ES2329276T3 - Un metodo para procesar un fluido biologico para la determinacion de un analito. - Google Patents
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Abstract
Un método para procesar un fluido biológico que comprende componentes celulares, en el que el fluido biológico es sangre completa, en el que el fluido se somete a un tratamiento térmico en condiciones (i) para proporcionar una desintegración sustancialmente cuantitativa de dichos componentes celulares, y (ii) para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo en una condición de temperatura y tiempo definida mediante un límite superior a una temperatura dada (indicada como valor t max) y mediante un límite de tiempo inferior a una temperatura dada (indicada como valor tmin), y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más prolongado que el valor tmax, se produce la gelificación, y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más corto que el valor tmin, se produce la desintegración incompleta, y en el que el recuento celular en el fluido biológico se reduce hasta 0,1% o menos.
Description
Método para procesar un fluido biológico para la
determinación de un analito.
La presente invención se refiere a un método de
procesamiento de sangre completa mediante tratamiento térmico. El
método es particularmente útil para preparar muestras biológicas
para la detección de analitos. Adicionalmente, la invención se
refiere a sangre completa con células desintegradas, que comprende
componentes celulares desintegrados sustancial y
cuantitativamente.
La determinación de analitos en muestras
procedentes de fluidos biológicos a menudo requiere procedimientos
de pretratamiento complicados y tediosos a fin de eliminar los
componentes celulares de la muestra fluida. Por ejemplo, la sangre
completa contiene componentes, a saber, eritrocitos, leucocitos y
trombocitos. A fin de determinar analitos en una muestra de sangre,
estos componentes celulares a menudo tienen que ser eliminados
mediante procedimientos de pretratamiento tales como centrifugación,
filtración, sedimentación y/o lisis mediante reactivos químicos o
tratamiento mecánico. Sin embargo, estos procedimientos a menudo son
difíciles de integrar en un formato de ensayo automatizado. Esto
también es aplicable para una situación en la que los analitos
diana están presentes en los componentes celulares, por ejemplo
inmunosupresiva en eritrocitos. En este caso, los componentes
celulares se aíslan o se enriquecen mediante centrifugación y/o
filtración antes de la adición de un reactivo de lisis, o se
desnaturalizan mediante adición de un agente desnaturalizante a la
muestra original, por ejemplo una mezcla de ZnSO_{4} y
acetonitrilo.
acetonitrilo.
En Renner et al., J. Chromatography
(2001), Vol. 916, páginas 247-25, se describe un
método para analizar metabolitos de las rutas de la glucosa en
eritrocitos humanos. Los eritrocitos se aíslan mediante
centrifugación de muestras de sangre completa heparinizadas, y se
resuspenden en tampón de PBS. Para la preparación de lisados
eritrocíticos, los eritrocitos se transforman en peletes, se recogen
en agua destilada y se hierven durante 2 min.
En el documento US 2001/051374 se describe un
suero de control o de calibración que tiene una tendencia reducida
a la formación de turbidez al reconstituirlo tras la liofilización
previa.
El objeto de la presente invención fue
proporcionar un método mejorado para procesar fluidos biológicos,
que no tenga las desventajas asociadas con los procedimientos de la
técnica anterior.
De este modo, un primer aspecto de la presente
invención es un método para procesar un fluido biológico que
comprende componentes celulares, en el que el fluido biológico es
sangre completa, en el que el fluido se somete a tratamiento
térmico en condiciones
- (i)
- para proporcionar una desintegración sustancialmente cuantitativa de dichos componentes celulares, y
- (ii)
- para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido,
\vskip1.000000\baselineskip
en el que el tratamiento térmico se
lleva a cabo en una condición de temperatura y tiempo definida
mediante un límite superior a una temperatura dada (indicada como
valor t_{max}) y por un límite de tiempo inferior a una
temperatura dada (indicada como valor t_{min}), y en el que, si el
tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo
mayor que el valor t_{max}, se produce la gelificación, y en el
que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de
tiempo más corto que el valor t_{min}, se produce la
desintegración incompleta, y en el que el recuento celular en el
fluido biológico se reduce a 0,1% o
menos.
Un aspecto adicional de la presente invención es
una sangre completa con células desintegradas obtenible mediante
tratamiento térmico de sangre completa según el método como se
describe anteriormente tratada con anticoagulante, que comprende
eritrocitos, leucocitos y trombocitos sustancial y cuantitativamente
desintegrados, que está libre sustancialmente de productos de
sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y
gelificación, y que está
- (i)
- libre de cualesquiera componentes particulares al observarla al microscopio con un aumento de 100 x; y
- (ii)
- libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de hasta 3000 g.
