ES2303140T3 - Nueva proteina centromerica denominada shugoshina. - Google Patents

Abstract

Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. n°: 2.

Description

Nueva proteína centromérica denominada shugoshina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una proteína Sgo1 protectora (shugoshina) de la cohesina Rec8 procedente de la escisión de la levadura Schizosaccharomyces pombe, a su homólogo y parálogo con actividad reguladora de segregación cromosómica.

Técnica anterior

En los eucariotas, la cohesión de la cromátide asociada se crea durante la fase S del ciclo celular y se mantiene en toda la fase G2 hasta la M. Durante la mitosis, esta cohesión se destruye a lo largo de toda la longitud del cromosoma, lo que permite a la cromátide asociada segregar a los lados opuestos de la célula (división isométrica) y que asegura que cada célula asociada reciba una copia de cada cromosoma. En cambio, la meiosis comprende dos rondas de segregación cromosómica después de una sola ronda de replicación de ADN, que conduce a la formación de cuatro gametos haploides procedentes de una célula germinativa diploide. Durante la meiosis I, los cromosomas homólogos (homólogos) se emparejan para recombinarse, formar el quiasma en el que una cromátide asociada procedente de un homólogo se une por enlace covalente a una cromátide procedente de otro homólogo. Por consiguiente, para que los homólogos segreguen en la meiosis I, es necesario que se disocie la cohesión de la cromátide asociada a lo largo de los brazos del cromosoma para resolver la quiasma. Sin embargo, la cohesión de la cromátide asociada se conserva en el centrómero hasta la meiosis II, y utiliza la cohesión centromérica residual cuando se segrega la cromátide asociada, de la misma manera que lo hace en la mitosis. De este modo, la división meiótica requiere la cohesión de la cromátide asociada para que se disocie en dos etapas. Sin embargo, el mecanismo molecular para la protección de la cohesión centromérica solamente durante la meiosis I y solamente en el centrómero ha quedado sin aclarar (por ejemplo, véase Annu. Rev. Genet. 35, 673-745 (2001)).

Existen importantes claves en lo que se refiere a la naturaleza molecular en la cohesión de la cromátide asociada y el mecanismo que disocia la cohesión de la cromátide asociada al comienzo de la anafase (por ejemplo, véase Annu. Rev. Genet. 35, 673-745 (2001); Curr. Opin. Cell. Biol. 12, 297-301 (2000); Curr. Biol. 13, R104-14 (2003); Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17, 753-77 (2001); Genes Dev. 16, 399-414 (2002)). En varios eucariotas, la cohesión de la cromátide asociada depende de un complejo de la multisubunidad cohesina e incluye a Scc1 (Rad21 en la escisión de la levadura Schizosaccharomyces pombe). La degradación dependiente del complejo (APC) que estimula la anafase de la securina, Cut2/Pds1, permite disociar la Cut1/Esp1 endopeptidasa (separasa), que a su vez escinde a Rad21/Scc1, disociando la cohesión de la cromátide asociada. Durante la meiosis, la subunidad de cohesión Rad21/Scc1 es reemplazada por una contrapartida meiótica, Rec8 (por ejemplo, véase Cell 98, 91-103 (1999); Mol. Cell. Biol. 19, 3515-3528 (1999); Nature 400, 461-4 (1999); Genes Dev. 15, 1349-60 (2001); J. Cell. Biol. 160, 657-70 (2003)). Como el complejo Rec8 reside solamente en el centrómero después de la meiosis I y la eliminación de Rec8 destruye la cohesión centromérica, la presencia de Rec8 en el centrómero se cree que proporciona persistencia de la cohesión en toda la meiosis I (por ejemplo, véase Nat. Cell. Biol. 1, E125-7 (1999)). Varias líneas de prueba sugieren que Rec8 a lo largo de los brazos del cromosoma es escindido por la separasa en la anafase I mientras que Rec8 centromérica está protegida específicamente hasta la metafase II (por ejemplo, véase Cell. 103, 387-98 (2000); Embo. J. 22, 5643-53 (2003)). La levadura SPO13 en germinación ha sido involucrada en la protección de Rec8 centromérica (por ejemplo, véase Genes Dev. 16, 1659-71 (2002); Genes Dev. 16, 1672-81 (2002)), pero SPO13 no es centromérica y puede funcionar indirectamente. La MEI-S332 de Drosophila es una proteína que reside en el centrómero, es requerida para la persistencia de la cohesión centromérica durante la meiosis I y tiene propiedades de un protector experimental de la cohesión meiótica centromérica, aunque los detalles de dicha protección no se han aclarado hasta el momento (por ejemplo, véase Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17, 753-77 (2001); Cell 83, 247-256 (1995)). A pesar de la terminación de los proyectos de secuenciado genómico en varios organismos, no ha surgido ningún homólogo de estas proteínas, que impida a la formulación de una vista generalizada de la protección. Simultáneamente, los estudios en escisión de la levadura han aclarado la importancia de la heterocromatina pericentromérica para la incorporación de complejos centroméricos de Rec8 y asegurar la cohesión centromérica durante la meiosis I (por ejemplo, véase Science 300, 1152-5 (2003)). Sin embargo, la heterocromatina pericentromérica no puede proporcionar sola la protección específica de Rec8 en la meiosis I hacia la meiosis II.

Exposición de la invención

Casi todos los eucariotas incluyendo el humano se reproducen por reproducción sexual predominante de manera evolutiva con una mezcla de genoma. La meiosis que reduce el número de cromosomas a la mitad es una parte central del mecanismo de reproducción sexual. En la mitosis somática, dos cinetocoros de la cromátide asociada son captados por el microtúbulo del huso extendido desde los polos opuestos y la cromátide asociada se segrega uniformemente a ambos polos disolviendo simultáneamente la cohesión de los brazos y cinetocoro (división isométrica). En cambio, en la meiosis I los centrómeros de las cromátides asociadas son captados por el microtúbulo del huso extendido en el mismo polo y segregado al mismo polo a la vez que conserva la cohesión en el centrómero (división meiótica). A continuación, durante el primer momento en la meiosis II se disuelve la cohesión de la parte del centrómero de la cromátide asociada y se separa hacia un polo o el otro de los dos polos respectivamente, lo que culmina en la generación de cuatro gametos haploides aproximados. La división meiótica específica para la meiosis es una modalidad de segregación cromosómica conservada en casi todos los eucariotas, desde la levadura hasta el hombre, sin embargo el mecanismo regulador a nivel molecular ha continuado siendo un enigma desde hace mucho tiempo. El presente inventor ha demostrado que el factor de cohesión cromosómico específico para la meiosis, cohesina desempeña una función esencial en esta regulación utilizando levadura de escisión (Nature 400, 461-4 (1999); Science 300, 1152-5 (2003); Nature 409, 359-363 (2001)). Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar la proteína Sgo1 (shugoshina) con cinetocoro nuevo específico para la meiosis procedente de la levadura de escisión Schizosaccharomyces pombe y un homólogo o parálogo de la misma con actividad reguladora de segregación cromosómica, como factor que asegura la retención de la unidirección y cohesión en el centrómero asociado en la meiosis I en cooperación con la cohesina.

La meiosis comprende dos etapas de divisiones nucleares especializadas para producir gametos haploides. Para llevar a cabo esto, es necesario que la cohesión de la cromátide asociada se disocie paso a paso, en primer lugar en los brazos del cromosoma en la anafase I y en segundo lugar en los centrómeros en la anafase II. En particular, los factores que protegen la cohesión centromérica durante la meiosis I han permanecido hasta ahora sin disolver. Para esclarecer estas proteínas que protegen a Rec8 durante la anafase, el presente inventor identificó en los genes de la levadura de escisión un gen que inhibe el crecimiento mitótico y evita la separación de la cromátide asociada en la anafase, cuando se expresa conjuntamente con Rec8. En este método, se identificó la proteína específica para la meiosis que es un protector de Rec8 en la levadura de escisión y protege la Rec8 centromérica (Shugo) de la degradación en la anafase I y se denominó Sgo1 (Shugoshina, en japonés "espíritu guardián"). Se identificó también que la Shugoshina desempeña una función importante en la segregación mitótica del cromosoma y a continuación se identificó un homólogo de la levadura Sgo1 en germinación y un parálogo Sgo2 mitótico de la levadura de escisión. Se identificó una similitud marginal entre Sgo1 y MEI-S332 de Drosophila, y el homólogo Sgo1 en otros eucariótidas. Las proteínas similares a la Shugoshina en las células animales, que se previeron a partir de la secuencia, también presentan conservación funcional con la Shugoshina de la levadura. La presente invención se ha completado de este modo basándose en este conocimiento.

En la presente memoria se describe (1) un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 y con una actividad reguladora de segregación cromosómica; (2) un ADN que comprende una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 1 o una secuencia complementaria de la misma; (3) un ADN que contiene parte o toda una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 1 o una secuencia complementaria de la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica; (4) un ADN que se hibrida con el ADN según "2" en condiciones severas y que codifica una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica. La presente invención se refiere a (5) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2; y (6) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 y que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica.

