ES2299285A1 - Procedimiento para transformar material vegetal procedente de arboles adultos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para transformar material vegetal procedente de árboles adultos. El procedimiento comprende transformar material vegetal, mediante transformación con Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT), y se caracteriza porque dicho material vegetal es un explante, procedente de un árbol adulto, que comprende, al menos dos hojas y una yema axilar o apical, que se somete a un tratamiento de reactivación previo al SAAT y, posteriormente, el material vegetal reactivado se somete a un tratamiento consistente en una combinación de ultrasonidos e infiltración a vacío. De aplicación en el campo de la mejora vegetal, permite transformar especies consideradas recalcitrantes a la transformación (Eucalyptus sp.).
Description
Procedimiento para transformar material vegetal
procedente de árboles adultos.
La invención se relaciona, en general, con un
procedimiento para transformar material vegetal procedente de
árboles adultos, basado en la transformación con
Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT). Dicho
procedimiento tiene su aplicación en el campo de la mejora vegetal,
pudiendo transformar especies que originalmente se consideraban
recalcitrantes a la transformación, tales como Eucalyptus
sp.
Los productos obtenidos a partir de los bosques
serán, con toda probabilidad, más requeridos en el futuro. No hay
duda del valor ecológico de los bosques naturales y la necesidad de
preservarlos. Sin embargo, esta preocupación ecológica tiene que
equilibrarse con los requerimientos de la población y la industria,
que han ido creciendo a un ritmo uniforme y probablemente lo
continuarán haciendo en el futuro. En este contexto, un incremento
en la productividad de árboles de interés industrial harta posible
la coexistencia de plantaciones productivas y los bosques naturales,
ecológicamente valiosos. Lamentablemente, la mejora de especies
arbóreas por cruzamientos se ve seriamente perjudicada por los
largos ciclos reproductivos y el largo período de inmadurez de
estas especies. Por todo ello, la aplicación de los protocolos de
transformación basados en Agrobacterium para transformar
especies forestales aparece como una herramienta con un enorme
potencial.
Eucalyptus sp. es un género de gran
importancia industrial, con grandes extensiones en Sudamérica,
Asia, Australia, y más de un millón de hectáreas en el Sur de
Europa. Este género presenta multitud de características deseables:
destaca entre ellas (i) su rápido crecimiento (100 m^{3}/ha/año
en condiciones óptimas), pero también (ii) soporta rotaciones
cortas y (iii) puede crecer en suelos pobres. Entre las setecientas
especies de este género, E. globulus es una de las más
importantes en lo que se refiere a aplicaciones industriales. Una
de ellas es la obtención de pulpa de papel, ya que su madera
presenta unas características químicas deseables: como el alto
contenido en celulosa y el bajo contenido en lignina, lo que
provoca un gran rendimiento en el proceso de obtención de pulpa
"Kraft". En conjunto, estas cualidades hacen a esta especie
una buena candidata para programas de mejora basados en la
biotecnología. Por otro lado, seria deseable la mejora de otras
muchas características: tolerancia al frío, crecimiento mejorado,
etc. Más concretamente, uno de los rasgos cuya modificación
resultaría más beneficiosa para la industria de papel es el
contenido en lignina. El procesamiento de la madera para separar la
celulosa de la lignina requiere el uso de productos químicos caros
y perjudiciales para el medio ambiente. Las mejoras que se pueden
introducir en este proceso pueden venir por dos vías: (i) reduciendo
la cantidad total de lignina presente en la madera y/o (ii)
alterando el perfil químico de las ligninas presentes para
facilitar su extracción.
La ruta biosintética de las ligninas es compleja
y variable, y todavía no está completamente definida. Sin embargo,
varios genes de interés para la biotecnología se han caracterizado
en la pasada década, como por ejemplo los genes que codifican la
cinamil-alcohol-deshidrogenasa (CAD)
y la cinamil-CoA-reductasa (CCR). Se
ha demostrado, además, que estos genes son buenos candidatos para
la modificación de ligninas en diferentes especies.
Hasta la fecha, la "domesticación" de
Eucalyptus sp. ha consistido en el uso masivo de la
propagación vegetativa de árboles élite mediante cultivo in
vitro. Consecuentemente, la modificación genética será una
herramienta valiosa si se dispone de un método de transformación
eficiente. Aunque en años recientes ha habido avances
significativos, la transformación del eucalipto es todavía un
proceso laborioso y difícil. Además, la proporción de
transformantes obtenidos es todavía demasiado baja. Se han obtenido
callos con presencia del gen reportero GUS mediante biobalistica, y
se han transformado plántulas de E. globulus con bombardeo
de partículas y, aunque la transformación mediante biobalistica
presenta la ventaja de ser menos dependiente del genotipo, con la
transformación mediante Agrobacterium se obtiene una mayor
proporción de inserciones con sólo una copia en un locus, lo que sin
duda es más deseable a la hora de controlar las modificaciones
genéticas.
