ES2292853T3 - Procedimiento para la induccion controlada de mutaciones somaticas y su aplicacion en proteomica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la inducción de mutaciones somáticas in vitro, caracterizado por que comprende 1) añadir a las células a hacer mutar, en las condiciones de cultivo y en un medio adecuados para dichas células, al menos una combinación de anticuerpos que comprende los anticuerpos anti-IgM elegida entre una combinación de anticuerpos anti-IgM y anti-CD19, una combinación de anticuerpos anti-IgM y anti-CD21 y una combinación de anticuerpos anti-IgM, anti-CD19 y anti-CD21, mientras que 2) dichos anticuerpos anti-IgM se biotinilan y se someten a una agregación específica gracias a la estreptavidina unida a un soporte.
Description
Procedimiento para la inducción controlada de
mutaciones somáticas y su aplicación en proteómica.
La presente invención se refiere a la biología
y, más especialmente, al dominio de la adaptación por mutación
dirigida, específica del mundo viviente. Se refiere más
especialmente a la inducción de mutaciones somáticas in
vitro así como a las aplicaciones que los perfeccionamientos de
una técnica así hacen posibles de ahora en adelante.
En una realización particular, la invención se
refiere a la inducción de mutaciones sobre el linfoma de Burkitt
BL2.
Para simplificar, se hace referencia en lo
sucesivo al linfoma de Burkitt BL2. Sin embargo, hay que destacar
que sólo pretende facilitar la exposición de la técnica referida y
del concepto inventivo reivindicado, sin por eso limitar a este
respecto la invención.
La estirpe celular del linfoma de Burkitt de
tipo I BL2 presenta las características de los linfocitos B
centroblásticos. Esta estirpe celular es la equivalente
inmortalizada más cercana de los centroblastos de los centros
germinativos. Se ha confirmado su origen de centro germinativo por
la presencia de mutaciones somáticas en los genes V_{H} de la
inmunoglobulina de los linfomas de Burkitt.
Se ha destacado la homogeneidad y la estabilidad
de las células BL2 en los cultivos adecuados (Denépoux S. et
al., Immunity, vol. 6, 35-46, 1997). Se ha
propuesto, conforme al fenotipo del centroblasto, considerar que
BL2 es el resultado de la transformación de un centroblasto del
centro germinativo que ha experimentado varias fases de mutaciones
somáticas.
Por otro lado, se estima que los linfocitos B
experimentan una hiperpermutación en la etapa de centroblasto
[Pascual V. et al., J. Exp. Med. 180, 329-339
(1994)].
El fenómeno de hipermutación de las
inmunoglobulinas tiene lugar en los núcleos germinativos, después de
la estimulación de un linfocito B por un antígeno dependiente de
T.
En particular, Denépoux S. et al., (obra
citada anteriormente) han establecido que las células del linfoma,
especialmente las células BL2, pueden poner en marcha un proceso de
hipermutación después de la agregación de su receptor de superficie
y del cocultivo con un linfocito T cooperador o amplificador,
después de una semana de cultivo. Se ha concluido en este artículo
que se puede aumentar la frecuencia de mutación mediante
activaciones repetidas de las células BL2. Igualmente, estos autores
han destacado que las mutaciones inducidas in vitro sobre
BL2 no afectan la región constante de la IgM y no hacen aparecer una
selección dirigida por un antígeno.
Igualmente, Yélamos J. et al., Nature,
vol. 376, págs. 225-229 (1995) han relatado
experimentos que tienden a demostrar que el fragmento del gen V de
la inmunoglobulina no es indispensable para una hipermutación y que
se podría simplificar la construcción de sustratos de mutación
artificiales.
Luxembourg A.T. et al., Journal of
Immunology, vol. 153, n.º 10, 1994, págs.
4448-4457 describen la activación9 de las células
sin tratamiento previo mediante CD21 o CD1, y el aumento del nivel
de c-fos, que es un protooncogén, mediante la
coactivación por la IgM de superficie y el CD21.
A pesar de estos avances, hoy en día no se
dispone de medios eficaces para estudiar estos fenómenos y para
obtener resultados prácticos, en particular con fines de diagnóstico
y/o de seguimiento, así como de tratamiento de los procesos
tumorales, en unas condiciones de ejecución y de rapidez
satisfactorias.
Por lo tanto, existía una necesidad de medios
que permitan realizar ensayos de hipermutación somática rápidos y
fiables. Más particularmente, existía una necesidad de medios que
permitan disponer de un modelo de inducción de mutaciones
somáticas, aplicable a los genes V, pero también a otros genes que
puedan estar implicados en un proceso tumoral, especialmente en los
humanos, como por ejemplo los genes Bcl-6 y el
ligando Fas (FasL).
