ES2325802B1 - Procedimiento de inmovilizacion de una glutamato deshidrogenasa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de inmovilización de una glutamato
deshidrogenasa.
Esta solicitud describe la preparación de un
derivado de una glutamato deshidrogenasa (GDH) de Thermus
spp inmovilizado-estabilizado por unión
covalente multipuntual. La enzima soluble ya es muy estable desde pH
6 a pH 10, incluso a 60ºC, reconoce NAD, NADH, NADP, y NADPH. Su
inmovilización en soportes glioxil permite la estabilización tanto
de su estructura multimérica como de la rigidez de cada monómero,
aumentando aún más su termoresistencia, y ampliando el rango de
utilización a pH inferiores a 5 (donde la enzima soluble se
inactiva por disociación). El derivado inmovilizado es resistente a
disolventes, alta temperatura, pHs drásticos, etc. Este derivado
inmovilizado de la GDH, por lo tanto tendría excelentes
posibilidades de utilización como enzima regeneradora de cofactores
en procesos de reducción-oxidación enzimáticos o
como biosensor.
Description
Procedimiento de inmovilización de una glutamato
deshidrogenasa.
La presente invención se encuadra en el sector
de la química fina y farmacéutica, más concretamente dentro del
campo de la biocatálisis para la regeneración de cofactores
(pudiendo usarse para la regeneración de NADH, NADPH, NAD^{+} O
NADP^{+}). También se refiere al campo de los biosensores, y
específicamente a biosensores en procesos fermentativos, control de
aguas, etc. Así, la presente invención se refiere a la preparación
de una GDH de Thermus spp
inmovilizada-estabilizada, así como su uso en
biotecnología, biocatálisis, fermentación, biomedicina,
medio-ambiente, alimentación, control de aguas,
etc.
La enzima glutamato deshidrogenasa (GDH) y el
sistema enzimático dual, glutamina sintetasa (GS) y glutamato
sintasa (GOGAT), son las rutas más importantes mediante las cuales
se asimila el amonio (Reitzer y Magasanik (1987), American Society
for Microbiology: 302-320). GDH es una enzima
extremadamente importante que une el metabolismo de los
carbohidratos con el del nitrógeno (Smith et al. (1975), The
enzymes 11: 293-367), y la función fisiológica de
las GDHs como enzimas anabólicas y/o catabólicas se define
generalmente por su especificidad por el cofactor. La comparación de
las GDHs de bacterias con las de arqueas muestra que las GDHs
microbianas pueden dividirse en tres tipos dependiendo del coenzima
usado: NADP dependientes (EC 1.4.1.4) (Aalen et al. (1997),
Arch. Microbiol. 168: 536-539; Ha et al.
(2003), J. Mol. Catal. B: Enzymatic 26: 231-240;
Kobayashi et al. (1995), J. Biochem. 118:
587-592; Yip et al. (1998), Eur. J. Biochem.
255: 336-346), NAD dependientes (EC 1.4.1.2) (Kujo
y Ohshima (1998), Appl. Environ. Microbiol. 64:
2152-2157), y GDHs con doble especificidad para el
coenzima (EC 1.4.1.3), siendo estas últimas las más frecuentes
entre eucariotas.
La enzima GDH tiene dos aplicaciones
biotecnológicas principales: como catalizador en
biotransformaciones de reducción-oxidación
(red-ox) regenerando el cofactor reducido (usando
ácido glutámico) u oxidado (utilizando alfa-ceto
glutárico y amoniaco) y como biosensor (Chenault et al.
(1988), Biotechnology and genetic engineering reviews 6:
221-245; Ha et al. (2003), J. Mol. Catal. B:
Enzymatic 26: 231-240; Van der Donk y Zhao (2003),
Current Opinion in Biotechomology 14: 421:426; Zhao y Van der Donk
(2003), Current Opinion in Biotechomology 14:
583-589).
En la primera aplicación, en biocatálisis, esta
enzima se acoplaría a otras enzimas red-ox que
catalizarían una reacción de interés utilizando cofactores
nicotínicos oxidados o reducidos (NAD, NADH, NAP, NADPH),
encargándose de su regeneración a partir de un sustrato como el
ácido glutámico (para regenerar cofactores reducidos) o el ácido
alfa-ceto glutárico y amoniaco (para regenerar
cofactores oxidados). La regeneración de cofactor es conveniente ya
que de otra forma la reacción transcurriría de forma
estequiométrica (y los cofactores son relativamente caros) y sería
complicado dirigir la reacción hacia transformaciones cuantitativas
del producto deseado (Chenault et al. (1988), Biotechnology
and genetic engineering reviews 6: 221-245; Van der
Donk y Zhao (2003), Current Opinion in Biotechomology 14: 421:426;
Zhao y Van der Donk (2003), Current Opinion in Biotechomology 14:
583-589)].
La segunda aplicación de la enzima podría ser
como biosensor. La aplicación principal sería en la detección y
control de la concentración de ácido glutámico, pero también se ha
descrito que esta enzima puede ser utilizada para detectar metales
pesados, amoniaco, urea, etc, usualmente acoplándola a otras
enzimas (Bertocchi et al. (1996), Biosens. Bioelectron. 11:
1-10); Rodríguez et al. (2004), Anal.
Bioanal. Chem. 380: 284-292; Rodríguez et
al. (2004), Biosens. Bioelectrn. 19:
1157-1167).
En la mayoría de los casos, las GDHs son
bastante específicas para el cofactor (NAD o NADP), por lo que
resulta necesario utilizar una enzima para cada caso Aalen et
al. (1997), Arch. Microbiol. 168: 536-539; Ha
et al. (2003), J. Mol. Catal. B: Enzymatic 26:
231-240; Kobayashi et al. (1995), J.