Los beneficios de la sonicación en la
transformación se han puesto de relieve en el artículo de González
et al., 2002, aunque no se especifican los tiempos empleados.
En ese artículo se menciona que el porcentaje de positivos
obtenidos ronda el 20% cuando se emplea material juvenil (17 días
tras la germinación). En brotes apicales de girasol, aplicando
tiempos cortos de sonicación, se consiguió aumentar la expresión
transitoria de GUS pero no se observó efecto en la expresión
estable (Weber et al., 2003). Con tiempos más prolongados (45 s) se
consiguió mejorar significativamente la transformación en embriones
zigóticos de pino (Tang, 2003).
La dificultad de transformar material vegetal
adulto en la mejora vegetal origina la necesidad de llevar a cabo
dicha mejora en material juvenil, material que, en muchas
ocasiones, no ha sido probado en el campo y, por tanto, su respuesta
a las condiciones de estrés es desconocida. Un procedimiento que
permitiera transformar material vegetal adulto procedente de
árboles cuya respuesta a las condiciones ambientales ya hubieran
sido probadas en el campo resultaría, por tanto, de gran
interés.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para la transformación de material
vegetal procedente de árboles adultos que subsane la totalidad o
parte de los inconvenientes asociados con los procedimientos
pertenecientes al estado de la técnica.
Los inventores han observado que la aplicación
de ultrasonidos e infiltración a vacío durante el proceso de
transformación con Agrobacterium de unos explantes
previamente reactivados, mediante incubación en un medio apropiado
antes de su transformación, incrementa de forma significativa la
eficacia de transformación de los explantes y rinde un porcentaje
de transformación muy elevado.
Un procedimiento como el proporcionado por esta
invención permite la transformación genética simple, eficiente,
reproducible, independiente del genotipo y con costes reducidos
para árboles adultos debido a la elevada eficacia de transformación
de los explantes y a la fácil reproducción del procedimiento.
Asimismo, aumenta la estabilidad y control de la inserción de la
secuencia nucleotídica de interés.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para transformar material vegetal,
mediante transformación con Agrobacterium asistida por
sonicación (SAAT), en el que dicho material vegetal es un explante
procedente de un árbol adulto que comprende al menos, dos hojas y
una yema axilar o apical, que se somete a un tratamiento de
reactivación previo a la SAAT, y posterior transformación con
Agrobacterium con ayuda de ultrasonidos e infiltración a
vacío en condiciones definidas para facilitar la transformación
mediada por Agrobacterium.
La mejora de las propiedades agronómicas de la
especie vegetal puede ir dirigida a tejidos específicos de la
planta. Por tanto, la cepa de Agrobacterium empleada en la
transformación vegetal puede contener un plásmido que comprende un
promotor específico de tejido funcional en plantas, operativamente
unido a una secuencia de nucleótidos de interés, o,
alternativamente, un plásmido que comprende un promotor de
expresión ubicuo funcional en plantas, operativamente unido a una
secuencia de nucleótidos de interés.
Tras la aplicación del procedimiento de
transformación proporcionado por esta invención, se obtiene un
material vegetal transformado que, tras un periodo de regeneración
en condiciones apropiadas, da lugar a una planta que incorpora la
característica deseable.
La regeneración de la planta a partir del
material vegetal transformado, constituye una realización
particular del procedimiento proporcionado por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un material vegetal transformado mediante el procedimiento
proporcionado por esta invención y a una planta procedente de la
regeneración de dicho material vegetal transformado según el
procedimiento objeto de esta invención.
La Figura 1 es un diagrama de barras que muestra
la actividad glucuronidasa de 40 explantes de Eucalyptus sp.
transformados mediante SAAT, en orden decreciente. Los explantes
enteros fueron homogeneizados y se añadió
4-metilumbeliferil-glucurónido para
medir la liberación de 4-metilumbeliferona tras dos
horas mediante fluorimetria. (C, dos explantes de control).
La Figura 2 es una fotografia que muestra los
resultados de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
realizada para amplificar fragmentos de los genes NPTII (a),
UIDA (b) y VIRD2 (c). Carriles 1-10:
explantes de ADN transformados. Carril 11: sin ADN. Carril 12:
explante no transformado. Carril 13: ADN extraído de
Agrobacterium con el plásmido p35SGUS int. Carril 14:
marcador de peso molecular.
La Figura 3 muestra los resultados de un
Southern blot realizado con una sonda basada en la secuencia del
gen NPTII. Los explantes se recogieron después de la
transformación y la selección en medio con kanamicina. 1, marcador
de peso molecular marcado con digoxigenina. 2, explante blanco (con
pérdida de clorofila). 3, explante transformado (con clorofila). 4,
explante necrótico. 5, explante sin transformar. 6, ADN extraído de
Agrobacterium que contiene el plásmido p35SGUS int; 7,
hibridación de la sonda consigo misma.
