ES2298191T3 - Nuevas variantes del receptor humano de androgenos. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos, caracterizado porque él comprende las secuencias de nucleótidos representadas en Seq ID NO 1 y/o 3.

Description

Nuevas variantes del receptor humano de andrógenos.

El invento se refiere a dos nuevas variantes del receptor de andrógenos y a su utilización.

Los andrógenos son las hormonas sexuales masculinas y se producen principalmente en el testículo (Roy, A. K. y colaboradores, Vitam. Horm. 1999, 55, 309-352). Ellos regulan a la diferenciación sexual masculina y son esenciales para la esparmatogénesis. Además, los andrógenos son responsables del pronunciamiento de las características sexuales secundarias y del modelo de comportamiento sexual. Los andrógenos desempeñan también un cometido esencial en la génesis y la multiplicación de los cánceres de próstata y testículos (Craft, N. y Sawyers, C. L., Cancer Metastasis Rev. 1998-99, 17, 421-427; Rajperts-De Meyts E. y Skakkebaek, N. E., Eur. Urol. 1993, 23, 54-59).

Los andrógenos actúan por fijación a un receptor nuclear específico, el receptor de andrógenos. El receptor de andrógenos ya conocido es un factor de transcripción dependiente de un ligando, que posee un sitio de fijación a un ligando, un sitio de fijación a ADN y múltiples funciones de transactivación (Lindzey, J. y colaboradores, Vitam. Horm. 1994, 49, 383-432). La función principal de transactivación se encuentra en la mitad terminal de N, que es codificada por el exón 1 del gen del receptor de andrógeno. Cuando el ligando, un andrógeno, se fija, se modifica la conformación del receptor. Mediante esta modificación de la conformación, el receptor puede formar un dímero y fijarse a una secuencia específica de un ADN bicatenario, que significa el elemento de respuesta a esteroides. Mediante interacciones con activadores concomitantes y otros factores de transcripción se activa la transcripción del gen diana (Lindzey, J. y colaboradores, Vitam. Horm. 1994, 49, 383-432).

Los andrógenos desempeñan un cierto cometido en los casos de tumores dependientes de hormonas. Así, p.ej. un cáncer de próstata es tratado con antiandrógenos, que compiten con la fijación de los andrógenos naturales al receptor de andrógenos. En este caso se muestra con frecuencia que los antiandrógenos, después de un cierto período de tiempo de tratamiento, ya no son eficaces (Crawford, E. D. y colaboradores, Urology 1999, 54, 1-7). Como causas de esta resistencia a una terapia se postularon unas mutaciones del receptor de andrógenos, que permiten una estimulación mediante antiandrógenos o respectivamente mediante estrógenos o glucocorticoides (Brinkmann, A. O. y Trapman, J., Nature Med. 2000, 6, 628-629). Estas mutaciones, no obstante, se presentan de una manera relativamente rara. Una causa adicional posible es una amplificación del gen del receptor de andrógenos, como se describe en aproximadamente un 28% de los pacientes resistentes a los andrógenos (Koivisto, P. y colaboradores, Cancer Res. 1997, 57, 314-319). De esta manera, no se pueden explicar ni con mucho todos los casos. Para una terapia con éxito de tumores es deseable por lo tanto conocer un punto de aplicación adicional para la terapia.

Este problema se resolvió mediante la puesta a disposición de dos nuevas variantes del receptor de andrógenos.

El primer receptor de andrógenos, conforme al invento, con la secuencia de aminoácidos que se indica en Seq ID NO 2, se denominará en lo sucesivo AR42 y el receptor de andrógenos, conforme al invento, con la secuencia de aminoácidos que se indica en Seq ID NO 4, se denominará AR32. El receptor de andrógenos, ya conocido, (Lubahn, D. B. y colaboradores, Science 1988, 240, 327-330; Chang et al., Science 1988, 240, 324-326) tiene en lo sucesivo la denominación AR.

Las secuencias de AR y AR42 coinciden en la zona de los dominios que fijan a ADN, de los denominados dominios de charnela (en inglés "hinge") y los dominios que fijan a ligandos (véanse los exones 2-8 en la Fig. 1). Ellos se diferencian en la zona del extremo terminal de N. Mientras que el AR tiene aquí un dominio de transactivación con una longitud de aproximadamente 537 aminoácidos, el AR42 posee aquí una zona con una longitud de solamente 7 aminoácidos, cuya secuencia es diferente con respecto de la secuencia de los dominios de transactivación del AR. Esta zona con una longitud de 7 aminoácidos no está contenida en la secuencia genómica en ninguno de los exones hasta ahora conocidos; más bien es parte componente de una zona de ADN, que hasta ahora no se consideraba como traducida.

