ES2301375B1

ES2301375B1 - PROCEDURE FOR REGULATED EXPRESSION OF GENES IN EUCARIOTIC CELLS AND ELEMENTS FOR THEIR REALIZATION.

Info

Publication number: ES2301375B1
Application number: ES200601963A
Authority: ES
Inventors: Maria Jose Quintero Carrasco; Miguel Arevalo Rodriguez; Angel Cebolla Ramirez; Sebastian Chavez De Diego
Original assignee: Universidad de Sevilla
Current assignee: Universidad de Sevilla
Priority date: 2006-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2026-07-19
Also published as: WO2008009766A1; ES2301375A1

Abstract

Procedimiento de expresión regulada de genes en células eucarióticas y elementos para su realización.Regulated gene expression procedure in eukaryotic cells and elements for its realization.

La presente invención consiste en un procedimiento y un conjunto de elementos para la expresión regulada de genes en células eucarióticas en respuesta a una molécula efectora exógena. El procedimiento de regulación se consigue mediante la doble acción inductora de la molécula efectora exógena sobre la actividad de un activador transcripcional y sobre sus niveles intracelulares. El activador regula la expresión del gen diana que se pretende expresar, al activar el promotor bajo cuyo control se sitúa dicho gen diana.The present invention consists of a procedure and a set of elements for regulated expression of genes in eukaryotic cells in response to a molecule exogenous effector. The regulation procedure is achieved by the double inducing action of the exogenous effector molecule about the activity of a transcriptional activator and about its intracellular levels The activator regulates gene expression target to be expressed by activating the promoter under whose control is located said target gene.

Los campos de aplicación de la presente invención son los del uso de organismos eucarióticos como modelos para el estudio de la función de genes del mismo o diferente organismo, y como herramientas biotecnológicas para la producción de biomoléculas de interés científico, terapeútico o industrial. Especial relevancia tiene la tecnología descrita en la expresión regulada de genes en microorganismos eucarióticos como la levadura Saccharomyces cerevisiae.The fields of application of the present invention are those of the use of eukaryotic organisms as models for the study of the function of genes of the same or different organism, and as biotechnological tools for the production of biomolecules of scientific, therapeutic or industrial interest. The technology described in the regulated expression of genes in eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae yeast has a special relevance.

Description

Fields of application

La presente invención puede aplicarse a la expresión regulada de genes endógenos o exógenos en células eucarióticas, con el fin de estudiar los efectos biológicos de tal expresión en un organismo, o bien con el fin de obtener los productos codificados por estos genes a una escala que permita su extracción y uso posterior. Los campos de aplicación de la tecnología descrita serán, por tanto, preferentemente los del uso de organismos eucarióticos como modelos para el estudio de la función de genes del mismo o diferente organismo, y como herramientas biotecnológicas para la producción de biomoléculas de interés científico, terapéutico o industrial. Especial relevancia tiene la tecnología descrita en la expresión regulada de genes en microorganismos eucarióticos como la levadura Saccharomyces cerevisiae.The present invention can be applied to the regulated expression of endogenous or exogenous genes in eukaryotic cells, in order to study the biological effects of such expression in an organism, or in order to obtain the products encoded by these genes at a scale that allow its extraction and later use. The fields of application of the described technology will therefore be preferably those of the use of eukaryotic organisms as models for the study of the function of genes of the same or different organism, and as biotechnological tools for the production of biomolecules of scientific, therapeutic interest. or industrial The technology described in the regulated expression of genes in eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae yeast has a special relevance.

State of the art

El estudio de las funciones de los genes constituye una parte preponderante de las investigaciones biológicas que se llevan a cabo en la actualidad. La secuenciación del genoma completo de un elevado número de organismos, incluyendo el ser humano, está proporcionando un creciente volumen de información que precisa de los medios adecuados para ser transformada en conocimiento útil. Entre las herramientas que sirven para analizar la función de los nuevos genes identificados se encuentra la expresión heteróloga, que permite por un lado estudiar los efectos biológicos de la expresión de estos genes, y por otro obtener sus productos, con los cuales realizar todo tipo de ensayos bioquímicos. Estos ensayos requieren a menudo la obtención de una cantidad considerable de proteína, especialmente cuando se necesita cristalizarla para resolver su estructura tridimensional, o cuando ha de administrase a animales de laboratorio en ensayos farmacológicos. Una vez que una proteína concreta se convierte en producto con valor comercial será necesaria su producción a gran escala para cubrir la demanda del mercado.The study of gene functions constitutes a preponderant part of the investigations Biologicals that are carried out today. Sequencing of the complete genome of a large number of organisms, including the human being is providing a growing volume of information that you need of the appropriate means to be transformed into useful knowledge. Among the tools that serve to analyze the function of the new genes identified are Find the heterologous expression, which allows you to study the biological effects of the expression of these genes, and on the other obtain your products, with which to carry out all kinds of tests biochemicals These tests often require obtaining a considerable amount of protein, especially when needed crystallize it to solve its three-dimensional structure, or when must be administered to laboratory animals in tests Pharmacological Once a specific protein becomes product with commercial value will be necessary to produce large scale to meet market demand.

En todo sistema de expresión génica, la cantidad de proteína producida vendrá determinada principalmente por la actividad promotora de la trascripción del sistema, que será la responsable de la síntesis del RNA específico de la proteína. La secuencia de DNA que promueve la trascripción del gen a expresar se denomina promotor, y su actividad puede ser constitutiva o regulable, siendo los sistemas regulables los más atractivos al permitir un mayor control sobre la expresión del gen objeto de estudio, o la producción de la proteína de interés. En este sentido, se han desarrollado sistemas de expresión en organismos eucariotas basados en promotores regulables por proteínas quiméricas, como la fusión entre la proteína TetR (que responde al antibiótico tetraciclina) y el dominio de activación transcripcional derivado de la proteína VP16 del virus Herpes simplex (Gossen and Bujard 1992). De manera similar, se ha desarrollado un sistema de expresión eucariota basado en un transactivador quimérico resultante de la fusión entre el receptor nuclear de la hormona de insecto ecdisona y la proteína VP16, que responde a la hormona activando la transcripción de promotores reconocibles por el receptor hormonal (No, Yao et al. 1996). Existen varias patentes publicadas que proponen sistemas de expresión eucarioticos basados en activadores transcripcionales quiméricos, formados por módulos de unión a ADN, y de activación de la transcripción que responden a moléculas efectoras exógenas, como el descrito en la patente WO0111037, que incorpora como elementos del transactivador quimérico a la proteína reguladora de S. cerevisiae Gal4 y a la ya descrita VP16, o el descrito en la patente US5599904, que incorpora un transactivador modular similar al anterior pero que responde a ácido retinoico. Otros sistemas de expresión eucarióticos objeto de patente utilizan similares elementos de respuesta a moléculas exógneas, como el basado en un transactivador que responde a ácido cúmico (patente US2004205834).In any gene expression system, the amount of protein produced will be determined mainly by the promoter activity of the transcription of the system, which will be responsible for the synthesis of protein-specific RNA. The DNA sequence that promotes the transcription of the gene to be expressed is called a promoter, and its activity can be constitutive or regulable, the adjustable systems being the most attractive by allowing greater control over the expression of the gene under study, or the production of The protein of interest. In this sense, expression systems have been developed in eukaryotic organisms based on promoters adjustable by chimeric proteins, such as the fusion between the TetR protein (which responds to the tetracycline antibiotic) and the transcriptional activation domain derived from the Herpes simplex virus VP16 protein (Gossen and Bujard 1992). Similarly, a eukaryotic expression system based on a chimeric transactivator resulting from the fusion between the nuclear receptor of the insect hormone ecdysone and the VP16 protein has been developed, which responds to the hormone by activating the transcription of promoters recognizable by the receptor. hormonal (No, Yao et al . 1996). There are several published patents that propose eukaryotic expression systems based on chimeric transcriptional activators, formed by DNA binding modules, and transcription activation modules that respond to exogenous effector molecules, such as that described in WO0111037, which incorporates as elements of chimeric transactivator to the regulatory protein of S. cerevisiae Gal4 and to that already described VP16, or that described in US5599904, which incorporates a modular transactivator similar to the previous one but which responds to retinoic acid. Other patent eukaryotic expression systems use similar response elements to exogenous molecules, such as that based on a transactivator that responds to cumic acid (US2004205834).

