ES2278596T3 - Composiciones y procedimientos para la terapia genica intraductal. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento in vitro o ex vivo para la transducción selectiva de una célula mioepitelial en una población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales mezcladas, que comprende el paso de poner en contacto una célula mioepitelial con un vector vírico adeno-asociado recombinante que transduce la célula a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por la célula.

Description

Composiciones y procedimientos para la terapia génica intraductal.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de vectores específicos para células tanto en el diagnóstico como en el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades de la mama, en particular del cáncer.
Antecedentes
Los cánceres de mama son una de las principales causas de muerte entre las mujeres, el desarrollo de cáncer de mama en mujeres presenta una incidencia acumulada de 1 cada 9. En consecuencia, para los profesionales de la salud es de gran interés entender los orígenes de estos desórdenes, así como la identificación de nuevas modalidades terapéuticas.
La mama humana adulta comprende de seis a nueve conductos principal es que proceden del pezón, se ramifican en conductos y terminan en estructuras lóbulo-alveolares (Russo et al., Lab. Invest. 62(3): 244-278 (1990)). La red ramificada de conductos está compuesta de células epiteliales del lumen en una matriz de soporte de tejido conectivo y células mioepiteliales. Los tejidos que se extirpan de las mamas humanas femeninas durante la cirugía y las autopsias han sido examinados en muchos estudios sobre la naturaleza y lugar de origen del crecimiento neoplásico. El amplio muestreo y la confirmación histológica han permitido la caracterización patológica de mamas completas, que muestran que el cáncer humano de mama surge en el sistema ductal de la mama exclusivamente a partir de las células epiteliales del lumen. El origen ductal está apoyado por la presencia de otras proliferaciones epiteliales más extensas, presumiblemente preneoplásicas, en mamas cancerosas extirpadas quirúrgicamente en comparación con mamas no cancerosas extirpadas en autopsias.
Debido a la significativa incidencia acumulada de desarrollo de cáncer de mama en mujeres existe una necesidad urgente de desarrollar tanto métodos terapéuticos de tratamiento que sean más efectivos, menos invasivos y que estén acompañados de menos efectos secundarios, así como métodos profilácticos de tratamiento que sean más efectivos que no solo el incremento y la intensificación del seguimiento físico y mucho menos extremos que la mastectomía radical. Los métodos profilácticos aún están limitados al seguimiento físico y a la mastectomía profiláctica a pesar del reciente descubrimiento del locus de susceptibilidad hereditaria al cáncer de mama, que incluye el BRCA1 y otros genes (ver, por ejemplo, Miki et al., Science 266:66-71 (1994)), y de la mejora de la capacidad de los médicos de identificar mujeres con un riesgo elevado de desarrollar cáncer.
En vista de lo anterior, en el campo de la técnica se necesita la identificación de nuevos métodos que contribuyan a la prevención y el tratamiento de los cánceres de glándula mamaria. En este contexto, los métodos óptimos son aquellos que tienen un amplio espectro de aplicación tanto en la diagnosis del cáncer, como en el tratamiento terapéutico y profiláctico del cáncer.
Resumen de la invención
La presente invención se basa en las observaciones de los respectivos roles de los linajes celulares epiteliales y mioepiteliales en el desarrollo del cáncer de mama y en el hecho de que estos tipos celulares expresan diferencialmente productos genéticos que pueden ser dianas para vectores específicos celulares. En este contexto, surgen nuevas estrategias que pueden utilizarse como medio para la diagnosis del carcinoma de mama, su profilaxis y su tratamiento. Una primera estrategia es intervenir selectivamente en células del epitelio de la mama de manera que no se desarrolle el carcinoma de mama. Una segunda estrategia consiste en intervenir en las células mioepiteliales como medio de refuerzo de la defensa mioepitelial de manera que, incluso si se desarrolla un carcinoma ductal "in situ" (DCIS), este quedará recluido en el sistema ductal indefinidamente.
El presente documento describe métodos terapéuticos y profilácticos para tratar una enfermedad del epitelio ductal de la glándula mamaria, en particular cáncer. En este contexto, la presente invención proporciona métodos in vitro y ex vivo dirigidos a la transducción selectiva de una célula en un sistema ductal de una glándula mamaria que comprenden la etapa de utilizar la canulación ductal para poner en contacto selectivamente la célula con un vector que es específico para esa célula. En una realización ilustrativa, la invención consiste en un procedimiento para la transducción selectiva de una célula mioepitelial, poniendo en contacto la célula con un vector específico para una molécula de proteoglicano heparán sulfato que se expresa en la célula mioepitelial.
En una realización específica de la invención, el vector es un virus adeno-asociado recombinante que es específico para una molécula expresada por una célula mioepitelial y que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer en las células epiteliales. En una realización específica, el polipéptido del virus adeno-asociado recombinante inhibe la angiogénesis o la proliferación, la invasión o la metástasis de una célula epitelial. En una realización concreta, el polipéptido es maspina, trombospondina-1, TIMP-1, proteasa nexina-II, \alpha-1 antitripsina o el receptor soluble bFGF. En una realización más preferida, el virus adeno-asociado recombinante contiene un elemento cis, por ejemplo un promotor lactoalbumínico y el promotor MUCI que estimula la replicación del virus adeno-asociado recombinante en presencia de un factor trans presente en la célula epitelial.
El documento describe un método para tratar profilácticamente el epitelio ductal de una glándula mamaria contra el cáncer, el método comprende el paso de poner en contacto, mediante canulación ductal, el epitelio ductal de la glándula mamaria con un vector específico para el tejido de manera que se inhiba la formación del cáncer originado en el epitelio ductal. Además, el documento describe métodos terapéuticos/profilácticos combinados para tratar terapéuticamente la glándula mamaria mediante cirugía, radiación y/o quimioterapia y, ya sea concomitantemente o posteriormente, poniendo en contacto el epitelio ductal de la glándula mamaria con un vector específico para células que sea específico para una célula mioepitelial.
El documento también describe un procedimiento para determinar el linaje de una célula en un sistema ductal en una glándula mamaria seleccionada del grupo que consiste en una célula epitelial del lumen y una célula mioepitelial, mediante la utilización de la canulación ductal para poner en contacto la célula con el vector que contiene un gen reportero, donde el vector es específico para una molécula que se expresa en la célula epitelial o en la célula mioepitelial.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un esquema que muestra la unidad ductal-lobular de la mama e ilustra la posibilidad de estrategias de terapia génica específicas para las células epiteliales y/o las células mioepiteliales.
La Figura 2A es una fotografía que ilustra la viabilidad del acceso a la totalidad del sistema ductal de la mama mediante la identificación de los conductos del pezón y la canulación.
La Figura 2B, una fotografía que muestra que cuando los conductos del pezón se canulan individualmente, un tinte inyectado alcanza cada uno de los orificios ductales.
La Figura 3A es una fotografía que muestra la ausencia de expresión de la \beta-galactosidasa en células mioepiteliales que han sido puestas en contacto con un adenovirus recombinante (Ad2) que contiene una \beta-galactosidasa para ilustrar cómo la expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales en la unidad ductal-lobular de la mama permite la especificidad selectiva para las células epiteliales y cómo la ausencia de CAR en las células mioepiteliales proporciona resistencia a esta célula contra la infección adenoviral.
La Figura 3B es una fotografía que muestra la intensa expresión de la \beta-galactosidasa en células epiteliales que han sido puestas en contacto con un adenovirus recombinante que contiene una \beta-galactosidasa para ilustrar cómo la expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales en la unidad ductal-lobular de la mama permite la especificidad selectiva para las células epiteliales.
La Figura 3C es una fotografía que muestra cómo la expresión de CAR está totalmente ausente en las células mioepiteliales (banda debajo de CAR) pero está presente en las células del epitelio ductal y en otras líneas de carcinoma (otras bandas).
