ES2297753T3 - Metodos para determinar la potencia, especificidad y toxicidad de prostaglandina d2 sintasa hematopoyetica. - Google Patents

Metodos para determinar la potencia, especificidad y toxicidad de prostaglandina d2 sintasa hematopoyetica. Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para el cribado en cuanto a potencia, especificidad y toxicidad de compuestos inhibidores de prostaglandina D2 sintasa hematopoyética (hPGDS) en células mamíferas, que comprende las etapas de: i) poner en contacto dicha célula mamífera con una molécula estimuladora que incrementa la liberación de ácido araquidónico, ii) tratar dicha célula mamífera con un compuesto, iii) medir la concentración de prostaglandina D2 (PGD2) en dicha célula mamífera o en el sobrenadante, iv) comparar las concentraciones de PGD2 en dicha célula mamífera respecto de las concentraciones de PGD2 en una célula mamífera de control que no está tratada con dicho compuesto para determinar la potencia de dicho compuesto, v) medir la concentración de prostaglandina E2 (PGE2) en dicha célula mamífera, vi) comparar las concentraciones de PGD2 con las concentraciones de PGE2 en dicha célula mamífera, en donde el hallazgo de que la concentración de PGD2 es inferior que la concentración de PGE2 indica actividad inhibidora específica del compuesto para hPGDS, vii) medir la cantidad de citotoxicidad en las células mamíferas tratadas con compuesto y de control, y comparar los niveles de citotoxicidad en las células mamíferas tratadas y de control, en donde el hallazgo de citotoxicidad en las células tratadas con compuesto es una indicación de la inhibición de la proliferación celular.

Description

Métodos para determinar la potencia, especificidad y toxicidad de prostaglandina D2 sintasa hematopoyética.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método nuevo y útil para ensayar compuestos y agentes en cuanto a su capacidad para disminuir o inhibir la actividad de la prostaglandina D2 sintasa hematopoyética (hPGDS). Específicamente, la presente invención se refiere a ensayos para medir la potencia, especificidad y toxicidad de los inhibidores de hPGDS.
Antecedentes de la invención
Las prostaglandinas son una clase de eicosanoides que tienen efectos biológicos diversos. Se ha demostrado que las prostaglandinas tienen efectos farmacológicos en el sistema cardiovascular, en la agregación plaquetaria, efectos en el músculo liso por lo que afectan al sistema gastrointestinal, la función renal y la formación de orina, efectos en el sistema nervioso central, en el sistema endocrino, efectos en el metabolismo, y desempeñan un papel crítico en la inflamación y en las respuestas inmunitarias. Así, las prostaglandinas pueden tener una amplia utilidad terapéutica. Las prostaglandinas se sintetizan a partir de ácido araquidónico, y poseen un anillo de cinco átomos de carbono que formaron parte de la cadena de ácido araquidónico. Típicamente, las prostaglandinas actúan de forma local, es decir, cerca del lugar de su síntesis.
La prostaglandina D2 (PGD2) es el prostanoide principal producido por los mastocitos activados en respuesta a la exposición a antígeno, por lo que es un mediador importante en los trastornos alérgicos de las vías respiratorias. En particular, provoca, entre otras cosas, broncoconstricción, hiperreactividad bronquial, congestión nasal e infiltración de eosinófilos y células Th2. También se cree que la PGD2 liberada de los mastocitos y basófilos estimulados por antígeno provoca la hipersensibilidad inmediata, la inflamación o el remodelado de las vías aéreas en el asma.
La enzima prostaglandina D sintasa (PGDS) cataliza la conversión de prostaglandina H2 (PGH2) a PGD2. Se conocen dos tipos de PGD2 sintasas. La primera es de tipo lipocalina (L-PGDS), hallada principalmente en el sistema nervioso central, y la segunda es PGDS hematopoyética (hPGDS), que se halla principalmente en los tejidos periféricos. L-PGDS es independiente de glutatión (GSH), mientras hPGDS es dependiente de GSH. Además, hay muy poca homología estructural entre L-PGDS y hPGDS.