Ahora bien, se ha encontrado actualmente que las
células del linfoma, especialmente los linfocitos BL2, pueden poner
en marcha un procedimiento de hipermutación acelerada, en contra de
lo que se describe en los datos de la técnica anterior, según los
cuales era difícil y requería mucho tiempo poner en marcha un
procedimiento comparable.
Más concretamente, se ha encontrado
inesperadamente en la actualidad que, teniendo por modelo la célula
BL2, se puede realizar in vitro, en unas condiciones de
rapidez y de eficacia excepcionales, la inducción de mutaciones
somáticas en las células adecuadas añadiendo a las células a hacer
mutar, en las condiciones de cultivo y un medio adecuados para
dichas células, al menos una combinación ternaria de los anticuerpos
anti-CD19, anti-CD21 y
anti-IgM.
La invención también tiene por primer objeto un
procedimiento para la inducción de mutaciones somáticas in
vitro o ex vivo, que contienen 1) la adición a las
células a mutar, en condiciones de cultivo y en un medio adecuados
para dichas células, de al menos una combinación ternaria de los
anticuerpos anti-CD19, anti-CD21 y
anti-IgM, mientras que 2) dichos anticuerpos
anti-IgM se biotinilan y se someten a una agregación
específica mediante la estreptavidina unida a un soporte,
ventajosamente un soporte compuesto en su totalidad o en parte por
perlas magnéticas.
Según una característica, la inducción de
mutaciones somáticas según la invención se pone en marcha durante
poco tiempo, en la práctica durante un tiempo del orden de 1 h 30
minutos (una hora y media).
Según una característica ventajosa, el
procedimiento según la invención no comporta la realización de
cocultivos con las células de otro tipo celular, especialmente con
un linfocito T.
En efecto, se ha constatado que el procedimiento
preconizado según la invención, en el que se efectúa una agregación
específica de anticuerpos anti-IgM biotinilados por
la estreptavidina unida a un soporte tal como, preferiblemente,
perlas magnéticas así como una combinación de al menos tres
anticuerpos anti-CD19, anti-CD21 y
anti-IgM, procura in vitro una mutación
rápida de las células cultivadas en presencia de estos anticuerpos,
en un tiempo muy corto que no tiene comparación con las duraciones
indicadas para la obtención de mutaciones in vitro según la
técnica anterior.
Según una variante de realización, el
procedimiento según la invención puede comprender una combinación de
anticuerpos anti-IgM elegida entre una combinación
de los anticuerpos anti-IgM y
anti-CD19, una combinación de los anticuerpos
anti-IgM y anti-CD21 y sus mezclas
en todas las proporciones.
Según otra característica, el procedimiento
según la invención se lleva a cabo mediante la inducción de
mutaciones sobre el linfoma de Burkitt BL2.
Asimismo, la invención tiene por objeto la
utilización de este procedimiento de inducción de mutaciones
somáticas para la realización de ensayos in vitro de
hipermutagenecidad a nivel proteico y/o génico.
Según una forma de realización, esta utilización
se aplica a los linfomas B, en particular a los linfomas B humanos,
más particularmente para la inducción de mutaciones sobre el linfoma
de Burkitt BL2.
Según una forma de realización particularmente
preferida, el sistema según la invención se utiliza para la
inducción de mutaciones sobre el linfoma de Burkitt BL2 en la fase
G0/G1.
Asimismo, la invención tiene por objeto un kit
para la inducción de mutaciones somáticas, que se caracteriza porque
comprende un sistema inductor de mutaciones somáticas como el
definido más arriba.
Otro objeto de la invención es la utilización de
este kit para la identificación cualitativa y/o cuantitativa de
compuestos del mutasoma, especialmente por el análisis de las
proteínas.
En una realización, la utilización del kit según
la invención comprende la identificación de modificaciones
postraduccionales inducidas, en particular, mediante la
identificación, aislamiento y análisis de un compuesto del
mutasoma, especialmente de un compuesto proteínico, que aparece
durante dicha inducción.
Según una característica de realización
preferida, esta utilización comprende la provisión de, al menos, un
gen, especialmente un gen que codifica una proteína de interés,
sobre el cual se desea inducir mutaciones, mientras que se incluye
dicho gen en un casete que contiene el promotor y el activador
(enhancer) de los genes que codifican la cadena pesada o
ligera de las IgG, y que con dicho gen se transfectan las células
del linfoma, especialmente del linfoma de Burkitt BL2.