Asimismo, en la presente memoria (7) se describe un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 4, (b) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 4 y con actividad reguladora de segregación cromosómica; (8) un ADN que comprende una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 3 o una secuencia complementaria de la misma; (9) un ADN que contiene parte o toda una secuencia de bases representada en la SEC. ID. nº: 3 o una secuencia complementaria de la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica; (10) un ADN que se hibrida con el ADN según "8" en condiciones severas y que codifica una proteína que tiene actividad reguladora de segregación cromosómica. La presente invención se refiere también a (11) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 4; y (12) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 4 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

Asimismo, en la presente memoria (13) se describe un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6, (b) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6 y con actividad reguladora de segregación cromosómica; (14) un ADN que comprende una secuencia de bases represenada en la SEC. ID. nº: 5 o una secuencia complementaria de la misma; (15) un ADN que contiene parte o toda una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 5 o una secuencia complementaria de la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica; (16) un ADN que se hibrida con el ADN según "14" en condiciones severas y que codifica una proteína que tiene actividad reguladora de segregación cromosómica. La presente invención se refiere además a (17) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6; y (18) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

Asimismo, en la presente memoria (19) se describe un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20, (b) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20; (20) un ADN que comprende una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 7, nº: 9, nº: 11, nº: 13, nº: 15, nº: 17 o nº: 19 o una secuencia complementaria de la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica; (21) un ADN que contiene parte o toda una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 7, nº: 9, nº: 11, nº: 13, nº: 15, nº: 17 o nº: 19 o una secuencia complementaria de la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica; (22) un ADN que se hibrida con el ADN según "7", "9", "11", "13", "15", "17" o "19" en condiciones severas y que codifica una proteína que tiene actividad reguladora de segregación cromosómica. La presente invención se refiere incluso además a (23) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20, y que tiene actividad reguladora de segregación cromosómica; y (24) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

Además, la presente invención se refiere a (25) una proteína de fusión en la que la proteína según "5", "6", "11", "12", "23" ó "24" se une a una proteína marcadora y/o a una etiqueta peptídica; (26) un anticuerpo que se une específicamente a la proteína según "5", "6", "11", "12", "23" ó "24"; y (27) el anticuerpo según "26", que es un anticuerpo monoclonal.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una serie de fotografías que demuestran que las cromátides asociadas no se segregan durante la mitosis por expresión conjunta de Sgo1 y Rec8 en la presente invención. a.) Las cepas cen2-GFP que expresan los genes indicados por los activadores endógenos (un activador constitutivo de cromatina para rad21+ o rec8+, y un activador represor de tiamina Pnmt1 para Sgo1+) se sembraron en una placa con tiamina agotada. b.) Se cultivaron muestras de células Padh1-rec8+ y Pnmt1-sgo1+ durante 15 horas a 30ºC después de agotar la tiamina. La falta de segregación de cen2-GFP (asterisco) se identificó en las células de cruce tabicadas. c.) Las faltas de segregaciones de cen2-GFP se contaron (n>100). d.) Se cultivaron las cepas Padh1-rec8+-GFP con o sin la utilización de Pnmt1-sgo1+ de la misma manera que (b). Se presentan las muestras de células en la interfase y en la anafase.

La Figura 2 es una serie de fotografías que demuestra que la segregación de la cromátide asociada se emprendió en la mitosis por expresión de la Rec8 no escindible. Se integró el plásmido pREP41-rec8-RDRD (que expresa la Rec8 no escindible (Embo. J. 22, 5643-53 (2003))) en el cromosoma de las cepas de la célula cen2-GFP (+Rec8-RDRD), y las células se sembraron en placas con o sin la presencia de tiamina. Las células de la cepa hospedadora (-Rec8-RDRD) se cultivaron del mismo modo como referencia. Obsérvese que Rec8-RDRD se expresó solamente en la placa sin tiamina. Se cultivaron muestras de las células en medio de cultivo durante 15 horas a 30ºC después de la eliminación de tiamina.

La Figura 3 es una serie de fotografías que demuestran que se requiere sgo1 de la presente invención para proteger a Rec8 y de este modo la cohesión en los centrómeros aumenta durante la anafase de la meiosis I. a.) Como para uno de los homólogos marcados con cen2-GFP, se observó segregación durante la meiosis en células naturales y sgo1\Delta (n>170). Se ilustra un modelo de segregación normal de cen2-GFP (izquierda). Se presentan muestras de células sgo1\Delta (derecha). b.) La separación de los puntos de cen2-GFP asociados después de la meiosis I (interrupción de mes1\Delta) es evidente en las células sgo1\Delta. c.) La señal de Rec8-GFP se observó en las células indicadas en la anafase I tardía (n>30) y en la prometafase II (n>100), y se hizo el recuento de la frecuencia del Rec8-GFP centromérica presentada en las células. Se observaron los husos mediante la expresión de CFP-Atb2 (\alpha2-tubulina) (Curr. Biol. 11, 836-45 (2001)). d.) Las concentraciones de Rec8-GFP en todos los puntos cromosómicos indicados en las células interrumpidas se midieron antes de la meiosis I (interrupción de mei4\Delta) por análisis ChIP con utilización de anticuerpos anti-GFP. El panel inferior presenta esquemáticamente el cromosoma I de Schizosaccharomyces pombe y los cebadores (cnt, imr, dg, dh, lys1, mes1) se utilizaron aquí.

La Figura 4 es una serie de fotografías que demuestra que Sgo1 de la presente invención se localiza en las zonas pericentrómeras durante la meiosis I. a.) Se tomaron muestras de la meiosis simultánea de las cepas de células pat1-114/pat1-114 diploides (Embo. J. 22, 5643-53 (2003)), se controló la división nuclear meiótica por tinción con DAPI y se detectó el nivel de proteínas de Sgo1 por inmunoelectrotransferencia Western mediante la utilización de anticuerpos anti-Sgo1. b.) Sgo1 (verde) se tiñó por contraste con tubulina (rojo) y DAPI (4'6'-diamidino-2-fenilindol) (azul) en las etapas indicadas en las células meióticas. c.) Se examinó una célula sgo1+-GFP que se expresa conjuntamente con mis6+-CFP bajo microscopia de fluorescencia. Se asociaron Sgo1-GFP (verde) y Mis6-CFP (rojo). d.) Las concentraciones de Sgo1-GFP en todos los puntos cromosómicos indicados en las células detenidas en la metafase I se midieron por el análisis ChIP con la utilización de anticuerpos anti-GFP. Se utilizaron los mismos cebadores que para la Fig. 2d en el sincronismo con cebadores adicionales a mat (zona de heterocromatina en el locus de tipo emparejamiento) y TAS (secuencia asociada al telómero). e.) Se detectó el Sgo1-GFP (verde) en la metafase I en las células indicadas que expresan a CFP Atb2 para visualizar los husos (rojo). f.) Rec8-HA se expresó con o sin Sgo1-FLAG en las células proliferantes y los extractos se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-FLAG. g.) Modelo para la acción de shugoshina en la meiosis. La shugoshina protege los complejos de Rec8 centroméricos de la escisión por la separasa al comienzo de la anafase I, de este modo mantiene la cohesión centromérica hasta la meiosis II. La shugoshina se degrada dependiendo de la APC durante la anafase I.

La Figura 5 es una serie de fotografías que demuestran el cambio en función del tiempo de los niveles de expresión de Sgo1 y Rec8 en el cultivo simultáneo de las cepas haploides de la célula pat1-114 (wt), y de las células cut1-206 o Prad21-slp1. La expresión de slp1+ (homólogo CDC20 de la levadura de escisión requerido para la activación de la APC (Mol. Cell. Biol. 17, 742-50 (1997)) se representó durante la meiosis en las células Prad21-slp1 en las que el activador slp1 fue remplazado por rad21. La división nuclear meiótica fue controlada mediante tinción con DAPI y las concentraciones en proteína de Sgo1, Rec8 y tubulina (referencia) se midieron por electroinmunotransferencia Western mediante la utilización de anti-Sgo1, anti-Rec8 y anticuerpos anti-tubulina, respectivamente. Aunque las células cut1-206 junto con la cinética normal condujeron a la degradación de Sgo1, se retardó la degradación de Rec8. Las células Prad21-slp1 presentaban degradación retardada de Sgo1 así como Rec8. Las cabezas de flecha indican un producto de escisión de Rec8 por la separasa Cut1.

La Figura 6 es una serie de fotografías que demuestran que la expresión ectópica de sgo1+ inhibe el crecimiento del mutante cut1-206. El activador sgo1+ cromosómico fue sustituido por Pnmt1 o Pnmt41 (versión más débil de Pnmt1) y se examinó el efecto del crecimiento mitótico en las células cut1-206 sensibles a la temperatura. Se sembraron las células indicadas en una placa sin tiamina y se cultivaron durante 3 días a 28ºC. Las células cut1-206 que expresan de forma moderada a Sgo1 por Pnmt1, interrumpieron el crecimiento mitótico incluso a la temperatura permitida, mientras que las células cut1+ crecieron normalmente.

La Figura 7 es una serie de fotografías que demuestran que Sgo2 de la presente invención desempeña una función importante en la mitosis en el centrómero. a.) Diluciones en serie de los cultivos indicados se sembraron como puntos en placas YEA que contenían 0, 5 ó 10 \mug/ml de TBZ, y se cultivaron durante 3 días a 30ºC. b.) Las cepas indicadas se sembraron en placas YEA y se cultivaron durante 3 días a 30ºC. c.) Se detectó Sgo2-GFP (verde) en la anafase I en células de tipo natural y bub1\Delta que expresa a CFP-Atb2 para observar los husos (rojo). El ADN se tiñó con Hoechst (azul). Se presentan también células de tipo natural en anafase. d.) Las células sgo2+-GFP mis6+-HA se fijaron y se tiñeron con anticuerpos anti-GFP y anti-HA. e.) Se midieron las concentraciones de Sgo2-GFP en todos los puntos cromosómicos indicados en las células interrumpidas en la prometafase o en las células no simultáneas mediante análisis ChIP.

La Figura 8 es una serie de fotografías que presentan los resultados del análisis de shugoshina ScSgo1 de la levadura en germinación de la presente invención. a.) Diploides ScSGO1-GFP de la levadura en germinación en proliferación se fijaron con metanol y se tiñeron por contraste con DAPI. b.) Se fijaron las células ScSGO1-Myc NDC10-HA y se tiñeron con DAPI y anticuerpos contra Myc y HA. c.) Los diploides ScSGO1-GFP que producen la meiosis en el medio de cultivo se fijaron con metanol y se tiñeron por contraste con DAPI. d.) Diluciones en serie de los cultivos indicados se sembraron por puntos en placas YPD que contenían 0 ó 15 \mug/ml de benomilo. e.) Se analizó la pérdida de cromosomas en los mutantes de tipo natural (wt) y Scsgo1\Delta mediante un ensayo de sectorización de colonias. La pérdida de fragmentos cromosómicos no esenciales produjo un sector rojo en una colonia blanca. Como referencia positiva, se utilizó ubr1\Delta mutante (Nature 410, 955-9 (2001)). Las frecuencias de las colonias de sectorización se presenta en la parte inferior (n>120). f.) Muestras de segregación de cenV-GFP en tetradas Scsgo1\Delta. Los modelos de segregación en tetradas se clasificaron en su mayor parte como uno de los tres mostrados en la parte inferior. Se muestra también cada población (n=200). g.) Los diploides ScSGO1-Myc fueron producidos por meiosis simultánea y se examinó la segregación de cenV-GFP marcada en uno de los dos homólogos en la meiosis I y la meiosis II. Aunque la mayoría de las células produjeron el modelo de segregación de reducción en la meiosis I (96%, n=207), la frecuencia de falta de segregación fue superior en la meiosis II (34%, n=322). h.) Las células marcadas con cenV-GFP en ambos homólogos fueron producidas para la meiosis y se tiñeron por contraste con anticuerpo anti-tubulina y DAPI. Las células en la anafase I tardía se examinaron por los puntos de cenV-GFP. Las células ScSGO1-Myc mostraron frecuentemente puntos de división en cenV-GFP en el par de cromátides asociadas (72%, n=138), mientras que las células de referencia naturales no (<2%, n=106).

