ES2303405B1 - Complejos de oro como marca de moleculas. - Google Patents
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Abstract
Complejos de oro como marca de moléculas de
interés biológico, medioambiental o agroalimentario y descripción de
una nueva metodología de marcaje utilizando estos complejos para
obtener moléculas marcadas oro-proteína u
oro-ADN y facilitar así la cuantificación de las
mismas donde proceda. El procedimiento de marcaje consta de dos
etapas. La primera es una mezcla y reacción de conjugación entre
los complejos de oro y proteína o hebra de ADN cumpliendo unas
relaciones molares proteína (o ADN)/complejo de oro. La segunda
etapa es la purificación mediante diálisis del conjugado obtenido.
Las moléculas marcadas siguiendo esta metodología se pueden utilizar
en diferentes ensayos de afinidad donde se lleve a cabo la
detección de antígenos de interés biológico o bien secuencias de ADN
determinantes de un patógeno. Esta invención es de aplicación a
sectores muy variados como análisis clínicos, medio ambiente o
análisis de alimentos.
Description
Complejos de oro como marca de moléculas.
El objeto de la presente invención es tanto el
uso de complejos de oro como nueva marca de moléculas, como una
metodología de marcaje utilizando dichos complejos para obtener
moléculas marcadas oro-proteína u
oro-ADN sin necesidad de agentes químicos
intermedios de enlace. Resulta de aplicación a ensayos de afinidad
principalmente en los sectores de análisis clínicos, medio ambiente
o agroalimentario.
La detección sensible de sustancias de tipo
biológico haciendo uso de ensayos de afinidad, tales como
inmunoensayos o hibridación de ADN, es muy importante en diferentes
áreas: química clínica, microbiología, genética, etc.
Para desarrollar ensayos con una alta
sensibilidad es necesario emplear reactivos marcados, o bien
antígenos o anticuerpos marcados o hebras de ADN marcadas. A pesar
de que las marcas enzimáticas son las más utilizadas, en las
pasadas décadas se han desarrollado tanto inmunoensayos como ensayos
de hibridación de ADN electroquímicos que usan marcas
electroactivas, entre ellos inmuno y genosensores.
Polarografía diferencial de pulso (DPP),
voltamperometría diferencial de pulso de barrido anódico (DPASV),
voltamperometría de onda cuadrada (SWV) y análisis de barrido
potenciométrico (PSA) son métodos electroquímicos extremadamente
sensibles, usados para la determinación de trazas de estas
marcas.
En el caso de los inmunoensayos electroquímicos
el marcaje consiste en unir el antígeno o anticuerpo con un grupo
que le proporciona electroactividad. Debe ser posible
reducir/oxidar al antígeno marcado en un rango de potenciales al
cual el antígeno no es electroactivo, lo que permite distinguir el
antígeno no marcado del marcado.
Las marcas electroactivas utilizadas para la
detección de diferentes antígenos han sido muy variadas y
comprenden cinco grupos: moléculas inorgánicas electroactivas como
el hexacianoferrato (II) (K.S. Lee, T-H Kim,
M-C Shin, W-Y. Lee,
J-K. Park, Anal. Chim. Acta, 1999, 380, 17),
marcas organometálicas como el ferricinio, cobaltocenio o ferroceno
(K. Di Gleria, H.A.O. Hill, C.J. McNeil, Anal. Chem., 1986,
58, 1203; B.Limoges, C. Degrand, P. Brossier, J. Electroanal.
Chem., 1996, 402, 175; L.X Tiefenauer, S. Kossek, C.Padeste,
P.Thiébaud, Biosens.Bioelectron., 1997, 12, 213), compuestos
orgánicos con propiedades redox tales como el
2,4-dinitrofenol o el azul de Nilo
(A.Costa-García, M.T.
Fernández-Abedul, P. Tuñón-Blanco,
Talanta, 1994, 41, 1191; M.D. Sánchez Suárez, A.
Costa-García, Talanta, 1997, 44, 909; K.
Sugawara, Y. Yamauchi, S. Hoshi, K. Akatsuka, F.Yamamoto, S.
Tanaka, H. Nakamura, Bioelectrochem. Bioenerg., 1996, 41,
167), coloides metálicos como el oro coloidal (M.B.
González-García, A.Costa-García,
Bioelectrochem. Bioenerg., 1995, 38, 389;
M.B.González-Garcia, C.
Fernández-Sánchez, A. Costa-García,
Biosens. Bioelectron., 2000, 15, 315;
M.B.González-García, A.
Costa-García, Biosens. Bioelectron., 2001,
15, 663; M. Dequaire, C. Degrand, B. Limoges, Anal. Chem.,
2000, 72, 5521) e iones metálicos como el indio (III), bismuto
(III) o cobre (II) (M.J. Doyle, H.B. Halsall, W.R. Heineman,
Anal. Chem., 1982, 54, 2318; F.J. Hayes, H.B.Halsall, W.R
Heineman, Anal. Chem., 1994, 66, 1860; E.P. Medyantseva,
E.V. Khaldeeva, N.I. Glushko, H.C. Budnikov, Anal. Chim.
Acta, 2000, 411, 13; Guo W, Song J-F, Zhao
M-R, Wang J-X (1998) Anal.
Biochem., 1998, 259, 74). Estos últimos dan lugar a métodos muy
sensibles pero el método de marcaje es muy tedioso y exige muchos
pasos de purificación. Para unir estos iones metálicos al antígeno
o anticuerpo es necesario utilizar un agente químico intermedio de
enlace
(agente quelante), el ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA), que actúa como puente entre la molécula y los iones.
(agente quelante), el ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA), que actúa como puente entre la molécula y los iones.