Según una forma de realización ventajosa, para
hacer mutar una secuencia cualquiera, se encuadra la secuencia a
mutar por el promotor y el activador de las IgG, preferiblemente, en
una casete de mutación.
La invención se describe a continuación en
referencia a un ejemplo de realización, que es puramente ilustrativo
y que pretende procurar al experto en la técnica las indicaciones
prácticas para la realización de la invención. Sobre la base de
estas indicaciones y de sus conocimientos propios, el experto en la
técnica es así apto para concebir, sin alejarse del alcance de la
presente invención, los sistemas de ensayo conformes a la invención
reivindicada.
Para la inducción de mutaciones somáticas in
vitro sobre la célula BL2, se ha procedido del siguiente
modo:
Se han proporcionado células BL2 y se han
mantenido en un medio completo a razón de 10^{5} células por
mililitro, durante 24 horas a 37ºC y al 5% de CO_{2}.
El medio de cultivo era medio RPMI 1640,
completado con FCS al 10%, así como 100 U/ml (unidades/ml) de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.
Se han lavado las células del medio RPMI, para
retirar cualquier rastro de suero, mediante centrifugación a
aproximadamente 1500 rpm durante 7 minutos, a una temperatura
comprendida entre 4ºC y 10ºC.
Se han recuperado las células BL2 en medio RPMI
a razón de 10^{6} células por 500 \mul.
En un frasco de 15 ml se han introducido
10^{6} células en hielo y se han añadido:
- \bullet
- 20 \mul de anti-CD19 unido a FITC (proporcionado por Immunotech),
- \bullet
- 20 \mul de anti-CD21 unido a la PE (proporcionado por Becton Dickinson) y
- \bullet
- 4 \mul de anti-IgM unido a biotina (proporcionado por Immunotech).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de agitar hasta obtener una mezcla
homogénea, se ha colocado ésta en hielo y se ha dejado ahí durante
unos 20 minutos.
A continuación, se han lavado las células de
esta mezcla en 10 ml de medio RPMI (a 4ºC) y luego se ha
centrifugado a 1500 rpm durante 7 min. Se han recuperado las
células lavadas así en 500 \mul de RPMI en un tubo Eppendorf (1,5
ml) y se han añadido 20 \mul de perlas magnéticas, comercializadas
bajo la denominación Dynal, que llevaban unida estreptavidina. Se ha
dejado el tubo rotando sobre una rueda a unos 4ºC durante 15
minutos.
Se han recuperado las células y las perlas a las
que se habían fijado estas células en unos 4 \mul de medio
completo más ADCM (procurado por el Centro de transfusión de Lyon,
Francia) y, a continuación, se han distribuido las células tratadas
así sobre una placa de titulación que contienen 24 pocillos por
cultivo celular (a razón de unas 2 x 10^{5} células por
pocillo).
Se han dejado incubar las células durante
aproximadamente 1 hora 30 minutos a 37ºC. A continuación, se ha
recuperado todo el contenido de un pocillo en un tubo Eppendorf de
1,5 ml y se ha centrifugado durante 10 minutos a 2000 rpm.
Se ha recuperado el producto de la
centrifugación para retirar el sobrenadante y sumergir el
precipitado de centrifugación en nitrógeno líquido.
Se han comprobado las mutaciones del ADN
mediante las técnicas moleculares clásicas, conocidas y practicadas
de forma habitual por el experto en la técnica.
El análisis de los resultados obtenidos y de los
de las investigaciones realizadas en paralelo sobre los distintos
genes de V_{H}, y/o con células distintas a BL2, muestra que se
pueden inducir así en la célula BL2 mutaciones in vitro sobre
el gen V_{H} reorganizado por la estimulación de un grupo de
receptores de superficie.
Como alternativa, se puede reemplazar la
secuencia Ig, por ejemplo, por una secuencia procariota, tal como el
gen de resistencia a la neomicina, y obtener mutaciones similares
con BL2.
Así se ha podido establecer, según la invención,
que:
- \bullet
- se pueden inducir mutaciones en aproximadamente 1 hora y 30 minutos después de la estimulación por el receptor de antígenos y en un grupo de correceptores, en ausencia de cocultivo con linfocitos T;
- \bullet
- como media, aproximadamente un tercio de las células experimentan el mecanismo de hipermutación;
- \bullet
- la mutación inducida según la invención tiene lugar en presencia de actinomicina D, que inhibe totalmente la transcripción;
- \bullet
- se inducen las mutaciones cuando se mantienen las células en la fase G0/G1 mediante hidroxiurea;
- \bullet
- asimismo, las mutaciones se inducen en aproximadamente 30 minutos cuando se preparan las células en la fase G0/G1 mediante separación por decantación.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados se contradicen con las
enseñanzas de la técnica anterior y demuestran que el procedimiento
de hipermutación puede tener lugar en ausencia de transcripción y de
cromátida hermana.