En todos los procesos de producción de proteínas recombinantes, los microorganismos continúan siendo los sistemas de expresión más utilizados, debido principalmente a su fácil manipulación y cultivo, y al alto rendimiento de producción que se consigue con los mismos. Entre estos organismos se encuentra la levadura S. cerevisiae, un organismo muy fácil de cultivar, extremadamente manipulable desde el punto de vista genético, y cuyo genoma ha sido secuenciado en su totalidad, circunstancias éstas que permiten utilizarla en investigación biológica como organismo eucariótico modelo para el estudio de funciones celulares, genéticas y moleculares, tanto endógenas como de otros organismos. La levadura es un organismo hospedador tradicionalmente utilizado en la expresión de proteínas, con fines analíticos y también de producción biotecnológica, siendo numerosos los procesos de producción de proteína heteróloga basados en S. cerevisiae (Hinnen, Meyhack et al. 1989; Goeddel 1990; Gellissen, Melber et al. 1992; Hinnen, Buxton et al. 1995; Gellissen and Hollenberg 1997; Cereghino and Cregg 1999; Porro, Sauer et al. 2005), si bien en los últimos tiempos el uso biotecnológico de las levaduras como sistemas de expresión se ha extendido a otros organismos, como Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Candida boidinii, Arxula adeninivorans y Yarrrowia lipolytica, entre otros (Bergkamp, Kool et al. 1992) (Buckholz and Gleeson 1991) (Gellissen, Weydemann et al. 1992; Faber, Harder et al. 1995) (Gellissen, Kunze et al. 2005) (Reiser, Glumoff et al. 1990).In all recombinant protein production processes, microorganisms continue to be the most widely used expression systems, mainly due to their easy handling and culture, and the high production yield achieved with them. Among these organisms is the yeast S. cerevisiae , an organism very easy to grow, extremely manipulable from the genetic point of view, and whose genome has been sequenced in its entirety, circumstances that allow it to be used in biological research as a model eukaryotic organism for the study of cellular, genetic and molecular functions, both endogenous and other organisms. Yeast is a host organism traditionally used in the expression of proteins, for analytical purposes and also for biotechnological production, with numerous heterologous protein production processes based on S. cerevisiae (Hinnen, Meyhack et al . 1989; Goeddel 1990; Gellissen , Melber et al . 1992; Hinnen, Buxton et al . 1995; Gellissen and Hollenberg 1997; Cereghino and Cregg 1999; Porro, Sauer et al . 2005), although in recent times the biotechnological use of yeasts as expression systems It has spread to other organisms, such as Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Candida boidinii, Arxula adeninivorans and Yarrrowia lipolytica , among others (Bergkamp, Kool et al . 1992) (Buckholz and Gleeson 1991) (Gellissen, Weydemann et al . 1992; Faber , Harder et al . 1995) (Gellissen, Kunze et al . 2005) (Reiser, Glumoff et al . 1990).

Los sistemas de expresión heteróloga en levaduras están por lo general basados en plásmidos replicativos, en los cuales es posible insertar la secuencia de ADN del gen de la proteína que se pretende expresar, y que pueden ser introducidos por transformación en la cepa de levadura adecuada (Parent, Fenimore et al. 1985; Rine 1991; Schneider and Guarente 1991; Romanos, Scorer et al. 1992). Estos plásmidos tienen su propio origen de replicación, y cuentan con genes cuya presencia en la cepa hospedadora es necesaria para que ésta sobreviva en determinadas condiciones de cultivo, y que pueden usarse por tanto como marcadores de selección de las cepas transformadas. Además, los plásmidos de expresión incorporan secuencias de ADN promotoras y terminadoras de la trascripción, señales operativas reconocibles por la maquinaria celular de síntesis de ARN que son necesarias para la expresión de genes procedentes de organismos diferentes a la levadura. Los plásmidos de levaduras portan también secuencias de replicación y selección en Escherichia coli que permiten su propagación en esta bacteria, facilitando los procedimientos de donación necesarios.Heterologous yeast expression systems are generally based on replicative plasmids, in which it is possible to insert the DNA sequence of the protein gene that is intended to be expressed, and which can be introduced by transformation into the appropriate yeast strain ( Parent, Fenimore et al . 1985; Rine 1991; Schneider and Guarente 1991; Romanos, Scorer et al . 1992). These plasmids have their own origin of replication, and have genes whose presence in the host strain is necessary for it to survive under certain culture conditions, and which can therefore be used as selection markers of the transformed strains. In addition, expression plasmids incorporate promoter and transcription terminator DNA sequences, operational signals recognizable by the cellular RNA synthesis machinery that are necessary for the expression of genes from organisms other than yeast. Yeast plasmids also carry replication and selection sequences in Escherichia coli that allow their spread in this bacterium, facilitating the necessary donation procedures.

Aunque se pueden utilizar promotores constitutivos, es conveniente usar promotores regulables o inducibles para que la proteína sólo se sobreexprese cuando está adquiriéndose biomasa en el medio de cultivo. De esta forma se evita que los mutantes que no expresan la proteína recombinante crezcan más rápido por no tener que soportar un lastre metabólico de superproducir todo el tiempo la proteína, ya que esto les harta dominar con rapidez el cultivo, bajando los rendimientos drásticamente. Los promotores con muy bajo nivel basal permiten además la expresión regulada de proteínas que resultan tóxicas para la célula hospedadora. Con este objetivo, se han desarrollado sistemas de expresión en levadura basados en plásmidos con promotores regulables, como el del gen MET3, regulado negativamente por el aminoácido metionina (Mountain, Bystrom et al. 1991), el del gen PHO5, regulado negativamente por fosfato inorgánico (Kramer, DeChiara et al. 1984), el del gen CUP1, regulado positivamente por iones Cu^{2+} (Macreadie, Horaitis et al. 1991), o el de los genes GAL1 y GAL10, que son transcritos de manera divergente a partir una misma región promotora situada entre ambos (West, Yocum et al. 1984; Yocum, Hanley et al. 1984).Although constitutive promoters can be used, it is convenient to use adjustable or inducible promoters so that the protein is only overexpressed when biomass is being acquired in the culture medium. In this way, mutants that do not express the recombinant protein are prevented from growing faster because they do not have to endure a metabolic ballast of overproducing the protein all the time, since this makes them quickly dominate the culture, drastically lowering yields. Promoters with a very low baseline level also allow regulated expression of proteins that are toxic to the host cell. With this objective, plasmid-based yeast expression systems have been developed with adjustable promoters, such as that of the MET3 gene, negatively regulated by the amino acid methionine (Mountain, Bystrom et al . 1991), that of the PHO5 gene, negatively regulated by phosphate inorganic (Kramer, DeChiara et al . 1984), that of the CUP1 gene, positively regulated by Cu 2+ ions (Macreadie, Horaitis et al . 1991), or that of the GAL1 and GAL10 genes, which are transcribed in a manner divergent from the same promoter region between them (West, Yocum et al . 1984; Yocum, Hanley et al . 1984).

De entre los sistemas con promotores regulables, los basados en GAL1-10 han demostrado ser los más potentes en cuanto a niveles de expresión obtenibles (Schneider and Guarente 1991). La actividad del promotor GAL1-10 se activa por la presencia de galactosa en el medio de cultivo, y se reprime por glucosa. En condiciones naturales, la activación del promotor GAL1-10 depende de la proteína activadora Gal4, producto del gen (Johnston 1992). Siendo la galactosa un compuesto caro, y la glucosa dificil de evitar en la mayor parte de los medios de cultivo industriales, la utilización de los sistemas de expresión basados en GAL1-10 puede resultar poco conveniente fuera del laboratorio. En este sentido, se ha descrito un sistema de expresión en S. cerevisiae que utiliza elementos del sistema GAL clásico, combinándolos con otros elementos heterólogos descritos anteriormente (un receptor hormonal, la proteína VP16), para configurar un sistema de expresión que responde a la hormona \beta-estradiol (Louvion, Havaux-Copf et al. 1993).Among the systems with adjustable promoters, those based on GAL1-10 have proven to be the most potent in terms of levels of expression obtainable (Schneider and Guarente 1991). The activity of the GAL1-10 promoter is activated by the presence of galactose in the culture medium, and is repressed by glucose. Under natural conditions, the activation of the GAL1-10 promoter depends on the Gal4 activator protein, product of the gene ( Johnston 1992 ). Since galactose is an expensive compound, and glucose difficult to avoid in most industrial culture media, the use of expression systems based on GAL1-10 may be inconvenient outside the laboratory. In this sense, an expression system in S. cerevisiae has been described that uses elements of the classical GAL system, combining them with other heterologous elements described above (a hormonal receptor, the VP16 protein), to configure an expression system that responds to the β-estradiol hormone (Louvion, Havaux-Copf et al . 1993).

