ES2303140T3 - Nueva proteina centromerica denominada shugoshina. - Google Patents
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Abstract
Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. n°: 2.
Description
Nueva proteína centromérica denominada
shugoshina.
La presente invención se refiere a una proteína
Sgo1 protectora (shugoshina) de la cohesina Rec8 procedente de la
escisión de la levadura Schizosaccharomyces pombe, a su
homólogo y parálogo con actividad reguladora de segregación
cromosómica.
En los eucariotas, la cohesión de la cromátide
asociada se crea durante la fase S del ciclo celular y se mantiene
en toda la fase G2 hasta la M. Durante la mitosis, esta cohesión se
destruye a lo largo de toda la longitud del cromosoma, lo que
permite a la cromátide asociada segregar a los lados opuestos de la
célula (división isométrica) y que asegura que cada célula asociada
reciba una copia de cada cromosoma. En cambio, la meiosis comprende
dos rondas de segregación cromosómica después de una sola ronda de
replicación de ADN, que conduce a la formación de cuatro gametos
haploides procedentes de una célula germinativa diploide. Durante la
meiosis I, los cromosomas homólogos (homólogos) se emparejan para
recombinarse, formar el quiasma en el que una cromátide asociada
procedente de un homólogo se une por enlace covalente a una
cromátide procedente de otro homólogo. Por consiguiente, para que
los homólogos segreguen en la meiosis I, es necesario que se disocie
la cohesión de la cromátide asociada a lo largo de los brazos del
cromosoma para resolver la quiasma. Sin embargo, la cohesión de la
cromátide asociada se conserva en el centrómero hasta la meiosis II,
y utiliza la cohesión centromérica residual cuando se segrega la
cromátide asociada, de la misma manera que lo hace en la mitosis.
De este modo, la división meiótica requiere la cohesión de la
cromátide asociada para que se disocie en dos etapas. Sin embargo,
el mecanismo molecular para la protección de la cohesión
centromérica solamente durante la meiosis I y solamente en el
centrómero ha quedado sin aclarar (por ejemplo, véase Annu. Rev.
Genet. 35, 673-745 (2001)).
Existen importantes claves en lo que se refiere
a la naturaleza molecular en la cohesión de la cromátide asociada y
el mecanismo que disocia la cohesión de la cromátide asociada al
comienzo de la anafase (por ejemplo, véase Annu. Rev. Genet.
35, 673-745 (2001); Curr. Opin. Cell. Biol.
12, 297-301 (2000); Curr. Biol. 13,
R104-14 (2003); Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.
17, 753-77 (2001); Genes Dev. 16,
399-414 (2002)). En varios eucariotas, la cohesión
de la cromátide asociada depende de un complejo de la multisubunidad
cohesina e incluye a Scc1 (Rad21 en la escisión de la levadura
Schizosaccharomyces pombe). La degradación dependiente del
complejo (APC) que estimula la anafase de la securina, Cut2/Pds1,
permite disociar la Cut1/Esp1 endopeptidasa (separasa), que a su
vez escinde a Rad21/Scc1, disociando la cohesión de la cromátide
asociada. Durante la meiosis, la subunidad de cohesión Rad21/Scc1
es reemplazada por una contrapartida meiótica, Rec8 (por ejemplo,
véase Cell 98, 91-103 (1999); Mol. Cell.
Biol. 19, 3515-3528 (1999); Nature 400,
461-4 (1999); Genes Dev. 15,
1349-60 (2001); J. Cell. Biol. 160,
657-70 (2003)). Como el complejo Rec8 reside
solamente en el centrómero después de la meiosis I y la eliminación
de Rec8 destruye la cohesión centromérica, la presencia de Rec8 en
el centrómero se cree que proporciona persistencia de la cohesión en
toda la meiosis I (por ejemplo, véase Nat. Cell. Biol. 1,
E125-7 (1999)). Varias líneas de prueba sugieren que
Rec8 a lo largo de los brazos del cromosoma es escindido por la
separasa en la anafase I mientras que Rec8 centromérica está
protegida específicamente hasta la metafase II (por ejemplo, véase
Cell. 103, 387-98 (2000); Embo. J. 22,
5643-53 (2003)). La levadura SPO13 en germinación
ha sido involucrada en la protección de Rec8 centromérica (por
ejemplo, véase Genes Dev. 16, 1659-71
(2002); Genes Dev. 16, 1672-81 (2002)), pero
SPO13 no es centromérica y puede funcionar indirectamente. La
MEI-S332 de Drosophila es una proteína que
reside en el centrómero, es requerida para la persistencia de la
cohesión centromérica durante la meiosis I y tiene propiedades de
un protector experimental de la cohesión meiótica centromérica,
aunque los detalles de dicha protección no se han aclarado hasta el
momento (por ejemplo, véase Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17,
753-77 (2001); Cell 83,
247-256 (1995)). A pesar de la terminación de los
proyectos de secuenciado genómico en varios organismos, no ha
surgido ningún homólogo de estas proteínas, que impida a la
formulación de una vista generalizada de la protección.
Simultáneamente, los estudios en escisión de la levadura han
aclarado la importancia de la heterocromatina pericentromérica para
la incorporación de complejos centroméricos de Rec8 y asegurar la
cohesión centromérica durante la meiosis I (por ejemplo, véase
Science 300, 1152-5 (2003)). Sin embargo, la
heterocromatina pericentromérica no puede proporcionar sola la
protección específica de Rec8 en la meiosis I hacia la meiosis
II.
Casi todos los eucariotas incluyendo el humano
se reproducen por reproducción sexual predominante de manera
evolutiva con una mezcla de genoma. La meiosis que reduce el número
de cromosomas a la mitad es una parte central del mecanismo de
reproducción sexual. En la mitosis somática, dos cinetocoros de la
cromátide asociada son captados por el microtúbulo del huso
extendido desde los polos opuestos y la cromátide asociada se
segrega uniformemente a ambos polos disolviendo simultáneamente la
cohesión de los brazos y cinetocoro (división isométrica). En
cambio, en la meiosis I los centrómeros de las cromátides asociadas
son captados por el microtúbulo del huso extendido en el mismo polo
y segregado al mismo polo a la vez que conserva la cohesión en el
centrómero (división meiótica). A continuación, durante el primer
momento en la meiosis II se disuelve la cohesión de la parte del
centrómero de la cromátide asociada y se separa hacia un polo o el
otro de los dos polos respectivamente, lo que culmina en la
generación de cuatro gametos haploides aproximados. La división
meiótica específica para la meiosis es una modalidad de segregación
cromosómica conservada en casi todos los eucariotas, desde la
levadura hasta el hombre, sin embargo el mecanismo regulador a
nivel molecular ha continuado siendo un enigma desde hace mucho
tiempo. El presente inventor ha demostrado que el factor de cohesión
cromosómico específico para la meiosis, cohesina desempeña una
función esencial en esta regulación utilizando levadura de escisión
(Nature 400, 461-4 (1999); Science
300, 1152-5 (2003); Nature 409,
359-363 (2001)). Un objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar la proteína Sgo1 (shugoshina) con
cinetocoro nuevo específico para la meiosis procedente de la
levadura de escisión Schizosaccharomyces pombe y un homólogo
o parálogo de la misma con actividad reguladora de segregación
cromosómica, como factor que asegura la retención de la unidirección
y cohesión en el centrómero asociado en la meiosis I en cooperación
con la cohesina.
La meiosis comprende dos etapas de divisiones
nucleares especializadas para producir gametos haploides. Para
llevar a cabo esto, es necesario que la cohesión de la cromátide
asociada se disocie paso a paso, en primer lugar en los brazos del
cromosoma en la anafase I y en segundo lugar en los centrómeros en
la anafase II. En particular, los factores que protegen la cohesión
centromérica durante la meiosis I han permanecido hasta ahora sin
disolver. Para esclarecer estas proteínas que protegen a Rec8
durante la anafase, el presente inventor identificó en los genes de
la levadura de escisión un gen que inhibe el crecimiento mitótico y
evita la separación de la cromátide asociada en la anafase, cuando
se expresa conjuntamente con Rec8. En este método, se identificó la
proteína específica para la meiosis que es un protector de Rec8 en
la levadura de escisión y protege la Rec8 centromérica (Shugo) de
la degradación en la anafase I y se denominó Sgo1 (Shugoshina, en
japonés "espíritu guardián"). Se identificó también que la
Shugoshina desempeña una función importante en la segregación
mitótica del cromosoma y a continuación se identificó un homólogo
de la levadura Sgo1 en germinación y un parálogo Sgo2 mitótico de
la levadura de escisión. Se identificó una similitud marginal entre
Sgo1 y MEI-S332 de Drosophila, y el homólogo
Sgo1 en otros eucariótidas. Las proteínas similares a la Shugoshina
en las células animales, que se previeron a partir de la secuencia,
también presentan conservación funcional con la Shugoshina de la
levadura. La presente invención se ha completado de este modo
basándose en este conocimiento.
En la presente memoria se describe (1) un ADN
que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a) una proteína
que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID.
nº: 2, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se sustituyen o se
añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº:
2 y con una actividad reguladora de segregación cromosómica; (2) un
ADN que comprende una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº:
1 o una secuencia complementaria de la misma; (3) un ADN que
contiene parte o toda una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID.
nº: 1 o una secuencia complementaria de la misma, y que codifica a
una proteína que tiene una actividad reguladora de la segregación
cromosómica; (4) un ADN que se hibrida con el ADN según "2" en
condiciones severas y que codifica una proteína que tiene una
actividad reguladora de la segregación cromosómica. La presente
invención se refiere a (5) una proteína constituida por una
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2; y (6) una
proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la que uno
o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en una
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 y que tiene
una actividad reguladora de la segregación cromosómica.
Asimismo, en la presente memoria (7) se describe
un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a) una
proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID. nº: 4, (b) una proteína constituida por una secuencia de
aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan,
sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID. nº: 4 y con actividad reguladora de segregación
cromosómica; (8) un ADN que comprende una secuencia de bases
mostrada en la SEC. ID. nº: 3 o una secuencia complementaria de la
misma; (9) un ADN que contiene parte o toda una secuencia de bases
representada en la SEC. ID. nº: 3 o una secuencia complementaria de
la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad
reguladora de la segregación cromosómica; (10) un ADN que se
hibrida con el ADN según "8" en condiciones severas y que
codifica una proteína que tiene actividad reguladora de segregación
cromosómica. La presente invención se refiere también a (11) una
proteína constituida por una secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID. nº: 4; y (12) una proteína constituida por una secuencia
de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan,
sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID. nº: 4 y con actividad reguladora de segregación
cromosómica.
Asimismo, en la presente memoria (13) se
describe un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada
en la SEC. ID. nº: 6, (b) una proteína constituida por una
secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se
eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. nº: 6 y con actividad reguladora de
segregación cromosómica; (14) un ADN que comprende una secuencia de
bases represenada en la SEC. ID. nº: 5 o una secuencia
complementaria de la misma; (15) un ADN que contiene parte o toda
una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 5 o una
secuencia complementaria de la misma, y que codifica a una proteína
que tiene una actividad reguladora de la segregación cromosómica;
(16) un ADN que se hibrida con el ADN según "14" en condiciones
severas y que codifica una proteína que tiene actividad reguladora
de segregación cromosómica. La presente invención se refiere además
a (17) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. nº: 6; y (18) una proteína constituida por
una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se
eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. nº: 6 y con actividad reguladora de
segregación cromosómica.