Si se trata de ensayos de hibridación de ADN, lo
más habitual ha sido utilizar complejos de metales o compuestos
orgánicos que se intercalan en la doble hebra, diferenciando hebra
sencilla de doble hebra, pero que no enlazan a las hebras (J. Wang,
G. Rivas, S. Cai, Electroanalysis, 1997, 9(5), 395; J.
Wang, X. Cai, G. Rivas, H. Shiraishi, Anal. Chim. Acta,
1996, 326, 141; K.M. Millan, S.R. Mikkelsen, Anal. Chem.,
1993, 65, 2317; G. Marrazza, I. Chianella, M. Mascini, Anal.
Chim. Acta, 1999, 387, 297; G. Marrazza, I. Chianella, M.
Mascini, Biosens. Bioelectron., 1999, 14, 43; K. Hashimoto,
K. Ito, Y. Ishimori, Anal. Chem., 1994, 66, 3830; P. Kara, B.
Meric, A. Zeytinoglu, M. Ozsoz, Anal. Chim. Acta, 2004, 518,
69; S. Takenaka, Y. Uto, H. Saita, M. Yokoyama, H. Kondo, W.D.
Wilson, Chem. Commun., 1998, 1111); aunque existen ciertos
compuestos orgánicos y algunos complejos de platino que se unen
químicamente a las hebras de ADN y que se pueden detectar
electroquímicamente o mediante un proceso catalítico, o bien porque
este complejo de platino actúa como agente enlazante entre la
molécula y una marca como fluoresceína, biotina, etc que se pueda
detectar electroquímicamente u ópticamente (A. Erdem, K. Kerman, B.
Meric, U.S. Akarca, M. Ozsoz, Anal. Chim. Acta, 2000, 422,
139; S.S. Babkina, N.A. Ulakhovich, E.P. Medyantseva, Y.I.
Zyavkina, J. Anal. Chem., 1999, 54(11), 1206; S. S.
Babkina, N.A. Ulakhovich, Y.I. Zyavkina, Anal. Chim. Acta,
2004, 502, 23).
Por otro lado, en las últimas décadas, ha
surgido un gran interés por el estudio de las propiedades de los
metales de transición como terapéuticos potentes. Por ejemplo, se
sabe desde hace más de 20 años que el
cis-diamonidicloroplatino (II) es activo contra el
cáncer de testículos, ovarios, cabeza y cuello (A. Prestayko, S.
Crooke, S. Carter, Academic Press, New York, 1980).
El aurotiomalato de sodio y otros complejos de
oro, como la auranofina o el aurotiosulfato, son usados en el
tratamiento de la artritis reumatoide, desde hace más de 70 años
(F. Berglof, K. Berglof, D. Waltz, J. Rheumatol., 1978, 5,
68).
Moller-Pedersen y col.
(S. Moller-Pedersen, Biochemical
Pharmacology, 1985, 34, 4319; S.
Moller-Pedersen, Annals of the Rheumatic
Diseases, 1986, 45, 712; S. Moller-Pedersen,
Biochemical Pharmacology, 1986, 35, 2407; S.
Moller-Pedersen, Biochemical Pharmacology,
1987, 36, 2661) estudiaron la unión entre la albúmina de suero
humano (HSA) y el oro procedente de sales de oro (I), tales como
aurotiomalato y aurotiosulfato de sodio, dado que estudios previos
realizados en pacientes a los que se les suministraban estas
drogas, habían sugerido que la mayor parte del oro que se
incorporaba a la circulación sanguínea estaba unido a moléculas de
albúmina. Para descubrir el mecanismo de esta unión, llevaron a
cabo una serie de estudios, in vitro y en condiciones
fisiológicas, concluyendo que la albúmina posee un sitio de gran
afinidad por el oro, con una constante de asociación K_{1} = 3 x
10^{4} mol x l^{-1}, que es el grupo tiol (SH) de la cisteína
34, y tres o más sitios de menor afinidad, cuya suma de constantes
de asociación es K_{2} = 10^{3} mol x l^{-1}.
Estos autores concluyen también que las
condiciones de pH y fuerza iónica son muy importantes para que el
aurotiomalato en disolución esté en forma de anión monomérico
(AuSH_{3}C_{4}O_{4}{}^{2-}). A pH bajos, fuerza fónica elevada
y alta concentración de aurotiomalato, se forman polímeros de bajo
peso molecular, que afectan a la interacción con la albúmina (A.
Anvarhuisen, P. Sadler, J.C.S. Dalton, 1981, 1657).
Previamente, Coffer y col. (M. Coffer, C.
Shaw, M. Eidsness, J. Inorg. Chem., 1986, 25, 333) habían
realizado estos estudios para albúmina de suero bovino (BSA) y aún
en los últimos años se ha seguido investigando en la interacción del
oro (I) con estas moléculas (J. Annapurna, S. Schraa, A.
Anvarhusein, Journal of Biological Inorganic Chemistry,
1998, 3, 9).
También se ha demostrado que complejos de oro
(I) y oro (III) poseen actividad antitumoral. El mecanismo de
actuación de estos complejos depende del tipo de ligandos que
rodean a la esfera de coordinación del átomo de oro y del estado de
oxidación del oro. Así por ejemplo, en el caso de complejos de oro
(I) con ligandos tiolatos (caso del aurotiomalato o auranofina) el
mecanismo de actuación se cree que es debido a que inhiben el
enzima ADN polimerasa y atacan a células con la mitocondria
alterada (M.J. McKeage, L. Maharaj, S.J.
Berners-Price, Coordination Chem. Rev.,
2002, 232, 127). En otros casos, complejos de oro (I) que contienen
el ion Cl^{-} como ligando actúan como droga antitumoral porque
se enlazan al ADN y producen su ruptura (C.E. Bleank, J.C.