En la presente invención se describe un sistema de expresión derivado de varios de los elementos antes descritos, ensamblados en circuitos regulatorios nuevos que posibilitan la expresión altamente regulada de genes de interés en investigación y biotecnología. Los procedimientos regulatorios de esta invención se basan en la utilización de una molécula efectora exógena que opera en un doble nivel: sobre la actividad de los elementos activadores de la transcripción y sobre sus niveles intracelulares. Se consigue así mejorar los procedimientos anteriormente existentes al reducir la expresión basal e incrementar los niveles de inducción.In the present invention a system is described of expression derived from several of the elements described above, assembled in new regulatory circuits that enable the highly regulated expression of genes of interest in research and biotechnology. The regulatory procedures of this invention are based on the use of an exogenous effector molecule that operates on a double level: on the activity of the activating elements of transcription and its intracellular levels. Is achieved thus improve previously existing procedures by reducing basal expression and increase induction levels.

Brief Description of the Invention

El objeto de la presente invención es un procedimiento para la expresión regulada de genes en células eucarióticas, mediante el uso de una molécula efectora exógena que permite inducir tanto la concentración intracelular como la actividad intrinseca de un regulador positivo de la transcripción que opera sobre una secuencia promotora específica y dirige a su través la expresión del gen que se desea regular. La actividad del promotor depende de que el regulador positivo se encuentre en un estado activado y de la concentración intracelular de dicho regulador positivo; ambos parámetros son dependientes de la presencia de la molécula efectora exógena. El doble efecto de la molécula efectora exógena propicia bajos niveles de expresión basal cuando no está presente en el medio, junto a altos índices de activación cuando sí está presente. El regulador de la transcripción debe ser capaz de reconocer la molécula efectora y unirse a una secuencia específica de ADN para activar la transcripción de los promotores cercanos a dicha secuencia. Esto puede conseguirse mediante la combinación modular de tres dominios proteicos: uno capaz de reconocer una secuencia en el ADN, otro capaz de activar la transcripción, y un tercero capaz de reconocer la molécula efectora y que funcione regulando la actividad de alguno de los otros dos dominios anteriores.The object of the present invention is a procedure for the regulated expression of genes in cells eukaryotic, through the use of an exogenous effector molecule that allows to induce both intracellular concentration and intrinsic activity of a positive transcription regulator which operates on a specific promoter sequence and directs its through the expression of the gene that you want to regulate. The activity of promoter depends on the positive regulator being in a activated state and the intracellular concentration of said positive regulator; both parameters are dependent on the presence of the exogenous effector molecule. The double effect of exogenous effector molecule promotes low levels of basal expression when it is not present in the middle, together with high rates of activation when it is present. The regulator of the transcription must be able to recognize the effector molecule and join a specific DNA sequence to activate the transcription of promoters close to said sequence. This can be achieved by the modular combination of three domains protein: one capable of recognizing a sequence in DNA, another able to activate transcription, and a third party able to recognize the effector molecule and that works by regulating the activity of one of the other two previous domains.

Cuando la transcripción de la secuencia que codifica el regulador se coloca bajo su propio control mediante técnicas de ingenieria genética, se obtiene un sistema que se retroalimenta positivamente en respuesta a la molécula efectora. Como la actividad del regulador depende a su vez de la molécula efectora, el resultado es que la cantidad de regulador activo presente en la célula crece en respuesta a la presencia de dicha molécula efectora.When the sequence transcript that code the regulator is placed under its own control by genetic engineering techniques, you get a system that positive feedback in response to the effector molecule. How the activity of the regulator in turn depends on the molecule effector, the result is that the amount of active regulator present in the cell grows in response to the presence of said effector molecule.

Una variante más sofisticada del sistema que aquí se describe utiliza dos reguladores positivos que responden a la misma molécula efectora, pero que reconocen diferentes secuencias en el ADN. Uno de ellos se expresa de manera constitutiva y regula transcripcionalmente la expresión del segundo, que a su vez regula transcripcionalmente la expresión de la proteína de interés; ambos reguladores se activan por la misma molécula efectora. Se consigue así que tanto la cantidad como la actividad del segundo regulador estén controladas por la misma molécula efectora y puedan actuar sinérgicamente. Este sistema permite niveles más elevados de expresión del gen de interés, a partir de niveles basales muy reducidos, sin necesidad de contar con un represor de la transcripción acoplado.A more sophisticated system variant than described here uses two positive regulators that respond to the same effector molecule, but they recognize different DNA sequences. One of them expresses itself constitutively and transcriptionally regulates the expression of the second, which in its instead transcriptionally regulates the protein expression of interest; both regulators are activated by the same molecule effector It is achieved that both the quantity and the activity of the second regulator are controlled by the same molecule effector and can act synergistically. This system allows higher levels of expression of the gene of interest, from very low baseline levels, without the need for a coupled transcription repressor.

Un desarrollo posible de esta invención utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae y reguladores positivos que responden a la hormona \beta-estradiol, bien el receptor humano de estrógenos (hER) o bien la proteína quimérica Gal4-ER-VP16, formada por el dominio de unión a ADN de Gal4, el dominio de respuesta a \beta-estradiol de hER y el dominio de activación de la trascripción derivado de una proteína viral (VP16) (Louvion, Havaux-Copf et al. 1993). En presencia de \beta-estradiol, la proteína resultante promueve fuertemente la transcripción de secuencias de ADN situadas corriente abajo de promotores reconocibles por Gal4, que en condiciones normales activa la expresión de genes de la levadura responsables de la asimilación de galactosa en medios de cultivo con este azúcar como fuente de carbono (Johnston 1992). La invención es sin embargo aplicable a otros reguladores positivos de la transcripción que reconozcan otras secuencias de ADN y respondan a otras moléculas efectoras.A possible development of this invention uses the yeast Saccharomyces cerevisiae and positive regulators that respond to the hormone β-estradiol, either the human estrogen receptor (hER) or the chimeric protein Gal4-ER-VP16, formed by the binding domain to Gal4 DNA, the hER β-estradiol response domain and the transcription activation domain derived from a viral protein (VP16) (Louvion, Havaux-Copf et al . 1993). In the presence of β-estradiol, the resulting protein strongly promotes the transcription of DNA sequences located downstream of promoters recognizable by Gal4, which normally activates the expression of yeast genes responsible for galactose assimilation in culture media. with this sugar as a source of carbon (Johnston 1992). The invention is, however, applicable to other positive transcription regulators that recognize other DNA sequences and respond to other effector molecules.

El sistema descrito posee varias ventajas importantes, ya que consigue elevados niveles de inducción de la expresión génica, a partir de expresiones basales muy reducidas, en respuesta a concentraciones muy pequeñas de la molécula efectora, que además no es metabolizada en el proceso. La inducción de la expresión génica se produce con un mínimo de interferencia con el metabolismo general de la levadura, requiere la adición de cantidades muy pequeñas del inductor, y es virtualmente independiente del medio de cultivo utilizado. Los sistemas de expresión que utilizan \beta- estradiol como molécula efectora pueden combinarse fácilmente con otros, como el reprimible-inducible por tetraciclina (Tet-Off y Tet-On) (Fishman, Kaplan et al. 1994; Belli, Gari et al. 1998), en estudios de sustitución de funciones celulares del producto de un gen por las del de otro. Además, los sistemas en levadura basados en Gal4-ER-VP16 son compatibles con el uso de construcciones génicas bajo promotores reconocibles por Gal4 obtenidas previamente.The described system has several important advantages, since it achieves high levels of induction of gene expression, from very low basal expressions, in response to very small concentrations of the effector molecule, which is also not metabolized in the process. Induction of gene expression occurs with a minimum of interference with the general yeast metabolism, requires the addition of very small amounts of the inducer, and is virtually independent of the culture medium used. Expression systems that use β-estradiol as an effector molecule can easily be combined with others, such as the repressible-inducible by tetracycline (Tet-Off and Tet-On) (Fishman, Kaplan et al . 1994; Belli, Gari et al . 1998), in studies of substitution of cellular functions of the product of one gene by those of another. In addition, yeast systems based on Gal4-ER-VP16 are compatible with the use of gene constructs under previously recognized promoters by Gal4.