La Figura 4A es una fotografía que muestra la expresión del gen reportero en las células mioepiteliales que han sido puestas en contacto con un virus adeno-asociado recombinante que contiene un gen reportero humano de fluorescencia verde que ilustra cómo la expresión del proteoglicano heparina sulfato en la superficie de las células mioepiteliales de la unidad ductal-lobular de la mama permite la especificidad selectiva para las células mioepiteliales.
La Figura 4B es una fotografía que muestra únicamente la expresión del gen reportero en células epiteliales puestas en contacto con un virus adeno-asociado recombinante que contiene un gen reportero humano de fluorescencia verde que ilustra cómo la expresión del proteoglicano heparina sulfato en la superficie de las células mioepiteliales en la unidad ductal-lobular de la mama permite la especificidad para las células mioepiteliales.
La Figura 5 es una transferencia Southern de ADN cortado con Hinf I y sondado utilizando la sonda multi-locus Jefferys (33,6) y muestra los patrones distintos e identificativos de un número de líneas celulares mioepiteliales ilustrativas y los xenoinjertos descritos en el presente documento (HMS-1, HMS-X, HMS-3, HMS-3X, HMS-4X). Todas las líneas celulares mioepiteliales y los xenoinjertos mostraron la misma susceptibilidad a la transfección viral con el adenovirus recombinante asociado y la misma resistencia a la transfección adenoviral. Otras líneas celulares mioepiteliales y xenoinjertos (HMS-5X, HMS-6X, HMS-5, HMS-6) no mostrados presentan las mismas
propiedades.
La Figura 6 es una transferencia sourthern de ADN escindido con Hae III y sondado mediante la sonda multi-locus Jefferys (33,6) y muestra los patrones distintos e identificativos de un número de líneas celulares mioepiteliales ilustrativas y los xenoinjertos descritos en el documento (HMS-1, HMS-X, HMS-3, HMS-3X, HMS-4X). Todas las líneas celulares mioepiteliales y los xenoinjertos mostraron la misma susceptibilidad a la transfección viral con el adenovirus recombinante asociado y la misma resistencia a la transfección adenoviral. Otras líneas celulares mioepiteliales y xenoinjertos (HMS-5X, HMS-6X, FD4S-5, HMS-6) no mostrados presentan las mismas propiedades.
La Figura 7 es un gráfico de barras que compara la invasión de las células MDA-MB-231 de carcinoma de mama en Matrigel en presencia de células no mioepiteliales (control), de células mioepiteliales HMS (HMS), de células mioepiteliales HMS transfectadas con rAAV (rAAV-maspina-HMS). Los resultados demuestran que las células mioepiteliales que sobreexpresan maspina son muy efectivas bloqueando la invasión de las células de carcinoma en Matrigel. Particularmente, el efecto de los clones mioepiteliales transfectados que expresan la maspina recombinante provocó un 200% de incremento de la inhibición de la invasión en los ensayos de inhibición de la invasión.
Descripción detallada de la invención Definiciones
El término "transducir" se utiliza en su sentido más amplio y se refiere a un proceso en el que un vector entra en el interior de una célula de manera que los polinucleótidos del vector se liberan en la célula.
El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control apropiadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un punto de unión ribosómico. Es conocido que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.
El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se relaciona de manera funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN correspondiente a una presecuencia o guía secretora se une operativamente al ADN correspondiente a un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si esta influye en la transcripción de la secuencia; o un punto de unión ribosómico se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se posiciona de tal manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" implica que las secuencias de ADN que se relacionan son contiguas y, en el caso de una guía secretora, contiguas y en fase para la lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace puede lograrse mediante la unión en las dianas de restricción apropiadas. Si tales dianas no existen, los adaptadores sintéticos oligonucleotídicos o los conectores pueden usarse según la práctica convencional.
"Polinucleótido" y "ácido nucleico" se refiere a moléculas de cadena simple o doble que pueden ser ADN, comprendiendo las bases nucleotídicas A, T, C y G, o ARN, comprendiendo las bases A, U (en lugar de T), C, y G. El polinucleótido puede ser una cadena codificante o su complementaria. Las moléculas de polinucleótido pueden ser idénticas en secuencia a la secuencia que se encuentra de manera natural o puede incluir codones alternativos que codifican el mismo aminoácido tal como se encuentra en la secuencia en forma natural (ver, Lewin "Genes V" Oxford University Press Chapter 7, pp. 171-174 (1994)). Además, las moléculas de polinucleótido pueden incluir codones que representen las sustituciones conservativas de los aminoácidos tal y como se describe. El polinucleótido puede ser ADN genómico o ADNc.
"Polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de aminoácidos que corresponden a aquellos codificados por una secuencia de polinucleótidos natural. El polipéptido puede incluir sustituciones conservativas en las que el aminoácido presente de forma natural sea reemplazado por otro con propiedades similares, donde tales sustituciones conservativas no alteran la función del polipéptido (ver, Lewin "Genes V" Oxford University Press Chapter 1, pp. 9-13 (1994)).
Las estrategias de terapia génica descritas en el presente documento se basan en la destrucción selectiva de la célula epitelial de la mama (donde surgen los cánceres) y/o en la potenciación de las funciones de las células mioepiteliales (que son supresores naturales del cáncer). La presente invención se basa en las observaciones de los diferentes papeles que juegan los linajes celulares del epitelio y mioepitelio ductal en el desarrollo del cáncer de mama y en el hecho de que estos tipos celulares expresan diferencialmente productos génicos que pueden ser dianas para vectores específicos de células. En este contexto, surgen nuevas estrategias que pueden utilizarse como medio para la diagnosis del carcinoma de mama, su profilaxis y su tratamiento. Una primera estrategia es transducir selectivamente células epiteliales del lumen de manera que no se desarrolle el carcinoma de mama. Una segunda estrategia consiste en transducir células mioepiteliales como un medio de reforzar la defensa mioepitelial de manera que incluso si se desarrolla un DCIS, este quede confinado en el sistema ductal indefinidamente.
La presente invención se beneficia de la observación de que el cáncer de mama temprano puede tomarse como una enfermedad del sistema ductal que surge del epitelio ductal y de que el cáncer de mama humano surge en el sistema ductal de la mama exclusivamente a partir de células epiteliales que están localizadas en los conductos mamarios. A lo largo de la presente descripción, las células epiteliales de los conductos mamarios son denominadas con varios nombres aceptados en el campo de la técnica, por ejemplo células epiteliales ductales, células epiteliales acinares, células epiteliales del lumen, etc. (ver, por ejemplo Virchows et al., Arch. 391(1): 45-51 (1981); Cristov et al., Am. J. Pathol. 138(6): 1371-7 (1991); Lochter, Biochem. Cell Biol. 76(6): 997-1008 (1998); Lakhani et al., I. Pathol. 189(4): 496-503 (1999)). Las diferentes denominaciones se utilizan con el objetivo de dar claridad en el contexto en el que se utilizan y todas se refieren a células epiteliales que pueden ser selectivamente transducidas mediante vectores que son específicos para el CAR que expresan estas células. Preferiblemente, dichas células residen en el sistema ductal de la mama. Cuando el cáncer queda confinado en dicho sistema se denomina carcinoma ductal in situ o DQS. Recientes pruebas sugieren que los determinantes de la progresión del DCIS a cáncer invasivo son más de carácter epigenético que de carácter genético y consiste en una intensa regulación de la paracrina a causa de la vecindad de células mioepiteliales (T. Kuukasjarvi et al. (1997) Am. J. Pathol., 150:1465-1471). Las células mioepiteliales son células que rodean este sistema ductal y mantienen confinado el cáncer en desarrollo denominado carcinoma ductal in situ (DCIS). A causa de su proximidad, se espera que las células mioepiteliales ejerzan una importante influencia paracrinal en la progresión del DCIS. Las células mioepiteliales cumplen este cometido mediante la producción y secreción de varios inhibidores proteinasa.