Dabrowiak, J. Inorg. Biochem., 1984, 21, 21; C.K Mirabelli,
J.P. Zimmerman, H.R. Bartus, C-M. Sung, S.T. Crooke,
Biochem. Pharmacol., 1986, 35, 1435). En cuanto a los
complejos de oro (III), si bien también depende del tipo de
ligando, su mecanismo de actuación es similar al que presentan los
complejos de platino, es decir, se unen al nitrógeno N7 de guaninas
y citosinas vecinales (A. Schimanski, E. Freisinger, A. Erxleben,
B. Lippert, Inorganica Chim. Acta, 1998, 283, 223;
S.Carotti, A. Guerri, T. Mazzei, L. Messori, E. Mini, P. Orioli,
Inorganica Chim. Acta, 1998, 281, 90; L. Messori, F. Abbate,
G. Marcon, P. Orioli, M. Fontani, E. Mini, T. Mazzei, S. Carotti,
T. O'Connell, P. Zanello, J. Med. Chem., 2000, 43, 3541; L.
Messori, P. Orioli, C. Tempi, G. Marcon, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 2001, 281, 352) Debido a estas propiedades, se ha
estudiado extensamente la interacción de estos complejos de oro con
ADN con el fin de entender su mecanismo de actuación y así poder
encontrar otros complejos de oro que sean más eficaces en el
tratamiento de tumores cancerígenos y presenten menos efectos
secundarios que otros agentes anticancerígenos.
Hasta este momento la mención de los complejos
de oro ha ido casi exclusivamente ligado a su uso como agentes
eficaces en el tratamiento de artritis reumatoide y como agentes
anticancerígenos, así como al estudio del mecanismo de actuación de
estas drogas en el organismo. Sin embargo, también puede ir unido al
de ensayos que impliquen el uso de los mismos como marcas de
proteínas y hebras de ADN en análisis clínicos, ambientales,
agroalimentarios, etc.
El objeto de la presente patente es el uso de
complejos de oro (I) y oro (III) como marca de moléculas de interés
biológico, medioambiental o agroalimentario y se describe una nueva
metodología de marcaje sin necesidad de agentes químicos
intermedios de enlace utilizando estos complejos para obtener
moléculas marcadas oro-proteína u
oro-ADN y facilitar así la cuantificación de las
mismas donde proceda.
Para comprobar la eficacia de marcaje así como
el uso de estos complejos como marcas se pueden utilizar métodos
analíticos de detección o cuantificación entre los que se
encuentran los electroquímicos u
óptico-espectroscópicos. Entre los primeros se
destacan tres ya publicados e incluso patentados por su alta
sensibilidad.
Uno de ellos es la electrodeposición catalítica
de plata. En este sentido cabe mencionar el método desarrollado por
Costa y colaboradores (D. Hernández Santos, M.B. González García,
A. Costa García, Electrochim. Acta, 2000, 46, 607; D.
Hernandez Santos, M.B. González García, A. Costa García,
Electroanalysis, 2000, 12, nº 18, 1461; A. de la
Escosura-Mufiiz, M.B.
González-García, A. Costa-García,
Electroanalysis, 2004, 16, 1561) en el que electrodos de
pasta de carbono o de carbono vitrificado son modificados, o bien
con oro coloidal por adsorción, o con oro en disolución que ha sido
reducido en la superficie del electrodo. Este oro metálico cataliza
la reducción de plata en el electrodo. Se basa en que la presencia
del metal en el electrodo hace que el potencial de reducción de la
plata (en una disolución amoniacal) se desplace hacia potenciales
menos positivos. Esto hace que se disponga de un intervalo de
potenciales en los cuales sólo se electrodepositará plata en el
electrodo si existe metal en la superficie del mismo. La
redisolución de esta plata electrodepositada a un potencial
comprendido dentro de este intervalo, da lugar a un proceso anódico
cuya intensidad de pico está directamente relacionada con la
cantidad de metal presente en la superficie del electrodo.
Este procedimiento ha sido aplicado al
seguimiento de la reacción estreptavidina-biotina,
empleando oro coloidal como marca (M.B. González García, A. Costa
García, Biosensors & Bioelect., 2000, 15, nº
11-12, 663).
En la patente de Costa y colaboradores ES2102970
se reivindican electroensayos de determinación de oro en disolución
y de oro en partículas independientemente de que sean o no marcas
utilizadas en electroinmunoensayos de reconocimiento biológico.
Otro método que se puede utilizar para detectar
moléculas marcadas oro-proteína u
oro-ADN es la electrodeposición catalítica de
mercurio, método desarrollado por Costa y colaboradores y que es
similar al anterior pero en el que el elemento sensibilizador es el
mercurio (patente solicitada en 2004, Número de solicitud:
P200402382).
Por último, el tercer método consiste en la
electrodeposición catalítica de hidrógeno, ya utilizada para la
detección de complejos de platino (II) unidos a hebras de ADN (D.
Hernández-Santos, M.B.
González-García, A. Costa-García,
Anal. Chem., 2005, 77, 2868). Utilizando este método, el
complejo de oro "marca" sería detectado
cronoamperométricamente registrando la intensidad generada al
reducirse los protones del medio ácido en el que se registra la
señal analítica (HCl).
Es objeto de la presente invención el uso de
complejos de oro como nueva marca de moléculas de interés biológico
y una metodología de marcaje sin necesidad de agentes químicos
intermedios de enlace utilizando estos complejos para obtener
moléculas marcadas oro-proteína u
oro-ADN. Esta invención es de aplicación a
diferentes ensayos de afinidad donde se lleve a cabo la detección de
antígenos o anticuerpos de interés biológico o bien secuencias de
ADN determinantes de un patógeno. Por tanto, los campos de
aplicación de la presente invención se hallan en sectores muy
variados como el de análisis clínicos, medio ambiente o
agroalimentario.
