 and 18.

GlaxoSmithKline ha sometido a revisión una solicitud de marketing para otra vacuna, Cervarix®. Esta es una formulación bivalente (esto es, dos antígenos) de VLPs de L1 recombinantes de los tipos 18 y 16 de VPH.GlaxoSmithKline has reviewed a Marketing request for another vaccine, Cervarix®. This is one Bivalent formulation (that is, two antigens) of L1 VLPs recombinant types 18 and 16 of HPV.

Aunque la vacunación con vacunas preventivas VPH es capaz de generar sueros con altos títulos de anticuerpos neutralizantes, tal inmunización puede no ser capaz de generar efectos terapéuticos significativos en infecciones VPH establecidas o avanzadas que hayan escapado a la neutralización mediada por anticuerpos. Por lo tanto, el segundo enfoque para el desarrollo de vacunas se dirige a inducir una respuesta inmune celular (de ambos tipos, CD4+ y CD8+), las cuales pueden ser capaces tanto de prevenir, como de inducir la regresión de lesiones neoplásicas. Esta estrategia es conocida como inmunoterapia antígeno-específica, en la cual células efectoras, particularmente células T, son inducidas contra epítopos de antígenos VPH que se sabe son expresados por las células neoplásicas (antígenos específicos de tumor) tales como E6 y E7. Las oncoproteínas E6 o E7 son consistentemente expresadas en células de cáncer de cuello uterino establecido, mientras que L1 o L2 están ausentes. Ensayos en fases tempranas en humanos utilizando vacunas terapéuticas han mostrado que son seguras. Sin embargo, no se han obtenido evidencias de eficacia clínica. Un posible efecto terapéutico basado bien en un descenso de la carga viral, bien de persistencia viral y/o en una reducción del tamaño de las lesiones fue observado en ensayos clínicos en pacientes con lesiones cervicales pre-cancerosas, neoplasia anogenital intraepitelial o verrugas anogenitales. Sin embargo, en ausencia de ensayos clínicos randomizados con placebos controlados comparando el descenso en la progresión de las lesiones, solo es posible especular sobre la eficacia clínica de estas vacunas terapéuticas. Finalmente, el tercer enfoque trata de combinar profilaxis y terapia en una vacuna, en un intento de ofrecer total cobertura para personas que han sido recientemente expuestas a virus de alto riesgo y para personas que ya sufren infección y displasia actualmente. Están siendo desarrolladas vacunas quiméricas en las que VLPs quiméricas conteniendo la proteína E7 o motivos de E7 insertados en las proteínas L1 o L2 son capaces de inducir tanto una respuesta inmunológica de anticuerpos neutralizantes anti-Li como una respuesta de linfocitos T citotóxicos específicos de E7 que inhiben el crecimiento tumoral en modelos animales (cfr. K. Schafer et al., "Immune response to human papillomavirus 16 L1 E7 chimeric virus-like particles: induction of cytotoxic T cells and specific tumor protection", Int. J. Cancer 1999, vol. 81, pp. 881-8).Although vaccination with HPV preventive vaccines is capable of generating sera with high titers of neutralizing antibodies, such immunization may not be able to generate significant therapeutic effects in established or advanced HPV infections that have escaped antibody-neutralized neutralization. Therefore, the second approach to vaccine development is aimed at inducing a cellular immune response (of both types, CD4 + and CD8 +), which may be capable of both preventing and inducing regression of neoplastic lesions. This strategy is known as antigen-specific immunotherapy, in which effector cells, particularly T cells, are induced against epitopes of HPV antigens that are known to be expressed by neoplastic cells (tumor-specific antigens) such as E6 and E7. The E6 or E7 oncoproteins are consistently expressed in established cervical cancer cells, while L1 or L2 are absent. Early phase trials in humans using therapeutic vaccines have shown that they are safe. However, no evidence of clinical efficacy has been obtained. A possible therapeutic effect based either on a decrease in viral load, either on viral persistence and / or a reduction in lesion size was observed in clinical trials in patients with pre-cancerous cervical lesions, intraepithelial anogenital neoplasia or anogenital warts. However, in the absence of randomized clinical trials with controlled placebos comparing the decrease in lesion progression, it is only possible to speculate on the clinical efficacy of these therapeutic vaccines. Finally, the third approach tries to combine prophylaxis and therapy in a vaccine, in an attempt to offer full coverage for people who have recently been exposed to high-risk viruses and for people who are currently suffering from infection and dysplasia. Chimeric vaccines are being developed in which chimeric VLPs containing the E7 protein or E7 motifs inserted into the L1 or L2 proteins are capable of inducing both an immune response of neutralizing anti-Li antibodies and a response of E7-specific cytotoxic T lymphocytes that inhibit tumor growth in animal models (cf. K. Schafer et al ., "Immune response to human papillomavirus 16 L1 E7 chimeric virus-like particles: induction of cytotoxic T cells and specific tumor protection", Int. J. Cancer 1999, vol. 81, pp. 881-8).

Partículas opsonizadas con anticuerpos incrementan su captación mediante la unión a receptores específicos presentes en células fagocíticas, produciendo como resultado un incremento en la activación de las células T. Los inmunocomplejos antígeno:anticuerpo se unen a los receptores Fc presentes en la superficie de las células presentadoras de antígeno (CPA), tales como, células dendríticas o macrófagos. Estos complejos son así internalizados y el antígeno procesado y presentado en el contexto de las moléculas que codifican los Complejos Mayores de Histocompatibilidad (CMH) para células T antígeno específicas. Los antígenos unidos a anticuerpos no se dispersan, ya que son reconocidos por receptores específicos en las CPA, lo que puede reducir el nivel de antígeno requerido para activar las células T. Sin embargo, aunque los inmunocomplejos han sido descritos como potentes inmunógenos (cfr. S. Amigorena, "Fc gamma receptors and cross-presentation in dendritic cells", J. Exp. Med. 2002, vol. 195 ppl-3), para conseguir este objetivo es necesario utilizar anticuerpos monoclonales, con posibles procesos de reacciones adversas, como ha sido observado en otros tratamientos con anticuerpos monoclonales (cfr. K. Tada et al., "Severe infusion reaction induced by trastuzumab: a case report", Breast Cancer 2003, vol. 10, pp. 167-9; R.J. Cersosimo, "Monoclonal antibodies in the treatment of cancer, Part 1", Am. J. Health Syst. Pharm. 2003, vol. 60, pp. 1531-48).Opsonized particles with antibodies increase their uptake by binding to specific receptors present in phagocytic cells, resulting in an increase in the activation of T cells. Antigen: antibody immunocomplexes bind to Fc receptors present on the surface of the presenting cells. of antigen (CPA), such as dendritic cells or macrophages. These complexes are thus internalized and the antigen processed and presented in the context of the molecules encoding the Major Histocompatibility Complexes (CMH) for specific antigen T cells. Antibodies bound to antibodies do not disperse, since they are recognized by specific receptors in CPAs, which may reduce the level of antigen required to activate T cells. However, although immunocomplexes have been described as potent immunogens (cf. S. Amigorena, "Fc gamma receptors and cross-presentation in dendritic cells", J. Exp. Med . 2002, vol. 195 ppl-3), to achieve this objective it is necessary to use monoclonal antibodies, with possible adverse reaction processes, as has been observed in other monoclonal antibody treatments (cf. K. Tada et al ., "Severe infusion reaction induced by trastuzumab: a case report", Breast Cancer 2003, vol. 10, pp. 167-9; RJ Cersosimo, "Monoclonal antibodies in the treatment of cancer, Part 1", Am. J. Health Syst. Pharm . 2003, vol. 60, pp. 1531-48).

A pesar de las mencionadas vacunas, todavía existe la necesidad de nuevos tratamientos inmunológicos terapéuticos contra el VPH, causante del cáncer de cuello uterino o de otras enfermedades relacionadas con el VPH. La inmunoterapia puede tener un impacto inmediato en la incidencia del cáncer cervical, mientras que las vacunas profilácticas tardarán años a reducir la mortalidad debido a esta enfermedad.Despite the mentioned vaccines, still there is a need for new immunological treatments therapeutic against HPV, the cause of cervical cancer or of other diseases related to HPV. Immunotherapy may have an immediate impact on the incidence of cancer cervical, while prophylactic vaccines will take years to reduce mortality due to this disease.

Explanation of the invention.

La presente invención se relaciona con las construcciones inmunogénicas y las vacunas contra el virus del papiloma humano (VPH). En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción con la fórmula AVPH-[L-X]n (fórmula I) donde AVPH es un radical de un antígeno de un virus papiloma humano (VPH); L es un conector de masa molecular entre 3400-20000 Da; X es un radical de la porción Fc de una inmunoglobulina o de un fragmento de la misma; y n es un entero entre 1 y 60.The present invention relates to the immunogenic constructions and vaccines against the virus human papilloma (HPV). In a first aspect, the present invention refers to a construction with the formula AVPH- [L-X] n (formula I) where AVPH is a radical of an antigen of a human papillomavirus (HPV); L is a molecular mass connector between 3400-20000 Da; X is a radical of the Fc portion of an immunoglobulin or a fragment thereof; and n is an integer between 1 and 60.

Los inventores han hallado un incremento de 5-10 veces en la respuesta en los linfocitos T inducida por las células dendríticas (DC) cuando éstas son cebadas con la construcción de la invención, respecto a las VLPs de VPH solas. La construcción permite dirigir el HPVA a los receptores Fc de las CPAs in vivo o ex-vivo. Entre otros efectos, la captación del antígeno por los receptores Fc[gamma] produce inducción de maduración en células dendríticas, incrementa la eficiencia de la presentación de antígenos exógenos por los complejos mayores de histocompatibilidad de clase I e incremento de la activación de las células T hasta 10 veces por encima de la que produce el antígeno sólo. El uso de los fragmentos Fc en la construcción, evita la potencial inducción de anticuerpos anti-idiotipo (región variable de las inmunoglobulinas), lo cual puede producirse en caso de utilizar anticuerpos completos, ya que el fragmento Fc presenta una alta homología interindividual.The inventors have found a 5-10 fold increase in the response in T lymphocytes induced by dendritic cells (DC) when they are primed with the construction of the invention, relative to HPV VLPs alone. The construction allows HPVA to be directed to the Fc receptors of the CPAs in vivo or ex-vivo . Among other effects, the uptake of the antigen by the Fc [gamma] receptors produces induction of maturation in dendritic cells, increases the efficiency of the presentation of exogenous antigens by major class I histocompatibility complexes and increases the activation of T cells. up to 10 times above that produced by the antigen only. The use of Fc fragments in the construction avoids the potential induction of anti-idiotype antibodies (variable region of immunoglobulins), which can occur in case of using complete antibodies, since the Fc fragment has a high interindividual homology.