Biochem. 118: 587-592; Yip et al. (1998),
Eur. J. Biochem. 255: 336-346). Además, algunas GDH
funcionan de forma óptima solo en un sentido (normalmente oxidando
el ácido glutámico). Por ello, sería interesante disponer de
enzimas que fueran capaces de reconocer ambos cofactores.
El uso de enzimas de microorganismos termófilos
puede tener ciertas ventajas en ambas aplicaciones, como por
ejemplo una mayor estabilidad térmica, en ocasiones correlacionada
con una mayor estabilidad frente a disolventes y otros agentes
inactivantes (Cowan (1997), Comp. Biochem. Phys. A 118:
429-438; Daniel y Cowan (2000), Cell Mol. Life Sci.
57: 250-264; Jaenicke et al. (1996), Adv.
Prot. Chem. 48: 181-269; Owusu y Cowan (1989),
Enzyme Microb. Technol. 11: 568-574). De hecho, se
han descrito varias GDHs de origen termófilo que muestran una gran
termoestabilidad (Aalen et al. (1997), Arch. Microbiol.
168: 536-539; Britton et al. (1999), J. Mol.
Biol. 293: 1121-1132; Díaz et al. (2006),
Extremophiles 10: 105-115; Ha et al. (2003),
J. Mol. Catal. B: Enzymatic 26: 231-240;Hudson
et al. (1993), Biochim. Biophys. Acta 1202:
244-250; Kort et al. (1997), Extremophiles
1: 52-60; Kujo y Ohshima (1998), Appli. Environ.
Microbiol. 64: 2152-2157; Robb et al. (2001),
Methods Enzymol. 331: 26-41; Ruiz et al.
(2003), J. Prot. Chem. 22: 295-301).
Por otro lado, el uso de enzimas inmovilizados
sobre soportes sólidos porosos tiene ventajas, aunque para ambas
aplicaciones propuestas en esta patente para las GDHs las enzimas
se encuentran habitualmente "inmovilizadas" por atrapamiento.
En el caso del uso como biocatalizadores, las enzimas
red-ox suelen utilizarse atrapadas en reactores de
ultrafiltración (utilizando cofactores poliméricos) [Hummel (1999),
Trends Biotechnol. 17: 487-492; Leonida (2001),
Curr. Med. Chem. 8: 345-369; Nakamura et al.
(1988), Electro-Enzymology Coenzyme Regeneration:
87-161). Sin embargo, se ha demostrado que la
inmovilización de enzimas en sólidos porosos tiene muchas ventajas
(Bolivar et al. (2006), Biomacromolecules 6:
1027-1030; Bolivar et al. (2006), J.
Biotechnol. 125: 85-94): se evita cualquier proceso
intermolecular (interacción con burbujas de gas, agregación, etc),
permite el uso de concentraciones muy altas de enzimas eliminando
el riesgo de precipitación, es posible evitar la adsorción de las
proteínas a la membrana del reactor, etc. Las enzimas
red-ox también se "atrapan" en sistemas
bifásicos acuosos (donde está la enzima y el cofactor) mientras que
sustratos y productos estarían repartidos en ambas fases (Eckstein
et al. (2004), Biocat. Biotrans. 22: 89-96).
El uso de enzimas pre-inmovilizadas evitará
interacciones deletéreas entre la enzima y la superficie
hidrofóbica de las gotas de disolvente (Bolivar et al.
(2006), Biomacromolecules 6: 1027-1030; Bolivar
et al. (2006), J. Biotechnol. 125:
85-94).
De una forma similar, las enzimas normalmente se
usan de forma inmovilizada cuando se emplean como biosensores,
pero por atrapamiento en polímeros con los que se "pinta" la
superficie del sensor (Basu et al. (2006), Bioelectron. 21:
1968-1972; Bertocchi et al. (1996), Biosens.
Bioelectron. 11: 1-10); Doong and Shih (2006),
Biosens. Bioelectron. 22: 185-191; Rodríguez et
al. (2004), Anal. Bioanal. Chem. 380: 284-292;
Rodríguez et al. (2004), Biosens. Bioelectrn. 19:
1157-1167). También para este tipo de aplicaciones
la pre-inmovilización de las enzimas en soportes
porosos tiene un cierto interés. En primer lugar, el tamaño de la
partícula del sólido será muy grande, permitiendo atrapar la enzima
en cualquier tipo de entramado polimérico, por ejemplo
sol-geles de gran tamaño de poro (y por lo tanto
donde la difusión de sustratos será más sencilla). Además, al tener
la enzima dentro de un poro podemos evitar la interacción de la
misma con el polímero, que quizás no sea muy compatible con la
actividad y estabilidad de las enzimas (Betancor (2005),
Biomacromolecules 6: 1027-1030).
Evidentemente las ventajas de usar una enzima
pre-inmovilizada para ambas aplicaciones aumentan
mucho si el proceso de inmovilización supone una cierta
estabilización de las mismas, por ejemplo por enlace covalente
multipuntual o multi-subunidad
(Fernández-Lafuente et al. (2001),
Biomacromolecules 2: 95-104; Gupta (1991),
Biotechnol. Appli. Biochem. 14: 1-11; Klibanov
(1979), Anal. Biochem. 93: 1-25; Klibanov (1983),
Biochem. Soc. Trans. 11: 19-20).