\vskip1.000000\baselineskip
Aún un aspecto adicional de la presente
invención es un método para determinar un analito en una muestra de
sangre completa, en el que la sangre completa se procesa como se
describe anteriormente, y el analito se determina en la sangre
completa procesada.
Sorprendentemente, se ha encontrado que se puede
lograr una desintegración completa de componentes celulares,
preferiblemente células o agrupamientos de células de organismos
superiores, más preferiblemente células de animales tales como
células de mamífero, incluyendo células de seres humanos, y lo más
preferible células de la sangre tales como eritrocitos, leucocitos
y/o trombocitos, en muestras de sangre completa, mediante
tratamiento térmico en condiciones predeterminadas de tiempo y
temperatura. Por medio de este tratamiento térmico, los componentes
celulares contenidos en sangre completa se desintegran sin
precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y/o gelificación
sustancial de los componentes del fluido.
El tratamiento térmico se puede llevar a cabo a
una temperatura de 60-90ºC, preferiblemente de
60-75ºC, y más preferiblemente de
65-70ºC. El tratamiento térmico se lleva a cabo
durante un tiempo suficiente para lograr una desintegración deseada
a la temperatura de tratamiento escogida. Preferiblemente, el
tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo de 5 segundos
a 1 minuto, más preferiblemente de 10 segundos a 40 segundos. Se
prefiere especialmente una temperatura de 70ºC durante
30-40, por ejemplo 35 segundos.
En la Tabla 1 se muestran condiciones adecuadas
para el tratamiento térmico de una muestra de sangre completa con
un recuento eritrocítico dado, opcionalmente suplementada con
disolventes orgánicos y/o plasma del grupo sanguíneo AB. Estas
condiciones de temperatura/tiempo se definen mediante un límite de
tiempo superior (indicado como valor tmax) a una temperatura dada,
y mediante un límite de tiempo inferior (indicado como valor tmin)
a una temperatura dada. Si el tratamiento térmico se lleva a cabo
durante un período de tiempo más prolongado que el valor tmax, se
produce gelificación. Si el período del tratamiento térmico es más
corto que el valor tmin, solamente se produce la desintegración
incompleta. Si se añaden otros fluidos, por ejemplo disolventes
orgánicos y/o fluidos acuosos, por ejemplo plasma, a la muestra
antes del tratamiento térmico, los valores de tmax y tmin pueden
variar como se muestra en las Tablas 2-6.
La gelificación de la muestra se puede
determinar por un incremento de la viscosidad. La terminación de la
desintegración se puede determinar mediante el recuento de células,
por ejemplo en una cámara de recuento de Neubauer, mediante
inspección microscópica para componentes particulares y/o mediante
la falta de formación de sedimentos tras la centrifugación. En este
contexto, se debería de señalar que alrededor de 95% de los
componentes celulares de la sangre están representados por
eritrocitos. De este modo, el recuento celular en una muestra de
sangre se determina preferiblemente contando los eritrocitos.
Por medio de la presente invención, el recuento
celular en la muestra se reduce preferiblemente hasta 0,1% o menos,
y más preferiblemente hasta 0,01% o menos del valor original. Por
ejemplo, cuando se somete una muestra con 5 \cdot 10^{6}
eritrocitos por \mul a tratamiento térmico, el recuento celular se
reduce preferiblemente hasta 5 \cdot 10^{3} células o menos por
\mul (véase el Ejemplo 1), más preferiblemente hasta 500 células
o menos por \mul. Lo más preferible, la muestra está libre de
células detectables. La ausencia de componentes particulares
también se puede determinar mediante observación microscópica a la
luz, por ejemplo con un aumento de hasta 100 x, y/o mediante
centrifugación durante 10 minutos a una velocidad de hasta 3000 g,
preferiblemente hasta 7400 g.