La Figura 4 es una fotografia que muestra
actividad GUS tal y como se pone de manifiesto por la coloración
azul en material transformado genéticamente, proveniente de E.
globulus. El éxito de la transformación fue evidente cuando se
examinaron con lupa explantes completos: (A-C),
varios explantes transformados con GUS bajo el promotor CaMV35S.
Cuando se examinó la expresión en profundidad, se comprobó una
fuerte expresión de GUS bajo el promotor CaMV35S: (D), sección
longitudinal mostrando un tallo, hojas y yema apical; (E), sección
longitudinal en la zona del meristemo apical; (F), sección
transversal de hojas y (H), sección transversal de tallos. Cuando
los explantes fueron transformados con GUS bajo el control del
promotor EgCCR, se encontró una fuerte expresión asociada al
tejido vascular; (G), sección transversal de hojas; obsérvese la
expresión de GUS en las fibras del xilema y floema, e (I), sección
de tallos mostrando expresión de GUS bajo el promotor EgCCR.
Barras en A, B y C=5 \mum; en D=500 \mum; en
E-G=100 \mum; en H e I=200 \mum.
En un aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento para transformar material vegetal procedente de
árboles adultos (en adelante procedimiento de la invención), que
comprende la transformación con Agrobacterium asistida por
sonicación (SAAT) caracterizado porque:
- a)
- dicho material vegetal es un explante, procedente de un árbol adulto, que comprende, al menos dos hojas y una yema axilar o apical;
- b)
- dicho material vegetal se somete a un tratamiento de reactivación previo al SAAT consistente en incubar dicho material vegetal en un medio de cultivo que comprende medio MS parcialmente modificado y suplementado con ácido naftalenacético (ANA) y benciladenina (BA); y
- c)
- el material vegetal reactivado, en presencia de Agrobacterium, se somete a un tratamiento que consiste en una combinación de (i) ultrasonidos durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 120 segundos, y posteriormente, (ii) infiltración a vacío durante un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 10 minutos.
En una realización particular, el material
vegetal empleado en la transformación es un explante procedente de
un árbol adulto, que comprende, al menos, dos hojas y una yema
axilar o apical. Ventajosamente, dicho árbol adulto es un árbol
élite adulto.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "árbol élite adulto" se refiere a una especie
vegetal leñosa (de porte arbóreo o arbustivo) que posee unas
características agronómicas destacables y que ha sido criada y
cultivada en el campo.
En una realización particular, dicho árbol
adulto es un árbol de la especie Eucalyptus sp por ejemplo
E. grandis, E. nitens, E. gunnii, E. globulus, o una variedad
o un híbrido del mismo. No obstante, el procedimiento de la
invención puede emplearse prácticamente con cualquier especie
vegetal gracias al planteamiento universal de su diseño, habiendo
sido comprobada por los inventores en kiwi (Actidinia
deliciosa) y vid (Vitis vinifera), y siendo
potencialmente aplicable a otras especies como pino (Pinus
sylvestris), las encinas y los robles (Quercus sp.), el
castaño (Castanea sativa), etc.
Según el procedimiento de la invención, los
explantes se someten a un tratamiento de reactivación previa a la
SAAT. Dicha reactivación se lleva a cabo cultivando los explantes
en medio MS parcialmente modificado y suplementado con ANA y BA, en
ocasiones identificado en esta descripción como medio R7 (véase la
Tabla 1 en el Ejemplo). Mediante dicho tratamiento de reactivación,
los explantes resultan más susceptibles a la infección por
Agrobacterium.
Para transformar eficientemente los explantes
previamente reactivados, el procedimiento de la invención propone
poner en contacto dichos explantes previamente reactivados con
Agrobacterium y someter al conjunto resultante a un
tratamiento con ultrasonidos durante un periodo de tiempo
comprendido entre 50 y 70 segundos, preferentemente, durante 60
segundos, y, posteriormente, un tratamiento consistente en una
infiltración a vacío durante un periodo de tiempo comprendido entre
4 y 6 minutos, preferentemente, 5 minutos. La combinación de ambos
tratamientos sobre los explantes previamente reactivados incrementa
significativamente el número de explantes transformados
eficientemente por Agrobacterium.
La aplicación de ultrasonidos puede realizarse
mediante el empleo de cualquier aparato apropiado. Asimismo, la
infiltración a vacío se puede llevar a cabo por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de una bomba
eléctrica o cualquier otro procedimiento conocido en el estado de
la técnica que conduzca al mismo resultado, por ejemplo, una bomba
de agua.
La transformación de los explantes, de acuerdo
con el procedimiento de la invención, se lleva a cabo utilizando
Agrobacterium como vector de transformación. Prácticamente
cualquier cepa de Agrobacterium puede ser utilizada en la
puesta en práctica del procedimiento de la invención. No obstante,
en una realización particular, ventajosamente, se emplean cepas
hipervirulentas de Agrobacterium, por ejemplo, la cepa
hipervirulenta de A. tumefaciens AGL1 pTiBo542 que contiene
el plásmido pBin19 (Ejemplo).