Debido a que PGD2 desempeña un papel importante en la inflamación, se han hecho esfuerzos para desarrollar ensayos para cribar compuestos que pueden inhibir su producción. En particular, los inhibidores de la síntesis de PGD2 pueden ser valiosos en el tratamiento de rinitis alérgica, asma y posiblemente enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La aplicación terapéutica se puede ampliar también al tratamiento de esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y trastornos que resultan de la lesión por isquemia-reperfusión, tumor cerebral y aplicaciones terapéuticas en procesos biológicos modulados por las prostaglandinas.
Se usan métodos tales como cromatografía líquida de alta presión (HPLC), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA), también conocidos como enzimoinmunoensayos (EIA), o radioinmunoensayos (RIA) para cuantificar la producción de PGD2 para determinar la capacidad de un compuesto o de un agente para disminuir, inhibir, aumentar o modular la producción de PGD2.
En el pasado, los estudios de la potencia, especificidad y toxicidad se han separado en diferentes paradigmas experimentales. Además, las determinaciones de la especificidad eran más factibles en ensayos bioquímicos, que en muchos casos no podían imitar las condiciones biológicas complejas existentes en las células. Así, es deseable diseñar un ensayo basado en células que mida la potencia, especificidad y toxicidad de los moduladores de PGDS a partir de la misma muestra experimental. Tal diseño acortaría las etapas, que normalmente requieren un cribado secundario, y proporcionaría información que estaría más estrechamente relacionada con las condiciones celulares in vivo.
Breve resumen de la invención
La presente invención establece un ensayo basado en células individuales para determinar la potencia, especificidad y citotoxicidad simultáneamente para los moduladores de hPGDS. Los compuestos que modulan la actividad de hPGDS proporcionan aproximaciones terapéuticas nuevas para el tratamiento de la inflamación y para la manipulación farmacológica de las respuestas inmunitarias. El diseño del ensayo es adecuado para el uso en cualquier línea celular mamífera en la que se exprese hPGD2, tal como mastocitos, células presentadoras de antígenos, megacariocitos y linfocitos Th2. En la presente invención, las células mamíferas se tratan con una molécula estimuladora que aumenta la liberación de ácido araquidónico. Las moléculas contempladas en la presente invención son ionóforos de calcio tales como A23187, ionomicina, ésteres de forbol, factores de crecimiento, citocinas, promotores tumorales o moléculas movilizadoras de canales de calcio tales como BAY K-8644. En una realización particular, se puede añadir directamente ácido araquidónico a las células.
Las células usadas para cribar compuestos que modulan hPGDS se tratan con el compuesto de ensayo y con una molécula estimuladora para inducir la liberación de ácido araquidónico. Los niveles de producción de PGD2 se miden en presencia del compuesto de ensayo, y se comparan con los niveles de PGD2 sin pretratamiento con el compuesto de ensayo. Además de medir la potencia de un compuesto de ensayo, la presente invención proporciona medidas de especificidad y citotoxicidad en el mismo sistema de ensayo basado en células. Esto se diseña determinando una segunda lectura para PGE2. Por ejemplo, si un compuesto de ensayo inhibe específicamente la actividad de hPGDS, generará una CI50 para PGD2 que es significativamente inferior que la de PGE2. Por contraste, si el compuesto de ensayo es inespecífico o citotóxico, generará valores de CI50 similares para PGD2 y PGE2. Se pueden usar ensayos de citotoxicidad adicionales para determinar si estos valores son debidos a la toxicidad del compuesto de ensayo o a la inhibición inespecífica de la síntesis de prostanoides.
Los anteriores aspectos y otros aspectos, características y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada junto con las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra los resultados del ensayo basado en células que distingue entre inhibidores de PGD2 específicos e inespecíficos. El compuesto A000050350 inhibe específicamente la producción de PGD2 en células RBL, mientras el compuesto A000127348 inhibe de forma inespecífica la producción tanto de PGD2 como de PGE2 en células RBL.