Asimismo, en la presente memoria (19) se
describe un ADN que codifica una proteína (a) o (b) siguientes: (a)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20,
(b) una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos en la
que uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden en
una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10,
nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20; (20) un ADN que comprende
una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 7, nº: 9, nº:
11, nº: 13, nº: 15, nº: 17 o nº: 19 o una secuencia complementaria
de la misma, y que codifica a una proteína que tiene una actividad
reguladora de la segregación cromosómica; (21) un ADN que contiene
parte o toda una secuencia de bases mostrada en la SEC. ID. nº: 7,
nº: 9, nº: 11, nº: 13, nº: 15, nº: 17 o nº: 19 o una secuencia
complementaria de la misma, y que codifica a una proteína que tiene
una actividad reguladora de la segregación cromosómica; (22) un ADN
que se hibrida con el ADN según "7", "9", "11",
"13", "15", "17" o "19" en condiciones severas y
que codifica una proteína que tiene actividad reguladora de
segregación cromosómica. La presente invención se refiere incluso
además a (23) una proteína constituida por una secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14,
nº: 16, nº: 18 o nº: 20, y que tiene actividad reguladora de
segregación cromosómica; y (24) una proteína constituida por una
secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se
eliminan, sustituyen o añaden en una secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº:
18 o nº: 20 y con actividad reguladora de segregación
cromosómica.
Además, la presente invención se refiere a (25)
una proteína de fusión en la que la proteína según "5",
"6", "11", "12", "23" ó "24" se une a una
proteína marcadora y/o a una etiqueta peptídica; (26) un anticuerpo
que se une específicamente a la proteína según "5", "6",
"11", "12", "23" ó "24"; y (27) el anticuerpo
según "26", que es un anticuerpo monoclonal.
La Figura 1 es una serie de fotografías que
demuestran que las cromátides asociadas no se segregan durante la
mitosis por expresión conjunta de Sgo1 y Rec8 en la presente
invención. a.) Las cepas cen2-GFP que expresan los
genes indicados por los activadores endógenos (un activador
constitutivo de cromatina para rad21+ o rec8+, y un activador
represor de tiamina Pnmt1 para Sgo1+) se sembraron en una placa con
tiamina agotada. b.) Se cultivaron muestras de células
Padh1-rec8+ y Pnmt1-sgo1+ durante 15
horas a 30ºC después de agotar la tiamina. La falta de segregación
de cen2-GFP (asterisco) se identificó en las células
de cruce tabicadas. c.) Las faltas de segregaciones de
cen2-GFP se contaron (n>100). d.) Se cultivaron
las cepas Padh1-rec8+-GFP con o sin la utilización
de Pnmt1-sgo1+ de la misma manera que (b). Se
presentan las muestras de células en la interfase y en la
anafase.
La Figura 2 es una serie de fotografías que
demuestra que la segregación de la cromátide asociada se emprendió
en la mitosis por expresión de la Rec8 no escindible. Se integró el
plásmido pREP41-rec8-RDRD (que
expresa la Rec8 no escindible (Embo. J. 22,
5643-53 (2003))) en el cromosoma de las cepas de la
célula cen2-GFP (+Rec8-RDRD), y las
células se sembraron en placas con o sin la presencia de tiamina.
Las células de la cepa hospedadora (-Rec8-RDRD) se
cultivaron del mismo modo como referencia. Obsérvese que
Rec8-RDRD se expresó solamente en la placa sin
tiamina. Se cultivaron muestras de las células en medio de cultivo
durante 15 horas a 30ºC después de la eliminación de tiamina.
La Figura 3 es una serie de fotografías que
demuestran que se requiere sgo1 de la presente invención para
proteger a Rec8 y de este modo la cohesión en los centrómeros
aumenta durante la anafase de la meiosis I. a.) Como para uno de los
homólogos marcados con cen2-GFP, se observó
segregación durante la meiosis en células naturales y sgo1\Delta
(n>170). Se ilustra un modelo de segregación normal de
cen2-GFP (izquierda). Se presentan muestras de
células sgo1\Delta (derecha). b.) La separación de los puntos de
cen2-GFP asociados después de la meiosis I
(interrupción de mes1\Delta) es evidente en las células
sgo1\Delta. c.) La señal de Rec8-GFP se observó en
las células indicadas en la anafase I tardía (n>30) y en la
prometafase II (n>100), y se hizo el recuento de la frecuencia
del Rec8-GFP centromérica presentada en las células.
Se observaron los husos mediante la expresión de
CFP-Atb2 (\alpha2-tubulina)
(Curr. Biol. 11, 836-45 (2001)). d.) Las
concentraciones de Rec8-GFP en todos los puntos
cromosómicos indicados en las células interrumpidas se midieron
antes de la meiosis I (interrupción de mei4\Delta) por análisis
ChIP con utilización de anticuerpos anti-GFP. El
panel inferior presenta esquemáticamente el cromosoma I de
Schizosaccharomyces pombe y los cebadores (cnt, imr, dg, dh,
lys1, mes1) se utilizaron aquí.
La Figura 4 es una serie de fotografías que
demuestra que Sgo1 de la presente invención se localiza en las zonas
pericentrómeras durante la meiosis I. a.) Se tomaron muestras de la
meiosis simultánea de las cepas de células
pat1-114/pat1-114 diploides
(Embo. J. 22, 5643-53 (2003)), se controló la
división nuclear meiótica por tinción con DAPI y se detectó el nivel
de proteínas de Sgo1 por inmunoelectrotransferencia Western mediante
la utilización de anticuerpos anti-Sgo1. b.) Sgo1
(verde) se tiñó por contraste con tubulina (rojo) y DAPI
(4'6'-diamidino-2-fenilindol)
(azul) en las etapas indicadas en las células meióticas. c.) Se
examinó una célula sgo1+-GFP que se expresa conjuntamente con
mis6+-CFP bajo microscopia de fluorescencia. Se asociaron
Sgo1-GFP (verde) y Mis6-CFP (rojo).
d.) Las concentraciones de Sgo1-GFP en todos los
puntos cromosómicos indicados en las células detenidas en la
metafase I se midieron por el análisis ChIP con la utilización de
anticuerpos anti-GFP. Se utilizaron los mismos
cebadores que para la Fig. 2d en el sincronismo con cebadores
adicionales a mat (zona de heterocromatina en el locus de tipo
emparejamiento) y TAS (secuencia asociada al telómero). e.) Se
detectó el Sgo1-GFP (verde) en la metafase I en las
células indicadas que expresan a CFP Atb2 para visualizar los husos
(rojo). f.) Rec8-HA se expresó con o sin
Sgo1-FLAG en las células proliferantes y los
extractos se inmunoprecipitaron con anticuerpo
anti-FLAG. g.) Modelo para la acción de shugoshina
en la meiosis. La shugoshina protege los complejos de Rec8
centroméricos de la escisión por la separasa al comienzo de la
anafase I, de este modo mantiene la cohesión centromérica hasta la
meiosis II. La shugoshina se degrada dependiendo de la APC durante
la anafase I.
La Figura 5 es una serie de fotografías que
demuestran el cambio en función del tiempo de los niveles de
expresión de Sgo1 y Rec8 en el cultivo simultáneo de las cepas
haploides de la célula pat1-114 (wt), y de las
células cut1-206 o Prad21-slp1. La
expresión de slp1+ (homólogo CDC20 de la levadura de escisión
requerido para la activación de la APC (Mol. Cell. Biol. 17,
742-50 (1997)) se representó durante la meiosis en
las células Prad21-slp1 en las que el activador slp1
fue remplazado por rad21. La división nuclear meiótica fue
controlada mediante tinción con DAPI y las concentraciones en
proteína de Sgo1, Rec8 y tubulina (referencia) se midieron por
electroinmunotransferencia Western mediante la utilización de
anti-Sgo1, anti-Rec8 y anticuerpos
anti-tubulina, respectivamente. Aunque las células
cut1-206 junto con la cinética normal condujeron a
la degradación de Sgo1, se retardó la degradación de Rec8. Las
células Prad21-slp1 presentaban degradación
retardada de Sgo1 así como Rec8. Las cabezas de flecha indican un
producto de escisión de Rec8 por la separasa Cut1.
La Figura 6 es una serie de fotografías que
demuestran que la expresión ectópica de sgo1+ inhibe el crecimiento
del mutante cut1-206. El activador sgo1+ cromosómico
fue sustituido por Pnmt1 o Pnmt41 (versión más débil de Pnmt1) y se
examinó el efecto del crecimiento mitótico en las células
cut1-206 sensibles a la temperatura. Se sembraron
las células indicadas en una placa sin tiamina y se cultivaron
durante 3 días a 28ºC. Las células cut1-206 que
expresan de forma moderada a Sgo1 por Pnmt1, interrumpieron el
crecimiento mitótico incluso a la temperatura permitida, mientras
que las células cut1+ crecieron normalmente.
La Figura 7 es una serie de fotografías que
demuestran que Sgo2 de la presente invención desempeña una función
importante en la mitosis en el centrómero. a.) Diluciones en serie
de los cultivos indicados se sembraron como puntos en placas YEA que
contenían 0, 5 ó 10 \mug/ml de TBZ, y se cultivaron durante 3 días
a 30ºC. b.) Las cepas indicadas se sembraron en placas YEA y se
cultivaron durante 3 días a 30ºC. c.) Se detectó
Sgo2-GFP (verde) en la anafase I en células de tipo
natural y bub1\Delta que expresa a CFP-Atb2 para
observar los husos (rojo). El ADN se tiñó con Hoechst (azul). Se
presentan también células de tipo natural en anafase. d.) Las
células sgo2+-GFP mis6+-HA se fijaron y se tiñeron con anticuerpos
anti-GFP y anti-HA. e.) Se midieron
las concentraciones de Sgo2-GFP en todos los puntos
cromosómicos indicados en las células interrumpidas en la
prometafase o en las células no simultáneas mediante análisis
ChIP.
La Figura 8 es una serie de fotografías que
presentan los resultados del análisis de shugoshina ScSgo1 de la
levadura en germinación de la presente invención. a.) Diploides
ScSGO1-GFP de la levadura en germinación en
proliferación se fijaron con metanol y se tiñeron por contraste con
DAPI. b.) Se fijaron las células ScSGO1-Myc
NDC10-HA y se tiñeron con DAPI y anticuerpos contra
Myc y HA. c.) Los diploides ScSGO1-GFP que producen
la meiosis en el medio de cultivo se fijaron con metanol y se
tiñeron por contraste con DAPI. d.) Diluciones en serie de los
cultivos indicados se sembraron por puntos en placas YPD que
contenían 0 ó 15 \mug/ml de benomilo. e.) Se analizó la pérdida de
cromosomas en los mutantes de tipo natural (wt) y Scsgo1\Delta
mediante un ensayo de sectorización de colonias. La pérdida de
fragmentos cromosómicos no esenciales produjo un sector rojo en una
colonia blanca. Como referencia positiva, se utilizó ubr1\Delta
mutante (Nature 410, 955-9 (2001)). Las
frecuencias de las colonias de sectorización se presenta en la parte
inferior (n>120). f.) Muestras de segregación de
cenV-GFP en tetradas Scsgo1\Delta. Los modelos de
segregación en tetradas se clasificaron en su mayor parte como uno
de los tres mostrados en la parte inferior. Se muestra también cada
población (n=200). g.) Los diploides ScSGO1-Myc
fueron producidos por meiosis simultánea y se examinó la segregación
de cenV-GFP marcada en uno de los dos homólogos en
la meiosis I y la meiosis II. Aunque la mayoría de las células
produjeron el modelo de segregación de reducción en la meiosis I
(96%, n=207), la frecuencia de falta de segregación fue superior en
la meiosis II (34%, n=322). h.) Las células marcadas con
cenV-GFP en ambos homólogos fueron producidas para
la meiosis y se tiñeron por contraste con anticuerpo
anti-tubulina y DAPI. Las células en la anafase I
tardía se examinaron por los puntos de cenV-GFP. Las
células ScSGO1-Myc mostraron frecuentemente puntos
de división en cenV-GFP en el par de cromátides
asociadas (72%, n=138), mientras que las células de referencia
naturales no (<2%, n=106).