Las células mioepiteliales de la mama difieren en varios aspectos de las células ductales del lumen y de las células epiteliales acinares: carecen de la expresión del receptor hormonal común, ER-1, y de sus genes de respuesta tales como el PR; están localizadas al lado de la membrana basal y contribuyen a la síntesis de esta estructura; raramente se transforman o proliferan y cuando lo hacen, sólo aparecen neoplasmas benignos de grado leve (M.D. Sternlicht y S.H Barsky (1997) Medical Hypotheses, 48:37-46). Las células mioepiteliales son omnipresentes en los conductos normales, en las proliferaciones benignas tales como la adenosis y en las proliferaciones precancerosas, por ejemplo en DCIS. Estos estudios acumulativos sugieren que el DCIS es un cáncer de mama en todo el sentido genético, biológico y clínico de la palabra, pero limitado en los confines del sistema ductal por las células mioepiteliales. Tanto las células mioepiteliales como las células epiteliales pueden ser dianas para la terapia génica ductal ya que se pueden identificar vectores específicos que sean específicos selectivamente para cada uno de los tipos de célula.
Los descubrimientos descritos en este documento permiten aproximaciones específicas a la terapia génica para llevar a cabo las estrategias discutidas arriba. Un primer descubrimiento es la posibilidad de tener acceso a la totalidad del sistema ductal de la mama a través de la identificación y la canulación de los conductos del pezón. Un segundo descubrimiento es que las células epiteliales ductales primarias de la mama expresan el receptor coxsackievirus-Ad (CAR, ver por ejemplo, J. Bergelson et al. (1997) Science 275:1320-1323) y se transducen fácilmente con vectores que tienen acceso al interior de la célula a través del canal mediado por CAR (como ciertos grupos de adenovirus) considerando que las células mioepiteliales carecen de CAR y son completamente resistentes a la transducción mediante vectores que son específicos para esta molécula. Tal como se ilustra en la Tabla I a continuación, un tercer descubrimiento es que las células mioepiteliales no expresan CAR y, en cambio, expresan el proteoglicano heparán sulfato en la superficie de la célula (ver, por ejemplo, Summerford et al., J.Virol. 72(2), 1438-1445 (1998)) y se transducen fácilmente con vectores tales como el rAAV, que acceden al interior de la célula a través del canal mediado por el proteoglicano heparán sulfato considerando que las células epiteliales ductales no expresan este proteoglicano y son resistentes a la transducción mediante vectores que son específicos para esta molécula. Estos descubrimientos están apoyados por varios experimentos con xenoinjertos mioepiteliales y líneas celulares establecidas (tanto inmortalizadas como en un episodio limitado de corta duración), que además demuestran la selectividad del rAAV para la diana mioepitelial.
La Tabla 1 muestra un alto contenido de proteoglicano heparán sulfato en la superficie celular de células mioepiteliales (HMS-1)
1
Todos los datos representan valores medios obtenidos a partir de dos o más determinaciones sobre la misma muestra. El ácido urónico se midió en microgramos por miligramo de tejido (peso seco) y en microgramos por microgramo de ADN. CS, sulfato de condroitina; HA, ácido hialurónico; HS Sulfato de heparán; DS, Sulfato de dermatán; KS, sulfato de queratina; no determinado.
Los descubrimientos descritos en el presente documento ilustran la posibilidad de que, utilizando una aproximación ductal y vectores virales específicos para células tal como rAD, se intervenga selectivamente y se destruya el epitelio mamario in vivo mientras que el mioepitelio subyacente se preserve. Además, estos descubrimientos ilustran la posibilidad de, utilizando la aproximación intraductal y diferentes vectores virales específicos como el rAAV, que son específicos para el mioepitelio in vivo, con un vector que contiene una molécula capaz de inhibir el crecimiento de las células epiteliales del lumen y la invasión como un medio de apoyar los efectos supresores de estas células. Adicionalmente, estos descubrimientos permiten la utilización de genes reporteros que contienen rAd y rAAV deficientes en la replicación para estudios de diagnóstico que evalúan la expansión de un tipo celular específico. Mientras que varias de las realizaciones de los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para el tratamiento de cualquier glándula exocrina, son particularmente útiles en el tratamiento de la glándula mamaria.
Los procedimientos descritos en el presente documento superan varias de las limitaciones de los procedimientos conocidos en el campo de la técnica. Concretamente, cuando una variedad de vectores (por ejemplo, vaccina, sindbis y ciertos vectores adenovirales y retrovirales) exhiben un amplio tropismo tisular y se utilizan para transducir varios linajes celulares incluyendo células epiteliales y mioepiteliales, la amplia especificidad de estos vectores incluso puede llegar a limitar su utilidad. En particular, aunque los vectores que presentan un amplio tropismo tisular están favorecidos en ciertas circunstancias, esta propiedad es una desventaja en situaciones donde es deseable transducir selectivamente un linaje celular específico que está presente en una población de diferentes linajes celulares mezclados. Por ejemplo, los técnicos que utilizan in vivo vectores con un amplio tropismo tisular pueden verse obligados a utilizarlos únicamente en circunstancias donde una respuesta inmunológica rápida del hospedador evite que escapen del medio en el que han sido introducidos. Los vectores y los procedimientos descritos en el presente documento superan tales problemas permitiendo al experto transducir selectivamente un linaje concreto (tal como células epiteliales o mioepiteliales) que está presente en una población de células de diferentes linajes mezclados. Concretamente, los procedimientos que utilizan vectores que transducen selectivamente un linaje específico restringen la capacidad de tales vectores para acceder al interior de las células de diferentes linajes próximos (los cuales no están transducidos por el vector), y en consecuencia inhibir la salida de tales vectores del medio en el que se han introducido.
Vectores que transducen selectivamente células epiteliales
Una característica significativa de los procedimientos descritos en el documento es la identificación y la utilización de vectores específicos para células que tienen la capacidad de transducir selectivamente células epiteliales y no transducir células mioepiteliales. Concretamente, ya que estos vectores acceden al interior de la célula diana a través de una molécula que se expresa en las células epiteliales pero no en las mioepiteliales, éstos pueden utilizarse para transducir selectivamente células epiteliales en una población de células epiteliales y mioepiteliales mezcladas.
Pueden utilizarse varios vectores diferentes que acceden al interior de células a través de la molécula de CAR para transducir selectivamente las células epiteliales. Las cepas de los virus coxsakie B (tales como coxsakie B3 y R4) entran, por ejemplo, en las células a través de los canales mediados por CAR (ver, por ejemplo, Bergelson et al., J.Virol. 72(1), 415-419 (1998)). Por lo tanto, los vectores víricos coxsackie pueden utilizarse para transducir selectivamente una célula epitelial en un sistema ductal de una glándula mamaria que expresa moléculas CAR. Además, ciertos subgrupos de adenovirus también acceden al interior de la célula a través de CAR. En particular, todos los serotipos de los subgrupos A (por ejemplo, Ad12), C (por ejemplo, Ad1, Ad2, Ad5 y Ad6), D (por ejemplo, Ad9, Ad15, Ad30 y Ad37), E (por ejemplo, Ad4), y F (por ejemplo, Ad40 y Ad41) utilizan CAR como receptor celular fibroso (ver, por ejemplo, Roelvink et al., J. Virol. 72(10): 7909-7915 (1998)).Sin embargo, es importante indicar que los adenovirus pueden ser específicos para diferentes moléculas que se expresan en las células diana y que no todas las cepas de adenovirus pueden utilizarse para transducir selectivamente células epiteliales que expresen CAR (ver, por ejemplo, Nalbantoglu et al., Hum. Gene Ther. 10(6): 1009-1019 (1999)). Por ejemplo, los adenovirus del subgrupo B (por ejemplo, Ad3, Ad7 y Ad35) parecen interactuar con las células diana a través de un receptor celular distinto a CAR y pueden no funcionar en los procedimientos descritos (ver, por ejemplo, Stevenson et al., J. Virol. 69(5): 2850-2857 (1995)). Así, es importante establecer que cualquier vector (adenovirus u otros) utilizados en los procedimientos descritos pueden transducir selectivamente células epiteliales mientras no transduzcan las células mioepiteliales próximas.