En muchos casos, las enzimas multiméricas (como
es el caso de la gran mayoría de las GDH descritas) comienzan su
inactivación por la disociación de las subunidades, lo que hace que
en condiciones de uso continuo o en forma diluida, el catalizador
se "inactive" al liberar enzimas al medio (incluso siendo una
enzima de un microorganismo termófilo). Esto supone además que la
enzima podría contaminar el medio de reacción (no deseable si es un
alimento). Por otro lado, el aumento de la rigidez de cada monómero
por unión covalente multipuntual podría aumentar de forma muy
significativa la estabilidad de las enzimas, incluso en el caso de
que ésta sea muy elevada inicialmente, y esta estabilización
debería de reflejarse contra cualquier agente que provocara la
distorsión de la estructura de la enzima (Nakkharat y Haltrich
(2006), Appl. Biochem. Biotechnol. 129: 215-225;
Nawani et al. (2006), Electron. J. Biotechnol. 9:
559-565; Pessela et al. (2003),
Biomacromolecules 4: 107-113; Tardioli et al.
(2006), Enzyme Microb. Technol. 39: 270-1278).
Sin embargo, la estabilización de enzimas para
esta estrategia requiere el uso de sistema y condiciones adecuados
(Gupta (1991), Biotechnol. Appl. Biochem. 14: 1-11;
Klibanov (1979), Anal. Biochem. 93: 1-25; Klibanov
(1983), Biochem. Soc. Trans. 11: 19-20), y en cada
caso el sistema idóneo puede ser diferente. Los soportes glioxil
agarosa podrían estar entre los más efectivos para este fin:
inmovilizan las enzimas por la región de su superficie más rica en
Lisinas, son grupos estables, que no ofrecen impedimentos
estéricos, etc. (Mateo et al. (2006), Enzyme Microb.
Technol. 39: 274-280; Mateo et al. (2005),
Enzyme Microb. Technol. 37: 456-462).
Anteriormente, ha sido descrita una GDH
hexamérica específica para NAD procedente de cultivos de
Thermus thermophilus HB8 (Ruiz et al. (1998),
FEMS Microbiol. Lett. 159: 15-20; Ruiz et
al. (2003), J. Prot. Chem. 22: 295-301). Sin
embargo, en el genoma público de la cepa HB27 aparece un segundo
gen (código TTC1211) codificante de otra posible actividad GDH. La
inmovilización y estabilización de la enzima codificada por este
segundo gen, así como su uso en biocatálisis y como biosensor, es
el objeto de la presente patente.
El gen codificante de una glutamato
deshidrogenasa (GDH) fue clonado y expresado en E. coli. Se
ha demostrado que de esta forma se produce una GDH que reconoce
NAD y NADP, y que puede catalizar tanto la oxidación de ácido
glutámico como la reducción de ácido
alfa-ceto-glutárico para regenerar
los cofactores reducidos u oxidados respectivamente. La enzima es
muy termoestable, pero a pH moderadamente ácido, de especial
interés en el reciclaje de cofactores reducidos, sufre un proceso de
inactivación por disociación de subunidades que la convierte en una
enzima inestable incluso a temperatura ambiente. Esta enzima ha
sido inmovilizada en diferentes soportes, entre los que se
encuentra el soporte glioxil, que ha permitido mantener un elevado
porcentaje de actividad catalítica y ha mejorado de forma
significativa su estabilidad en todas las condiciones (diferentes
pH, presencia de disolventes, etc). De especial relevancia es el
hecho de que su inmovilización en estos soportes permite
estabilizar su estructura cuaternaria, aumentando de forma muy
significativa su estabilidad a pH ácido.
La presente invención se enfrenta al problema de
proporcionar un enzima altamente estable, incluso a pH ácido y
altas temperaturas, y que presente actividad tanto con
NAD(H) como con NADP(H), para su uso como catalizador
en reacciones red-ox y como biosensor en la
detección de ácido glutámico, metales pesados u otros
compuestos.
En la presente invención, los inventores han
identificado en el genoma público de la cepa Thermus
thermophilus HB27 el gen codificante de una glutamato
deshidrogenada (código TTC1211)
(http://wishart.biology.ualberta.ca/
BacMap) utilizando el programa Blastp como herramienta bioinformática en línea. El gen se amplifica mediante la técnica de PCR con dos oligonucleótidos, uno capaz de hibridar sobre el extremo 5' del gen, como por ejemplo el cebador gdh2sense (51-cgcatatgaagagcgaa-3') y que incluye una diana de corte para la enzima de restricción Nde1 (subrayada), y otro que hibride sobre su extremo 3', como por ejemplo el denominado gdh2antisense (5'-ttaagggta
taggcccc-3'), con o sin diana de restricción. El producto de la amplificación es clonado en un vector para su replicación y amplificación en E. coli, como por ejemplo el vector pCR2.1TOPO (Invitrogen), desde el que es extraído mediante digestión con dos enzimas de restricción, tales como NdeI y HindIII que permiten la inserción dirigida del gen en un plásmido de sobre-expresión que contenga dichas dianas de restricción, como por ejemplo el vector pET28b (Novagen) o el pMKE2, que permiten la inclusión de una secuencia de polihistidinas en el extremo amino terminal. De esta forma se obtiene un plásmido de expresión, como por ejemplo el denominado pET28gdh2, desde el que el gen de la glutamato deshidrogenasa es transcrito de forma masiva a partir de un promotor inducible mediante la adición de una sustancia química, como por ejemplo el isopropil beta galactopiranósido, azúcares o incluso nitrato. Para la producción de la GDH, el plásmido de expresión es transferido a una cepa bacteriana adecuada, como por ejemplo Escherichia coli BL21DE3, Streptomyces spp, Bacillus subtilis o Thermus thermophilus, o a una levadura como
Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. El microorganismo así obtenido es posteriormente sometido a crecimiento en las condiciones medioambientales propicias, en un medio de cultivo adecuado al que se le puede añadir o no un compuesto inductor de la transcripción como los anteriormente mencionados, prolongando las condiciones adecuadas de cultivo para la transcripción del gen clonado en el vector de expresión. Tras el periodo de expresión apropiado, variable según sea el organismo productor elegido, se procede a la recogida de las células, o en su caso del material secretado al medio de cultivo, para proceder a su tratamiento mediante rotura celular en el primer caso o ultrafiltración en el segundo. En el caso de las células rotas, éstas son sometidas a centrifugación para eliminar el material insoluble. La fracción soluble obtenida puede ser sometida a tratamiento térmico entre 60 y 75ºC durante 15 a 60 minutos para desnaturalizar y eliminar posteriormente por centrifugación las proteínas del organismo productor en el caso de que éste no sea termófilo. En todo caso, la fracción soluble de cualquiera de estos procesos es sometida a cromatografía de afinidad en columnas con metales quelados tales como cobalto, níquel o hierro, a los que se unen con alta afinidad las colas de histidina incorporadas a la secuencia del gen de la GDH durante la construcción del vector de expresión. Tras lavados a distintas fuerzas iónicas, la proteína es recuperada en un grado de gran pureza mediante tratamiento con imidazol u otros potenciales agentes quelantes. Finalmente, la solución obtenida de la proteína es dializada para eliminar estos agentes frente a un tampón adecuado para su almacenamiento a baja temperatura.
BacMap) utilizando el programa Blastp como herramienta bioinformática en línea. El gen se amplifica mediante la técnica de PCR con dos oligonucleótidos, uno capaz de hibridar sobre el extremo 5' del gen, como por ejemplo el cebador gdh2sense (51-cgcatatgaagagcgaa-3') y que incluye una diana de corte para la enzima de restricción Nde1 (subrayada), y otro que hibride sobre su extremo 3', como por ejemplo el denominado gdh2antisense (5'-ttaagggta
taggcccc-3'), con o sin diana de restricción. El producto de la amplificación es clonado en un vector para su replicación y amplificación en E. coli, como por ejemplo el vector pCR2.1TOPO (Invitrogen), desde el que es extraído mediante digestión con dos enzimas de restricción, tales como NdeI y HindIII que permiten la inserción dirigida del gen en un plásmido de sobre-expresión que contenga dichas dianas de restricción, como por ejemplo el vector pET28b (Novagen) o el pMKE2, que permiten la inclusión de una secuencia de polihistidinas en el extremo amino terminal. De esta forma se obtiene un plásmido de expresión, como por ejemplo el denominado pET28gdh2, desde el que el gen de la glutamato deshidrogenasa es transcrito de forma masiva a partir de un promotor inducible mediante la adición de una sustancia química, como por ejemplo el isopropil beta galactopiranósido, azúcares o incluso nitrato. Para la producción de la GDH, el plásmido de expresión es transferido a una cepa bacteriana adecuada, como por ejemplo Escherichia coli BL21DE3, Streptomyces spp, Bacillus subtilis o Thermus thermophilus, o a una levadura como
Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. El microorganismo así obtenido es posteriormente sometido a crecimiento en las condiciones medioambientales propicias, en un medio de cultivo adecuado al que se le puede añadir o no un compuesto inductor de la transcripción como los anteriormente mencionados, prolongando las condiciones adecuadas de cultivo para la transcripción del gen clonado en el vector de expresión. Tras el periodo de expresión apropiado, variable según sea el organismo productor elegido, se procede a la recogida de las células, o en su caso del material secretado al medio de cultivo, para proceder a su tratamiento mediante rotura celular en el primer caso o ultrafiltración en el segundo. En el caso de las células rotas, éstas son sometidas a centrifugación para eliminar el material insoluble. La fracción soluble obtenida puede ser sometida a tratamiento térmico entre 60 y 75ºC durante 15 a 60 minutos para desnaturalizar y eliminar posteriormente por centrifugación las proteínas del organismo productor en el caso de que éste no sea termófilo. En todo caso, la fracción soluble de cualquiera de estos procesos es sometida a cromatografía de afinidad en columnas con metales quelados tales como cobalto, níquel o hierro, a los que se unen con alta afinidad las colas de histidina incorporadas a la secuencia del gen de la GDH durante la construcción del vector de expresión. Tras lavados a distintas fuerzas iónicas, la proteína es recuperada en un grado de gran pureza mediante tratamiento con imidazol u otros potenciales agentes quelantes. Finalmente, la solución obtenida de la proteína es dializada para eliminar estos agentes frente a un tampón adecuado para su almacenamiento a baja temperatura.
La enzima así obtenida presentaba actividad
tanto con NAD(H) como NADP(H), catalizando la
reacción tanto en la dirección de oxidación como en la de
reducción, lo que aumentaba en gran medida el interés de esta
enzima y la hacia adecuada para todas la posibles aplicaciones de
la misma. La enzima es muy estable a pH superior a 6 (manteniendo
la actividad casi inalterada incluso a 50ºC durante 24 h), pero
muestra una estabilidad muy reducida a pH 4 o 5 (donde se inactiva
en pocos minutos incluso a 25ºC). Los investigadores han mostrado
que esta baja estabilidad de la enzima a pH ácido se debía a que en
estas condiciones la inactivación de la enzima comenzaba por la
disociación de las subunidades y esta se producía de forma muy
rápida.