La Figura 9 es una serie de fotografías que
muestran secuencias de las zonas superenrolladas del terminal amino
y de las zonas básicas del terminal carboxi de proteínas similares a
la shugoshina en varios organismos. Las secuencias primarias de las
zonas del terminal amino de Sgo1 se conservan en la
Schizosaccharomyces pombe (Sgo1 y Sgo2), levadura en
germinación (ScSgo1) y Neurospora crassa (B23G1.060),
mientras que las secuencias que contienen MEI-S332
en otras especies no se conservan, todas llevan supuestamente el
motivo superenrollado (previsto por el programa COILS
(Science 252, 1162-4 (1991))). Véanse las
cabezas de la flecha, asteriscos y círculos en las fotografías.
La Figura 10 es una fotografía que muestra los
resultados del examen de las mutaciones de sgo1 que se generaron en
las zonas conservadas. Tanto las células h+sgo1\Delta y
h-sgo1\Deltacen2-GFP transformadas
con el plásmido indicado, se mezclaron en placas SPA y se
controlaron para la segregación de cen2-GFP en la
meiosis II. Un plásmido que lleva pREP81 una versión débil del
activador nmt1 reprimible por tiamina se utilizó para expresar sgo1.
Las células de referencia que llevan el plásmido
pREP81-sgo1 (wt) presentaban casi el 80% de
segregación en la meiosis II, mientras que las células que no
expresan ninguna segregación del alelo sgo1 presentaban segregación
aleatoria (50% de segregación). Algunas de las mutaciones probadas,
excepto la mutación 297TA de la zona no conservada, no
complementaron a sgo1\Delta en este ensayo. Se muestran las medias
de dos experimentos independientes (n>100).
La Figura 11 (a) es una fotografía que muestra
la representación esquemática de las proteínas de la familia
shugoshina. Un superenrollamiento (rojo) previsto y una zona básica
(azul) conservada existe en las zonas del terminal N y del terminal
C respectivamente. Además, la figura 11 (b) es una fotografía que
muestra el resultado del análisis en los extractos de células HeLa
por electroinmunotransferencia Western después de la transfección
con ARNsi.
La Figura 12 es una serie de fotografías que
presenta los resultados en los que las células HeLa se tiñeron
(verde) con anticuerpo contra hSgo1 o hSgo2 preparados a partir de
conejo, teñidas simultáneamente con anticuerpo de tubulina y DAPI, y
a continuación respectivamente teñidas conjuntamente con huso (rojo)
y ADN cromosómico (azul). Entre tanto, las células se fijaron con
paraformaldehído.
La Figura 13 es una serie de fotografías que
presenta los resultados de las células HeLa en la prometafase y
metafase teñidas con anticuerpos contra hSgo1 o hSgo2 (verde) y
simultáneamente teñidas conjuntamente con anticuerpos contra la
proteína CENP-A del centrómero (a, c; rojo),
anticuerpos contra la proteína pasajera Aurora B del cromosoma
localizado en el cinetocoro desde la profase hasta la metafase (b,
d; rojo) y DAPI (azul). Tanto las señales de hSgo1 como las de hSgo2
presentaban señales en los puntos próximos a los puntos de
CENP-A en el cromosoma. De lo anterior, se deduce
que tanto hSgo1 como hSgo2 son proteínas centroméricas. Además,
ambos puntos de Sgo1 y Aurora B eran prácticamente los mismos en la
prometafase y en la metafase, mientras que Sgo2 se colocó justo
fuera de Aurora B. De lo anterior, se deduce que tanto hSgo1 como
hSgo2 se colocaron dentro del cinetocoro desde la prometafase hasta
la metafase.
La Figura 14 es una fotografía que presenta los
resultados de los experimentos con ARNi de hSgo1 y hSgo2 dirigidos
respectivamente. Las expresiones en algunas proteínas se suprimieron
significativamente después de 48 horas, por lo que se acumularon las
células interrumpidas en la mitosis (total en la figura). Como la
acumulación se disolvió suprimiendo un factor con punto de control
del huso BubR1 por ARNi, se sugirió que hSgo1 y hSgo2 directa o
indirectamente funcionan durante el proceso en el que el huso toma
el cinetocoro propiamente en los centrómeros.
La Figura 15 es una serie de fotografías que
presentan los resultados, donde se realizaron experimentos con ARNi
dirigido a hSgo1 utilizando células HeLa y a continuación se
montaron las células en el vidrio de un portaobjetos y se tiñeron
con Giemsa. Se puso de manifiesto que la cromátide asociada se
adhería fuertemente al punto del centrómero en las células de
referencia; pero suprimió hSgo1 en las células, la adhesión en el
punto del centrómero era débil y se destacaba fácilmente por la
operación del experimento.
La Figura 16 es una serie de fotografías que
demuestra que se requieren Sgo1 y Bub1 para la condensación en los
centrómeros en la mitosis. (a) Por tratamiento con ARNsi, el
cromosoma extendido se realizó en las células HeLa mitóticas teñidas
con Giemsa. Se muestra la extensión representativa junto con las
frecuencias de aparición. Más de un centenar de profases y metafases
se observaron para cada ARNi. Un ejemplo de par de cromátides
asociadas está ampliado en la parte superior. (b) Después del
tratamiento con nocodazol durante 4 horas, el cromosoma extendido se
observó en las células interferidas con ARNi. Ejemplos de la
extensión se muestran con la frecuencia (n > 100). (c) Se fijaron
células HeLa que expresan a Scc1-myc 36 horas
después del tratamiento con los ARNsi. Se inmunotiñeron las células
con anti-myc-anticuerpo (verde) y
anti-centrómero-anticuerpo (ACA)
(rojo). El ADN se tiñó con DAPI (azul). (d) Se muestran cantidades
de células que presentan tinción con Scc1-myc. Las
células que expresan a Scc1-myc en esta estirpe
celular eran inferiores al 25%. La barra a escala muestra 10
\mum.
La Figura 17 es una serie de fotografías que
presenta los resultados de los experimentos con ARNi que se dirigen
a Bub1, respectivamente. (A, B) Se realizaron experimentos con ARNi
que se dirigen a Bub1 respectivamente y dieron como resultado la
desaparición de la localización de ambas proteínas, hSgo1 y hSgo2 en
el centrómero. (C, D) Como la localización de ambas proteínas, hSgo1
y hSgo2 en el centrómero era normal en los experimentos con ARNi que
se dirigen a una referencia, BubR1; se aseguró la significación de
los resultados de Bub1. Se demuestra que Bub1 y BubR1 son similares
pero proteínas diferentes y la localización de hSgo1 y hSgo2 en el
centrómero depende de Bub1 (A, B), pero no en BubR1 (C, D).
La Figura 18 es una serie de fotografías que
presenta los resultados de un clon en el que el ADNc del gen
homólogo a shugoshina de ratón (SEC. ID. nº: 21 y nº: 23) se fusiona
con el gen de GFP generado utilizando vector retrovírico y se
expresa en células HeLa humanas. Se puso de manifiesto que
cualquiera de las proteínas de fusión de GFP está localizada
conjuntamente con la proteína Bub1 del cinetocoro humano en la
mitosis.
Como en el caso de una proteína de la presente
invención, pueden ponerse como ejemplos una proteína Sgo1
(shugoshina) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC. ID. nº: 2 y que tiene una actividad reguladora de
segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 donde uno o varios
aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que tiene actividad
reguladora de la segregación cromosómica; un parálogo Sgo2 de la
proteína Sgo1 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC. ID. nº: 4 donde uno o varios aminoácidos se eliminan,
sustituyen o añaden y que tiene actividad reguladora de la
segregación cromosómica; un homólogo ScSgo1 en Saccharomyces
cerevisiae de la proteína ScSgo1 que comprende una secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6 y que tiene una actividad
reguladora de la segregación cromosómica; una proteína que comprende
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 6 donde uno
o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que tiene
actividad reguladora de la segregación cromosómica; una proteína
(NC) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC.
ID. nº: 8 y que presenta una actividad reguladora procedente de
Neurospora crassa de la segregación cromosómica; una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID. nº: 8 donde uno o varios aminoácidos se eliminan,
sustituyen o añaden y que tiene actividad reguladora de segregación
cromosómica; una proteína (At) que comprende una secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 10 o nº: 12 y que presenta
actividad reguladora procedente de Arabidopsis de la
segregación cromosómica; una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 10 o nº: 12 donde uno o
varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y que presenta
actividad reguladora de la segregación cromosómica; una proteína
(Mm) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC.
ID. nº: 14 o nº: 16 y que tiene actividad reguladora procedente de
un ratón de la segregación cromosómica; una proteína que comprende
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 14 o nº: 16
donde uno o varios aminoácidos se eliminan, sustituyen o añaden, y
que presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; una
proteína (Hs) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC. ID. nº: 18 o nº: 20 y que presenta actividad reguladora
procedente del ser humano de la segregación cromosómica; y una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID. nº: 18 o nº: 20 donde uno o varios aminoácidos se eliminan,
sustituyen o añaden y que presenta actividad reguladora de la
segregación cromosómica. Además, como en el caso de la actividad
reguladora de la segregación cromosómica descrita anteriormente,
aunque no está especialmente limitada por la condición de que las
actividades regulen la segregación cromosómica, por ejemplo, las
actividades que regulan correctamente la segregación cromosómica de
las células germinativas y/o de la división de las células
somáticas son preferibles y las actividades que protegen (Shugo) el
centrómero de la cromátide asociada de la separación en la meiosis
es más preferible. Además, las proteínas de la presente invención
pueden prepararse por los procedimientos conocidos basados en la
información de la secuencia del ADN y similares, y las
modificaciones no están limitadas a levaduras, ratones, seres
humanos y similares. Además, por ejemplo, Sgo1 (shugoshina) mutante
que es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
mostradas en la SEC. ID. nº: 2, donde uno o varios aminoácidos se
eliminan, sustituyen o añaden y que tiene una actividad reguladora
de la segregación cromosómica, puede prepararse por los
procedimientos ordinarios tales como la manipulación genética
conocida, la mutación puntual y similares.
Como en el caso de un ADN, se describe asimismo
en la presente memoria un ADN que codifica una proteína de la
presente invención que tiene actividad reguladora de la segregación
cromosómica: un ADN procedente de la levadura de escisión
Schizosaccharomyces pombe, que comprende una secuencia básica
mostrada en la SEC. ID. nº: 1 o nº: 3 o una secuencia
complementaria de la misma; y un ADN que contiene parte o la
totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que
presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN
procedente de Saccharomyces cerevisiae, que comprende una
secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 5 o una secuencia
complementaria de la misma; y un ADN que contiene parte o la
totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que
presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN
procedente de Neurospora crassa, que comprende una secuencia
básica mostrada en la SEC. ID. nº: 7 o una secuencia complementaria
de la misma y que codifica una proteína que presenta actividad
reguladora de segregación cromosómica; y un ADN que contiene parte
o la totalidad de estas secuencias, que codifica una proteína que
presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica: un ADN
procedente de Arabidopsis, que comprende una secuencia
básica mostrada en la SEC. ID. nº: 9 o nº: 11 o una secuencia
complementaria de la misma y que codifica una proteína que presenta
actividad reguladora de la segregación cromosómica; y un ADN que
contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una
proteína que presenta actividad reguladora de la segregación
cromosómica: un ADN procedente de ratón, que comprende una secuencia
básica mostrada en la SEC. ID. nº: 13 o nº: 15 o una secuencia
complementaria de la misma y que codifica una proteína que presenta
actividad reguladora de la segregación cromosómica; y un ADN que
contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que codifica una
proteína que presenta actividad reguladora de la segregación
cromosómica: un ADN procedente del hombre, que comprende una
secuencia básica mostrada en la SEC. ID. nº: 17 o nº: 19 o una
secuencia complementaria de la misma y que codifica una proteína que
presenta actividad reguladora de la segregación cromosómica; y un
ADN que contiene parte o la totalidad de estas secuencias, que
codifica una proteína que presenta actividad reguladora de la
segregación cromosómica: un ADN que se hibrida con el ADN anterior
en condiciones severas, que codifica una proteína que presenta
actividad reguladora de la segregación cromosómica: y similares,
pueden ponerse como ejemplos.