El AR32 se diferencia del AR en el extremo terminal de N y en el extremo terminal de C (véanse los exones 1, 7 y 8 en la Fig. 1). El AR32 tiene la misma secuencia terminal de N que el AR42. Él se diferencia del AR42 y del AR en el extremo terminal de C. Su secuencia terminal de C es más corta y 10 aminoácidos son distintos en comparación con AR42 y AR.

Los AR42 y AR32 conformes al invento son expresados en diferentes tejidos de seres humanos sanos. El AR42 es expresado de una manera especialmente fuerte en el corazón (Fig. 2).

Los AR42 y AR32 conformes al invento pueden fijar a un andrógeno y a otros ligandos. Después de la fijación de un ligando, los AR42 y AR32 pueden formar homodímeros (AR42/AR42 o AR32/AR32) o formar heterodímeros entre ellos o con el AR (AR42/AR o AR32/AR). Los homodímeros pueden fijar ciertamente al elemento de respuesta a esteroides del AR; sin embargo, ellos no pueden activar a la transcripción de los genes dianas, a la que activa el AR. El AR42 y el AR32 actúan entonces como un represor para el AR. Mediante una formación de heterodímeros con el AR, se puede modular la actividad del AR. El que se trate de una inhibición o de una activación depende de los genes dianas. Una activación de la expresión se efectúa en el caso de los genes dianas, cuya expresión es bloqueada mediante una interacción del AR con factores de transcripción de Ets. Estos factores de transcripción de Ets actúan como represores concomitantes para el AR mediante fijación al extremo terminal de N de éste (Schneikert J. y colaboradores, J. Biol. Chem. 1996, 271, 23907-23913). Por el contrario, ellos no pueden fijarse al AR42 ni al AR32. De esta manera se suprime el bloqueo y se estimula la expresión.

El invento se refiere a ácidos nucleicos, que codifican un receptor de andrógenos, comprendiendo ellos las secuencias de nucleótidos que se representan en Seq ID NO 1 y/o 3.

Los ácidos nucleicos pueden constituir ADN mono- o bicatenarios, p.ej. ADNc (cromosomales), o ARN, p.ej. ARNm (mensajeros), ARNc (cromosomales), pre-ARNm.

Un segmento codificador de proteínas de la secuencia representada en Seq ID NO 1 está situado en la zona de los nucleótidos 163 a 1.329 y un segmento que codifica una proteína, de la secuencia representada en Seq ID NO 3, está situado en la zona de los nucleótidos NO 163 a NO 1.047.

Son objeto del invento además ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido con la secuencia de aminoácidos que se representa en Seq ID NO 2 o/y 4.

Los ácidos nucleicos conformes al invento son obtenibles a partir de mamíferos, p.ej. a partir de células humanas o a partir de una biblioteca de ADNc o de una biblioteca genómica, que se obtiene p.ej. a partir de células humanas. Ellos se pueden aislar de acuerdo con técnicas conocidas mediando utilización de cortos segmentos de las secuencias de ácidos nucleicos que se muestran en Seq ID NO 1 y 3 como sondas de hibridación o como cebadores de amplificación. Son especialmente preferidos los segmentos que codifican las secuencias de péptidos que se representan en Seq ID NO 5 y 6.

El invento se refiere además a polipéptidos, que son codificados por un ácido nucleico conforme al invento. Estos polipéptidos tienen la función de un receptor de andrógenos.

Además, son objeto del invento unos polipéptidos, que codifican la secuencia de aminoácidos que se representa en Seq ID NO 2 o 4.

Los polipéptidos conformes al invento pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos aislados naturales o polipéptidos sintéticos.

Además, el invento se refiere a unos péptidos, que comprenden la secuencia representada en Seq ID NO 5. La secuencia representada en Seq ID NO 5 corresponde al extremo terminal de C (aminoácidos 285-294) de AR32.

El invento se refiere también a péptidos, que comprenden la secuencia de aminoácidos que se representa en Seq ID NO 6. La secuencia de aminoácidos que se representa en Seq ID NO 6 corresponde al extremo terminal de N(aminoácidos 1-7) de AR42 y AR32.