La Fig. 2 es un gráfico que representa la determinación de la citotoxicidad midiendo la proliferación celular de células de leucemia basófila de ratas (RBL) tratadas con varias concentraciones de compuestos de ensayo de PGDS mediante el uso del CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un ensayo basado en células para cribar compuestos que modulan la PGD2 sintasa hematopoyética (hPGDS). El ensayo determina la potencia, especificidad y toxicidad de los compuestos de ensayo en células vivas. La presente invención permite la identificación de compuestos inhibidores que se pueden usar como fármacos para tratar muchas enfermedades inflamatorias, que incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis alérgica, EPOC, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y otros trastornos que resultan de la lesión por isquemia-reperfusión.
La presente invención se refiere en general a un ensayo basado en células que se usa para medir la potencia, especificidad y citotoxicidad de los compuestos de ensayo que modulan la actividad de hPGDS en un ensayo basado en células individuales. Las medidas se pueden realizar rápidamente, y se pueden ampliar para ensayar simultáneamente muchos compuestos diferentes.
No hay restricciones particulares en cuanto al compuesto que se puede ensayar. Los ejemplos incluyen moléculas de bajo peso molecular, bibliotecas de compuestos sintéticos de bajo peso molecular, proteínas purificadas, productos de expresión de bibliotecas génicas, bibliotecas peptídicas sintéticas, extractos celulares y sobrenadantes de cultivos.
Se puede usar cualquier línea celular mamífera en la presente invención siempre que la línea celular mamífera exprese hPGDS. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, mastocitos, células presentadoras de antígenos, megacariocitos y linfocitos Th2. Además, se pueden usar líneas celulares mamíferas tales como leucemia basófila de ratas (RBL). Son ejemplos adicionales los mastocitos primarios de diferentes especies tales como humano y ratón, o subtipos de células T de diferentes especies. Están contempladas por la presente invención las células modificadas mediante ingeniería genética para expresar o sobreexpresar hPGDS o hPGDS modificada.
Las células mamíferas elegidas se tratan con una molécula estimuladora que aumenta la liberación de ácido araquidónico. Las moléculas contempladas para el uso en la presente invención son ionóforos de calcio tales como A23187, ionomicina, ésteres de forbol, factores de crecimiento, citocinas, promotores tumorales y moléculas movilizadoras de canales de calcio tales como BAY K-8644. En otra realización particular de la presente invención, se puede añadir ácido araquidónico directamente a las células mamíferas elegidas.
Para medir la potencia en la presente invención, las células se tratan con un compuesto de ensayo seguido de la adición de una molécula estimuladora para aumentar la liberación de ácido araquidónico. Se miden los niveles de producción de PGD2 en las células tratadas con la molécula estimuladora y con diversas concentraciones de los compuestos de ensayo. Estos niveles se comparan con los niveles de PGD2 producida en las células que se trataron con los estímulos, pero que no se expusieron al compuesto de ensayo.
La presente invención también proporciona en el mismo ensayo basado en células la capacidad de medir la especificidad y la citotoxicidad. Esto se diseña determinando una segunda lectura de la producción de prostanoides, por ejemplo, las concentraciones de PGE2, en el sobrenadante de las células. Si un compuesto de ensayo inhibe de forma específica la actividad de hPGDS, generará una CI50 para PGD2 que es significativamente inferior que la de PGE2. Por contraste, si el compuesto de ensayo es inespecífico o citotóxico, generará valores de CI50 similares tanto para PGD2 como para PGE2. Para determinar si la inhibición inespecífica es debida a la toxicidad del compuesto de ensayo, se puede disponer un ensayo adicional de citotoxicidad posteriormente mediante el uso de las mismas muestras que en el ensayo basado en células, o por separado mediante el uso de las mismas condiciones del ensayo basado en células descrito anteriormente. Un hallazgo de inhibición de la proliferación celular se considera una medida de actividad inespecífica del compuesto ensayado.