Como es conocido, Agrobacterium contiene
un plásmido en el que se va a insertar la secuencia de nucleótidos
de interés que se desea introducir en la especie vegetal a
transformar, operativamente unida a una secuencia reguladora de su
expresión, que puede ser específica de tejido o de expresión
ubicua.
Por tanto, en una realización particular de la
presente invención, la cepa de Agrobacterium utilizada en la
transformación según el procedimiento de la invención, contiene un
plásmido que comprende un promotor específico de tejido funcional en
plantas, por ejemplo, el promotor de la cinamil-CoA
reductasa (CCR) de E. gunnii (EgCCR). La presencia en
el plásmido de Agrobacterium del promotor EgCCR va a
originar que la secuencia de nucleótidos de interés al que está
operativamente unido, se exprese en el tejido vascular de la
planta. De igual modo, se puede dirigir la expresión de la
secuencia de nucleótidos de interés uniéndolo operativamente a
cualquier otro promotor funcional en plantas específico de tejido,
tal como el promotor de la sacarosa- sintasa de maíz (RSsI) que se
va a expresar en el floema,
el promotor de la metalotioneína de maíz (MT-L), que va a expresarse preferentemente en el tejido de la raíz, etc.
el promotor de la metalotioneína de maíz (MT-L), que va a expresarse preferentemente en el tejido de la raíz, etc.
Adicionalmente, cuando se desea obtener una
expresión ubicua de la secuencia de nucleótidos de interés, se
puede optar por utilizar promotores capaces de expresarse en
cualquier tejido, tales como, el promotor de la subunidad 35S de
virus de mosaico del tabaco (CaMV35S), el promotor de la
ubiquitina-1 de maíz (Ubi-1), el
promotor de la actina-1 de arroz
(Act-1), etc.
Tal como se utiliza en esta descripción, la
expresión "secuencia de nucleótidos de interés" se refiere a
una secuencia de nucleótidos que proporciona a la planta
transformada una característica deseada, por ejemplo, resistencia a
patógenos, tales como bacterias, hongos y virus; resistencia a
estrés abiótico, tales corno sequía, frío, etc; resistencia a
herbicidas e insectos, etc. Entre las secuencias de interés citadas
anteriormente se encuentran los siguientes
ejemplos:
ejemplos:
- (i)
- secuencias que confieren resistencia a enfermedades bacterianas, mayor rendimiento de los árboles frutales y mejora de las propiedades organolépticas de los frutos o, tal como se describe en la presente invención, secuencias que permiten modificar los perfiles de la lignina en la madera de eucalipto, un objetivo de primer orden en la industria de obtención de pulpa y papel;
- (ii)
- secuencias que proporcionan resistencia a virus: genes que codifican para ARN antisentido, genes que codifican para secuencias defectivas con capacidad de interferir en la replicación del virus;
- (iii)
- secuencias que proporcionan resistencia a insectos: genes Cry, genes Bt, etc;
- (iv)
- secuencias que proporcionan resistencia a hongos: genes que codifican para enzimas de la ruta de las fitoalexinas, genes que codifican enzimas que generan especies reactivas al oxígeno, etc.;
- (v)
- secuencias que proporcionan resistencia a condiciones de estrés abiótico: genes para la síntesis de compuestos osmoprotectores (gen betA, gen codA, gen TPS1, gen sacB, etc), genes que incrementan la flexibilidad de las membranas (gen fad7, gen des9, etc), genes para proteína inducibles por estrés (gen HVA 1, gen afp y gen afa3), genes para eliminar radicales activos de oxígeno (gen sod, etc), etc.; y
- (vi)
- secuencias que proporcionan resistencia a herbicidas: transferencia de genes que producen una enzima que detoxifica el herbicida (gen GST de maíz, gen BXN de Klebsiella, gen bar de Streptomyces, etc), transferencia de genes que alteran la sensibilidad del enzima blanco del herbicida (gen mutante psbA procedente de Amaranthus, gen mutante para la glutamina sintetasa), etc.
\vskip1.000000\baselineskip
El éxito de la transformación puede determinarse
mediante métodos convencionales, utilizando un vector que
transporte un gen reportero operativamente unido a la secuencia
reguladora. En el procedimiento de transformación aquí descrito, se
han utilizado el gen UIDA
(\beta-glucuronidasa) bajo el control del promotor
CaMV35S o del promotor EgCCR.
En una realización particular del procedimiento
descrito en esta invención, el material vegetal transformado puede
ser sometido a un proceso de regeneración por métodos
convencionales con el fin de obtener la planta regenerada completa.
Esta regeneración se puede llevar a cabo empleando el medio de
cultivo MS modificado (M3) [Tabla 1], seguido del protocolo
convencional de micropropagación, que comprende las etapas de
enraizamiento, aclimatación en el invernadero y transferencia de
las plántulas a su ambiente natural.