Para mejorar su estabilidad se ha inmovilizado
sobre una batería de soportes activados con diferentes grupos
(amino, glutaraldehido, epóxido, glioxil, etc). En cada caso se
eligieron las condiciones óptimas descritas en la literatura para
la inmovilización y rigidificación posterior por unión covalente
multipuntual, siendo el que mejor resultado dio la inmovilización
sobre soportes glioxil (p.e., glioxil agarosa,
glioxil-silica, glioxil- vidrio poroso).
La inmovilización en este tipo de soportes
glioxil debía de realizarse a pH alcalino ya que la inmovilización
en este soporte debe de producirse directamente a través de varios
enlaces imina débiles simultáneamente establecidos entre los grupos
amino de la enzima y los grupos aldehido del soporte. Solo a
valores de pH cercanos o superiores a 10, las Lisinas (con un pK
de 10.7) serán reactivas con los grupos aldehidos permitiendo esta
primera inmovilización bipuntual. En estas condiciones la
inmovilización es muy rápida, pero dado que deseamos conseguir una
unión covalente multipuntual intensa, dejamos que la enzima ya
inmovilizada continúe reaccionando con el soporte.
El pH alcalino sigue siendo necesario para
conseguir una unión covalente multipuntual intensa, que era el
objetivo si se pretende aumentar la rigidez de la estructura de la
enzima e implicar las 3 subunidades de la misma en la
inmovilización. Por otro lado, el soporte y la enzima no son
estructuras complementarias, por lo que el proceso de
multi-interacción enzima-soporte
requiere condiciones donde la movilidad de las cadenas de la enzima
se vea favorecida, es decir, temperaturas moderadamente elevadas
(e.g, 35-50ºC) y períodos largos de reacción (p.e.,
3 horas). También es importante el tampón que se utiliza, no
debiendo de contener grupos amino (descartándose el Tris, la
etanolamina, etc) ni derivados del ácido bórico, que es capaz de
formar complejos con los grupos aldehído reduciendo la reactividad
de los grupos. El bicarbonato seria un tampón adecuado para esta
reacción (p.e., 100 mM). Dada la importancia del valor de pH, este
debe de ser estrictamente controlado para evitar sobre todo que
descienda de 10. En el caso de esta enzima extremadamente estable a
pH alcalino, es posible trabajar a pH superior a 10. Una variable
clave era la densidad superficial de grupos glioxil en el soporte,
que controla el numero de grupos reactivos debajo de cada molécula
de proteína y por lo tanto las posibilidades de reacción
enzima-soporte (p.e., soportes agarosa 4BCL con 55
micromoles de glioxiles/g húmedo tienen unos 17 aldehído por 1000
A^{2}).
Tras el periodo de reacción entre la enzima y el
soporte, los soportes glioxil tienen una ventaja adicional, pueden
reducirse con borohidruro sódico transformando los enlaces imina
entre la enzima y el soporte en amino secundario y los aldehídos en
hidroxilos, generando enlaces irreversibles y una superficie
extremadamente inerte en el soporte. Para ellos se añadía 1 mg de
borohidruro sódico en polvo por ml de suspensión (manteniendo el pH
en torno a 10 para evitar que el borohidruro se destruya).
El tamaño de poro del soporte es importante, ya
que debe de ser el menor posible para permitir que toda la
superficie del mismo se recubra de la enzima, no tan pequeño como
para que las moléculas de enzima puedan "taponar los poros" ni
tan grande que la capacidad de carga se vea muy reducida.
Utilizando agarosa 4 BCL, se podían inmovilizar hasta 30 mg de
enzima por g de soporte.
Estos derivados eran mucho más estables que la
enzima soluble en todas las condiciones de pH y T, presencia de
codisolventes, etc.
Se comprobó que esta preparación tenía las 3
subunidades de la enzima unidas al soporte de forma covalente, ya
que no se liberaba proteína al medio cuando se hervía en presencia
de SDS, lo que evitaba que la enzima se pudiera disociar, con las
consiguientes ventajas de estabilidad a pH ácido y ausencia de
proteína soluble en el medio de reacción que pudiera contaminar
los productos. Por otro lado, la enzima inmovilizada era totalmente
estable en sistemas agitados, al no interaccionar la enzima
directamente con las burbujas de gas.
La enzima inmovilizada en
glioxil-vidrio poroso pudo ser atrapada en
polímeros de tetrametil ortosilicato (TIMOS) sin ningún tipo de
pérdida de actividad (lo que la convertía en un posible biosensor
con una elevadísima termoestabilidad). Además, no se apreció
liberación de la enzima al medio de reacción, incluso utilizando
los grados de polimerización menores del
sol-gel.
El gen TTC1211 fue amplificado por PCR desde DNA
cromosómico de la cepa Thermus thermophilus HB27
(http://wishart.biology.ualberta.ca/BacMap) con los
oligonucleótidos gdh2sense
(5'-cgcatatgaagagcgaa-3'),
que incluía una diana de corte para la enzima de restricción NdeI
(subrayada), y gdh2antisense (5'-ttaagggtataggcccc-
3'). El producto de la amplificación fue clonado en el vector
pCR2.1TOPO (Invitrogen) para su replicación y amplificación en
E. coli, y posteriormente extraído mediante digestión con
NdeI y HindIII. El fragmento fue clonado en el plásmido pET28b
(Novagen) empleando las mismas dianas de restricción, de forma que
al gen de la GDH se le añadió una secuencia codificante de 6
histidinas en el extremo 5' en fase con la secuencia codificante. El
plásmido de expresión obtenido, denominado pET28gdh2, fue
transferido a la cepa Escherichia coli BL21DE3 para la
producción de la proteína. La cepa resultante fue cultivada en
medio LB a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica a 550 nm de 0.5,
momento en el que se añadió al cultivo una solución de Isopropil
beta D-galactopiranósido hasta alcanzar una
concentración final de 1 mM. El cultivo fue mantenido en las mismas
condiciones durante 4 horas, momento en el que las células fueron
recogidas por centrifugación. Las células fueron resuspendidas en
tampón, y se les añadió alúmina como abrasivo necesario para su
ruptura mecánica. Los restos celulares y de alúmina fueron
eliminados por centrifugación, y el sobrenadante fue utilizado para
la purificación de la enzima. Ésta se llevó a cabo en dos pasos.
