ES2307347A1 - Metodo y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombotica venosa. - Google Patents
Metodo y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombotica venosa. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención describe un método in vitro para diagnosticar el riesgo de padecer un evento trombótico venoso. Este método consiste en la detección simultánea de cuatro alteraciones genéticas a partir de una muestra de ADN de un individuo y posterior análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y ensayo inmunoenzimático (ELISA). La invención también describe el kit de diagnóstico para la detección de las alteraciones genéticas asociadas al riesgo de padecer un evento trombótico venoso.
Description
Método y kit para diagnosticar el riesgo de
desarrollar una enfermedad trombótica venosa.
La invención se relaciona en general con el
diagnóstico de desórdenes trombóticos y en particular se refiere a
un método in vitro de análisis de muestras biológicas que
permite la detección simultánea de alteraciones genéticas asociadas
al riesgo de padecer un evento trombótico venoso.
La hemostasia es el resultado del equilibrio
entre factores procoagulantes y sistemas opuestos anticoagulantes,
la mayoría de estos factores son proteínas reguladas por otras que
actúan como activadores o inhibidores (Fig. 1). (1) La alteración en
el equilibrio de ambos sistemas debido a defectos genéticos o por
factores adquiridos puede dar lugar a fenómenos hemorrágicos o
trombóticos. Los individuos con alteraciones genéticas en los
factores que intervienen en el sistema anticoagulante, tienen una
situación bioquímica que provoca una activación silente del sistema
de coagulación aunque se mantengan clínicamente asintomáticos. La
hipercoagulabilidad es un estado de activación de los factores
procoagulantes, responsable de la patogénesis de los fenómenos
tromboembólicos.
La trombosis es una situación anómala por la
cual se produce una interacción entre plaquetas, fibrina y pared
del vaso sanguíneo dando lugar a la formación de un acúmulo
intravascular que origina un tapón que obstruye el flujo sanguíneo.
El acontecimiento que se produce como consecuencia de éste fenómeno
es la activación de la fibrinolisis mecanismo fisiológico que
disuelve, recanaliza y organiza el trombo.
En USA se producen 2 millones de episodios de
trombosis anualmente y se estima la mortalidad relacionada con
embolismo pulmonar en aproximadamente 60.000 casos/año, superior al
número de fallecimientos por cáncer de mama. El diagnóstico y
tratamiento de la trombosis venosa profunda (TVP) en el momento
actual supone uno de los objetivos prioritarios de la práctica
médica ya que constituye un problema de salud mayoritario (2).
La TVP afecta cada año a 1 de cada 1.000
individuos, siendo mas frecuente en ancianos y constituyendo una de
las causas mas importantes de morbilidad entre la población. La
recuperación del standard de salud después de un episodio de
embolismo pulmonar o de un síndrome postrombótico central o
periférico generalmente es incompleta provocando secuelas que
merman la calidad de vida de la población que ha sufrido episodios
de trombosis. La prevención del fenómeno trombótico es una práctica
que pretende evitar o reducir la incidencia de trombosis en
poblaciones de riesgo, disminuyendo a su vez los costes
asistenciales.
Los estados de hipercoagulabilidad hereditarios
se asocian con mayor frecuencia a trombosis venosas; sin embargo
también tienen su protagonismo en varias formas de trombosis
arterial, la mayoría asociadas a aumento en la activación de las
plaquetas y a pérdida de resistencia del endotelio vascular. El
tromboembolismo arterial puede originarse por liberación de un
trombo desde una TVP. Otra asociación descrita muy recientemente es
la trombosis venosa espontánea y la enfermedad ateroesclerótica. Se
postula que el vaso ateroescleroso activa el sistema plasmático de
la coagulación así como a las plaquetas provocando un estado
protrombótico previo a la aparición de una TVP (3).
La Trombofilia es la situación en la que se
produce la conjunción de factores genéticos junto con factores
adquiridos que precipitan la obstrucción de un vaso sanguíneo por un
coágulo. Por sí sola la alteración genética no es la responsable de
la TVP, pero predispone a ella manteniendo un estado constante de
hipercoagulabilidad a lo largo de la vida. Así la presencia de
factores genéticos protrombóticos se detecta en el 50% de los
sujetos que han sufrido un episodio de trombosis. En la mitad de
los episodios de VTP existen factores desencadenantes fácilmente
reconocibles (embarazo, cirugía, inmovilización) en los restantes
el acontecimiento se considera como idiopático o espontáneo
(4,5).