Brief description of the figures

Figura 1: Esquema general de la invención. Una molécula efectora exógena induce simultáneamente, bien directamente, bien a través de elementos intermediarios, la actividad transcripcional y los niveles intracelulares de un activador de la transcripción, cuya secuencia codificante se encuentra bajo el control del promotor 1. El activador sensible a la molécula efectora regula, a través del promotor 2, los niveles de expresión del gen diana de la regulación, que se encuentra bajo el control de este segundo promotor.Figure 1: General scheme of the invention. A exogenous effector molecule simultaneously induces, well directly, either through intermediary elements, the transcriptional activity and intracellular levels of a transcription activator, whose coding sequence is is under the control of promoter 1. The activator sensitive to the effector molecule regulates, through promoter 2, the levels of expression of the target gene of regulation, which is under the control of this second promoter.

Figura 2: Esquema de bucle de retroalimentación positiva controlado por una molécula efectora exógena. La molécula efectora exógena desencadena la retroalimentación positiva al activar simultáneamente la actividad del activador y su propia síntesis, lo que se consigue al situar la secuencia codificante del activador bajo su propio control transcripcional.Figure 2: Feedback loop scheme positive controlled by an exogenous effector molecule. Molecule exogenous effector triggers positive feedback to simultaneously activate the activity of the activator and its own synthesis, what is achieved by placing the coding sequence of the activator under its own transcriptional control.

Figura 3: Aplicación del esquema de la figura 2 a la levadura S. cerevisiae mediante el uso del activador quimérico Gal4-ER-VP16 controlado por \beta-estradiol. El activador es capaz de activar el promotor GAL1 gracias al domino de unión al ADN del Gal4 y el dominio de activación de la transcripción de VP 16, pero sólo en presencia de \beta-estradiol, que es detectado por el dominio de unión a hormona del receptor de estrógenos. En presencia de \beta-estradiol, el activador activa su propia síntesis al estar ésta bajo el control del promotor GAL1, así como la transcripción del gen diana, que también se encuentra bajo el control del promotor GAL1.Figure 3: Application of the scheme of Figure 2 to S. cerevisiae yeast by using the Gal4-ER-VP16 chimeric activator controlled by β-estradiol. The activator is capable of activating the GAL1 promoter thanks to the DNA binding domain of Gal4 and the transcription activation domain of VP 16, but only in the presence of β-estradiol, which is detected by the hormone binding domain of the estrogen receptor. In the presence of β-estradiol, the activator activates its own synthesis by being under the control of the GAL1 promoter, as well as transcription of the target gene, which is also under the control of the GAL1 promoter.

Figura 4: Esquema de cascada reguladora controlada por una molécula efectora exógena. La molécula efectora exógena induce la actividad de un regulador primario que activa la transcripción del gen diana, a través de un promotor regulable que es reconocido por dicho regulador primario. De manera simultánea, la misma molécula efectora exógena induce un incremento en los niveles intracelulares del activador primario, al activar un activador secundario que regula positivamente el promotor del gen que codifica el activador primario. El activador secundario se encuentra permanentemente expresado en la célula al estar su expresión situada bajo el control de un promotor constitutivo.Figure 4: Regulatory Cascade Scheme controlled by an exogenous effector molecule. The effector molecule exogenous induces the activity of a primary regulator that activates the transcription of the target gene, through an adjustable promoter that is recognized by said primary regulator. Simultaneously the same exogenous effector molecule induces an increase in intracellular levels of the primary activator, when activating a secondary activator that positively regulates the gene promoter which encodes the primary trigger. The secondary trigger is is permanently expressed in the cell when its expression placed under the control of a constitutive promoter.

Figura 5: Aplicación del esquema de la figura 4 a la levadura S. cerevisiae mediante el uso del receptor de estrógenos humano (hER) como activador primario y del activador quimérico Gal4-ER-VP16 como activador secundario. La actividad de ambos reguladores es inducida por \beta-estradiol. El gen diana de la regulación se encuentra bajo el control de un promotor que contiene uno o varios elementos de respuesta a estrógenos (ERE), lo que permite su reconocimiento por el receptor de estrógenos cuando se encuentra activo. La expresión del receptor de estrógenos se encuentra bajo el control del promotor GAL1, que a su vez es regulado por el activador quimérico Gal4-ER-VP16, cuya expresión es constitutiva al estar bajo el control del promotor del gen ADH1.Figure 5: Application of the scheme of Figure 4 to the S. cerevisiae yeast by using the human estrogen receptor (hER) as the primary activator and the chimeric activator Gal4-ER-VP16 as a secondary activator. The activity of both regulators is induced by β-estradiol. The regulation target gene is under the control of a promoter that contains one or more estrogen response elements (ERE), which allows its recognition by the estrogen receptor when it is active. Estrogen receptor expression is under the control of the GAL1 promoter, which in turn is regulated by the chimeric activator Gal4-ER-VP16, whose expression is constitutive as it is under the control of the ADH1 gene promoter .

Figura 6: Resultados del Ejemplo 1. Cuantificación de las actividades \beta-galactosidasa de los cultivos de la cepa W303-1A de Saccharomyces cerevisiae transformada únicamente con el plásmido reportero p416GAL1lacZ (Sin activador), con el plásmido reportero y el plásmido pADH1-GAL4ERVP16 que expresa constitutivamente el activador quimérico (Con Gal4ERVP16 constitutivo), o con el plásmido reportero y el plásmido que expresa el activador quimérico bajo control del promotor GAL1 (Con Gal4ERVP16 autoregulado). Se muestran los valores correspondientes a las media obtenida a partir de cuatro ensayos de la actividad \beta-galactosidasa alcanzada por cada cultivo tras 6 generaciones en presencia o ausencia de \beta-estradiol (11 \muM). Las barras de error indican la desviación estándar.Figure 6: Results of Example 1. Quantification of the β-galactosidase activities of the cultures of Saccharomyces cerevisiae strain W303-1A transformed only with the reporter plasmid p416GAL1lacZ (Without activator), with the reporter plasmid and the plasmid pADH1-GAL4ERVP16 constitutively expressing the chimeric activator (with constitutive Gal4ERVP16), or with the reporter plasmid and the plasmid expressing the chimeric activator under control of the GAL1 promoter (with self-regulated Gal4ERVP16). The values corresponding to the average obtained from four assays of the β-galactosidase activity achieved by each culture after 6 generations in the presence or absence of β-estradiol (11 µM) are shown. Error bars indicate the standard deviation.

Figura 7: Resultados del Ejemplo 2. Cuantificación de las actividades \beta-galactosidasa de los cultivos de la cepa W303-1A de S. cerevisiae transformada únicamente con el plásmido reportero pERECYC1lacZ (Sin activador); de cultivos en medio con galactosa de dicha cepa transformada con el plásmido reportero y con el plásmido pGAL1-ER, que en esas condiciones expresa constitutivamente el receptor de estrógenos (Con hER constitutivo); o de cultivos de la cepa Y01044 (carente del activador Gal4 y del represor Gal4-Gal80) transformada con el plásmido reportero, el plásmido pADH1-GAL4ERVP 16, que expresa constitutivamente el activador quimérico, y el plásmido pGAL1-ER, que expresa el receptor de estrógenos cuando se activa el promotor GAL1 (Con Gal4ERVP16 y hER en cascada). Se muestran los valores correspondientes a la media obtenida a partir de cuatro ensayos de la actividad \beta-galactosidasa alcanzada por cada cultivo tras 6 generaciones en presencia o ausencia de \beta-estradiol (1 \muM). Las barras de error indican la desviación estándar.Figure 7: Results of Example 2. Quantification of the β-galactosidase activities of cultures of S. cerevisiae strain W303-1A transformed only with the reporter plasmid pERECYC1lacZ (Without activator); of cultures in galactose medium of said strain transformed with the reporter plasmid and with the plasmid pGAL1-ER, which under these conditions constitutively expresses the estrogen receptor (with constitutive hER); or of cultures of strain Y01044 (lacking the Gal4 activator and the Gal4-Gal80 repressor) transformed with the reporter plasmid, plasmid pADH1-GAL4ERVP 16, which constitutively expresses the chimeric activator, and plasmid pGAL1-ER, which expresses the receptor estrogen when the GAL1 promoter is activated (with Gal4ERVP16 and hER in cascade). The values corresponding to the average obtained from four assays of the β-galactosidase activity achieved by each culture after 6 generations in the presence or absence of β-estradiol (1 µM) are shown. Error bars indicate the standard deviation.