Estos ADN pueden prepararse por procedimientos
conocidos basados en la información de la secuencia del ADN, tal
como un gen o un banco de ADNc de levadura, ratón, seres humanos y
similares. Además, utilizando una secuencia de bases mostradas en
las SEC. ID. nº: 1, nº: 3, nº: 5, nº: 7, nº: 9, nº: 11, nº: 13, nº:
15, nº: 17, nº: 19, u otras o una secuencia complementaria de las
mismas, o parte o la totalidad de estas secuencias como sonda, los
bancos de ADN de levadura, ratón, seres humanos o similares se
hibridan en condiciones severas, y el ADN deseado que codifica una
proteína que presenta actividad reguladora de la segregación
cromosómica puede obtenerse aislando los ADN que se hibridan con
las sondas. En cuanto a una condición de hibridación para obtener
el ADN; puede ponerse como ejemplo la hibridación a 42ºC y el
tratamiento de lavado mediante un tampón que contiene 1\times SSC
y 0,1% de SDS a 42ºC; preferentemente la hibridación a 65ºC y el
tratamiento de lavado mediante un tampón que contiene 0,1\times
SSC y 0,1% de SDS a 65ºC. Además, en cuanto a un elemento que
afecta la severidad de la hibridación, existen varios elementos
aparte de las condiciones de temperatura descritas anteriormente,
los expertos en la materia pueden actualizar la severidad
equivalente a la de la hibridación ejemplificada en lo anterior con
una combinación apropiada de varios elementos.
En cuanto a una proteína de fusión de la
presente invención, puede utilizarse cualquier proteína con la
condición de que la proteína de la presente invención esté unida a
una proteína marcadora y/o a una etiqueta peptídica, ya que para
una proteína marcadora, no está limitada especialmente pero una
proteína marcadora convencionalmente conocida, por ejemplo, la
fosfatasa alcalina, la zona Fc del anticuerpo, HRP, GFP y similares
pueden ponerse como ejemplo. Además, como en el caso de la etiqueta
peptídica de la presente invención, las etiquetas peptídicas
convencionalmente conocidas tales como Myc, His, FLAG y GST pueden
ponerse como ejemplos específicamente. La proteína de fusión puede
producirse por los procedimientos ordinarios; y es útil para la
purificación de la proteína Sgo1 y similares utilizando la afinidad
de Ni-NTA y la etiqueta His y para un reactivo para
estudio en la técnica.
En cuanto a un anticuerpo que se une
específicamente a una proteína de la presente invención, los
anticuerpos inmunoespecíficos tales como el anticuerpo monoclonal,
el anticuerpo policlonal, el anticuerpo híbrido, el anticuerpo
monocatenario, el anticuerpo humanizado y similares, pueden ponerse
como ejemplos de manera específica. Estos anticuerpos pueden ser
producidos por los procedimientos habituales mediante la utilización
de proteínas tal como la Sgo1 mencionada anteriormente o parte de
la misma como antígeno, y entre ellas es preferible un anticuerpo
monoclonal desde el punto de vista de la especificidad. Los
anticuerpos tales como un anticuerpo monoclonal son útiles para
aclarar la localización de Sgo1 y otros in vivo.
Los anticuerpos de la presente invención
mencionados anteriormente pueden generarse mediante la utilización
de un protocolo común administrando las proteínas de la presente
invención o los fragmentos que contienen el epítopo de las mismas o
las células que expresan la proteína en sus superficies de la
membrana, para animales (preferentemente no humanos). Por ejemplo,
para la preparación de un anticuerpo monoclonal puede utilizarse
cualquier procedimiento tal como hibridoma (Nature 256,
495-497, 1975), trioma, hibridoma de linfocitos B
humanos (Immunology Today 4, 72, 1983) e hibridoma EBV
(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, págs.
77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985), mediante el cual
se generan anticuerpos a partir de cultivos de estirpes celulares
continuas.
Para generar un anticuerpo monocatenario contra
una proteína de la presente invención, puede aplicarse un
procedimiento para la preparación del anticuerpo monocatenario
(patente US nº 4.946.778). Además, para expresar el anticuerpo
humanizado, puede utilizarse un ratón transgénico u otros mamíferos,
los clones que expresan una proteína de la presente invención con
utilización del anticuerpo mencionado anteriormente pueden aislarse
e identificarse, y su polipéptido puede purificarse por
cromatografía de afinidad. Los anticuerpos contra el péptido que
contiene las proteínas de la presente invención o los epítopos del
antígeno de las mismas pueden utilizarse posiblemente para el
diagnóstico y el tratamiento del cáncer o de las enfermedades por
segregación cromosómica tales como la infecundidad o síndrome de
Down utilizando un factor regulador de la segregación cromosómica
como índice.
El análisis funcional de una proteína de la
presente invención puede realizarse utilizando proteínas de fusión
fusionadas con, por ejemplo: sustancias fluorescentes tales como
FITC (isocianato de fluoresceína) o tetrametil isocianato de
rodamina; radioisótopos tales como ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C,
^{35}S o ^{3}H; marcadores con enzimas tales como la fosfatasa
alcalina, peroxidasa, \beta-galactosidasa o
ficoeritrina; proteínas de emisión de fluorescencia tales como la
proteína verde fluorescente (GFP); o similares, a anticuerpos tales
como los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente. Como
método de análisis inmunológico con utilización del anticuerpo de
la presente invención, pueden ponerse como ejemplos métodos tales
como RIA, ELISA, método del anticuerpo fluorescente, análisis de
células formadoras de placa, método de oligometrorragia, ensayo de
hemaglutinación y método de Ouchterlony.
La presente invención se explicará en detalle a
continuación con referencia a los ejemplos, pero el alcance técnico
de la presente invención no se limitará a éstos.
El presente inventor examinó un gen que es
tóxico solamente cuando se expresa conjuntamente con Rec8 en células
vegetales. La secuencia que codifica a Rec8 que se fusionó con GFP
se clonó en pREP82 (marcador ura4+) en el activador nmt1+
reprimible de tiamina, para construir
pREP82-rec8+-GFP. Se utilizaron un banco de ADNc de
Schizosaccharomyces pombe construido por ARNm que se preparó
a partir de células meióticas y un vector pREP3 (activador nmt1+,
marcador de LEU2+) (Y. Akiyoshi y Y.W., no publicada). Las células
leu1 ura4-D18 que llevan
pREP82-rec8+-GFP se transformaron con el banco de
ADNc, se extendieron en placas de agar-agar que
contienen tiamina (sin activador) y se incubaron durante 3 días a
30ºC. Las colonias se replicaron a continuación en placas de
agar-agar exentas de tiamina: una que contiene
uracilo y ácido 5'-fluoroortoico
(5'-FOA) donde solamente pueden crecer las células
que carecían del plásmido pREP82-rec8+-CFP (por
consiguiente expresa un solo clon del banco) y la otra que no
contiene 5'-FOA (permite la coexpresión de rec8-+GFP
y un clon del banco). El presente inventor añadió Phloxina B, un
fármaco que tiñe de rojo las células muertas, sobre ambas placas de
agar-agar, con lo cual se iluminaron las colonias
enfermas. Tras la incubación durante dos días, se seleccionaron las
colonias que presentan enfermedad solamente en la placa de
agar-agar de coexpresión y se recuperaron y
analizaron los plásmidos procedentes del banco.
La eliminación y el etiquetado de GFP o FLAG a
sgo1+ y sgo2+ endógenas se realizaron por un procedimiento de
direccionamiento génico basado en la PCR (Yeast 14,
943-951 (1998)). Mediante la inserción de GFP en el
terminal C del sgo1+-FLAG ampliado por PCR,
sgo1+-FLAG-GFP se generó y se integró en el locus de
sgo1 endógeno. Además, un activador endógeno del sgo1+ fue
sustituido por un activador de nmt para generar
Pnmt-sgo1+ o
Pnmt-sgo1+-FLAG-GFP por el
procedimiento de direccionamiento génico basado en la PCR. Las
proteínas activadas para Sgo1-GFP o
Sgo1-FLAG se eliminaron dependiendo del objetivo. Se
utilizó una mutación de mei4\Delta para detener las células
meióticas antes de la meiosis I (cerca de la profase tardía en la
meiosis I) y se utilizó una mutación mes1\Delta para detener
después de la meiosis I, como se describió anteriormente
(Nature 400, 461-4 (1999)).
Para observar los modelos de segregación de los
homólogos en la meiosis I, se sembraron por puntos células h90 que
conservan el cen2-GFP (Embo. J. 22,
2284-96 (2003)) en medio productor de meiosis, SPA.
Para examinar los modelos de segregación de las cromátides
asociadas, células opuestas de tipo apareamiento, una marcada con
cen2-GFP y la otra sin marcar, se mezclaron y se
sembraron por puntos en SPA. Después de la incubación durante un
día, se controlaron los zigotos para GFP. Se obtuvieron imágenes
bajo un microscopio (Axioplan2, Zeiss) equipado con una cámara CCD
enfriada (Quantix, Photometrics) y utilizando el programa
informático Metamorph (Universal Imaging Corporation). Se
convirtieron siete secciones Z para señales de GFP en una sola
imagen en dos dimensiones tomando la señal máxima en cada posición
del píxel en las imágenes.
Se utilizó el diploide
sgo1+-FLAG-GFP para la ChIP con Sgo1. Para conseguir
un cultivo muy coincidente, se sustituyó el activador endógeno
slp1+ por el activador rad21+ que no es activo durante la meiosis y
se detuvieron las células en la metafase I. Se incubaron las
células en medio con nitrógeno agotado durante 17 horas a 30ºC y el
60% de las células o menos se detuvieron en la metafase I. Para la
ChIP con Sgo2, las células nda3-KM311 sgo2+-GFP
proliferaron a 30ºC y a continuación se desplazaron a 18ºC. Tras la
incubación durante 8 horas, la mayoría de las células se detuvieron
en la metafase. Se fijaron las células con 3% de
para-formaldehído durante 30 minutos a 18ºC y se
prepararon los extractos. El ADN se rompió hasta un tamaño medio de
400 bp y los extractos se inmunoprecipitaron con anticuerpos
anti-GFP de conejo (Clontech). Los ADN preparados a
partir de los extractos en bruto de la célula completa o las
fracciones de cromatina inmunoprecipitada se analizaron por PCR
cuantitativa, con un LightCycler o un Lightcycler- kit Green I
Master SYBR de ADN (Roche Molecular Biochemicals). Se utilizaron
muestras de anticuerpo-menos como referencias en
cada experimento para explicar la unión no específica en las
fracciones de ChIP.