La conjunción de dos ó más factores genéticos
(mutaciones protrombóticas) multiplica por 5 el riesgo de
desarrollar una TVP ante cualquier factor desencadenante. Se puede
considerar a la hipercoagulabilidad como un proceso crónico y
sistémico con una tasa de recurrencia del 17,5% a los 2 años y del
30,3% a los 8 años del primer episodio de trombosis. En el caso de
TVP en una extremidad la recurrencia se produce en el 50% de los
casos en la extremidad contralateral. Este hecho apoya que la
situación de hipercoagulabilidad es sistémica y no provocada por
factores locales (6-8).
Los estados de hipercoagulabilidad se producen
por dos situaciones fundamentales:
- Defectos cualitativos o cuantitativos de
proteínas antitrombóticas
- -
- Déficit de antitrombina III
- -
- Déficit de proteína C
- -
- Déficit de proteína S
- Incremento en la concentración de factores
protrombóticos
- -
- Factor V Leiden (cambio G por A en la posición 1691 del gen F5)
- -
- Mutación G20210A en el gen de la protrombina
- -
- Mutación C46T en el gen F12
- -
- Mutaciones en los genes de las enzimas que regulan el metabolismo de la homocisteina (variante C677T de la metiltetrahidrofolato reductasa)
- -
- Incremento en los niveles plasmáticos de factor VII, XI, IX, VIII, von Willebrand
\vskip1.000000\baselineskip
El riesgo de trombosis es variable. En un
estudio realizado en una cohorte de familias con defectos
congénitos de proteínas de la coagulación, se refiere a una
incidencia de TVP en 1,07 x 100 pacientes/año para la deficiencia
de Antitrombina III, 0,54 para la deficiencia en proteína C, 0,50
para el déficit de proteína S y 0,30 para la resistencia a la
proteína C activada (6).
El riesgo también es diferente según las
situaciones adquiridas, así el riesgo es muy superior en la cirugía
de prótesis de cadera o de rodilla que durante el embarazo o en
vuelos de larga duración. Los individuos con más de un factor
hereditario de trombofilia tienen un riesgo muy superior de
trombosis respecto a los que solamente tienen uno (7,8).
A medida que se avanza en el conocimiento de las
bases genéticas de la trombosis, aumenta la lista de factores
relacionados. Algunos de ellos no son verdaderas mutaciones en
genes estructurales, sino polimorfismos, caracterizados por estar
presenten en más del 1% de la población estudiada (9). Por ejemplo
el polimorfismo que afecta a la sustitución de G por A en la región
3' del gen de la protrombina G20210A, esta alteración produce
incremento en la concentración de protrombina. Los polimorfismos
pueden modular los niveles plasmáticos de los factores XI, IX,
VIII, VII y von Willebrand cada uno de los cuales se asocia con un
riesgo diferente de TVP. También se han encontrado polimorfismos en
el genotipo de los grupos sanguíneos ABO que determinan aumento en
la concentración del factor von Willebrand al que se asocia riesgo
de trombosis (10). Se trata de estados individuales en los que se
produce desequilibrio en los sistemas hemostáticos. Sería deseable
disponer de un sistema que permitiera identificar el mayor número de
factores de riesgo posibles de forma conjunta mediante un método
fácil, fiable y reproductible para poder asignar de forma
individualizada un perfil genético de riesgo de hipercoagulabilidad.
Se sabe que los sujetos con factores de riesgo hereditarios tienen
una incidencia muy superior de TVP en situaciones de riesgo
adquirido que aquellos que no los tienen.
Al relacionar factores genéticos y adquiridos en
la génesis de la TVP se puede pensar que, probablemente todos los
pacientes que desarrollan TVP tienen ya una cierta predisposición
genética que es desencadenada por los factores adquiridos
correspondientes. El grado de hipercoagulabilidad es individualizado
y depende del perfil genético que se posea, siendo de bajo riesgo
si solamente presenta un defecto como por ejemplo el factor V
Leiden solamente se provocará un episodio de TVP ante un gran
estímulo como puede ser un embarazo. Por el contrario individuos con
múltiples mutaciones o polimorfismos y un estímulo mucho menor
desarrollaran episodios de TVP probablemente de forma recurrente.