Detailed description of the invention

La presente invención consiste en un procedimiento de expresión regulada de genes que comprende:The present invention consists of a Regulated gene expression procedure comprising:

1.one.: Una secuencia promotora de la transcripción que dirige la expresión del gen que codifica la proteína de interés. Esta secuencia puede ser un promotor completo del organismo utilizado, que contenga tanto las secuencias de unión del regulador transcripcional como las secuencias que dirigen la iniciación de la transcripción. En el caso de S. cerevisiae pueden utilizarse promotores altamente regulados como el de los genes GAL1-GAL10, cuyas secuencias reguladoras (GAL UAS) son reconocidas simultáneamente por el sistema de represión que mantiene bajos los niveles de transcripción basal y por el regulador positivo. Alternativamente, la secuencia promotora puede consistir en un promotor quimérico que combine secuencias reguladoras y regiones de ensamblaje de la maquinaria transcripcional (core promoter elements) de distinta procedencia.A transcription promoter sequence that directs the expression of the gene that encodes the protein of interest. This sequence can be a complete promoter of the organism used, which contains both the binding sequences of the transcriptional regulator and the sequences that direct the initiation of transcription. In the case of S. cerevisiae, highly regulated promoters such as the GAL1-GAL10 genes can be used , whose regulatory sequences (GAL UAS) are simultaneously recognized by the repression system that keeps baseline transcription levels low and by the positive regulator. Alternatively, the promoter sequence may consist of a chimeric promoter that combines regulatory sequences and assembly regions of the transcriptional machinery ( core promoter elements ) from different sources.

2.2.: Un regulador positivo de la transcripción o activador, que reconoce específicamente las secuencias reguladoras del promotor regulado antes descrito. Este regulador positivo puede ser un factor transcripcional del organismo utilizado o puede provenir de otro organismo diferente y ser expresado heterólogamente en el organismo de trabajo. También puede consistir en una proteína quimérica que combine dominios proteicos con diferente funcionalidad: dominio de unión al ADN que reconozca la secuencia reguladora, dominio de activación de la transcripción y dominio regulador alostérico que responda a una molécula efectora. En el caso de utilizarse promotores cuyas secuencias reguladoras sean las GAL UAS de S. cerevisiae, pueden utilizarse reguladores quiméricos que contengan el dominio de unión al ADN de la proteína Gal4, fusionado a dominios de activación de la transcripción y a dominios reguladores de diferente procedencia, como es el caso de la proteína quimérica Gal4-ER-VP16 (Louvion, Havaux-Copf et al. 1993).A positive transcription regulator or activator, which specifically recognizes the regulatory sequences of the regulated promoter described above. This positive regulator may be a transcriptional factor of the organism used or it may come from a different organism and be expressed heterologously in the working organism. It can also consist of a chimeric protein that combines protein domains with different functionality: DNA binding domain that recognizes the regulatory sequence, transcription activation domain and allosteric regulatory domain that responds to an effector molecule. In the case of promoters whose regulatory sequences are the UAS GALs of S. cerevisiae , chimeric regulators containing the DNA binding domain of the Gal4 protein, fused to transcription activation domains and regulatory domains of different origin, may be used, as is the case with the chimeric protein Gal4-ER-VP16 (Louvion, Havaux-Copf et al . 1993).

3.3.: Una molécula efectora que modula la actividad del regulador positivo de la transcripción así como la concentración intracelular de éste (Figura 1). La molécula efectora puede regular actuando positivamente sobre la actividad del regulador y sobre su abundancia, o puede hacerlo negativamente, siendo necesario en este caso retirar la molécula efectora para conseguir regular positivamente la expresión de la proteína de interés. La molécula efectora puede modular la actividad del regulador mediante interacción directa con éste, a través de un sitio regulador, o puede hacerlo a través de uno o varios elementos intermediarios que transmitan hasta el regulador la señal originada en la molécula efectora. En el caso de utilizarse como regulador un receptor nuclear, la molécula efectora es el ligando correspondiente, normalmente una hormona, que es reconocida por el dominio de unión a hormona. Éste es también el caso de la proteína quimérica GAL4-ER-VP16, que contiene el dominio de unión a estrógeno del receptor de estrógenos humano, y cuya actividad requiere estrictamente la presencia de estrógenos como el \beta-estradiol. La molécula efectora controla asimismo los niveles intracelulares del regulador positivo. Para ello la expresión del regulador positivo debe estar bajo el control de la molécula efectora. En el modelo más simple comprendido por la presente invención la expresión del regulador positivo está bajo su propio control, al encontrarse las secuencias reguladoras que reconoce el regulador positivo en el promotor que regula la expresión de éste. El sistema global adopta la forma de un bucle que se retroalimenta positivamente tras ser desencadenado por la presencia de la molécula efectora (Figura 2). Si se utiliza la proteína GAL4-ER-VP16 como activador y el \beta-estradiol como molécula efectora, la retroalimentación positiva se consigue colocando la expresión de GAL4-ER-VP16 bajo el control de secuencias GAL-UAS como las que contiene el promotor del gen GAL1 de S. cerevisiae, que son reconocidas por el propio regulador en presencia de la molécula efectora (Figura 3).An effector molecule that modulates the activity of the positive transcription regulator as well as its intracellular concentration (Figure 1). The effector molecule can regulate acting positively on the activity of the regulator and its abundance, or it can do so negatively, being necessary in this case to remove the effector molecule to achieve positively regulate the expression of the protein of interest. The effector molecule can modulate the activity of the regulator by direct interaction with it, through a regulatory site, or it can do so through one or more intermediate elements that transmit the signal originating in the effector molecule to the regulator. In the case of using a nuclear receptor as a regulator, the effector molecule is the corresponding ligand, usually a hormone, which is recognized by the hormone binding domain. This is also the case of the GAL4-ER-VP16 chimeric protein, which contains the estrogen binding domain of the human estrogen receptor, and whose activity strictly requires the presence of estrogens such as β-estradiol. The effector molecule also controls the intracellular levels of the positive regulator. For this, the expression of the positive regulator must be under the control of the effector molecule. In the simplest model encompassed by the present invention, the expression of the positive regulator is under its own control, as the regulatory sequences recognized by the positive regulator are found in the promoter that regulates its expression. The global system takes the form of a loop that is positively fed back after being triggered by the presence of the effector molecule (Figure 2). If GAL4-ER-VP16 protein is used as activator and β-estradiol as effector molecule, positive feedback is achieved by placing GAL4-ER-VP16 expression under the control of GAL-UAS sequences such as those contained in the promoter. of the S. cerevisiae GAL1 gene, which are recognized by the regulator itself in the presence of the effector molecule (Figure 3).

El sistema de bucle retroalimentado positivamente funciona de manera óptima cuando los niveles basales de expresión del activador, en ausencia de la molécula efectora, son bajos, como consecuencia por Ejemplo de la actuación de un represor. La necesidad de que los niveles basales del activador primario sean reducidos disminuye si éste se encuentra bajo el control transcripcional de un segundo activador (activador secundario), que se expresa constitutivamente, pero cuya actividad responde a la presencia de la misma molécula efectora. En este caso, en lugar de un bucle con retroalimentación positiva, disponemos de una cascada regulatoria que depende de la molécula efectora exógena (Figura 4). Si se utiliza \beta-estradiol como molécula efectora exógena, el regulador primario puede ser el propio receptor de estrógenos humano, con capacidad para reconocer en el ADN la secuencia de los elementos de respuesta a estrógenos (ERE). El promotor que dirige la expresión de la proteína de interés ha de contener por tanto secuencias ERE. La expresión del regulador primario, en este caso el receptor de estrógenos humano, ha de encontrarse bajo el control del activador secundario, que a su vez debe responder también al \beta-estradiol. Como regulador secundario puede por tanto utilizarse la proteína Gal4-ER-VP 16, siempre que el regulador primario se sitúe bajo el control de las GAL UAS que reconoce el dominio de unión al ADN de Gal4. El activador secundario puede expresarse mediante un promotor constitutivo, como el del gen ADH1 de S. cerevisiae. El resultado global es una cascada regulatoria que responde al \beta-estradiol amplificando la respuesta al mismo (Figura 5). Dados la gran conservación evolutiva de la maquinaria transcripcional eucariótica y el hecho de que este sistema de regulación en cascada inducido por \beta-estradiol sea prácticamente independiente de cualquier regulador específico del hospedador, es altamente probable que este sistema pueda ser adaptado con facilidad a otros eucariontes que carezcan de regulación por estrógenos.The positive feedback loop system works optimally when the basal levels of expression of the activator, in the absence of the effector molecule, are low, as a consequence of the action of a repressor. The need for the basal levels of the primary activator to be reduced decreases if it is under the transcriptional control of a second activator (secondary activator), which is constitutively expressed, but whose activity responds to the presence of the same effector molecule. In this case, instead of a loop with positive feedback, we have a regulatory cascade that depends on the exogenous effector molecule (Figure 4). If β-estradiol is used as an exogenous effector molecule, the primary regulator may be the human estrogen receptor itself, with the ability to recognize in the DNA the sequence of estrogen response elements (ERE). The promoter that directs the expression of the protein of interest must therefore contain ERE sequences. The expression of the primary regulator, in this case the human estrogen receptor, must be under the control of the secondary activator, which in turn must also respond to β-estradiol. As a secondary regulator, the Gal4-ER-VP 16 protein can therefore be used, provided that the primary regulator is under the control of the UAS GAL that recognizes the Gal4 DNA binding domain. The secondary activator can be expressed by a constitutive promoter, such as that of the S. cerevisiae ADH1 gene. The overall result is a regulatory cascade that responds to β-estradiol by amplifying the response to it (Figure 5). Given the great evolutionary conservation of eukaryotic transcriptional machinery and the fact that this β-estradiol-induced cascade regulation system is virtually independent of any specific host regulator, it is highly likely that this system can be easily adapted to others. eukaryotes that lack estrogen regulation.