El Sgo1+ ORF se amplió por PCR a partir de un
banco de ADNc de Schizosaccharomyces pombe y se insertaron
en los plásmidos pGEX4T-2 (Pharmacia Biotech) y
pET-19b (Novagen) respectivamente para preparar
proteínas recombinantes GST-Sgo1 e
His-Sgo1. Se utilizó GST-Sgo1 para
inmunizar el conejo y se purificaron los anticuerpos surgidos por
His-Sgo1 como se describió anteriormente (Embo.
J. 22, 5643-53 (2003)). Además, a fin de
analizar las proteínas de análisis (SEC. ID. nº: 18 y nº: 20; hSgo1
y hSgo2 respectivamente) que codifican el gen homólogo de la
shugoshina humana (SEC. ID. nº: 17 y nº: 19), parte de hSgo1 y hSgo2
se expresaron en E. coli, y se produjeron anticuerpos contra
hSgo1 y hSgo2 inyectando la proteína en el conejo.
Para teñir Sgo1 endógeno, las células diploides
naturales cultivadas durante 5 horas en MM-N se
fijaron con formaldehído al 3% durante 40 min. a 30ºC, y se tiñeron
por el procedimiento descrito anteriormente (Embo. J. 22,
5643-53 (2003)). Para teñir Sgo2-GFP
y Mis6-HA, se utilizaron células de crecimiento
logarítmico. Se detectó Sgo1 utilizando anticuerpo
anti-Sgo1 de conejo en la proporción 1:50 y
anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa488
(Molecular Probes) en la proporción 1:100. Se detectó tubulina
utilizando anticuerpo TAT-1
anti-tubulina de ratón (proporcionado por Keith
Gull) a 1:200 y anticuerpo anti-ratón activado por
Cy3 (Chemicon) a 1:2.000. Se tiñeron las células por contraste con
DAPI para observar el ADN. El Sgo2-GFP se detectó
utilizando anticuerpos anti-GFP de ratones (Roche)
a 1:50 y anticuerpos anti-ratón conjugados con
BODIPY FL (Molecular Probes) a 1:100. La MIS6-HA se
detectó utilizando anticuerpos Y-11
anti-HA de conejos (Santa Cruz) a 1:50 y anticuerpos
anticonejo conjugados con Alexa488 a 1:100. Las células se tiñeron
por contraste con DAPI para visualizar el ADN. Además se realizó la
inmunotinción utilizando anticuerpo anti-hSgo1 de
conejo y anticuerpo anti-hSgo2 de conejo de la misma
manera que la descrita anteriormente.
Las células de la cepa
Padh-rec8+-3HA
Pnmt41-sgo1+-FLAG-GFP y las células
de la cepa Padh-rec8+-3HA de referencia se
cultivaron sin tiamina durante 15 horas a 30ºC, se recogieron y se
prepararon los extractos. Para liberar las proteínas unidas a la
cromatina, se trataron los extractos con ADNasa I. Después de
clarificar los extractos por centrifugación, la proteína
Sgo1-FLAG-GFP se inmunoprecipitó con
anticuerpo M2 anti-FLAG (Sigma). Se detectaron
Rec8-3HA y
Sgo1-FLAG-GFP mediante el anticuerpo
Y-11 anti-HA y el anticuerpo M2
anti-FLAG, respectivamente.
Todas las cepas de la muestra excepto las del
ensayo de la pérdida de cromosoma se derivan de SK1 (Cell
98, 91-103 (1999)). El ensayo de pérdida de
cromosomas se realizó como se describió anteriormente (Nature
410, 955-9 (2001)). Se eliminó el gen ScSGO1 o se
activó el epítopo utilizando casetes generados por PCR (Yeast
14, 953-961 (1998)). Se chequeó la dirección
aproximada del gen por PCR. Los puntos de URA3-GFP
que marcan el cromosoma V (cenV-GFP) se
describieron anteriormente (Cell 98, 91-103
(1999)). La esporulación se produjo cultivando células diploides a
30ºC como se describió anteriormente (Dev. Cell. 4,
535-48 (2003)). La inmunofluorescencia in
situ se realizó como se describió anteriormente (Dev.
Cell. 4, 535-48 (2003)).
Se cultivaron células HeLa en DMEM enriquecido
con suero de ternero fetal al 10% y L-glutamina al
0,03%. La cepa celular HeLa que expresa Scc1-myc se
cultivó con 200 \mug/ml de G418 (Invitrogen) y 100 \mug/ml de
higromicina B (Wako). La expresión de Scc1-myc fue
producida por incubación con 2 \mug/ml de doxociclina (Sigma)
durante 48 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ya que la información para la secuencia
aminoácido N-terminal de Sgo1 humano no se obtuvo a
partir de las bases de datos, el presente inventor clonó un
fragmento de ADNc que se amplió a partir de un banco de ADNc (BD
Biosciences) con utilización de cebadores que reconocen el punto de
clonación de \lambdaTriplEx: CTCGGGAAGCGCGC
CATTGTG (SEC. ID. nº: 38) y la secuencia de ADN correspondiente a los números 237 a 242 en la secuencia de aminoácidos de Q9BVA8: CCTGGCTGAATCAGCTTTGGTG (SEC. ID. nº: 39). El secuenciado puso de manifiesto que el ARNm de Sgo1 codifica una proteína que tiene 527 aminoácidos. Para obtener los anticuerpos policlonales contra Sgo1, un fragmento de ADNc que codifica los números 109-491 en la secuencia de aminoácidos de Sgo1 se amplió y se insertó en los marcos de lectura de plásmidos pGEX4T-2 (Amersham) y pET19b (Novagen) para producir GST-Sgo1 y His-Sgo1 respectivamente, y seguido de inmunización de un conejo (QIAGEN) (realizada según las instrucciones del fabricante). Se purificó por afinidad His-Sgo1 en sepharose activada por CNBr (Amersham). Los anticuerpos contra Sgo2 se construyeron con GST-Sgo2 (aminoácidos números 331 a 631) y se purificaron con His-Sgo2 de la misma manera que anteriormente.
CATTGTG (SEC. ID. nº: 38) y la secuencia de ADN correspondiente a los números 237 a 242 en la secuencia de aminoácidos de Q9BVA8: CCTGGCTGAATCAGCTTTGGTG (SEC. ID. nº: 39). El secuenciado puso de manifiesto que el ARNm de Sgo1 codifica una proteína que tiene 527 aminoácidos. Para obtener los anticuerpos policlonales contra Sgo1, un fragmento de ADNc que codifica los números 109-491 en la secuencia de aminoácidos de Sgo1 se amplió y se insertó en los marcos de lectura de plásmidos pGEX4T-2 (Amersham) y pET19b (Novagen) para producir GST-Sgo1 y His-Sgo1 respectivamente, y seguido de inmunización de un conejo (QIAGEN) (realizada según las instrucciones del fabricante). Se purificó por afinidad His-Sgo1 en sepharose activada por CNBr (Amersham). Los anticuerpos contra Sgo2 se construyeron con GST-Sgo2 (aminoácidos números 331 a 631) y se purificaron con His-Sgo2 de la misma manera que anteriormente.
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La tinción inmunofluorescente se realizó como se
describió anteriormente, utilizando Sgo1 anti-humano
(1:1.000), antisuero Sgo2 anti-humano (1:10.000),
anti-Bub1 (1:1.000, MBL), anti-BubR1
(1:1.000, MBL), anti-CENP-A
(1:1.000, MBL), anti-Aurora B AIM-1 (1:1.000, BD Biosciences) y DM1A anti-tubulina (1:1.000, Sigma). Se realizó la inmunotinción de Scc1-myc como se describió anteriormente utilizando CM-100 anti-myc (1:1.000, Gramsch Laboratories) y ACA (1:1.000, proporcionado por el Dr. Yoshinari Takasaki). Como anticuerpo secundario, se utilizaron anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (1:1.000, Molecular Probes), anticuerpo anti-ratón (1:1.000, CHEMICON) conjugado con Cy3 y anticuerpo anti-humano de asno conjugado con Cys (1:1.000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Se utilizaron 3 \mug/ml de Hoechst 33342 ó 0,5 \mug/ml de DAPI para tinción por contraste. Se tomaron imágenes utilizando el programa informático SlideBook o MetaMorph.
(1:1.000, MBL), anti-Aurora B AIM-1 (1:1.000, BD Biosciences) y DM1A anti-tubulina (1:1.000, Sigma). Se realizó la inmunotinción de Scc1-myc como se describió anteriormente utilizando CM-100 anti-myc (1:1.000, Gramsch Laboratories) y ACA (1:1.000, proporcionado por el Dr. Yoshinari Takasaki). Como anticuerpo secundario, se utilizaron anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (1:1.000, Molecular Probes), anticuerpo anti-ratón (1:1.000, CHEMICON) conjugado con Cy3 y anticuerpo anti-humano de asno conjugado con Cys (1:1.000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Se utilizaron 3 \mug/ml de Hoechst 33342 ó 0,5 \mug/ml de DAPI para tinción por contraste. Se tomaron imágenes utilizando el programa informático SlideBook o MetaMorph.
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Se recogieron células HeLa durante la mitosis
por extracción mitótica y se incubaron con 330 nM de nocodazol
durante 0 hasta 4 horas. Se realizó la extensión de cromosomas como
se describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hirvieron células HeLa con el tampón de
muestra y se resolvieron por electroforesis en gel
SDS-poliacrilamida. Se transfirieron las proteínas
a la membrana Immobilon-P (Millipore), seguido de
bloqueo con 5% de leche entera (Nacalai) en TBST (150 mM de NaCl,
20 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,05% de
Tween-20). Se realizaron incubaciones del
anticuerpo en leche entera TBST al 0,1% enriquecida con anticuerpo
anti-Sgo1 (1:1.000), anticuerpo
anti-Sgo2 (1:1.000), anticuerpo
anti-Bub1 (1:500) y anticuerpo
anti-tubulina (1:3.000). Las transferencias fueron
producidas por ECL (Amersham).
\vskip1.000000\baselineskip
Como secuencia diana de ARNsi, se seleccionaron
respectivamente hSgo1: AAGUCUACUGAUAAUGUCUUATT (SEC. ID. nº: 40) y
hSgo2: AAGCACUACCACUUU GAAUAATT (SEC. ID. nº: 41), y Sgo1 humana:
GUGAGC
CUCUGUGAAUCAATT (SEC. ID. nº: 42) y Sgo2 humana: GCUCUCAUGAACAAUAACUTT (SEC. ID. nº: 43) en hSgo1ARN o hSgo2ARN. Además, como secuencia diana de ARNsi, se seleccionó GAGUGAUCACGAUUU
CUAATT (SEC. ID. nº: 44) en otra secuencia diana de ARNsi, Bub1ARN; la secuencia diana ARNsi, AACGGG
CAUUUGAAUAUGAAA (SEC. ID. nº: 45, véase JCS, 117, 1577-1589 (2004)) se seleccionó en 2 puntos del ARN del factor BubR1 de comprobación del huso. Estas secuencias se sintetizaron en forma de doble cadena y se introdujeron en las células utilizando oligofectamina (Invitrogen). Además de manera similar, al producir el vector VIH, se transfectaron las células HeLa con el vector del plásmido de VIH, pMD.G (plásmido de expresión VSV-G env), pMDLg/p.RRE (el plásmido de empaquetamiento de tercera generación) y pRSV Rev (plásmido que expresa Rev) por el método del fosfato cálcico, recogido del sobrenadante del cultivo 48 horas después de la transfección y condensado para utilizarlo como vector vírico.