En la práctica, también se puede estudiar así en
gel bidimensional la pérdida o la aparición de las proteínas, pero
también su modificación postraduccional.
Por otro lado, las mutaciones somáticas
realizadas así según la presente invención se han podido reinducir
en las células adecuadas, tales como el linfoma de Burkitt BL2,
mediante la estimulación de los receptores de la superficie. Una
estimulación de este tipo se produce con toda probabilidad también
in vivo.
El procedimiento y los medios según la invención
permiten abordar en unas condiciones radicalmente más eficaces y
seguras los estudios y los ensayos de determinación de los fenómenos
de hiperpermutación de los genes, en particular de los genes de las
inmunoglobulinas.
A continuación se resumen algunos avances y
algunas aplicaciones que se pueden proponer debido a la realización
de los medios según la invención. Está claro que esta enumeración no
es limitante y que también se pueden contemplar otras
aplicaciones.
A modo de ejemplo, es importante que se pueda
determinar según la invención, en condiciones que no se podían
realizar hasta ahora, cuáles son el papel y la importancia de la
hipermutación somática en la transformación maligna de los
linfocitos B en el centro germinativo.
La invención, que proporciona un modelo único de
simplicidad y de rapidez para la inducción de mutaciones somáticas,
ha permitido demostrar que el procedimiento de hipermutación puede
tener lugar en ausencia de transcripción y de cromátida hermana.
También proporciona medios para la obtención del
distintivo de la hipermutación a nivel proteico y génico, que tiene
como objetivo permitir disponer de un ensayo simple, aplicable en
particular a los linfomas B humanos.
Otras cuestiones sin resolver hasta la fecha son
especialmente la del mecanismo molecular de la hipermutación y de la
posible presencia de una polimerasa muy mutágena, así como la de los
cofactores presentes.
En efecto, hay que recordar que no se conocen
los cofactores, es decir, los componentes del mutasoma que permiten
que el procedimiento de hipermutación actúe selectivamente sobre los
genes V_{H} y V_{L} reorganizados en una etapa concreta de la
respuesta inmunitaria. El sistema de ensayo según la invención
proporciona los medios fiables y rápidos para seguir la cinética de
tal procedimiento de hipermutación y para que el experto en la
técnica, sobre la base de sus conocimientos propios e ilustrado por
la presente descripción, pueda realizar ensayos rápidos y económicos
especialmente aplicables a los linfomas B humanos.
Otro objeto más de la presente invención es un
kit o conjunto de medios para la inducción de hipermutaciones y para
la realización de ensayos relativos a ello, en el que el medio para
la inducción de una hipermutación rápida comprende una combinación
de anticuerpos como la descrita más arriba.
De forma más general, la presente invención
proporciona los medios que permiten el estudio y el seguimiento de
las primeras etapas moleculares de los procedimientos de mutación
somática a nivel del ADN y de las proteínas.
Brevemente, también se puede, gracias a los
medios llevados a cabo según la invención, modificar un gen mediante
recombinación homóloga, o inactivarlo, por ejemplo en la célula
BL2. La técnica según la invención, también realizable en las
células, especialmente las células BL2, permite mejorar las
propiedades mutadoras de estas células, pero también permite
analizar la función que podría realizar tal molécula en la
fisiología de los linfocitos B y de los linfomas de Burkitt.
Llevando a cabo los medios según la invención,
se puede, por consiguiente, a modo de ejemplos no limitantes,
obtener la sobreexpresión de algunos genes en BL2 y mejorar así la
eficacia como célula mutante de ésta, mientras que la transfección
de las moléculas que parecen estar implicadas en el procedimiento
puede incluir, entre otros: AID, MSH2, MSH6 o las enzimas del tipo
RAD30A y/o RAD30B.
Las mutaciones se inducen en la fase G1 del
ciclo celular y se producen sobre una hebra del ADN del gen V_{H}
reorganizado, que se fijan mediante replicación en una de las
células hijas.
Por otro lado, los presentes inventores han
podido establecer también el papel determinante de la pol iota, que
es una ADN-polimerasa de la familia Y, en tal
procesamiento de hipermutación somática (HMS) de los genes de las
inmunoglobulinas.