El conocer la situación de riesgo de trombosis individual ayudaría
a evitar un número importante de episodios de TVP y por tanto de la
comorbilidad asociada a los mismos.
Los factores de riesgo de la trombosis venosa
son embarazo, insuficiencia cardiaca, éxtasis venoso por edemas,
síndrome nefrótico, postoperatorio, inmovilización, síndrome de la
clase turista, obesidad, traumatismo, obstrucción pélvica,
tratamiento con estrógenos, tratamiento hormonal, neoplasias,
trabajo muscular extremo, varices, anomalías anatómicas vasculares
y policitemia/trombocitemia.
Durante los últimos años se han establecido
varios marcadores moleculares como factores de riesgo genético en
el desarrollo de trombosis venosa, como se ha mencionado
anteriormente. Los factores genéticos o congénitos de
hipercoagulabilidad hacen referencia a mutaciones genéticas que
provocan alteraciones funcionales en moléculas implicadas en la
coagulación. Estas alteraciones genéticas predisponen a la persona
que las porta a padecer un evento trombótico en cualquier etapa de
su vida y en ausencia de estímulos adquiridos (obesidad, embarazo,
inmovilidad, traumatismo, otras enfermedades...). Los factores de
riesgo genético más importantes son la mutación G1691A del Factor V
Leiden, la mutación G20210A de la Protrombina II, el polimorfismo
MTHFR, el polimorfismo C46T del Factor 12, la deficiencia de la
proteína S, la deficiencia de la proteína C, la deficiencia de
Antitrombina II, la deficiencia del Plasminógeno, y la deficiencia
del Cofactor II de la Heparina.
La mayoría de los defectos congénitos están
relacionados con proteínas que intervienen en el equilibrio natural
entre procoagulantes y anticoagulantes. La mutación puntual en el
gen del F5 (G1691A), que origina un fenotipo denominado resistencia
a proteína C activada. El Factor V es una proteína implicada en la
cascada de la coagulación. La presencia de una mutación
G-A presente en el nucleótido 1691 (localizado en el
exón 10 del gen) en el gen que codifica este factor es la
responsable de la resistencia a la proteína C activada. Esta
mutación produce un cambio en la proteína en el aminoácido 506,
arginina a glutamina, que está implicado en el reconocimiento de la
proteína C activada. Esta mutación, también conocida como FV
Leiden, previene la inactivación de este factor por la proteína C
activada, lo que conduce a un estado de hipercoagulabilidad.
La mutación G20210A en el gen que codifica la
protrombina, proteína implicada en la cascada de coagulación, es
una sustitución de una base G-A en el nucleótido
20210 localizado en la región 3' no traducida del gen (11). Esta
variable alélica está asociada con un aumento de la concentración
plasmática y de la actividad de esta proteína.
Los individuos heterocigotos para este
polimorfismo tienen de 2 a 5 veces aumentado el riesgo de trombosis
venosa en ausencia de otros factores de riesgo y este riesgo aumenta
si se une a otros factores externos como la utilización de
anticonceptivos orales. Además, se ha observado que esta mutación
confiere un riesgo de recidiva de ETV (12).
El polimorfismo C46T en el gen F12 (13) está
asociado con una disminución de la concentración plasmática y de la
actividad de del Factor XII. Es la forma homocigota (individuos
portadores de los dos alelos mutados TIT) la que se asocia a un
riesgo 5 veces superior de padecer un evento trombótico
comparándolo con los individuos no portadores de este genotipo
(14). Además, este polimorfismo en su forma homocigota también se
asocia a un riesgo 4-5 veces superior de padecer
Infarto de miocardio o ictus (infarto cerebral) (15, 16).
La Homocisteinemia (C677T MTHFR) es otro factor
hereditario que conlleva aumento del riesgo de trombosis (17). Los
pacientes con hiperhomocisteinemia tienen un riesgo aumentado de
trombosis de 2 a 3 veces. Entre las causas de la
hiperhomocisteninemia se incluyen deficiencias nutricionales de
folato, vitamina B6 o vitamina B12 y defectos hereditarios en las
enzimas de la ruta metabólica de la homocisteína como la
cistationina b cintaza o la metilentetrahidrofolato reductasa
(MTHFR).