El tratamiento térmico se puede llevar a cabo
cuando el fluido se mantiene estático, por ejemplo mientras que el
fluido está en una vasija de reacción. En una realización preferida,
sin embargo, particularmente para operaciones automatizadas, el
tratamiento térmico se puede llevar a cabo mientras que el fluido
está en circulación, por ejemplo mientras que el fluido se hace
pasar a través de un conducto. El tratamiento térmico en un sistema
que fluye se puede llevar a cabo mientras se hace pasar el fluido de
la muestra a través de un conducto calentado, por ejemplo un
conducto capilar, preferiblemente con un diámetro interno de
alrededor de 0,1-0,8 mm, por ejemplo de alrededor
de 0,5 mm, con un caudal predeterminado, en el que el conducto tiene
una longitud predeterminada a fin de lograr el tiempo de
permanencia deseado dentro del conducto calentado. El calentamiento
se puede llevar a cabo por cualquier medio adecuado, y puede
comprender, por ejemplo, calentamiento inductivo tal como
tratamiento con microondas, por ejemplo como se describe en el
documento US 6.605.454, calentamiento convectivo, calentamiento
resistivo y/o calentamiento mediante excitación con láser.
El fluido biológico es sangre completa, tal como
sangre venosa, arterial o capilar, particularmente sangre completa
tratada con anticoagulantes, por ejemplo sangre completa tratada con
EDTA, citrato, o heparina. Por ejemplo, se puede tomar una muestra
con un dispositivo de extracción de sangre que contiene un
anticoagulante, y se puede someter directamente a un procesamiento
posterior como se describe más abajo.
El volumen de la muestra puede variar
ampliamente, por ejemplo en el intervalo de 1 nl o más,
preferiblemente 10 nl o más, y hasta 1 ml. De este modo, el método
es adecuado para aplicaciones en miniatura, por ejemplo
dispositivos microfluídicos en formato de chip, análisis nano
LC-MS, etc.
El método de la presente invención no requiere
etapas de sedimentación ni/o de precipitación, tales como
centrifugación y/o la adición de lisis química y/o reactivos de
desintegración. De este modo, el tratamiento térmico se lleva a
cabo preferiblemente sin la eliminación y/o lisis previa de
componentes celulares. El método se puede llevar a cabo en
cualquier dispositivo adecuado, por ejemplo un dispositivo de un
solo uso, o un dispositivo reutilizable. Preferiblemente, el método
es un procedimiento automatizado que se puede llevar a cabo en un
dispositivo integrado, es decir, un dispositivo en el que la
muestra de fluido se transfiere sin pretratamiento, particularmente
sin eliminación ni/o lisis de componentes celulares. Dentro del
dispositivo, la muestra se somete preferiblemente de forma directa
al tratamiento sin eliminación ni/o una lisis previa de los
componentes celulares. Después del tratamiento, se pueden llevar a
cabo etapas subsiguientes, por ejemplo una determinación de un
analito. Lo más preferible, el tratamiento térmico se lleva a cabo
con una muestra sustancialmente pura, por ejemplo una muestra que
comprende componentes celulares sustancialmente intactos.
El método de la presente invención puede incluir
la adición de otro fluido al fluido biológico antes y/o después del
procesamiento. El fluido adicional puede ser un disolvente orgánico,
preferiblemente en una cantidad de hasta 20% (vol/vol), más
preferiblemente en una cantidad de hasta 10% (vol/vol), basada en el
volumen del fluido biológico. El disolvente orgánico se selecciona
preferiblemente de disolventes miscibles con agua, tales como
metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, y sus
combinaciones. La adición de disolventes orgánicos puede tener una
influencia sobre las condiciones de temperatura/tiempo para el
tratamiento térmico como se muestra en las Tablas
2 y 3.
2 y 3.
Preferiblemente, el fluido adicional no efectúa
sustancialmente la lisis de los componentes celulares. Más
preferiblemente, el fluido adicional es un fluido acuoso, por
ejemplo una disolución tampón acuosa o un fluido biológico
adicional, que tiene preferiblemente una fuerza iónica que
corresponde a 0,5-1,4% de NaCl, más preferiblemente
0,7-1,2% de NaCl, y lo más preferible alrededor de
0,9% de NaCl. Preferiblemente, el fluido acuoso es un fluido
biológico sin componentes celulares, tal como plasma. Más
preferiblemente, el plasma es plasma del grupo sanguíneo AB. El
fluido acuoso adicional puede comprender un disolvente orgánico, por
ejemplo en una cantidad de hasta 20% (vol/vol), preferiblemente
hasta 10% (vol/vol), basada en el volumen del segundo fluido
biológico, tal como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido
y/o sus combinaciones. El segundo fluido biológico se añade
preferiblemente en una relación en volumen de 5:1 a 1:10, basada en
el volumen del primer fluido biológico. Preferiblemente, el segundo
fluido se añade antes del tratamiento térmico. La adición del
segundo fluido puede influir en las condiciones adecuadas de
temperatura/tiempo para la etapa de tratamiento térmico como se
muestra en las Tablas 4-6. Sorprendentemente, se
encontró que la adición de plasma AB, opcionalmente con un
disolvente orgánico, incrementa realmente el intervalo adecuado de
tiempo de tratamiento a una temperatura dada.