Siguiendo el procedimiento de la invención, se
obtiene un material vegetal transformado, procedente de árboles
adultos que, si se desea, va a dar lugar a una planta que incorpora
alguna característica deseada. En una realización particular, dicha
planta pertenece a la especie Eucalyptus sp.
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Ejemplo
Se emplearon plántulas micropropagadas de E.
globulus (obtenidas a partir de árboles élite adultos
seleccionados por sus propiedades de campo) proporcionados por J.
Oller (ENCE-DIT, Pontevedra, España) como material
vegetal para los experimentos de transformación genética. Para la
proliferación de brotes se empleó un medio MS modificado
(suplementado con ANA y BA), y los cultivos se mantuvieron en una
cámara a 23ºC y con un fotoperiodo
de 16 h.
de 16 h.
\newpage
Se empleó la cepa hipervirulenta de
Agrobacterium tumefaciens AGL1 pTiBo542 (Lazo et al.,
1991), que contiene el plásmido pBin19. Las secuencias transferidas
en los experimentos fueron:
a) p35S GUS int (Vacanneyt et al., 1990),
que incluye el gen UIDA
(\beta-glucuronidasa) bajo el control del
promotor CaMV35S y el gen de resistencia a la kanamicina
NPTII (neomicina fosfotransferasa), y
b) una construcción que incluye el gen
UIDA bajo el control del promotor de la CCR de Eucalyptus
gunnii (Lacombe et al., 1997).
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La transformación genética se realizó en
explantes completos con al menos dos hojas. Algunos de los
explantes tenían, al menos, una yema apical y otras, una yema
axilar. Estos explantes se mantuvieron durante 14 días en oscuridad
y 7 días con un fotoperiodo de 16 h en medio de regeneración MS
(R7) [Tabla 1]. El cultivo bacteriano se dejó crecer durante la
noche en medio líquido LB (LB Broth Miller, Sigma, St Louis, MO,
EEUU) con los antibióticos apropiados (50 mg L^{-1} kanamicina,
ampicilina y rifampicina, Sigma). Se añadió acetosiringona y
prolina hasta alcanzar una concentración final de 100 \muM y 1 mM
respectivamente. Las bacterias se recogieron en la fase de
crecimiento exponencial; para ello la suspensión se centrifugó a
3.000 g durante 10 minutos, y se resuspendió en medio MS
suplementado con acetosiringona 100 \muM, prolina 1 mM y 1 mg
L^{-1} de ácido diclorofenoxiacético (2,4-D)
(medio de cocultivo líquido). Se colocaron aproximadamente 50
explantes en contacto con el medio en que se habían resuspendido
previamente las bacterias, y se aplicó sonicación en un baño de
ultrasonidos Branson 3510E-DTH (42 kHz, Branson
Ultrasonics Corporation, CT, EEUU). Seguidamente se realizó una
infiltración al vacío en un desecador empleando una bomba de vacío
eléctrica (0,084 MPa, Modelo XX55 220 50, Millipore Corporation,
MA, EEUU). Los tiempos ensayados para optimizar los tiempos de
sonicación e infiltración a vacío se recogen en las tablas 2 y 3,
respectivamente. Posteriormente, se recogieron los explantes y se
lavó el resto de medio de cocultivo líquido con agua conteniendo
500 mg de Augmentine® (2 g de amoxicilina suplementada con 200 mg
de ácido clavulánico, proporcionada por SmithKline Beecham,
Cambridge, Reino Unido). Seguidamente, se realizó un cocultivo
sólido en medio de proliferación MS (M3) [Tabla 1] suplementado con
acetosiringona 100 \muM y prolina 1 mM durante 7 días, en
oscuridad y a 25ºC. Finalmente, los explantes se cultivaron en
medio de proliferación MS, conteniendo 500 mgL^{-1} de Augmentine®
y 150 mg de kanamicina.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Como método rutinario para la detección de la
transformación, los explantes fueron analizados mediante un
protocolo modificado a partir de Jefferson (1987) para la detección
histoquímica de la actividad GUS. El material vegetal se tiñó
mediante el empleo de X-Gluc (Eurogentec, Liége,
Bélgica) en tampón fosfato conteniendo EDTA 10 mM, ferrocianuro de
potasio 0,1 mM a 37ºC durante toda la noche. Después de la tinción,
el material se fijó en una mezcla 14:4:1:1 de agua, etanol, ácido
acético glacial y formaldehído. Tras la fijación, la clorofila se
eliminó sumergiendo la planta en etanol al 70%. Los resultados se
examinaron bajo una lupa Olympus SZX12. En algunos casos, los
explantes fijados se cortaron en pequeños trozos de unos 5 mm, y se
realizaron secciones transversales y longitudinales mediante un
vibratomo (TPI, St Louis, MO, EEUU), que se examinaron en un
microscopio Olympus BX60. Se tomaron fotografias mediante el uso de
una cámara digital (Olympus DP 11) y las imágenes se editaron en
tamaño y resolución con el programa Adobe Photoshop 5.0, y
modificadas en brillo y contraste.