La MTHFR es una enzima reguladora implicada en
el metabolismo de la homocisteína que cataliza la reducción de
5,10-metilentetrahidrofolato a
5-metilentetrahidrofolato. Una mutación puntual
cambia C por T en el nucleótido 677 dando lugar a una sustitución de
valina por alanina en la posición 222. Esta mutación se traduce en
una pérdida de actividad enzimática (18). El efecto de esta
mutación en la trombosis venosa no está bien definido y parece que
no es un factor de riesgo independiente de trombosis venosa. El
metabolismo de la homocisteina se sitúa en la intersección de dos
vías metabólicas la de transulfuración y la de remetilación: las
mutaciones involucradas son 5-10
methylenetetrahydrofolate reductasa (MTHFR: genes C677T y Al298C),
metionin sintasa y la metionin sintasa reductasa (MTRH: gen A66G).
El aumento de homocisteina se acentúa en dietas pobres en folatos y
es un factor de riesgo de trombosis sobre todo en territorio
arterial (18).
El estudio de la presencia de factores que
predisponen a la trombosis es importante para la prevención y
posible profilaxis con tratamiento anticoagulante. La identificación
precoz de pacientes con riesgo de desarrollar trombosis y la
aplicación del tratamiento profiláctico disminuyen la morbilidad y
mortalidad asociada a esta enfermedad. El estudio directo del ADN
del sujeto podría determinar definitivamente la presencia de
ninguna, una o dos copias de uno o varios defectos genéticos.
Además es el método más adecuado para evaluar a miembros
asintomáticos pertenecientes a familias de riesgo.
La detección de estos factores de riesgo
genéticos en pacientes es de gran importancia en la rutina
hospitalaria:
- -
- Para prevenir efectos futuros en pacientes con alto riesgo de recurrencia.
- -
- Para distinguir los factores de riesgo ambientales de los factores de riesgo adquiridos, que son permanentes e irreversibles.
- -
- Para establecer tanto la duración como la intensidad de la terapia anticoagulante que podría depender de sí la causa de la trombosis es permanente o transitoria.
- -
- Para aconsejar profilaxis: dar tratamiento anticoagulante a miembros asintomáticos con alguno de estos factores genéticos de riesgo antes de periodos específicos de riesgo incrementado de trombosis, como cirugía, embarazo, uso de anticonceptivos orales o inmovilización prolongada.
Por lo tanto la existencia en los servicios
hospitalarios de tests específicos para el estudio de riesgo
trombótico (adquirido o heredado) es crucial para la evaluación
óptima de esta enfermedad. La valoración de los factores de riesgo
genético, en particular los procedimientos analíticos para la
identificación de alteraciones en el DNA genómico, está siendo ya
una parte importante en la evaluación diagnóstica de pacientes que
presentan signos y síntomas de trombosis venosa o en grupos de
riesgo.
Debido a que la demanda de estos análisis
aumenta, también crece la necesidad de métodos rápidos,
reproducibles, sencillos, automatizables, robustos y económicos que
puedan realizarse con instrumentos frecuentes en cualquier
laboratorio de diagnóstico.
El hecho de poder detectar las 4 alteraciones
genéticas, anteriormente descritas, (G1691A FV, G20210A FII, C677T
MTHFR y C46T F12), de forma simultánea, hace que el proceso de
genotipado sea mucho más rápido, eficiente y económico (20).
Actualmente no se ha descrito ningún sistema de detección de estos
4 defectos genéticos de forma simultánea. En las patentes US
5830681, US 5874256, US 6043035, US 6518016, WO /9106861, WO
95/21938 y WO 96/30546 Se describen métodos de detección de estos
defectos genéticos por separado y en las patentes US 5710028 y WO
00/18965 se describen también sistemas capaces de detectar 2 o 3
alteraciones genéticas. Entre las opciones descritas se
destacan:
- -
- Métodos basados en las técnicas PCR-RFLP o PCR alelo específica para la detección simultánea de FV Leiden y G20210A en protrombina. Además de no detectar más que dos polimorfismos, estos métodos son laboriosos y poco automatizables (analytical evaluation of primer engineered multiplex PCR.) (19).