Para producir los clones de BL2 deficientes en
la pol iota (que es uno de los dos homólogos humanos de RAD30 de la
levadura que presenta una actividad polimerasa muy propensa a
errores para rellenar huecos cortos en el ADN), se ha utilizado un
procedimiento de inactivación de los genes parecido al que se ha
desarrollado para la inactivación del gen de AID
(citidina-desaminansa inducida por la activación o
en inglés, Activation-induced cytidine
deaminase). La molécula de AID ha sido descrita, especialmente,
por Muramatsu, M. et al., "Class switch recombination and
hypermutation require activation-induced cytidine
deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme", Cell
102, 553-63 (2000); y Revy, P. et al.,
"Activation-induced cytidine deaminase (AID)
deficiency causes the autosomal recessive form of the
Hyper-IgM syndrome (HIGM2)", Cell 102,
565-75 (2000).
\newpage
Se han generado dos clones pol iota^{-/-} (54
y 267) a partir de un clon heterocigótico de pol iota. Se han
utilizado las construcciones adecuadas para inactivar los dos
alelos. Los dos clones iota^{-/-} tenían la misma velocidad de
proliferación que la estirpe celular de BL2 original, con un índice
mitótico y un perfil de ciclo celular similares, y no presentaban
aberraciones cromosómicas o translocaciones. No se ha detectado
ninguna expresión de pol iota en los análisis de inmunotransferencia
de los extractos celulares de los clones iota^{-/-} 54 y 267
utilizando anticuerpos policlonales de conejo inducidos contra la
pol iota humana. Se ha recuperado la expresión de la pol iota
mediante la transfección de los vectores pIRES que dirigen la
expresión del ADNc de la pol iota humana completa bajo el control
del promotor de CMV: en los experimentos realizados, las tasas de
expresión eran comparables con la observada en la estirpe de células
BL2 normales, en los límites de las variaciones inherentes en las
cuantificaciones mediante análisis de inmunotransferencia. Después
de varios intentos, no ha sido posible obtener clones que
sobreexpresan la pol iota, tanto en un contexto (background)
normal como en un contexto carente de pol iota. Para el análisis
posterior, se han seleccionado dos clones recuperados por cada
célula diana.
Se pueden utilizar dos métodos diferentes para
inducir en la estirpe celular BL2 una hipermutación de su gen
V_{H} reorganizado. El primero hace intervenir una interconexión o
reticulación del anti-IgM en cocultivo con un clon
T cooperador, o una estirpe de linfocitos T cooperadores, en cuyo
caso, las mutaciones, si se llegan a producir, se observan después
de 3 días en cultivo [véase Denépoux, S. et al., más arriba;
y Poltoratsky, V. et al., "Expression of
error-prone polymerases in BL2 cells activated for
Ig somatic hypermutation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,
7976-81 (2001)]. En los presentes ensayos, este
sistema de inducción de HMS se ha adaptado mediante la utilización
de la estirpe celular CB15, que es un linfocito T cooperador
transformado mediante el virus del herpes Saimiri, en cocultivo, y
una interconexión de IgM seguida de la agregación del anticuerpo
anti-IgM biotinilado, por perlas de estreptavidina.
El segundo método sólo hace intervenir la reticulación o una unión
cruzada de los tres receptores de superficie, IgM, CD19 y CD21, o
de una combinación de IgM y CD21 y/o IgM y CD19, seguida de la misma
agregación del anticuerpo anti-IgM biotinilado, por
perlas de estreptavidina, en cuyo caso se observaron mutaciones
solamente después de 90 minutos de incubación. La frecuencia de
mutación que surge de un solo ciclo de mutagénesis era parecida
según los dos métodos, es decir, 4 a 6 x 10^{-4} por par de bases
(véase la tabla 1 más adelante). La estirpe de células BL2 presenta
también una frecuencia muy pequeña de mutación constitutiva de su
gen V_{H} reorganizado, cuando se mantiene en cultivo, en la
práctica, que no sobrepasa las 10^{-4} mutaciones por par de base
después de 2 a 3 meses en cultivo.
No se ha observado ningún aumento detectable de
la frecuencia de mutación cuando se han inducido mediante
hipermutación los clones deficientes en pol iota 54 ó 267, tanto en
el cultivo de linfocitos T como en el ensayo con los tres
anticuerpos susodichos: sólo se han recuperado 7 mutaciones entre
298 secuencias V después de la estimulación frente a 5 entre 222
secuencias antes de la estimulación. Al contrario, la inducción de
las mutaciones se ha recuperado mediante la reexpresión del ADNc de
la pol iota en estos clones, a unos niveles comparables a los que
presentaba la BL2 normal: 83 mutaciones en 547 secuencias V después
de la estimulación frente a 6 en 547 secuencias V antes de la
estimulación. Además, el esquema de reversión de la mutación en
estos clones que expresan la pol iota era similar al esquema de
mutación de BL2, con una acción específica sobre los pares de bases
GC y una propensión a las transiciones (véase la tabla 2). Como para
la BL2 normal, el gen C\mu de los clones con la pol iota
restaurada no parece sufrir mutaciones selectivas después de la
inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Otro objeto de la invención es la utilización de
la ADN-polimerasa iota para el ajuste de la
hipermutagenecidad en los ensayos in vitro de la
hipermutagenecidad a nivel proteico y/o génico, en particular sobre
los linfomas B, especialmente el linfoma de Burkitt BL2.