Pueden utilizarse complejos de oro (I) y de oro
(III). Los complejos de oro (I) que tengan en su esfera de
coordinación un tiolato, como por ejemplo aurotiomalato,
aurotiosulfato, auranofina, aurotioglucosa o aurotiopropanol
sulfonato, son preferibles aunque no exclusivos para el marcaje de
proteínas con grupos tiol o disulfuro en sus moléculas. Los
complejos de oro (I) y oro (III) que contengan en su esfera de
coordinación átomos como Cl o Br y ligandos con uno o dos átomos N
dadores, como por ejemplo el cloruro trietilfosfina oro (I),
bromuro de trietilfosfina oro (I), cloruro de piridina
oro(I), tricloropiridina oro (III), complejos poliamínicos de
oro (III) o el ion tetracloroaurato, son preferibles aunque no
exclusivos para el marcaje de hebras de ADN ya que tienden a unirse
al nitrógeno N7 de las guaninas o al N1/N7 de las adeninas, y al
nitrógeno N3 de la citosina y timina.
En cuanto a la proteína a marcar puede ser
cualquier molécula que pueda actuar como antígeno o anticuerpo,
preferiblemente que contenga en su secuencia de aminoácidos grupos
tiol o puentes disulfuro, sin que esto último sea excluyente de los
casos en que estos grupos no estén presentes ya que los complejos de
oro se pueden unir a otros aminoácidos como el grupo imidazol de
las histidinas o los grupos amino en general aunque con menor
afinidad. En cuanto a las hebras de ADN, éstas pueden ser sencillas
o dobles.
La metodología de marcaje tanto de proteínas
como de hebras de ADN con los diferentes complejos de oro consta de
dos etapas: mezcla y reacción de conjugación, y purificación del
conjugado obtenido.
La mezcla entre los complejos de oro y proteína
o hebra de ADN se hace en relaciones molares proteína (o ADN):
complejo de oro comprendidas entre 1:5 y 1:10000. Dicha relación
depende del tipo de proteína o hebra a marcar y del tipo de
complejo de oro utilizado. En algunos casos como el aurotiomalato
(complejo de oro (I)) no se debe utilizar concentraciones
superiores a 5.0 x 10^{-3} M para evitar la formación de
polímeros de este complejo que eviten su reacción con la proteína o
hebra de ADN.
La reacción de marcaje o conjugación debe ser
hecha en unas condiciones de temperatura, fuerza fónica y pH
cercanos a las condiciones fisiológicas, es decir, temperatura de
37ºC, fuerza iónica 0.15M y pH 7.5. No es necesario que el medio de
reacción esté tamponado pero se debe asegurar que durante el
transcurso de la reacción no haya cambios drásticos de pH. El medio
de reacción utilizado dependerá de la solubilidad del complejo de
oro utilizado. El tiempo de reacción de conjugación necesario para
que se complete la formación de las moléculas marcadas
oro-proteína u oro-ADN se estima
alrededor de 24 horas.
La etapa de purificación de las moléculas
marcadas oro-proteína u oro-ADN una
vez transcurrida la reacción de marcaje se lleva a cabo mediante
diálisis utilizando membranas de diálisis cuyo tamaño de poro
dependerá del peso molecular de la proteína o hebra de ADN a
marcar. El objeto de esta purificación es separar la molécula
marcada oro-proteína u oro-ADN del
complejo de oro que ha quedado sin reaccionar dado que éste último
se utiliza en exceso con respecto a la proteína o ADN. La diálisis
se hace frente a una disolución idéntica a la utilizada para la
reacción de marcaje pero libre de proteína o ADN y complejo de oro.
La diálisis se lleva a cabo entre 24 y 48 horas renovando la
disolución a la que se enfrenta dos veces.
Una vez purificadas las moléculas marcadas
oro-proteína u oro-ADN se conservan
a 4ºC y protegidos de la luz. De esta forma en las moléculas
marcadas oro-proteína y oro-ADN así
formados el oro se mantiene como oro fónico y no se reduce a oro
metálico.
En la presente invención se utiliza el método de
sensibilización con plata, descrito previamente, y electrodos de
carbono vitrificado de forma preferente para detectar las moléculas
marcadas oro-proteína y oro-ADN que
se les hace participar previamente en una reacción de afinidad,
pero se pueden utilizar otros electrodos como electrodos de pasta
de carbono o electrodos serigrafiados de carbono así como otros
métodos de detección electroquímicos como la redisolución anódica
del oro previamente depositado en la superficie del electrodo, el
método de sensibilización con mercurio o la detección
cronoamperométrica de la intensidad de corriente generada por la
reducción de los protones del medio catalizada por estas moléculas
marcadas oro-proteína u oro-ADN. En
realidad, cualquier método analítico basado en la detección del
complejo de oro "marca" podría ser utilizado con el fin de
determinar la molécula marcada, sea proteína o ADN, en un ensayo de
afinidad.
El uso de complejos de oro como marca de
moléculas de interés biológico y la metodología de marcaje descrita
en la presente invención presentan la ventaja de que la metodología
de marcaje es sencilla y no necesita ningún agente químico
intermedio de enlace entre los complejos de oro y la proteína o
hebras de ADN a marcar, a diferencia de lo que ocurre en otros
casos en los que la marca es también un ión metálico. Otra ventaja
a destacar es que las moléculas marcadas
oro-proteína u oro-ADN obtenidos
siguiendo la metodología expuesta pueden ser detectados con
diferentes métodos analíticos de detección o cuantificación,
resultando en muchos casos tan sensibles como cuando se utilizan
enzimas como marcas.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra las diferentes relaciones de
marcaje del anticuerpo IgG de conejo anti-IgM
humana con aurotiomalato de sodio y su respuesta ante la
electrodeposición catalítica de plata comparada con el caso de la
BSA con marcaje 1:5.