- -
- Métodos basados en las técnica PCR a tiempo real o en microarrays. Estas técnicas son sofisticadas, costosas y requieren una alta inversión en aparatos y en personal cualificado (21, 22).
- -
- Método de análisis de las mutaciones G1691A, G20210A, C677T y 844ins68 en CBS, basados en la detección fluorescente del producto amplificado, este sistema es costoso y no es un sistema de análisis simultáneo ya que hay que realizar una reacción de amplificación por cada una de las mutaciones que se quiere estudiar (20, 23).
El método que se presenta permite la detección
de las alteraciones genéticas G1691A en el gen que codifica FV,
G20210A en gen que codifica FII, C677T en gen que codifica MTHFR y
C46T en gen que codifica FXII, alteraciones que suponen un riesgo
elevado de ETV. Este método está basado en la metodología
PCR-ELISA y es un método rápido, económico,
sencillo, robusto, que no requiere una alta inversión en equipo y
que puede ser fácilmente incluido en la rutina hospitalaria.
La presente invención proporciona un método de
diagnóstico de individuos con VTE, una herramienta diagnóstica muy
útil que será particularmente importante en el screening de
individuos asintomáticos que se sospecha que puedan desarrollar la
enfermedad. Los individuos asintomáticos de familias con historia
de VTE pueden ser testados usando este método permitiendo el
diagnóstico precoz antes de la aparición de síntomas. A los
individuos que posean alguna de estas mutaciones se les puede
aconsejar para que adopten las medidas necesarias que puedan
ayudarle a prolongar su vida.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar un método eficaz, económico y rápido para detectar el
riesgo de desarrollar una enfermedad trombótica venosa.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en una metodología capaz de detectar la ausencia/presencia de
la combinación de las siguientes alteraciones genéticas: mutación
G1691A del Factor V, la mutación G20210A de la Protrombina II, la
mutación V677T de MTHFR y el polimorfismo C46T del Factor 12.
Un aspecto de la invención lo constituye, un
método in vitro para diagnosticar el riesgo de desarrollar
una enfermedad trombótica venosa que comprende la detección de la
ausencia/presencia de la combinación de las siguientes alteraciones
genéticas: mutación G1691A del Factor V, la mutación G20210A de la
Protrombina II, la mutación V677T de MTHFR y el polimorfismo C46T
del Factor 12.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método in vitro para diagnosticar el riesgo de desarrollar
una enfermedad trombótica venosa mediante la detección de la
ausencia/presencia de la combinación de las siguientes alteraciones
genéticas: mutación G1691A del Factor V, la mutación G20210A de la
Protrombina II, la mutación V677T de MTHFR y el polimorfismo C46T
del Factor 12, dicho método comprende la extracción de ADN a partir
de una muestra biológica, la amplificación de los fragmentos de ADN
y el análisis de los fragmentos amplificados en el paso anterior
mediante ELISA.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
método in vitro para diagnosticar el riesgo de desarrollar
una enfermedad trombótica venosa que comprende la detección
simultanea de la ausencia/presencia de las siguientes alteraciones
genéticas: mutación G1691A del Factor V, la mutación G20210A de la
Protrombina II, la mutación V677T de MTHFR y el polimorfismo C46T
del Factor 12.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método in vitro para diagnosticar el riesgo de desarrollar
una enfermedad trombótica venosa mediante la detección simultánea de
la ausencia/presencia de las siguientes alteraciones genéticas:
mutación G1691A del Factor V, la mutación G20210A de la Protrombina
II, la mutación V677T de MTHFR y el polimorfismo C46T del Factor
12, dicho método comprende la extracción de ADN a partir de una
muestra biológica, la amplificación de los fragmentos de ADN y el
análisis de los fragmentos amplificados en el paso anterior
mediante ELISA.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad
trombótica venosa que comprende los reactivos necesarios para
llevar a cabo la detección simultanea de la ausencia/presencia de
las siguientes alteraciones genéticas: mutación G1691A del Factor
V, la mutación G20210A de la Protrombina II, la mutación V677T de
MTHFR y el polimorfismo C46T del Factor 12, mediante un método que
comprende la extracción de ADN a partir de una muestra biológica,
la amplificación de los fragmentos de ADN y el análisis de los
fragmentos amplificados en el paso anterior mediante ELISA.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una
enfermedad trombótica venosa que comprende las sondas con secuencia
nucleotídica según SEQ ID NO: 1-8.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Cascada de la coagulación una vez
provocada una lesión en el endotelio vascular. El equilibrio de las
proteínas C y S es crítico en la regulación de la homeostasis. En
condiciones normales, la antitrombina III (AT III) inhibe al factor
II (trombina) y a los factores Xa y IXa, de modo que la proteína C
activada junto con su cofactor la proteína S actúa como
anticoagulante por inactivación de los factores Va y VIIa.