Los ensayos de citotoxicidad que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ensayos tales como MTS, MTT y LDH, todos disponibles comercialmente de Promega, por ejemplo.
La capacidad de un compuesto para modular las concentraciones de PGD2 se determina no solamente tomando medidas en presencia y ausencia del compuesto inhibidor, sino también a diversas concentraciones de éste. Tomando medidas a diversas concentraciones de compuesto es posible calcular ciertas características, tales como su CI50. Una CI50 se define como la concentración a la que el compuesto produce un 50% de inhibición. A la inversa, el ensayo de la presente invención es fácilmente adaptable para ensayar compuestos que estimulan la producción de PGD2 mediante el uso de una cantidad sub-umbral de molécula estimuladora, o sin molécula estimuladora.
También se entiende que el ensayo de la presente invención se puede llevar a cabo también como un ensayo de un único punto, que determina la inhibición del compuesto sobre la producción de PGD2 y PGE2 mediante el uso solamente de una concentración del compuesto de ensayo. Tanto el cribado con un único punto como las determinaciones de CI50 son adaptables al cribado de elevado rendimiento. Los sistemas de cribado de elevado rendimiento están disponibles comercialmente (véase, p.ej., Zymark Corp., Hopkington, Mass.; Air Technical Industries, Mentor, Ohio; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, Calif.; Precision Systems, Inc., Natick, Mass., etc.). Estos sistemas típicamente automatizan procedimientos enteros que incluyen todo el pipeteo de la muestra y de los reactivos, la dispensación de líquidos, las incubaciones cronometradas y la lectura final de las muestras en detector(es) apropiado(s) para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan un elevado rendimiento y una puesta en marcha rápida, así como un grado elevado de flexibilidad y adaptación. Los fabricantes de tales sistemas proporcionan protocolos detallados para los diversos ensayos de elevado rendimiento.
Los métodos para medir concentraciones de PGD2 y PGE2 se conocen en la técnica. Los ejemplos incluyen cromatografía líquida de alta presión (HPLC), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), también conocido como enzimoinmunoensayo (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y polarización de fluorescencia (PF). El ensayo de proximidad por centelleo también puede ser útil para medir las concentraciones de PGD2 y PGE2.
La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas aquí. De hecho, serán aparentes diversas modificaciones de la invención, además de las descritas aquí, para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Tales modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento de células con ionóforo de calcio e incubación con compuestos de ensayo y de control
En este ejemplo se somete a células RBL-2H3 (obtenidas del American Tissue Culture Center) a tratamiento con tripsina (0,05% de tripsina-EDTA) en medios MEM preparados (Gibco 11095-080) complementados con un 10% de suero bovino fetal, L-glutamina, penicilina y estreptomicina hasta proporcionar una suspensión de células individuales. Las células RBL se colocan en las placas a 2x10^{4} células/pocillo en placas de 96 pocillos. Las placas se incuban durante la noche a 37ºC.
Se diluye tampón HBSS (Gibco/Invitrogen 14025-092) con DMSO (Sigma D-8779) equivalente a la concentración más elevada de DMSO contenido en el compuesto de referencia o de ensayo. La(s) placa(s) de compuesto y de control de referencia se descongelan y se mezclan bien antes del uso. En este ejemplo, se usó como referencia SC560, un inhibidor de COX-1, y se adquirió de Cayman Chemical.
Las diluciones del compuesto de ensayo y de SC560 de referencia se hacen con un bloque de ensayo de Costar (3960 o equivalente) según la plantilla de EIA mostrada más adelante. Los pocillos de la columna 1 (blanco, AT=actividad total, UI=unión inespecífica y Fo=fondo) y las columnas 2 y 3 no se usan para los tratamientos de células, sino que están llenas con patrones para el EIA. Los controles 1, 2, 5 y 6 son controles positivos que contienen ionóforo de calcio sin compuesto. Los controles 3, 4, 7 y 8 son controles negativos sin ionóforo de calcio ni compuesto.