Otro objeto más de la invención es la
utilización de una ADN polimerasa iota mejorada, especialmente
restaurada después de cambiar, al menos, uno de sus aminoácidos
naturales, según las técnicas que conoce el experto en la técnica,
para aumentar la hipermutagenecidad en tales ensayos. Según la
invención, esta mejora de la pol iota se efectúa ventajosamente
mediante mutagénesis al azar del dominio II anular ("Ring
Finger") para reemplazarle, al menos, un aminoácido y,
luego, restaurar las funciones de la enzima.
La invención tiene como otro objeto un kit para
inducir mutaciones somáticas como las descritas más arriba, que
contienen además los medios para inactivar el gen pol iota y/o para
restaurarlo mediante la expresión del ADNc de la pol iota.
La identificación de esta contribución de pol
iota se ilustra con más detalle, a continuación, en la parte
experimental.
Se ha inducido una hipermutación del gen V según
dos modos operativos diferentes. Con el primer modo operativo, se
han efectuado interconexiones de los receptores de superficie IgM,
CD19 y CD21 conforme al protocolo descrito más arriba. El segundo
modo de activación se basaba en un cocultivo con la estirpe celular
CB15, que es una estirpe de linfocitos T cooperadores transformados
mediante el virus del herpes Saimiri. Se ha cultivado la CB15 en el
medio RPMI 1640 (Invitrogen), complementado con 10% de suero bovino
fetal (Hyclone), penicilina/estreptomicina (Invitrogen) y 50
unidades/ml de IL2 (Sigma). Se ha irradiado la CB15 a 4000 rads, se
ha resuspendido en un medio completo más el 2% de Caryoser (CTS,
Lyon) y se ha depositado a razón de 500.000 células por pocillo en
placas de 24 pocillos o alvéolos que se habían recubierto durante
una noche con anti-CD3 (OKT3,
Janssen-Cilag, 2,5 \mug/pocillo). Se han incubado
2 x 10^{6} células BL2 en 0,5 ml de RPMI durante 20 minutos sobre
hielo con un anticuerpo anti-IgM biotinilado (0,6
mg/ml, Caltag Laboratories) y, luego, se ha reticulado con perlas
magnéticas conjugadas con estreptavidina (Dynabeads M280, Dynal),
durante 20 minutos, sobre una bandeja giratoria y a temperatura
baja. Se ha resuspendido la BL2 a razón de 100.000 células/ml en
medio RPMI completado con el 2% de Caryoser, y se han depositado
0,5 ml por pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene CB15
irradiada y anti-CD3 (en una proporción BL2:CB15 de
1:10). Se han recogido las células después de 3 días de incubación
a 37ºC, se ha extraído el ADN por medio de un kit adecuado,
denominado kit de tejidos DNeasy (Qiagen), y se han analizado las
mutaciones después de la amplificación del gen
V4-39-JH5. Se han identificado las
mutaciones mediante alineamientos múltiples de electroferogramas y
la utilización de la aplicación AutoAssembler (Applera).