Figura 2. Análisis mediante electroforesis en
gel de agarosa al 2% de la PCR multiplex que amplifica
conjuntamente los cuatro marcadores genéticos objeto de la
metodología desarrollada: factor V (366 pb), protrombina II (297
pb), F12 (369 pb) y MTHFR (269 pb).
Figura 3. Análisis en placa ELISA de los
productos obtenidos tras la amplificación por PCR multiplex. En
esta placa se han analizado 11 individuos con antecedentes
trombóticos que presentan diversos genotipos correspondientes a
cada uno de los factores genéticos analizados. La última columna es
un control negativo de cada una de las sondas respectivamente.
Figura 4. Parte del electroferograma obtenido
tras el análisis en un secuenciador automático AB que confirma la
presencia en heterocigosis de la mutación G1691A del Factor V,
previamente detectada mediante la metodología ELISA desarrollada en
uno de los pacientes estudiados.
Figura 5. Análisis mediante electroforesis en
gel de agarosa al 3% correspondiente a la técnica de corte con la
enzima de restricción Hinf I para la validación de la detección del
polimorfismo C677T de MTHFR. Esta enzima corta sólo el alelo mutado
generando dos fragmentos de 57 y 176 pb, mientras que el alelo
normal permanece intacto con un tamaño de 233 pb.
Figura 6. Curvas de melting que se obtienen como
resultado de la RT-PCR diseñada para el genotipado
del polimorfismo C46T del Factor XII. La gráfica de arriba muestra
un individuo homocigoto normal, la del centro un individuo
homocigoto mutado y la de abajo un individuo heterocigoto.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene como objeto
principal el desarrollo de un método in vitro para detectar
de forma simultánea cuatro alteraciones genéticas asociadas al
riesgo de trombosis venosa: la mutación G1691A del factor V, la
mutación G20210A de la protrombina, el polimorfismo C667T de MTHFR
y el polimorfismo C46T de F12.
La metodología objeto de la invención se basa en
primer lugar en el desarrollo de una PCR multiplex que amplifica
las secuencias nucleotídicas correspondientes a las regiones donde
se encuentran las alteraciones genéticas objeto de análisis y en
segundo lugar en el diseño de una serie de sondas
oligonucleotídicas capaces de hibridar con las secuencias normales
y mutadas de cada uno de los cuatro marcadores genéticos incluidos
en el diagnóstico.
La metodología a utilizar sería la siguiente
para el análisis de las cuatro alteraciones genética:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- A partir del ADN obtenido de una muestra biológica del individuo (200 pl de sangre), se procede a la utilización de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de los cuatro fragmentos correspondientes a la región génica donde se encuentran cada una de las alteraciones genéticas que van a ser analizadas (Fig. 2). Los cebadores utilizados se describen en la tabla 1.
- -
- La reacción de amplificación se lleva a cabo en un volumen final de 50 pl a partir de 250 ng de ADN en una mezcla de 10X PCR buffer (Applied Biosystems), 1,5 mM MgCl (Applied Biosystems), 0,1 mM dNTPs, 0.625 nmol dUTP-digoxigenina (Roche), 0,03 \mug/\mul cebadores Factor V, 0,015 \mug/\mul cebadores Protrombina II, 0,01 pg/pl cebadores MTHFR, 0,03 \mug/\mul cebadores C46T de F12 y 2 U de taq gold polimerasa (Applied Biosystems). Los ciclos de amplificación utilizados son: 1 ciclo de 10 min de desnaturalización a 96ºC, 40 ciclos: desnaturalización 30 segundos a 94ºC, 1 minuto hibridación a 58ºC y elongación a 72ºC durante 2 minutos y una extensión final de 72ºC durante 10 minutos.
