ES2308868B1 - Uso de arrays de secuencias especificas de genoma mitocondrial humano sobre soporte solido y procedimiento para la deteccion de mutaciones asociadas a la neuropatia optica de leber. - Google Patents
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Abstract
Uso de arrays de secuencias específicas de
genoma mitocondrial humano sobre soporte sólido y procedimiento para
la detección de mutaciones asociadas a la Neuropatía Óptica de
Leber, mediante chips de ADN. El procedimiento se basa en la
amplificación de los fragmentos que contienen las mutaciones y
polimorfismos de interés y la determinación de la base implicada en
los mismos mediante una reacción de minisecuenciación empleando
cebadores que en su extremo 5' portan una cola (tag), para su
posterior detección mediante la hibridación de los productos de la
reacción de minisecuenciación con un microarray constituido por las
secuencias complementarias a las colas (cTag).
Description
Uso de arrays de secuencias específicas de
genoma mitocondrial humano sobre soporte sólido y procedimiento para
la detección de mutaciones asociadas a la Neuropatía Óptica de
Leber.
Uso de arrays de secuencias específicas de
genoma mitocondrial humano sobre soporte sólido y procedimiento
para la detección de mutaciones asociadas a la Neuropatía Óptica de
Leber, mediante chips de ADN. Son de aplicación en genética, y en
particular, diagnóstico molecular y genética de poblaciones.
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El ADN mitocondrial humano es una cadena
circular de 16,6 kb que contiene 37 genes, de los cuales solo 13
codifican polipéptidos componentes de la cadena respiratoria
(sistema de fosforilación oxidativa, OXPHOS), siendo los restantes
genes responsables de la formación de los ARN de transferencia y
ribosómicos. Las mitocondrias se caracterizan por su herencia
materna, aparecer en un numero variable de entre cientos a miles en
cada célula y el que la replicación del ADN mitocondrial y su
herencia en los linajes somáticos es aleatoria. Dentro de cada
mitocondria coexisten cientos o miles de cadenas circulares de ADN
mitocondrial, de manera que la aparición de mutaciones puede llevar
a la coexistencia de dos o más genotipos dentro de una célula,
órgano o individuo, fenómeno denominado heteroplasmia. En general
para una mutación patógena, la proporción de moléculas mutadas en
la población heteroplásmica (carga mutacional) repercute en la
severidad del defecto y en la clínica, aunque no de una manera
lineal. Dado el carácter aleatorio de la replicación y herencia del
ADN mitocondrial, la carga mutacional puede cambiar durante la vida
del paciente y pueden darse diferentes cargas mutacionales en
diferentes células y tejidos. Al tener estos diferentes
requerimientos energéticos la heteroplasmia y la segregación al
azar explica la variable presentación clínica y gravedad de las
mutaciones en el genoma mitocondrial.
Las enfermedades asociadas a alteraciones del
genoma mitocondrial tienen como base común un defecto en la
biosíntesis de ATP, ya sea por mutaciones o deleciones que afectan a
los genes codificantes o por mutaciones o deleciones que afectan
ARNs ribosómicos o transferentes específicos que son requeridos
para la síntesis de los polipéptidos codificados por los primeros
(DIMAURO S., SCHON E.A. Mitochondrial DNA mutations in human
disease. Am J Med Genet. 2001, Vol 106, páginas
18-26; SMEITINK J. et al. The genetics and
pathology of oxidative phosphorylation. Nat Rev Genet. 2001, Vol 2,
páginas 342-352). Estas enfermedades presentan una
clínica muy variada y pueden afectar a todos los órganos y tejidos
(WONG L.-J. C., BOLES R.G. Mitochondrial DNA analysis in clinical
laboratory diagnostics. Clin Chim Acta. 2005, Vol 354, páginas
1-20). En ciertos casos aparecen con unos aspectos
clínicos, morfológicos y bioquímicos muy concretos que dan lugar a
síndromes bien caracterizados. Sin embargo, en la mayoría de los
casos los síntomas son poco informativos, siendo orientativo de una
enfermedad de origen mitocondrial la presencia de anomalías
neurológicas, a veces con aumento de ácido láctico y otros
síntomas, así como una herencia materna. Por ello son enfermedades
de estudio complejo, interviniendo estudios morfológicos,
histoquímicos y bioquímicos, necesarios para asegurar su
naturaleza. Estos estudios son a veces incluyentes y muchas veces
traumáticos para el paciente, como el caso de biopsias, con lo que
el estudio genético resulta la confirmación de la patología de una
forma más segura y económica.
En Europa los defectos del ADN mitocondrial son
causa de enfermedad en 6,57 de cada 100.000 individuos adultos,
estimándose que 1 de cada 8.000 individuos tienen o presentan un
riesgo de padecer una enfermedad causada por daños en este ADN.
Estos valores hacen que la prevalencia de estas enfermedades sea
equivalente a la de otras enfermedades neurológicas, como la Corea
de Huntington, o incluso superior como en el caso de la distrofia de
Dúchenme, por citar dos entidades muy estudiadas molecularmente.
Existen pocos datos sobre la prevalencia de la Neuropatía Óptica
de Leber. Es la causa de la ceguera en 0,42-2% de
los casos registrados en Australia, y en el noroeste de Inglaterra
11,8 de cada 100000 personas porta una mutación primaria o causal,
presentando la enfermedad 3,22 de cada 100000. Se calcula que uno
en 140000 varones adultos tienen defectos visuales como consecuencia
de esta patología. Por otro lado la frecuencia relativa de las
mutaciones que causan la Neuropatía Óptica de Leber varía en el
mundo. La mutación G11778A es la más prevalente, siendo responsable
del 70% de los casos. Esta mutación, junto con T14484C y A3460G, es
considerada del grupo de mutaciones inequívocamente causales o
primarias, y en conjunto se encuentra en el 95% de los casos
diagnosticados.
Desde que en 1988 se publicaron las primeras
mutaciones han sido descritas una gran cantidad de mutaciones y
polimorfismos en el genoma mitocondrial: unas 180 mutaciones, y un
número cercano de deleciones, algunas de ellas extremadamente raras,
asociadas a una gran variedad de patologías. Una base de datos
pública (WALLACE D.C., LOTT M.T. MITOMAP: a human mitochondrial
genome database: http://www.mitomap.org/) recoge información de
todas las mutaciones descubiertas hasta el momento y se va
actualizando con aportación de datos clínicos.
La existencia de polimorfismos y de mutaciones
no patogénicas en el genoma mitocondrial, aunque de menor interés
en el campo diagnóstico, sí tiene aplicaciones prácticas en el
campo de la genética de poblaciones, para el estudio de filogenias
de poblaciones humanas y del origen y prevalencia de alteraciones
mitocondriales. Además, dichos polimorfismos y mutaciones no
patógenas pueden tener un efecto modificador de la expresión de
otras mutaciones presentes en el genoma mitocondrial, lo que puede
tener un potencial interés en el diagnóstico, pronóstico y terapia
de afectados por dichas patologías (TORRONI A. et al.
Haplotype and phylogenetic analyses suggest that one
European-specific mtDNA background plays a role in
the expression of Leber hereditary optic neuropathy by increasing
the penetrance of the primary mutations 11778 and 14484. Am J Hum
Genet. 1997, Vol 60, N° 5, páginas 1107-11021).
Las mutaciones puntuales en el ADN mitocondrial
se diagnostican actualmente mediante secuenciación del genoma
mitocondrial. Su excesivo tamaño (16,6 kb) hace difícil el acceder a
la secuenciación completa del mismo, de forma que normalmente se
secuencian únicamente aquellos fragmentos para los cuales hay
inicialmente una sospecha, lo que muchas veces es una estrategia
inadecuada dada la variabilidad en expresión de las patologías
mitocondriales ya comentada. Todavía se utilizan otras técnicas,
como los RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), cuando la
alteración afecta a un punto de corte de una enzima de restricción,
y la PCR alelo específica. El problema de ambos métodos es la
dificultad de automatización del análisis, imprescindible cuando el
número de mutaciones a analizar es elevado.