La Figura 9 es una serie de fotografías que muestran secuencias de las zonas superenrolladas del terminal amino y de las zonas básicas del terminal carboxi de proteínas similares a la shugoshina en varios organismos. Las secuencias primarias de las zonas del terminal amino de Sgo1 se conservan en la Schizosaccharomyces pombe (Sgo1 y Sgo2), levadura en germinación (ScSgo1) y Neurospora crassa (B23G1.060), mientras que las secuencias que contienen MEI-S332 en otras especies no se conservan, todas llevan supuestamente el motivo superenrollado (previsto por el programa COILS (Science 252, 1162-4 (1991))). Véanse las cabezas de la flecha, asteriscos y círculos en las fotografías.

La Figura 10 es una fotografía que muestra los resultados del examen de las mutaciones de sgo1 que se generaron en las zonas conservadas. Tanto las células h+sgo1\Delta y h-sgo1\Deltacen2-GFP transformadas con el plásmido indicado, se mezclaron en placas SPA y se controlaron para la segregación de cen2-GFP en la meiosis II. Un plásmido que lleva pREP81 una versión débil del activador nmt1 reprimible por tiamina se utilizó para expresar sgo1. Las células de referencia que llevan el plásmido pREP81-sgo1 (wt) presentaban casi el 80% de segregación en la meiosis II, mientras que las células que no expresan ninguna segregación del alelo sgo1 presentaban segregación aleatoria (50% de segregación). Algunas de las mutaciones probadas, excepto la mutación 297TA de la zona no conservada, no complementaron a sgo1\Delta en este ensayo. Se muestran las medias de dos experimentos independientes (n>100).

La Figura 11 (a) es una fotografía que muestra la representación esquemática de las proteínas de la familia shugoshina. Un superenrollamiento (rojo) previsto y una zona básica (azul) conservada existe en las zonas del terminal N y del terminal C respectivamente. Además, la figura 11 (b) es una fotografía que muestra el resultado del análisis en los extractos de células HeLa por electroinmunotransferencia Western después de la transfección con ARNsi.

La Figura 12 es una serie de fotografías que presenta los resultados en los que las células HeLa se tiñeron (verde) con anticuerpo contra hSgo1 o hSgo2 preparados a partir de conejo, teñidas simultáneamente con anticuerpo de tubulina y DAPI, y a continuación respectivamente teñidas conjuntamente con huso (rojo) y ADN cromosómico (azul). Entre tanto, las células se fijaron con paraformaldehído.

La Figura 13 es una serie de fotografías que presenta los resultados de las células HeLa en la prometafase y metafase teñidas con anticuerpos contra hSgo1 o hSgo2 (verde) y simultáneamente teñidas conjuntamente con anticuerpos contra la proteína CENP-A del centrómero (a, c; rojo), anticuerpos contra la proteína pasajera Aurora B del cromosoma localizado en el cinetocoro desde la profase hasta la metafase (b, d; rojo) y DAPI (azul). Tanto las señales de hSgo1 como las de hSgo2 presentaban señales en los puntos próximos a los puntos de CENP-A en el cromosoma. De lo anterior, se deduce que tanto hSgo1 como hSgo2 son proteínas centroméricas. Además, ambos puntos de Sgo1 y Aurora B eran prácticamente los mismos en la prometafase y en la metafase, mientras que Sgo2 se colocó justo fuera de Aurora B. De lo anterior, se deduce que tanto hSgo1 como hSgo2 se colocaron dentro del cinetocoro desde la prometafase hasta la metafase.

La Figura 14 es una fotografía que presenta los resultados de los experimentos con ARNi de hSgo1 y hSgo2 dirigidos respectivamente. Las expresiones en algunas proteínas se suprimieron significativamente después de 48 horas, por lo que se acumularon las células interrumpidas en la mitosis (total en la figura). Como la acumulación se disolvió suprimiendo un factor con punto de control del huso BubR1 por ARNi, se sugirió que hSgo1 y hSgo2 directa o indirectamente funcionan durante el proceso en el que el huso toma el cinetocoro propiamente en los centrómeros.

La Figura 15 es una serie de fotografías que presentan los resultados, donde se realizaron experimentos con ARNi dirigido a hSgo1 utilizando células HeLa y a continuación se montaron las células en el vidrio de un portaobjetos y se tiñeron con Giemsa. Se puso de manifiesto que la cromátide asociada se adhería fuertemente al punto del centrómero en las células de referencia; pero suprimió hSgo1 en las células, la adhesión en el punto del centrómero era débil y se destacaba fácilmente por la operación del experimento.

La Figura 16 es una serie de fotografías que demuestra que se requieren Sgo1 y Bub1 para la condensación en los centrómeros en la mitosis. (a) Por tratamiento con ARNsi, el cromosoma extendido se realizó en las células HeLa mitóticas teñidas con Giemsa. Se muestra la extensión representativa junto con las frecuencias de aparición. Más de un centenar de profases y metafases se observaron para cada ARNi. Un ejemplo de par de cromátides asociadas está ampliado en la parte superior. (b) Después del tratamiento con nocodazol durante 4 horas, el cromosoma extendido se observó en las células interferidas con ARNi. Ejemplos de la extensión se muestran con la frecuencia (n > 100). (c) Se fijaron células HeLa que expresan a Scc1-myc 36 horas después del tratamiento con los ARNsi. Se inmunotiñeron las células con anti-myc-anticuerpo (verde) y anti-centrómero-anticuerpo (ACA) (rojo). El ADN se tiñó con DAPI (azul). (d) Se muestran cantidades de células que presentan tinción con Scc1-myc. Las células que expresan a Scc1-myc en esta estirpe celular eran inferiores al 25%. La barra a escala muestra 10 \mum.

La Figura 17 es una serie de fotografías que presenta los resultados de los experimentos con ARNi que se dirigen a Bub1, respectivamente. (A, B) Se realizaron experimentos con ARNi que se dirigen a Bub1 respectivamente y dieron como resultado la desaparición de la localización de ambas proteínas, hSgo1 y hSgo2 en el centrómero. (C, D) Como la localización de ambas proteínas, hSgo1 y hSgo2 en el centrómero era normal en los experimentos con ARNi que se dirigen a una referencia, BubR1; se aseguró la significación de los resultados de Bub1. Se demuestra que Bub1 y BubR1 son similares pero proteínas diferentes y la localización de hSgo1 y hSgo2 en el centrómero depende de Bub1 (A, B), pero no en BubR1 (C, D).

La Figura 18 es una serie de fotografías que presenta los resultados de un clon en el que el ADNc del gen homólogo a shugoshina de ratón (SEC. ID. nº: 21 y nº: 23) se fusiona con el gen de GFP generado utilizando vector retrovírico y se expresa en células HeLa humanas. Se puso de manifiesto que cualquiera de las proteínas de fusión de GFP está localizada conjuntamente con la proteína Bub1 del cinetocoro humano en la mitosis.

Mejor modo de poner en práctica la invención

Como en el caso de una proteína de la presente invención, pueden ponerse como ejemplos una proteína Sgo1 (shugoshina) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 y que tiene una actividad reguladora de segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que tiene actividad reguladora de la segregación cromosómica; un parálogo Sgo2 de la proteína Sgo1 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 4 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden y que tiene actividad reguladora de la segregación cromosómica; un homólogo ScSgo1 en Saccharomyces cerevisiae de la proteína ScSgo1 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6 y que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que tiene actividad reguladora de la segregación cromosómica; una proteína (NC) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8 y que presenta una actividad reguladora procedente de Neurospora crassa de la segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden y que tiene actividad reguladora de segregación cromosómica; una proteína (At) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 10 o nº: 12 y que presenta actividad reguladora procedente de Arabidopsis de la segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 10 o nº: 12 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; una proteína (Mm) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 14 o nº: 16 y que tiene actividad reguladora procedente de un ratón de la segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 14 o nº: 16 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; una proteína (Hs) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 18 o nº: 20 y que presenta actividad reguladora procedente del ser humano de la segregación cromosómica; y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 18 o nº: 20 donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden y que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica. Además, como en el caso de la actividad reguladora de la segregación cromosómica descrita anteriormente, aunque no está especialmente limitada por la condición de que las actividades regulen la segregación cromosómica, por ejemplo, las actividades que regulan correctamente la segregación cromosómica de las células germinativas y/o de la división de las células somáticas son preferibles y las actividades que protegen (Shugo) el centrómero de la cromátide asociada de la separación en la meiosis es más preferible. Además, las proteínas de la presente invención pueden prepararse por los procedimientos conocidos basados en la información de la secuencia del ADN y similares, y las modificaciones no están limitadas a levaduras, ratones, seres humanos y similares. Además, por ejemplo, Sgo1 (shugoshina) mutante que es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostradas en la SEC. ID. nº: 2, donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden y que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica, puede prepararse por los procedimientos ordinarios tales como la manipulación genética conocida, la mutación puntual y similares.

Como en el caso de un ADN, se describe asimismo en la presente memoria un ADN que codifica una proteína de la presente invención que tiene actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN procedente de la levadura de escisión Schizosaccharomyces pombe, que comprende una secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 1 o nº: 3 o una secuencia complementaria de la misma; y un ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN procedente de Saccharomyces cerevisiae, que comprende una secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 5 o una secuencia complementaria de la misma; y un ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN procedente de Neurospora crassa, que comprende una secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 7 o una secuencia complementaria de la misma y que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de segregación cromosómica; y un ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN procedente de Arabidopsis, que comprende una secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 9 o nº: 11 o una secuencia complementaria de la misma y que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; y un ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN procedente de ratón, que comprende una secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 13 o nº: 15 o una secuencia complementaria de la misma y que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; y un ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN procedente del hombre, que comprende una secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 17 o nº: 19 o una secuencia complementaria de la misma y que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; y un ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN que se hibrida con el ADN anterior en condiciones severas, que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: y similares, pueden ponerse como ejemplos.