Adicionalmente a los vectores con un tropismo natural hacia CAR, es conocido en la técnica que se pueden construir una amplia variedad de vectores específicos para una molécula concreta, como es CAR, de una célula. En particular, la especificidad para la célula diana de los vectores de inserción puede proporcionarse mediante la incorporación de un dominio de unión específico para la célula diana mediante la utilización de cualquier dominio de unión, que se una específicamente a un punto de unión de la célula diana (ver, por ejemplo, Patente U.S. N° 5,834,589). Ya que se ha identificado el CAR que se une con los residuos de las proteínas fibrosas adenovirales (ver, por ejemplo, Santis et al., J. Gen. Virol. 80(Pt 6): 1519-1527 (1999)) y ya que la actividad de unión de CAR con adenovirus se ha localizado en el dominio amino terminal relacionado con IgV de la molécula, el experto en la materia puede preparar vectores específicos para este dominio de enlace.
Tal como se indica arriba, ciertos vectores virales pueden acceder al interior de las células a través de múltiples receptores expresados en la superficie de la célula. Por ejemplo, ciertos subtipos adenovirales pueden acceder al interior de las células a través del dominio I \alpha2 de clase MHC o de los pertenecientes a la familia de las integrinas \beta2 (ver, por ejemplo, Davison et al., J. Virol. 73(5): 4513-4517 (1999) y Huang et al. J. Virol. 70(7): 4502-4508 (1996)). Así, es importante establecer que cualquier vector (adenovirus u otro) utilizado para transducir selectivamente las células epiteliales no transducirá las células mioepiteliales próximas. En particular, ya que ciertos vectores son capaces de acceder a la célula diana a través de más de un receptor, es razonable comprobar la especificidad celular de cualquier vector candidato. Los procedimientos para comprobar la especificidad de un vector candidato son conocidos en la técnica y simplemente consisten en poner en contacto una célula diana de interés con un vector candidato y observar si ocurre la transducción. En estas circunstancias, la Figura 3 proporciona un ejemplo ilustrativo de la comprobación del vector adenoviral utilizado en los ejemplos descritos. En particular, la Figura 3A muestra la ausencia de expresión de la \beta-galactosidasa en las células mioepiteliales que han sido puestas en contacto con un adenovirus recombinante que contiene \beta-galactosidasa para ilustrar como la expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales permite seleccionar específicamente las células epiteliales y como la ausencia de CAR en las células mioepiteliales aporta resistencia a la célula contra la infección adenoviral. En contraste, la Figura 3B muestra la intensa expresión de la \beta-galactosidasa en las células epiteliales que han sido puestas en contacto con un adenovirus recombinante que contiene una \beta-galactosidasa como ilustración de como la expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales permite la transducción selectiva de las células epiteliales.
Vectores que transducen selectivamente células mioepiteliales
Una característica significativa de los procedimientos de la invención descritos en el documento es la identificación y la utilización de vectores celulares específicos que tienen la capacidad de transducir selectivamente células mioepiteliales y no transducir células epiteliales. Concretamente, ya que estos vectores acceden al interior de las células diana a través de una molécula que se expresa en las células mioepiteliales pero no en las epiteliales, pueden utilizarse para transducir selectivamente células mioepiteliales en una población de células mioepiteliales y epiteliales mezcladas.
Pueden utilizarse distintos vectores que acceden al interior de células a través de la molécula de proteoglicano sulfato de heparán para transducir selectivamente las células mioepiteliales. El parvovirus humano, el virus adenoasociado-2 (AAV), puede, por ejemplo, entrar en las células a través del canal mediado por el proteoglicano heparán sulfato (ver, por ejemplo, C. Summerford y R.J. Samulski, J. Virology 72:1438-1445)). Adicionalmente, se cree que la especificidad celular de los virus del herpes viene dada por sus moléculas de proteoglicano heparán sulfato (ver, por ejemplo, Zhu et al., P.N.AS. 92(8): 3546-3550 (1995)). Sin embargo, es importante indicar que los vectores virales pueden unirse a diferentes moléculas que se expresan en las células diana y/o que pueden utilizar coreceptores para acceder a una célula (ver, por ejemplo, Summerford et al., Nat. Med. 5(1): 78-82 (1999) y Qing et al., Nat. Med. 5(1):71-11 (1999)). Por lo tanto, es importante establecer que cualquiera de los vectores (virus adenoasociado-2 u otros) utilizados en los procedimientos descritos puede transducir selectivamente células mioepiteliales siempre que no transduzca las células epiteliales próximas.
Adicionalmente a los vectores con un tropismo natural hacia el proteoglicano heparán sulfato, es conocido en la técnica que se pueden construir una amplia variedad de vectores específicos para una molécula concreta de una célula tal como el proteoglicano heparán sulfato. En particular, la especificidad de los vectores de inserción para la célula diana puede proporcionarse mediante la incorporación de un dominio de unión específico para la célula diana mediante la utilización de cualquier dominio de unión, el cual se una específicamente a un punto de unión de la célula diana (ver, por ejemplo, Patente U.S. N° 5.834.589).
Tal como se indica arriba, ciertos vectores virales pueden acceder al interior de las células a través de múltiples receptores expresados en la superficie de la célula. Por ejemplo, el virus adeno-asociado 2 puede acceder al interior de las células a través del receptor 1 del factor de crecimiento del fibroblasto humano o de las integrinas \alphaV\beta (ver, por ejemplo, Summerford et al., Nat. Med. 5(1): 78-82 (1999) y Qing et al., Nat. Med. 5(1): 71-11 (1999)). Así, es importante establecer que cualquier vector (virus adeno-asociado 2 u otro) utilizado para transducir selectivamente las células mioepiteliales no transducirá las células epiteliales próximas. En particular, ya que ciertos vectores son capaces de acceder a la célula diana a través de más de un receptor, es razonable comprobar la especificidad celular de cualquier vector candidato. Los procedimientos para comprobar la especificidad de un vector candidato son conocidos en el campo de la invención y simplemente consisten en poner en contacto la célula diana de interés con un vector candidato y observar si ocurre la transducción. En estas circunstancias, la Figura 4 proporciona un ejemplo ilustrativo de la valoración del virus adeno-asociado 2 utilizado en los ejemplos descritos. En particular, la Figura 4A muestra la expresión del gen reportero en células mioepiteliales puestas en contacto con un virus adeno-asociado recombinante que contiene un gen reportero humano de fluorescencia verde que ilustra cómo la expresión del proteoglicano sulfato de heparán en la superficie de las células mioepiteliales permite la selección específica de las células mioepiteliales. En comparación, la Figura 4B muestra únicamente la expresión de fondo del gen reportero en células epiteliales puestas en contacto con un virus adeno-asociado recombinante que contiene un gen reportero humano de fluorescencia verde e ilustra cómo la expresión del proteoglicano heparán sulfato en la superficie de las células mioepiteliales permite la transducción selectiva de las células mioepiteliales.
Creación y Manipulación de Vectores de la Invención
Los procedimientos para la preparación y la manipulación de vectores tales como los virus adeno-asociados recombinantes descritos en el presente documento son conocidos en campo de la invención, por ejemplo se describen en las patentes U.S. Nos. 5.681.731, 5.585.362, 5.756.283 y 5.843.742. Tal como se describe a continuación, en la práctica de las realizaciones de la invención descritas en el presente documento pueden utilizarse varias técnicas aceptadas en el campo de la invención. Aunque los vectores de la invención puedan ser conocidos, también pueden manipularse para facilitar su utilización en los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que contenga una región de regulación, tal como un promotor o un potenciador, puede insertarse en el interior de un vector específico para células para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Alternativamente, en un vector específico para una célula puede insertarse un ácido nucleico que codifique un gen de interés tal como un gen suicida o un gen supresor tumoral para su expresión en una célula diana.