1
Los compuestos de ensayo se diluyeron como sigue: Añadir 1 ml de HBSS (sin DMSO) a los pocillos A4-A10 del bloque de ensayo (30 \muM). Añadir 620 \mul de HBSS con un 0,3% de DMSO a los pocillos B4-B10 hasta H4-H10. Añadir 3 \mul de reserva de compuesto (10 mM) a los pocillos 30 \muM. Mezclar bien. Añadir 310 \mul desde la fila A (30 \muM) hasta la fila B (10 \muM). Mezclar bien. Continuar diluyendo como anteriormente, para generar las siguientes concentraciones (30, 10, 3,3, 1,1, 0,37, 0,12, 0,04 y 0,014 \muM).
El SC560 de referencia se diluyó como sigue: Añadir 1 ml de HBSS (sin DMSO) al pocillo A11. Añadir 620 \mul de HBSS con un 0,3% de DMSO a los pocillos B11-H11. Añadir 3 \mul de la reserva prediluida (1 mM en un 100% de DMSO) al pocillo A11 (3 \muM). Mezclar bien. Añadir 310 \mul desde el pocillo A11 (3 \muM) al pocillo B11 (1 \muM). Mezclar bien. Continuar diluyendo para generar las siguientes concentraciones (3 \muM, 1 \muM, 0,33 \muM, 0,11 \muM, 0,037 \muM, 0,012 \muM, 0,0041 \muM y 0,0013 \muM).
Se diseñó un tratamiento de células automatizado para la adición de ionóforo de calcio (A23187 Sigma #C-7522) y reactivo de formación de metoxima (preparado según las instrucciones del equipo nº 512011 de Cayman) mediante el uso de una plataforma SciClone de Zymark.
El presente protocolo automatizado (A) necesita que varias etapas se realicen manualmente (M) como se resume a continuación.
(A) Eliminar los medios utilizados durante la noche y lavar 1x con 200 \mul de tampón HBSS. Eliminar el tampón HBSS de las células y reemplazar con 200 \mul/pocillo de compuestos y controles diluidos según la plantilla. (M) Cubrir y volver a colocar las placas de células a 37ºC. Incubar durante 15 minutos. Destapar las placas de células y volver a ponerlas en la plataforma. (A) Añadir 10 \mul de concentración 20x a los 200 \mul de los tratamientos de células, que incluyen los pocillos de los controles positivos. Nótese que no hay adición de ionóforo de calcio a los pocillos de los controles negativos. (M) Eliminar las cajas de puntas de pipeta vacías y sustituir con puntas de pipeta de 200 \mul en las localizaciones B2, B3 y B4 de la plataforma. (M) Cubrir y volver a colocar las placas de células a 37ºC. Incubar durante 15 minutos. (M) Centrifugar las placas a 1000 rpm durante 5 minutos. Destapar las placas de células y volver a colocarlas en la plataforma. (A) Recoger 25 \mul de los sobrenadantes para formar químicamente la metoxima con 25 \mul de reactivo MOX (proporción 1:1) según el equipo de EIA PGD2-MOX (nº 512011 de Cayman o equivalente). Véase el siguiente ejemplo. (M) Cubrir las placas de ensayo de MOX e incubar a 60ºC durante 30 minutos. (M) Colocar las placas de ensayo adicionales en las localizaciones D2, D3 y D4 de la plataforma para que se recojan los sobrenadantes para el análisis de PGE2. (A) Recoger 175 \mul del sobrenadante restante para determinar la PGE2. Los sobrenadantes con metoxima (para PGD2) y sin metoxima (para PGE2) se pueden almacenar hasta 3 meses a -80ºC.
Ejemplo 2 Cuantificación de las concentraciones de prostaglandina D2: enzimoinmunoensayo
En este ejemplo se midió la concentración de PGD2 mediante el uso de un enzimoinmunoensayo (EIA). Los EIAs para medir PGD2 están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un equipo de EIA para PGD2 está disponible de Cayman Chemical.