Los distintos elementos genéticos que constituyen los sistemas regulatorios descritos, tanto los promotores y secuencias codificantes que dirigen la expresión de los activadores, como los promotores bajo cuya expresión se sitúan los genes diana, pueden expresarse desde uno o varios plásmidos. Estos plásmidos pueden tener carácter no replicativos e introducirse en las células por transfección transitoria, o pueden tener carácter replicativo e introducirse en la célula de manera estable mediante transfección, transformación o conjugación. El número de copias que alcanza cada plásmido en la célula hospedadora pueden ser estable, por Ejemplo de copia única, o puede ser múltiple y variar en función de la fisiología del cultivo. En el caso de que se utilice S. cerevisiae como organismo de expresión, los plásmidos estables han de portar secuencias de replicación autónoma, que pueden acompañarse de secuencias centrómericas, o pueden llevar secuencias replicativas derivados del círculo de 2 micras; en el primer caso los plásmidos resultantes tendrán un número de copias estable y próximo a uno, mientras que en el segundo caso el número de copias será múltiple y variable dentro de la población de células del cultivo (Futcher 1988; West 1988). Los plásmidos que contienen los elementos genéticos de los sistemas regulatorios descritos en esta invención pueden contener más de uno de estos elementos. En el caso de utilizarse promotores similares para dirigir la transcripción de más de uno de los elementos del sistema, puede usarse un promotor bidireccional situado en un plásmido y que dirija de manera divergente la transcripción de dos de los genes. En el caso del sistema regulatotorio mediante bucle retroalimentado positivamente, el promotor bidireccional puede dirigir la transcripción de la secuencia codificante del activador y, de forma divergente, dirigir la transcripción del gen diana. La aplicación de este esquema a S. cerevisiae puede concretarse situando en el plásmido el promotor divergente GAL1-GAL10, bajo cuyo control quedaria en una dirección la secuencia codificante de un activador que reconozca las secuencias GAL-UAS presentes en dicho promotor y en la dirección opuesta el gen diana objeto de la regulación. Lo descrito para plásmidos centroméricos circulares de Saccharomyces cerevisiae es de aplicación también a cromosomas artificiales de levadura (YAC) (Burke 1990).The different genetic elements that constitute the regulatory systems described, both the promoters and coding sequences that direct the expression of the activators, and the promoters under whose expression the target genes are located, can be expressed from one or several plasmids. These plasmids can be non-replicative and introduced into cells by transient transfection, or they can be replicative in nature and introduced into the cell stably by transfection, transformation or conjugation. The number of copies that each plasmid reaches in the host cell can be stable, for example single copy, or it can be multiple and vary depending on the physiology of the culture. In the case where S. cerevisiae is used as an expression organism, stable plasmids must carry autonomous replication sequences, which may be accompanied by centriomerican sequences, or may carry replicative sequences derived from the 2 micron circle; in the first case the resulting plasmids will have a stable and close to one copy number, while in the second case the copy number will be multiple and variable within the culture cell population (Futcher 1988; West 1988). Plasmids containing the genetic elements of the regulatory systems described in this invention may contain more than one of these elements. In the case of using similar promoters to direct the transcription of more than one of the elements of the system, a bidirectional promoter located in a plasmid can be used and divergently directs the transcription of two of the genes. In the case of the positively feedback loop regulatory system, the bidirectional promoter can direct the transcription of the activator coding sequence and, divergently, direct the transcription of the target gene. The application of this scheme to S. cerevisiae can be achieved by placing the divergent promoter GAL1-GAL10 on the plasmid, under whose control the coding sequence of an activator that recognizes the GAL-UAS sequences present in said promoter and in the direction would remain in one direction. opposite the target gene subject to regulation. What is described for Saccharomyces cerevisiae circular centromeric plasmids is also applicable to artificial yeast chromosomes (YAC) (Burke 1990).

Alternativamente, los elementos genéticos que conforman los sistemas de regulación génica descritos en esta invención pueden estar integrados en el genoma cromosómico del organismo elegido para realizar la expresión. En este caso sería necesario utilizar técnicas que permitan la integración de las unidades transcripcionales que dirigen la expresión de los activadores y del gen diana, mediante procedimientos de recombinación molecular. Esta recombinación puede ser aleatoria (recombinación ilegítima), puede estar mediada por recombinasas (recombinación específica de sitio) o puede responder a homología de secuencia (recombinación homóloga). En el caso de utilizarse S. cerevisiae como organismo de expresión, el procedimiento de integración mediante recombinación homóloga es altamente exitoso. Las unidades transcripcionales que expresan los elementos genéticos del sistema regulatorio pueden por tanto integrarse en esta levadura si se hacen flanquear por secuencias de más de 40 pares de bases de longitud que presenten homología con el locus elegido para la integración (Rose 1990).Alternatively, the genetic elements that make up the gene regulation systems described in this invention may be integrated into the chromosomal genome of the organism chosen to perform the expression. In this case it would be necessary to use techniques that allow the integration of the transcriptional units that direct the expression of the activators and the target gene, by molecular recombination procedures. This recombination may be random (illegitimate recombination), may be mediated by recombinases (site-specific recombination) or may respond to sequence homology (homologous recombination). In the case of S. cerevisiae being used as an expression organism, the homologous recombination integration procedure is highly successful. The transcriptional units that express the genetic elements of the regulatory system can therefore be integrated into this yeast if they are flanked by sequences of more than 40 base pairs in length that have homology with the locus chosen for integration (Rose 1990).

La presente invención ha sido desarrollada en la levadura Saccharomyces cerevisiae pero es aplicable a otros organismos eucarióticos usando elementos y factores de transcripción análogos, ya conocidos en el estado de la técnica.The present invention has been developed in the yeast Saccharomyces cerevisiae but is applicable to other eukaryotic organisms using analogous elements and transcription factors, already known in the state of the art.