En la Tabla 1 se indican las mutaciones y
polimorfismos más importantes del genoma mitocondrial humano
teniendo en cuenta la prevalencia de las distintas mutaciones, la
importancia diagnóstica de las patologías a las que se asocian y por
el interés de ciertos polimorfismos y mutaciones no patógenas o de
trascendencia dudosa. Todas estas mutaciones y polimorfismo, al
igual que los responsables de la Neuropatía Óptica de Leber, pueden
incluirse simultáneamente en un chip de mutaciones como el
propuesto siguiendo el mismo procedimiento al descrito. Estas
mutaciones se asocian generalmente a patologías de origen
mitocondrial y de gran transcendencia clínica: Síndrome de
Kearns-Sayre, Enfermedad de Leigh, Neuropatía
óptica de Leber (LHON), MELAS (Encefalopatía mitocondrial con
acidosis láctica), MERRF (Epilepsia mioclónica), NARP (Neuropatía,
ataxia y retinitis pigmentosa), PEO (Oftalmoplegia externa
progresiva), entre otras. Sin embargo la experiencia clínica
demuestra que la mayoría de los individuos con patologías
mitocondriales no se ajustan con exactitud a uno de los síndromes
específicos definidos y que la correlación genotipo -
fenotipo en medicina mitocondrial es pobre (WONG L-J. C., BOLES R. G. op. cited).
fenotipo en medicina mitocondrial es pobre (WONG L-J. C., BOLES R. G. op. cited).
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Para lograr la generalización del diagnóstico
molecular de patologías mitocondriales es necesario tipar un alto
número de mutaciones y polimorfismos, siendo imprescindible la
utilización de tecnologías que nos permitan analizar muchas
variantes del ADN mitocondrial simultáneamente y de la manera más
rápida, económica y automatizada posible. En la actualidad, existe
un gran número de tecnologías disponibles para el genotipado de
mutaciones puntuales y polimorfismos de base única ó SNPs (SYVANEN
A.C. Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide
polymorphisms. Nat Rev Genet. 2001, Vol 2, N° 12, páginas
930-942).
La elección del método de genotipado adecuado
para cada aplicación depende del número de SNPs y muestras que sea
necesario analizar, la flexibilidad de la tecnología, el fácil
manejo y el coste. Una tecnología prometedora es la de los
chips o microarrays de ADN (SOUTHERN E.M. DNA chips:
analysing sequence by hybridization to oligonucleotides on a large
scale. Trends Genet. 1996, Vol 12, N° 3, páginas
110-115; HACIA J.G. Resequencing and mutational
analysis using oligonucleotide microarrays. Nat Genet. 1999,
Vol 21, N° 1, páginas 42-47). Los chips de ADN
consisten en la disposición ordenada de fragmentos de ADN sobre un
soporte sólido mediante su inmovilización o síntesis
in situ, para su posterior hibridación con el ADN marcado fluorescentemente de la muestra que queremos analizar.
in situ, para su posterior hibridación con el ADN marcado fluorescentemente de la muestra que queremos analizar.
En los últimos años se ha producido un avance
importante en el desarrollo de esta tecnología. La mayoría de los
métodos de genotipado descritos hasta el momento se basan en tres
tipos de reacción: la hibridación con sondas
alelo-específicas (ASO, Allelic Specific
Oligonucleotide) (HACIA J.G. op. cited); minisecuenciación
(también llamada Single Base Extensión, SBE) (PASTINEN T. et.
al. Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and
diagnostics on oligonucleotide arrays. Genome Res. 1997, Vol 7, N°
6, páginas 606-614); y ligamiento de
oligonucleóotidos alelo-específicos (OLA,
Oligonucleotide Ligation Assay) (GERRY N. P. et. al.
Universal DNA microarray method for multiplex detection of
low abundance point mutations. J Mol Biol. 1999, Vol 292, N° 2,
páginas 251-262). Todos estos métodos pueden ser
utilizados con microarrays.
El genotipado simultáneo de múltiples SNPs
mediante hibridación con sondas ASO resulta difícil y no siempre
fiable (WANG D.G., et. al. Large-scale
identification, mapping, and genotyping of
single-nucleotide polymorphisms in the human genome.
Science. 1998 Vol 280, páginas 1077-1082; CHO R.J.,
et. al. Genome-wide mapping with biallelic
markers in Arabidopsis thaliana. Nat Genet. 1999, Vol. 23, N° 2,
páginas 203-207). Sin embargo, los métodos basados
en reacciones enzimáticas, como son los otros dos mencionados
anteriormente, tienen mayor aceptación como alternativas más
específicas que la hibridación con sondas ASO (RAITIO M., et.
al. Y-chromosomal SNPs in
Finno-Ugric-speaking populations
analyzed by minisequencing on microarrays. Genome Res. 2001
Vol 11, N° 3, páginas 471-482; PASTINEN T., et.
al. A system for specific, high-throughput
genotyping by allele-specific primer exrtension on
micorarrays. Genome Res. 2000, Vol 10, páginas
1031-1042; FORTINA P., et. al. Simple
two-color array-based approach for
mutation detection. Eur J Hum Genet. 2000, Vol 8, N° 11, páginas
884-894; SOUTHERN E., et. al. Molecular
interactions on microarrays. Nat Genet. 1999, Vol 21, N° 1,
páginas 5-9).
En las reacciones de minisecuenciación una ADN
polimerasa es usada para extender el primer o cebador,
diseñado de tal forma que el extremo 3' es complementario a la base
anterior al SNP que queremos analizar. Los cebadores son extendidos
con distintos análogos de nucleótidos marcados que son
complementarios a los nucleótidos de la base polimórfica. Este
método fue descrito en un principio para ser llevado a cabo en
placas de microtitulación, donde los productos de PCR eran
inmovilizados (SYVANEN A.C., et. al. A
primer-guided nucleotide incorporation assay in the
genotyping of apolipoprotein E. Genomics 1990, Vol 8, N° 4, páginas
684-692; SYVANEN A.C., et. al. Identification
of individuals by analysis of biallelic DNA markers, using PCR and
solid-phase minisequencing. Am J Hum Genet. 1993,
Vol 52, N° 1, páginas 46-59). Más tarde, la
minisecuenciación fue adaptada a los microarrays uniendo el
cebador covalentemente a la superficie del microarray. Los
dideoxinucleótidos (ddNTPs) usados en la extensión estaban marcados
con radioactividad o fluorocromos (PASTINEN T., op. cited;
RAITIO M., op. cited).
Una alternativa a estas estrategias de
minisecuenciación es el uso de oligonucleótidos genéricos
denominados cTags que son inmovilizadas sobre la superficie
del microarray en lugar de los primers o cebadores.
En este caso, los cebadores utilizados en la reacción de
minisecuenciación finalizan en su extremo 3' en la base anterior a
la posición polimórfica, y en el extremo 5' tienen una cola o
tag de unos 25-27 nucleótidos, que son
complementarias a las cTags que constituyen el
microarray. Estas colas son secuencias no homólogas con el
genoma humano con temperaturas de melting similares, lo que
facilita la hibridación. La reacción de minisecuenciación tiene
lugar en un termociclador mediante la incorporación de
dideoxinucleótidos marcados con distintos fluorocromos, de forma que
podamos detectar que base se ha incorporado. A continuación, el
producto de la minisecuenciación se hibrida con el
microarray para genotipar todos los SNPs, identificando la
base incorporada en cada una de las posiciones del
microarray (Figura 1).
El uso de tag-primers fue
descrito por primera vez para el análisis de la expresión génica en
levaduras mediante PCR (SHOEMAKER D.D., et. al. Quantitative
phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly
parallel molecular bar-coding strategy. Nat Genet.
1996, Vol 14, N° 4, páginas 450-456) y ha sido
aplicada más tarde para el genotipado de SNPs mediante
minisecuenciación con micropartículas (CAI H., et. al. Flow
cytometry-based minisequencing: a new platform for
high-throughput single-nucleotide
polymorphism scoring. Genomics 2000, Vol. 66, N° 2, páginas
135-143), en los chips de alta densidad de
Affymetrix (GenFlex^{TM} array) (FAN J.B., et. al.