La figura 2 muestra el esquema de la
construcción del inmunosensor para la detección de inmunoglobulina
M humana.
La figura 3 presenta un esquema de la
construcción del genosensor para el virus del SARS.
La figura 4 muestra la respuesta del genosensor
cuando se hibrida con la hebra complementaria el oligonucleótido de
30 bases que contiene una secuencia determinante del virus SARS
para tres relaciones de marcaje con aurotiomalato de sodio
diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia del procedimiento se ilustra
adicionalmente mediante tres ejemplos que no pretenden ser
limitativos de su alcance.
Este ejemplo ilustra la metodología utilizada
para marcar con aurotiomalato de sodio un anticuerpo
inmunoglobulina G de conejo (RIgG)
anti-inmunoglobulina M humana.
\vskip1.000000\baselineskip
El método consta de tres etapas:
1. Mezcla de disoluciones de RIgG y de
aurotiomalato de sodio.
Se ensayaron distintas relaciones de marcaje.
Las cantidades de reactivos mezcladas, así como las concentraciones
finales y la consiguiente relación de marcaje se reflejan en la
tabla 1:
2. La reacción de conjugación para todas las
relaciones de marcaje se realiza en un tubo eppendorf a 37ºC
durante 24 horas.
3. Purificación del producto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
La RIgG marcada con oro es separada del
aurotiomalato libre mediante un sistema de diálisis. Este sistema
consiste en la introducción del producto conjugado en un cassette
de diálisis de 10000 MWCO, sumergida en 200 ml de una disolución de
NaCl 0.15 M, cuyo pH ha sido ajustado a 7.5 con una disolución de
NaOH 0.1 M. El sistema se deja dializando durante 48 horas,
renovando la disolución de NaCl a las 24 horas.
El producto conjugado obtenido
(RIgG-Au) se conserva a 4ºC y protegido de la
luz.
Para comprobar la eficacia del marcaje, las
moléculas marcadas RIgG-Au así obtenidos son
previamente adsorbidos en un electrodo de carbono vitrificado
pretratado y se registra la señal analítica obtenida mediante la
electrodeposición catalítica de plata. La metodología seguida para
obtener la señal analítica es como sigue:
- 1.
- Pretratamiento electródico. El electrodo es pulido sobre un paño impregnado en una disolución que contiene partículas de alúmina de diámetro medio inferior a 1.0 \mum. Se repite el pulido utilizando partículas de alúmina de 0.3 \mum y posteriormente se somete a sonicación. Posteriormente, el electrodo pulido, se somete a un pretratamiento electroquímico, introduciéndolo en una disolución de HCl 0.1 M y sometiéndolo a un potencial de +1.40 V durante 2 minutos, con agitación.
- 2.
- Adsorción de la RIgG-Au sobre la superficie electródica. Una gota de 50 \mul de la disolución de proteína marcada (RIgG-Au) se coloca sobre la superficie del electrodo pretratado y se deja durante 10 minutos.
- 3.
- Acumulación de oro sobre el electrodo. Después de un lavado con una disolución de NaCl 0.15 M pH 7.5, el electrodo se introduce en una celda con 20 ml de una disolución de HCl 0.1 M y el oro, enlazado a la RIgG, es electrodepositado en la superficie electródica aplicando un potencial de deposición de -1.0 V durante 5 minutos, con agitación.
- 4.
- Etapa de oxidación en H_{2}SO_{4}. Tras un lavado con agua, el electrodo es introducido en una celda con 20 ml de una disolución de H_{2}SO_{4} 0.1 M y se le somete a un potencial oxidante de +1.40 V durante 1 minuto, con agitación.
- 5.
- Registro de la señal analítica. Se introduce el electrodo en una disolución de NH_{3} 1.0 M, conteniendo 2.0 x 10^{-4} M de nitrato de plata, y se le somete a un potencial de deposición de -0.14 V durante 1 minuto, transcurrido el cual se inicia el barrido de potenciales anódico hasta +0.30 V con una velocidad de barrido de 50 mV s^{-1}. Llevando a cabo este último paso, se registra el voltamperograma cíclico correspondiente a la señal analítica.
- 6.
- Etapa de limpieza de la superficie del electrodo. La etapa de limpieza consiste en introducir el electrodo en una disolución de KCN 0.1 M (preparada en NaOH 0.1 M) durante 2 minutos, en circuito abierto y con agitación.
El marcaje de RIgG se compara con otro realizado
para marcar albúmina de suero bovino (BSA) con aurotiomalato de
idéntica forma a como se ha llevado a cabo el de RIgG pero con una
relación de marcaje de 1:5. Para ello se mezcla una alícuota de 100
\mul de una disolución de 1.0 x 10^{-3} M de BSA con una
alícuota de 900 \mul de una disolución de 5.5 x 10^{-4} M de
aurotiomalato de sodio.
Los resultados obtenidos se muestran en la
figura 1. La relación lineal obtenida para la
BSA-Au (1:5) se encuentra en un intervalo de
concentraciones comprendido entre 2.5 x 10^{-8} M y 7.5 x
10^{-7} M, con un coeficiente de correlación lineal de 0.9994.
Cuando se trasladan las mismas condiciones para
el marcaje de RIgG con aurotiomalato de sodio (es decir, relación
de marcaje 1:5), no se obtiene señal analítica. Este hecho sugiere
que la afinidad de la RIgG por el oro es menor que la que tiene la
BSA y, por tanto, la relación de marcaje usada no es suficiente para
obtener un marcaje aceptable.