De acuerdo con la invención, el antígeno es de virus de papiloma humano (VPH). Los virus del papiloma son pequeños virus ADN que codifican hasta ocho genes tempranos, E1 a E8, y dos genes tardíos. Los genes tardíos L1 y L2 codifican para proteínas estructurales, que se ensamblan dentro de la célula para formar una cápside. La cápside de un solo virus es un icosaedro T=7d compuesto de 360 capsómeros pentaméricos, cada uno de los cuales contiene cinco moléculas de la proteína mayor de la cápside L1. La proteína menor de la cápside, L2, está presente en un tercio aproximadamente de la cantidad de L1.According to the invention, the antigen is of human papillomavirus (HPV). Papillomavirus are small DNA viruses that encode up to eight early genes, E1 to E8, and two late genes. The late genes L1 and L2 code for proteins structural, which are assembled inside the cell to form a capsid The single virus capsid is a compound icosahedron T = 7d of 360 pentameric capsomeres, each of which contains five molecules of the major protein of the L1 capsid. The protein minor of the capsid, L2, is present in approximately one third of the amount of L1.

En una realización particular de la invención, el antígeno es una partícula similar a virus ("virus-like particle", VLP) de VPH que comprende la proteína L1 de VPH. En otra particular realización, el antígeno es una VLP quimérica de VPH que comprende además al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en L2, E6 y E7 de VPH. En otra realización, el VPH es seleccionado de los VPH de los tipos 16 y 31.In a particular embodiment of the invention, the antigen is a virus-like particle ("virus-like particle", VLP) of HPV that comprises HPV L1 protein. In another particular embodiment, the antigen is a chimeric HPV VLP that further comprises at least a protein selected from the group consisting of L2, E6 and E7 of HPV In another embodiment, the HPV is selected from the HPV of the types 16 and 31.

Tal como se usa aquí, el término "virus-like particle (VLP)" se refiere a una estructura parecida a una partícula vírica pero que ha demostrado no ser patogénica. Típicamente una VLP de acuerdo con la invención, no lleva información genética que codifique para las proteínas de la VLP. Las VLPs carecen del genoma vírico y por lo tanto, no son replicativas, ni infecciosas. Además, las VLPs a menudo pueden ser producidas en grandes cantidades mediante expresión heteróloga y pueden ser fácilmente purificadas.As used here, the term "virus-like particle (VLP)" refers to a structure similar to a viral particle but that has shown no be pathogenic Typically a VLP according to the invention, not carries genetic information that codes for the proteins in the VLP VLPs lack the viral genome and therefore are not replicative or infectious. In addition, VLPs can often be produced in large quantities by heterologous expression and They can be easily purified.

VLPs adecuadas para la invención son VLPs tipo salvaje generalmente formadas predominantemente de L1 y una menor proporción de la proteína L2; VLPs que contienen sólo la proteína L1; VLPs que contienen las proteínas L1 o L2 modificadas, otras proteínas (naturales o no, tales como las proteínas E del VPH) las cuales han sido fusionadas a como mínimo una porción de las proteínas L1 o L2. Las VLPs basadas en la L1 del VPH se describen en WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 y WO 94/05792. Las VLPs basadas en la L2 son descritas, por ejemplo en WO 93/00436. Otras VLPs se basan en la fusión con proteínas tempranas, tales como E7 o en la interacción con otras proteínas fusionadas, tales como L2-E7. La proteína L1 usada para formar la VLP puede ser una proteína L1 truncada. Preferiblemente el corte extrae una señal de localización nuclear. Preferiblemente el corte es en C-terminal. Preferiblemente el corte en C-terminal extrae menos de 50 aminoácidos, más preferible menos de 40 aminoácidos. Cuando la VLP es una VLP de VPH 16 entonces preferiblemente el corte C-terminal extrae 34 aminoácidos de la L1 de VPH 16. Las proteínas L1 truncadas son proteínas derivadas L1 que funcionan de forma adecuada. Los derivados de proteínas funcionales L1 son capaces de provocar una respuesta inmune, que es capaz de reconocer una VLP consistente en una proteína L1 de tamaño completo y/o el tipo de VPH del cual la proteína L1 deriva.VLPs suitable for the invention are type VLPs wild generally formed predominantly of L1 and a minor proportion of the L2 protein; VLPs that contain only the protein L1; VLPs containing modified L1 or L2 proteins, others proteins (natural or not, such as HPV proteins E) which have been merged to at least a portion of the L1 or L2 proteins. VLPs based on HPV L1 are described in WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 and WO 94/05792. VLPs based on L2 are described, for example in WO 93/00436. Other VLPs are based on fusion with early proteins, such as E7 or in interaction with other fused proteins, such as L2-E7. The L1 protein used to form the VLP It can be a truncated L1 protein. Preferably the cut extracts A nuclear location signal. Preferably the cut is in C-terminal Preferably the cut in C-terminal extracts less than 50 amino acids, more Preferably less than 40 amino acids. When the VLP is an HPV VLP 16 then preferably the C-terminal cut extracts 34 amino acids from HPV L1 16. L1 proteins truncated are L1 derived proteins that work in a way adequate. L1 functional protein derivatives are capable of elicit an immune response, which is able to recognize a VLP consisting of a full-size L1 protein and / or the type of HPV from which the L1 protein is derived.

Las VLPs de la invención pueden comprender otros tipos de derivados de proteínas funcionales, incluyendo proteínas L1 de VPH mutantes de longitud completa o truncadas, tales como, mutaciones por deleción, sustitución o inserción. Derivados apropiados también incluyen secuencias con codones optimizados. La proteína L1 o derivados también puede ser una proteína de fusión, tal como la fusión de la proteína L1 con L2 o una proteína temprana. La proteína L1 o proteínas derivadas funcionales son capaces de formar una VLP y la formación de la VLP puede ser establecida por técnicas estándar, tales como microscopía electrónica y dispersión dinámica de luz láser.The VLPs of the invention may comprise other types of functional protein derivatives, including proteins L1 of full-length or truncated HPV mutants, such as, deletion, substitution or insertion mutations. Derivatives Appropriate also include sequences with optimized codons. The L1 protein or derivatives may also be a fusion protein, such as the fusion of the L1 protein with L2 or an early protein. The L1 protein or functional derived proteins are capable of form a VLP and the formation of the VLP can be established by standard techniques, such as electron microscopy and dispersion dynamic laser light.

Las VLPs pueden ser fabricadas en cualquier sustrato celular adecuado, tales como, bacterias, levaduras o células de insecto, p.ej. células infectadas con baculovirus. Son bien conocidos en la técnica los métodos para la preparación de VLPs e incluyen el método de desensamblaje-reensamblaje para conseguir una mayor homogeneidad, por ejemplo como se describe en WO 99/13056 y US 6245568.VLPs can be manufactured in any suitable cell substrate, such as, bacteria, yeasts or insect cells, eg cells infected with baculovirus. They are methods well known in the art for the preparation of VLPs and include the method of disassembly-reassembly to achieve greater homogeneity, for example as described in WO 99/13056 and US 6245568.

De acuerdo con la invención, L es un polímero biradical de masa molecular entre 3400-20000 Da que es usado como un conector. El conector de la invención tal como es usado aquí, se refiere a un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetitivas enlazadas unas con otras mediante uniones covalentes excluyendo el enlace peptídico. El conector que puede ser usado en la presente invención puede seleccionarse entre polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol, propile glicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, poliviniletil éter, polímeros biodegradables tales como, ácido poliláctico (APL) y ácido poliláctico-glicólico (APLG), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos.According to the invention, L is a polymer biradical molecular mass between 3400-20000 Da that It is used as a connector. The connector of the invention as it is used here, refers to a biocompatible polymer that includes two or more repetitive units linked to each other by covalent junctions excluding the peptide bond. The connector that can be used in the present invention can be selected from polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol copolymers, propylene glycol, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, polymers biodegradable such as polylactic acid (APL) and acid polylactic-glycolic (APLG), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid and combinations thereof.

El conector de la presente invención puede ser un polímero o una combinación de diferentes tipos de polímeros. El conector posee un grupo reactivo capaz de unirse a la porción Fc de la inmunoglobulina y a los HPVA. El conector posee un grupo reactivo en ambos extremos, que es preferiblemente seleccionado de entre un grupo reactivo aldehído, un grupo propión-aldehído, un grupo butil-aldehído, un grupo maleimido y un derivado succinimido. El derivado succinimido puede ser succinimidil- propionato, hidroxi succinimidil, succinimidil carboximetil o succinimidil carbonato. En particular, cuando el conector posee un grupo reactivo aldehído en ambos extremos, es efectivo para unir a ambos extremos con un polipéptido fisiológicamente activo y una porción Fc de las inmunoglobulinas con mínimas reacciones no específicas. Los grupos reactivos a ambos extremos del conector pueden ser los mismos o diferentes. Por ejemplo, el conector puede poseer un grupo maleimido en un extremo y en el otro extremo, un grupo aldehído, un grupo propiónico aldehído o un grupo butil aldehído.The connector of the present invention can be a polymer or a combination of different types of polymers. He connector has a reactive group capable of binding to the Fc portion of immunoglobulin and HPVA. The connector has a group reagent at both ends, which is preferably selected from between an aldehyde reactive group, a group propion-aldehyde, a group butyl aldehyde, a maleimido group and a derivative succinimido. The succinimide derivative can be succinimidyl- propionate, hydroxy succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate. In particular, when the connector has a aldehyde reactive group at both ends, is effective to bind to both ends with a physiologically active polypeptide and a Fc portion of immunoglobulins with minimal reactions not specific. The reactive groups at both ends of the connector They can be the same or different. For example, the connector can possess a maleimido group at one end and at the other end, a aldehyde group, an aldehyde propionic group or a butyl group aldehyde.

En una realización particular de la invención, L es un biradical de un polímero seleccionado entre polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, copolimeros de etilenglicol y propilenglicol, dextrano, ácido poliláctico, ácido poliláctico-glicólico y ácido hialurónico. En una realización preferida, L es un biradical de PEG.In a particular embodiment of the invention, L it is a biradical of a polymer selected from polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, ethylene glycol copolymers and propylene glycol, dextran, polylactic acid, acid polylactic-glycolic and hyaluronic acid. In a preferred embodiment, L is a biradical of PEG.