Los polipéptidos conformes al invento se pueden utilizar para la producción de anticuerpos. Para la producción de anticuerpos policlonales, los péptidos se pueden fijar p.ej. a KLH (de Keyhole Limpet Hemocyanin = hemocianina de lapa californiana) e inyectarse a animales, p.ej. conejos. Ellos se pueden utilizar también para la producción de anticuerpos monoclonales. Para la producción de anticuerpos, se puede utilizar un péptido conforme al invento o una mezcla de varios péptidos conformes al invento. La producción de los anticuerpos se efectúa en tal caso de acuerdo con procedimientos clásicos, tal como se describen p.ej. en las citas de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 1975, 256, 495-497 y de Nelson, P. N. y colaboradores, Mol. Pathol. 2000, 53, 111-117.

Son objeto del invento también los anticuerpos, que están dirigidos contra un polipéptido con la Seq ID NO 5 o la Seq ID NO 6.

Los anticuerpos conformes al invento se pueden utilizar para la detección de los AR42 y AR32 conformes al invento. Esto puede efectuarse p.ej. mediante una inmunohistoquímica. Se prefiere la detección de los polipéptidos conformes al invento en tejidos de tumores, especialmente en tejidos de tumores de próstata. Así, se puede comprobar si una resistencia a una terapia con hormonas se ha de atribuir a una expresión alterada de los AR42 y/o AR32 conformes al invento. Los anticuerpos conformes al invento se pueden emplear también en otros ensayos inmunitarios, tal como p.ej. en un ELISA (del inglés enzyme linked immunosorbent assay = ensayo de inmunosorbente enlazado a enzimas) o en ensayos radioinmunológicos. Así, se puede comprobar la concentración de los AR42 y AR32 conformes al invento en extractos de tejidos o de células.

La detección de la expresión de AR42 o AR32 se puede efectuar también por medio de la detección de ARNm en las células. Es objeto del invento, por lo tanto, también la utilización de una sonda con secuencias de ácidos nucleicos, que son complementarias con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos, que codifican los péptidos conformes al invento con una secuencia de aminoácidos según la Seq ID NO 5 o 6, para la producción de un reactivo destinado a la detección de la presencia de un ARNm conforme al invento en células tumorales. Una sonda es un corto trozo de ADN con por lo menos 14 nucleótidos. La sondas conformes al invento se pueden utilizar p.ej. en un análisis de borrón Northern (Northern Blot). Este método se describe p.ej. en la cita de Sambrook, J. y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Otros métodos para la detección del ARN son una hibridación in situ, un ensayo de protección con RNAsa o una PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

Además, son objeto del invento unos vectores que contienen por lo menos una copia de un ácido nucleico conforme al invento. Los vectores pueden ser vectores procarióticos o eucarióticos. Ejemplos de vectores son pPRO (de Clontech), pBAD (de Invitrogen), pSG5 (de Stratagene), pCI (de Promega), pIRES (de Clontech), pBAC (de Clontech), pMET (de Invitrogen) y pBlueBac (de Invitrogen). En estos vectores se pueden introducir, con los métodos conocidos para un experto en la especialidad, los ácidos nucleicos conformes al invento. Los ácidos nucleicos conformes al invento se encuentran preferiblemente en unión con señales de expresión tales como p.ej. las de promotor y de intensificador en el vector.

El invento se refiere además a células, que son transfectadas con una secuencia de ácido nucleico conforme al invento o con un vector conforme al invento. Como células se pueden utilizar p.ej. las de E. coli, levaduras, Pichia, Sf9, COS, CV-1 o BHK. Son preferidas unas células que se seleccionan entre el conjunto que se compone de células PC3, células LNCaP, células CV-1 y células de Dunning. Estas células se pueden utilizar tanto para la producción de AR42 y/o AR32 como también para ensayos basados en células.

Es objeto del invento además la utilización

a.

de un ácido nucleico conforme al invento,

b.

de un polipéptido conforme al invento,

c.

de un péptido con la secuencia de aminoácidos representada en Seq ID NO 5, o

d.

de una célula conforme al invento,

para la identificación de efectores de un polipéptido conforme al invento. Son efectores las sustancias que actúan inhibiendo o activando sobre el polipéptido conforme al invento, y que están en situación de influir sobre la función del receptor de andrógenos de los polipéptidos conformes al invento.