Estos ADN pueden prepararse por procedimientos conocidos basados en la información de la secuencia del ADN, tal como un gen o un banco de ADNc de levadura, ratón, seres humanos y similares. Además, utilizando una secuencia de bases mostradas en las SEC. ID. nº: 1, nº: 3, nº: 5, nº: 7, nº: 9, nº: 11, nº: 13, nº: 15, nº: 17, nº: 19, u otras o una secuencia complementaria de las mismas, o parte o la totalidad de estas secuencias como sonda, los bancos de ADN de levadura, ratón, seres humanos o similares se hibridan en condiciones severas, y el ADN deseado que codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica puede obtenerse aislando los ADN que se hibridan con las sondas. En cuanto a una condición de hibridación para obtener el ADN; puede ponerse como ejemplo la hibridación a 42ºC y el tratamiento de lavado mediante un tampón que contiene 1\times SSC y 0,1% de SDS a 42ºC; preferentemente la hibridación a 65ºC y el tratamiento de lavado mediante un tampón que contiene 0,1\times SSC y 0,1% de SDS a 65ºC. Además, en cuanto a un elemento que afecta la severidad de la hibridación, existen varios elementos aparte de las condiciones de temperatura descritas anteriormente, los expertos en la materia pueden actualizar la severidad equivalente a la de la hibridación ejemplificada en lo anterior con una combinación apropiada de varios elementos.

En cuanto a una proteína de fusión de la presente invención, puede utilizarse cualquier proteína con la condición de que la proteína de la presente invención esté unida a una proteína marcadora y/o a una etiqueta peptídica, ya que para una proteína marcadora, no está limitada especialmente pero una proteína marcadora convencionalmente conocida, por ejemplo, la fosfatasa alcalina, la zona Fc del anticuerpo, HRP, GFP y similares pueden ponerse como ejemplo. Además, como en el caso de la etiqueta peptídica de la presente invención, las etiquetas peptídicas convencionalmente conocidas tales como Myc, His, FLAG y GST pueden ponerse como ejemplos específicamente. La proteína de fusión puede producirse por los procedimientos ordinarios; y es útil para la purificación de la proteína Sgo1 y similares utilizando la afinidad de Ni-NTA y la etiqueta His y para un reactivo para estudio en la técnica.

En cuanto a un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de la presente invención, los anticuerpos inmunoespecíficos tales como el anticuerpo monoclonal, el anticuerpo policlonal, el anticuerpo híbrido, el anticuerpo monocatenario, el anticuerpo humanizado y similares, pueden ponerse como ejemplos de manera específica. Estos anticuerpos pueden ser producidos por los procedimientos habituales mediante la utilización de proteínas tal como la Sgo1 mencionada anteriormente o parte de la misma como antígeno, y entre ellas es preferible un anticuerpo monoclonal desde el punto de vista de la especificidad. Los anticuerpos tales como un anticuerpo monoclonal son útiles para aclarar la localización de Sgo1 y otros in vivo.

Los anticuerpos de la presente invención mencionados anteriormente pueden generarse mediante la utilización de un protocolo común administrando las proteínas de la presente invención o los fragmentos que contienen el epítopo de las mismas o las células que expresan la proteína en sus superficies de la membrana, para animales (preferentemente no humanos). Por ejemplo, para la preparación de un anticuerpo monoclonal puede utilizarse cualquier procedimiento tal como hibridoma (Nature 256, 495-497, 1975), trioma, hibridoma de linfocitos B humanos (Immunology Today 4, 72, 1983) e hibridoma EBV (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, págs. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985), mediante el cual se generan anticuerpos a partir de cultivos de estirpes celulares continuas.

Para generar un anticuerpo monocatenario contra una proteína de la presente invención, puede aplicarse un procedimiento para la preparación del anticuerpo monocatenario (patente US nº 4.946.778). Además, para expresar el anticuerpo humanizado, puede utilizarse un ratón transgénico u otros mamíferos, los clones que expresan una proteína de la presente invención con utilización del anticuerpo mencionado anteriormente pueden aislarse e identificarse, y su polipéptido puede purificarse por cromatografía de afinidad. Los anticuerpos contra el péptido que contiene las proteínas de la presente invención o los epítopos del antígeno de las mismas pueden utilizarse posiblemente para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer o de las enfermedades por segregación cromosómica tales como la infecundidad o síndrome de Down utilizando un factor regulador de la segregación cromosómica como índice.

El análisis funcional de una proteína de la presente invención puede realizarse utilizando proteínas de fusión fusionadas con, por ejemplo: sustancias fluorescentes tales como FITC (isocianato de fluoresceína) o tetrametil isocianato de rodamina; radioisótopos tales como ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, ^{35}S o ^{3}H; marcadores con enzimas tales como la fosfatasa alcalina, peroxidasa, \beta-galactosidasa o ficoeritrina; proteínas de emisión de fluorescencia tales como la proteína verde fluorescente (GFP); o similares, a anticuerpos tales como los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente. Como método de análisis inmunológico con utilización del anticuerpo de la presente invención, pueden ponerse como ejemplos métodos tales como RIA, ELISA, método del anticuerpo fluorescente, análisis de células formadoras de placa, método de oligometrorragia, ensayo de hemaglutinación y método de Ouchterlony.

La presente invención se explicará en detalle a continuación con referencia a los ejemplos, pero el alcance técnico de la presente invención no se limitará a éstos.

Ejemplo 1 Procedimiento Identificación del protector de Rec8

El presente inventor examinó un gen que es tóxico solamente cuando se expresa conjuntamente con Rec8 en células vegetales. La secuencia que codifica a Rec8 que se fusionó con GFP se clonó en pREP82 (marcador ura4+) en el activador nmt1+ reprimible de tiamina, para construir pREP82-rec8+-GFP. Se utilizaron un banco de ADNc de Schizosaccharomyces pombe construido por ARNm que se preparó a partir de células meióticas y un vector pREP3 (activador nmt1+, marcador de LEU2+) (Y. Akiyoshi y Y.W., no publicada). Las células leu1 ura4-D18 que llevan pREP82-rec8+-GFP se transformaron con el banco de ADNc, se extendieron en placas de agar-agar que contienen tiamina (sin activador) y se incubaron durante 3 días a 30ºC. Las colonias se replicaron a continuación en placas de agar-agar exentas de tiamina: una que contiene uracilo y ácido 5'-fluoroortoico (5'-FOA) donde solamente pueden crecer las células que carecían del plásmido pREP82-rec8+-CFP (por consiguiente expresa un solo clon del banco) y la otra que no contiene 5'-FOA (permite la coexpresión de rec8-+GFP y un clon del banco). El presente inventor añadió Phloxina B, un fármaco que tiñe de rojo las células muertas, sobre ambas placas de agar-agar, con lo cual se iluminaron las colonias enfermas. Tras la incubación durante dos días, se seleccionaron las colonias que presentan enfermedad solamente en la placa de agar-agar de coexpresión y se recuperaron y analizaron los plásmidos procedentes del banco.

Cepas de Schizosaccharomyces pombe

La eliminación y el etiquetado de GFP o FLAG a sgo1+ y sgo2+ endógenas se realizaron por un procedimiento de direccionamiento génico basado en la PCR (Yeast 14, 943-951 (1998)). Mediante la inserción de GFP en el terminal C del sgo1+-FLAG ampliado por PCR, sgo1+-FLAG-GFP se generó y se integró en el locus de sgo1 endógeno. Además, un activador endógeno del sgo1+ fue sustituido por un activador de nmt para generar Pnmt-sgo1+ o Pnmt-sgo1+-FLAG-GFP por el procedimiento de direccionamiento génico basado en la PCR. Las proteínas activadas para Sgo1-GFP o Sgo1-FLAG se eliminaron dependiendo del objetivo. Se utilizó una mutación de mei4\Delta para detener las células meióticas antes de la meiosis I (cerca de la profase tardía en la meiosis I) y se utilizó una mutación mes1\Delta para detener después de la meiosis I, como se describió anteriormente (Nature 400, 461-4 (1999)).

Observación de los cromosomas marcados con GFP

Para observar los modelos de segregación de los homólogos en la meiosis I, se sembraron por puntos células h90 que conservan el cen2-GFP (Embo. J. 22, 2284-96 (2003)) en medio productor de meiosis, SPA. Para examinar los modelos de segregación de las cromátides asociadas, células opuestas de tipo apareamiento, una marcada con cen2-GFP y la otra sin marcar, se mezclaron y se sembraron por puntos en SPA. Después de la incubación durante un día, se controlaron los zigotos para GFP. Se obtuvieron imágenes bajo un microscopio (Axioplan2, Zeiss) equipado con una cámara CCD enfriada (Quantix, Photometrics) y utilizando el programa informático Metamorph (Universal Imaging Corporation). Se convirtieron siete secciones Z para señales de GFP en una sola imagen en dos dimensiones tomando la señal máxima en cada posición del píxel en las imágenes.

Inmunoprecipitación con cromatina: ChIP

Se utilizó el diploide sgo1+-FLAG-GFP para la ChIP con Sgo1. Para conseguir un cultivo muy coincidente, se sustituyó el activador endógeno slp1+ por el activador rad21+ que no es activo durante la meiosis y se detuvieron las células en la metafase I. Se incubaron las células en medio con nitrógeno agotado durante 17 horas a 30ºC y el 60% de las células o menos se detuvieron en la metafase I. Para la ChIP con Sgo2, las células nda3-KM311 sgo2+-GFP proliferaron a 30ºC y a continuación se desplazaron a 18ºC. Tras la incubación durante 8 horas, la mayoría de las células se detuvieron en la metafase. Se fijaron las células con 3% de para-formaldehído durante 30 minutos a 18ºC y se prepararon los extractos. El ADN se rompió hasta un tamaño medio de 400 bp y los extractos se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-GFP de conejo (Clontech). Los ADN preparados a partir de los extractos en bruto de la célula completa o las fracciones de cromatina inmunoprecipitada se analizaron por PCR cuantitativa, con un LightCycler o un Lightcycler- kit Green I Master SYBR de ADN (Roche Molecular Biochemicals). Se utilizaron muestras de anticuerpo-menos como referencias en cada experimento para explicar la unión no específica en las fracciones de ChIP.