El fluido adicional puede ser un fluido de
estandarización y/o calibrador que comprende una cantidad
predeterminada de al menos un compuesto de estandarización y/o
calibrador. La adición de compuestos de estandarización y/o
calibradores es particularmente adecuada si el fluido biológico
tratado con calor se analiza posteriormente por medio de métodos
cromatográficos, espectrométricos y/o espectroscópicos. Los
compuestos de estandarización y/o calibradores pueden ser análogos
de analitos que contienen isótopos estables tales como ^{2}H y/o
^{13}C, y de este modo se pueden detectar mediante espectrometría
de masas.
El método también puede incluir la adición de un
compuesto marcador/de tinción para lípidos, proteínas, péptidos,
ácidos nucleicos e hidratos de carbono al fluido biológico, antes
y/o después del procesamiento.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de una composición que comprende plasma AB, un
disolvente orgánico en una cantidad de hasta 20% (vol/vol),
preferiblemente hasta 10% (vol/vol) basada en el volumen del
plasma, tal como metanol, etanol, acetonitrilo y/o dimetilsulfóxido,
y una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de
estandarización y/o calibrador, en combinación con el procedimiento
de tratamiento térmico como se describe anteriormente.
Aún un aspecto adicional de la presente
invención se refiere a sangre completa con células desintegradas
como se describe anteriormente. Este fluido representa una nueva
matriz que es particularmente adecuada para el ensayo clínico. El
fluido procesado es estable al menos 1 semana, preferiblemente al
menos 2 semanas a 4ºC, y/o al menos 1 día, preferiblemente al menos
5 días, a 25ºC. De este modo, la manipulación del fluido procesado
es mucho menos complicada en comparación con una muestra de sangre
completa no tratada. El término "estable" significa
particularmente que no se produce sedimentación.
La sangre completa con células desintegradas
comprende células de la sangre sustancial y cuantitativamente
desintegradas como se describe anteriormente. El fluido procesado
está sustancialmente libre de productos de precipitación,
desnaturalización, aglutinamiento y/o gelificación. La invención se
refiere a una sangre completa procesada que
- (i)
- está libre de cualesquiera componentes particulares al observarla al microscopio con un aumento de 100 x; y
- (ii)
- está libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de hasta 3000 g, preferiblemente hasta 7400 g.
\vskip1.000000\baselineskip
El fluido procesado tiene preferiblemente una
fuerza iónica que corresponde a 0,5-1,4% de NaCl,
más preferiblemente 0,7-1,2% de NaCl, y lo más
preferible una concentración salina sustancialmente fisiológica. El
fluido procesado puede estar libre de reactivos de desintegración
y/o de lisis y/o de detergentes añadidos. Por otro lado, el fluido
procesado también puede comprender disolventes orgánicos y/o fluido
acuoso añadido, tal como plasma del grupo sanguíneo AB como se
describe anteriormente. El fluido procesado es sangre completa
procesada.
La presente invención también se refiere a un
método para determinar un analito en una muestra de sangre completa
que se ha sometido a un tratamiento térmico como se describe
anteriormente. El analito puede ser cualquier analito que se pueda
detectar en sangre completa, por ejemplo un compuesto biológico tal
como un ácido nucleico, un polipéptido, péptido, lípido, azúcar,
hormona, metabolito, etc. Por otro lado, el analito puede ser un
compuesto no biológico, por ejemplo un compuesto farmacéutico. En
una realización preferida, el analito es un fármaco inmunosupresor,
tal como ciclosporina, rapamicina o tacrolimus, o compuestos
relacionados.
La determinación del analito en la sangre
completa procesada se puede llevar a cabo según cualquier método
conocido. Por ejemplo, la determinación del analito se puede llevar
a cabo según métodos químicos, bioquímicos y/o fisicoquímicos, y
puede comprender una reacción de hibridación, una reacción
inmunológica, una reacción enzimática, por ejemplo una
amplificación de ácidos nucleicos, un análisis cromatográfico, un
análisis espectrométrico, tal como un análisis espectrométrico de
masas o un análisis de RMN, y/o un análisis espectroscópico. En una
realización especialmente preferida, la invención se refiere a un
método para determinar un agente inmunosupresor en una muestra de
sangre completa, en el que la sangre completa se procesa mediante un
tratamiento térmico como se describe anteriormente, y el agente
inmunosupresor se determina en la sangre completa procesada según
métodos estándar, por ejemplo mediante métodos espectrométricos de
masas.