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Además, el invento se refiere a un sistema de ensayo para la detección de inhibidores o activadores de la función del receptor de andrógenos de los polipéptidos conformes al invento, realizándose que

a.

en las células conformes al invento se expresa un gen reportero y

b.

estas células, cuando ellas no contienen ningún polipéptido o solamente poca cantidad de un polipéptido conforme al invento, son transfectadas adicionalmente con un vector conforme al invento,

c.

las células se cultivan en presencia o ausencia de las sustancias de ensayo, y

d.

se mide la modificación de la expresión del gen reportero.

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Además, el invento se refiere a un sistema de ensayo para la detección de sustancias de ensayo con una actividad antiandrógena, realizándose que

a.

en las células conformes al invento se expresa un gen reportero y

b.

estas células, cuando ellas no contienen ningún polipéptido o solamente poca cantidad de un polipéptido conforme al invento, son transfectadas adicionalmente con un vector conforme al invento,

c.

las células se cultivan en presencia o ausencia de las sustancias de ensayo, y

d.

se mide la modificación de la expresión del gen reportero.

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Para un sistema de ensayo conforme al invento se transfectan células apropiadas, por ejemplo células CV-1, células COS, o células, que proceden de la próstata, de una manera estable o transitoria con un ácido nucleico conforme al invento o con partes de éste, o con partes de éste en combinación con un dominio de transactivación de otros factores. Ciertas partes de un ácido nucleico conforme al invento pueden ser p.ej. los dominios que se fijan a ligandos, los dominios de transactivación y los dominios que se fijan a ADN. Los dominios de transactivación de otros factores pueden ser p.ej. los dominios que fijan a ligandos, los dominios de transactivación y los dominios que fijan a ADN del AR o del receptor de progesterona, los dominios de transactivación de Gal 4 o los dominios de transactivación de VP 16. Los plásmidos reporteros pueden ser concomitantemente transfectados. Éstos contienen uno o varios elementos de respuesta a esteroides, que constituyen repeticiones invertidas de la secuencia TGTTCT con un espaciador de tres pares de bases. Además, tales elementos de respuesta pueden ser repeticiones directas de la secuencia TGTTCT con un espaciador de tres a cinco pares de bases. Son posibles ciertas desviaciones en la secuencia de TGTTCT, como se describen en elementos de respuesta naturales (Kokontis, J. M. y Liao, S., Vitam. Horm. 1999, 55, 219-307). Secuencia abajo se encuentra, en unión operativa, un promotor mínimo (Schenborn, E. y Groskreutz, D., Mol. Biotechnol. 1999, 13, 29-44) y un gen reportero heterólogo. Los plásmidos reporteros pueden contener también un promotor o partes de un promotor procedentes de conocidos genes regulados por andrógenos. Se prefieren genes que son expresados en la próstata de un modo dependiente de andrógenos. Ejemplos de ellos son los genes de PSA, de probasina y de C3(1). Los genes reporteros pueden ser p.ej. un gen de luciferasa, un gen de cloranfenicol-acetil-transferasa, un gen de urocinasa, un gen de la proteína fluorescente verde y un gen de \beta-galactosidasa. Las sustancias de ensayo se seleccionan de manera preferida entre el conjunto de los derivados de andrógenos. Estos sistemas de ensayo se pueden emplear, sin embargo, también para el escrutinio de grandes bibliotecas de sustancias. Para el sistema de ensayo destinado a la detección de sustancias de ensayo con una actividad anti-andrógena, se pueden utilizar en la etapa c., como andrógeno, p.ej. R1881, testosterona, dihidro-testosterona y derivados de testosterona.

Se prefieren las sustancias que en un sistema de ensayo conforme al invento modifican la expresión de un gen reportero, pero que no son efectores del AR. Para la determinación de si las sustancias son efectores del AR, se puede utilizar un sistema de ensayo, que está constituido de una manera análoga al sistema de ensayo conforme al invento, siendo transfectadas las células, en vez de con un vector conforme al invento, con un vector que contiene el ácido nucleico del AR.

Los efectores, que activan a los polipéptidos conformes al invento pero no al AR, conducen, mediante formación de heterodímeros de los polipéptidos conformes al invento con el AR, a una inhibición del AR. Este efecto inhibitorio se puede determinar con un sistema de ensayo descrito en el Ejemplo 5. Una inhibición del AR es deseable en los casos de todas las enfermedades dependientes de andrógenos, p.ej. para el tratamiento de tumores de próstata y también en el caso del control de la fertilidad masculina. En el caso del control de la fertilidad masculina, mediante inhibición del AR, se puede inhibir p.ej. la expresión de genes, que son necesarios para la formación de espermas maduros.