En el primero, el extracto celular fue sometido a calentamiento a
70ºC durante 30 minutos para desnaturalizar la mayor parte de las
proteínas de E. coli, que fueron retiradas mediante
centrifugación. En un segundo paso, empleamos cromatografía de
afinidad en columnas de Níquel-agarosa y posterior
elusión con un gradiente de imidazol, lo que permitió obtener una
fracción casi pura de la enzima.
La inmovilización se realizó añadiendo a dos
gramos de glioxil agarosa 6BCL (funcionalizada con 75 \mumol/mL
de grupos glioxil por mL de soporte empaquetado) 40 mL de
bicarbonato de sodio 100 mM a pH 10.05 que contenía 200 Unidades
enzimáticas (U) de glutamato deshidrogenasa. La suspensión se
sometió a una agitación suave a 25ºC.
A diferentes tiempos de incubación se tomaron
muestras tanto de sobrenadante como de suspensión y se determinó la
actividad enzimática: un determinado volumen
(25-400 \muL) de suspensión enzimática se añadió a
una celda que contenía 2 mL de ácido glutámico 250 mM y 100 \muL
de NAD(P) + 100 mM en fosfato de sodio 100 mM a pH 8, a
66ºC. La actividad enzimática se mide recogiendo en un
espectrofotómetro UV el incremento de absorbancia a 340 nM
promovido por la formación de NAD(P)H durante la
oxidación de ácido glutámico. Se define una unidad enzimática (U)
de actividad como la cantidad de enzima necesaria para oxidar 1
pmol de ácido glutámico por minuto a pH 8 y 66ºC.
Después de la inmovilización completa de la
enzima en el soporte, la suspensión se siguió incubando a 25ºC
durante diferentes 1,5 h para permitir una interacción más intensa
entre la enzima y el soporte. A continuación, se añadió 40 mg de
borohiduro de sodio a estas preparaciones enzimáticas para reducir
los enlaces formados entre la proteína y el soporte, la reducción
se dejó bajo agitación suave durante 30 minutos a 25ºC. Finalmente
el derivado enzimático se lavó con abundante agua destilada y
fosfato de sodio 100 mM a pH 7.
La inmovilización se realizó añadiendo a dos
gramos de vidrio poroso (tamaño 1000A) (funcionalizada con
30 \mumol/mL de grupos glioxil por mL de soporte empaquetado) 40 mL de bicarbonato de sodio 100 mM a pH 10.05 que contenía 50 Unidades enzimáticas (U) de Glutamato deshidrogenasa. La suspensión se sometió a una agitación suave a 25ºC.
30 \mumol/mL de grupos glioxil por mL de soporte empaquetado) 40 mL de bicarbonato de sodio 100 mM a pH 10.05 que contenía 50 Unidades enzimáticas (U) de Glutamato deshidrogenasa. La suspensión se sometió a una agitación suave a 25ºC.
A diferentes tiempos de incubación se tomaron
muestras tanto de sobrenadante como de suspensión y se determinó
la actividad enzimática: un determinado volumen
(25-400 \muL) de suspensión enzimática se añadió
a una celda que contenía 2 mL de ácido glutámico 250 mM y 100
\muL de NAD(P) + 100 mM en fosfato de sodio 100 mM a pH 8,
a 66ºC. La actividad enzimática se mide recogiendo en un
espectrofotómetro UV el incremento de absorbancia a 340 nM
promovido por la formación de NAD(P)H durante la
oxidación de ácido glutámico. Se define una unidad enzimática (U)
de actividad como la cantidad de enzima necesaria para oxidar 1
\mumol de ácido glutámico por minuto a pH 8 y 66ºC.
Después de la inmovilización completa de la
enzima en el soporte, la suspensión se siguió incubando a 25ºC
durante diferentes períodos de 1,5 h para permitir una interacción
más intensa entre la enzima y el soporte. A continuación, se añadió
40 mg de borohiduro de sodio a estas preparaciones enzimáticas para
reducir los enlaces formados entre la proteína y el soporte, la
reducción se dejó bajo agitación suave durante 30 minutos a 25ºC.
Finalmente el derivado enzimático se lavó con abundante agua
destilada y fosfato de sodio 100 mM a pH 7.
Se utilizó un derivado al que sólo se
inmovilizaron 4 UI/g de soporte para evitar problemas de
difusión.