La secuencia genómica de la pol iota humana se
ha recogido a partir del clon HTGS de 180 kb AC021325, que contiene
todos los exones codificantes. Los fragmentos de ADN utilizados para
generar las construcciones de acción selectiva se han amplificado a
partir del ADN genómico de BL2 y se han clonado primero con el kit
de clonación para PCR TOPO-XL (Invitrogen), se han
escindido por medio de SalI y de XhoI si sus sitios
estaban añadidos a los cebadores de PCR, o bajo la forma de
fragmentos MluI-NotI si los sitios de restricción no
se habían perdido, y se han clonado en los sitios correspondientes
de un vector pBSK (Stratagene) al que se habían añadido los sitios
SfiI y MluI en el sitio SacI de su
policonector. Los genes de resistencia a la neomicina o a la
higromicina se han insertado entre los fragmentos que enmarcan 5' y
3'. Se han utilizado los cebadores de PCR siguientes para la
amplificación:
Se han utilizado las polimerasas Pfu
turbo (Stratagene) para la amplificación del fragmento 5' de la
primera construcción y Herculase (Stratagene) para el fragmento 3'
de la segunda construcción (30 s a 94ºC, 30 s a 62ºC y 12 min a
68ºC durante 40 ciclos), el sistema de PCR Expand Long Template PCR
System (Roche) para el fragmento 3' de la primera construcción (40
ciclos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que
comprenden un incremento en el tiempo de elongación), y el kit de
PCR Advantage 2 PCR Kit (Clontech) para el fragmento 5' de la
segunda construcción (30 s a 94ºC, 30 s a 64ºC y 4 min a 68ºC). Se
ha efectuado la transfección de 30 \mug de construcciones
linalizadas por NotI o MluI tal y como se describe en
Bertocci, B. et al., Immunity 9, 257-65
(1998). El cribado de los clones diana del gen se ha efectuado
mediante PCR sobre lotes de 10 clones con los cebadores siguientes
situados en el exterior de la construcción y en el interior del gen
de resistencia a la neomicina o a la higromicina:
Para el primer alelo, se ha obtenido la
recombinación homóloga en un clon entre 518 transfectantes.
Para el segundo alelo, 2 clones entre 535
estaban modificados selectivamente de forma correcta.
Se ha atribuido esta poca frecuencia a la
utilización de enzimas de PCR con una fidelidad mediocre para
construir los vectores de acción selectiva. Se ha observado tal
actividad de polimorfismo específica de una cepa sobre la
recombinación homóloga en las células ES murinas, donde se ha
comprobado que una diferencia de secuencia del 0,6% ha dado lugar a
una división por 50 de la eficacia de la acción selectiva. También
las otras inactivaciones de genes efectuadas después sobre BL2 con
las construcciones amplificadas solamente con la
ADN-polimerasa Pfu turbo (Stratagene), que
es una enzima cuya frecuencia de error es inferior a 10^{-4} por
par de bases en las condiciones de amplificación utilizadas, han
dado una frecuencia de acción selectiva en el intervalo del 1% al
2%.
Los clones deficientes en pol iota se han
transfectado con los vectores de expresión de pol iota y se han
construido mediante amplificación de un ADNc de pol iota humano de
longitud completa [McDonald, J. P. et al., Genomics 60,
20-30 (1999)] con los cebadores siguientes:
(se ha subrayado el sitio de
BamHI), en el sitio BamHI del vector pIRES puro
(Invitrogen). La transfección y la selección de los clones se ha
efectuado según las técnicas clásicas, que conoce el experto en la
técnica, tal y como se describe más
arriba.
Los análisis de inmunotransferencia se han
realizado de la manera tradicional con los anticuerpos policlonales
contra pol iota (péptido KLH-conjugado
15-mero, en el extremo carboxilo).
Además, se ha comprobado que se puede mejorar
aún más la pol iota según las técnicas que conoce el experto en la
técnica (véase especialmente la técnica de Prakash), puestas a punto
para la enzima pol eta, que posee como pol iota un dominio II anular
("Ring Finger") en el cual se puede hacer mutar, mediante una
mutagénesis al azar de dicho dominio II, al menos un aminoácido
presente en este dominio "Ring Finger", que tiene por resultado
un aumento significativo de la actividad de la enzima mutada de esta
manera.
La invención también tiene por objeto un kit
para la inducción de mutaciones somáticas como las descritas más
arriba, que contienen una enzima pol iota mejorada así mediante
mutagénesis al azar de su dominio II anular para cambiarle, al
menos, un aminoácido que tiene por resultado mejorar el
funcionamiento y, luego, la restauración de la enzima mediante
medios tales como los indicados más arriba.
Este sistema, en sus diversas variantes de
realización expuestas más arriba, permite también especialmente
identificar las mutaciones necesarias para mejorar las funciones de
una proteína de interés. Por ejemplo, en el caso ilustrativo y no
limitante del gen que codifica la insulina, colocado en un casete
promotor-activador transfectado en BL2, puede
producir numerosas moléculas, entre las cuales la que funcione mejor
se fijará preferiblemente sobre su sustrato. Procediendo a
continuación a la secuenciación del gen mutado que codifica esta
proteína preferente y a la identificación, por los medios conocidos,
de los aminoácidos modificados que han permitido esta mejora del
funcionamiento, las mutaciones que permiten obtener una insulina más
eficaz se pueden identificar muy rápidamente mediante el
procedimiento según la invención.