Además, se pueden identificar unos genes, que son regulados selectivamente por medio de homodímeros o heterodímeros de los polipéptidos conformes al invento. Estos genes se pueden identificar con experimentos deliberados de Knock-Out y Knock-In (es decir, de carencia de un gen en particular o de reemplazo de un gen normal por otro alterado con una mutación).

Son preferidas las sustancias que aumentan o inhiben por lo menos en 10 veces la actividad del gen reportero en los sistemas de ensayo conformes al invento. Una sustancia, que es identificada mediante un procedimiento conforme al invento, puede ser optimizada eventualmente en lo referente a la estabilidad metabólica, a la actividad en un sistema de ensayo conforme al invento y/o a la biodisponibilidad. Para esto, se pueden utilizar métodos corrientes en la química.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la estructura de intrones y exones del gen de AR y la estructura de dominios del AR, del AR42 y del AR32. En el gen se mostraron con flechas la conocida iniciación de la transcripción (tsp) en el promotor y la 2ª iniciación putativa de la transcripción (?tsp) delante del exón 1B. El nuevo exón 1B está sombreado con rayas cruzadas. Unos asteriscos marcan unos sucesos de empalme que conducen específicamente a la generación de los ARNm para AR42 y AR32. En la proteína se mostraron los diferentes dominios. Las nuevas regiones, que se presentan adicionalmente en AR42 y AR32 mediante el empalme alternativo del gen de AR, están sombreadas con rayas cruzadas.

La Fig. 2 muestra la distribución en tejidos de los ARNm de AR42 y AR32. Un cebador del mismo sentido, que había sido dirigido contra el exón específico de AR42 y AR32, y un cebador antisentido, que había sido dirigido contra la zona terminal de C común, se utilizaron para la amplificación por PCR. El ARN total se obtuvo a partir de diferentes tejidos humanos y se transcribió con una transcriptasa inversa. Este ADNc de primera hebra sirvió como molde. Los productos de la PCR fueron separados sobre un gel de agarosa y teñidos con bromuro de etidio. El ADNc de AR42 se puede reconocer como una banda intensa y el ADNc de AR32 se puede reconocer como banda muy débil en el gel.

La Fig. 3 muestra la expresión de una proteína de AR42 en células LNCaP. Un anticuerpo, que está dirigido contra el dominio que fija a un ligando del AR, se utilizó para el análisis por borrón Western (Western Blot). Extractos celulares totales de diferentes linajes de células (LNCaP, PC-3ARwt, PC-3, CV-1) fueron aplicados sobre un gel de Tris-glicina al 8%. Unas proteínas de AR y AR42 traducidas in vitro fueron aplicadas como testigos. La proteína de AR42 fue detectada solamente en células LNCaP. La proteína de AR de 110 kDa fue detectada en LNCaP y en PC3-ARwt. El linaje de células PC-3ARwt se obtuvo por transfección de células PC-3 con un plásmido que contiene AR.

La Fig. 4.a muestra que el AR42 no posee ninguna función de transactivación en células PC-3. 100 ng de pSG5-AR42 se transfectaron concomitantemente en PC-3 en común con 100 ng de un plásmido reportero, que contiene el promotor de MMTV. Estas células se trataron, después de esto, con diferentes andrógenos (R1881: metribolona; T: testosterona; DHT: 5\alpha-dihidro-testosterona) con una concentración final de 10^{-7} M.

La Fig. 4.b muestra la actividad transrepresora del AR42. 10 ng de pSG5-AR y diferentes cantidades de pSG5-AR42 se transfectaron concomitantemente en células PC-3. Adicionalmente se transfectaron 100 ng de un plásmido reportero, que contiene el promotor de MMTV. La actividad del gen reportero se midió después de un tratamiento con R1881 (10^{-9} M). Unas cantidades crecientes de pSG5-AR42 transfectado inhibieron los efectos transactivadores del AR estimulado.

La Fig. 5 muestra la expresión de un ARNm de AR42 en un tejido de tumor de próstata. La totalidad del ARN de próstata se obtuvo a partir de un tejido normal (N) o de tumor (T) de dos pacientes de carcinoma de próstata y se transcribió con una transcriptasa inversa. Un cebador del mismo sentido, que estaba dirigido contra el exón específico de AR42 y AR32, y un cebador antisentido, que estaba dirigido contra la región terminal de C del AR común, se utilizaron para una amplificación por PCR. Los fragmentos de ADN de AR y S9 se volvieron a amplificar paralelamente. Las cantidades de ADN de S9 sirven como patrón interno. Los resultados muestran que un ARN de AR42 es expresado más intensamente en ambos tejidos de tumores de próstata que en un tejido normal. Las cantidades de transcritos de AR no tenían ninguna modificación comparable. Las denominaciones x2, x0,5 etc indican en qué factor es más intensa la respectiva banda en el tejido de tumor frente al tejido normal.