CUCUGUGAAUCAATT (SEC. ID. nº: 42) y Sgo2 humana: GCUCUCAUGAACAAUAACUTT (SEC. ID. nº: 43) en hSgo1ARN o hSgo2ARN. Además, como secuencia diana de ARNsi, se seleccionó GAGUGAUCACGAUUU
CUAATT (SEC. ID. nº: 44) en otra secuencia diana de ARNsi, Bub1ARN; la secuencia diana ARNsi, AACGGG
CAUUUGAAUAUGAAA (SEC. ID. nº: 45, véase JCS, 117, 1577-1589 (2004)) se seleccionó en 2 puntos del ARN del factor BubR1 de comprobación del huso. Estas secuencias se sintetizaron en forma de doble cadena y se introdujeron en las células utilizando oligofectamina (Invitrogen). Además de manera similar, al producir el vector VIH, se transfectaron las células HeLa con el vector del plásmido de VIH, pMD.G (plásmido de expresión VSV-G env), pMDLg/p.RRE (el plásmido de empaquetamiento de tercera generación) y pRSV Rev (plásmido que expresa Rev) por el método del fosfato cálcico, recogido del sobrenadante del cultivo 48 horas después de la transfección y condensado para utilizarlo como vector vírico.
La sustitución de la cohesina mitótica,
Rad21/Scc1, por la versión meiótica, Rec8, es un prerrequisito para
proteger la cohesión de la cromátide centromérica asociada a través
de la anafase de la meiosis I (Cell 103,
1155-68 (2000), Mol. Cell. Biol. 23,
3965-73 (2003)). Sin embargo, cuando la Rec8 se
expresó ectópicamente durante la mitosis, Rec8 estaba localizado en
mayor medida en los centrómeros pero desapareció en la anafase, con
las cromátides asociadas segregando a las caras opuestas (Figs. 1c y
d). Además, la expresión ectópica de Rec8 no escindible durante la
mitosis (obsérvese que Rec8 es escindido por la separasa Cut1
durante la meiosis (Embo. J. 22, 5643-53
(2003))) produjeron una incapacidad para separar las cromátides
asociadas (véase la Fig. 2). Por lo tanto, en contraste con la
situación durante la meiosis I, la Rec8 centromérica es escindida
por la separasa durante la mitosis, y produce la separación de las
cromátides asociadas. El presente inventor supuso de este modo un
protector centromérico específico para la meiosis I de Rec8 a partir
de estas observaciones. Para identificar este factor, el presente
inventor buscó un gen que genere toxicidad durante el crecimiento
mitótico solamente cuando se expresa conjuntamente con Rec8. Este
cribado identificó un nuevo gen, sgo1+ (ORF: SPB35G2.03C). El
impedimento del crecimiento por Sgo1 fue significativamente
dependiente de Rec8, ya que Sgo1 tenía poco efecto sobre el
crecimiento cuando se expresa conjuntamente con Rad21 (Fig. 1a). La
expresión conjunta de rec8+ y sgo1+ produjo alta frecuencia de la
división nuclear bloqueada, ya que los marcadores de la proteína
verde fluorescente asociados al centrómero
(cen2-GFP) segregaban en el mismo lado de una
célula tabicada muy frecuentemente (véase las Figs. b y c). Para
probar la posibilidad de que Sgo1 proteja a Rec8 de la degradación
en la anafase, se examinó la localización de Rec8 asociada a la
expresión de Sgo1, la Rec8 activada con GFP en su terminal
carboxilo se expresó bajo el control de un activador adh1
constitutivo y produjo la Sgo1 utilizando un activador nmt1
reprimible por tiamina. En consecuencia se descubrió que la señal
de Rec8-GFP persistía a través de la anafase
solamente cuando Sgo1 se expresaba conjuntamente (Fig. 1d). Como
Sgo1 se expresa exclusivamente en la meiosis (datos de la microrred
del ADN (Nat. Genet. 32, 143-7 (2002)),
véase a continuación), se descubrió a partir de los resultados
mencionados anteriormente, que Sgo1 es un protector de Rec8 durante
la meiosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar si Sgo1 se requiere de hecho para
la protección de Rec8 durante la meiosis, el ORF completo que
codifica a sgo1+ se eliminó y se examinó el fenotipo. Las células
Sgo1\Delta son viables y presentaban crecimiento vegetativo
normal, coherente con el concepto de que sgo1+ es un gen específico
para la meiosis. Para examinar la segregación del cromosoma
meiótico de las células sgo1\Delta, las secuencias unidas al
centrómero se marcaron con GFP (cen2-GFP) solamente
en uno de los dos homólogos en un zigoto, y la segregación de los
puntos de GFP se controló durante la meiosis I. Se puso de
manifiesto que la meiosis I aparecía normalmente en las células
sgo1\Delta, como pares de cromátides asociadas generalmente
desplazadas conjuntamente en el mismo lado de cada zigoto. Por
consiguiente, el acoplamiento monopolar estaba intacto (Fig. 3a).
Además, marcando cen2-GFP en ambos cromosomas, se
determinó que se experimentaba segregación precisa con homólogos en
la meiosis I (datos no mostrados). Sin embargo, los pares de
cromátides asociadas no pudieron segregar de manera apropiada en la
meiosis II, la falta de segregación se produjo en el 50% de las
células o menos (Fig. 3a). Este valor es coherente con la
segregación aleatoria de cromosomas en la meiosis II.
Para examinar la cohesión centromérica, el
cen2-GFP marcado en ambos homólogos se controló en
los zigotos interrumpidos antes de la meiosis II por una mutación
de mes1\Delta. Apoyando los resultados anteriores, las células
sgo1\Delta presentaron frecuentemente una división precoz de los
centrómeros ya que las señales de división de
cen2-GFP prevalecieron en los núcleos del par (Fig.
3b). Por último, se examinó si la protección de Rec8 en los
centrómeros depende de Sgo1 controlando Rec8-GFP en
la anafase I tardía y la prometafase II. Aunque es significativo
que las señales de Rec8 eran centroméricas en las células naturales,
las señales de Rec8 habían desaparecido en gran medida de los
centrómeros en estas etapas en las células sgo1\Delta (Fig. 3c).
A pesar de que todos los fenotipos de las células sgo1\Delta eran
reminiscencias de Schizosaccharomyces pombe con
insuficiencia de heterocromatina, en los que la localización de Rec8
en las zonas pericentroméricas disminuye y la cohesión centromérica
se pierde durante la meiosis I, lo que conduce a la división
aleatoria en la meiosis II (Science 300,
1152-5 (2003)). La fijación de cromatina por Rec8
fue examinada en las células interrumpidas antes de la meiosis I
utilizando un ensayo de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP).
En contraste marcado con las células insuficientes en
heterocromatina, la localización de Rec8 fue intacta en las células
sgo1\Delta en las zonas pericentroméricas así como en todas las
demás zonas probadas. Estos resultados sugieren que la pérdida del
Rec8 centromérico después de la meiosis I no es producida por un
defecto inicial en la localización de Rec8 para los centrómeros
sino más bien por un defecto en la conservación del Rec8
centromérico durante la meiosis I. Los resultados anteriores
indicaban que la Cut1 separasa se vuelve activa al comienzo de la
anafase I y escinde la mayoría de la Rec8 cromosómica, dejando
solamente intacto la Rec8 centromérica (Embo. J. 22,
5643-53 (2003)). Estos resultados indicaban que Sgo1
desempeña un papel esencial en la protección de la cohesión
centromérica durante la meiosis I protegiendo la cohesina Rec8 de la
escisión por la separasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar la proteína Sgo1, se produjeron
anticuerpos específicos para Sgo1 y los resultados de la
inmunoelectrotransferencia Western indicaron que Sgo1 se expresa
solamente alrededor en la meiosis I (Fig. 4a). Los resultados de la
microscopia por inmunofluorescencia en células en varias etapas de
la meiosis pusieron de manifiesto que Sgo1 aparece en la profase
tardía de la meiosis I y está completamente localizada como varios
puntos por el punto de la metafase I (Fig. 4b). Estos puntos
estaban localizados en la proteína Mis6 del cinetocoro (Cell.
90, 131-143 (1997)) e indicaban que Sgo1 es una
proteína que se asocia al centrómero (Fig. 4c). Al comienzo de la
anafase I, las señales de Sgo1 disminuyeron drásticamente. Se
descubrió que Sgo1 permanece sin degradar en los centrómeros en las
células con la APC agotada detenidas en la metafase I pero
experimenta degradación normal en las células con insuficiencia de
separasa (Fig. 5) e indicaba que la degradación por Sgo1 en la
anafase I está regulada más directamente por la APC más bien que por
la separasa. Aunque las señales del Sgo1 residual eran detectables
en los centrómeros en la anafase I precoz, desaparecieron
completamente al final de la anafase I (Fig. 4b). Esto indica que
se requiere una cantidad sustancial de Sgo1 al comienzo de la
anafase I cuando la separasa está completamente activada. Sin
embargo, se considera que las cantidades de Sgo1 requeridas son
cada vez más pequeñas a medida que progresa la anafase I. Esta idea
es justificable cuando la actividad de la separasa se regula por
disminución rápidamente o cuando se evita el acceso a los cromosomas
durante la anafase I. La Sgo1 nunca reaparece durante la meiosis II
(Fig. 4b) y que es coherente con la idea de que se requiere Sgo1
para la protección de Rec8 solamente durante la meiosis I.
El presente inventor ha descrito ya que la
localización de Rec8 en las zonas pericentroméricas es especialmente
importante para la persistencia de la cohesión centromérica en toda
la meiosis I (Science 300, 1152-5 (2003)).
Si Sgo1 es un protector centromérico de Rec8, entonces podría
esperarse localizarla ahí también. Para probar esta posibilidad, se
diseñó la localización de Rec8 con más precisión utilizando el
ensayo ChIP. La Sgo1 asociada de hecho con las zonas
pericentroméricas de heterocromatina más bien que con las zonas del
núcleo central a lo largo de las secuencias centrómeras (Fig. 4d).
Dado que los resultados de los experimentos de inmunoprecipitación
indicaban que Sgo1 interactúa con los complejos de Rec8 in
vivo (Fig. 4f), se llevó a cabo la protección por interacción
íntima. Simultáneamente, estos resultados indican que Sgo1 reside en
las zonas pericentroméricas y actúa para proteger a Rec8
centromérica de la escisión de la separasa en la anafase I (Fig.
4d). Se descubrió que la localización de Rec8 no depende de Sgo1, y
viceversa (figura 3d, figura no mostrada). Realmente, la Rec8 y la
Sgo1 se generan de hecho independientemente en las zonas
pericentroméricas, en cuanto a la localización, la Rec8 y la Sgo1
dependen de la heterocromatina y de Bub1 cinasa respectivamente
(figura 4e). En cambio, Rec8 y Sgo1 se localizan en los centrómeros
en las células swi6\Delta (insuficientes en heterocromatina) y en
las células bub1\Delta respectivamente (figura 4e). De este modo
por localización independiente, puede asegurarse que la Rec8 se
protege solamente en los centrómeros no a lo largo de las zonas del
brazo cromosómico.
Además, se indica que la shugoshina protege a
Rec8 físicamente de la acción de la separasa y contrarresta los
efectos. En este asunto, aun cuando la expresión fuerte de la dosis
de Sgo1 no expresa a Rec8, el crecimiento mitótico se desestabilizó
moderadamente (figura no mostrada); y aun cuando la temperatura es
tolerada para el alelo cut1, se observó que el mutante cut1 era
destruido por la expresión moderada de Sgo1 (fig. 6).
Mediante una investigación convencional con
BLAST de las bases de datos del genoma, el presente inventor
identificó proteínas similares a Sgo1 procedentes de
Saccharomyces cerevisiae y Neurospora crassa, e indicó
que Sgo1 es una proteína conservada (véase a continuación). En la
misma investigación, se identificó también un parálogo Sgo1 de
Schizosaccharomyces pombe que el presente inventor denominó
Sgo2 (ORF: SPAC15A10.15). Se destruyó el gen sgo2+ y se identificó
que las células sgo2\Delta son viables pero presentan sensibilidad
al fármaco tiabendazol (TBZ) desestabilizador del huso (Fig. 7a).