- -
- En la misma reacción de amplificación se incorpora un nucleótido unido a digoxigenina (dUTP) que constituye un marcaje indirecto para la reacción enzimática final con peroxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- El ensayo se lleva a cabo en una placa microtriter revestida con estreptavidina (Labsystems).
- -
- Se añaden las sondas oligonucleótidicas (0,2 ng/\mul), marcadas con biotina en el extremo 5' que permiten la unión de la sonda a la placa a través de la estreptavidina, a cada pocillo correspondiente. Las secuencias nucleótidicas de las sondas están descritas en la tabla 2.
- -
- Se incuban 15 minutos a Tª ambiente.
- -
- Se procede a la desnaturalización de los productos de la PCR multiplex durante 10 minutos a 95ºC.
- -
- Se lavan los pocillos de la placa 3 veces con tampón de lavado 1X.
- -
- Se añade la solución de hibridación 0,8% SSC y el producto de PCR desnaturalizado.
- -
- Se híbrida 30 minutos a 47ºC.
- -
- Se lava 3 veces con tampón de lavado 1X.
- -
- Se añade conjugado diluido y se incuba durante 30 minutos a Tª ambiente.
- -
- Se lava 3 veces con tampón de lavado 1X.
- -
- Se añade la solución de revelado 1X y se incuba 30 min a Tª ambiente.
- -
- Se mide la absorbancia emitida tras la reacción enzimática a 405 nm en un lector de placas Multiskan RC de Labsystems.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera inspección es visual, el color verde
significa una señal positiva y si no hay color significa que no hay
señal.
Tras la inspección visual, el genotipo es
analizado por densidad óptica mediante la lectura de la placa a 405
nm.
Si estas condiciones preliminares son correctas
se puede proceder al análisis de los resultados obtenidos mediante
la siguiente relación de los valores OD obtenidos tras la lectura de
la placa:
R=
OD(normal)-OD(negativo
normal)/OD(mutado)- OD(negativo
mutado)
OD(normal) de cada muestra es el valor
obtenido del pocillo correspondiente a esa muestra en el que se ha
utilizado el reactivo 1 (sonda normal).
OD(mutado) de cada muestra es el valor
obtenido del pocillo correspondiente a esa muestra en el que se ha
utilizado el reactivo 2 (sonda mutada).
OD(negativo normal) es el valor obtenido
del pocillo correspondiente al control negativo en el que se ha
utilizado el reactivo 1 (sonda normal).
OD(negativo mutado) es el valor obtenido
del pocillo correspondiente al control negativo en el que se ha
utilizado el reactivo 2 (sonda mutada).
La interpretación de la fórmula es la
siguiente:
- -
- Si el ratio (R) es \geq a 3 el genotipo es homocigoto normal
- -
- Si el ratio (R) es \leq 2.5 y \geq 0.8 el genotipo es heterocigoto
- -
- Si el ratio (R) es \leq 0.4 el genotipo es homocigoto mutado
Este análisis es realizado utilizando un
software que permite rellenar con los datos de OD que se obtienen
del lector de placas y al que previamente se le ha suministrado un
rango de valores para cada genotipo en cada factor. De este modo
tras incluir estos datos, el programa automáticamente genera el
genotipo de cada muestra para cada uno de los cuatro factores de
riesgo de trombosis venosa analizados:
\global\parskip0.950000\baselineskip
Homocigoto normal
Heterocigoto
Homocigoto mutado
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha utilizado la metodología anteriormente
descrita para el análisis de estos marcadores de riesgo en 100
muestras clínicas correspondientes a individuos con riesgo de
padecer una trombosis venosa y a individuos de la población. El
genotipo heterocigoto para la mutación G1691A en el Factor V ha
sido detectado en varios individuos (Fig. 3).
Estos resultados han sido validados mediante la
secuenciación del fragmento de amplificación del Factor V de estos
individuos en un secuenciador automático modelo ABI 3100 (Fig.
4).
\vskip1.000000\baselineskip
El genotipo heterocigoto para la mutación
G20210A en la Protrombina II ha sido detectado en varios individuos
mediante la metodología desarrollada (Fig. 3).
Estos resultados han sido validados utilizando
una técnica alternativa para la detección de la mutación, la
digestión selectiva con la enzima de restricción Hind III.