Para la determinación in vitro de la
actividad GUS, el tejido se molió finamente empleando nitrógeno
líquido, y se resuspendió en tampón fosfato pH 7,0 conteniendo EDTA
10 mM, Tritón X-100 al 0,1%, SDS (dodecilsulfato
sódico) al 0,1% y mercaptoetanol 10 mM. Tras centrifugar (12.000 g,
15 min, 4ºC), se tomaron 50 \mul del sobrenadante y se mezclaron
con tampón de extracción con
4-metil-umbeliferil-\beta-D-glucorónido
2 mM. La mezcla de reacción se incubó durante 2 h a 37ºC. Los
resultados se analizaron por fluorimetria (365 nm para excitación y
455 nm para emisión) en un fluorimetro Kontron SFM25 (Kontron
Instruments, Herts, Reino Unido).
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Se realizaron PCR para detectar la presencia de
transgenes en los explantes. El ADN fue extraído a partir de
explantes completos empleando un procedimiento adaptado a partir de
Doyle y Doyle (1990). El tejido se homogeneizó en nitrógeno líquido
y se resuspendió en tampón Tris-HCl precalentado,
que contenía CTAB (bromuro de cetiltrimetil amonio) al 2%, PVP
(polivinil pirrolidona) al 1%, EDTA 20 mM, mercaptoetanol al 0,2%,
y NaCl 1,4 M. El homogenado se incubó entonces durante 30 minutos a
60ºC. Seguidamente, se añadió una mezcla 14:1 de cloroformo/alcohol
isoamílico. La mezcla se centrifugó, y se recuperó la fase orgánica.
Posteriormente se realizaron dos pasos de lavado empleando alcohol
isopropílico y etanol al 70%. Una vez purificado, el ADN se
resuspendió en agua y se conservó a una temperatura de -20ºC hasta
su uso.
Las PCRs se realizaron en un volumen de reacción
de 20 \muL, que contenían aproximadamente 100 ng de ADN de
Eucalyptus sp., 15 pmol de cada cebador, 200 mM de cada
dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM y 0,5 unidades de Taq (Bioline Ltd, London,
reino Unido), todo ello diluido en el tampón de PCR proporcionado
por el fabricante. Se emplearon dos pares de cebadores para
detectar la presencia de los genes NPTII y UIDA:
para el gen NPTII
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para amplificar UIDA
generando fragmentos de una
longitud esperada de 805 y 326 pb (pares de bases) respectivamente.
Como control de la presencia de Agrobacterium se realizó el
mismo tipo de experimento empleando cebadores específicos para el
gen
VIRD2:
que amplifican una secuencia de 338
pb. Las condiciones en las que se realizaron las PCR fueron las
siguientes: 94ºC durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 94ºC
durante 45 s, 50ºC durante 45 s y 72ºC durante 45 s. Tras los
ciclos, se añadió un paso final de extensión de 72ºC durante 5
minutos. La reacción se llevó a cabo en un termociclador Biometra
(Biometra GmbH I.L., Goettingen,
Alemania).
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El ADN total fue extraído a partir de explantes
completos empleando el kit de extracción NucleoSpin® Plant
(Macherey-Nagel GmbH, Düren, Alemania) siguiendo
las instrucciones del fabricante e incluyendo un paso de tratamiento
con RNAsa. Aproximadamente 10 \mug de ADN fueron incubados con la
enzima de restricción EcoRI (Promega, Madison, WI, EEUU) a
37ºC durante una noche. Posteriormente, el ADN digerido se
fraccionó en un gel de agarosa al 1% y fue transferido a una
membrana de nylon cargada positivamente (Roche Molecular
Biochemicals, Manheim, Alemania). Se empleó subsecuentemente el kit
comercial DIG-high prime DNA labelling and detection
starter kit I (Roche Molecular Biochemicals) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Tras fabricar una sonda creada
mediante cebadores al azar y dNTPs marcados con digoxigenina,
empleando como molde un fragmento amplificado a partir del gen
NPTII, ésta se puso en contacto con la membrana y se realizó
una hibridación a 41ºC. La membrana se lavó en condiciones de alta
especificidad. Posteriormente, el resultado de la detección de
color mediante
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (BCIP) se fotografió con una cámara digital.
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Una característica del procedimiento previamente
descrito es que se realizó in planta, es decir, el material
empleado en todo el proceso de transformación fueron explantes
completos. Varios pasos de este protocolo han sido optimizados,
midiendo la eficiencia de transformación en función de dos
parámetros: la capacidad de los explantes para crecer y
desarrollarse en medio con kanamicina, y el porcentaje de explantes
que mostraban, al menos, un sector azul conspicuo tras la tinción
GUS (Villar et al., 1999; Gallego et al., 2004).
Dicho procedimiento método incluye una fase de
reactivación de los explantes, que fue optimizada mediante el uso
de un medio MS Murashige y Skoog (1962) parcialmente modificado, y
suplementado con ANA, BA, arginina y glicina (Medio R7).