Preparación de anticuerpos anti-Sgo1

El Sgo1+ ORF se amplió por PCR a partir de un banco de ADNc de Schizosaccharomyces pombe y se insertaron en los plásmidos pGEX4T-2 (Pharmacia Biotech) y pET-19b (Novagen) respectivamente para preparar proteínas recombinantes GST-Sgo1 e His-Sgo1. Se utilizó GST-Sgo1 para inmunizar el conejo y se purificaron los anticuerpos surgidos por His-Sgo1 como se describió anteriormente (Embo. J. 22, 5643-53 (2003)). Además, a fin de analizar las proteínas de análisis (SEC. ID. nº: 18 y nº: 20; hSgo1 y hSgo2 respectivamente) que codifican el gen homólogo de la shugoshina humana (SEC. ID. nº: 17 y nº: 19), parte de hSgo1 y hSgo2 se expresaron en E. coli, y se produjeron anticuerpos contra hSgo1 y hSgo2 inyectando la proteína en el conejo.

Inmunotinción

Para teñir Sgo1 endógeno, las células diploides naturales cultivadas durante 5 horas en MM-N se fijaron con formaldehído al 3% durante 40 min. a 30ºC, y se tiñeron por el procedimiento descrito anteriormente (Embo. J. 22, 5643-53 (2003)). Para teñir Sgo2-GFP y Mis6-HA, se utilizaron células de crecimiento logarítmico. Se detectó Sgo1 utilizando anticuerpo anti-Sgo1 de conejo en la proporción 1:50 y anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa488 (Molecular Probes) en la proporción 1:100. Se detectó tubulina utilizando anticuerpo TAT-1 anti-tubulina de ratón (proporcionado por Keith Gull) a 1:200 y anticuerpo anti-ratón activado por Cy3 (Chemicon) a 1:2.000. Se tiñeron las células por contraste con DAPI para observar el ADN. El Sgo2-GFP se detectó utilizando anticuerpos anti-GFP de ratones (Roche) a 1:50 y anticuerpos anti-ratón conjugados con BODIPY FL (Molecular Probes) a 1:100. La MIS6-HA se detectó utilizando anticuerpos Y-11 anti-HA de conejos (Santa Cruz) a 1:50 y anticuerpos anticonejo conjugados con Alexa488 a 1:100. Las células se tiñeron por contraste con DAPI para visualizar el ADN. Además se realizó la inmunotinción utilizando anticuerpo anti-hSgo1 de conejo y anticuerpo anti-hSgo2 de conejo de la misma manera que la descrita anteriormente.

Coinmunoprecipitación

Las células de la cepa Padh-rec8+-3HA Pnmt41-sgo1+-FLAG-GFP y las células de la cepa Padh-rec8+-3HA de referencia se cultivaron sin tiamina durante 15 horas a 30ºC, se recogieron y se prepararon los extractos. Para liberar las proteínas unidas a la cromatina, se trataron los extractos con ADNasa I. Después de clarificar los extractos por centrifugación, la proteína Sgo1-FLAG-GFP se inmunoprecipitó con anticuerpo M2 anti-FLAG (Sigma). Se detectaron Rec8-3HA y Sgo1-FLAG-GFP mediante el anticuerpo Y-11 anti-HA y el anticuerpo M2 anti-FLAG, respectivamente.

Análisis de levadura en germinación

Todas las cepas de la muestra excepto las del ensayo de la pérdida de cromosoma se derivan de SK1 (Cell 98, 91-103 (1999)). El ensayo de pérdida de cromosomas se realizó como se describió anteriormente (Nature 410, 955-9 (2001)). Se eliminó el gen ScSGO1 o se activó el epítopo utilizando casetes generados por PCR (Yeast 14, 953-961 (1998)). Se chequeó la dirección aproximada del gen por PCR. Los puntos de URA3-GFP que marcan el cromosoma V (cenV-GFP) se describieron anteriormente (Cell 98, 91-103 (1999)). La esporulación se produjo cultivando células diploides a 30ºC como se describió anteriormente (Dev. Cell. 4, 535-48 (2003)). La inmunofluorescencia in situ se realizó como se describió anteriormente (Dev. Cell. 4, 535-48 (2003)).

Cultivo celular

Se cultivaron células HeLa en DMEM enriquecido con suero de ternero fetal al 10% y L-glutamina al 0,03%. La cepa celular HeLa que expresa Scc1-myc se cultivó con 200 \mug/ml de G418 (Invitrogen) y 100 \mug/ml de higromicina B (Wako). La expresión de Scc1-myc fue producida por incubación con 2 \mug/ml de doxociclina (Sigma) durante 48 horas.

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Preparación de anticuerpo Sgo anti-humano

Ya que la información para la secuencia aminoácido N-terminal de Sgo1 humano no se obtuvo a partir de las bases de datos, el presente inventor clonó un fragmento de ADNc que se amplió a partir de un banco de ADNc (BD Biosciences) con utilización de cebadores que reconocen el punto de clonación de \lambdaTriplEx: CTCGGGAAGCGCGC
CATTGTG (SEC. ID. nº: 38) y la secuencia de ADN correspondiente a los números 237 a 242 en la secuencia de aminoácidos de Q9BVA8: CCTGGCTGAATCAGCTTTGGTG (SEC. ID. nº: 39). El secuenciado puso de manifiesto que el ARNm de Sgo1 codifica una proteína que tiene 527 aminoácidos. Para obtener los anticuerpos policlonales contra Sgo1, un fragmento de ADNc que codifica los números 109-491 en la secuencia de aminoácidos de Sgo1 se amplió y se insertó en los marcos de lectura de plásmidos pGEX4T-2 (Amersham) y pET19b (Novagen) para producir GST-Sgo1 y His-Sgo1 respectivamente, y seguido de inmunización de un conejo (QIAGEN) (realizada según las instrucciones del fabricante). Se purificó por afinidad His-Sgo1 en sepharose activada por CNBr (Amersham). Los anticuerpos contra Sgo2 se construyeron con GST-Sgo2 (aminoácidos números 331 a 631) y se purificaron con His-Sgo2 de la misma manera que anteriormente.

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Microscopio de inmunofluorescencia y propagación de cromosoma

La tinción inmunofluorescente se realizó como se describió anteriormente, utilizando Sgo1 anti-humano (1:1.000), antisuero Sgo2 anti-humano (1:10.000), anti-Bub1 (1:1.000, MBL), anti-BubR1 (1:1.000, MBL), anti-CENP-A
(1:1.000, MBL), anti-Aurora B AIM-1 (1:1.000, BD Biosciences) y DM1A anti-tubulina (1:1.000, Sigma). Se realizó la inmunotinción de Scc1-myc como se describió anteriormente utilizando CM-100 anti-myc (1:1.000, Gramsch Laboratories) y ACA (1:1.000, proporcionado por el Dr. Yoshinari Takasaki). Como anticuerpo secundario, se utilizaron anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (1:1.000, Molecular Probes), anticuerpo anti-ratón (1:1.000, CHEMICON) conjugado con Cy3 y anticuerpo anti-humano de asno conjugado con Cys (1:1.000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Se utilizaron 3 \mug/ml de Hoechst 33342 ó 0,5 \mug/ml de DAPI para tinción por contraste. Se tomaron imágenes utilizando el programa informático SlideBook o MetaMorph.

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Propagación de cromosomas

Se recogieron células HeLa durante la mitosis por extracción mitótica y se incubaron con 330 nM de nocodazol durante 0 hasta 4 horas. Se realizó la extensión de cromosomas como se describió anteriormente.

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Inmunoelectrotransferencia

Se hirvieron células HeLa con el tampón de muestra y se resolvieron por electroforesis en gel SDS-poliacrilamida. Se transfirieron las proteínas a la membrana Immobilon-P (Millipore), seguido de bloqueo con 5% de leche entera (Nacalai) en TBST (150 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,05% de Tween-20). Se realizaron incubaciones del anticuerpo en leche entera TBST al 0,1% enriquecida con anticuerpo anti-Sgo1 (1:1.000), anticuerpo anti-Sgo2 (1:1.000), anticuerpo anti-Bub1 (1:500) y anticuerpo anti-tubulina (1:3.000). Las transferencias fueron producidas por ECL (Amersham).

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ARNi

Como secuencia diana de ARNsi, se seleccionaron respectivamente hSgo1: AAGUCUACUGAUAAUGUCUUATT (SEC. ID. nº: 40) y hSgo2: AAGCACUACCACUUU GAAUAATT (SEC. ID. nº: 41), y Sgo1 humana: GUGAGC
CUCUGUGAAUCAATT (SEC. ID. nº: 42) y Sgo2 humana: GCUCUCAUGAACAAUAACUTT (SEC. ID. nº: 43) en hSgo1ARN o hSgo2ARN. Además, como secuencia diana de ARNsi, se seleccionó GAGUGAUCACGAUUU
CUAATT (SEC. ID. nº: 44) en otra secuencia diana de ARNsi, Bub1ARN; la secuencia diana ARNsi, AACGGG
CAUUUGAAUAUGAAA (SEC. ID. nº: 45, véase JCS, 117, 1577-1589 (2004)) se seleccionó en 2 puntos del ARN del factor BubR1 de comprobación del huso. Estas secuencias se sintetizaron en forma de doble cadena y se introdujeron en las células utilizando oligofectamina (Invitrogen). Además de manera similar, al producir el vector VIH, se transfectaron las células HeLa con el vector del plásmido de VIH, pMD.G (plásmido de expresión VSV-G env), pMDLg/p.RRE (el plásmido de empaquetamiento de tercera generación) y pRSV Rev (plásmido que expresa Rev) por el método del fosfato cálcico, recogido del sobrenadante del cultivo 48 horas después de la transfección y condensado para utilizarlo como vector vírico.