Cuando es usado como conector el PEG que tiene un grupo hidroxi reactivo a ambos lados, el grupo hidroxi puede ser activado para varios grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas. Alternativamente, para preparar la construcción de la presente invención, puede ser usado un PEG comercialmente disponible con un grupo reactivo modificado. Generalmente, el PEG es un componente bifuncional disponible comercialmente con un grupo N-hidroxisuccinimida que se une a grupos amino del HPVA, y un grupo maleimida que reacciona con los grupos tiol de la porción Fc.When it is used as a connector the PEG that has a reactive hydroxy group on both sides, the hydroxy group can be activated for various reactive groups by chemical reactions known. Alternatively, to prepare the construction of the In the present invention, a PEG can be used commercially available with a modified reactive group. Generally, the PEG it is a commercially available bifunctional component with a group N-hydroxysuccinimide that binds to amino groups of the HPVA, and a maleimide group that reacts with the thiol groups of the portion Fc.

De acuerdo con la invención, X es un radical de la porción Fc de las inmunoglobulinas o un fragmento del mismo. El término "porción Fc de las inmunoglobulinas", tal como se usa aquí, se refiere a una proteína que contiene la región constante 2 de la cadena pesada (C_{H}2) y la región constante 3 de la cadena pesada (C_{H}3) de una inmunoglobulina y no las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, ni la región constante 1 de la cadena pesada (C_{H}1 ), ni la región constante 1 de la cadena ligera (CO) de la inmunoglobulina. Puede incluir además la región bisagra de la región constante de la cadena pesada. También, la porción Fc de las inmunoglobuilinas de la presente invención puede contener una porción o la región constante 1 de la cadena pesada (C_{H}1) entera y/o la región constante 1 de la cadena ligera (C_{L}I ), excepto las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. También, siempre que esta tenga un función fisiológica similar o mejor que la proteína nativa, la porción Fc de la IgG puede ser un fragmento conteniendo una deleción en una porción relativamente larga de la secuencia de aminoácidos de C_{H}2 y/o C_{H}3. Así pues, la porción Fc de la inmunoglobulina de la presente invención puede comprender un dominio C_{H}1, un dominio C_{H}2, un dominio C_{H}3 y un dominio C_{H}4; un dominio C_{H}1 y un dominio C_{H}2; un dominio C_{H}1 y un dominio C_{H}3; un dominio C_{H}2 y un dominio C_{H}3; una combinación de uno o más dominios y una región bisagra de las inmunoglobulinas (o una porción de la región bisagra); y un dímero de cada dominio de las regiones constantes de la cadena pesada y de la región constante de la cadena ligera. Adicionalmente, la porción Fc, si se desea, puede ser modificada mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación y parecidos. Los mencionados derivados de Fc son derivados que poseen una actividad biológica idéntica a la porción Fc de la presente invención o con estabilidad estructural mejorada, por ejemplo, contra el calor o el pH.According to the invention, X is a radical of the Fc portion of the immunoglobulins or a fragment thereof. He term "Fc portion of immunoglobulins", as used here, it refers to a protein that contains the constant region 2 of the heavy chain (C H 2) and the constant region 3 of the chain heavy (C H 3) of an immunoglobulin and not regions variables of the heavy and light chains, nor the constant region 1 of the heavy chain (C H 1), nor the constant region 1 of the light chain (CO) of immunoglobulin. It can also include the hinge region of the constant region of the heavy chain. Too, the Fc portion of the immunoglobuilins of the present invention may contain a portion or constant region 1 of the chain heavy (C H 1) integer and / or constant region 1 of the chain light (C L), except the variable regions of the chains heavy and light Also, as long as it has a function physiological similar or better than the native protein, the Fc portion of the IgG can be a fragment containing a deletion in a relatively long portion of the amino acid sequence of C_ {2} and / or C_ {3}. So, the Fc portion of the immunoglobulin of the present invention may comprise a domain C_ {H} 1, a C_ {H} 2 domain, a C_ {H} 3 domain and a domain CH 4; a C H domain 1 and a C H domain 2; a domain C H 1 and a C H 3 domain; a C_ {H} 2 domain and a domain C H 3; a combination of one or more domains and a hinge region of immunoglobulins (or a portion of the hinge region); and a dimer of each domain of the constant regions of the chain heavy and of the constant region of the light chain. Additionally, the Fc portion, if desired, can be modified. by phosphorylation, sulphation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation and the like. The mentioned Fc derivatives are derivatives that have an activity Biological identical to the Fc portion of the present invention or with improved structural stability, for example, against heat or pH

Adicionalmente, la porción Fc de las inmunoglobulinas de la presente invención puede tener cadenas de azúcar nativas, cadenas de azúcar incrementadas comparado con la forma nativa; o cadenas de azúcar disminuidas comparado con la forma nativa; o puede encontrarse en una forma desglicosilada. El incremento, la disminución o la eliminación de las cadenas de azúcar de la Fc de las inmunoglobulinas, pueden llevarse a cabo mediante métodos comunes en esta materia, tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética usando un microorganismo. La eliminación de las cadenas de azúcar de la porción Fc, produce una severa disminución de la afinidad de unión a la parte Clq del primer componente del complemento Cl y una disminución o pérdida en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo o de la citotoxicidad dependiente de complemento, evitando de este modo respuestas inmunológicas innecesarias in vivo. En este sentido, una forma desglicosilada o aglicosilada de la porción Fc de la inmunoglobulinas, puede también ser adecuada para el objeto de la presente invención.Additionally, the Fc portion of the immunoglobulins of the present invention may have native sugar chains, increased sugar chains compared to the native form; or diminished sugar chains compared to the native form; or it can be found in a deglycosylated form. The increase, decrease or elimination of the Fc sugar chains of immunoglobulins can be carried out by common methods in this area, such as a chemical method, an enzymatic method and a genetic engineering method using a microorganism. The elimination of sugar chains from the Fc portion causes a severe decrease in the affinity of binding to the Clq part of the first component of the Cl complement and a decrease or loss in cell-mediated cytotoxicity dependent on antibody or cytotoxicity dependent complement, thus avoiding unnecessary immune responses in vivo . In this sense, a deglycosylated or aglycosylated form of the Fc portion of the immunoglobulins may also be suitable for the purpose of the present invention.

La porción Fc de las inmunoglobulinas de la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos nativa y secuencias derivadas (mutantes) de la misma. Una secuencia de aminoácidos derivada es una secuencia que es diferente de la secuencia de aminoácidos nativa debido a una deleción, una inserción, una sustitución conservativa o no conservativa o combinaciones de las mismas de uno o más residuos aminoácidos.The Fc portion of the immunoglobulins of the The present invention includes a native amino acid sequence and derived sequences (mutants) thereof. A sequence of derived amino acid is a sequence that is different from the native amino acid sequence due to a deletion, a insertion, a conservative or non-conservative substitution or combinations thereof of one or more amino acid residues.

La porción Fc de las inmunoglobulinas puede ser una porción Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE y IgM, o por aquellas producidas por combinaciones o híbridos de las mismas. Preferiblemente, es derivada de IgG o IgM, las cuales se encuentran entre las proteínas más abundantes en la sangre humana y más preferiblemente de IgG, la cual se sabe incrementa la vida media de las proteínas ligando unidas. IgA es una Ig dimérica que se encuentra principalmente en regiones mucosas y representa la primera barrera en la defensa. IgM es una Ig pentamérica y aparece tempranamente en la respuesta inmunológica. Hay un cambio de IgA e IgM hacia IgG tras el primer reconocimiento del antígeno. IgE es una Ig relacionada con la respuesta a alergenos. Cada Ig posee receptores específicos en diversas células de los sistemas inmunológico y hematológico. Los receptores Fc se dividen en cuatro clases, conocidas como: receptores Fc[gamma], Fc[alpha], Fc[mu] y Fc[epsilon], los cuales se unen a IgG, IgA, IgM y IgE, respectivamente. Los receptores para la porción Fc de la IgG (Fc[gamma]R) cuando se activan por ligandos transmiten una señal celular induciendo la maduración e incrementando la respuesta inmune. Las células dendríticas, los monocitos y los macrófagos humanos expresan las tres clases principales de Fc[gamma]R, identificadas como Fc[gamma]RI (CD64), Fc[gamma]RII (CD32), y Fc[gamma]RIII (CD16).The Fc portion of immunoglobulins can be an Fc portion derived from IgG, IgA, IgD, IgE and IgM, or by those produced by combinations or hybrids thereof. Preferably, it is derived from IgG or IgM, which are found among the most abundant proteins in human blood and more preferably of IgG, which is known to increase the half-life of bound ligand proteins. IgA is a dimeric Ig that is found mainly in mucous regions and represents the first barrier in defense. IgM is a pentameric Ig and appears early in the immune response. There is a change of IgA and IgM towards IgG after the first recognition of the antigen. IgE is an Ig related to the allergen response. Each Ig owns specific receptors in various system cells Immunological and hematological. Fc receivers are divided into four classes, known as: Fc [gamma] receptors, Fc [alpha], Fc [mu] and Fc [epsilon], which are bind IgG, IgA, IgM and IgE, respectively. The receptors for the Fc portion of IgG (Fc [gamma] R) when activated by ligands transmit a cell signal inducing maturation and increasing the immune response. Dendritic cells, the monocytes and human macrophages express the three classes Fc [gamma] R main, identified as Fc [gamma] RI (CD64), Fc [gamma] RII (CD32), and Fc [gamma] RIII (CD16).