\vskip1.000000\baselineskip
El genotipo heterocigoto del polimorfismo C677T
de MTHFR ha sido observado en un porcentaje muy elevado de muestras
estudiadas, mientras que el número de individuos homocigotos es
menor (Fig. 3).
Estos resultados han sido validados utilizando
una técnica alternativa para la detección del polimorfismo C677T
MTHFR, la digestión selectiva con la enzima de restricción Hinf I
(Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
El genotipo heterocigoto del polimorfismo C46T
del gen F12 se encuentra ampliamente representado en las muestras
analizadas y se ha observado el genotipo homocigoto mutado en
varios individuos mediante la metodología ELISA desarrollada (Fig.
3).
Inicialmente la validación técnica del Factor
XII se realizó mediante una digestión enzimática con SfaNI del
producto de PCR donde se encuentra el polimorfismo C46T, pero se
observó que sus resultados eran poco reproducibles. Con el fin de
utilizar un método más fiable y rápido se procedió a utilizar un
protocolo de PCR a tiempo real (RT-PCR) basado en
las diferentes Ta de melting de sondas alelo específicas. Las
imágenes de los resultados de este protocolo se pueden observar en
la figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Detección simultánea de alteración genética en
más de un marcador de riesgo trombótico.
En una de las muestras analizadas se ha
observado la coexistencia de genotipo heterocigoto en el FII y
mutación homocigota de MTHFR.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FV-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggacaggcg aggaataca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FV-M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggacaggca aggaataca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PII-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcagcga gcctcaat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PII-M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcagcaa gcctcaat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MTHFR-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaatcggc tgccgcag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MTHFR-M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaatcgac tgccgcag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> F12-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggacgcac gccatgagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> F12-M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggacgcat gccatgagg
\hfill19
Claims (5)
1. Método in vitro para diagnosticar el
riesgo de desarrollar una enfermedad trombótica venosa que
comprende la detección de la ausencia/presencia de la combinación de
las siguientes alteraciones genéticas: mutación G1691A del Factor
V, la mutación G20210A de la Protrombina II, la mutación V677T de
MTHFR y el polimorfismo C46T del Factor 12.
2. Método in vitro para diagnosticar el
riesgo de desarrollar una enfermedad trombótica venosa según la
reivindicación anterior que comprende los siguientes pasos:
- -
- Extracción de ADN a partir de una muestra biológica
- -
- Amplificación de los fragmentos de ADN
- -
- Análisis de los fragmentos amplificados en el paso anterior mediante ELISA.
3. Método in vitro para diagnosticar el
riesgo de desarrollar una enfermedad trombótica venosa según las
reivindicaciones anteriores donde la detección de la
ausencia/presencia de dichas alteraciones genéticas se realiza de
manera simultanea.
4. Kit para diagnosticar el riesgo de
desarrollar una enfermedad trombótica venosa que comprende los
reactivos necesarios para realizar un método según las
reivindicaciones anteriores.
5. Kit para diagnosticar el riesgo de
desarrollar una enfermedad trombótica venosa según la
reivindicación 4, que comprende las sondas con secuencia
nucleotídica según SEQ ID NO: 1-8.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402513A ES2307347B1 (es) | 2004-10-21 | 2004-10-21 | Metodo y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombotica venosa. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402513A ES2307347B1 (es) | 2004-10-21 | 2004-10-21 | Metodo y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombotica venosa. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2307347A1 true ES2307347A1 (es) | 2008-11-16 |
| ES2307347B1 ES2307347B1 (es) | 2009-09-28 |
Family
ID=39926810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200402513A Withdrawn - After Issue ES2307347B1 (es) | 2004-10-21 | 2004-10-21 | Metodo y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombotica venosa. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2307347B1 (es) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1398388A2 (de) * | 2002-08-09 | 2004-03-17 | OGHAM GmbH | Methode zur Bestimmung eines erblichen Thromboserisikos mit DNA-arrays |
-
2004
- 2004-10-21 ES ES200402513A patent/ES2307347B1/es not_active Withdrawn - After Issue
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1398388A2 (de) * | 2002-08-09 | 2004-03-17 | OGHAM GmbH | Methode zur Bestimmung eines erblichen Thromboserisikos mit DNA-arrays |
Non-Patent Citations (7)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2307347B1 (es) | 2009-09-28 |
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Effective date: 20100210 |