La influencia del pH en la actividad enzimática
de la preparación glioxil agarosa de la GDH se analizó midiendo la
actividad enzimática en la reacción de oxidación de glutamato de
sodio con NAD^{+} y NADP^{+}, y la reacción de reducción del
\alpha-cetoglutarato
(\alpha-KGO) con NADH (figura 2). La reacción de
oxidación del glutamato se analiza como sigue: un determinado
volumen (25-400 \muL) de suspensión enzimática se
añadió a una celda que contenía 2 mL
de glutamato 250 mM y 100 \muL de NAD(P)^{+} 100 mM a 66ºC. La actividad enzimática se mide recogiendo en un espectrofotómetro UV el incremento de absorbancia a 340 nM promovido por la formación de NAD(P)H durante la oxidación de glutamato de sodio. La reacción de reducción del \alpha-cetoglutarato de amonio se analizó añadiendo un determinado volumen de suspensión enzimática (25-400 \muL) a una celda que contenía 2 mL de a-cetoglutarato 250 mM y 100 \muL de NADH 10 mM a 66ºC. La actividad enzimática se mide recogiendo en un espectrofotómetro ultravioleta el descenso de absorbancia a 340 nm promovido por la oxidación del NADH a NAD^{+}, usando 100 mM de fosfato de sodio o amonio al pH indicado. La actividad expresada se recogió durante los primeros 50 segundos de reacción.
de glutamato 250 mM y 100 \muL de NAD(P)^{+} 100 mM a 66ºC. La actividad enzimática se mide recogiendo en un espectrofotómetro UV el incremento de absorbancia a 340 nM promovido por la formación de NAD(P)H durante la oxidación de glutamato de sodio. La reacción de reducción del \alpha-cetoglutarato de amonio se analizó añadiendo un determinado volumen de suspensión enzimática (25-400 \muL) a una celda que contenía 2 mL de a-cetoglutarato 250 mM y 100 \muL de NADH 10 mM a 66ºC. La actividad enzimática se mide recogiendo en un espectrofotómetro ultravioleta el descenso de absorbancia a 340 nm promovido por la oxidación del NADH a NAD^{+}, usando 100 mM de fosfato de sodio o amonio al pH indicado. La actividad expresada se recogió durante los primeros 50 segundos de reacción.
La máxima actividad en los 3 casos se encontró a
pH 9, siendo la actividad con NADH mayor que con NADPH y la de
oxidación mayor que la de reducción a pH ácidos.
La actividad relativa se calculó tomando como
100% la actividad observada en la reacción de oxidación del
glutamato con NAD^{+}.
Todas las inactivaciones se realizaron usando
derivados con menos de 4 U/g de soporte, para evitar problemas
difusionales que pudieran alterar la caracterización de la
estabilidad del catalizador preparado.
Se incubaron en fosfato de sodio 100 mM a pH 7 a
66ºC una suspensión de glutamato deshidrogenasa soluble a 0.3
U/mL y el derivado glioxil agarosa 6BCL óptimo a 0.3 U/mL.
A diferentes tiempos se tomaron muestras de
suspensión de las dos incubaciones y se determinó la actividad
residual según el procedimiento explicado anteriormente, en las
mismas condiciones.
La figura 3 muestra la gran estabilidad de la
enzima inmovilizada en glioxil agarosa.
Todas las inactivaciones se realizaron usando
derivados con menos de 4 U/g de soporte, para evitar problemas
difusionales que pudieran alterar la caracterización de la
estabilidad del catalizador preparado.
Se incubaron en acetato de sodio 100 mM a pH 4 y
25ºC una suspensión de glutamato deshidrogenasa soluble y de
derivado glioxil agarosa a diferentes concentraciones.
A diferentes tiempos se tomaron muestras de
suspensión de las dos incubaciones y se determinó la actividad
residual, midiendo la actividad según el procedimiento explicado
anteriormente, en las mismas condiciones. La Figura 4 muestra que,
mientras la enzima soluble era muy inestable y su estabilidad
dependía de la concentración, la del derivado no.
El atrapamiento de GDH inmovilizada en
tetrametil ortosilicato se realizó preparando capas finas sobre
vidrio de 2 x 3 cm.
La placa de vidrio se lavó sucesivamente con
tolueno, acetona y etanol. A continuación se incubó en 1M NaOH
durante 24 h. Después se lavó con agua y se sonicó durante 20
minutos el vidrio para asegurar su limpieza, secándose a 120ºC
durante 2 h.
Una solución de TIMOS
pre-polimerizado se preparó por catálisis ácida.
Para ello, 1.1 g de TIMOS y 2 mL de agua destilada se mezclaron e
incubaron durante 5 minutos a -20ºC. Esta solución bifásica se
agitó vigorosamente mientras se añadió 0.5 mL de HCL 0.1 M. La
mezcla se dejó 5 minutos a -20ºC y entonces se almacenó a 4ºC. Tras
24 h, 0.5 ml
de esta solución pre-polimerizada se mezclaron con 0.5 ml de NaOH 50 mM y se agitaron vigorosamente mientras se añadían 0.5 mL de una suspensión de 2 U de GDH inmovilizada en glioxil-vidrio poroso (en una suspensión 1:1). La mezcla se vertió sobre las placas de vidrio y la polimerización fue completa unos 2 minutos después de la adición de la enzima. Más del 80% de la actividad se recuperó, mostrando una estabilidad muy similar a la de la enzima inmovilizada sin atrapar, lo que muestra que la pre-inmovilización evita interacciones no deseadas con el polímero y permite mantener la estabilidad conseguida por unión covalente multipuntual.
de esta solución pre-polimerizada se mezclaron con 0.5 ml de NaOH 50 mM y se agitaron vigorosamente mientras se añadían 0.5 mL de una suspensión de 2 U de GDH inmovilizada en glioxil-vidrio poroso (en una suspensión 1:1). La mezcla se vertió sobre las placas de vidrio y la polimerización fue completa unos 2 minutos después de la adición de la enzima. Más del 80% de la actividad se recuperó, mostrando una estabilidad muy similar a la de la enzima inmovilizada sin atrapar, lo que muestra que la pre-inmovilización evita interacciones no deseadas con el polímero y permite mantener la estabilidad conseguida por unión covalente multipuntual.