Parallel genotyping of human SNPs using generic
high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res.
2000, Vol 10, N° 6, páginas 853-860) y en los chips
de media densidad (HIRSCHHORN J.N., et. al.
SBE-TAGS: an array-based method for
efficient single-nucleotide polymorphism genotyping.
Proc Natl Acad Sci USA. 2000, Vol 97, N° 22, páginas
12164-12169).
Esta última estrategia denominada
SBE-TAGs (Single Base Extensión con Tags) nos
permite tipar al mismo tiempo un gran número de SNPs porque además
de ser un método enzimático, y por lo tanto mucho más específico
que las sondas ASO, el uso de Tags con temperaturas de
melting similares, facilita en gran medida la hibridación de
los productos de la reacción de minisecuenciación con el
microarray. El hecho de que el microarray esté
constituido por las cTags, en lugar de por cebadores
específicos de cada locus, nos permite que el mismo
microarray pueda ser utilizado para distintos grupos de
marcadores, teniendo que cambiar únicamente los cebadores que se
utilizan en la reacción de minisecuenciación que tiene lugar en el
termociclador.
Para la minisecuenciación con microarrays
pueden estar los cuatro ddNTPs marcados con el mismo fluorocromo y
usarse en reacciones separadas, o bien cada uno de ellos marcado con
un fluorocromo distinto, y llevarse a cabo una única reacción. Por
un lado, resulta más ventajoso el uso de cuatro fluorocromos
distintos porque únicamente es necesaria una reacción de
minisecuenciación. Sin embargo puede ser necesario separar las
reacciones cuando puede existir interferencia entre los cebadores
específicos, como es el caso de SNPs muy próximos (1 a 20 pares de
bases de separación). Por otro lado, si usamos un solo fluorocromo
estamos facilitando la posibilidad de usar esta tecnología en un
mayor número de laboratorios, ya que se puede usar un escáner que
lea únicamente para dos longitudes de onda, como pueden ser los que
se dedican al análisis de expresión génica. Antes de la reacción de
minisecuenciación ha de llevarse a cabo una reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) (MULLIS K.B., FALOONA F.A. Specific synthesis
of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed
chain reaction. Methods Enzymol. 1987, Vol 155, páginas
335-350) para amplificar los fragmentos de ADN que
contienen los SNPs de interés.
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En el chip de ADN de la invención se puede
aplicar el concepto de "array de arrays" (PASTINEN T.
op. cited 2000), que nos permitiria hibridar simultáneamente
los productos de reacciones de minisecuenciación de varias muestras
sobre el mismo soporte al utilizar un molde de silicona que forma
pocillos de hibridación independientes (Figura 2). Esto permite a su
vez una gran capacidad a la hora de incluir mutaciones y
polimorfismos nuevos para esta y otras patologías
mitocondriales.
El objeto de la propuesta de invención consiste
en un chip y un procedimiento que nos permita genotipar
simultáneamente las mutaciones responsables de la Neuropatía Óptica
de Leber, así como otras mutaciones y polimorfismos asociados. La
novedad de la invención estriba en el hecho de proporcionar al
usuario la secuencia de los primers o cebadores que permiten
identificar el alelo de cada mutación y su posterior detección
mediante microarrays. El procedimiento utilizado se
caracteriza por la facilidad con que son detectados todos los
marcadores seleccionados simultáneamente, lo que supone un gran
ahorro de tiempo, reactivos y de muestra de partida para realizar
el análisis. Este último punto es de gran importancia, tanto en
diagnóstico molecular, donde la muestra de partida suele estar
limitada, como en estudios de genética de poblaciones, en los que
se trabaja muchas veces con muestras muy valiosas y difíciles de
conseguir.
La presente invención describe un chip y un
procedimiento para el genotipado de las mutaciones responsables de
la Neuropatía Óptica de Leber, mediante una reacción de
minisecuenciación combinada con el uso de microarrays. El
procedimiento se caracteriza por:
- -
- la amplificación de los fragmentos de ADN mitocondrial que contienen las mutaciones de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
- -
- La determinación de la base implicada en la mutación mediante una reacción de minisecuenciación empleando primers o cebadores que en su extremo 5' portan una cola (Tag)
- -
- y por la detección de los productos de la minisecuenciación mediante la hibridación de los mismos con un microarray previamente fabricado con las secuencias complementarias a las colas (cTags) situadas en el extremo 5' de los cebadores de la minisecuenciación.
El procedimiento consta de las etapas que se
detallan a continuación y que se muestran en la Figura 3.
- 1.
- Fabricación de los microarrays.
- 2.
- Amplificación del ADN mitocondrial en 3 fragmentos mediante PCR larga.
- 3.
- Comprobación de la amplificación.
- 4.
- Mezcla de los productos de las PCRs larga.
- 5.
- Purificación de los productos de PCR.
- 6.
- Reacción de minisecuenciación o Single Base Extensión (SBE).
- 7.
- Hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray.
- 8.
- Escaneado del microarray.
- 9.
- Análisis de los resultados mediante un software de análisis de imagen.
- 10.
- Interpretación de los resultados.
A continuación se describe detalladamente cada
una de las etapas anteriores:
Los microarrays son fabricados con un
robot o "arrayer" que deposita de forma ordenada y
precisa sobre un soporte sólido los oligonucleótidos (cTags)
complementarios a las tags que van unidas a los extremos 5'
de los primers o cebadores de minisecuenciación. Estos
oligonucleótidos se unen al soporte sobre el que se fabrican los
microarrays por el extremo 3'. Para esta unión, dependiendo
del tipo de soporte sobre el que se depositen, será necesario que en
dicho extremo porten una modificación.
El sistema, al ser de una gran flexibilidad,
permite la fabricación de gran variedad de chips de mutaciones a
partir de una librería de secuencias específicas. Para las
mutaciones y polimorfismos incluidos en la Tabla 1 hemos comprobado
el funcionamiento en la práctica de una serie de secuencias
cTag. En la Tabla 2 se muestra que cTag es usada para
detectar cada mutación y polimorfismo y su correspondencia con las
secuencias recogidas en la Lista de secuencias.
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Para el chip de diagnóstico de la Neuripatía
Óptica de Leber, que comprende las mutaciones G11778A, T14484C y
A3460G (primarias) y las mutaciones y polimorfismos asociados 3316A,
3496T, 3497T, 4136G, 4160C, 4216C, 4917G, 5244A, 7444A, 9101C,
9438A, 9738T, 9804A, 10663C, 13528G, 13708A, 13730A, 14459A,
14482A,
14482G, 14495G, 14498C, 14568T, 14596A, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A y 11696G, se han empleado las secuencias cTag siguientes: Sec. ID. N°: 5, Sec. ID. N°: 7, Sec. ID. N°: 8, Sec. ID. N°: 9, Sec. ID. N°: 10, Sec. ID. N°: 11, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 13, Sec. ID. N°: 14, Sec. ID. N°: 17, Sec. ID. N°: 26, Sec. ID. N°: 27, Sec. ID. N°: 28, Sec. ID. N°: 29, Sec. ID. N°: 31, Sec. ID. N°: 32, Sec. ID. N°: 35, Sec. ID. N°: 36, Sec. ID. N°: 40, Sec. ID. N°: 41, Sec. ID. N°: 42, Sec. ID. N°: 43, Sec. ID. N°: 44, Sec. ID. N°: 45, Sec. ID. N°: 46, Sec. ID. N°: 47, Sec. ID. N°: 48, Sec. ID. N°: 49, Sec. ID. N°: 50, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 58, Sec. ID. N°: 59, Sec. ID. N°: 60 y Sec. ID. N°: 58.