En una realización preferida de la invención, la inmunoglobulina es una IgG humana, la cual se une a CD64. La IgG está compuesta de varias regiones, las cuales, empezando por el extremo COOH, son llamadas C_{H}3, C_{H}2, una región bisagra que permite la flexibilidad de las regiones anexas, las cuales están compuestas por una C_{H}1 y una V_{H} (región variable de la cadena pesada). Estas últimas regiones están unidas por puentes disulfuro a la cadena ligera de la IgG, compuesta por las regiones C\kappa y V\kappa. Todos los otros tipos de inmunoglobulinas presentan una alta homología con estas descritas previamente. Varios fragmentos de las inmunoglobulinas pueden obtenerse por tratamientos enzimáticos y genéticos. En una realización preferida de la invención, X es un fragmento de las IgGs humanas nativas obtenido por digestión mediante papaína que produce un fragmento completamente glicosilado compuesto de dos regiones C_{H}3-C_{H}2 y la región bisagra unida por puentes disulfuro.In a preferred embodiment of the invention, the Immunoglobulin is a human IgG, which binds to CD64. IgG It is composed of several regions, which, starting with the COOH end, are called C H 3, C H 2, a hinge region which allows the flexibility of the annexed regions, which they are composed of a C_ {H} 1 and a V_ {H} (variable region of heavy chain) The latter regions are linked by bridges IgG light chain disulfide, composed of regions C \ kappa and V \ kappa. All other types of immunoglobulins they have a high homology with these previously described. Several fragments of immunoglobulins can be obtained by Enzymatic and genetic treatments. In a preferred embodiment of the invention, X is a fragment of native human IgGs obtained by papain digestion that produces a fragment completely glycosylated composed of two regions C_ {H} 3-C_ {2} and the hinge region joined by disulfide bridges

La IgG se divide en las subclases IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 y la presente invención incluye combinaciones y híbridos de las mismas. Polipéptidos que codifican cadenas simples de la región Fc de las inmunoglobulinas del mismo origen son unidas a un polipéptido de cadena simple de diferente origen para formar dimeros o multímeros. Esto es, un dímero o multímero puede estar formado por dos o más fragmentos selecionados del grupo consistente en las porciones IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc y IgG4 Fc. La región de la porción Fc de la IgG que se une al FcR ha sido descrita basada en cristalografía de rayos X. El área de mayor contacto de Fc con el FcR está cercana al empalme entre los dominios C_{H}2 y C_{H}3. Contactos potenciales son los residuos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 de C_{H}2 y 385-387, 428 y 433-436 de C_{H}3. De acuerdo con esto, la porción Fc usada en la construcción de la invención comprende uno o más de estos aminoácidos.IgG is divided into subclasses IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and the present invention includes combinations and hybrids thereof. Polypeptides encoding single chains of the Fc region of immunoglobulins of the same origin are linked to a single chain polypeptide of different origin to form dimeros or multimers. That is, a dimer or multimer can be formed by two or more selected fragments of the group consisting in the portions IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc and IgG4 Fc. The region of the Fc portion of the IgG that binds to the FcR has been described based in X-ray crystallography. The area of greatest contact of Fc with the FcR is close to the junction between domains C_ {H} 2 and C_ {H} 3. Potential contacts are waste 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 and 314 of C 2 and 385-387, 428 and 433-436 of C 3. According to this, the Fc portion used in the construction of the invention comprises one or More of these amino acids.

Las porciones Fc pueden obtenerse de formas nativas aisladas de humanos u otros animales incluyendo vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, o pueden ser recombinantes o derivados de las mismas, obtenidas mediante células animales transformadas o microorganismos. Aquí, puede ser obtenida de la inmunoglobulina nativa aislada de las inmunoglobulinas totales de organismos humanos o animales y tratadas con un enzima proteolítico. Pueden ser adquiridas a vendedores comerciales o aisladas para los propósitos de la invención. La IgG puede ser aislada de suero de sangre mediante precipitación en sulfato amónico. La proteína precipitada es seguidamente fraccionada mediante cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de filtración en gel para aislar IgG no específica sustancialmente purificada. Con IgG no específica se quiere decir que no exista una especificidad única dominante en la población de anticuerpos. La IgG también puede purificarse de suero de sangre mediante adsorción a proteína A unida a un soporte sólido tal como Proteína A-Sepharose (Pharmacia), Proteína A-AvidChrom (Sigma), o Proteína G-Sepharose (Sigma). Otros métodos de purificación de IgG son bien conocidos por personas expertas en la materia y pueden ser usados para el propósito de aislar IgG no específica. Para preparar porciones de la IgG humana, la IgG aislada es sometida a digestión con papaína inmovilizada de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Otras proteasas que digieren IgG para producir porciones Fc intactas que pueden unirse a los receptores Fc como p.ej., elastasa de Pseudomonas aeuroginosa, plasmina (Sigma) o ficina inmovilizada (Pierce), son conocidas por los expertos en la materia y pueden ser usadas para preparar porciones Fc. La inmunoglobulina digerida es entonces incubada con una matriz de afinidad, tal como proteína A-Sepharose o proteína-G-Sepharose. Los fragmentos no unidos de IgG son eluídos de la matriz de afinidad mediante extensivos lavados en lote o en formato de columna. Las porciones Fc de la IgG son entonces eluidas por adición de un tampón incompatible con la unión del Fc adsorbido. Otras metodologías efectivas para la purificación de las porciones Fc también pueden ser empleadas. Preferiblemente, la porción Fc a ser usada en la invención es de suero humano o una porción Fc derivada de la inmunoglobulina humana recombinante que es obtenida de un microorganismo.Fc portions can be obtained in ways native isolated from humans or other animals including cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats and guinea pigs, or they can be recombinant or derivatives thereof, obtained by transformed animal cells or microorganisms. Here, can be obtained from native immunoglobulin isolated from total immunoglobulins of human or animal organisms and treated with a proteolytic enzyme. They can be purchased at commercial or isolated sellers for the purposes of the invention. IgG can be isolated from blood serum by precipitation in ammonium sulfate. The precipitated protein is then fractionated by exchange chromatography ionic or gel filtration chromatography to isolate non-IgG Specific substantially purified. With non-specific IgG, it means that there is no single dominant specificity in the population of antibodies. IgG can also be purified from serum of blood by adsorption to protein A bound to a solid support such as Protein A-Sepharose (Pharmacia), Protein A-AvidChrom (Sigma), or Protein G-Sepharose (Sigma). Other purification methods of IgG are well known by persons skilled in the art and can be used for the purpose of isolating non-specific IgG. To prepare portions of human IgG, isolated IgG is subjected to immobilized papain digestion according to the protocol recommended by the manufacturer. Other proteases that digest IgG to produce intact Fc portions that can bind to Fc receptors such as, for example, Pseudomonas aeuroginosa elastase, plasmin (Sigma) or immobilized ficine (Pierce), are known by those skilled in the art and can be used to prepare Fc portions. The digested immunoglobulin is then incubated with an affinity matrix, such as protein A-Sepharose or G-Sepharose protein. Fragments unbound IgG are eluted from the affinity matrix by extensive washes in batch or column format. Portions Fc of the IgG are then eluted by adding a buffer incompatible with the adsorbed Fc junction. Other methodologies effective for purification of the Fc portions can also be employed Preferably, the portion Fc to be used in the invention is human serum or an Fc portion derived from the recombinant human immunoglobulin that is obtained from a microorganism.

Otro aspecto de la invención se relaciona con el método de preparación de la construcción definida más arriba, la cual comprende las etapas de: (i) incubar cantidades apropiadas de AVPH y de un compuesto generador de L conteniendo grupos reactivos diferentes a ambos extremos; (ii) incubar el producto resultante de la etapa (i) con cantidades apropiadas de un compuesto generador de X químicamente activado; y (iii) separar la construcción AVPH-[L-X]_{n} de los compuestos que no hayan reaccionado. En una descripción detallada de realizaciones particulares y sin que sean limitativas de la presente invención, se describe un ejemplo particular del proceso de preparación.Another aspect of the invention relates to the construction preparation method defined above, the which comprises the steps of: (i) incubating appropriate amounts of AVPH and an L-generating compound containing reactive groups different at both ends; (ii) incubate the product resulting from step (i) with appropriate amounts of a compound generating X chemically activated; and (iii) separate the construction AVPH- [L-X] n of the compounds that do not have reacted In a detailed description of embodiments particular and without being limiting of the present invention, a particular example of the preparation process is described.

Una de las principales ventajas de la construcción de la invención es que, puesto que posee sólo la porción Fc, se evitan reacciones inmunológicas indeseadas que pueden ser inducidas por la IgG completa. La construcción induce una respuesta inmunológica mayor que el antígeno solo y comparable con aquellas descritas para inmunocomplejos. A pesar del hecho de no ser un inmunocomplejo, actúa como éste induciendo una potente respuesta inmunológica y dirigiendo al antígeno a los FcRn en células dendríticas. Su producción es muy sencilla ya que tanto la porción Fc, como el PEG están disponibles comercialmente y las reacciones químicas para unir estos compuestos al antígeno son muy comunes para los expertos en la materia. Las VLPs de VPH usadas como antígenos, pueden ser obtenidas de sistemas procariotas o eucariotas. La construcción de la invención es un buen candidato para la fabricación de vacunas profilácticas y especialmente terapéuticas.One of the main advantages of the construction of the invention is that, since it possesses only the Fc portion, unwanted immune reactions are avoided that They can be induced by complete IgG. The construction induces an immune response greater than the antigen alone and comparable with those described for immunocomplexes. Despite the fact of not being an immune complex, acts like this inducing a potent immune response and directing the antigen to the FcRn in dendritic cells Its production is very simple since both the Fc portion, such as PEG are commercially available and chemical reactions to bind these compounds to the antigen are very common for subject matter experts. HPV VLPs used as antigens, they can be obtained from prokaryotic systems or eukaryotes The construction of the invention is a good candidate for the manufacture of prophylactic vaccines and especially therapeutic

Así, otros aspectos de la invención son los relacionados con el uso de las construcciones de la invención para la fabricación de medicamentos inmunogénicos y composiciones farmacéuticas que comprendan cantidades terapéuticamente efectivas de al menos una de las construcciones definidas anteriormente, junto con cantidades apropiadas de diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.Thus, other aspects of the invention are the related to the use of the constructions of the invention for the manufacture of immunogenic drugs and compositions pharmaceuticals that comprise therapeutically effective amounts of at least one of the constructions defined above, together with appropriate amounts of diluents or carriers pharmaceutically acceptable.