Ejemplo 2 Resultados Identificación de Sgo1 de shugoshina en la levadura de escisión

La sustitución de la cohesina mitótica, Rad21/Scc1, por la versión meiótica, Rec8, es un prerrequisito para proteger la cohesión de la cromátide centromérica asociada a través de la anafase de la meiosis I (Cell 103, 1155-68 (2000), Mol. Cell. Biol. 23, 3965-73 (2003)). Sin embargo, cuando la Rec8 se expresó ectópicamente durante la mitosis, Rec8 estaba localizado en mayor medida en los centrómeros pero desapareció en la anafase, con las cromátides asociadas segregando a las caras opuestas (Figs. 1c y d). Además, la expresión ectópica de Rec8 no escindible durante la mitosis (obsérvese que Rec8 es escindido por la separasa Cut1 durante la meiosis (Embo. J. 22, 5643-53 (2003))) produjeron una incapacidad para separar las cromátides asociadas (véase la Fig. 2). Por lo tanto, en contraste con la situación durante la meiosis I, la Rec8 centromérica es escindida por la separasa durante la mitosis, y produce la separación de las cromátides asociadas. El presente inventor supuso de este modo un protector centromérico específico para la meiosis I de Rec8 a partir de estas observaciones. Para identificar este factor, el presente inventor buscó un gen que genere toxicidad durante el crecimiento mitótico solamente cuando se expresa conjuntamente con Rec8. Este cribado identificó un nuevo gen, sgo1+ (ORF: SPB35G2.03C). El impedimento del crecimiento por Sgo1 fue significativamente dependiente de Rec8, ya que Sgo1 tenía poco efecto sobre el crecimiento cuando se expresa conjuntamente con Rad21 (Fig. 1a). La expresión conjunta de rec8+ y sgo1+ produjo alta frecuencia de la división nuclear bloqueada, ya que los marcadores de la proteína verde fluorescente asociados al centrómero (cen2-GFP) segregaban en el mismo lado de una célula tabicada muy frecuentemente (véase las Figs. b y c). Para probar la posibilidad de que Sgo1 proteja a Rec8 de la degradación en la anafase, se examinó la localización de Rec8 asociada a la expresión de Sgo1, la Rec8 activada con GFP en su terminal carboxilo se expresó bajo el control de un activador adh1 constitutivo y produjo la Sgo1 utilizando un activador nmt1 reprimible por tiamina. En consecuencia se descubrió que la señal de Rec8-GFP persistía a través de la anafase solamente cuando Sgo1 se expresaba conjuntamente (Fig. 1d). Como Sgo1 se expresa exclusivamente en la meiosis (datos de la microrred del ADN (Nat. Genet. 32, 143-7 (2002)), véase a continuación), se descubrió a partir de los resultados mencionados anteriormente, que Sgo1 es un protector de Rec8 durante la meiosis.

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Sgo1 protege la cohesión centromérica en la meiosis I

Para examinar si Sgo1 se requiere de hecho para la protección de Rec8 durante la meiosis, el ORF completo que codifica a sgo1+ se eliminó y se examinó el fenotipo. Las células Sgo1\Delta son viables y presentaban crecimiento vegetativo normal, coherente con el concepto de que sgo1+ es un gen específico para la meiosis. Para examinar la segregación del cromosoma meiótico de las células sgo1\Delta, las secuencias unidas al centrómero se marcaron con GFP (cen2-GFP) solamente en uno de los dos homólogos en un zigoto, y la segregación de los puntos de GFP se controló durante la meiosis I. Se puso de manifiesto que la meiosis I aparecía normalmente en las células sgo1\Delta, como pares de cromátides asociadas generalmente desplazadas conjuntamente en el mismo lado de cada zigoto. Por consiguiente, el acoplamiento monopolar estaba intacto (Fig. 3a). Además, marcando cen2-GFP en ambos cromosomas, se determinó que se experimentaba segregación precisa con homólogos en la meiosis I (datos no mostrados). Sin embargo, los pares de cromátides asociadas no pudieron segregar de manera apropiada en la meiosis II, la falta de segregación se produjo en el 50% de las células o menos (Fig. 3a). Este valor es coherente con la segregación aleatoria de cromosomas en la meiosis II.

Para examinar la cohesión centromérica, el cen2-GFP marcado en ambos homólogos se controló en los zigotos interrumpidos antes de la meiosis II por una mutación de mes1\Delta. Apoyando los resultados anteriores, las células sgo1\Delta presentaron frecuentemente una división precoz de los centrómeros ya que las señales de división de cen2-GFP prevalecieron en los núcleos del par (Fig. 3b). Por último, se examinó si la protección de Rec8 en los centrómeros depende de Sgo1 controlando Rec8-GFP en la anafase I tardía y la prometafase II. Aunque es significativo que las señales de Rec8 eran centroméricas en las células naturales, las señales de Rec8 habían desaparecido en gran medida de los centrómeros en estas etapas en las células sgo1\Delta (Fig. 3c). A pesar de que todos los fenotipos de las células sgo1\Delta eran reminiscencias de Schizosaccharomyces pombe con insuficiencia de heterocromatina, en los que la localización de Rec8 en las zonas pericentroméricas disminuye y la cohesión centromérica se pierde durante la meiosis I, lo que conduce a la división aleatoria en la meiosis II (Science 300, 1152-5 (2003)). La fijación de cromatina por Rec8 fue examinada en las células interrumpidas antes de la meiosis I utilizando un ensayo de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP). En contraste marcado con las células insuficientes en heterocromatina, la localización de Rec8 fue intacta en las células sgo1\Delta en las zonas pericentroméricas así como en todas las demás zonas probadas. Estos resultados sugieren que la pérdida del Rec8 centromérico después de la meiosis I no es producida por un defecto inicial en la localización de Rec8 para los centrómeros sino más bien por un defecto en la conservación del Rec8 centromérico durante la meiosis I. Los resultados anteriores indicaban que la Cut1 separasa se vuelve activa al comienzo de la anafase I y escinde la mayoría de la Rec8 cromosómica, dejando solamente intacto la Rec8 centromérica (Embo. J. 22, 5643-53 (2003)). Estos resultados indicaban que Sgo1 desempeña un papel esencial en la protección de la cohesión centromérica durante la meiosis I protegiendo la cohesina Rec8 de la escisión por la separasa.

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Sgo1 se localiza en los centrómeros durante la meiosis I

Para detectar la proteína Sgo1, se produjeron anticuerpos específicos para Sgo1 y los resultados de la inmunoelectrotransferencia Western indicaron que Sgo1 se expresa solamente alrededor en la meiosis I (Fig. 4a). Los resultados de la microscopia por inmunofluorescencia en células en varias etapas de la meiosis pusieron de manifiesto que Sgo1 aparece en la profase tardía de la meiosis I y está completamente localizada como varios puntos por el punto de la metafase I (Fig. 4b). Estos puntos estaban localizados en la proteína Mis6 del cinetocoro (Cell. 90, 131-143 (1997)) e indicaban que Sgo1 es una proteína que se asocia al centrómero (Fig. 4c). Al comienzo de la anafase I, las señales de Sgo1 disminuyeron drásticamente. Se descubrió que Sgo1 permanece sin degradar en los centrómeros en las células con la APC agotada detenidas en la metafase I pero experimenta degradación normal en las células con insuficiencia de separasa (Fig. 5) e indicaba que la degradación por Sgo1 en la anafase I está regulada más directamente por la APC más bien que por la separasa. Aunque las señales del Sgo1 residual eran detectables en los centrómeros en la anafase I precoz, desaparecieron completamente al final de la anafase I (Fig. 4b). Esto indica que se requiere una cantidad sustancial de Sgo1 al comienzo de la anafase I cuando la separasa está completamente activada. Sin embargo, se considera que las cantidades de Sgo1 requeridas son cada vez más pequeñas a medida que progresa la anafase I. Esta idea es justificable cuando la actividad de la separasa se regula por disminución rápidamente o cuando se evita el acceso a los cromosomas durante la anafase I. La Sgo1 nunca reaparece durante la meiosis II (Fig. 4b) y que es coherente con la idea de que se requiere Sgo1 para la protección de Rec8 solamente durante la meiosis I.

El presente inventor ha descrito ya que la localización de Rec8 en las zonas pericentroméricas es especialmente importante para la persistencia de la cohesión centromérica en toda la meiosis I (Science 300, 1152-5 (2003)). Si Sgo1 es un protector centromérico de Rec8, entonces podría esperarse localizarla ahí también. Para probar esta posibilidad, se diseñó la localización de Rec8 con más precisión utilizando el ensayo ChIP. La Sgo1 asociada de hecho con las zonas pericentroméricas de heterocromatina más bien que con las zonas del núcleo central a lo largo de las secuencias centrómeras (Fig. 4d). Dado que los resultados de los experimentos de inmunoprecipitación indicaban que Sgo1 interactúa con los complejos de Rec8 in vivo (Fig. 4f), se llevó a cabo la protección por interacción íntima. Simultáneamente, estos resultados indican que Sgo1 reside en las zonas pericentroméricas y actúa para proteger a Rec8 centromérica de la escisión de la separasa en la anafase I (Fig. 4d). Se descubrió que la localización de Rec8 no depende de Sgo1, y viceversa (figura 3d, figura no mostrada). Realmente, la Rec8 y la Sgo1 se generan de hecho independientemente en las zonas pericentroméricas, en cuanto a la localización, la Rec8 y la Sgo1 dependen de la heterocromatina y de Bub1 cinasa respectivamente (figura 4e). En cambio, Rec8 y Sgo1 se localizan en los centrómeros en las células swi6\Delta (insuficientes en heterocromatina) y en las células bub1\Delta respectivamente (figura 4e). De este modo por localización independiente, puede asegurarse que la Rec8 se protege solamente en los centrómeros no a lo largo de las zonas del brazo cromosómico.

Además, se indica que la shugoshina protege a Rec8 físicamente de la acción de la separasa y contrarresta los efectos. En este asunto, aun cuando la expresión fuerte de la dosis de Sgo1 no expresa a Rec8, el crecimiento mitótico se desestabilizó moderadamente (figura no mostrada); y aun cuando la temperatura es tolerada para el alelo cut1, se observó que el mutante cut1 era destruido por la expresión moderada de Sgo1 (fig. 6).