En el resto de las relaciones de marcaje
ensayadas para la RIgG, la relación obtenida entre la concentración
de RIgG-Au y la señal analítica es lineal.
Se puede observar que, a medida que aumenta la
relación de marcaje de RIgG, aumenta la pendiente de la recta
obtenida. Este hecho sugiere que al aumentar esta relación, aumenta
la cantidad de oro enlazado a la molécula de RIgG. Sin embargo, en
ningún caso se alcanza la pendiente obtenida para la
BSA-Au (1:5), lo que ratifica la mayor afinidad de
esta última molécula por el oro.
Al llegar a la relación de marcaje 1:10000, ya
no se observa diferencia con lo obtenido para 1:1000, debido a que
la molécula de RIgG alcanza una saturación de sus sitios de
enlace.
Este ejemplo ilustra la aplicabilidad del
anticuerpo RIgG marcado con aurotiomalato en el desarrollo de un
inmunosensor para determinar el antígeno correspondiente
(inmunoglobulina M humana).
El inmunosensor se construye utilizando un
electrodo de carbono vitrificado que es pretratado siguiendo la
metodología expuesta en el ejemplo 1. Un esquema del inmunosensor
se muestra en la figura 2. La relación de marcaje del anticuerpo
escogido en este ejemplo es 1:1000. El anticuerpo marcado según la
metodología descrita en el ejemplo 1 se le hace reaccionar durante
una hora con su antígeno (inmunoglobulina M humana) que ha sido
previamente adsorbido durante 15 minutos en la superficie del
electrodo pretratado. La señal analítica se obtiene siguiendo la
metodología expuesta en el ejemplo 1.
En primer lugar se ha observado el efecto que
ejerce la concentración de RIgG-Au, que se hace
reaccionar con la IgM inmovilizada, sobre la señal analítica. Para
ello, se fijó una concentración de IgM 5 x 10^{-10} M, adsorbida
durante 15 minutos, y un tiempo de reacción inmunológica de 60
minutos. En este caso se obtiene una relación lineal entre la
concentración de RIgG-Au y el valor de la señal
analítica, en un intervalo comprendido entre 5.0 x 10^{-9} M y
1.0 x 10^{-7} M de RIgG-Au, con un coeficiente de
correlación lineal de 0.9985. El límite de detección obtenido,
calculado como la concentración correspondiente a tres veces la
desviación estándar de la estima de la ordenada en el origen, es de
4.24 x 10^{-9} M de RIgG-Au.
Siguiendo el procedimiento anteriormente
descrito, manteniendo fija la concentración de la disolución de
RIgG-Au, la desviación estándar relativa del valor
de la señal analítica obtenida para una concentración de IgM de 5 x
10^{-10} M y para 5 medidas consecutivas es de 7.9%, con una
intensidad media de pico de 11.12 \muA.
Además para dos concentraciones de
RIgG-Au distintas: 5 x 10^{-8} M y 1 x 10^{-7}
M, se encontró una relación lineal entre la concentración de IgM
inmovilizada sobre el electrodo y el valor de la señal analítica.
Los intervalos lineales, así como los coeficientes de correlación
lineal, pendientes de las rectas obtenidas y límites de detección,
para ambos casos, se muestran en la tabla 2:
Como se puede observar, al aumentar la
concentración de RIgG-Au fijada, aumenta la
pendiente de la recta obtenida. Sin embargo el límite de detección
no disminuye y el intervalo lineal se acorta. Esto último puede ser
debido a que el electrodo alcanza su máxima señal (saturación del
electrodo) a aproximadamente 11 \muA, y al aumentar la
concentración de RIgG-Au, se alcanza esta saturación
más rápidamente, es decir, para menores concentraciones de IgM.
Si comparamos estos resultados, con los
obtenidos en otros trabajos (E. Abad-Villar, M.T.
Fernández-Abedul, A. Costa-García,
Biosens. Bioelectronics., 2002, 17, 797) en los que se
realiza este mismo ensayo, pero utilizando láminas de oro como
electrodo de trabajo, una RIgG con una marca enzimática (fosfatasa
alcalina) y una detección en un sistema de flujo, encontramos que
los límites de detección de IgM son similares. Cabe resaltar este
dato, ya que los inmunosensores en los que se utilizan marcas
electroactivas suelen ser menos sensibles que aquellos en los que la
marca utilizada es un enzima. Además, el electrodo de carbono
vitrificado utilizado tiene una superficie electródica
sensiblemente inferior a la de las láminas de oro, a lo que hay que
sumar la gran afinidad que tienen los electrodos de oro por las
proteínas, además de la mayor sensibilidad de los sistemas de
flujo. Esto hace que sean aún más reseñables los bajos límites de
detección alcanzados con esta marca electroactiva sobre electrodos
de carbono vitrificado.
Este ejemplo ilustra la metodología utilizada
para marcar con aurotiomalato de sodio una hebra de ADN y el uso de
la hebra en un genosensor para la detección del virus del SARS. El
oligonucleótido que se marca es sintético y consta de una secuencia
de 30 bases.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de marcaje consta de tres etapas:
1. Mezcla de disoluciones del oligonucleótido y
de aurotiomalato de sodio.
Se ensayaron distintas relaciones de marcaje.
Las cantidades de reactivos mezcladas, así como las concentraciones
finales y la consiguiente relación de marcaje se reflejan en la
tabla 3:
2. La reacción de conjugación para todas las
relaciones de marcajes se realiza en un tubo eppendorf a 37ºC
durante 24 horas.
3. Purificación del producto conjugado.
La hebra de ADN marcada con oro es separada del
aurotiomalato libre mediante un sistema de diálisis. Este sistema
consiste en la introducción del producto conjugado en un tubo de
minidiálisis de 3500 MWCO, sumergida en 200 ml de una disolución de
NaCl 0.15 M, cuyo pH ha sido ajustado a 7.5 con una disolución de
NaOH 0.1 M. El sistema se deja dializando durante 48 horas,
renovando la disolución de NaCl a las 24 horas.