14482G, 14495G, 14498C, 14568T, 14596A, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A y 11696G, se han empleado las secuencias cTag siguientes: Sec. ID. N°: 5, Sec. ID. N°: 7, Sec. ID. N°: 8, Sec. ID. N°: 9, Sec. ID. N°: 10, Sec. ID. N°: 11, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 13, Sec. ID. N°: 14, Sec. ID. N°: 17, Sec. ID. N°: 26, Sec. ID. N°: 27, Sec. ID. N°: 28, Sec. ID. N°: 29, Sec. ID. N°: 31, Sec. ID. N°: 32, Sec. ID. N°: 35, Sec. ID. N°: 36, Sec. ID. N°: 40, Sec. ID. N°: 41, Sec. ID. N°: 42, Sec. ID. N°: 43, Sec. ID. N°: 44, Sec. ID. N°: 45, Sec. ID. N°: 46, Sec. ID. N°: 47, Sec. ID. N°: 48, Sec. ID. N°: 49, Sec. ID. N°: 50, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 58, Sec. ID. N°: 59, Sec. ID. N°: 60 y Sec. ID. N°: 58.
Los microarrays son fabricados según el
modelo de "array de arrays". Esto consiste en que sobre
un mismo portaobjetos se depositan las cTags necesarias en
distintas posiciones del portaobjetos, de forma que el mismo
array (que pasaremos a llamarle subarray) está
repetido varias veces. Cada muestra, para tipar las 32 mutaciones y
polimorfismos, necesita emplear tres subarrays. Usando un
molde de silicona y una cámara de hibridación adecuados, que nos
permitan aislar cada uno de los subarrays, podremos hibridar,
simultáneamente sobre el mismo portaobjetos, varias muestras, con
el consiguiente ahorro de tiempo y dinero.
En la Figura 2 se muestra la disposición de cada
subarray, así como un ejemplo de una posible distribución de
las mutaciones (aunque sobre el microarray está unida la
cTag correspondiente a cada mutación).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN mitocondrial se somete a la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR) con objeto de obtener la cantidad
suficiente de cada fragmento de ADN de manera que sea posible la
detección de todas mutaciones que presenta cada individuo. Una
ventaja de esta estrategia es que permitiría detectar cualesquiera
mutaciones en genoma mitocondrial, no solamente las de la
Neuropatía Óptica de Leber, sin necesidad de nuevas PCRs. Los
cebadores y la reacción de amplificación utilizados se describen en
las Tablas 3 y 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las PCR largas se llevaron a cabo en 25 \muL
de volumen final. Para su realización se preparan dos premixes que
se mezclan en el momento de introducirlas en el termociclador:
La eficacia de la amplificación puede ser
comprobada con cualquier técnica apropiadas aunque por el tamaño de
los fragmentos amplificados se recomienda el uso de geles de agarosa
al 1%. Para comprobar los tamaños de los fragmentos amplificados se
utiliza un marcador de peso molecular.
En esta etapa ya se pueden detectar en ciertos
casos mutaciones por duplicación o deleción del genoma
mitocondrial, como la deleción común de 5 Kb en el Síndrome de
Kearns-Sayre, al desaparecer fragmentos o aparecer
fragmentos de distinto tamaño (mayores o menores respectivamente)
al de los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procede a la concentración de la mezcla de
los productos de PCR evaporando la muestra mediante incubación a
37°C hasta obtener un volumen final suficiente para llevar a cabo
la reacción de minisecuenciación.
Este paso solamente es necesario si la cantidad
de material de partida es muy escaso y se requiere concentración de
la muestra. Como sólo se emplean 5 fragmentos de ADN amplificado no
es necesario mezclar y concentrar los productos de las PCRs para
evitar que cada fragmento de ADN amplificado quede muy diluido como
en otros arrays basados en multiplex.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR deben ser purificados para
eliminar los posibles restos de cebadores y dNTPs de la PCR para
evitar que interfieran en la reacción de minisecuenciación. Esto
puede realizarse con cualquier método apropiado para esta
aplicación.
\vskip1.000000\baselineskip
La minisecuenciación se lleva a cabo en tres
reacciones para las 32 mutaciones y polimorfismos, siempre a
partir de los tres productos de PCR previamente mezclados. Los
cebadores de estas reacciones se han diseñado de manera que el
extremo 3' del cebador sea complementario a la base anterior a la
mutación o polimorfismo. Al existir mutaciones muy próximas es
necesario separar ambas reacciones para impedir competencia entre
los cebadores. En otros casos este problema se soluciona al
disponer el cebador de la primera mutación en sentido sense
y el de la segunda en antisense. La región de ADN
mitocondrial comprendida entre los nucleótidos 14453 y 14498 es
especialmente compleja pues acumula 7 mutaciones, lo que ha
obligado a introducir una tercera reacción. De esta manera, en las
tres reacciones de minisecuenciación, el cebador se extenderá con
el dideoxinucleótido (ddNTP) complementario a la base mutada o
polimórfica. Detectando el ddNTP que ha sido añadido podremos
determinar el alelo de dicha mutación. Además, el cebador porta en
el extremo 5' una cola (tag) o secuencia no homologa a
secuencias humanas, cuya función es la de permitir la hibridación
con el microarray (Figura 2). Cada mutación o polimorfismo
tiene su propia tag para una mezcla de reacción dada. Las
tres mezclas de reacción hibridan en subarrays o cámaras
específicas dentro del chip. Entre subarrays se pueden
compartir cTags, con el correspondiente ahorro de
material.
Para el diseño de los cebadores se utilizó un
software propio (OligoTags) de forma que la temperatura de
melting de todos los cebadores fuese similar para facilitar
la minisecuenciación de todos los marcadores en la misma reacción.
La posible formación de estructuras secundarias en los cebadores ha
sido comprobada con el software OligoTags.
Para todas las mutaciones listadas en la Tabla 1
se han comprobado experimentalmente el funcionamiento de distintos
cebadores de minisecuenciación, tanto en la amplificación como en la
hibridación a sus correspondientes cTags listadas en la Tabla
2. En la Tabla 5 se muestra la correspondencia entre cada una de las
partes de los cebadores de minisecuenciación de cada mutación y
polimorfismo con las secuencias recogidas en la Lista de
secuencias.
Para el diagnóstico de la Neuropatía Óptica de
Leber se emplean las siguientes secuencias: 3316A (SEC. ID. N°: 66
+ SEC. ID. N°: 127); 3460A (SEC. ID. N°: 68 + SEC. ID. N°: 129);
3496T (SEC. ID. N°: 69 + SEC. ID. N°: 130); 3497T (SEC. ID. N°: 70 +
SEC. ID. N°: 131); 4136G (SEC. ID. N°: 71 + SEC. ID. N°: 132);
4160C (SEC. ID. N°: 72 + SEC. ID. N°: 133); 4216C (SEC. ID. N°: 73
+ SEC. ID. N°: 134); 4917G (SEC. ID. N°: 74 + SEC. ID. N°: 135);
5244A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 136); 7444A (SEC. ID. N°: 78 +
SEC. ID. N°: 139); 9101C (SEC. ID. N°: 87 + SEC. ID. N°: 147);
9176C (SEC. ID. N°: 88 + SEC. ID. N°: 148); 9176G (SEC. ID. N°: 89 +
SEC. ID. N°: 148); 9438A (SEC. ID. N°: 90 + SEC. ID. N°: 149);
9738T (SEC. ID. N°: 92 + SEC. ID. N°: 151); 9804A (SEC. ID. N°: 93 +
SEC. ID. N°: 152); 10663C (SEC. ID. N°: 96 + SEC. ID. N°: 156);
11778A (SEC. ID. N°: 97 + SEC. ID. N°: 157); 13528G (SEC. ID. N°:
101 + SEC. ID. N°: 161); 13708A (SEC. ID. N°: 102 + SEC. ID. N°:
162); 13730A (SEC. ID. N°: 103 + SEC. ID. N°: 163); 14459A (SEC. ID.
N°: 75 + SEC. ID. N°: 165); 14482A (SEC. ID. N°: 104 + SEC. ID.