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Ejemplos

Los métodos de biología molecular utilizados en los ejemplos tales como p.ej. la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la preparación de un ADNc, la clonación de un ADN y la secuenciación de un ADN fueron llevados a cabo como se describe en manuales conocidos, tal como por ejemplo en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clona-
ción molecular, un manual de laboratorio) (Sambrook, J. y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Ejemplo 1 Identificación de AR42 y AR32

El material de partida era 1 \mug del ARN total procedente de una placenta humana, que había sido transformada en ADNc mediante el estuche de amplificación SMART RACE (de Clontech). Para la amplificación por PCR se usó el estuche de PCR Advantage-2 (de Clontech) juntamente con un cebador antisentido (5'-CAGATTACCAA-GCTT
CAGCTTCCG-3'), que está dirigido contra la región de charnela del receptor humano de andrógenos, y se utilizó un cebador 5'-Smart II del mismo sentido. Las condiciones de reacción fueron: 5 s (segundos) a 94ºC, 3 min. (minutos) a 72ºC (5 ciclos); 5 s a 94ºC, 10 s a 70ºC, 3 min. a 72ºC (5 ciclos); 5 s a 94ºC, 10 s a 68ºC, 3 min. a 72ºC (27 ciclos). En este caso se amplificó un fragmento de aproximadamente 500 pares de bases, se purificó sobre un gel de agarosa, se clonó en el plásmido TOPO de PCR (de Invitrogen) y se secuenció. La secuencia de ADN mostró que estaba presente el dominio del receptor de andrógenos que fija al ADN completo (que corresponde a los exones 2 y 3 en el gen del receptor de andrógenos). De manera adicional, directamente delante del exón 2 estaba acoplada una nueva secuencia. Este segmento, al que se puede denominar como exón 1B, contiene aproximadamente 160 pares de bases procedentes de la zona no traducida y una nueva secuencia corta que codifica 7 aminoácidos. Con el fin de aislar el ADNc completo, se sintetizaron los cebadores del mismo sentido 5'-ACAGGG-AACCAGGGAAACGAATG
CAGAGTGCTCCTGACATTGCCTGT-3' (en una concentración final 0,2 \muM) y 5'-GACAGGGAACCAGGGAAA-CGAATG-3' (en una concentración final 1 \muM), que proceden de la nueva zona del exón 1B y un cebador antisentido (5'-TCACTGGGTGTGGAAATAGATGGGCTTGA-3'), que codifica el extremo terminal de C del AR conocido. Se utilizaron las condiciones preestablecidas para la PCR SMART. De esta manera es posible amplificar y clonar un fragmento de aproximadamente 1.200 pares de bases procedente del mismo ADNc de placenta. Después de una secuenciación del ADN se comprobó que se trataba de dos diferentes fragmentos, como se muestra en las Seq ID NO 1 y NO 3. En ambas estaba presente la nueva parte correspondiente al exón 1B. La diferencia entre el AR42 y el AR32 se encontraba situada en la zona terminal de C, puesto en el AR32 faltaba la región que es codificada por el exón 7. Una búsqueda en bancos de datos genómicos mostró que la nueva zona del exón 1B está situada en el centro del primer intrón del gen del receptor de andrógenos. Un análisis del segmento de gen situado delante muestra que posiblemente en esta zona se encuentra situado un segundo promotor del gen de receptor de andrógenos. Este segmento contiene regiones iniciadoras putativas, que sirven para el reconocimiento mediante la maquinaria de transcripción basal, así como varios elementos putativos que responden a hormonas de esteroides.