Sgo2 es un parálogo mitótico de Sgo1 en la levadura de escisión

Mediante una investigación convencional con BLAST de las bases de datos del genoma, el presente inventor identificó proteínas similares a Sgo1 procedentes de Saccharomyces cerevisiae y Neurospora crassa, e indicó que Sgo1 es una proteína conservada (véase a continuación). En la misma investigación, se identificó también un parálogo Sgo1 de Schizosaccharomyces pombe que el presente inventor denominó Sgo2 (ORF: SPAC15A10.15). Se destruyó el gen sgo2+ y se identificó que las células sgo2\Delta son viables pero presentan sensibilidad al fármaco tiabendazol (TBZ) desestabilizador del huso (Fig. 7a). Ya que las células sgo1\Delta presentan dicho defecto, este fenotipo es destacable. Para investigar su distribución celular, el gen endógeno sgo2+ se activó con GFP. En las células proliferantes, se observó Sgo2-GFP como dos o tres puntos en el núcleo (Fig. 7d). Sin embargo, Sgo2-GFP se localizó conjuntamente con la proteína Mis6 del centrómero en la metafase y desapareció durante la anafase (Figs. 7c y d). Los resultados de los análisis de ChIP demostraron que la asociación de la cromatina Sgo2 es detectable solamente en las poblaciones simultáneas de células mitóticas, y que la asociación de la cromatina se localiza en las zonas pericentroméricas (Fig. 7e). Al aumentar esta localización, la eliminación de sgo2 proporciona un defecto drástico a la segregación de cromosomas cuando la mutación swi6\Delta insuficiente en heterocromatina se unió a ésta, que sin embargo por sí misma proporciona ligeramente la función centromérica (Science 269, 1429-31 (1995))(Fig. 7b). Estos resultados indican que Sgo2 coopera con los factores centroméricos de la heterocromatina para asegurar la segregación de cromosomas en la mitosis. Además, se descubrió que las células sgo2\Delta presentan un aumento modesto (hasta el 15%) en la falta de segregación de los homólogos en la meiosis I, e indica que Sgo2 es también importante para estimular la meiosis I apropiada. Sin embargo, la función de Sgo2 no se solapa con la de Sgo1, ya que sgo1\Delta no produce un defecto aparente en la meiosis I (Fig. 3a) ni aumenta un defecto de sgo2 en la meiosis.

Localización de shugoshina controlada por Bub1

Puesto que la Rec8 centromérica no puede ser detectada después de la meiosis I en los mutantes Bub1 de la levadura de escisión, una cinasa Bub1 asociada al centrómero conservada se considera que funciona protegiendo la Rec8 durante la meiosis (Nat. Cell. Biol. 3, 522-6 (2001)) (Fig. 3c). Aunque la mutación bub1 presenta efectos pleyótropos en la segregación meiótica de cromosomas, se considera que la función de Sgo1 puede ser activada por la actividad de Bub1. Para aclarar este problema, se examinaron las señales de Sgo1-GFP en células bub1\Delta que experimentan meiosis. Obviamente, las células Bub1\Delta estaban dedicadas casi completamente a las señales de Sgo1-GFP centroméricas precisas, en cambio presentaban una fluorescencia difusa en el núcleo (Fig. 4e). Similares resultados se obtuvieron utilizando la mutación puntual bub1-K762R que suprime la actividad de la cinasa (Embo. J. 22, 1075-87 (2003)). Aunque las concentraciones sustanciales de la proteína Sgo1 se detectaron en las células bub1\Delta meióticas por análisis de inmunoelectrotransferencia Western (figura no mostrada), la dosis de Bub1 no influye en la estabilidad proteica de Sgo1. Por lo tanto, se requiere actividad de cinasa de Bub1 para incorporar la Sgo1 a los centrómeros, y los defectos observados en la protección centromérica en las células bub1\Delta puede explicarse mediante la localización alterada de Sgo1.

En experimentos en paralelo, se identificó que la localización mitótica de Sgo2 en los centrómeros estaba alterada igualmente en los mutantes de bub1 (Fig. 7c). Se ha indicado que la pérdida de la función de Bub1 da lugar a que la función centromérica se debilite (J. Cell. Biol. 143, 1775-87 (1998)). A este respecto, la mutación bub1-K762R presenta letalidad conjunta con swi6\Delta, una mutación que también proporciona ligeramente función centromérica mediante su función en la formación de la heterocromatina pericentromérica. Se observó que sgo2\Delta presenta asimismo letalidad conjunta con swi6\Delta (Fig. 7b) y presenta segregación defectuosa severa de cromosomas en la mitosis (figura no mostrada). Como el mutante doble sgo2\Delta bub1\Delta no presentaba ningún defecto acumulativo en absoluto en el crecimiento o sensibilidad de TBZ (Fig. 7a), se confirmó la función tándem Sgo2 y Bub1 para asegurar la segregación de cromosomas en la mitosis mediante estos análisis genéticos. Considerados en conjunto, los resultados anteriores pusieron de manifiesto que la incorporación de Sgo1 y Sgo2 a los centrómeros es una función crucial de Bub1 cinasa en la meiosis y mitosis, respectivamente.

Características de un homólogo de Sgo1 de la levadura en germinación

El presente inventor identificó un solo homólogo de Sgo1, ScSgo1 en la levadura en germinación (ORF:
YOR073W), que no ha sido analizado hasta ahora. Se examinó la localización celular de ScSgo1 activando el ScSGO1 endógeno con GFP. Se detectó ScSgo1-GFP principalmente como un solo punto en las células proliferantes, pero solamente en un subconjunto limitado de la población (Fig. 8a). Scsgo1-GFP no se detectó durante el periodo G1/S (es decir en las células sin germinar o con una pequeña germinación) pero apareció como un punto en G2/M (células con una gran germinación y un solo núcleo) y desapareció en la anafase (células con una gran germinación y un núcleo flexible) (Fig. 8a). El punto está localizado conjuntamente con la proteína Ndc10 del cinetocoro (Fig. 8b). Durante la meiosis, se detectó ScSgo1-GFP en el cinetocoro solamente en la metafase I, pero nunca durante la anafase I o la meiosis II (Fig. 8c). Por lo tanto, el modelo de localización de ScSgo1 se parece mucho al de SpSgo2 en la mitosis y a SpSgo1 en la meiosis.

Se destruyó el gen ScSGO1 para examinar la función de ScSgo1. Aunque las células Scsgo1\Delta eran viables, crecieron lentamente y presentaban sensibilidad al fármaco benemilo desestabilizador del huso (Fig. 8d) e indicaban que la función centromérica podría alterarse. Y a continuación las cantidades de pérdida cromosómica en las células Scsgo1\Delta se compararon con las de las células naturales mediante un ensayo de sectorización de colonias. Mientras que el 40% de las colonias de Scsgo1\Delta contenían sectores rojos (lo que indica pérdida de cromosomas), menos del 2% de colonias naturales contenían dichos sectores (Fig. 8e). Se llegó a la conclusión de que Scsgo1 desempeña una función crucial en los centrómeros para asegurar la segregación mitótica de los cromosomas. Al comienzo de la meiosis, las células Scsgo1\Delta presentaban defectos significativos que muchas células están detenidas con un solo núcleo en el estado meiótico. Sin embargo, entre los productos tetranucleados de la meiosis fugados, el modelo de distribución de cenV-GFP era coherente con la segregación apropiada en la meiosis I a excepción de la segregación aleatoria en la meiosis II (Fig. 8f). Se descubrió también que la activación de ScSGO1 cromosómico con 13Myc en su terminal carbonilo, que por sí mismo da lugar a defectos no detectables en el crecimiento mitótico o en la meiosis I, dio como resultado la segregación alterada en la meiosis II (34% sin segregación indica 68% de segregación aleatoria) (Fig. 8g). Además, las células ScSGO1-Myc presentaban separación frecuente de los centrómeros asociados en la anafase I meiótica tardía (Fig. 8h), lo que indicaba que la cohesión centromérica no estaba protegida de forma apropiada. Simultáneamente, estos resultados apoyan la idea de que ScSgo1 desempeña una función crucial en la protección de la cohesión centromérica en toda la meiosis I, y la meiosis II estaba asegurada de este modo como es el caso con la Sgo1 de la levadura de escisión.

Conservación de Shugoshina entre eucariotas

Las investigaciones por BLAST indicaron que solamente tres proteínas de tipo Sgo1, estaban todas en los hongos: Sgo2 de Schizosaccharomyces pombe, ScSgo1 de Saccharomyces cerevisiae y B23G1.060 de Neurospora crassa. Ya que las dos zonas conservadas se encontraban en estas proteínas, las proteínas relacionadas se investigan en condiciones de dos secuencias de bloque por los programas BLOCK MAKER y MAST (Nucleic Acids Res. 26, 309-12 (1998), Bioinformatics 14, 48-54 (1998)). Este método extrajo varias proteínas experimentales de varios eucariotas incluyendo la mosca, el gusano, planta, ratón y ser humano (véase las SEC. ID. nº: 21 a nº: 37; drosophila Dm, Ce, Arabidopsis At, ratón Mm y humano Hs, respectivamente, en la Fig. 9). Especialmente, esta lista incluye la MEI-S332 de Drosophila, que está caracterizada anteriormente como proteína esencial para conservar la cohesión centromérica en la meiosis (Cell. 83, 247-256 (1995)), aunque la puntuación de la similitud es marginal (valor E=10). Todas las demás proteínas en la lista presentaban un tramo corto de similitud en las zonas básicas del terminal carboxilo, mientras que las secuencias primarias en el primer bloque no se conservan excepto que contengan un supuesto superenrollamiento. El espacio y las secuencias entre estos dos bloques divergen entre las proteínas. Ya que se identificó previamente que estos bloques eran importantes para la función de MEI-S332 (Genes Dev. 12, 3843-3856 (1998)), se investigó la importancia de las zonas conservadas en Sgo1. Se intercambiaron varios aminoácidos individualmente por alaninas en estos bloques con similitud y se examinó la función de las proteínas mutantes in vivo (Fig. 10). Se observó que tres aminoácidos conservados, conocidos por ser importantes para la función MEI-S332, se requerían también para la función Sgo1 (13N, 34V y 368S en MEI-S332; 29N, 501 y 294S en Sgo1) (marcado como cabezas de flecha en la Fig. 9). Además, otros aminoácidos conservados en el segundo bloque (293P, 296R, 298K, 299L y 300R en Sgo1) se necesitaban también todos para la función Sgo1 (asteriscos en la Fig. 9) y el resto 297T no conservado pudo cambiarse por alanina sin alterar la función (círculo en la Fig. 9). Estos resultados indicaban que la similitud estructural marginal observada entre Sgo1 de Schizosaccharomyces pombe y otras proteínas en varios eucariotas es importante. Las plantas y mamíferos llevan dos proteínas similares a shugoshina, lo que sugiere que la posibilidad de que la función de shugoshina diverja para completar la mitosis y la meiosis como en la levadura de escisión.