N°: 166); 14482G (SEC. ID. N°: 105 + SEC. ID. N°: 166); 14484C
(SEC. ID. N°: 106 + SEC. ID. N°: 167); 14495G (SEC. ID. N°: 107 +
SEC. ID. N°: 168); 14498C (SEC. ID. N°: 108 + SEC. ID. N°: 169);
14568T (SEC. ID. N°: 109 + SEC. ID. N°: 170); 14596T (SEC. ID. N°:
110 + SEC. ID. N°: 171); 15257A (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°:
177); 3394C (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 180); 3635A (SEC. ID.
N°: 120 + SEC. ID. N°: 181); 4640A (SEC. ID. N°: 121 + SEC. ID.
N°: 182); 11696G (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 185).
La minisecuenciación se puede llevar a cabo bien
utilizando los cuatro ddNTPs, marcados cada uno de ellos con un
fluorocromo distinto, o bien, utilizando el mismo fluorocromo para
los cuatro ddNTPs. En el primer caso se realizan tres reacciones de
minisecuenciación por muestra, a la que se añaden los cuatro ddNTPs
con marcajes distintos; mientras que en el segundo caso serian
necesarias doce reacciones de minisecuenciación por muestra,
teniendo cada una de ellas uno de los cuatro ddNTPs marcado y los
otros tres sin marcar (en realidad, y dado que la tercera reacción
de minisecuenciación comprende sólo dos mutaciones ambas las cuales
incorporan únicamente ddTTP y ddCTP, sólo son necesarios diez
reacciones, ver Figura 2). Utilizando microarrays
constituidos por varios subarrays (Figura 2), en el caso de
reacciones con cuatro fluorocromos distintos podremos analizar un
número de muestras cuatro veces superior por microarray al
que analizaríamos con un único fluorocromo. Por otro lado, la
posibilidad de usar un único fluorocromo hace esta técnica más
flexible, permitiendo que se pueda realizar en laboratorios que no
disponen de escáner que lea a cuatro longitudes de onda
distintas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la reacción de
minisecuenciación son hibridados con el microarray. Las
colas (tag) situadas en el extremo 5' de los cebadores de
minisecuenciación hibridarán con las secuencias reversas y
complementarias de dichas colas (cTag) que constituyen el
microarray (Figura 1 y Figura 2). Para hibridar de forma
independiente cada subarray se utiliza un molde de silicona
que nos permite aislar cada subarray de los demás, formando
cámaras de hibridación independientes para cada uno de ellos. El
producto de cada reacción de minisecuenciación es añadido a la
cámara de hibridación que le corresponda por su situación sobre el
microarray. La hibridación tiene lugar a 42°C durante 180
minutos. Transcurrido este tiempo se procede a lavar el
microarray para retirar los restos de los productos de las
reacciones de minisecuenciación que no se han unido.
\vskip1.000000\baselineskip
El microarray se escanea para detectar en
que posiciones del microarray hay fluorescencia. Esto se
realiza siguiendo las instrucciones del escáner usado en cada caso.
Cuando la minisecuenciación se ha hecho con los cuatro ddNTPs
marcados con el mismo fluorocromo, solamente es necesario leer a la
longitud de onda de dicho fluorocromo. Sin embargo, si hemos
utilizado cuatro marcajes distintos deberemos escanear el
microarray para cada una de las longitudes de onda de los
fluorocromos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las imágenes obtenidas con el escáner deben ser
analizadas para cuantificar la fluorescencia en cada uno de los
puntos del microarray. Esto se puede realizar con cualquier
software apropiado para esta aplicación.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 6 se muestran los alelos descritos
para cada uno de las mutaciones y polimorfismos asociados a la
Neuropatía Óptica de Leber, así como el ddNTP incorporado en
reacción de minisecuenciación, que no siempre coincide con los
alelos descritos, ya que depende de la dirección de diseño del
primer.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la
invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de
la misma.
El siguiente ejemplo ilustra como usar "Mito
Chip" en un laboratorio de diagnóstico molecular o de genética
clínica.
Se reciben en el laboratorio una muestra de
sangre procedente de un paciente con sospecha clínica de una
Neuropatía Óptica de Leber.
Se prepara una placa de 96 ó 384 pocillos con
las cTags con las que se va a fabricar el microarray
(Sec. ID. N°: 5, Sec. ID. N°: 7, Sec. ID. N°: 8, Sec. ID. N°: 9,
Sec. ID. N°: 10, Sec. ID. N°: 11, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 13,
Sec. ID. N°: 14, Sec. ID. N°: 17, Sec. ID. N°: 26, Sec. ID. N°: 27,
Sec. ID. N°: 28, Sec. ID. N°: 29, Sec. ID. N°: 31, Sec. ID. N°: 32,
Sec. ID. N°: 35, Sec. ID. N°: 36, Sec. ID. N°: 40, Sec. ID. N°: 41,
Sec. ID. N°: 42, Sec. ID. N°: 43, Sec. ID. N°: 44, Sec. ID. N°: 45,
Sec. ID. N°: 46, Sec. ID. N°: 47, Sec. ID. N°: 48, Sec. ID. N°: 49,
Sec. ID. N°: 50, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 58, Sec. ID. N°: 59,
Sec. ID. N°: 60 y Sec. ID. N°: 58 de la Lista de secuencias) para
que el robot las pueda recoger y depositar sobre el soporte sólido,
según se muestra en la Figura 2. Se utilizaron como soporte los
"CodeLink Activated Slides" de Amersham Biosciences, y el
Arrayer 417 de Affymetrix como robot. Las cTags se diluyeron
en tampón de impresión (fosfato sódico pH 8.5, 50 mM) hasta una
concentración de 20 \muM. Las cTags tienen en el extremo
3' un grupo amino que se va a unir covalentemente a la superficie de
los "CodeLink Activated Slides". Una vez que se han depositado
las cTags sobre los portaobjetos se dejan secar de 4 a 72
horas.
A continuación es necesario bloquear los grupos
amino-reactivos de la superficie del
microarray a la que no se han unido las cTags. Esto se
lleva a cabo mediante una serie de pasos que consisten en:
a) Colocar los microarrays en un tubo
tipo Falcon de 50 mL y añadir la solución de bloqueo (0.1 M Tris,
50 mM etanolamina, pH 9.0) precalentada a 50°C durante 30
minutos.
b) Tirar la solución de bloqueo.
c) Enjuagar los microarrays dos veces con
agua destilada.
d) Lavar los microarrays con 4x SSC (NaCl
0.6 M, citrato sódico 0.06 M), 0.1% SDS (dodecil sulfato sódico)
(precalentado a 50°C) durante 30 minutos con agitación.
e) Tirar la solución de lavado y enjuagar con
agua destilada.
f) Centrifugar los microarrays a 800
r.p.m. durante 3 minutos. Para ello los microarrays se
colocan en una caja para portaobjetos y esta caja se centrifuga en
una centrífuga de placas, o bien, se meten los microarrays
en tubos Falcon de 50 mL y se centrifugan en una centrífuga con un
rotor para este tipo de tubos.
g) Se guardan a temperatura ambiente hasta que
vayan a ser usados.
En este ejemplo se ha utilizado un
microarray. El Arrayer 417 de Affymetrix permite fabricar
hasta 42 microarrays, que pueden ser guardados hasta su uso
(10 meses en el caso de los "CodeLink Activated Slides").
\vskip1.000000\baselineskip
La extracción del ADN de la muestra se puede
realizar por cualquier método de extracción o utilizando cualquier
kit de extracción apropiado para este tipo de muestras. Al
amplificarse únicamente 3 fragmentos de ADN mitocondrial la cantidad
de muestra necesaria es muy pequeña (unos 10 microlitros de ADN a
una concentración de entre 100 y 200 nanogramos/microlitro es más
que suficiente), con el consiguiente ahorro de muestra. De hecho
todo el análisis se puede realizar con unas pocas gotas de sangre
(< 300 microlitros de sangre total).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez extraído el ADN de la sangre, se procede
a amplificar los 3 fragmentos del ADN mitocondrial. Esto se hace
según el protocolo descrito anteriormente empleando el sistema
"Expand Long Template PCR" de Roche. En la Tabla
3 se muestran los cebadores de para cada fragmento.