La secuencia de ácido nucleico de interés puede insertarse en un vector mediante una variedad de procedimientos. Generalmente, el ADN se inserta en un(os) sitio(s) de restricción endonucleasa apropiado(s) utilizando las técnicas conocidas en el campo de la invención. Los componentes vectoriales generalmente incluyen, pero no están limitados a, una o más secuencias de señalización, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. En la construcción de los vectores apropiados que contienen uno o más de estos componentes se emplean técnicas estándar de unión que son conocidas para el experto en la materia.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación pueden contener una secuencia de ácido nucleico que permita la replicación del vector en uno o más hospedadores seleccionados. Estas secuencias son bien conocidas para varios mamíferos, bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2: es apropiado para levaduras, y varios orígenes de virus (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para la clonación de vectores en células de mamífero.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación normalmente contendrán un gen de selección, también denominado marcador selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) proporcionan resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporciona nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la d-Alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcador selectivo para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células apropiadas como portadoras de un ácido nucleico de interés, por ejemplo Neomicina, DHFR o timidina quinasa. Cuando se emplea DHFR natural, una célula hospedadora apropiada es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y desarrollada como describe Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección apropiado para su utilización en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura sin la capacidad de desarrollarse en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Tanto los vectores de expresión como los de clonación normalmente pueden contener un promotor unido funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen los promotores reconocidos por varias de las potenciales células hospedadoras. Los promotores apropiados para su utilización con hospedadores procariotas incluyen la \beta-lactamasa y los sistemas de promotores lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, sistema de promotor triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) unida funcionalmente al ADN que codifica el ácido nucleico de interés.
La transcripción a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero puede controlarse, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el virus polioma, el virus fowipox (UK 2.211.504 publicada en Julio 1989), adenovirus (como el adenovirus 2), el virus papiloma bovino, virus sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus hepatitis B y el virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, ya que tales promotores son compatibles con los sistemas celulares hospedadores. Adicionalmente, un polinucleótido de interés puede estar bajo la regulación transcripcional de un promotor inductor como el promotor Tet. Alternativamente, puede estar bajo el control de un promotor específico para la célula o el tejido epitelial. Los promotores específicos para las células epiteliales, tales como la proteína ácida sérica (wap), puede utilizarse en la expresión específica de un gen dado, por ejemplo, un gen suicida, en las células epiteliales ductales. También pueden utilizarse promotores que controlen los genes supresores tumorales naturales, tales como Maspina, p53 o Mcs-1 (rata), los genes de caja homeótica que se expresan en las células normales pero no en las células cancerosas.
La transcripción mediante las células de mamífero de un ADN que codifica un polinucleótido de interés puede incrementarse insertando la secuencia de un potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN con actividad cis, normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. A partir de los genes de mamífero actualmente se conocen muchas secuencias de potenciadores (globina, elastasa, albúmina, ``-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, normalmente se utilizará un potenciador proveniente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador temprano del promotor del citomegalovirus, el potenciador polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores adenovirales. El potenciador puede estar insertado en el vector en la posición 5' o 3' de la secuencia de codificación, pero preferiblemente está localizado en un punto 5' desde el promotor.
Procedimientos para Transducir Selectivamente las Células Mioepiteliales
Los procedimientos de la invención descritos en el presente documento permiten la transducción selectiva de las células mioepiteliales. Una realización ilustrativa de la invención es un procedimiento para la transducción selectiva de una célula entre una población de células ductales epiteliales y mioepiteliales mezcladas, que comprende el paso de poner en contacto la célula con un vector específico para la célula que transduce la célula a través de una molécula que solamente se expresa en la célula mioepitelial. En una realización preferida de la presente invención, la población de células ductales epiteliales y mioepiteliales mezcladas está en el sistema ductal de una glándula mamaria y las células que van a ser transducidas se ponen en contacto con el vector mediante canulación ductal.
En una realización preferida de la presente invención, la célula es una célula mioepitelial que se transduce con un vector (por ejemplo un virus adeno-asociado recombinante) que comprende un gen que codifica un polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer. En una realización específica de la presente invención, el vector contiene un elemento cis que modula la expresión del gen en presencia de un factor trans presente en la célula mioepitelial. En realizaciones preferidas de este procedimiento, el polipéptido inhibe la proliferación de una célula epitelial ductal, la invasión de la célula epitelial ductal, la migración endotelial, la angiogénesis o los incrementos de la producción de óxido nítrico de la célula mioepitelial. Los polipéptidos ilustrativos incluyen maspina, trombospondina-1, TIMP-1, proteasa nexina-II, antitripsina \alpha-1 y receptor bFGF soluble. Preferiblemente, el polipéptido induce la muerte (por ejemplo mediante apoptosis) de una célula epitelial ductal.
El documento también describe un procedimiento para transducir selectivamente una célula en un sistema ductal en una glándula mamaria seleccionada del grupo que consiste en una célula epitelial ductal y en una célula mioepitelial ductal, que comprende poner en contacto, mediante canulación ductal, a la célula con un vector que es específico para la molécula de proteoglicano heparán sulfato que se expresa en la célula mioepitelial. El documento también describe un procedimiento para transducir selectivamente una célula mioepitelial en un sistema ductal en una glándula mamaria, que comprende poner en contacto, mediante canulación ductal, la célula con un vector que es específico para la molécula de proteoglicano heparán sulfato que expresa la célula.
En otra realización relacionada, la invención consiste en un procedimiento para transducir células mioepiteliales en una población de células ductales epiteliales y mioepiteliales mezcladas, sin transducir las células epiteliales ductales próximas, a través de poner en contacto a las células mioepiteliales con un vector que accede a las células mioepiteliales a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por las células mioepiteliales. En otra realización relacionada, la invención consiste en un procedimiento para transducir células mioepiteliales en una población de células ductales epiteliales y mioepiteliales mezcladas, sin transducir las células epiteliales ductales, a través de poner en contacto las células mioepiteliales con un vector que accede a las células mioepiteliales a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por las células mioepiteliales pero no expresada por las células epiteliales.
Métodos Profilácticos para el Tratamiento de un Conducto Mamario
Los métodos profilácticos descritos en el documento incluyen métodos para tratar profilácticamente y selectivamente a una célula en el conducto de una mama contra una enfermedad que afecta al epitelio ductal de la mama como es el cáncer. Una realización de estos métodos consiste en transducir selectivamente tanto una célula epitelial del lumen como una célula mioepitelial (o ambas, la célula epitelial del lumen y la célula mioepitelial) en el conducto de una mama, mediante la utilización de la canulación ductal para poner en contacto la célula de interés con un vector que es específico para una molécula que se expresa tanto en la célula epitelial del lumen como en la célula mioepitelial. Dependiendo de cual sea la célula puesta en contacto, los vectores utilizados en estos métodos se utilizan para provocar una actividad biológica deseada por ejemplo la citólisis o la expresión de una molécula efectora soluble.
En una realización de ejemplo, el método comprende poner en contacto, preferiblemente mediante canulación ductal, a una célula mioepitelial con un vector que suprime el crecimiento de las células cancerosas o provoca la destrucción de epitelio ductal en parte o en su totalidad de manera que se inhiba la formación de cáncer de origen epitelial ductal. En otra realización ilustrativa, la invención consiste en un método de tratamiento del epitelio ductal de una glándula mamaria contra el cáncer de origen epitelial ductal, el cual comprende el paso de poner en contacto, mediante canulación ductal, una célula en el epitelio ductal de la glándula mamaria seleccionada del grupo que consiste en una célula epitelial ductal y una célula mioepitelial, con un vector que accede a la célula a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato que expresa la célula mioepitelial, donde la expresión de polinucleótidos del vector transducido de esta manera inhibe la formación de cáncer originado en células epiteliales ductales.