Las proteínas que codifican el gen homólogo humano de shugoshina están localizadas específicamente en los centrómeros en la mitosis

El presente inventor identificó anteriormente dos supuestas proteínas Sgo humanas, Sgo1 y Sgo2 en la base de datos, aunque su homología de secuencia completa para conocer las proteínas Sgo en cualquier especie distinta de la humana es marginal (Fig. 11a). Para examinar si estas proteínas identificadas en la base de datos son realmente homólogos humanos de Sgo, el presente inventor examinó la localización de las proteínas. Con esta finalidad, el presente inventor cultivó anticuerpos policlonales de conejo contra proteínas recombinantes que se producían en las bacterias. Los anticuerpos Sgo obtenidos detectaron hasta una banda de 70 kD (el peso molecular previsto es de 60 kD) en los extractos celulares de HeLa y la señal se redujo de manera significativa cuando las células eran tratadas con ARNsi que se dirige a ARNm de Sgo1 (Fig. 11b). Asimismo, los anticuerpos de Sgo2 detectaron hasta una banda de 120 kD (peso molecular previsto es de 145 kD), la señal se redujo en los extractos obtenidos de células tratadas con ARNsi de Sgo2 (Fig. 11b). Estos datos indican que tanto Sgo1 como Sgo2 se expresan por lo menos en las células proliferantes HeLa. A continuación, con el objetivo de analizar las proteínas (SEC. ID. nº: 18 y nº: 20, respectivamente hSgo1 y hSgo2) que codifican el gen homólogo de la shugoshina humana (SEC. ID. nº: 17 y nº: 19), que se supuso que eran homólogos de Sgo humano, parte de hSgo1 y hSgo2 se expresó en E. coli y los anticuerpos contra hSgo1 y hSgo2 se produjeron inyectando la proteína en el conejo, se tiñeron las células HeLa con los anticuerpos y simultáneamente con anticuerpos de tubulina y DAPI, y se tiñeron conjuntamente con ADN del huso y cromosómico respectivamente, y se examinó la expresión de las proteínas hSgo1 y hSgo2 que eran ambas endógenas en las células proliferantes. Los resultados se presentan en la figura 12. Como se muestra en la Figura 12, tanto las señales de hSgo1 como de hSgo2 se observaron también como puntos en los cromosomas desde la prometafase hasta la metafase. Como resultado de la inmunotinción, se identificó que ambas proteínas, hSgo1 y hSgo2 están localizadas específicamente en los centrómeros en la fase mitótica. Además, las células HeLa en la prometafase y en la metafase se tiñeron con anticuerpos contra hSgo1 o hSgo2; teñidas conjuntamente a la vez con anticuerpos contra la proteína CENP-A del centrómero y DAPI; y se examinó la expresión de las proteínas hSgo1 y hSgo2. Estos resultados se presentan en la figura 13. Como se muestra en la Figura 13, ambas señales de hSgo1 y hSgo2 se observaron en puntos próximos a los puntos de CENP-A en los cromosomas. Como resultado de lo anterior, se puso de manifiesto que tanto hSgo1 como hSgo2 eran proteínas del centrómero. Además, para examinar esta posibilidad, se tiñó Aurora B, que es una proteína pasajera del cromosoma conocida por estar localizada dentro del cinetocoro desde la profase hasta la metafase. Los puntos de Sgo1 y Aurora B eran prácticamente los mismos en la prometafase y metafase, mientras que Sgo2 se colocó justo fuera de Aurora B (véase la Fig. 13). Como resultado de lo anterior, se puso de manifiesto que tanto hSgo1 como hSgo2 están situadas dentro de los cinetocoros desde la prometafase hasta la metafase. Las vistas representativas del cinetocoro asociado están ampliadas a la derecha. La barra a escala es de 10 \mug.

Las proteínas que codifican el gen homólogo de la shugoshina humana están localizadas específicamente en los centrómeros en la mitosis y desempeñan una función importante para la evolución de la segregación de cromosomas

Se realizaron experimentos con ARNi que expresan a hSgo1 y hSgo2 respectivamente. Los resultados se presentan en la figura 14. Como resultado, se suprimieron las expresiones en algunas proteínas de manera significativa 48 horas después, las células interrumpidas en la mitosis (total, en la figura) se acumularon como se indica en la figura 14. Como se describió anteriormente, se sugirió firmemente que cualquier proteína localizada en los centrómeros en la mitosis desempeña una función importante para la evolución de la segregación de cromosomas. Dado que la acumulación se disolvió suprimiendo un factor BubR1 de comprobación del huso por ARNi, se sugirió que hSgo1 y hSgo2 son función directa o indirecta durante el proceso en el que el huso toma apropiadamente el cinetocoro en los centrómeros como se describe a continuación.

Además, las células para las que se realizaron experimentos que se dirigen a hSgo1 utilizando células HeLa se montaron en un vidrio portaobjetos y se tiñeron con Giemsa. Los resultados se presentan en la figura 15. Se puso de manifiesto que la cromátide asociada en la profase se adhiere fuertemente al punto del centrómero en las células de referencia donde se realizó ARNi; mientras que en las células que suprimen la expresión de hSgo1, donde actuó ARNi, la adherencia fue débil en el punto del centrómero, y se desprendió fácilmente. Por consiguiente, se demostró que hSgo1 desempeña una función importante para mantener la cohesión fuerte en la zona del centrómero en la mitosis en las células proliferantes. Las células mitóticas donde la proteína Sgo1 modificada genéticamente actuó mediante experimentos con ARNi se recogieron y los cromosomas se extendieron para observar la estructura cromosómica directamente. En las células de referencia, se resolvieron las cromátides asociadas a lo largo de las zonas del brazo pero presentaban la limitación primaria en los centrómeros (Fig. 16a i). Sorprendentemente, en las células con Sgo1 agotada, las cromátides asociadas se separaron frecuentemente a lo largo de toda la longitud del cromosoma (Fig. 16a iii). En las muestras donde las cromátides asociadas se situaron densamente próximas, aunque las cromátides asociadas no indicaban la limitación primaria (Fig. 16a iv), esto sugiere que la cohesión centrómera se perdió de manera selectiva. El tratamiento con nocodazol activa el punto de control del huso; por lo que el ciclo celular se detiene en la prometafase. Dicha detención prolongada en la fase M produce la separación completa de la conectividad de las zonas del brazo cromosómico. Por esta razón, las cromátides asociadas están solamente conectadas a los centrómeros y forman el cromosoma "en forma de X" (Fig. 16b, referencia). Como es de esperar, el tratamiento con nocodazol produjo la separación completa de las cromátides asociadas a lo largo de la longitud del cromosoma en las células Sgo1 con ARNi (hasta el 97%) (Figs. 16c y d). Por consiguiente, se demostró que hSgo1 desempeña una función importante para mantener la cohesión fuerte en el punto cromosómico del centrómero en la mitosis en las células proliferantes.

Se realizaron respectivamente experimentos con ARNi que se dirigen a Bub1. Los resultados se presentan en la figura 17. Por consiguiente, desapareció la localización de una de las dos proteínas de hSgo1 y hSgo2 en el centrómero. Este resultado significa que la conclusión, "la localización de shugoshina en el centrómero depende de la Bub1 cinasa", que se encontró en la levadura del presente inventor, se conserva también en los organismos superiores.

A continuación, se produjo el clon donde el ADNc de los genes homólogos de shugoshina de ratón (SEC. ID. nº: 21 y nº: 23) se fusionó con el gen GFP utilizando el vector retrovírico y se expresó en células HeLa humanas. Los resultados se presentan en la figura 18. Por consiguiente, se puso de manifiesto que alguna de las proteínas de fusión de GFP está también localizada conjuntamente con la proteína Bub1 del cinetocoro humano en la mitosis.

El análisis de las hSgo1 y hSgo2 anteriores y los resultados del análisis obtenidos mediante la utilización de genes homólogos de shugoshina de ratón sugirió fuertemente que la proteína similar a la shugoshina en las células animales, que se previó a partir de la secuencia, también presentan conservación funcional con la shugoshina de la levadura.

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Aplicación industrial

La shugoshina de la presente invención que es un factor regulador de la segregación cromosómica conservado en gran medida en células eucarióticas, puede utilizarse provechosamente para estudios del mecanismo de inducción del cáncer en la división somática, las enfermedades de segregación de cromosomas tal como la infecundidad o síndrome de Down en la división meiótica, y similares excepto en la aclaración del mecanismo en la segregación de cromosomas.

<110> Japan Science and Technology Agency

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<120> Nueva proteína centromérica SHUGOSHINA

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<130> P026341EP

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<140> 04819775.0

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<141> 2004-11-24

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<150> JP2003-401943

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<151> 2003-12-01

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<150> JP2004-279450

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<151> 2004-09-27

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<160> 45

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 960

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1944

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 647

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1773

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 590

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2325

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 774

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 556

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 446

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

26

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1554

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 517

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3495

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1525

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 511

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3798

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1265

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

53

54

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dactylicapnos macrocapnos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> levadura

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dactylicapnos macrocapnos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Caenorhabditis elegans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> \lambdaTriplEx

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hSgo1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hSgo2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hSgo1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hSgo2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> siRNA, Target1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> siRNA,_Target2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

80

Claims (11)

1. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 2.

2. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 2 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

3. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 4.

4. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 4 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

5. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6.

6. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

7. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

8. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.

9. Proteína de fusión en la que la proteína según la reivindicación 1, 2, 3, 4, 7 u 8 está unida a una proteína marcadora y/o a una etiqueta del péptido.

10. Anticuerpo que se une específicamente a la proteína según la reivindicación 1, 2, 3, 4, 7 u 8.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo monoclonal.