En una realización particular, la composición comprende además, cantidades efectivas de al menos un adyuvante para su administración como una vacuna. Tal como es usado aquí, el término "vacuna" se refiere a una formulación que comprende la composición de la presente invención y que se encuentra en una forma que es adecuada para ser administrada a un animal. Típicamente, la vacuna comprende un medio en solución acuosa salina o tamponada convencional en el cual la composición de la presente invención está en suspensión o disuelta. En esta forma, la composición de la presente invención puede ser usada convenientemente para prevenir, mejorar o bien tratar una enfermedad. Tras su introducción en el hospedador, la vacuna es capaz de provocar un respuesta inmune que incluye, pero no está limitada a, la producción de anticuerpos, citocinas y/o la activación de células T citotóxicas, células presentadoras de antígeno, células T colaboradoras, células dendríticas y/o otras respuestas celulares.In a particular embodiment, the composition also comprises effective amounts of at least one adjuvant for administration as a vaccine. As used here, the term "vaccine" refers to a formulation comprising the composition of the present invention and which is in a form that is suitable to be administered to an animal. Typically, the vaccine comprises a medium in aqueous saline solution. or conventional buffer in which the composition of the present invention is in suspension or dissolved. In this way, the composition of the present invention can be used conveniently to prevent, improve or treat a disease. After its introduction in the host, the vaccine is capable of eliciting an immune response that includes, but is not limited to the production of antibodies, cytokines and / or the activation of cytotoxic T cells, presenting cells of antigen, helper T cells, dendritic cells and / or others cellular responses

Los adyuvantes incrementan la respuesta inmune de la construcción ya que inducen la maduración de las células dendríticas e incrementan la presentación del antígeno. Los adyuvantes preferidos en la presente invención son aquellos que se unen a los receptors relacionados con el control de la infección, como los Toll-like receptors (TLR). En realizaciones particulares, los adyuvantes son poli (I:C), un polinucleótido que se asemeja a una infección vírica, el cual se une al TLR-3; el lipopolisacárido de enterobacteria (LPS), el cual se une a TLR-4; el factor estimulante de colonias granulocito-macrofágicas (GM-CSF); o sulfato de potasio aluminio (alumbre) el cual facilita la entrada en las CPAs. Otro adyuvante apropiado es el CpG, que se refiere a dinucleótidos deoxicitidil-deoxiguanidina no metilados que mimetizan la actividad inmuno-estimuladora del ADN bacteriano y se unen al TLR-9. Los CpGs poseen un efecto mitogénico sobre, o inducen o incrementan la expresión de citocinas por las células presentadoras de antígeno. Por ejemplo, los CpGs pueden ser útiles para activar las células B, células NK y células presentadoras de antígeno, tales como monocitos, células dendríticas y macrófagos, y células T. Los CpGs pueden incluir análogos de nucleótidos, tales como análogos conteniendo uniones fosforotioéster y pueden ser de doble cadena o de cadena simple. En realizaciones particulares, las composiciones comprenden más de un adyuvante, p.ej. poli (I:C) y GM-CSF o CpG y GM-CSF. Derivados en particular de los mencionados adyuvantes han sido aprobados para uso clínico.Adjuvants increase the immune response of construction as they induce cell maturation dendritic and increase the presentation of the antigen. The Preferred adjuvants in the present invention are those that are bind to receptors related to infection control, like the Toll-like receptors (TLR). In realizations In particular, adjuvants are poly (I: C), a polynucleotide that It resembles a viral infection, which binds to the TLR-3; enterobacterial lipopolysaccharide (LPS), which joins TLR-4; the stimulating factor of granulocyte-macrophage colonies (GM-CSF); or aluminum potassium sulfate (alum) the which facilitates entry into the CPAs. Another appropriate adjuvant is CpG, which refers to dinucleotides non-methylated deoxycytidyl deoxyguanidine which mimic the immuno-stimulatory activity of DNA bacterial and bind to TLR-9. CpGs have a mitogenic effect on, or induce or increase the expression of cytokines by antigen presenting cells. For example, CpGs can be useful for activating B cells, NK cells and antigen presenting cells, such as monocytes, cells dendritic and macrophages, and T cells. CpGs may include nucleotide analogs, such as analogs containing junctions phosphorothioester and can be double stranded or single stranded. In particular embodiments, the compositions comprise more than one adjuvant, eg poly (I: C) and GM-CSF or CpG and GM-CSF. Particular derivatives of those mentioned Adjuvants have been approved for clinical use.

Las vacunas de la invención pueden ser administradas por una variedad de rutas, tales como: oral, tópica, subcutánea, vía mucosa (típicamente intravaginal), intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, intradérmica y vía supositorio. Preferiblemente, la vacuna es una formulación líquida, aunque la vacuna puede ser liofilizada y reconstituida previa a su administración. La dosis de los componentes de la vacuna, variarán con la enfermedad, sexo, edad y peso del individuo, la ruta de administración y el AVPH de la vacuna. La cantidad puede también variar con el número de tipos de VLPs. Lo adecuado es la administración de una cantidad de vacuna que genere una respuesta inmunológica protectora.The vaccines of the invention can be administered by a variety of routes, such as: oral, topical, subcutaneous, mucosal (typically intravaginal), intravenous, intramuscular, intranasal, sublingual, intradermal and via suppository. Preferably, the vaccine is a liquid formulation, although the vaccine can be lyophilized and reconstituted before its administration. The dose of vaccine components will vary. with the disease, sex, age and weight of the individual, the route of administration and the AVPH of the vaccine. The amount can also vary with the number of types of VLPs. Adequate is the administration of a quantity of vaccine that generates a response immunological protective

La vacuna puede ser formulada o co-administrada con otros antígenos VPH, tales como antígenos tempranos o antígenos no VPH para incrementar o reforzar la respuesta inmune a múltiples antígenos simultáneamente. Antígenos no VPH adecuados, pueden proporcionar protección contra otras enfermedades, como enfermedades de transmisión sexual, tales como el virus del herpes simplex, VEB, clamidia, hepatitis y VIH.The vaccine can be formulated or co-administered with other HPV antigens, such as early antigens or non-HPV antigens to increase or reinforce the immune response to multiple antigens simultaneously. Suitable non-HPV antigens can provide protection against other diseases, such as sexually transmitted diseases, such such as herpes simplex virus, EBV, chlamydia, hepatitis and HIV

La invención se relaciona además, con un método para prevenir y/o tratar el cáncer cervical o las verrugas genitales, que comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de la construcción o de la composición farmacéutica tal como se define anteriormente.The invention also relates to a method. to prevent and / or treat cervical cancer or warts genitals, which includes the administration to an individual of a effective amount of construction or composition pharmaceutical as defined above.

Un tratamiento alternativo es un método para estimular la respuesta celular ex vivo. Células efectoras (CPAs y linfocitos) pueden ser tomadas del paciente mediante, por ejemplo, aféresis. Las células efectoras pueden ser tratadas con un agente que incremente la expresión de los receptores Fc en la superficie de las células efectoras. Agentes adecuados incluyen citocinas, tales como factor estimulante de colonias granulocíticas (G-CSF), GM-CSF, [gamma]-interferón (IFN-[gamma]), factor de necrosis tumoral (TNF), y combinaciones de los mismos. Las células son tratadas con la composición farmacéutica de la invención y entonces son reinfundidas al paciente. Adicionalmente, las células del paciente (p.ej. células de la sangre) pueden ser extraídas, fraccionadas y cultivadas, si fuera apropiado para expandir el número de células, tratadas ex vivo y devueltas al paciente para terapia. Además, células cultivadas ex vivo pueden ser tratadas en varios puntos durante el cultivo y expansión ex vivo, con agentes para modificar la expresión o actividad de ciertos FcR funcionales. Agentes que incluyen, pero no están limitados a: factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, tales como, IFN-[gamma], G-CSF, TNF, y GM-CSF, e interleucinas, tales como, IL-2, IL-10 y IL-12. La dosis óptima de células, así como la relación molar de la composición de la invención, pueden variar dependiendo de factores, tales como: la situación inmunológica del hospedador, la situación de la enfermedad, etc. Así, otro aspecto de la invención se relaciona con un método de preparación del cultivo de células terapéuticas, particularmente usando células dendríticas como células efectoras. Otro aspecto se relaciona con un cultivo de células obtenible mediante el método de preparación.An alternative treatment is a method to stimulate the cellular response ex vivo . Effector cells (CPAs and lymphocytes) can be taken from the patient by, for example, apheresis. The effector cells can be treated with an agent that increases the expression of the Fc receptors on the surface of the effector cells. Suitable agents include cytokines, such as granulocytic colony stimulating factor (G-CSF), GM-CSF, [gamma] -interferon (IFN- [gamma]), tumor necrosis factor (TNF), and combinations thereof. The cells are treated with the pharmaceutical composition of the invention and then reinfused to the patient. Additionally, the patient's cells (eg blood cells) can be extracted, fractionated and cultured, if appropriate to expand the number of cells, treated ex vivo and returned to the patient for therapy. In addition, ex vivo cultured cells can be treated at various points during ex vivo culture and expansion, with agents to modify the expression or activity of certain functional FcRs. Agents that include, but are not limited to: growth factors, cytokines, lymphokines, such as, IFN- [gamma], G-CSF, TNF, and GM-CSF, and interleukins, such as, IL-2, IL- 10 and IL-12. The optimal dose of cells, as well as the molar ratio of the composition of the invention, may vary depending on factors, such as: the immunological situation of the host, the situation of the disease, etc. Thus, another aspect of the invention relates to a method of preparing therapeutic cell culture, particularly using dendritic cells as effector cells. Another aspect relates to a cell culture obtainable by the method of preparation.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados tendrán el mismo significado según lo entendido comúnmente por un experto en el tema al que pertenece esta invención. Métodos y materiales similares o equivalente a los aquí descritos se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. A través de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características, añadidos, componentes, o pasos técnicos. Otros objetos, ventajas y características adicionales de la invención podrán ser evidentes a los expertos en la materia sobre el examen de la descripción o se podrán aprender por la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used will have the same meaning as commonly understood by an expert in the subject To which this invention belongs. Similar methods and materials or equivalent to those described here can be used in practice of the present invention. Through the description and the claims the word "understand" and its variations do not intend to exclude other features, additives, components, or technical steps Other objects, advantages and features Additional of the invention may be apparent to those skilled in the subject about examining the description or can be learned by the practice of the invention. The following embodiments particulars and drawings are provided by way of illustration, and not It is intended to be limiting of the present invention.

Description of the drawings

La Fig. 1 muestra la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo de las células dendríticas obtenidas con diferentes estímulos. La Fig. 1.1 muestra el fenotipo de las células dendríticas obtenidas con el método estándar (GM-CSF, IL-4 por 6 días y maduración con TNF-\alpha) (negrilla representada por ST) con respecto a células dendríticas inmaduras (negrilla representada por C). La Fig. 1.2 muestra el fenotipo de las células dendríticas obtenidas con el método rápido (GM-CSF, Poly (I:C)) (negrilla representada por ST) con respecto al control negativo (negrilla representada por C). La Fig. 1.3 muestra células dendríticas inmaduras (C), maduración inducida por VLP-16 (negrilla representada por VLP-16), o VLP-16-PEG-Fc (negrilla representada por VLP-16-PEG-Fc) o fracción Fc libre (negrilla representada por Fc).Fig. 1 shows the phenotypic characterization by flow cytometry of the dendritic cells obtained With different stimuli. Fig. 1.1 shows the phenotype of the dendritic cells obtained with the standard method (GM-CSF, IL-4 for 6 days and maturation with TNF-?) (bold represented by ST) with respect to immature dendritic cells (bold) represented by C). Fig. 1.2 shows the phenotype of the cells dendritic obtained with the rapid method (GM-CSF, Poly (I: C)) (bold represented by ST) with respect to the control negative (bold represented by C). Fig. 1.3 shows cells immature dendritic (C), maturation induced by VLP-16 (bold represented by VLP-16), or VLP-16-PEG-Fc (bold represented by VLP-16-PEG-Fc) or free Fc fraction (bold represented by Fc).