La molécula marcada obtenida
(ADN-Au) se conserva a 4ºC y protegida de la
luz.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprobar la eficacia del marcaje las
moléculas marcadas ADN-Au así obtenidos son
previamente adsorbidos en un electrodo de carbono vitrificado
pretratado y se registra la señal analítica obtenida mediante la
electrodeposición catalítica de plata. La metodología seguida para
obtener la señal analítica es como sigue:
- 1.
- Pretratamiento electródico. El electrodo es pulido sobre un paño impregnado en una disolución que contiene partículas de alúmina de diámetro medio inferior a 1.0 \mum. Se repite el pulido utilizando partículas de alúmina de 0.3 \mum y posteriormente se somete a sonicación. Posteriormente, el electrodo pulido, se somete a un pretratamiento electroquímico, introduciéndolo en una disolución de HCl 0.1 M y sometiéndolo a un potencial de +1.40 V durante 2 minutos, con agitación.
- 2.
- Adsorción del ADN-Au sobre la superficie electródica. Una gota de 50 \mul de la disolución de hebra marcada se coloca sobre la superficie del electrodo pretratado y se deja durante 5 minutos.
- 3.
- Acumulación de oro sobre el electrodo. Después de un lavado con una disolución de NaCl 0.15 M pH 7.5, el electrodo se introduce en una celda con 20 ml de una disolución de HCl 0.1 M y el oro, enlazado a la hebra de ADN, es electrodepositado en la superficie electródica aplicando un potencial de deposición de -1.0 V durante 5 minutos, con agitación.
- 4.
- Etapa de oxidación en H_{2}SO_{4}. Tras un lavado con agua, el electrodo es introducido en una celda con 20 ml de una disolución de H_{2}SO_{4} 0.1 M y se le somete a un potencial oxidante de +1.40 V durante 1 minuto, con agitación.
- 5.
- Registro de la señal analítica. Se introduce el electrodo en una disolución de NH_{3} 1.0 M, conteniendo 2.0 x 10^{-4} M de nitrato de plata, y se le somete a un potencial de deposición de -0.14 V durante 1 minuto, transcurrido el cual se inicia el barrido de potenciales anódico hasta +0.30 V con una velocidad de barrido de 50 mV s^{-1}. Llevando a cabo este último paso, se registra el voltamperograma cíclico correspondiente a la señal analítica.
- 6.
- Etapa de limpieza de la superficie del electrodo. La etapa de limpieza consiste en introducir el electrodo en una disolución de KCN 0.1 M (preparada en NaOH 0.1 M) durante 2 minutos, en circuito abierto y con agitación.
Parte de los resultados obtenidos se muestran en
la tabla 4.
La relación lineal obtenida para la relación de
marcaje 1:5 se encuentra en un intervalo de concentraciones
comprendido entre 10 y 100 pg/\mul de hebra de ADN, con un
coeficiente de correlación lineal de 0.9967.
Se puede observar que cuando se aumenta la
relación de marcaje de la hebra de ADN de 1:5 a 1:100, aumenta la
pendiente de la recta obtenida y el intervalo lineal obtenido se
encuentra comprendido en un orden 10 veces menor de concentración.
Este hecho sugiere que al aumentar esta relación, aumenta la
cantidad de oro enlazado a la molécula de ADN. Para el caso de la
relación de marcaje 1:1000 en principio el intervalo lineal aumenta
hacia concentraciones más bajas pero la pendiente es menor que en
el caso de la relación de marcaje 1:100, lo que indica que dicho
intervalo está muy cerca de la saturación del electrodo. De hecho
si se aumenta 10 veces más el marcaje de la hebra de ADN, se
obtiene para una concentración de hebra de 0.1 pg/\mul una
intensidad de pico de 10.43 \muA, intensidad de pico muy cercana a
la que se obtiene en condiciones de saturación de la superficie del
electrodo.
En cuanto a la relación de marcaje 1:1 de la
hebra de ADN no mostrado en la tabla 4, la saturación del electrodo
se obtiene para una concentración de hebra 50 veces mayor con
respecto a la relación de marcaje 1:5 y 500 veces mayor con respecto
a la relación de marcaje 1:100.
Por tanto cuanto mayor es la relación de marcaje
de la hebra mayor es la señal analítica obtenida para las mismas
concentraciones de hebra ensayadas y mismo tiempo de acumulación y
por tanto, mayor sensibilidad.
A esta hebra marcada con diferentes relaciones
de marcaje se le hace hibridar con una hebra sonda complementaria
adsorbida previamente en la superficie de un electrodo de carbono
vitrificado, pretratado como se ha explicado antes. Para ello una
gota de 50 \mul de la hebra sonda de una concentración de 0.9
ng/\mul se deposita en la superficie del electrodo durante una
hora y después de una etapa de lavado con una buffer de 2xSSC se le
hace hibridar con la hebra marcada con aurotiomalato durante 30
minutos depositando sobre el genosensor una alícuota de 50 \mul de
esta hebra complementaria en una concentración determinada
(disuelta en una disolución reguladora 2xSSC). La señal analítica
se obtiene de idéntica forma a la explicada anteriormente. Un
esquema del genosensor se muestra en la figura 3.