El documento describe métodos de tratamiento profiláctico donde las células mioepiteliales de una glándula mamaria se tratan profilácticamente con un vector específico para células que comprende un polinucleótido que codifica una molécula supresora de manera que se inhibe la formación del cáncer originado en el epitelio ductal.
Los métodos profilácticos para tratar una glándula mamaria que se describen en el presente documento son particularmente útiles para el tratamiento de una glándula mamaria en un mamífero con riesgo de desarrollar cáncer de mama. La glándula mamaria puede estar caracterizada por no haber tenido nunca un tumor, por haber tenido un tumor previamente pero que ya no es detectable gracias a otro tratamiento terapéutico previo, o que tenga un tumor incipiente u oculto, preneoplasia o hiperplasia ductal. Normalmente, las hiperplasias y los tumores incipientes u ocultos no son detectables mediante el examen físico o la radiología. En consecuencia, el método profiláctico será utilizado en los casos en los que existan razones para tomar medidas profilácticas, tales como cuando existen factores hereditarios de predisposición al cáncer, cuando existan lesiones sospechosas en la mama con la posibilidad de que desarrollen malignidad, cuando ha habido exposición a agentes carcinogénicos ambientales, cuando la edad predispone al cáncer, cuando aparece cáncer en otra glándula, por ejemplo, en la glándula mamaria de la mama contralateral, sugiere propensión al desarrollo del cáncer, o cuando existe una temor o sospecha de metástasis.
Los métodos descritos en el documento también pueden combinarse con otros métodos de tratamiento profiláctico y terapéutico adicionales a los citados en el presente documento, por ejemplo los métodos que se basan en la destrucción de células cancerosas, por ejemplo, siendo específicos para marcadores de la superficie celular, ligandos de receptores, por ejemplo, ligandos de los receptores de los liberadores peptídicos de gastrina, los antígenos asociados a tumores, por ejemplo la citoqueratina de 57 kD o el antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal GB24, la matriz extracelular glicoproteica tenascina, oncogenes antisentido tales como c-fos, genes de caja homeótica que se expresan en células cancerosas pero no en células normales, linfocitos infiltrados en el tumor que expresan citoquinas, péptidos y proteínas que contienen RGD, los cuales se administran a posteriormente a la cirugía, liposomas que contienen fármacos Iipofílicos que están conjugados covalentemente con anticuerpos monoclonales para ser específicos para células cancerosas, dieta baja en grasa, ejercicio físico moderado y modulación hormonal.
Introducción de Vectores mediante Canulación Ductal
El epitelio ductal preferiblemente se pone en contacto con el agente mediante la introducción del agente a través del conducto del epitelio ductal exocrino, por ejemplo mediante canulación ductal. En la glándula mamaria hay de 6 a 9 conductos mayores que se originan en el pezón y que se ramifican en otros conductos, y acaban en las estructuras lóbulo-alveolares (Russo et al. (1990), supra). En consecuencia, en algunas circunstancias, como por ejemplo en las que se necesita o se desea un tratamiento más localizado, por ejemplo, por la elección de un agente anticáncer, puede ser preferible acceder al epitelio ductal de la glándula exocrina a través de uno de estos conductos mayores que conectan con la estructura lóbulo-alveolar. En este aspecto, la canulación ductal permite la inyección intratumoral.
Los procedimientos para la canulación ductal son conocidos en campo de la invención (ver por ejemplo S.M. Love y S.H. Barsky (1996) The Lancet, 348:997-999; Makita et al., Breast Cancer Res. Treat.18:179-188 (1991) y Okazaki et al., Jpn. Clin. Oncol. 21:188-193 (1991)). En resumen, una mama puede preparase y cubrirse, con los orificios de los conductos de la mama identificados con lupas de magnificación o mediante los procedimientos descritos a continuación. A continuación se pueden canular uno o más conductos con una cánula de las conocidas en el campo de la técnica tal como una sonda ductal de metal rígido (6 FR Taber-Rothschild Galacrography Kit, Manan Medical Products Inc., Northbrook, Illinois).
Para facilitar la localización de cada uno de los orificios en un pezón de una mama se pueden emplear procedimientos para marcar temporalmente y localizar cada uno de los orificios en un pezón de una mama como se describe en el documento U.S. 09/153,564. Además, en los documentos U.S. 09/067.661 y 09/301.058 se describen procedimientos adicionales para acceder y evaluar las células de un conducto de la mama. Por ejemplo, se puede introducir una sustancia detectable, como por ejemplo un agente de marcaje, tinte, o similar, en el pezón de manera que la sustancia queda localizada y/o acumulada en el orificio o cerca de él para permitir la detección visual, automatizada u de otro tipo. Alternativamente, se pueden utilizar otros estímulos para inducir una respuesta, cambio, o reacción en la localización del orificio en el pezón o cerca de él. Por ejemplo, puede ser posible iluminar el pezón con una luz determinada o con otros tipos de energía que ayuden a distinguir entre el orificio y las otras superficies tisulares. También puede ser posible la introducción de reactivos químicos que reaccionen con las secreciones ductales en el orificio para mejorar la visibilidad, por ejemplo para generar un producto de reacción visible o detectable de otra manera.
Métodos Específicos para Células Mioepiteliales
En otra realización particular de los métodos de tratamiento profiláctico descritos en el documento, el mioepitelio de una glándula mamaria puede tratarse profilácticamente contra el cáncer de manera que se inhiba la formación de cáncer originado en el epitelio ductal. El método comprende poner en contacto, preferiblemente mediante canulación ductal, el mioepitelio de la glándula mamaria con un vector que comprende una molécula que inhibe la formación del cáncer originado en el epitelio ductal, por ejemplo maspina. En una realización preferida de la invención, el vector es un virus adeno-asociado recombinante que es específico para una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por la célula mioepitelial y comprende un polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer celular epitelial. En una realización específica, el polipéptido del virus adeno-asociado recombinante inhibe la angiogénesis o la proliferación, la invasión o la metástasis de una célula epitelial del lumen. En una realización concreta, el polipéptido es maspina, trombospondina-1, TIMP-1, proteasa nexina-II, \alpha-1 antitripsina o el receptor soluble bFGF.
Además de los vectores virales adeno-asociados descritos en el presente documento se contemplan otros vectores. Por ejemplo, se cree que la especificidad celular de los virus del herpes viene dada por sus moléculas de proteoglicano heparán sulfato (ver, por ejemplo, Zhu et al., P.N.AS. 92(8): 3546-3550 (1995)). Así, los vectores víricos de herpes como los conocidos en el campo de la técnica (ver, por ejemplo, Levatte et al., Neuroscience 86(4): 1321-1336 (1998)), también pueden utilizarse para transducir selectivamente una célula en un sistema ductal en una glándula mamaria que expresa moléculas de proteoglicano heparán sulfato. Además, es conocido en el campo de la técnica que se pueden construir una amplia variedad de vectores que sean específicos para una molécula en concreto, tal como el proteoglicano heparán sulfato, en una célula. En particular, la especificidad para la célula diana de los vectores de inserción puede proporcionarse mediante la incorporación de un dominio de enlace específico para la célula diana mediante la utilización de cualquier dominio de enlace que se enlace específicamente con un punto de unión de la célula diana (ver, por ejemplo, la patente U.S. 5.834.589).