Ejemplo 2 Distribución en tejidos de AR42 y AR32

La distribución en tejidos se determinó mediante una PCR semi-cuantitativa. Los cebadores, que se habían usado para el aislamiento de las secuencias completas de ADNc de AR42 y AR32 (Ejemplo 1) se utilizaron también en el presente caso. En el testigo se usaron cebadores específicos para la beta-actina (cebador del mismo sentido: 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'; cebador antisentido: 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC
GATGGAGGG-3'). Se usó el ARN total a partir de los siguientes tejidos humanos: de cerebro, testículos, riñones, hígado, útero, próstata, pulmón, tráquea, músculo, mama, corazón. Después de una transcripción en un ADNc de primera hebra (de Stratagene) se llevó a cabo un análisis por PCR con estuche de PCR Advantage-2 (de Clontech). Las condiciones de reacción fueron: 5 s a 94ºC, 3 min. a 72ºC (5 ciclos); 5 s a 94ºC, 10 s a 70ºC, 3 min. a 72ºC (5 ciclos); 5 s a 94ºC, 10 s a 68ºC, 3 min. a 72ºC (20 ciclos). Los productos de la amplificación fueron separados en un gel de agarosa al 1% y teñidos con bromuro de etidio. Los resultados mostraron que el ARN de AR42 era expresado con la máxima frecuencia en el corazón, en el músculo, en el útero y en la próstata. Las cantidades de ARN de AR32 eran generalmente pequeñas y no mostraron ninguna diferencia esencial entre tejidos.

Ejemplo 3 Expresión de AR42 y AR32

Para la expresión del AR42 o respectivamente AR32 total la zona codificadora se introdujo en el vector de expresión de baculovirus pBlueBac4.5 (Invitrogen). Con el fin de simplificar la detección y la purificación, se efectuó una fusión con una marca de His. Después de una transfección concomitante de células de insectos con el ADN de Bac-N-Blue se produjeron virus recombinantes, que fueron identificados mediante un procedimiento de PCR. Una existencia de fagos fue colocada entonces y utilizada en mayores cantidades para transfecciones adicionales y para la producción del AR42 o respectivamente del AR32 en cantidades mayores. La purificación de las proteínas marcadas con His se efectúa a través de una columna de afinidad con níquel.

Ejemplo 4 Sistema de ensayo para el hallazgo de efectores

Se construye un vector para la expresión transitoria de AR42 o respectivamente AR32 en el plásmido pSG5 (de Stratagene). Este vector es transfectado en células CV-1 o PC-3. Paralelamente a esto, un plásmido reportero, que contiene una o varias copias de un elemento de respuesta a esteroides o de un elemento selectivo de respuesta a andrógenos, acoplado a un gen reportero de luciferasa, es concomitantemente transfectado. Con el fin de encontrar efectores específicos de AR42 o respectivamente AR32 se lleva a cabo un escrutinio con alto caudal de paso de bancos de sustancias. Las sustancias que se conectaban en una concentración de 10^{-6} M o menos a la actividad del gen reportero son elaboradas ulteriormente. La búsqueda de antagonistas de receptores se lleva a cabo en presencia de 10^{-9} M de un andrógeno, p.ej. el R1881. Se seleccionan las sustancias que dividen por lo menos en la mitad a la inducción de andrógenos en una concentración de 10^{-6} M o menos.

Ejemplo 5 Actividad transrepresora de AR42 y AR32

Se construye un vector para la expresión transitoria de AR42, AR32 o respectivamente AR en el plásmido pSG5 (de Stratagene). Una cantidad constante de pSG5-AR y diferentes cantidades de pSG5-AR42 o respectivamente pSG5-AR32 se transfectan en células CV-1. En el testigo se transfecta concomitantemente con el pSG5-AR un plásmido de pSG5, que contiene un ADNc irrelevante de longitud similar. Adicionalmente, un plásmido reportero, que contiene una o varias copias de un elemento de respuesta a esteroides o de un elemento selectivo de respuesta a andrógenos, acoplado a un gen reportero de luciferasa, es transfectado concomitantemente. Después de un tratamiento con un andrógeno, se mide una elevación de la actividad del gen reportero. Unas cantidades crecientes de pSG5-AR42 o pSG5-AR32 transfectado inhiben estos efectos transactivadores del AR estimulado.

Ejemplo 6 Detección de la expresión de la proteína AR42

El AR42 o AR fueron traducidos in vitro en el sistema de transcripción / traducción TNT T7 Quick Coupled [acoplado con rapidez] (de Promega). Para esto se incubó durante 90 minutos a 30ºC un pSG5-AR42 o pSG5-AR con una mezcla de material lisado de reticulocitos de conejo. Una parte del material empleado (1/25) o respectivamente del extracto total de células (40 ng) se separaron en un gel de Tris-glicina al 8% y se transfirieron en el tampón de Towbin sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana de transferencia fue bloqueada en un tampón de PBS-Tween con leche al 5%. El anticuerpo primario era un anticuerpo policlonal procedente de conejos, que estaba dirigido contra el dominio del AR que fija a ligandos. Este anticuerpo se diluyó hasta 1/500 en un tampón de PBS-Tween con leche al 3%. Para la detección se utilizó el estuche ECL de Amersham.