En una realización adicional preferida, el
analito es un parámetro clínico-químico, por ejemplo
un parámetro clínico-químico asociado con un
trastorno metabólico innato, por ejemplo fenilcetonuria. En esta
realización, la muestra es preferiblemente una muestra de sangre
capilar que se puede obtener de neonatos.
En aún una realización adicional preferida, el
método es adecuado para procesar muestras de sangre procedentes de
animales no humanos, preferiblemente ratones, cobayas y ratas. Por
ejemplo, las muestras se pueden tomar mediante sistemas
automatizados y se pueden procesar directamente como se describe
anteriormente. Un sistema automatizado preferido es el Accu
Sampler® de DiLab®.
Adicionalmente, la presente invención se explica
con más detalle mediante los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llenó un capilar de vidrio (55 mm de longitud
x 0,5 mm de diámetro interno) con alrededor de 10 \mul de una
muestra de sangre (eritrocitos: 5,18 x 10^{6}/\mul; hemoglobina:
17,5 g/dl; hematocrito 50,1%), se cerró en un extremo con
plastilina y se calentó en un baño de agua termostatizado a una
temperatura dada durante un tiempo dado. Al final del proceso de
calentamiento, el capilar de vidrio se sumergió inmediatamente en
un baño de hielo (4ºC). El cierre de plastilina se cortó, el capilar
de vidrio se vació, y la muestra de sangre tratada se investigó
adicionalmente en busca de gelificación y para determinar la
plenitud de la desintegración de las células de la sangre. El
parámetro t_{max} se define como el tiempo de calentamiento
[segundos] en el cual se produce la gelificación de la muestra
menos 1 segundo. El parámetro t_{min} se define como el tiempo de
calentamiento mínimo en el cual no se detectan eritrocitos usando
una cámara de recuento de Neubauer.
\vskip1.000000\baselineskip
A 10 \mul de sangre completa o sangre tratada,
se añadieron 990 \mul de disolución de Hayemsch (Merck KGaA,
Darmstadt, Alemania). La mezcla se sometió a vórtex, y una alícuota
se introdujo en una cámara de recuento de Neubauer. Los eritrocitos
presentes en 5 cuadrados definidos se contaron usando un microscopio
y un aumento de 100.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados se muestran en las siguientes
Tablas 1-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Tratamiento térmico de sangre completa
(eritrocitos: 5,18 x 10^{6}/\mul; hemoglobina: 17,5 g/dl;
hematocrito 50,1%)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el tratamiento de una muestra de sangre
(por ejemplo, 10 \mul) usando un capilar de acero inoxidable
calentado, con la dimensión de 0,5 mm de diámetro interno y 300 mm
de longitud, el tiempo de calentamiento a una temperatura dada se
puede preajustar vía el caudal de un fluido de ensayo dado, tal como
una disolución de NaCl al 0,9% en volumen.