Métodos Terapéuticos para el Tratamiento de un Conducto Mamario
Las realizaciones de los métodos terapéuticos de la presente descripción están relacionados y son similares a los métodos profilácticos descritos arriba e incluyen tratar terapéuticamente el epitelio ductal de una mama contra una enfermedad que afecta al epitelio ductal. En una realización de los métodos terapéuticos descritos en el documento, el epitelio ductal de una glándula mamaria se trata terapéuticamente contra el cáncer de manera que se destruyen las células epiteliales cancerosas y no cancerosas del epitelio ductal y se inhibe la diseminación del cáncer. En una realización ejemplar, el método comprende poner en contacto, preferiblemente mediante canulación ductal, a una célula mioepitelial con un vector que pueda suprimir el crecimiento de las células cancerosas o provocar la destrucción de las células cancerosas de origen epitelial ductal en parte o en su totalidad. En otra realización específica de los métodos terapéuticos, las células mioepiteliales de la glándula mamaria se ponen en contacto con un vector específico para células que comprende un polinucleótido que codifica una molécula supresora de manera que se inhibe la progresión del cáncer originado en el epitelio ductal. En tales métodos terapéuticos, el agente destructor del epitelio podría suprimir el crecimiento o destruir todo el epitelio enfermo o maligno. Adicionalmente, el epitelio ductal que rodea el epitelio enfermo/maligno preferiblemente también debería ser suprimido o destruido.
Métodos Terapéuticos/Profilácticos Combinados para el Tratamiento de un Conducto Mamario
La descripción describe métodos de tratamiento el epitelio ductal de una glándula mamaria utilizando métodos terapéuticos y profilácticos conocidos en el campo de la técnica en combinación con los métodos profilácticos y terapéuticos descritos en el presente documento. Los ejemplos de estos métodos aceptados en el campo de la técnica incluyen la extirpación quirúrgica del tejido canceroso, la terapia con radiación y la quimioterapia. Tal combinación de métodos comprendería métodos conocidos en el campo tales como la extirpación quirúrgica del tejido canceroso y adicionalmente, a continuación poner en contacto, ya sea concomitantemente o posteriormente al tratamiento terapéutico, el epitelio ductal de la glándula mamaria, por ejemplo mediante canulación ductal, con los vectores específicos para células descritos en la presente descripción, de manera que se suprima o se destruya cualquier célula cancerosa o no cancerosa que quede y que se inhiba la diseminación del cáncer.
Métodos de Diagnóstico para la Evaluación del Cáncer en un Conducto Mamario
La presente descripción además proporciona el uso en los estudios diagnósticos que pueden evaluar la expansión de un linaje celular concreto de los vectores específicos para la célula que contienen genes reporteros. Específicamente, utilizando los procedimientos de transducción descritos en el presente documento, se puede determinar si un grupo de células (tales como las células proliferativas) en el conducto de una mama pertenecen tanto al linaje epitelial o al mioepitelial. Por ejemplo, se puede utilizar la canulación ductal para exponer las células epiteliales del lumen a un vector específico para una célula (como por ejemplo el rAd de replicación defectuosa) que contiene un gen reportero con el fin de evaluar la expansión de este linaje asociado al cáncer. Alternativamente, se puede usar la canulación ductal para exponer las células mioepiteliales a un vector específico para una célula (por ejemplo rAAV) que contiene un gen reportero con el fin de evaluar la expansión de este linaje. De esta manera, el experto en la materia puede determinar si un grupo de células (por ejemplo un grupo de células proliferativas) son propensas al cáncer, como en el caso de las células epiteliales del lumen. Además, los procedimientos en los que se utilizan vectores específicos para células que contienen genes reporteros pueden utilizarse para facilitar la comprobación de la presencia de células cancerosas ocultas, y por tanto contribuyen en el tratamiento y la prognosis a largo término.
En el campo de la técnica se conoce una amplia variedad de genes reporteros y de ensayos que pueden ser adaptados a los métodos de diagnóstico descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un gen reportero puede codificar un enzima que produce un cambio colorimétrico o fluorimétrico en la célula hospedadora que es detectable mediante el análisis in situ y que es una función cuantitativa o semicuantitativa de la activación transcripcional. Los enzimas de ejemplo incluyen esterasas, fosfatasas, proteasas (activador del plasminógeno tisular o uroquinasa) y otros enzimas capaces de ser detectados por la actividad que genera un cromóforo o fluoróforo como es conocido para el experto en la materia. Un ejemplo preferido es la E. coli beta-galactosidasa descrita en el presente documento. Este enzima produce un cambio de color al unir el sustrato indigogénico indolil-B-D-galactosido con células que tienen beta-galactosidasa (ver, por ejemplo, Goring et al., Science, 235:456-458 (1987) y Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 84:156-160 (1987)). Este enzima es preferido porque la actividad endógena \beta-galactosidasa en las células de mamífero normalmente es bastante baja, el sistema analítico de cribado utilizando \beta-galactosidasa no está limitado por la señal de fondo de la célula hospedadora.
Composiciones
Con la finalidad de facilitar la utilización de los vectores útiles en la terapia génica que son específicos para las células del conducto de la mama, se establecieron líneas celulares mioepiteliales inmortalizadas y xenoinjertos transplantables que provienen de mioepiteliomas humanos de la glándula salivar benignos (HMS-1, HMS-X, HMS-3, HMS-3X), de mama (HMS-4, HMS-4X) y de bronquios (HMS-6, HMS-6X) (M.D. Sternlicht et aL (1996) In Vitro, 32:550-563; MD. Sternlicht et al. (1997) Clin. Cancer Res., 3:1949-1958; Z. Shao et al. (1998) Exper. Cell Res., 241:394-403). Estas líneas celulares y estos xenoinjertos expresan marcadores mioepiteliales idénticos de la misma manera que sus correspondientes in situ y muestran un cariotipo diploide esencialmente normal. Las líneas celulares mioepiteliales y los xenoinjertos y las células mioepiteliales in situ expresan constitutivamente grandes cantidades de proteinasa e inhibidores de la angiogénesis que incluyen TIMP-1, proteasa nexina-II, \alpha-1 antitripsina, trombospondina-1, receptores solubles bFGF, y maspina. Estas moléculas supresoras son bien conocidas en el campo de la técnica. (Ver en general, Sternlict et al., Lab. Invest. 74(4):781-796 (1996) y Sternlict et al., Med. Hypo. 48:37-46 (1997). Además, acerca TIMP-1, ver U.S. Pat. No. 5.595.885, acerca la proteasa nexina-II, ver U.S. Pat. No. 5.213.962, acerca la \alpha-1 antitripsina ver U.S. Pat. No. 5.736.379, acerca la trombospondina-1 ver U.S. Pat. No. 5.648.461, acerca los receptores bFGF ver 5.750.371, y acerca maspina ver U.S. Pat. No. 5.470.970.
Las líneas celulares mioepiteliales humanas inhiben tanto la invasión celular ER positiva como la ER negativa del carcinoma de mama y la migración endotelial y la proliferación (angiogénesis) in vitro. Las líneas celulares mioepiteliales también inhiben la proliferación del carcinoma de mama a través de la inducción de la apoptosis celular en el carcinoma de mama, un fenómeno que en el DCIS ocurre a niveles altos (Z. Shao et al. (1998) Exper. Cell Res., 241:394-403). En base a los estudios de inmunoprecipitación, la maspina mioepitelial parece ser la molécula efectora más importante que inhibe la invasión, y la trombospondina-1 parece ser la molécula efectora mas importante que inhibe la angiogénesis (S. Bodis et al. (1996) Cancer, 77:1831-1835). El óxido nítrico mioepitelial parece ser la molécula efectora más importante que inhibe la proliferación del carcinoma de mama a través de su efecto de inducción a la apoptosis (Z. Shao et al. (1998) Multidiscip. Symposium on Breast Disease).
La presente invención se va a detallar adicionalmente en los siguientes Ejemplos, que se ofrecen en modo de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la invención en modo alguno.
Ejemplos Ejemplo 1 Transfección de Células con Adenovirus
Este ejemplo está relacionado con el descubrimiento de que las células epiteliales ductales primarias de la mama expresan CAR, y se transducen fácilmente con rAd considerando que las células mioepiteliales carecen de CAR y son completamente resistentes. Se cree que CAR ejerce como mediador, en parte, de la unión del adenovirus a la membrana celular (J. Bergelson et al. (1997) Science 275:1320-1323). En este contexto, se pueden utilizar los siguientes estudios con rAd como una ilustración de los métodos de la presente invención.