La Fig. 2 muestra el promedio de la producción de IFN-\gamma (promedio de seis ensayos).Fig. 2 shows the average production of IFN-? (average of six trials).

La Fig. 3 muestra un estudio comparativo entre la inducción de la proliferación de células T por células dendríticas (CPM significa cuentas x min) cargadas con VLPs con respecto a aquellas cargadas con VLP-PEG-Fc. A es no cebadas; B es VLP-HPV-16; C es VLP-HPV-16-PEG-Fc; D es VLP-HPV-31; E es VLP-HPV-31-PEG-Fc; y F es SEB. (SEB significa enterotoxina B de Staphylococcus).Fig. 3 shows a comparative study between induction of T cell proliferation by cells dendritic (CPM stands for x min accounts) loaded with VLPs with regarding those loaded with VLP-PEG-Fc. A is not primed; B is VLP-HPV-16; C is VLP-HPV-16-PEG-Fc; D is VLP-HPV-31; E is VLP-HPV-31-PEG-Fc; and F is SEB. (SEB means Staphylococcus enterotoxin B).

Detailed description of the particular embodiments Chemical products

Éster de fluoresceina-PEG_{2000}-N-hidroxilsuccinimida ester (FITC-PEG-NHS), PEG_{5000}-NHS, PEG_{20000}-NHS y maleimido-PEG_{3400}-N-hidroxilsuccinimida (MAL-PEG_{3400}-NHS) se obtuvieron de Shearwater Polymers (Birmingham, AL). Ditiotreitol (DTT), succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB) y N-succinimidil-3-(2-pirilditio)-propionato (SPDP) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Sephadex G-50 y Sephacryl-400 se obtuvieron de Pharmacia Biotech (Upsala, Suecia).Ester of fluorescein-PEG 2000 -N-hydroxylsuccinimide ester (FITC-PEG-NHS), PEG_ {5000} -NHS, PEG_ {20000} -NHS Y maleimido-PEG_ {3400} -N-hydroxylsuccinimide (MAL-PEG_ {3400} -NHS) is obtained from Shearwater Polymers (Birmingham, AL). Dithiothreitol (DTT), succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) -butyrate (SMPB) and N-succinimidyl-3- (2-pyrildithium) -propionate (SPDP) were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Sephadex G-50 and Sephacryl-400 were obtained from Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden).

Production of VLPs and chemical modifications

Las VLPs de VPH fueron producidas en células de insecto Sf21 usando baculovirus recombinantes que codificaban el gen LI de VPH-16 y 31 (cfr. A. Touzé et al., "The L1 major capsid protein of human papillomavirus type 16 variants affects the yield of virus-like particle produced in an insect cells expression system", J. Clin. Microbiol. 1998, vol. 36, pp. 2046-51; y A.L. Combita et al., "Gene transfer using human papillomavirus pseudovirions varies according to virus genotype and required cell surface heparan sulphate", FEMS Microbiol. Left. 2001, vol. 204, pp. 183-8). Las células Sf21 mantenidas en medio para células de insecto Grace suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS, Invitrogen) fueron infectadas con diferentes baculovirus recombinantes e incubadas durante 72 h a 27ºC. Las células fueron recogidas (300 x g durante 10 min), resuspendidas en Tampón fosfato salino (PBS) conteniendo Nonidet P40 (0.5%), pepstatina A (10 \mug/ml, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) y leupeptina (1 \mug/ml, Sigma Aldrich), y dejadas durante 30 min a 4ºC. Los lisados celulares fueron entonces centrifugados a 12000 x g durante 20 min a 4ºC. Los precipitados nucleares fueron resuspendidos en PBS frío conteniendo pepstatina A (10 \mug/ml) y leupeptina (1 \mug/ml) y sonicados tres veces a 15-s de cizallamiento al 60% de la potencia máxima (Vibra Cell; Bioblock Scientific, Strasbourg, Francia).HPV VLPs were produced in Sf21 insect cells using recombinant baculovirus encoding the HPV-16 and 31 LI gene (cf. A. Touzé et al ., "The L1 major capsid protein of human papillomavirus type 16 variants affects the yield of virus-like particle produced in an insect cells expression system ", J. Clin. Microbiol . 1998, vol. 36, pp. 2046-51; and AL Combita et al .," Gene transfer using human papillomavirus pseudovirions varies according to virus genotype and required cell surface heparan sulphate ", FEMS Microbiol. Left . 2001, vol. 204, pp. 183-8). Sf21 cells maintained in medium for Grace insect cells supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Invitrogen) were infected with different recombinant baculoviruses and incubated for 72 h at 27 ° C. The cells were collected (300 xg for 10 min), resuspended in phosphate buffered saline (PBS) containing Nonidet P40 (0.5%), pepstatin A (10 µg / ml, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) and leupeptin (1 µg / ml, Sigma Aldrich), and left for 30 min at 4 ° C. The cell lysates were then centrifuged at 12000 xg for 20 min at 4 ° C. The nuclear precipitates were resuspended in cold PBS containing pepstatin A (10 µg / ml) and leupeptin (1 µg / ml) and sonicated three times at 15-s shear at 60% of maximum power (Vibra Cell; Bioblock Scientific , Strasbourg, France).

Los lisados fueron entonces cargados en un gradiente preformado CsCl y centrifugados hasta equilibrio en un rotor Beckman SW28 (22 h, 27000 rpm, 4ºC). Las fracciones del gradiente fueron analizadas por densidad (Refractómetro Abbé, Bioblock Scientific) y analizadas para estudiar la presencia de proteínas L1 mediante electroforesis en un gel al 10% de dodecilsulfato-poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) y teñidas con azul de Coomassie. Las fracciones conteniendo la proteína L1 se juntaron, se diluyeron en PBS y precipitaron en un rotor Beckman SW 28 (3 h, 28000 rpm, 4ºC). Después de la centrifugación las VLPs fueron resuspendidas en 0.15 M de NaCl y sonicadas una vez a 5-s de cizallamiento al 60% de la máxima potencia. El contenido proteico fue determinado mediante el kit MicroBCA (Pierce, Touzard et Matignon, Francia) y el ensamblamiento en VLPs verificado por microscopía electrónica. Con este propósito, preparaciones de VLPs purificadas fueron aplicadas a rejillas cubiertas de carbono, teñidas negativamente con 1.5% de acetato de uranilo y observadas a x 50000 de magnificación nominal utilizando un microscopio electrónico JEOL 1010.The lysates were then loaded into a CsCl preformed gradient and centrifuged until equilibrium in a Beckman SW28 rotor (22 h, 27000 rpm, 4 ° C). The fractions of gradient were analyzed by density (Abbé Refractometer, Bioblock Scientific) and analyzed to study the presence of L1 proteins by electrophoresis in a 10% gel of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) and stained with Coomassie blue. The fractions containing L1 protein were pooled, diluted in PBS and precipitated on a Beckman SW 28 rotor (3 h, 28000 rpm, 4 ° C). After centrifugation the VLPs were resuspended in 0.15 M of NaCl and sonicated once at 5-s shear at 60% of maximum power. The protein content was determined using the MicroBCA kit (Pierce, Touzard et Matignon, France) and the VLPs assembly verified by electron microscopy. With For this purpose, purified VLPs preparations were applied to carbon-coated grids, negatively stained with 1.5% of uranyl acetate and observed at 50000 nominal magnification using a JEOL 1010 electron microscope.

Covalent union of PEG to VLPs

La reacción entre los grupos reactivos N-hidroxil-succinimidil del PEG (PEG-NHS) y los grupos amino de la proteína de la VLP rinden un enlace covalente amida entre estas dos moléculas. Las VLPs (10^{10} partículas/ml) fueron mezcladas con diferentes proporciones de PEG activado (0-2 x 10^{7} moléculas de PEGNLP). El medio de incubación fue 10 mM PBS pH=7.4. La mezcla se dejó reaccionar durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción fue parada por adición aminoetanol (0.1% v/v concentración final). Finalmente, el PEG que no había reaccionado, el aminoetanol excedente y los subproductos de reacción fueron eliminados por intercambio de tampón en una columna Sephadex G-50 equilibrada con 10 mM PBS, pH 7.4 y las VLPs PEGiladas fueron dializadas finalmente en tampón fosfato salino (pH 7.4), 10% (v/v) glicerol.The reaction between the reactive groups PEG N-hydroxyl-succinimidyl (PEG-NHS) and amino groups of the protein of the VLP yield a covalent amide bond between these two molecules. The VLPs (10 10 particles / ml) were mixed with different proportions of activated PEG (0-2 x 10 7 PEGNLP molecules). The incubation medium was 10 mM PBS pH = 7.4. The mixture was allowed to react for 3 h at room temperature. The reaction was stopped by addition aminoethanol (0.1% v / v concentration final). Finally, the PEG that had not reacted, the aminoethanol surplus and reaction byproducts were removed by buffer exchange on a Sephadex G-50 column equilibrated with 10 mM PBS, pH 7.4 and PEGylated VLPs were finally dialyzed in phosphate buffered saline (pH 7.4), 10% (v / v) glycerol.