Tras la reactivación, se colocaron los explantes
y el cultivo bacteriano en una fase de cocultivo. En este punto,
los explantes se sometieron a sonicación; la cavitación acústica
provocada por los ultrasonidos conlleva la aparición de heridas
microscópicas que facilitan la interacción de la bacteria con el
explante (Trick and Finer, 1997). Se probaron diferentes tiempos de
sonicación (Tabla 2), observando que 60 s de sonicación, provocaban
un drástico incremento en la tinción GUS estable obtenida, por lo
que este fue el valor considerado óptimo. Aunque la resistencia a
kanamicina fue superior en el caso de 120 s, la proporción de
explantes GUS-positivos quiméricos fue también
mayor, mientras que 60 s provocaban una coloración GUS más
uniforme.
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\vskip1.000000\baselineskip
Un paso de infiltración posterior a la
sonicación utilizando una bomba eléctrica, incrementa
significativamente el éxito de la transformación. Por este motivo,
se determinó el tiempo de infiltración óptimo (Tabla 3),
comprobando que cuando se aplica vacío durante 5 minutos, se
obtienen los mejores resultados tanto si se tiene en cuenta la
resistencia a kanamicina como el porcentaje de
GUS-positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se examinó el efecto de diferentes medios
en esta fase de cocultivo líquido en el éxito de transformación
(Tabla 4), se comprobó que el medio óptimo tanto en relación a la
resistencia a kanamicina como a la tinción GUS fue el medio MS
suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D).
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\vskip1.000000\baselineskip
Durante la optimización de la técnica de
transformación, se realizaron de forma rutinaria ensayos de
actividad \beta-glucuronidasa tal y como se
describe en la sección Materiales y Métodos. Para determinar si la
variabilidad en la actividad \beta-glucuronidasa
observada en la tinción histoquimica con X-gluc
(ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico)
era también observable de forma cuantitativa, se realizaron
mediciones de esta actividad in vitro frente a
4-metil-umbeliferona. La actividad
GUS se pudo observar en un 75% de los explantes; sin embargo, los
niveles de actividad variaron drásticamente, desde casi
indetectables hasta 1,46 pkat por explante (Figura 1), indicando
grandes diferencias en la expresión del enzima debidas tanto a
efectos de posición en el genoma o a número de copias
integradas.
Cuando se emplearon los parámetros óptimos a lo
largo de todo el protocolo, se obtuvieron excelentes resultados
(Tabla 5). Dichos parámetros óptimos comprenden un tiempo de
sonicación de 60 segundos, un tiempo de infiltración de 5 minutos y
un medio de cocultivo líquido MS parcialmente modificado.
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La transformación fue exitosa no sólo en cuanto
al número de explantes que sobrevivieron al medio de selección con
kanamicina o a los que se les determinó actividad glucuronidasa,
sino también en cuanto a la extensión de la transformación
conseguida, tal y como pudo verse en un gran número de explantes con
coloración azul uniforme (Figura 4 a, b, c). Tras la tinción con
X-gluc, secciones transversales y longitudinales de
estos explantes fueron analizadas mediante microfotografia,
mostrando que la actividad GUS estaba presente en profundidad y en
todos los tejidos del explante incluyendo meristemos, haces
vasculares, tallo y hojas (Figura 4, d, e, f, h).
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Para determinar la presencia de los transgenes
en los tejidos de eucalipto sometidos a transformación genética, se
realizaron diversas PC'Rs con cebadores diseñados de acuerdo con
las secuencias publicadas para los genes UIDA (GUS),
NPTII (resistencia a kanamicina) y VIRD2 (diagnóstico
de la presencia de Agrobacterium, estos genes no son
transmitidos a la planta). De esta forma, UIDA y NPTII
se emplearon como signo de transformación exitosa, mientras que
VIRD2 se usó como control de la contaminación residual
bacteriana que pudiese enmascarar los resultados. La Figura 2
muestra los resultados obtenidos cuando se analizaron muestras de
tejido vegetal mediante PCR un mes después de la transformación; en
los carriles 9 y 10, aparecieron bandas claras de amplificación
correspondientes a los genes NPTII y UIDA.
VIRD2 se amplificó solo en un explante, probablemente debido
a contaminación residual de Agrobacterium; en conjunto, los
resultados positivos en la gran mayoría de las PCR realizadas
reflejan la ausencia de contaminación bacteriana.
A partir del ADN extraído de los explantes
seleccionados se realizó un Southern blot. No aparecieron bandas de
hibridación en los explantes que no habían superado la selección
con kanamicina (Figura 3). La presencia de una banda en el explante
transformado (con clorofila) que se analizó, indica la integración
estable de los transgenes en el genoma vegetal.