Ya que las células sgo1\Delta presentan dicho defecto, este
fenotipo es destacable. Para investigar su distribución celular, el
gen endógeno sgo2+ se activó con GFP. En las células proliferantes,
se observó Sgo2-GFP como dos o tres puntos en el
núcleo (Fig. 7d). Sin embargo, Sgo2-GFP se localizó
conjuntamente con la proteína Mis6 del centrómero en la metafase y
desapareció durante la anafase (Figs. 7c y d). Los resultados de los
análisis de ChIP demostraron que la asociación de la cromatina Sgo2
es detectable solamente en las poblaciones simultáneas de células
mitóticas, y que la asociación de la cromatina se localiza en las
zonas pericentroméricas (Fig. 7e). Al aumentar esta localización,
la eliminación de sgo2 proporciona un defecto drástico a la
segregación de cromosomas cuando la mutación swi6\Delta
insuficiente en heterocromatina se unió a ésta, que sin embargo por
sí misma proporciona ligeramente la función centromérica
(Science 269, 1429-31 (1995))(Fig.
7b). Estos resultados indican que Sgo2 coopera con los factores
centroméricos de la heterocromatina para asegurar la segregación de
cromosomas en la mitosis. Además, se descubrió que las células
sgo2\Delta presentan un aumento modesto (hasta el 15%) en la falta
de segregación de los homólogos en la meiosis I, e indica que Sgo2
es también importante para estimular la meiosis I apropiada. Sin
embargo, la función de Sgo2 no se solapa con la de Sgo1, ya que
sgo1\Delta no produce un defecto aparente en la meiosis I (Fig.
3a) ni aumenta un defecto de sgo2 en la meiosis.
Puesto que la Rec8 centromérica no puede ser
detectada después de la meiosis I en los mutantes Bub1 de la
levadura de escisión, una cinasa Bub1 asociada al centrómero
conservada se considera que funciona protegiendo la Rec8 durante la
meiosis (Nat. Cell. Biol. 3, 522-6 (2001))
(Fig. 3c). Aunque la mutación bub1 presenta efectos pleyótropos en
la segregación meiótica de cromosomas, se considera que la función
de Sgo1 puede ser activada por la actividad de Bub1. Para aclarar
este problema, se examinaron las señales de Sgo1-GFP
en células bub1\Delta que experimentan meiosis. Obviamente, las
células Bub1\Delta estaban dedicadas casi completamente a las
señales de Sgo1-GFP centroméricas precisas, en
cambio presentaban una fluorescencia difusa en el núcleo (Fig. 4e).
Similares resultados se obtuvieron utilizando la mutación puntual
bub1-K762R que suprime la actividad de la cinasa
(Embo. J. 22, 1075-87 (2003)). Aunque las
concentraciones sustanciales de la proteína Sgo1 se detectaron en
las células bub1\Delta meióticas por análisis de
inmunoelectrotransferencia Western (figura no mostrada), la dosis
de Bub1 no influye en la estabilidad proteica de Sgo1. Por lo tanto,
se requiere actividad de cinasa de Bub1 para incorporar la Sgo1 a
los centrómeros, y los defectos observados en la protección
centromérica en las células bub1\Delta puede explicarse mediante
la localización alterada de Sgo1.
En experimentos en paralelo, se identificó que
la localización mitótica de Sgo2 en los centrómeros estaba alterada
igualmente en los mutantes de bub1 (Fig. 7c). Se ha indicado que la
pérdida de la función de Bub1 da lugar a que la función
centromérica se debilite (J. Cell. Biol. 143,
1775-87 (1998)). A este respecto, la mutación
bub1-K762R presenta letalidad conjunta con
swi6\Delta, una mutación que también proporciona ligeramente
función centromérica mediante su función en la formación de la
heterocromatina pericentromérica. Se observó que sgo2\Delta
presenta asimismo letalidad conjunta con swi6\Delta (Fig. 7b) y
presenta segregación defectuosa severa de cromosomas en la mitosis
(figura no mostrada). Como el mutante doble sgo2\Delta
bub1\Delta no presentaba ningún defecto acumulativo en absoluto
en el crecimiento o sensibilidad de TBZ (Fig. 7a), se confirmó la
función tándem Sgo2 y Bub1 para asegurar la segregación de
cromosomas en la mitosis mediante estos análisis genéticos.
Considerados en conjunto, los resultados anteriores pusieron de
manifiesto que la incorporación de Sgo1 y Sgo2 a los centrómeros es
una función crucial de Bub1 cinasa en la meiosis y mitosis,
respectivamente.
El presente inventor identificó un solo homólogo
de Sgo1, ScSgo1 en la levadura en germinación (ORF:
YOR073W), que no ha sido analizado hasta ahora. Se examinó la localización celular de ScSgo1 activando el ScSGO1 endógeno con GFP. Se detectó ScSgo1-GFP principalmente como un solo punto en las células proliferantes, pero solamente en un subconjunto limitado de la población (Fig. 8a). Scsgo1-GFP no se detectó durante el periodo G1/S (es decir en las células sin germinar o con una pequeña germinación) pero apareció como un punto en G2/M (células con una gran germinación y un solo núcleo) y desapareció en la anafase (células con una gran germinación y un núcleo flexible) (Fig. 8a). El punto está localizado conjuntamente con la proteína Ndc10 del cinetocoro (Fig. 8b). Durante la meiosis, se detectó ScSgo1-GFP en el cinetocoro solamente en la metafase I, pero nunca durante la anafase I o la meiosis II (Fig. 8c). Por lo tanto, el modelo de localización de ScSgo1 se parece mucho al de SpSgo2 en la mitosis y a SpSgo1 en la meiosis.
YOR073W), que no ha sido analizado hasta ahora. Se examinó la localización celular de ScSgo1 activando el ScSGO1 endógeno con GFP. Se detectó ScSgo1-GFP principalmente como un solo punto en las células proliferantes, pero solamente en un subconjunto limitado de la población (Fig. 8a). Scsgo1-GFP no se detectó durante el periodo G1/S (es decir en las células sin germinar o con una pequeña germinación) pero apareció como un punto en G2/M (células con una gran germinación y un solo núcleo) y desapareció en la anafase (células con una gran germinación y un núcleo flexible) (Fig. 8a). El punto está localizado conjuntamente con la proteína Ndc10 del cinetocoro (Fig. 8b). Durante la meiosis, se detectó ScSgo1-GFP en el cinetocoro solamente en la metafase I, pero nunca durante la anafase I o la meiosis II (Fig. 8c). Por lo tanto, el modelo de localización de ScSgo1 se parece mucho al de SpSgo2 en la mitosis y a SpSgo1 en la meiosis.
Se destruyó el gen ScSGO1 para examinar la
función de ScSgo1. Aunque las células Scsgo1\Delta eran viables,
crecieron lentamente y presentaban sensibilidad al fármaco benemilo
desestabilizador del huso (Fig. 8d) e indicaban que la función
centromérica podría alterarse. Y a continuación las cantidades de
pérdida cromosómica en las células Scsgo1\Delta se compararon con
las de las células naturales mediante un ensayo de sectorización de
colonias. Mientras que el 40% de las colonias de Scsgo1\Delta
contenían sectores rojos (lo que indica pérdida de cromosomas),
menos del 2% de colonias naturales contenían dichos sectores (Fig.
8e). Se llegó a la conclusión de que Scsgo1 desempeña una función
crucial en los centrómeros para asegurar la segregación mitótica de
los cromosomas. Al comienzo de la meiosis, las células
Scsgo1\Delta presentaban defectos significativos que muchas
células están detenidas con un solo núcleo en el estado meiótico.
Sin embargo, entre los productos tetranucleados de la meiosis
fugados, el modelo de distribución de cenV-GFP era
coherente con la segregación apropiada en la meiosis I a excepción
de la segregación aleatoria en la meiosis II (Fig. 8f). Se descubrió
también que la activación de ScSGO1 cromosómico con 13Myc en su
terminal carbonilo, que por sí mismo da lugar a defectos no
detectables en el crecimiento mitótico o en la meiosis I, dio como
resultado la segregación alterada en la meiosis II (34% sin
segregación indica 68% de segregación aleatoria) (Fig. 8g). Además,
las células ScSGO1-Myc presentaban separación
frecuente de los centrómeros asociados en la anafase I meiótica
tardía (Fig. 8h), lo que indicaba que la cohesión centromérica no
estaba protegida de forma apropiada. Simultáneamente, estos
resultados apoyan la idea de que ScSgo1 desempeña una función
crucial en la protección de la cohesión centromérica en toda la
meiosis I, y la meiosis II estaba asegurada de este modo como es el
caso con la Sgo1 de la levadura de escisión.
Las investigaciones por BLAST indicaron que
solamente tres proteínas de tipo Sgo1, estaban todas en los hongos:
Sgo2 de Schizosaccharomyces pombe, ScSgo1 de Saccharomyces
cerevisiae y B23G1.060 de Neurospora crassa. Ya que las
dos zonas conservadas se encontraban en estas proteínas, las
proteínas relacionadas se investigan en condiciones de dos
secuencias de bloque por los programas BLOCK MAKER y MAST
(Nucleic Acids Res. 26, 309-12 (1998),
Bioinformatics 14, 48-54 (1998)). Este método
extrajo varias proteínas experimentales de varios eucariotas
incluyendo la mosca, el gusano, planta, ratón y ser humano (véase
las SEC. ID. nº: 21 a nº: 37; drosophila Dm, Ce, Arabidopsis
At, ratón Mm y humano Hs, respectivamente, en la Fig. 9).
Especialmente, esta lista incluye la MEI-S332 de
Drosophila, que está caracterizada anteriormente como
proteína esencial para conservar la cohesión centromérica en la
meiosis (Cell. 83, 247-256 (1995)), aunque la
puntuación de la similitud es marginal (valor E=10). Todas las
demás proteínas en la lista presentaban un tramo corto de similitud
en las zonas básicas del terminal carboxilo, mientras que las
secuencias primarias en el primer bloque no se conservan excepto
que contengan un supuesto superenrollamiento. El espacio y las
secuencias entre estos dos bloques divergen entre las proteínas. Ya
que se identificó previamente que estos bloques eran importantes
para la función de MEI-S332 (Genes Dev. 12,
3843-3856 (1998)), se investigó la importancia de
las zonas conservadas en Sgo1. Se intercambiaron varios aminoácidos
individualmente por alaninas en estos bloques con similitud y se
examinó la función de las proteínas mutantes in vivo (Fig.
10). Se observó que tres aminoácidos conservados, conocidos por ser
importantes para la función MEI-S332, se requerían
también para la función Sgo1 (13N, 34V y 368S en
MEI-S332; 29N, 501 y 294S en Sgo1) (marcado como
cabezas de flecha en la Fig. 9). Además, otros aminoácidos
conservados en el segundo bloque (293P, 296R, 298K, 299L y 300R en
Sgo1) se necesitaban también todos para la función Sgo1 (asteriscos
en la Fig. 9) y el resto 297T no conservado pudo cambiarse por
alanina sin alterar la función (círculo en la Fig. 9). Estos
resultados indicaban que la similitud estructural marginal
observada entre Sgo1 de Schizosaccharomyces pombe y otras
proteínas en varios eucariotas es importante. Las plantas y
mamíferos llevan dos proteínas similares a shugoshina, lo que
sugiere que la posibilidad de que la función de shugoshina diverja
para completar la mitosis y la meiosis como en la levadura de
escisión.