Conjugation of Fc fragments to PEGylated VLPs

Para incorporar los fragmentos Fc a los complejos VLP-PEG, las VLPs PEGiladas con el heterobifuncionalido MAL-PEG3400-NHS (2 x 10^{7} moléculas PEGNLP) fueron unidas a los fragmentos Fc previamente activados con SPDP mediante enlace tioéter a una relación molar de 30 PDP/partícula Fc (cfr. M. Mercadal et al., "A novel strategy affords high-yield coupling of antibody to extremities of liposomal surface-grafted PEG chains", Biochim Biophys Acta 1999, vol. 1418, pp. 232-8). El enlace de los grupos maleimido a tiol es una de las reacciones más útiles para la preparación de bioconjugados. Esta reacción es altamente específica para tioles a pH 6.5-7.5 en presencia de otros grupos funcionales. La reacción con la porción tiol genera un enlace 3-tiosuccinimidil éter estable. La mezcla se dejó reaccionar durante 24 horas a 4ºC en agitación suave, bajo atmósfera de N_{2}. Las VLPs modificadas fueron separadas del polímero libre y de los fragmentos Fc no unidos mediante una columna SizeSep 400 Spun Columns (Pharmacia, Uppsala, Suecia).To incorporate the Fc fragments into the VLP-PEG complexes, the PEGylated VLPs with the MAL-PEG3400-NHS heterobifunctionalide (2 x 10 7 PEGNLP molecules) were linked to the Fc fragments previously activated with SPDP via thioether linkage at a ratio 30 PDP / Fc particle molar (cf. M. Mercadal et al ., "A novel strategy affords high-yield coupling of antibody to extremities of liposomal surface-grafted PEG chains", Biochim Biophys Acta 1999, vol. 1418, pp. 232-8). The linkage of maleimido groups to thiol is one of the most useful reactions for the preparation of bioconjugates. This reaction is highly specific for thiols at pH 6.5-7.5 in the presence of other functional groups. The reaction with the thiol portion generates a stable 3-thiosuccinimidyl ether bond. The mixture was allowed to react for 24 hours at 4 ° C under gentle stirring, under N2 atmosphere. The modified VLPs were separated from the free polymer and unbound Fc fragments by a SizeSep 400 Spun Columns column (Pharmacia, Uppsala, Sweden).

Dendritic cells and T cells

Las células mononucleadas (CMN) fueron obtenidas de capas leucocitarias proporcionadas por el Centre de Transfusions i Banc de Teixits de Barcelona. La sangre de las capas leucocitarias se diluyó y el plasma rico en plaquetas fue extraído por centrifugación a 250 g x 5 min. Los precipitados fueron resuspendidos al doble del volumen inicial y cargados sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia) 850 g x 20 min. La banda de la interfase que contiene las CMN fue extraída y lavada 2 veces en salino. 5 x 10^{6} de CMN/ml de AIM-V (Gibco/BRL) fueron incubadas durante dos horas a 37ºC 5% de CO_{2}. Las células no adherentes fueron extraídas y congeladas (10% DMSO, 10% suero autólogo en AIM-V) o mantenidas en cultivo en presencia de 100 IU de IL-2 (Chiron). Las células adherentes (70-80% monocitos) fueron cultivadas durante 5 días en AIM-V suplementado con 250 ng/ml de GM-CSF (Leucomax. Novartis Farmaceutica, S.A. Barcelona) y 100 ng/ml de IL-4 (Sigma) y 2 días adicionales en presencia de 3 ng/ml de TNF-\alpha (Sigma) en lugar de IL-4 para inducir la maduración. Alternativamente se obtuvieron células dendríticas maduras por un método rápido descrito por P. Ponsaerts et al., (cfr. "Messenger RNA electroporation of human monocytes, followed by rapid in vitro differentiation, leads to highly stimulatory antigen-loaded mature dendritic cells", J. Immunol. 2002, vol. 169, pp. 1669-75) brevemente: 2 días en cultivo en AIM-V suplementado con 100 ng/ml de GM-CSF (Leucomax) y adición de 25 \mug/ml de poli I:C (SIGMA) 24 horas tras el inicio del cultivo.Mononucleated cells (CMN) were obtained from leukocyte layers provided by the Center for Transfusions and Banc de Teixits de Barcelona. The blood of the leukocyte layers was diluted and the platelet rich plasma was extracted by centrifugation at 250 gx 5 min. The precipitates were resuspended at twice the initial volume and loaded onto Ficoll-Hypaque (Pharmacia) 850 gx 20 min. The interface band containing the CMNs was extracted and washed twice in saline. 5 x 10 6 CMN / ml AIM-V (Gibco / BRL) were incubated for two hours at 37 ° C 5% CO2. Non-adherent cells were extracted and frozen (10% DMSO, 10% autologous serum in AIM-V) or maintained in culture in the presence of 100 IU of IL-2 (Chiron). Adherent cells (70-80% monocytes) were cultured for 5 days in AIM-V supplemented with 250 ng / ml of GM-CSF (Leucomax. Novartis Farmaceutica, SA Barcelona) and 100 ng / ml of IL-4 (Sigma) and 2 additional days in the presence of 3 ng / ml of TNF-? (Sigma) instead of IL-4 to induce maturation. Alternatively, mature dendritic cells were obtained by a rapid method described by P. Ponsaerts et al ., (Cf. "Messenger RNA electroporation of human monocytes, followed by rapid in vitro differentiation, leads to highly stimulatory antigen-loaded mature dendritic cells", J Immunol . 2002, vol. 169, pp. 1669-75) briefly: 2 days in culture in AIM-V supplemented with 100 ng / ml of GM-CSF (Leucomax) and addition of 25 µg / ml of poly I: C (SIGMA) 24 hours after the start of the crop.

Dendritic cells induced with VLPs and VLP-PEG-Fc

Las VLPs LI de VPH-16 y VPH-31 y sus homólogas químicamente modificadas con PEG-Fc fueron incubadas una noche con 1 x 10^{6} DCs/ml. Tras la inducción de las DC por las VLPs se lavaron y se hicieron maduran como se ha descrito anteriormente. Al final del proceso la mitad de las DC (0.5 x 10^{6}) de cada situación fueron congeladas hasta su uso para re-estimular a las células T. La otra mitad (0.5 x 10^{6} DCs) fueron co-cultivadas con las células T.The VLPs LI of HPV-16 and HPV-31 and its chemically modified counterparts with PEG-Fc were incubated one night with 1 x 10 6 DCs / ml After induction of the DC by the VLPs, they were washed and They made mature as described above. At the end of process half of the DC (0.5 x 10 6) of each situation were frozen until use to re-stimulate T cells. The other half (0.5 x 10 6 DCs) were co-cultured with T cells.

Induction of proliferative response of T cells by DCs induced by VLPs

Tras una semana de co-cultivo de las células T con DCs cebadas con VLPs, los cultivos fueron reestimulados mediante la adición de las DCs previamente congeladas, las cuales habían sido cebadas con VLPs de VPH-16 y VPH-31 modificadas o no modificadas. Células dendríticas cebadas con 1 \mug/ml de SEB (Enterotoxina B de Staphylococcus, Sigma) fueron usadas como controles positivos en todos las pruebas realizadas. La proliferación de las células T fue determinada a las 72 h como una medida de la radioactividad incorporada al ADN por adición de 1 \muCi/pocillo de ^{3}H-Timidina (Amersham) durante las 18 h finales de cultivo. No se observaron diferencias entre las DC tratadas o no durante 30 min con Mitomicina C (50 \mug/ml concentración final) tras su descongelación.After a week of co-cultivation of T cells with DCs primed with VLPs, cultures were re-stimulated by adding the DCs previously frozen, which had been primed with VLPs of HPV-16 and HPV-31 modified or not modified. Dendritic cells primed with 1 µg / ml SEB (Staphylococcus Enterotoxin B, Sigma) were used as Positive controls in all tests performed. The T cell proliferation was determined at 72 h as a measurement of radioactivity incorporated into DNA by adding 1 µCi / well of 3 H-Thymidine (Amersham) during the final 18 h of cultivation. No differences were observed. between DC treated or not for 30 min with Mitomycin C (50 / mug / final concentration) after defrosting.

Measurement of T cell activation by production of Interferon- γ

De la misma manera que se indujo la actividad proliferativa, se midió la producción de Interferón-\gamma como una función de la activación de T_{H}1. Tras 72 h de co-cultivo los sobrenadantes de cada pocillo fueron extraídos y el contenido de Interferón-\gamma medido utilizando un kit de ELISA (Pharmingen) siguiendo las instrucciones del suministrador.In the same way the activity was induced proliferative, the production of Interferon-? As a function of the T_ {1} activation. After 72 h of co-cultivation the supernatants from each well were extracted and the content of Interferon- γ measured using a kit ELISA (Pharmingen) following the instructions of the supplier

Specific cytotoxicity induced by VLPs

La actividad citotóxica fue medida sobre macrófagos antólogos cebados con VLPs de VPH-16 o VPH-31. Los macrófagos fueron obtenidos por cultivo de monocitos seleccionados negativamente mediante inmunopartículas (Kit de selección negativa de monocitos, Dynal) tratadas con 10^{4} U/ml de M-CSF durante 5 días y cargadas con las VLPs. Un día después se cargaron con ^{51}Cr (Amersham) y se sembraron con los linfocitos activados a una relación de 50 a 0.5 linfocitos por macrófago. La liberación de ^{51}Cr fue medida en un ensayo de liberación de 4 h en un contador Gamma (Pharmacia). El porcentaje de actividad citotóxica fue calculado mediante la fórmula % de C=E-LEsp/E-T donde E es la liberación de ^{51}Cr espontánea, LEsp es la liberación específica y T la liberación total (inducida por SDS).Cytotoxic activity was measured on anthropological macrophages primed with HPV-16 VLPs or HPV-31. The macrophages were obtained by culture of monocytes selected negatively by immunoparticles (Kit of negative selection of monocytes, Dynal) treated with 10 4 U / ml M-CSF for 5 days and charged with the VLPs. A day later they were loaded with 51 Cr (Amersham) and they were seeded with activated lymphocytes at a ratio of 50 to 0.5 lymphocytes per macrophage. The 51 Cr release was measured in a 4 h release test on a Gamma counter (Pharmacia). The percentage of cytotoxic activity was calculated by formula% of C = E-LEsp / E-T where E is the release of 51 Cr spontaneously, LEsp is the release specific and T total release (induced by SDS).

VLPs-PEG-Fc induce complete maturation phenotype in dendritic cells

Las células dendríticas (DC) fueron obtenidas mediante el método rápido descrito por Ponsaerts et al. (indicado anteriormente) el cual diferencia y madura monocitos a DC por medio del cultivo con GM-CSF y Poli (I:C) en sólo 3 días. Este método consigue DCs maduras, pero se caracteriza por la baja expresión de de los antígenos de maduración con respecto al clásico método de 9 días que utiliza GM-CSF y IL-4 para diferenciar y la citocinas proinflamatorias como TNF-\alpha, para madurar.Dendritic cells (DC) were obtained by the rapid method described by Ponsaerts et al . (indicated above) which differentiates and matures monocytes to DC through culture with GM-CSF and Poly (I: C) in just 3 days. This method achieves mature DCs, but is characterized by the low expression of the maturation antigens with respect to the classic 9-day method that uses GM-CSF and IL-4 to differentiate and proinflammatory cytokines such as TNF-α, to mature .