Claims (20)
1. Procedimiento para la inducción de mutaciones
somáticas in vitro, caracterizado porque comprende 1)
añadir a las células a hacer mutar, en las condiciones de cultivo y
en un medio adecuados para dichas células, al menos una combinación
de anticuerpos que comprende los anticuerpos
anti-IgM elegida entre una combinación de
anticuerpos anti-IgM y anti-CD19,
una combinación de anticuerpos anti-IgM y
anti-CD21 y una combinación de anticuerpos
anti-IgM, anti-CD19 y
anti-CD21, mientras que 2) dichos anticuerpos
anti-IgM se biotinilan y se someten a una agregación
específica gracias a la estreptavidina unida a un soporte.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho soporte se compone en su totalidad
o en parte de perlas magnéticas.
3. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se utiliza el
linfoma de Burkitt BL2 para las células a hacer mutar.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende además
la etapa que consiste en hacer variar la tasa de la
ADN-polimerasa iota.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se recupera la
ADN-polimerasa iota previamente inactivada, mediante
transfección de los vectores pIRES que conducen a la expresión del
ADNc de la pol iota completa bajo el control del promotor de
CMV.
6. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la realización de
ensayos in vitro de hipermutagenicidad a nivel proteico y/o
génico.
7. Utilización según la reivindicación 6,
caracterizada porque se aplica a los linfomas B, en
particular a los linfomas B humanos.
8. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque se destina a la inducción de mutaciones
en el linfoma de Burkitt BL2.
9. Utilización según la reivindicación 8,
caracterizada porque se pretende la inducción de mutaciones
sobre el linfoma de Burkitt BL2 en la fase G0/G1.
10. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque comprende además
la utilización de la ADN-polimerasa iota para
ajustar la hipermutagenicidad en los ensayos in vitro de la
hipermutagenicidad a nivel proteico y/o génico, en particular en los
linfomas B, especialmente el linfoma de Burkitt BL2.
11. Utilización según la reivindicación 10,
caracterizada porque se pone en funcionamiento una
ADN-polimerasa iota con el reemplazo de al menos un
aminoácido en el dominio II Ring finger.
12. Utilización de un kit que contiene los
medios para la inducción de mutaciones somáticas que comprenden, al
menos, una combinación de anticuerpos que contienen los anticuerpos
anti-IgM elegida entre una combinación de
anticuerpos anti-IgM y anti-CD19,
una combinación de anticuerpos anti-IgM y
anti-CD21 y una combinación de anticuerpos
anti-IgM, anti-CD19 y
anti-CD21, para la inducción de mutaciones
somáticas, in vitro.
13. Kit para utilización según la reivindicación
12, caracterizado porque dichos anticuerpos
anti-IgM están biotinilados y se han sometido a una
agregación específica gracias a la estreptavidina unida a un
soporte, especialmente a perlas magnéticas, mientras que el kit
comprende una combinación ternaria de los anticuerpos
anti-IgM, anti-CD19 y
anti-CD21.
14. Kit para la utilización según una de las
reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque comprende
además los medios para la inactivación del gen de la pol iota y/o
para la restauración de éste mediante la expresión del ADNc de la
pol iota.
15. Kit según la reivindicación 14,
caracterizado porque comprende una
ADN-polimerasa iota con el reemplazo de al menos un
aminoácido en el dominio II Ring finger.
16. Utilización según la reivindicación 12, para
la identificación cualitativa y/o cuantitativa de compuestos del
mutasoma, especialmente para el análisis de las proteínas.
17. Utilización según la reivindicación 16,
caracterizada porque comprende la identificación, las
modificaciones postraduccionales inducidas, en particular mediante
la identificación, aislamiento y análisis de un compuesto del
mutasoma, especialmente de un compuesto proteínico, que aparece
durante dicha inducción.
18. Utilización según la reivindicación 16,
caracterizada porque comprende la provisión de al menos un
gen, especialmente un gen que codifica una proteína de interés,
sobre el cual se desea inducir mutaciones, mientras que dicho gen
está incluido en un casete que contiene el promotor y el activador
(enhancer) de los genes que codifican la cadena pesada o
ligera de las IgG, y que con dicho gen se transfectan células de
linfoma, especialmente del linfoma de Burkitt BL2.
19. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada por hacer mutar una
secuencia cualquiera, encuadrándose la secuencia a hacer mutar por
el promotor y el activador de las Ig, preferiblemente en un casete
de mutación.
20. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque, para hacer
mutar una secuencia cualquiera, se introduce esta secuencia mediante
recombinación homóloga en el locus de las inmunoglobulinas,
reemplazando todo o parte del gen V de uno de los dos loci
reorganizados.
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