Figura
1
A) Expresión en E. coli. Carriles: 1)
Marcadores de tamaño (115.9, 96.7, 51.5, 37.7, 29.2); 2) E.
coli transformada con pET28b; 3) E. coli transformada
con pET28gdh; B) Purificación de Gdh. 4) Fracción obtenida tras el
calentamiento; 5) Paso de muestra; 6-10) fracciones
eluidas con imidazol. C) Actividad GDH detectada por incremento de
la absorción a 340 nm debida a la reducción de NAD^{+}. 1)
Fracción soluble de E. coli transformada con pET28b tras el
calentamiento a 70ºC; 2, 3) Fracciones de enzima purificada
correspondiente a las muestras de los carriles 7 y 8 del panel
B.
Figura
2
(\ding{108}) Glioxil agarosa 6BCL, reacción de
oxidación del glutamato de sodio con NAD^{+}. (\ding{117})
Glioxil agarosa 6BCL, reacción de reducción del
\alpha-cetoglutarato de amonio con NADH.
(\blacksquare) Glioxil agarosa 6BCL, reacción de oxidación del
glutamato de sodio con NADP^{+}. Los ensayos enzimáticos se
realizaron a 66ºC, tal y como se describe anteriormente.
Figura
3
Las condiciones fueron 66ºC, pH 7, 0.3 U /mL.
Fosfato de sodio 100 mM
(\medcirc) GDH soluble.
(\ding{115}) Glioxil agarosa 75 \mumol/g
25ºC 1,5 h.
Figura
4
(\medcirc) Soluble GDH 0.3 U/mL (\boxempty)
Soluble GDH 0.06 U/mL.
(\ding{115}) Glioxil agarosa 75 \mumol/g
25ºC 1.5 h 0.3 U/mL
(\ding{117}) Glioxil agarosa 75 \mumol/g
25ºC 1.5 h 0.06 U/mL.
Claims (15)
1. Procedimiento de inmovilización de una
glutamato deshidrogenasa de Thermus thermophilus
caracterizado porque la enzima se estabiliza por unión
covalente multipuntual y multi-subunidades sobre
soportes activados con grupos glioxil y porque comprende las
siguientes etapas:
- i)
- inmovilización de la enzima sobre un soporte glioxil
- ii)
- incubación de la enzima inmovilizada en condiciones adecuadas para conseguir una unión covalente multipuntual intensa
- iii)
- reducción final de la preparación con un agente reductor de aldehídos e iminas (p.e. borohidruro).
2. Procedimiento según reivindicación 1 en el
que el soporte es agarosa, vidrio poroso o soportes de base
silícea.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y
2 en el que la inmovilización y la incubación se realizan entre
pH 9.5 y 11.
4. Procedimiento según las reivindicaciones
anteriores en el que la enzima se deja reaccionar con el soporte
entre 1 h y 24 h.
5. Procedimiento según las reivindicaciones
anteriores en el que la temperatura de inmovilización y de
incubación está entre 4ºC y 50ºC.
6. Procedimiento según las reivindicaciones
anteriores en el que el agente reductor de aldehído es el
borohidruro sódico.
7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
6 caracterizado porque la glutamato deshidrogenasa
inmovilizada-estabilizada presenta actividad tanto
con NAD(H) como con NADP(H) y se utiliza en la
regeneración de cofactores oxidados o reducidos.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el
que la enzima inmovilizada-estabilizada finalmente
se utiliza para regenerar NAD.
9. Procedimiento según la reivindicación 7 en el
que la enzima inmovilizada-estabilizada se utiliza
para regenerar NADH.
10. Procedimiento según la reivindicación 7 en
el que la enzima inmovilizada-estabilizada se
utiliza para regenerar NADP.
11. Procedimiento según la reivindicación 7 en
el que la enzima inmovilizada-estabilizada se
utiliza para regenerar NADPH.
12. Procedimiento según las reivindicaciones
1-6 en el que la preparación enzimática se atrapa
en sol-geles u otros polímeros para depositar en el
sensor de biosensores (por ej. de ácido glutámico, metales pesados,
amoniaco, urea, etc).
13. Un biocatalizador de Glutamato
deshidrogenasa de Thermus thermophilus
inmovilizada-estabilizada por el procedimiento
según las reivindicaciones 1 a 12.
14. Uso de una glutamato deshidrogenasa de
Thermus thermophilus,
inmovilizada-estabilizada según las reivindicaciones
1 a 12, como enzima regeneradora de cofactores en procesos de
reducción-oxidación enzimáticos.
15. Uso de una glutamato deshidrogenasa de
Thermus thermophilus,
inmovilizada-estabilizada según las
reivindicaciones 1 a 12, como biosensor, por ej. de ácido
glutámico, metales pesados, amoniaco, urea, etc...
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ES200702294A ES2325802B1 (es) | 2007-08-16 | 2007-08-16 | Procedimiento de inmovilizacion de una glutamato deshidrogenasa. |
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-
2007
- 2007-08-16 ES ES200702294A patent/ES2325802B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
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SIU, E. et al.: "{}Electrochemical Regeneration of NADH Using Conductive Vanadia-Silica Xerogels"{}, Biotechnol. Prog. (enero-febrero 2007), vol. 23, pp.: 293-296, todo el documento. * |
Also Published As
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