Este ensayo se basa en la competición entre PGD2-metoxima (MOX) y un conjugado PGD2-MOX-acetilcolinesterasa (AchE) (trazador de PGD2-MOX) por un número limitado de sitios de unión de antisuero de conejo específico de PGD2-MOX. Debido a que la concentración del trazador de PGD2-MOX se mantiene constante mientras la concentración de PGD2-MOX varía, la cantidad del trazador de PGD2-MOX que es capaz de unirse al antisuero de conejo será inversamente proporcional a la concentración de PGD2-MOX en el pocillo. Este complejo antisuero de conejo-PGD2-MOX se une a la IgG monoclonal anti-conejo de ratón que se ha unido previamente al pocillo. Después de lavar la placa se añade al pocillo reactivo de Ellman (que contiene el sustrato para AchE). El producto enzimático tiene un color amarillo distinto, que absorbe intensamente a 412 nm. La intensidad de este color es proporcional a la cantidad de trazador de PGD2-MOX unido al pocillo, que es inversamente proporcional a la cantidad de PGD2-MOX libre presente en el pocillo durante la incubación.
El EIA y los tampones de lavado se hicieron según las instrucciones comerciales. Las muestras se prepararon según el ejemplo previo. Debido a que las concentraciones de prostaglandina pueden variar, los sobrenadantes se diluyen con tampón de EIA para proporcionar concentraciones de prostaglandina dentro del intervalo lineal de la curva patrón. Las diluciones de PGD2 usadas comúnmente son 1:12,5.
El reactivo de formación de metoxima, el patrón de EIA PGD2-MOX Express, el trazador PGD2-MOX AchE Express, el antisuero PGD2-M0X Express y el control de formación de metoxima de EIA PGD2-MOX Express se prepararon según las instrucciones del fabricante. El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante, y las placas se leyeron a una longitud de onda de 412 nm.
Después de determinar las concentraciones de prostaglandinas en las células tratadas con 8 concentraciones de los compuestos de ensayo, se puede generar una CI50 del compuesto realizando un gráfico semilogarítmico de la concentración de prostaglandina respecto de la escala logarítmica de la concentración del compuesto. Este ensayo también se puede realizar como un ensayo de un único punto que determina la inhibición del compuesto sobre la producción de PGD2 mediante el uso solamente de una concentración del compuesto.
Ejemplo 3 Cuantificación de las concentraciones de prostaglandina E2
En este ejemplo se midieron las concentraciones de PGE2 mediante el uso de un enzimoinmunoensayo (EIA). Los EIAs para medir PGE2 están disponibles comercialmente. Por ejemplo, hay disponible un equipo de EIA para PGE2 de Assay Designs. El EIA para PGE2 emplea un anticuerpo monoclonal de ratón específico para PGE2. El PGE2 libre en disolución compite con una cantidad conocida de trazador de PGE2 para unirse a una cantidad limitada del anticuerpo anti-PGE2. El trazador de PGE2 es un conjugado de PGE2 y acetilcolinesterasa. El anticuerpo anti-PGE2 se fija después mediante el uso de un anticuerpo anti-Ig de ratón de cabra. El anticuerpo fijado se revela después con reactivo de Ellman, que contiene el sustrato para la acetilcolinesterasa. El producto producido mediante esta reacción tiene un color amarillo, y absorbe intensamente a 412 nm. Si hay una concentración elevada de PGE2, el PGE2 competirá y superará al trazador, y la muestra resultante tendrá una absorbancia débil a 412 nm. A la inversa, si hay una concentración baja de PGE2, el trazador competirá y superará a PGE2, y la muestra resultante tendrá una absorbancia intensa a 412 nm. Al realizar este ensayo, se comparó la absorbancia a 412 nm respecto de un patrón de absorbancias a concentraciones conocidas de PGE2.
Alguien experto en la técnica puede convertir fácilmente este ensayo en un formato automatizado mediante el uso de una plataforma SciClone de Zymark, por ejemplo.