Para una temperatura de 75ºC, el tiempo de
retención capilar mínimo t_{min} de 9 segundos (véase el Ejemplo
1, Tabla 1) se alcanzó con un caudal de 466 \mul/min., y el tiempo
de retención capilar máximo t_{max} de 23 segundos (véase el
Ejemplo 1, Tabla 1) se alcanzó con un caudal de 183 \mul/min. De
este modo, un caudal preferido para tal tamaño de muestra y
configuración de capilar estaría dentro de estos márgenes, por
ejemplo ascendiendo hasta aproximadamente 325 \mul/min. Este
caudal también es óptimo para la ionización mediante
electropulverización en espectrometría de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo:
Claims (25)
1. Un método para procesar un fluido biológico
que comprende componentes celulares, en el que el fluido biológico
es sangre completa, en el que el fluido se somete a un tratamiento
térmico en condiciones
- (i)
- para proporcionar una desintegración sustancialmente cuantitativa de dichos componentes celulares, y
- (ii)
- para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido,
en el que el tratamiento térmico se
lleva a cabo en una condición de temperatura y tiempo definida
mediante un límite superior a una temperatura dada (indicada como
valor t_{max}) y mediante un límite de tiempo inferior a una
temperatura dada (indicada como valor t_{min}), y en el que, si el
tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo
más prolongado que el valor t_{max}, se produce la gelificación, y
en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un
período de tiempo más corto que el valor t_{min}, se produce la
desintegración incompleta, y en el que el recuento celular en el
fluido biológico se reduce hasta 0,1% o
menos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el tratamiento térmico se lleva a cabo a una temperatura de
60-90ºC, preferiblemente de
60-75ºC.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo de 5
segundos a 1 minuto.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el tratamiento
térmico se lleva a cabo mientras que el fluido está estático.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el tratamiento
térmico se lleva a cabo mientras que el fluido está en
circulación.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que el tratamiento
térmico comprende calentamiento inductivo, calentamiento
convectivo, calentamiento resistivo y/o calentamiento mediante
excitación con láser.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el fluido biológico
es sangre completa tratada con anticoagulantes.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, que no incluye
- (i)
- una etapa de sedimentación ni/o precipitación, ni/o
- (ii)
- una adición de reactivos de desintegración.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, que se lleva a cabo como un
procedimiento automatizado, preferiblemente en un dispositivo
integrado.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que se añade, antes y/o
después del procesamiento, un fluido adicional.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
el fluido adicional es un disolvente orgánico en una cantidad de
hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del fluido biológico, tal
como metanol, etanol, acetonitrilo y/o dimetilsulfóxido.
12. El método de la reivindicación 10 u 11, en
el que el fluido adicional es un fluido acuoso sin componentes
celulares, que comprende opcionalmente un disolvente orgánico en una
cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del fluido
acuoso.
13. El método de la reivindicación 12, en el que
el fluido adicional es plasma, particularmente plasma del grupo
sanguíneo AB.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en el que el fluido
adicional es un fluido de estandarización y/o calibrador, que
comprende una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de
estandarización y/o calibrador.
15. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 10-14, en el que el fluido
adicional es una composición que comprende un plasma del grupo
sanguíneo AB, un disolvente orgánico miscible con agua en una
cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del plasma,
tal como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, y/o sus
combinaciones, y una cantidad predeterminada de al menos un
compuesto de estandarización y/o calibrador.
16. Sangre completa con células desintegradas
obtenible mediante tratamiento térmico de sangre completa tratada
con anticoagulantes según el método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, que comprende eritrocitos,
leucocitos y trombocitos sustancial y cuantitativamente
desintegrados, que está sustancialmente libre de productos de
sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y
gelificación, y que está
- (i)
- libre de cualesquiera componentes particulares al observarla al microscopio con un aumento de 100 x; y
- (ii)
- libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de hasta 3000 g.
17. La sangre completa con células desintegradas
de la reivindicación 16, que tiene una concentración salina
sustancialmente fisiológica.
18. Un método para determinar un analito en una
muestra de sangre completa, en el que la sangre completa se procesa
según el método de una cualquiera de las reivindicaciones
1-15, y el analito se determina en la sangre
completa procesada.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
el analito se selecciona de compuestos biológicos tales como ácidos
nucleicos, polipéptidos, péptidos, lípidos, azúcares, hormonas,
metabolitos, etc., y compuestos farmacéuticos.
20. El método de la reivindicación 18 ó 19, en
el que el analito es un fármaco inmunosupresor, tal como
ciclosporina, rapamicina o tacrolimus.
21. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 18-20, en el que la determinación
comprende una reacción de hibridación, una reacción inmunológica,
una reacción enzimática, un análisis cromatográfico, un análisis
espectrométrico y/o un análisis espectroscópico.
22. Un método para determinar un agente
inmunosupresor en una muestra de sangre completa, en el que la
sangre completa se procesa según el método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, y el agente inmunosupresor
se determina en la sangre completa procesada.
23. Un método para determinar un parámetro
clínico-químico en una muestra de sangre completa
procedente de neonatos, en el que la sangre completa se procesa
según el método de una cualquiera de las reivindicaciones
1-15, y el parámetro clínico-químico
se determina en la sangre completa procesada.
24. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 18-23, en el que la muestra se
procesa y se determina en un dispositivo integrado.
25. Uso de una composición que comprende un
plasma de grupo sanguíneo AB, un disolvente orgánico miscible con
agua en una cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del
plasma, tal como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido
y/o sus combinaciones, y una cantidad predeterminada de al menos un
compuesto de estandarización y/o calibrador, en un método según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-15 ó
18-24.
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