Las PCR largas se llevaron a cabo en 25 \muL
de volumen final. Las condiciones de las PCRs para los tres
fragmentos se muestran en la Tabla 4. Para su realización se
preparan dos premixes que se mezclan en el momento de introducirlas
en el termociclador, tal y como se ha indicado anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comprobó la amplificación mediante
electroforesis en geles de agarosa standar al 1%. Los geles se
prepararon manualmente en el laboratorio añadiéndose al mismo
bromuro de etidio para la visualización del ADN. Su composición
es:
- 0.3 g de Agarosa DNA Typing Grade
- 30 mL de TAE lx (Tris Acético EDTA 0.5 M, pH
8.5)
- 1.5 \muL de Bromuro de Etidio (10 mg/mL)
(concentración final de BrEt de 0.5 mg/mL).
Se carga en el gel 2 \muL del producto de PCR
con 10 \muL de Solución de Carga
(Tris-Acetato-EDTA pH 8.3, azul de
bromofenol, sacarosa y glicerol).
La determinación del tamaño de los fragmentos
obtenidos se hizo comparando con un marcador de peso molecular (1 Kb
DNA Ladder, New England BioLabs).
En esta etapa se puede detectar la presencia de
deleciones o duplicaciones.
Los productos de las tres reacciones de PCR de
cada muestra se mezclan en un único tubo y se dejan evaporando a
37°C hasta llegar a un volumen final de 30 \muL.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR deben ser purificados para
eliminar los posibles restos de cebadores y dNTPs de la PCR para
evitar que interfieran en la reacción de minisecuenciación. Para
ello, se añaden 4 \muL de Exo-SapIT (Amersham
Bioscience) a 10 \muL de los productos de PCR mezclados y
concentrados, y se incuban a 37°C durante 15 minutos, seguido de
otros 15 minutos a 85°C.
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso se ha utilizado el mismo
fluorocromo para los cuatro ddNTPs y por lo tanto son necesarias
diez reacciones por muestra. Cada una de las reacciones se llevó a
cabo en un volumen final de 15 \muL. Las concentraciones de cada
uno de los reactivos se muestran en la Tabla 7. Los 32 cebadores
utilizados en la minisecuenciación se recogen en la Tabla 5 y son
los siguientes: 3316A (SEC. ID. N°: 66 + SEC. ID. N°: 127); 3460A
(SEC. ID. N°: 68 + SEC. ID.
N°: 129); 3496T (SEC. ID. N°: 69 + SEC. ID. N°: 130);
N°: 129); 3496T (SEC. ID. N°: 69 + SEC. ID. N°: 130);
\hskip0,5cm3497T (SEC. ID. N°: 70 + SEC. ID. N°: 131);
4136G (SEC. ID. N°: 71 + SEC. ID. N°: 132);
\hskip0,5cm4160C (SEC. ID. N°: 72 + SEC. ID. N°: 133);
4216C (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°: 134);
\hskip0,5cm4917G (SEC. ID. N°: 74 + SEC. ID. N°: 135);
5244A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 136);
\hskip0,5cm7444A (SEC. ID. N°: 78 + SEC. ID. N°: 139);
9101C (SEC. ID. N°: 87 + SEC. ID. N°: 147);
\hskip0,5cm9176C (SEC. ID. N°: 88 + SEC. ID. N°: 148);
9176G (SEC. ID. N°: 89 + SEC. ID. N°: 148);
\hskip0,5cm9438A (SEC. ID. N°: 90 + SEC. ID. N°: 149);
9738T (SEC. ID. N°: 92 + SEC. ID. N°: 151);
\hskip0,5cm9804A (SEC. ID. N°: 93 + SEC. ID. N°: 152);
10663C (SEC. ID. N°: 96 + SEC. ID. N°: 156);
\hskip0,5cm11778A (SEC. ID. N°: 97 + SEC. ID. N°: 157);
13528G (SEC. ID. N°: 101 + SEC. ID. N°: 161);
\hskip0,5cm13708A (SEC. ID. N°: 102 + SEC. ID. N°: 162);
13730A (SEC. ID. N°: 103 + SEC. ID. N°: 163);
\hskip0,5cm14459A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 165);
14482A (SEC. ID. N°: 104 + SEC. ID. N°: 166);
\hskip0,5cm14482G (SEC. ID. N°: 105 + SEC. ID. N°: 166);
14484C (SEC. ID. N°: 106 + SEC. ID. N°: 167);
\hskip0,5cm14495G (SEC. ID. N°: 107 + SEC. ID. N°: 168);
14498C (SEC. ID. N°: 108 + SEC. ID. N°: 169);
\hskip0,5cm14568T (SEC. ID. N°: 109 + SEC. ID. N°: 170);
14596T (SEC. ID. N°: 110 + SEC. ID. N°: 171);
\hskip0,5cm15257A (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°: 177);
3394C (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 180);
\hskip0,5cm3635A (SEC. ID. N°: 120 + SEC. ID. N°: 181);
4640A (SEC. ID. N°: 121 + SEC. ID. N°: 182);
\hskip0,5cm11696G (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 185).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Por cada muestra se realizaron tres reacciones
de minisecuenciación, cambiando únicamente las mezclas de
cebadores:
- Mezcla 1: con los cebadores de las mutaciones
y polimorfismos 3316A, 3460A, 3496T, 4136G, 4160C, 4216C, 4917G,
5244A, 7444A, 9101C, 9438A, 9738T, 9804A, 10663C, 11778A, 13708A,
13730A, 14482A, 14484C, 14568T, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A,
11696G.
- Mezcla 2: con los cebadores de las mutaciones
3497T, 13528G, 14482G, 14498C y 14596T.
- Mezcla 3: con los cebadores de las mutaciones
14459A y 14495G.
\vskip1.000000\baselineskip
Se coloca el microarray en la cámara de
hibridación con la silicona formando las cámaras de hibridación
independientes. Se preparan las muestras a hibridar mezclando 7
\muL de los productos de la reacción de minisecuenciación con el
tampón de hibridación (4x SSC, 0.1% SDS) en un volumen final de 15
\muL. Se introducen los 15 \muL de cada muestra en cada una de
las cámaras de hibridación formadas por el molde de silicona. La
disposición de las muestras sobre el microarray se realiza
según la Figura 2, de forma que cada fila representa una muestra y
las columnas las reacciones de minisecuenciación con uno de los
cuatro ddNTP marcados. En este caso, la primera columna son las
muestras con ddATP-Tarara, la segunda columna con
ddTTP-Tamra, la tercera con
ddCTP-Tamra y la cuarta con
ddGTP-Tamra. Se deja incubar el microarray
en un horno de hibridación a 42°C durante 180 minutos,
aproximadamente. Pasado este tiempo se retira el microarray
de la cámara de hibridación y se lava siguiendo los siguientes
pasos:
\vskip1.000000\baselineskip
a) Colocar el microarray en un tubo tipo
Falcon de 50 mL y enjuagar brevemente con 4x SSC.
b) Pasar el microarray a otro tubo de 50
mL y lavar con 2x SSC y 0.1% SDS a 42°C durante 5 minutos.
c) Tirar la solución de lavado y repetir el paso
b.
d) Tirar la solución.
e) Lavar con 0.2x SSC a temperatura ambiente
durante 1 minuto. Tirar la solución.
f) Lavar con 0.1x SSC a temperatura ambiente
durante 1 minuto. Tirar la solución.
g) Centrifugar los microarrays a 1000
r.p.m. durante 5 minutos. Para ello los microarrays se
colocan en una caja para portaobjetos y esta caja se centrifuga en
una centrifuga de placas, o bien, se meten los microarrays
en tubos Falcon de 50 mL y se centrifugan en una centrífuga con un
rotor para este tipo de tubos.
h) Se guardan en la oscuridad hasta ser
escaneados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se escanea el microarray a la longitud de
onda del fluorocromo utilizado en la reacción de minisecuenciación.