Utilizando este genosensor se han probado tres
relaciones de marcaje de la hebra de ADN del virus SARS con una
concentración determinada. Los resultados se muestran en la figura
4. Se puede observar que al aumentar la relación marcaje de 1:100 a
1:1000 la respuesta del genosensor es muy parecida pero para una
concentración de la hebra con un marcaje 1:100, que es diez veces
mayor que la que está marcada con una relación de marcaje de
1:1000. Es decir, al igual que pasaba con la adsorción directa de
la hebra marcada en la superficie del electrodo, a mayor relación
de marcaje, mayor sensibilidad. Sin embargo, cuando se compara la
relación de marcaje 1:1000 con el 1:10000, en este caso la
respuesta del genosensor es similar para la misma concentración de
hebra ensayada. Aunque cualquier relación de marcaje seria
factible, la utilización de uno u otro dependerá de la sensibilidad
requerida.
Utilizando una relación de marcaje de la hebra
con aurotiomalato 1:1000 se ha valorado la respuesta del genosensor
para diferentes concentraciones de hebra de ADN marcada pudiendo
detectarse hasta 50 pg (10 pg/\mul) de la hebra complementaria
del virus del SARS marcada con aurotiomalato (1:1000). La
reproducibilidad interelectródica obtenida para una concentración
de 50 pg/\mul de hebra complementaria del virus del SARS marcada
con aurotiomalato (1:1000) es del 10%, expresado en términos de
desviación estándar relativa.
Con el marcaje descrito en este ejemplo de la
invención es posible distinguir secuencias de oligonucleótidos (30
bases) que tengan tres bases diferentes a la hebra complementaria,
obteniéndose una señal analítica que disminuye entre el 64 y el 45%,
dependiendo de la concentración ensayada. Para una concentración de
50 pg/\mul la señal analítica disminuye un 60%. En el caso de que
la hebra ensayada tenga una base diferente, la señal analítica
disminuye un 90% con respecto a la obtenida con una hebra
complementaria, pero utilizando condiciones de hibridación más
estringentes, es decir, cuando la hibridación se lleva a cabo en
una disolución reguladora de 2xSSC de pH 7.2 que contiene un 50% de
formamida.
Claims (7)
1. Uso de complejos de oro en estado de
oxidación +1 ó +3, indistintamente, cuyo átomo de oro tiene, en su
esfera de coordinación, al menos un grupo tiolato o bien uno o más
átomos de cloro o bromo y uno o más ligandos con átomos de
nitrógeno dadores, para marcar moléculas de interés analítico.
2. Uso de complejos de oro, según reivindicación
1, caracterizado porque las moléculas a marcar pueden ser
proteínas que pueden actuar como antígenos o anticuerpos, o como
hebras sencillas o dobles de ADN.
3. Procedimiento de marcaje de moléculas de
interés analítico utilizando los complejos de oro de la
reivindicación 1, caracterizado porque comprende dos fases:
una primera en la que se realiza una mezcla en una relación molar
proteína o ADN:complejo de oro comprendida entre 1:5 y 1:10000, en
unas condiciones de reacción como pH, temperatura y fuerza fónica
similares a las fisiológicas durante 24 horas y sin utilizar
agentes químicos intermedios de enlace entre la proteína o ADN y el
complejo de oro; y una segunda etapa de purificación mediante
diálisis de las moléculas marcadas oro-proteína u
oro-ADN.
4. Uso de las moléculas marcadas, obtenidas por
el procedimiento de la reivindicación 3, en ensayos de afinidad o
hibridación.
5. Uso de las moléculas marcadas, según
reivindicación 4, caracterizado porque en los ensayos de
afinidad o hibridación se puede utilizar cualquier método analítico
para la detección o cuantificación de las moléculas marcadas
oro-proteína u oro-ADN.
6. Uso de las moléculas marcadas, según
reivindicación 5, caracterizado porque la detección o
cuantificación de las moléculas marcadas
oro-proteína u oro-ADN se lleva a
cabo usando la electrodeposición catalítica de plata o mercurio o
la reducción catalítica de hidrógeno.
7. Uso de las moléculas marcadas, según
reivindicación 6, caracterizado porque para la
electrodeposición catalítica se utilizan electrodos de pasta de
carbono, de carbono vitrificado o electrodos serigrafiados de
carbono como transductores de la señal eléctrica y/o soportes de
las correspondientes reacciones de afinidad.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501725A ES2303405B1 (es) | 2005-07-06 | 2005-07-06 | Complejos de oro como marca de moleculas. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501725A ES2303405B1 (es) | 2005-07-06 | 2005-07-06 | Complejos de oro como marca de moleculas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2303405A1 ES2303405A1 (es) | 2008-08-01 |
| ES2303405B1 true ES2303405B1 (es) | 2009-06-12 |
Family
ID=39637007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200501725A Active ES2303405B1 (es) | 2005-07-06 | 2005-07-06 | Complejos de oro como marca de moleculas. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2303405B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5298135A (en) * | 1992-07-07 | 1994-03-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Production of electrophoretically-homogenous protein-colloidal gold complexes |
| AU728515B2 (en) * | 1995-09-28 | 2001-01-11 | Redox Pharmaceutical Corporation | Metal complexes as cysteine protease inhibitors |
-
2005
- 2005-07-06 ES ES200501725A patent/ES2303405B1/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ESCOSURA-MUÑIZ, ALFREDO DE LA y col. Electrocatalytic detection of aurothiomalate on carbon electrodes. Application as a non- enzymatic label to the quantification of proteins. Analytica Chimica Acta 25.10.2004, Vol.524, N$^{o}$1-2, páginas 355-363, ISSN 0003-2670. * |
| RONCONI L. y col. Gold dithiocarbamate derivatives as potential antineoplastic agents: design, spectroscopic properties, and in vitro antitumor activity. Inorganic Chemistry Marzo 2005, Vol. 44, N$^{o}$6, páginas 1867-1881. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2303405A1 (es) | 2008-08-01 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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Date of ref document: 20080801 Kind code of ref document: A1 |