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Se realizaron experimentos de transformación
genética para determinar si el promotor EgCCR caracterizado
en E. gunnii conserva en E. globules la capacidad de
provocar expresión diferencial, y para comprobar el protocolo de
transformación de la invención con un promotor específico. Estos
resultados se compararon con los obtenidos cuando el promotor
empleado para controlar la expresión del GUS fue el promotor
constitutivo CaMV35S. Se estudió la expresión GUS en plántulas
resistentes a kanamicina, y se observó claramente un patrón de
expresión diferencial; mientras que las plántulas transformadas con
el promotor CaMV35S mostraban un patrón de expresión constitutivo
(Figura 4 f, h), el promotor EgCCR provocaba que la
coloración GUS apareciera tan sólo asociada a los haces vasculares
de E. globulus (Figura 4 g, i).
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Este procedimiento permite la recuperación de un
70% de plántulas positivamente transformadas de forma rutinaria a
partir de una población inicial in vitro. El alto porcentaje
de éxito se debe probablemente a la combinación de sonicación y su
capacidad para causar heridas microscópicas, y al paso de
infiltración que facilita significativamente la interacción de
Agrobacterium con los tejidos vegetales, siempre en un
ambiente cuidadosamente controlado.
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El ejemplo descrito en la presente invención,
proporciona un procedimiento de transformación optimizado para E.
globulus con un promotor específico capaz de controlar la
expresión de los genes de interés. Para confirmar la expresión
vascular conferida por el promotor EgCCR, se empleó una
construcción con el gen reportero GUS bajo el control de ese
promotor. De esta forma se obtuvo evidencia de expresión vascular,
en claro contraste con el patrón de expresión ubicua conferido por
el promotor CaMV35S. Por tanto, el promotor EgCCR puede
contemplarse desde un punto de vista tecnológico como un buen
candidato para dirigir la expresión de transgenes de interés hacia
los haces vasculares, impidiendo efectos colaterales indeseables
provocados por promotores constitutivos. En algunos casos, incluso
ha sido posible demostrar que el uso de un promotor implicado en la
ruta biosintética de ligninas es más eficiente a la hora de alterar
el perfil de ligninas que el CaMV35S.
En conclusión, el procedimiento optimizado
proporcionado por esta invención abre nuevas posibilidades para la
transformación genética de material adulto de especies vegetales de
interés agronómico consideradas recalcitrantes a la transformación.
La capacidad para transformar tejidos provenientes de plantas
adultas se debe probablemente a la fase de reactivación combinada
con sonicación, infiltración y medios de cultivo modificados.
\vskip1.000000\baselineskip
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of sunflower (Helianthus annuus L.): assessment of macerating
enzymes and sonication. Plant Cell Rep. 21,
475-482.
Claims (14)
1. Un procedimiento para transformar material
vegetal, mediante transformación con Agrobacterium asistida
por sonicación (SAAT), caracterizado porque:
- a)
- dicho material vegetal es un explante, procedente de un árbol adulto, que comprende, al menos dos hojas y una yema axilar o apical;
- b)
- dicho material vegetal se somete a un tratamiento de reactivación previo al SAAT consistente en incubar dicho material vegetal en un medio de cultivo que comprende medio MS parcialmente modificado y suplementado con ácido naftalenacético (ANA) y benciladenina (BA); y
- c)
- el material vegetal reactivado, en presencia de Agrobacterium, se somete a un tratamiento que consiste en una combinación de (i) ultrasonidos durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 120 segundos, y posteriormente, (ii) infiltración a vacío durante un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 10 minutos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho material vegetal es un explante procedente de un árbol
adulto, que comprende, al menos dos hojas y una yema axilar o
apical.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho árbol adulto es un árbol de la especie
Eucalyptus sp.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende la aplicación de ultrasonidos durante 60 segundos, y,
posteriormente, infiltración a vacío durante 5 minutos.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la cepa de Agrobacterium utilizada en la
transformación contiene un plásmido que comprende un promotor
específico de tejido funcional en plantas.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho promotor específico de tejido funcional en plantas es
el promotor de la cinamil-CoA reductasa (CCR) de
Eucalyptus gunnii (EgCCR).
7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6,
en el que dicho plásmido comprende un promotor específico de tejido
funcional en plantas operativamente unido a una secuencia de
nucleótidos de interés.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la cepa de Agrobacterium utilizada en la
transformación contiene un plásmido que comprende un promotor de
expresión ubicua funcional en plantas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicho promotor de expresión ubicua funcional en plantas es
el promotor de la subunidad 35S del virus del mosaico del tabaco
(CaMV35S).
10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9,
en el que dicho plásmido comprende un promotor constitutivo
funcional en plantas operativamente unido a una secuencia de
nucleótidos de interés.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 que comprende, además, la regeneración de
la planta a partir del material vegetal transformado.
12. Material vegetal transformado obtenible
según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
13. Una planta procedente de la regeneración de
un material vegetal transformado según el procedimiento de la
reivindicación 11.
14. Planta según la reivindicación 13,
caracterizada porque es una planta perteneciente a la
especie Eucalyptus sp.
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