En este caso hemos usado el "Scanner 418 de Affymetrix".
\vskip1.000000\baselineskip
Se cuantificó la fluorescencia con el Imagene
4.1 (BioDiscovery Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 8 se representan los resultados
obtenidos. Dado que los resultados obtenidos a partir de la muestra
de sangre del paciente se corresponden para las mutaciones
asociadas a la Neuropatía óptica de Leber con la mutación 11778A,
considerada patológica, podemos confirmar esta patología. La
presencia de dos alelos raros no tiene significación clínica clara
y en ausencia de otros datos clínicos de interés no se deben
informar.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Esquema del procedimiento de
SBE-Tags para genotipado de variantes de copia
única. La reacción de minisecuenciación unirá un nucleótido al
cebador de minisecuenciación específico para cada mutación (A), el
cual a su vez se unirá por su cola o Tag a una secuencia
complementaria (cTag) fijada al soporte en la fase de hibridación
(B). Cada mutación queda fijada a un punto específico del
soporte.
\newpage
Figura 2. Diseño del microarray. El
rectángulo de la izquierda representa el portaobjetos sobre el que
se fabrica el microarray. En el interior de este rectángulo
hay una matriz de círculos. Cada uno de estos círculos representa
un subarray. Cada subarray está formado por las
cTags correspondientes a cada SNP (cada uno de los puntos del
subarray). La situación de cada una de las cTags en el
subarray tiene que ser conocida, aunque puede variar de un
microarray a otro. En esta figura se muestra una de las
disposiciones posibles incluyendo otras mutaciones además de las
asociadas a la Neuropatía Óptica de Leber.
Figura 3. Esquema del protocolo a seguir para el
genotipado mutaciones y polimorfismos del ADN mitocondrial mediante
el procedimiento descrito.
Claims (4)
1. Procedimiento para la detección en una
muestra biológica de la Neuropatía Óptica de Leber, patología de
origen mitocondrial, mediante el uso de secuencias específicas del
genoma mitocondrial humano mediante chips de ADN para la detección
de la alteración causante de la patología que puede ser alguna de
las mutaciones primarias G 11778A, T 14484C y A3460G y de las
mutaciones y polimorfismos asociados a la misma: 3316A, 3496T,
3497T, 4136G, 4160C, 4216C, 4917G, 5244A, 7444A, 9101C, 9438A,
9738T, 9804A, 10663C, 13528G, 13708A, 13730A, 14459A, 14482A,
14482G, 14495G, 14498C, 14568T, 14596A, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A
y 11696G, caracterizado por la amplificación del ADN
mitocondrial, y la determinación de dichas mutaciones mediante una
reacción de minisecuenciación o Single Base Extension (SBE)
utilizando los cebadores de minisecuenciación que finalizan en su
extremo 3' en la base anterior a la posición alterada y en el
extremo 5' portan una cola o tag y cuyas secuencias se
corresponden con los si-
guientes identificadores: 3316A (SEQ. ID. N°: 66 + SEQ. ID. N°: 127);
3496T (SEQ. ID. N°: 69 + SEQ. ID. N°: 130);
4136G (SEQ. ID. N°: 71 + SEQ. ID. N°: 132);
4216C (SEQ. ID. N°: 73 + SEQ. ID. N°: 134);
5244A (SEQ. ID. N°: 75 + SEQ. ID. N°: 136);
9101C (SEQ. ID. N°: 87 + SEQ. ID. N°: 147);
9176G (SEQ. ID. N°: 89 + SEQ. ID. N°: 148);
9738T (SEQ. ID. N°: 92 + SEQ. ID. N°: 151);
10663C (SEQ. ID. N°: 96 + SEQ. ID. N°: 156);
13528G (SEQ. ID. N°: 101 + SEQ. ID. N°: 161);
13730A (SEQ. ID. N°: 103 + SEQ. ID. N°: 163);
14482A (SEQ. ID. N°: 104 + SEQ. ID. N°: 166);
14484C (SEQ. ID. N°: 106 + SEQ. ID. N°: 167);
14498C (SEQ. ID. N°: 108 + SEQ. ID. N°: 169);
14596T (SEQ. ID. N°: 110 + SEQ. ID. N°: 171);
3394C (SEQ. ID. N°: 119 + SEQ. ID. N°: 180);
4640A (SEQ. ID. N°: 121 + SEQ. ID. N°: 182);
guientes identificadores: 3316A (SEQ. ID. N°: 66 + SEQ. ID. N°: 127);
\hskip0,2cm3460A (SEQ. ID. N°: 68 + SEQ. ID. N°: 129);
3496T (SEQ. ID. N°: 69 + SEQ. ID. N°: 130);
\hskip0,5cm3497T (SEQ. ID. N°: 70 + SEQ. ID. N°: 131);
4136G (SEQ. ID. N°: 71 + SEQ. ID. N°: 132);
\hskip0,5cm4160C (SEQ. ID. N°: 72 + SEQ. ID. N°: 133);
4216C (SEQ. ID. N°: 73 + SEQ. ID. N°: 134);
\hskip0,5cm4917G (SEQ. ID. N°: 74 + SEQ. ID. N°: 135);
5244A (SEQ. ID. N°: 75 + SEQ. ID. N°: 136);
\hskip0,5cm7444A (SEQ. ID. N°: 78 + SEQ. ID. N°: 139);
9101C (SEQ. ID. N°: 87 + SEQ. ID. N°: 147);
\hskip0,5cm9176C (SEQ. ID. N°: 88 + SEQ. ID. N°: 148);
9176G (SEQ. ID. N°: 89 + SEQ. ID. N°: 148);
\hskip0,5cm9438A (SEQ. ID. N°: 90 + SEQ. ID. N°: 149);
9738T (SEQ. ID. N°: 92 + SEQ. ID. N°: 151);
\hskip0,5cm9804A (SEQ. ID. N°: 93 + SEQ. ID. N°: 152);
10663C (SEQ. ID. N°: 96 + SEQ. ID. N°: 156);
\hskip0,5cm11778A (SEQ. ID. N°: 97 + SEQ. ID. N°: 157);
13528G (SEQ. ID. N°: 101 + SEQ. ID. N°: 161);
\hskip0,5cm13708A (SEQ. ID. N°: 102 + SEQ. ID. N°: 162);
13730A (SEQ. ID. N°: 103 + SEQ. ID. N°: 163);
\hskip0,5cm14459A (SEQ. ID. N°: 75 + SEQ. ID. N°: 165);
14482A (SEQ. ID. N°: 104 + SEQ. ID. N°: 166);
\hskip0,5cm14482G (SEQ. ID. N°: 105 + SEQ. ID. N°: 166);
14484C (SEQ. ID. N°: 106 + SEQ. ID. N°: 167);
\hskip0,5cm14495G (SEQ. ID. N°: 107 + SEQ. ID. N°: 168);
14498C (SEQ. ID. N°: 108 + SEQ. ID. N°: 169);
\hskip0,5cm14568T (SEQ. ID. N°: 109 + SEQ. ID. N°: 170);
14596T (SEQ. ID. N°: 110 + SEQ. ID. N°: 171);
\hskip0,5cm15257A (SEQ. ID. N°: 73 + SEQ. ID. N°: 177);
3394C (SEQ. ID. N°: 119 + SEQ. ID. N°: 180);
\hskip0,5cm3635A (SEQ. ID. N°: 120 + SEQ. ID. N°: 181);
4640A (SEQ. ID. N°: 121 + SEQ. ID. N°: 182);
\hskip0,5cm11696G (SEQ. ID. N°: 119 + SEQ. ID. N°: 185), para su posterior detección mediante la hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con un microarray constituido por las secuencias complementarias a las colas (cTag) siguientes: SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, SEQ. ID. N°: 9, SEQ. ID. N°: 10, SEQ. ID. N°: 11, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID. N°: 13, SEQ. ID. N°: 14, SEQ. ID. N°: 17, SEQ. ID. N°: 26, SEQ. ID. N°: 27, SEQ. ID. N°: 28, SEQ. ID. N°: 29, SEQ. ID. N°: 31, SEQ. ID. N°: 32, SEQ. ID. N°: 35, SEQ. ID. N°: 36, SEQ. ID. N°: 40, SEQ. ID. N°: 41, SEQ. ID. N°: 42, SEQ. ID. N°: 43, SEQ. ID. N°: 44, SEQ. ID. N°: 45, SEQ. ID. N°: 46, SEQ. ID. N°: 47, SEQ. ID. N°: 48, SEQ. ID. N°: 49, SEQ. ID. N°: 50, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID. N°: 58, SEQ. ID. N°: 59, SEQ. ID. N°: 60 y SEQ. ID. N°: 58, oligonucleótidos complementarios a las colas que portan los cebadores de minisecuenciación en su extremo 5'. Las cTags se encuentran unidas al soporte sobre el que se fabrica el microarray por el extremo 3'. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:
- a)
- Fabricación de los microarrays.