Ejemplo 4 Cuantificación de PGD2 y PGE2 para distinguir los compuestos específicos e inespecíficos
Este ejemplo muestra cómo se pueden usar los anteriores ensayos basados en células para PGD2 y PGE2 para distinguir entre compuestos específicos e inespecíficos. Como se muestra en la Figura 1, el compuesto A00050350 genera un valor de CI50 de 2,65 \muM respecto de la inhibición de PGD2, pero no exhibió inhibición de PGE2, lo que sugiere que A0050350 es un inhibidor potente y específico de la síntesis de PGD2. Por contraste, el compuesto A000127348 genera valores de CI50 similares para PGD2 y PGE2; 0,33 \muM y 0,41 \muM, respectivamente, lo que sugiere que A000127348 es un compuesto inespecífico o citotóxico. Un estudio de citotoxicidad posterior confirmó que el compuesto A000127348 afecta a la proliferación celular en las condiciones de ensayo.
En este ejemplo las células RBL se trataron con los compuestos de PGDS durante 45 min en las mismas condiciones que en el ensayo basado en células, excepto que no se añadió A23187. La citotoxicidad potencial se determinó con el CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, nº de cat. G3582). El ensayo se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se determinó la citotoxicidad de ocho concentraciones de cada compuesto que oscilaban de 0,01 \muM a 30 \muM. Las concentraciones de ensayo fueron 0,014 \muM, 0,041 \muM, 0,123 \muM, 0,370 \muM, 1,111 \muM, 3,333 \muM, 10 \muM y 30 \muM (véase la Figura 2). El compuesto A000127348 y otro compuesto de PGDS, A000123383, fueron tóxicos, y son distinguibles de varios compuestos de ensayo atóxicos mostrados en el mismo gráfico. Se usó geneticina como control positivo.

Claims (7)

1. Un método in vitro para el cribado en cuanto a potencia, especificidad y toxicidad de compuestos inhibidores de prostaglandina D2 sintasa hematopoyética (hPGDS) en células mamíferas, que comprende las etapas de:
i)
poner en contacto dicha célula mamífera con una molécula estimuladora que incrementa la liberación de ácido araquidónico,
ii)
tratar dicha célula mamífera con un compuesto,
iii)
medir la concentración de prostaglandina D2 (PGD2) en dicha célula mamífera o en el sobrenadante,
iv)
comparar las concentraciones de PGD2 en dicha célula mamífera respecto de las concentraciones de PGD2 en una célula mamífera de control que no está tratada con dicho compuesto para determinar la potencia de dicho compuesto,
v)
medir la concentración de prostaglandina E2 (PGE2) en dicha célula mamífera,
vi)
comparar las concentraciones de PGD2 con las concentraciones de PGE2 en dicha célula mamífera, en donde el hallazgo de que la concentración de PGD2 es inferior que la concentración de PGE2 indica actividad inhibidora específica del compuesto para hPGDS,
vii)
medir la cantidad de citotoxicidad en las células mamíferas tratadas con compuesto y de control, y comparar los niveles de citotoxicidad en las células mamíferas tratadas y de control, en donde el hallazgo de citotoxicidad en las células tratadas con compuesto es una indicación de la inhibición de la proliferación celular.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula mamífera se selecciona del grupo que consiste en mastocitos, células presentadoras de antígenos, megacariocitos y linfocitos Th2.
3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula mamífera es de leucemia basófila de ratas (RBL).
4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha molécula estimuladora se selecciona del grupo que consiste en ionóforos de calcio, ionomicina, ésteres de forbol, factores de crecimiento, citocinas, promotores tumorales y moléculas movilizadoras de canales de calcio.
5. El método de la reivindicación 4, en el que dicho ionóforo de calcio es A23187.
6. El método de la reivindicación 4, en el que dicha molécula movilizadora de canales de calcio es BAY K-8644.
7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha molécula estimuladora es ácido araquidónico.
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