Las VLPs de VPH-16 y VPH-31 (10 \mug/ml) fueron incubadas con células dendríticas derivadas de monocitos durante 24 h y los cambios fenotípicos inducidos en estas células fueron comparados con aquéllos producidos por sus homólogos modificados químicamente (VLP-PEG-Fc) en presencia o ausencia de Poli (I:C). Los cambios fenotípicos fueron estudiados por citometría de flujo utilizando los marcadores CD1a, CD14, CD80, CD86, CD83, HLA-DR. Las VLPs solas no indujeron ningún cambio remarcable en el fenotipo compatible con la diferenciación y maduración de las DC (cfr. Fig. 1.2). Por el contrario las VLP-PEG-Fc incrementaron CD83, CD86 y bajaron CD14, aunque en menor grado en que lo hicieron TNF-\alpha o LPS. Este comportamiento puede no ser sólo atribuido a la presencia de la fracción Fc, ya que la Fc libre no afectó a la maduración de las DC (cfr. Fig. 1.3). Sin embargo, el grado de maduración alcanzado es menor que el obtenido por adición de Poli (I:C) (cfr. Fig. 1.2). Las VLPs o las VLP-PEG-Fc no modifican significativamente el fenotipo inducido por Poli (I:C). Por lo tanto, este adyuvante fue mantenido en los ensayos de activación de linfocitos.HPV-16 VLPs and HPV-31 (10 µg / ml) were incubated with cells dendritic derived from monocytes for 24 h and changes Phenotypic induced in these cells were compared with those produced by their chemically modified counterparts (VLP-PEG-Fc) in the presence or absence of Poly (I: C). Phenotypic changes were studied. by flow cytometry using the markers CD1a, CD14, CD80, CD86, CD83, HLA-DR. VLPs alone did not induce no remarkable change in the phenotype compatible with the differentiation and maturation of DC (cf. Fig. 1.2). For him opposite the VLP-PEG-Fc increased CD83, CD86 and lowered CD14, although to a lesser extent in that TNF-? or LPS did. This behavior may not only be attributed to the presence of the Fc fraction, since free Fc did not affect the maturation of DC (cf. Fig. 1.3). However, the degree of maturation reached is less than that obtained by the addition of Poly (I: C) (cf. Fig. 1.2). VLPs or VLP-PEG-Fc do not significantly modify the phenotype induced by Poly (I: C). Therefore, this adjuvant was maintained in the trials of lymphocyte activation

Dendritic cells loaded with VLPs from HPV-16 and HPV-31 induce IFN-? production by T cells

Las CPA inducen un respuesta diferente en la activación de las células T dependiendo de si la presentación del antígeno se ha producido por MHC de clase I o II y de las vías activadas en las CPA principalmente debido al tipo de antígeno y a la ruta de captación del antígeno. Este hecho tiene implicaciones en el nivel y tipo de moléculas co-estimuladoras y citocinas que serán expresadas por las DC. El IFN-\gamma es un marcador de Th1 y de activación CD8 que regula positivamente la presentación de antígeno y la actividad de las células T. La producción de IFN-\gamma por las células T fue estudiada a las 72 h tras activación con DC cargadas con VLPs o VLPs químicamente modificadas (VLP-PEG-Fc) de VPH-16 y VPH-31. A pesar de la variabilidad tanto en la intensidad, como en el tipo de respuesta al antígeno observada entre los donantes de sangre, hubo siempre el mismo patrón de respuesta en todos los individuos probados. Los resultados presentados en la Fig. 2 muestran que como promedio la producción de IFN-\gamma se incrementó de 2 a 10 veces cuando las VLPs fueron cargadas en células dendríticas como VLP-PEG-Fc y por lo tanto putativamente por los receptores Fc\gammaR.CPAs induce a different response in the T cell activation depending on whether the presentation of the antigen has been produced by MHC class I or II and pathways activated in the CPA mainly due to the type of antigen and the route of antigen uptake. This fact has implications. in the level and type of co-stimulatory molecules and cytokines that will be expressed by DC. He IFN-? Is a Th1 and activation marker CD8 that positively regulates antigen presentation and T cell activity The production of IFN-? By T cells was studied at 72 h after activation with DC loaded with VLPs or chemically VLPs modified (VLP-PEG-Fc) of HPV-16 and HPV-31. In spite of the variability in both intensity and type of response to the antigen observed among blood donors, there was always the Same response pattern in all tested individuals. The Results presented in Fig. 2 show that on average the IFN-? production increased from 2 to 10 times when the VLPs were loaded into dendritic cells as VLP-PEG-Fc and therefore putatively for the FcγR receptors.

Dendritic cells loaded with VLPs from HPV-16 and HPV-31 induce T cell proliferation

Las células dendríticas maduras inducen a los linfocitos T a proliferar cuando el antígeno presentado es reconocido por el receptor de las células T. La inmunogeneidad del antígeno y la presencia de células T de memoria determinan la respuesta de tal inducción a la proliferación. Las células T naif proliferan débilmente cuando son activadas por células dendríticas a menos que sean posteriormente estimuladas. Es probable encontrar células T reactivas a VPH en donantes de sangre sanos, ya que es muy común que los adultos hayan tenido contacto con el virus. Así, una re-estimulación con células dendríticas cargadas con VLPs es suficiente para inducir una proliferación significativa de las células T antólogas. La Fig. 3 muestra un estudio comparativo entre la proliferación de células T inducida por células dendríticas cargadas con VLPs respecto a aquellas cargadas con VLP-PEG-Fc. Aunque las diferencias no fueron tan grandes como para el IFN-\gamma, el patrón fue el mismo. Las células dendríticas cargadas con VLPs modificadas por PEG a la misma concentración que PEG-Fc (10 \mug VLPs/ ml) sólo indujeron una leve inhibición de la activación de los linfocitos.Mature dendritic cells induce T lymphocytes to proliferate when the antigen presented is recognized by the T cell receptor. The immunogeneity of the antigen and the presence of memory T cells determine the response of such induction to proliferation. Naive T cells they proliferate weakly when activated by dendritic cells to unless they are subsequently stimulated. Is likely to find HPV-reactive T cells in healthy blood donors, as it is very common that adults have had contact with the virus. So, a re-stimulation with dendritic cells loaded with VLPs is enough to induce proliferation significant of the anthologous T cells. Fig. 3 shows a comparative study between T cell proliferation induced by dendritic cells loaded with VLPs relative to those loaded with VLP-PEG-Fc. Although the differences were not so big as for the IFN- γ, the pattern was the same. The cells dendritic charged with VLPs modified by PEG to it concentration that PEG-Fc (10 V VLPs / ml) only induced a mild inhibition of the activation of lymphocytes

Sorprendentemente, DC cargadas con concentraciones crecientes de VLP-PEG (20, 30 \mug/ml) indujeron una mayor inhibición de la respuesta de las células T que 10 \mug/ml, lo cual no se observó cuando el Fc estaba unido Fig. 3.Surprisingly, DC loaded with increasing concentrations of VLP-PEG (20, 30 mug / ml) induced a greater inhibition of the response of T cells that 10 µg / ml, which was not observed when the Fc It was attached Fig. 3.

Claims

1. Construction of formula (I):

(I) AVPH- [L-X] n

where

AVPH is a radical of an antigen from a virus human papilloma (HPV);

L is a molecular mass connector between 3400-20000 Da;

X is a radical of the Fc portion of a immunoglobulin or a fragment thereof; Y

n is an integer between 1 and 60.

2. Construction according to claim 1, wherein the antigen is a particle similar to HPV virus that comprises HPV L1 protein.

3. Construction according to claim 2, wherein the antigen is a particle similar to chimeric HPV virus that it also comprises at least one protein selected from the group that It consists of L2, E6 and E7 of HPV.

4. Construction according to any of the claims 2-3, wherein HPV is selected from HPV types 16 and 31.

5. Construction according to any of the claims 1-4, wherein L is biradical polymer selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, dextran, polylactic acid, acid polylactic-glycolic and hyaluronic acid.

6. Construction according to claim 5, wherein L is a biradical polyethylene glycol.

7. Construction according to any of the claims 1-6, wherein the immunoglobulin is selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, and combinations and hybrids thereof.

8. Construction according to claim 7, wherein The immunoglobulin is human IgG.

9. Construction according to claim 8, wherein X is a fragment of the Fc portion of the IgG comprising a fully glycosylated fragment comprising two regions C_ {H} 3-C_ {2} with a hinge region joined by disulfide bridges

10. Pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of at least one of the constructions as defined in any of the claims 1-9, together with amounts appropriate pharmaceutical diluents or carriers acceptable.

11. Composition according to claim 10, which also comprises effective amounts of at least one adjuvant for Its administration as a vaccine.

12. Composition according to claim 11, where the adjuvant is selected from the group consisting of oligonucleotides of poly (inosine: cytosine), lipopolysaccharide Enterobacteria, oligonucleotides containing unmethylated CpG, colony stimulating factor granulocyte-macrophage and sulfate potassium-aluminum.

13. Composition according to claim 10, which further comprises a tumor antigen or a component of a pathogen other than HPV.

14. Use of a construction as defined in any of claims 1-9 for the manufacture of an immunogenic drug.

15. Use of a construction as defined in any of claims 1-9 for the manufacture of a pharmaceutical composition for prevention and / or Human treatment of cervical cancer or warts genitals.

16. Method of preparing a crop of therapeutic cells comprising the steps of:

(i) extraction of effector cells from patient;

(ii) adding an agent that increases the Fc receptor expression on the surface of cells effectors; Y

(iii) addition of the pharmaceutical composition as defined in claim 10 on the resulting cells of stage (ii).

17. Method according to claim 16, wherein the effector cells are dendritic cells.

18. Cell culture obtainable by the method of preparation defined in any of the claims 16-17.

19. Method of preparing a construction as defined in any of the claims 1-9, which includes the stages of:

(i) incubate appropriate amounts of AVPH and an L generating compound containing different reactive groups at both ends;

(ii) incubate the product resulting from the stage (i) with appropriate amounts of a compound generating X chemically activated; Y

(iii) separate construction AVPH- [L-X] n, of the compounds that do not have reacted