- b)
- Amplificación mediante PCR larga de los fragmentos de ADN que incluyen las mutaciones y polimorfismos seleccionados.
- c)
- Comprobación de la amplificación.
- d)
- Mezcla de los productos de PCR y concentración del ADN mediante evaporación.
- e)
- Purificación de los productos de PCR.
- f)
- Reacción de minisecuenciación o Single Base Extensión (SBE).
- g)
- Hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray.
- h)
- Escaneado del microarray a la longitud de onda correspondiente, según los fluorocromos utilizados en la reacción de minisecuenciación.
- i)
- Análisis de los resultados mediante un software de análisis de imagen.
- j)
- Interpretación de los resultados.
2. El chip de mutaciones, según reivindicación
1, caracterizado por estar constituido por los
microarrays fabricados con las secuencias identificadas en la
lista de secuencias como SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID.
N°: 8, SEQ. ID. N°: 9, SEQ. ID. N°: 10, SEQ. ID. N°: 11, SEQ. ID.
N°: 12, SEQ. ID. N°: 13, SEQ. ID. N°: 14, SEQ. ID. N°: 17, SEQ. ID.
N°: 26, SEQ. ID. N°: 27, SEQ. ID. N°: 28, SEQ. ID. N°: 29, SEQ. ID.
N°: 31, SEQ. ID. N°: 32, SEQ. ID. N°: 35, SEQ. ID. N°: 36, SEQ. ID.
N°: 40, SEQ. ID. N°: 41, SEQ. ID. N°: 42, SEQ. ID. N°: 43, SEQ. ID.
N°: 44, SEQ. ID. N°: 45, SEQ. ID. N°: 46, SEQ. ID. N°: 47, SEQ. ID.
N°: 48, SEQ. ID. N°: 49, SEQ. ID. N°: 50, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID.
N°: 58, SEQ. ID. N°: 59, SEQ. ID. N°: 60 y SEQ. ID. N°: 58, y por
los cebadores de minisecuenciación, SEQ. ID. N°: 66, SEQ. ID. N°:
127, SEQ. ID. N°: 68, SEQ. ID. N°: 129, SEQ. ID. N°: 69, SEQ. ID.
N°: 130, SEQ. ID. N°: 70, SEQ. ID. N°: 131, SEQ. ID. N°: 71, SEQ.
ID. N°: 132, SEQ. ID. N°: 72, SEQ. ID. N°: 133, SEQ. ID. N°: 73,
SEQ. ID. N°: 134, SEQ. ID. N°: 74, SEQ. ID. N°: 135, SEQ. ID. N°:
75, SEQ. ID. N°: 136, SEQ. ID. N°: 78, SEQ. ID. N°: 139, SEQ. ID.
N°: 87, SEQ. ID. N°: 147, SEQ. ID. N°: 88, SEQ. ID. N°: 148, SEQ.
ID. N°: 89, SEQ. ID. N°: 148, SEQ. ID. N°: 90, SEQ. ID. N°: 149,
SEQ. ID. N°: 92, SEQ. ID. N°: 151, SEQ. ID. N°: 93, SEQ. ID. N°:
152, SEQ. ID. N°: 96, SEQ. ID. N°: 156, SEQ. ID. N°: 97, SEQ. ID.
N°: 157, SEQ. ID. N°: 101, SEQ. ID. N°: 161, SEQ. ID. N°: 102, SEQ.
ID. N°: 162, SEQ. ID. N°: 103, SEQ. ID. N°: 163, SEQ. ID. N°: 75,
SEQ. ID. N°: 165, SEQ. ID. N°: 104, SEQ. ID. N°: 166, SEQ. ID. N°:
105, SEQ. ID. N°: 166, SEQ. ID. N°: 106, SEQ. ID. N°: 167, SEQ. ID.
N°: 107, SEQ. ID. N°: 168, SEQ. ID. N°: 108, SEQ. ID. N°: 169, SEQ.
ID. N°: 109, SEQ. ID. N°: 170, SEQ. ID. N°: 110, SEQ. ID. N°: 171,
SEQ. ID. N°: 73, SEQ. ID. N°: 177, SEQ. ID. N°: 119, SEQ. ID. N°:
180, SEQ. ID. N°: 120, SEQ. ID. N°: 181, SEQ. ID. N°: 121, SEQ. ID.
N°: 182, SEQ. ID. N°: 119, SEQ. ID. N°: 185.
3. Procedimiento de amplificación del ADN
mitocondrial según reivindicación 1 caracterizado por el
empleo de los cebadores de amplificación SEQ. ID N°: 188 a 193.
4. Aplicaciones del array de mutaciones,
fabricado según las reivindicaciones anteriores, para análisis
genético en casos de pacientes de neuropatía óptica de Leber, con
patología probada o con sospecha clínica de patología, dentro del
campo del diagnóstico molecular, así como para todos los estudios
genético-poblacionales en los que estos marcadores
sean de interés.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200500966A ES2308868B1 (es) | 2005-04-13 | 2005-04-13 | Uso de arrays de secuencias especificas de genoma mitocondrial humano sobre soporte solido y procedimiento para la deteccion de mutaciones asociadas a la neuropatia optica de leber. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200500966A ES2308868B1 (es) | 2005-04-13 | 2005-04-13 | Uso de arrays de secuencias especificas de genoma mitocondrial humano sobre soporte solido y procedimiento para la deteccion de mutaciones asociadas a la neuropatia optica de leber. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2308868A1 ES2308868A1 (es) | 2008-12-01 |
| ES2308868B1 true ES2308868B1 (es) | 2009-10-26 |
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ID=40018992
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200500966A Active ES2308868B1 (es) | 2005-04-13 | 2005-04-13 | Uso de arrays de secuencias especificas de genoma mitocondrial humano sobre soporte solido y procedimiento para la deteccion de mutaciones asociadas a la neuropatia optica de leber. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2308868B1 (es) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185244A (en) * | 1989-12-08 | 1993-02-09 | Emory University | Genetic test for hereditary neuromuscular disease |
| US5670320A (en) * | 1994-11-14 | 1997-09-23 | Emory University | Detection of mitochondrial DNA mutation 14459 associated with dystonia and/or Leber's hereditary optic neuropathy |
-
2005
- 2005-04-13 ES ES200500966A patent/ES2308868B1/es active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185244A (en) * | 1989-12-08 | 1993-02-09 | Emory University | Genetic test for hereditary neuromuscular disease |
| US5670320A (en) * | 1994-11-14 | 1997-09-23 | Emory University | Detection of mitochondrial DNA mutation 14459 associated with dystonia and/or Leber's hereditary optic neuropathy |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FAN, J-B, et al. Paralell genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res. 2000, vol. 10, páginas 853-860. Ver todo el documento, especialmente páginas 853,854,858 y figura 1. * |
| HIRSCHHORN, J N, et al. SBE-TAGS: an array-based method for efficient single-nucleotide polymorphism genotyping. Proc. Nat. Acad. Sci. 24-10-2000, vol. 97, número 22, páginas 12164-12169. Ver todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2308868A1 (es) | 2008-12-01 |
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