Examples of embodiment of the invention Example 1 Β-estradiol-induced expression of E. coli β-galactosidase in S. cerevisiae by a positively feedback loop system

El presente Ejemplo muestra la capacidad del procedimiento descrito para inducir la expresión de la \beta-galactosidasa de la bacteria Escherichia coli en la levadura Saccharomyces cerevisiae mediante la adición al medio de concentraciones micromolares de \beta-estradiol, partiendo de niveles basales de expresión muy reducidos.The present Example shows the ability of the described procedure to induce the expression of the β-galactosidase of the bacterium Escherichia coli in the yeast Saccharomyces cerevisiae by adding to the medium micromolar concentrations of β-estradiol, starting from very basal levels of expression reduced

Para realizar el Ejemplo se construyó el plásmido pGAL1-GAL4ERVP16 mediante la inserción en el vector centromérico de expresión en levadura p414GAL1 (Mumberg, Muller et al. 1994) de los fragmentos de ADN correspondientes al dominio de unión al ADN de la proteína Gal4 de S. cerevisiae (93 primeros residuos aminoacídicos del extremo N-terminal), el dominio de unión a hormona del receptor de estrógenos humano (residuos 282 a 756 de la proteína) y el dominio de transactivación de la proteína VP16 del virus Herpes simplex (residuos 424 a 490 de la proteína). Estos tres dominios fueron insertados en fase como una fusión traduccional, entre el promotor GAL1 y el terminador CYC1 presentes en el vector. Se construyó asimismo el plásmido pADH1-GAL4ERVP16, mediante la inserción de la fusión traduccional GAL4ERVP16 en el vector p413ADH1, entre el promotor ADH1 y el terminador CYC1 presentes en el vector (Mumberg, Muller et al. 1995).For Example plasmid pGAL1-GAL4ERVP16 was constructed by inserting into the centromeric vector yeast expression p414GAL1 (Mumberg, Muller et al. 1994) the DNA fragments corresponding to the DNA-binding domain of the Gal4 protein S cerevisiae (93 first amino acid residues of the N-terminal end), the hormone binding domain of the human estrogen receptor (residues 282 to 756 of the protein) and the transactivation domain of the VP16 protein of Herpes simplex virus (residues 424 to 490 of the protein). These three domains were inserted in phase as a translational fusion, between the GAL1 promoter and the CYC1 terminator present in the vector. Plasmid pADH1-GAL4ERVP16 was also constructed, by inserting the GAL4ERVP16 translational fusion into the vector p413ADH1, between the ADH1 promoter and the CYC1 terminator present in the vector (Mumberg, Muller et al . 1995).

Como vector de expresión de la \beta-galactosidasa se utilizó el plásmido centromérico p416GAL1lacZ, en el que el gen lacZ de E. coli se sitúa bajo el control del promotor GAL1 de S. cerevisiae (Mumberg, Muller et al. 1994).The centromeric plasmid p416GAL1lacZ was used as the β-galactosidase expression vector, in which the E. coli lac Z gene is placed under the control of the S. cerevisiae GAL1 promoter (Mumberg, Muller et al . 1994).

La estirpe W303-1A (MATa, ade2, his3, leu2, trpl, ura3) de S. cerevisiae fue transformada con los plásmidos pGAL1-GAL4ERVP16 y p416GAL1lacZ, con pADH1GAL4ERVP16 y p416GAL1lacZ, o sólo con p416GAL1lacZ, mediante procedimientos estándar de manipulación genética de levaduras (Rose 1990). Los transformantes fueron cultivados a 30ºC, en medio líquido SC libre de uracilo, triptófano o histidina (según la combinación de plásmidos) para mantener la presión selectiva a favor del mantenimiento de los plásmidos introducidos, y en agitación orbital continua. Como control se utilizaron transformantes que portaban exclusivamente el plásmido p416GAL1lacZ. Los cultivos, de 5 ml, se realizaron en presencia de 1 \muM \beta-estradiol (SIGMA E-1024-1G), mediante la adición de 2 \mul de una solución 2,5 mM de \beta-estradiol disuelta en etanol. A los controles sin \beta-estradiol se les añadió igual volumen de etanol. Tras 6 generaciones de cultivo (aproximadamente 14 horas) y alcanzar una densidad óptica de entre 0,8 y 1,0 (a 600 nm) se procedió a recoger las células por centrifugación. La actividad \beta-galactosidasa se ensayó siguiendo los procedimientos estándar para levaduras (Guarente 1983). Los experimentos se realizaron por cuadruplicado.The W303-1A line ( MATa, ade2, his3, leu2, trpl, ura3 ) of S. cerevisiae was transformed with plasmids pGAL1-GAL4ERVP16 and p416GAL1lacZ, with pADH1GAL4ERVP16 and p416GAL1lacZ, or only with p416 manipulation standard yeasts (Rose 1990). The transformants were grown at 30 ° C, in liquid medium SC free of uracil, tryptophan or histidine (depending on the combination of plasmids) to maintain the selective pressure in favor of the maintenance of the introduced plasmids, and in continuous orbital agitation. As a control, transformants that exclusively carried plasmid p416GAL1lacZ were used. The 5 ml cultures were carried out in the presence of 1 µM? -Estradiol (SIGMA E-1024-1G), by adding 2 µL of a 2.5 mM solution of?-Estradiol dissolved in ethanol . Equal volume of ethanol was added to controls without β-estradiol. After 6 generations of culture (approximately 14 hours) and reaching an optical density between 0.8 and 1.0 (at 600 nm), the cells were collected by centrifugation. The β-galactosidase activity was tested following standard procedures for yeasts (Guarente 1983). The experiments were performed in quadruplicate.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 6. La presencia del regulador positivo bajo el control del bucle retroalimentado positivamente no supuso aumento alguno de la expresión basal de la \beta-galactosidasa, mientras que la adición de la molécula efectora (\beta-estradiol) produjo una inducción de 274 veces en el nivel de expresión. Por contra, cuando se expresó constitutivamente el regulador positivo (pADH1GAL4ERVP16) la expresión basal en ausencia de \beta-estradiol fue 27 veces superior y la inducción obtenida al añadir \beta-estradiol fue sólo de 32 veces.The results obtained are shown in the Figure 6. The presence of the positive regulator under the control of the positive feedback loop did not involve any increase in the basal expression of β-galactosidase, while the addition of the effector molecule (β-estradiol) produced an induction of 274 times at the level of expression. By cons, when it was expressed constitutively the positive regulator (pADH1GAL4ERVP16) the baseline expression in the absence of β-estradiol was 27 times higher and the induction obtained by adding β-estradiol was only 32 times.

Example 2 Β-estradiol-induced expression of E. coli β-galactosidase in S. cerevisiae by a regulatory system with two cascading transcriptional activators

El presente Ejemplo muestra la capacidad del procedimiento descrito para inducir altos niveles de expresión de la \beta-galactosidasa de la bacteria E. coli en la levadura S. cerevisiae mediante la adición al medio de concentraciones micromolares de \beta-estradiol, partiendo de reducidos niveles basales de expresión, en ausencia de mecanismos de represión de la expresión de los reguladores positivos.The present Example shows the ability of the described procedure to induce high levels of E. coli β-galactosidase expression in S. cerevisiae yeast by adding micromolar concentrations of β-estradiol to the medium, starting from reduced basal levels of expression, in the absence of mechanisms to repress the expression of positive regulators.

Para realizar el Ejemplo se construyó el plásmido pGAL1-ER mediante la inserción del cDNA del receptor de estrógenos humano en el vector centromérico de expresión en levadura p414GAL1, entre el promotor GAL1 y el terminador CYC1 presentes en el vector (Mumberg, Muller et al. 1995).To perform the Example, plasmid pGAL1-ER was constructed by inserting the human estrogen receptor cDNA into the centromeric yeast expression vector p414GAL1, between the GAL1 promoter and the CYC1 terminator present in the vector (Mumberg, Muller et al . nineteen ninety five).

Como vector de expresión de la \beta-galactosidasa se construyó el plásmido centromérico pERECYC1lacZ, en el que el gen lacZ de Escherichia coli se sitúa bajo el control del promotor quimérico compuesto por una secuencia de respuesta a estrógenos (ERE) y los elementos basales del promotor CYC1 de S. cerevisiae. Para ello se insertó la secuencia ERE en el vector p416CYC1lacZ, aguas arriba del promotor CYC1 (Mumberg, Muller et al. 1995).The centromeric plasmid pERECYC1lacZ was constructed as the β-galactosidase expression vector, in which the Escherichia coli lac Z gene is placed under the control of the chimeric promoter composed of an estrogen response sequence (ERE) and the basal elements of the CYC1 promoter of S. cerevisiae . For this, the ERE sequence was inserted into the vector p416CYC1lacZ, upstream of the CYC1 promoter (Mumberg, Muller et al . 1995).