El presente inventor identificó anteriormente
dos supuestas proteínas Sgo humanas, Sgo1 y Sgo2 en la base de
datos, aunque su homología de secuencia completa para conocer las
proteínas Sgo en cualquier especie distinta de la humana es
marginal (Fig. 11a). Para examinar si estas proteínas identificadas
en la base de datos son realmente homólogos humanos de Sgo, el
presente inventor examinó la localización de las proteínas. Con esta
finalidad, el presente inventor cultivó anticuerpos policlonales de
conejo contra proteínas recombinantes que se producían en las
bacterias. Los anticuerpos Sgo obtenidos detectaron hasta una banda
de 70 kD (el peso molecular previsto es de 60 kD) en los
extractos celulares de HeLa y la señal se redujo de manera
significativa cuando las células eran tratadas con ARNsi que se
dirige a ARNm de Sgo1 (Fig. 11b). Asimismo, los anticuerpos de Sgo2
detectaron hasta una banda de 120 kD (peso molecular previsto es de
145 kD), la señal se redujo en los extractos obtenidos de células
tratadas con ARNsi de Sgo2 (Fig. 11b). Estos datos indican que tanto
Sgo1 como Sgo2 se expresan por lo menos en las células
proliferantes HeLa. A continuación, con el objetivo de analizar las
proteínas (SEC. ID. nº: 18 y nº: 20, respectivamente hSgo1 y hSgo2)
que codifican el gen homólogo de la shugoshina humana (SEC. ID. nº:
17 y nº: 19), que se supuso que eran homólogos de Sgo humano, parte
de hSgo1 y hSgo2 se expresó en E. coli y los anticuerpos
contra hSgo1 y hSgo2 se produjeron inyectando la proteína en el
conejo, se tiñeron las células HeLa con los anticuerpos y
simultáneamente con anticuerpos de tubulina y DAPI, y se tiñeron
conjuntamente con ADN del huso y cromosómico respectivamente, y se
examinó la expresión de las proteínas hSgo1 y hSgo2 que eran ambas
endógenas en las células proliferantes. Los resultados se presentan
en la figura 12. Como se muestra en la Figura 12, tanto las señales
de hSgo1 como de hSgo2 se observaron también como puntos en los
cromosomas desde la prometafase hasta la metafase. Como resultado de
la inmunotinción, se identificó que ambas proteínas, hSgo1 y hSgo2
están localizadas específicamente en los centrómeros en la fase
mitótica. Además, las células HeLa en la prometafase y en la
metafase se tiñeron con anticuerpos contra hSgo1 o hSgo2; teñidas
conjuntamente a la vez con anticuerpos contra la proteína
CENP-A del centrómero y DAPI; y se examinó la
expresión de las proteínas hSgo1 y hSgo2. Estos resultados se
presentan en la figura 13. Como se muestra en la Figura 13, ambas
señales de hSgo1 y hSgo2 se observaron en puntos próximos a los
puntos de CENP-A en los cromosomas. Como resultado
de lo anterior, se puso de manifiesto que tanto hSgo1 como hSgo2
eran proteínas del centrómero. Además, para examinar esta
posibilidad, se tiñó Aurora B, que es una proteína pasajera del
cromosoma conocida por estar localizada dentro del cinetocoro desde
la profase hasta la metafase. Los puntos de Sgo1 y Aurora B eran
prácticamente los mismos en la prometafase y metafase, mientras que
Sgo2 se colocó justo fuera de Aurora B (véase la Fig. 13). Como
resultado de lo anterior, se puso de manifiesto que tanto hSgo1
como hSgo2 están situadas dentro de los cinetocoros desde la
prometafase hasta la metafase. Las vistas representativas del
cinetocoro asociado están ampliadas a la derecha. La barra a escala
es de 10 \mug.
Se realizaron experimentos con ARNi que expresan
a hSgo1 y hSgo2 respectivamente. Los resultados se presentan en la
figura 14. Como resultado, se suprimieron las expresiones en algunas
proteínas de manera significativa 48 horas después, las células
interrumpidas en la mitosis (total, en la figura) se acumularon como
se indica en la figura 14. Como se describió anteriormente, se
sugirió firmemente que cualquier proteína localizada en los
centrómeros en la mitosis desempeña una función importante para la
evolución de la segregación de cromosomas. Dado que la acumulación
se disolvió suprimiendo un factor BubR1 de comprobación del huso por
ARNi, se sugirió que hSgo1 y hSgo2 son función directa o indirecta
durante el proceso en el que el huso toma apropiadamente el
cinetocoro en los centrómeros como se describe a continuación.
Además, las células para las que se realizaron
experimentos que se dirigen a hSgo1 utilizando células HeLa se
montaron en un vidrio portaobjetos y se tiñeron con Giemsa. Los
resultados se presentan en la figura 15. Se puso de manifiesto que
la cromátide asociada en la profase se adhiere fuertemente al punto
del centrómero en las células de referencia donde se realizó ARNi;
mientras que en las células que suprimen la expresión de hSgo1,
donde actuó ARNi, la adherencia fue débil en el punto del
centrómero, y se desprendió fácilmente. Por consiguiente, se
demostró que hSgo1 desempeña una función importante para mantener la
cohesión fuerte en la zona del centrómero en la mitosis en las
células proliferantes. Las células mitóticas donde la proteína Sgo1
modificada genéticamente actuó mediante experimentos con ARNi se
recogieron y los cromosomas se extendieron para observar la
estructura cromosómica directamente. En las células de referencia,
se resolvieron las cromátides asociadas a lo largo de las zonas del
brazo pero presentaban la limitación primaria en los centrómeros
(Fig. 16a i). Sorprendentemente, en las células con Sgo1 agotada,
las cromátides asociadas se separaron frecuentemente a lo largo de
toda la longitud del cromosoma (Fig. 16a iii). En las muestras donde
las cromátides asociadas se situaron densamente próximas, aunque
las cromátides asociadas no indicaban la limitación primaria (Fig.
16a iv), esto sugiere que la cohesión centrómera se perdió de manera
selectiva. El tratamiento con nocodazol activa el punto de control
del huso; por lo que el ciclo celular se detiene en la prometafase.
Dicha detención prolongada en la fase M produce la separación
completa de la conectividad de las zonas del brazo cromosómico. Por
esta razón, las cromátides asociadas están solamente conectadas a
los centrómeros y forman el cromosoma "en forma de X" (Fig.
16b, referencia). Como es de esperar, el tratamiento con nocodazol
produjo la separación completa de las cromátides asociadas a lo
largo de la longitud del cromosoma en las células Sgo1 con ARNi
(hasta el 97%) (Figs. 16c y d). Por consiguiente, se demostró que
hSgo1 desempeña una función importante para mantener la cohesión
fuerte en el punto cromosómico del centrómero en la mitosis en las
células proliferantes.
Se realizaron respectivamente experimentos con
ARNi que se dirigen a Bub1. Los resultados se presentan en la
figura 17. Por consiguiente, desapareció la localización de una de
las dos proteínas de hSgo1 y hSgo2 en el centrómero. Este resultado
significa que la conclusión, "la localización de shugoshina en el
centrómero depende de la Bub1 cinasa", que se encontró en la
levadura del presente inventor, se conserva también en los
organismos superiores.
A continuación, se produjo el clon donde el ADNc
de los genes homólogos de shugoshina de ratón (SEC. ID. nº: 21 y
nº: 23) se fusionó con el gen GFP utilizando el vector retrovírico y
se expresó en células HeLa humanas. Los resultados se presentan en
la figura 18. Por consiguiente, se puso de manifiesto que alguna de
las proteínas de fusión de GFP está también localizada conjuntamente
con la proteína Bub1 del cinetocoro humano en la mitosis.
El análisis de las hSgo1 y hSgo2 anteriores y
los resultados del análisis obtenidos mediante la utilización de
genes homólogos de shugoshina de ratón sugirió fuertemente que la
proteína similar a la shugoshina en las células animales, que se
previó a partir de la secuencia, también presentan conservación
funcional con la shugoshina de la levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
La shugoshina de la presente invención que es un
factor regulador de la segregación cromosómica conservado en gran
medida en células eucarióticas, puede utilizarse provechosamente
para estudios del mecanismo de inducción del cáncer en la división
somática, las enfermedades de segregación de cromosomas tal como la
infecundidad o síndrome de Down en la división meiótica, y similares
excepto en la aclaración del mecanismo en la segregación de
cromosomas.
<110> Japan Science and Technology
Agency
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva proteína centromérica
SHUGOSHINA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P026341EP
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> 04819775.0
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-11-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2003-401943
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2004-279450
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-09-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
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<212> ADN
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<213> levadura
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
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<210> 2
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<211> 319
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<212> PRT
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<213> levadura
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 1944
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<212> ADN
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<213> levadura
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 647
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<212> PRT
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<213> levadura
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1773
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<212> ADN
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<213> levadura
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 590
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<212> PRT
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<213> levadura
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 2325
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<212> ADN
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<213> Neurospora crassa
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 774
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<212> PRT
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<213> Neurospora crassa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
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<211> 1671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 446
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> ratón
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 517
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> ratón
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<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> ratón
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<400> 15
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1164
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<212> PRT
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<213> ratón
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 1525
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 511
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 3798
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 1265
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 20
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<210> 21
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<211> 45
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<212> PRT
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<213> levadura
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<211> 45
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<212> PRT
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<213> levadura
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 45
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<212> PRT
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<213> levadura
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<210> 24
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<211> 45
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<212> PRT
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<213> Neurospora crassa
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 45
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<212> PRT
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<213> Dactylicapnos macrocapnos
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<400> 25
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<210> 26
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> levadura
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<210> 27
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> levadura
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<210> 28
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<211> 28
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<212> PRT
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<213> levadura
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<400> 28
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<210> 29
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<211> 28
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<212> PRT
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<213> Neurospora crassa
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<400> 29
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<210> 30
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Dactylicapnos macrocapnos
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 28
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Caenorhabditis elegans
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 29
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 33
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<213> ratón
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<212> PRT
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<213> ratón
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<223> \lambdaTriplEx
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 40
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> hSgo1
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<400> 40
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<210> 41
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> hSgo2
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<210> 42
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> hSgo1
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<210> 43
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<212> ADN
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<223> hSgo2
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<400> 43
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> siRNA, Target1
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<400> 44
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<210> 45
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<212> ADN
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<223> siRNA,_Target2
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<400> 45
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\hskip1cm
Claims (11)
1. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 2.
2. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se
sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada
en la SEC. ID. nº: 2 y con actividad reguladora de segregación
cromosómica.
3. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 4.
4. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se
sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada
en la SEC. ID. nº: 4 y con actividad reguladora de segregación
cromosómica.
5. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6.
6. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se
sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada
en la SEC. ID. nº: 6 y con actividad reguladora de segregación
cromosómica.
7. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº:
14, nº: 16, nº: 18 o nº: 20 y con actividad reguladora de
segregación cromosómica.
8. Proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se eliminan, se
sustituyen o se añaden en una secuencia de aminoácidos representada
en la SEC. ID. nº: 8, nº: 10, nº: 12, nº: 14, nº: 16, nº: 18 o nº:
20 y con actividad reguladora de segregación cromosómica.
9. Proteína de fusión en la que la proteína
según la reivindicación 1, 2, 3, 4, 7 u 8 está unida a una proteína
marcadora y/o a una etiqueta del péptido.
10. Anticuerpo que se une específicamente a la
proteína según la reivindicación 1, 2, 3, 4, 7 u 8.
11. Anticuerpo según la reivindicación 10, que
es un anticuerpo monoclonal.
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