Ejemplo 7 Expresión de ARN en tumores de próstata

La expresión de ARNm de AR42 y AR32 en un tumor de próstata se determinó mediante una PCR semi-cuantitativa. Se utilizaron los cebadores descritos en el Ejemplo 2. En el testigo se usaron cebadores específicos para la proteína ribosomal humana S9 (cebador del mismo sentido: 5'-GATGAGAAGGACCCACGGCGTCTGTTCG-3'; cebador antisentido: 5'-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGGACA-3') y para AR (cebador del mismo sentido: 5'-CCCTGGATGGATAGCTACTCCGGACCTTAC-GGGGACATGCGT-3'; cebador antisentido: 5'-TCACTGGGTGT-GGAAATAGATGGGCTTGA-3'). El ARN total procedente de un tejido normal de próstata o de un tumor de próstata se analizó igual a como en el Ejemplo 2. La densidad óptica de las bandas se midió con el sistema Gel Doc y con el programa lógico software Quantity One Software de Biorad.

<110> Schering AG

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<120> Nuevas variantes del receptor de andrógeno

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<130> 52011

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<140>

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<141>

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1329

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 388

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<212> PRT (proteína)

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

2

200

3

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<210> 3

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<211> 1171

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 294

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 4

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5

\newpage

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<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Asn Cys Glu Arg Ala Ala Ser Val His Phe}

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<210> 6

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\sa{Met Ile Leu Trp Leu His Ser}

Claims (17)

1. Ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos, caracterizado porque él comprende las secuencias de nucleótidos representadas en Seq ID NO 1 y/o 3.

2. Ácido nucleico caracterizado porque él codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en Seq ID NO 2 o/y 4.

3. Receptor de andrógenos, caracterizado porque él codifica un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2.

4. Receptor de andrógenos, caracterizado porque él comprende la secuencia de aminoácidos representada en Seq ID NO 2 o 4.

5. Péptido, caracterizado porque él comprende la secuencia representada en Seq ID NO 5.

6. Péptido, caracterizado porque él comprende la secuencia de aminoácidos representada en Seq ID NO 6.

7. Utilización de un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4 o de un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 5 o/y 6 para la producción de anticuerpos.

8. Anticuerpo contra un péptido con la Seq ID NO 5 ó 6.

9. Utilización de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, para la detección de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 en un tejido de tumor.

10. Utilización de una sonda con secuencias de ácidos nucleicos que son complementarias con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos, que codifican los péptidos con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Seq ID NO 5 o la Seq ID NO 6, para la preparación de un reactivo destinado a la detección de la presencia de un ARNm de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2 en células de tumores.

11. Vector, caracterizado porque él contiene por lo menos una copia de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2.

12. Célula, caracterizada porque ella es transfectada con un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Célula de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque ella está seleccionada entre el conjunto que se compone de células PC-3, células LNCaP, células CV-1 y células de Dunning.

14. Utilización de una célula de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 para la expresión del ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2.

15. Utilización

a.

de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2,

b.

de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4,

c.

de un péptido con la secuencia de aminoácidos representada en Seq ID NO 5 o

d.

de una célula de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13,

para la identificación de inhibidores o activadores de la función del receptor de andrógenos de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.

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16. Sistema de ensayo para la detección de inhibidores o activadores de la función del receptor de andrógenos de los polipéptidos conformes al invento, realizándose que

a.

en una célula de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 se expresa un gen reportero, y

b.

esta célula, cuando ella no contiene ningún polipéptido o solamente poca cantidad de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, es transfectada adicionalmente con un vector de acuerdo con la reivindicación 11,

\newpage

c.

las células son cultivadas en presencia o ausencia de las sustancias de ensayo, y

d.

se mide la modificación de la expresión del gen reportero.

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17. Sistema de ensayo para la detección de sustancias de ensayo con una actividad anti-andrógena, realizándose que

a.

en una célula de acuerdo con la reivindicación 12 o 13 se expresa un gen reportero, y

b.

esta célula, cuando ella no contiene ningún polipéptido o solamente poca cantidad de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, es transfectada adicionalmente con un vector de acuerdo con la reivindicación 11,

c.

las células son cultivadas en presencia o ausencia de las sustancias de ensayo, y

d.

se mide la modificación de la expresión del gen reportero.