La estirpe Y01044 (MATa, his3, leu2, met15, ura3, gal4) de S. cerevisiae, que carece del activador Gal4 y por tanto del represor Gal4-Gal80, fue transformada con los plásmidos pADH1-GAL4ERVP16, pGAL1-ER y pERECYC1lacZ, mediante procedimientos estándar de manipulación genética de levaduras (Rose 1990). Los transformantes fueron cultivados a 30ºC, en medio líquido SC libre de uracilo, triptófano o histidina (según la combinación de plásmidos) para mantener la presión selectiva a favor del mantenimiento de los plásmidos introducidos, y en agitación orbital continua. Como control se utilizaron transformantes de la cepa W303-1A que portaban exclusivamente el plásmido pERECYC1lacZ. Como control constitutivo se utilizaron células de la estirpe W303-1A transformada con pERECYC1lacZ y pGAL1-ER, cultivadas en medio con galactosa como única fuente de carbono para conseguir la expresión continua del promotor GAL1. Los cultivos, de 5 ml, se realizaron en presencia de 11 \muM \beta-estradiol, mediante la adición de 2 \mul de una solución 2,5 mM de \beta-estradiol disuelta en etanol. A los controles sin \beta-estradiol se les añadió igual volumen de etanol. Tras 6 generaciones de cultivo (aproximadamente 14 horas) y alcanzar una densidad óptica de entre 0,8 y 1,0 (a 600 nm) se procedió a recoger las células por centrifugación. La actividad \beta-galactosidasa se ensayó siguiendo los procedimientos estándar para levaduras (Guarente 1983). Los experimentos se realizaron por cuadruplicado.Line Y01044 ( MATa, his3, leu2, met15, ura3, gal4 ) of S. cerevisiae , which lacks the Gal4 activator and therefore the Gal4-Gal80 repressor, was transformed with plasmids pADH1-GAL4ERVP16, pGAL1-ER and pERECYC1lacZ, by standard procedures of genetic manipulation of yeasts (Rose 1990). The transformants were grown at 30 ° C, in liquid medium SC free of uracil, tryptophan or histidine (depending on the combination of plasmids) to maintain the selective pressure in favor of the maintenance of the introduced plasmids, and in continuous orbital agitation. As a control, transformants of strain W303-1A that exclusively carried the plasmid pERECYC1lacZ were used. As constitutive control, cells of the W303-1A line transformed with pERECYC1lacZ and pGAL1-ER, grown in medium with galactose as the sole carbon source were used to achieve continuous expression of the GAL1 promoter. The 5 ml cultures were performed in the presence of 11 µM? -Estradiol, by adding 2 µL of a 2.5 mM solution of β-estradiol dissolved in ethanol. Equal volume of ethanol was added to controls without β-estradiol. After 6 generations of culture (approximately 14 hours) and reaching an optical density between 0.8 and 1.0 (at 600 nm), the cells were collected by centrifugation. The β-galactosidase activity was tested following standard procedures for yeasts (Guarente 1983). The experiments were performed in quadruplicate.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7. La presencia de los elementos genéticos de la cascada reguladora en ausencia de la molécula efectora no supuso aumento alguno de la expresión basal de la \beta-galactosidasa, mientras que la adición de la molécula efectora (\beta-estradiol) produjo una inducción de 135 veces en el nivel de expresión de esta enzima, alcanzándose niveles de \beta-galactosidasa 16 veces superiores al Ejemplo anterior. Sin embargo, cuando los cultivos expresaban constitutivamente el receptor de estrógenos, la acumulación de \beta-galactosidasa en ausencia de \beta-estradiol fue significativamente superior y el nivel de inducción por la molécula efectora no superó las 4 veces.The results obtained are shown in the Figure 7. The presence of the genetic elements of the waterfall regulator in the absence of the effector molecule was not an increase some of the basal expression of the β-galactosidase, while the addition of the effector molecule (β-estradiol) produced a 135 times induction in the expression level of this enzyme, reaching levels of β-galactosidase 16 times higher than the previous Example. However, when cultures constitutively expressed the estrogen receptor, the accumulation of β-galactosidase in the absence of β-estradiol was significantly superior and the level of induction by the effector molecule did not exceed 4 times.

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Claims

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1. Procedure for the regulated expression of genes introduced by recombinant DNA technology in eukaryotic cells characterized by the use of

a.to.: al menos un activador transcripcional heterólogo, cuya concentración intracelular y actividad intrinseca son reguladas simultáneamente por una misma molécula efectora exógena.to the less a heterologous transcriptional activator, whose concentration intracellular and intrinsic activity are regulated simultaneously by the same exogenous effector molecule.

b.b.: un promotor que es diana de dicho activador y que dirige la expresión de dichos genes recombinantes introducidos.a promoter that is the target of said activator and that directs the expression of said introduced recombinant genes.

2. Method for the regulated expression of genes according to claim 1 characterized in that the expression of the heterologous transcriptional activator is controlled by at least one other heterologous transcriptional activator whose intrinsic activity is regulated by the same exogenous effector molecule.

3. Method for the regulated expression of genes according to claim 1 characterized in that the expression of the heterologous transcriptional activator is controlled by a promoter that is inducible by the same heterologous transcriptional activator in the presence of the exogenous effector molecule.

Method for the regulated expression of genes according to claims 1 to 3 characterized in that at least one of the heterologous transcriptional activators is a chimeric polypeptide constituted by

a.to.: Un dominio de unión al ADNA DNA binding domain

b.b.: Un dominio activador de la transcripciónA transcription activator domain

c.C.: Un dominio sensor de la molécula efectora exógena que regula la actividad del polipéptido quimérico.A sensor domain of the exogenous effector molecule that regulates the chimeric polypeptide activity.

5. Procedure for the regulated expression of genes according to claim 4 wherein the DNA sequence coding for the chimeric polypeptide comprises a sequence of DNA coding for a sensor domain that comes from the sequence of the hormone binding domain of an estrogen receptor.

6. Method for the regulated expression of genes according to claim 4 wherein the DNA sequence encoding the chimeric polypeptide comprises a coding sequence for a DNA binding domain that comes from the GAL4 gene sequence of Saccharomyces cerevisiae .

7. Procedure for the regulated expression of genes according to claim 4 wherein the DNA sequence coding for the chimeric polypeptide comprises a sequence of DNA coding for a transcription activating domain that It comes from the VP16 gene of the Herpes simplex virus.

Method for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 3 characterized in that at least one of the heterologous transcriptional activators is an estrogen receptor.

9. Method for the regulated expression of genes according to any one of claims 1, 2, 3 and 8 characterized in that at least one of the heterologous transcriptional activators is the human estrogen receptor.

10. Method for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 5, 8 and 9 characterized in that the exogenous effector molecule has estrogenic activity.

Method for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 5, and 8 to 10 characterized in that the exogenous effector molecule is β-estradiol or any of its derivatives.

12. The method of claim 1 to 3 characterized in that the sequence of the target promoter of at least one heterologous transcriptional activator is derived from the GAL1-GAL10 promoter of Saccharomyces cerevisiae .

13. The method of claims 1 to 11 characterized in that the target promoter of at least one heterologous transcriptional activator contains at least one estrogen response element that allows it to be recognized by the estrogen receptor DNA binding domain.

14. Method for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 13 wherein the promoter or terminal promoters that direct the expression of the recombinant genes contain sequences from the GAL1-GAL10 promoter of Saccharomyces cerevisiae .

15. Procedure for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 13 wherein the promoter or terminal promoters that direct the expression of the recombinant genes contain sequences of at least one element of estrogen response that allows it to be recognized by the domain binding to estrogen receptor DNA.

         \global\parskip1.000000\baselineskip\ global \ parskip1.000000 \ baselineskip

16. Procedure for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 15 wherein the coding sequences of the transcriptional activators heterologists are integrated into at least one plasmid.

17. Procedure for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 16 wherein the coding sequences of the transcriptional activators heterologists are integrated into any of the chromosomes of the host cell of the expression system.

18. Procedure for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 17 wherein at least one terminal promoter and the gene or genes controlled by it they are integrated into a plasmid vector or a chromosome artificial.

19. Procedure for the regulated expression of genes according to any one of claims 1 to 18 wherein at least one terminal promoter and the gene or genes controlled by it they are integrated in any of the cell's chromosomes host

20. Eukaryotic cells containing the coding sequences of transcriptional activators heterologists to use them in the procedure of any one of claims 1 to 19.

21. Cells of claim 20 wherein the Organimo is from the ascomycete group.

22. Cells of claim 21 wherein the organ is Saccharomyces cerevisiae .

23. DNA vectors containing the bidirectional promoter GAL1-GAL10 of Saccharomyces cerevisiae that on the one hand control the expression of the chimeric heterologous transcriptional activator of claim 6 and divergently direct the expression of the recombinant gene.

24. Use of the procedure of any one of claims 1 to 19 to control the expression of polypeptides for use in research, diagnosis, enzymes industrial, therapeutic targets, or in metabolic engineering for overproduce or generate vaccines or new metabolites of use Industrial or pharmaceutical.