Estudios rAd: se puede utilizar un rAd2 de replicación deficiente (ver, por ejemplo, Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 240: 88-92 (1997)) con un reportero 6-galactosidasa y medir su capacidad para transducir células epiteliales comparada con células mioepiteliales a través de aproximaciones ex vivo e in vivo. Adicionalmente, se pueden utilizar muestras que provienen de mastectomías y administrar el rAd intracanalicularmente como se hizo con el rAAV en el siguiente Ejemplo 2. Ya que rAd no se integra (al contrario que rAVV), el periodo de incubación probablemente sea menor (del orden de 72-96 horas). Se puede detectar la \beta-galactosidasa mediante un ensayo de sustrato en secciones congeladas de las muestras de mastectomía. A continuación se puede comparar el desarrollo colorimétrico mioepitelial y el epitelial. En los experimentos en paralelo, se puede administrar rAd intracanalicularmente a conejos anestesiados y después de unos pocos días observar la actividad \beta-galactosidasa en las secciones de sus mamas. En este punto, se puede comparar la actividad epitelial con la actividad mioepitelial. Incluso en situaciones en las que se utiliza un virus de replicación deficiente, se puede medir la concentración de adenovirus en las heces y la orina de los ratones mediante ELISA para evaluar cómo la capa mioepitelial ofrece una barrera para la infección
sistémica.
Ejemplo 2 Transfección de Células con Virus Adeno-asociados
Este ejemplo está relacionado con el descubrimiento de que al contrario que en la expresión de CAR por parte de la las células epiteliales, las células mioepiteliales por su parte expresan proteoglicano heparán sulfato (HS) y se transducen fácilmente con rAW. Como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior, las células epiteliales ductales primarias carecen de este proteoglicano y son resistentes a rAAV. Se cree que el HS de la superficie celular ejerce de receptor para rAAV lo que determina la transductabilidad (C. Summerford y RJ. Samulski, J. Virology 72: 1438-1445). En este contexto, se pueden utilizar los siguientes estudios con rAAV como ilustración de los procedimientos de la presente invención. Hasta el momento en que se estableció que rAAV podía utilizarse para transfectar con éxito las células mioepiteliales (HMS-1), nuestras líneas celulares fueron totalmente resistentes a la transfección mediante cualquier otro procedimiento convencional.
Estudios rAAV: se puede partir de rAAV (ver, por ejemplo, Flannery et al., P.N.A.S., 94: 6916-6921, (1997)). Este virus recombinante contiene un promotor CMV y la proteína humana fluorescente verde. A continuación se pueden inyectar concentraciones cada vez mayores de este virus junto con un tinte supravital, por ejemplo, Lymphazurin (el tinte del ganglio centinela) para ayudar a guiar las inyecciones al centro del tumor. A continuación se puede inyectar los xenoinjertos mioepiteliales descritos en el presente documento (HMS-X, HMS-3X, HMS-4X, HMS-6X) con un tamaño de 1 cm de diámetro y después de 1-3 semanas extirpar estos tumores, cortarlos en secciones finas congeladas y estudiar la distribución radial de la fluorescencia en relación con el tinte azul celeste. Como controles, se pueden utilizar tumores carcinoma no mioepiteliales en los que se podría esperar que la transducción esté ausente o sea mínima. Mediante estos estudios de inyección tumoral directa, se puede determinar cómo tiene lugar la transducción de rAAV en células mioepiteliales seguida de la expresión génica recombinante in vivo. Si se obtienen resultados positivos, se puede administrar rAAV intracanalicularmente a través de la canulación del pezón en muestras humanas de mastectomía ex vivo y en los pezones de ratón in vivo. Después de 24 horas se pueden iniciar explantes de cultivos de órganos de las mastectomías y a continuación, después de varias semanas, observar la fluorescencia en las células mioepiteliales en comparación con las células epiteliales ductales. Ya que los ratones tienen ocho pezones, cada uno de ellos con 4 sistemas ductales, proporcionan un modelo animal simple para probar la administración génica intracanalicular. Después de tres semanas se pueden sacrificar los ratones, seccionar sus mamas y comparar la fluorescencia epitelial con la mioepitelial.
Ejemplo 3 Verificación de las observaciones en relación con la especificidad del adenovirus recombinante (rAd) y el virus adeno-asociado recombinante (rAAV) para células epiteliales y mioepiteliales respectivamente
Utilizando experimentos in vivo, expandimos los primeros descubrimientos y se perfilaron los parámetros que iban a facilitar la práctica de la invención in vivo. Estos parámetros incluyen la determinación de la dosis (titración), frecuencia de la administración, periodo de incubación, periodo de observación, etc. Los controles para todos estos experimentos correlativos in vitro pueden incluir vectores no reporteros como no incluir vectores.
Adicionalmente, se excluyó la posibilidad de que se diera un fenómeno de pseudotransducción en estos ejemplos (administración de proteína mediada por el vector en vez de expresión génica) especialmente en los experimentos con rAAV donde este fenómeno había sido observado por otros. Por ejemplo, en los experimentos en los que se observó un producto correcto del gen reportero, verificamos que era la expresión génica la que estábamos administrando y no sólo proteína mediante un experimento de dilución volumétrica. Específicamente, los efectos de la dilución volumétrica deberían ser el descenso de la tinción proteica en todas las células en el caso de que exista pseudotransfección; en el caso de verdadera transfección, debería haber un descenso del número de células que presentan la proteína de marcaje, pero la intensidad del teñido en las células positivas no debería descender. Nuestros resultados establecen que en nuestro caso se da una verdadera transfección, ya que se han realizado las observaciones anteriores. Además, en nuestros experimentos con rAAV in vitro realizados hasta la fecha, la intensidad del teñido indicador en comparación con la intensidad de la proteína humana fluorescente verde en las células HMS-1 transfectadas se incrementó a las tres semanas contra 1 semana después de la transfección. Este incremento del gen reportero con un episodio incremental es indicativo de expresión génica real ya que los genes rAAV administrados siempre son un poco lentos para mostrar una expresión completa. Si hubiéramos estado experimentando con la pseudotransfección (administración de proteínas mediada por vector), la tinción indicadora descendería con el episodio.
Adicionalmente, hemos acumulado los ensayos de expresión del gen marcador con un análisis genético molecular que muestra la presencia de virus mediante estudios PCR.
Para ampliar los estudios iniciales se llevaron a cabo estudios cinéticos de eficacia de los genes reporteros, a través de sus vectores virales respectivos en células epiteliales y mioepiteliales in vitro.
Adicionalmente, se ha confirmado la utilidad del rAd borrado en E 1A que contiene dos promotores diferentes conocidos en el campo de la técnica, es decir CMV y RSV LTR.
Se incluyen los estudios de respuesta a la dosificación diseñados para determinar si existe una relación entre la multiplicidad del vector de infección (moi) y la eficacia de la transferencia del gen reportero (\beta-galactosidasa) en las células epiteliales de la mama (HMEC). Concretamente, se observó que un moi de 102 resultará en una eficacia de la transducción del 100%. AI mismo tiempo se ha monitorizado la resistencia a la transducción rAd de las células mioepiteliales y se ha determinado que su resistencia es absoluta. Por ejemplo, son completamente resistentes a la transcripción incluso con un moi de 104.
También se llevó a cabo un estudio del tiempo de exposición a rAd durante 1-10 horas para determinar si la eficacia de la transfección mejora con un tiempo de exposición mayor. No mejora.
En el caso del rAd, se monitorizó la expresión del gen reportero en función del tiempo a partir de la infección para determinar la proporción de la expresión y su descenso. Se encontró que la vida media de la expresión fue de 48 horas. Se repitieron estos estudios in vitro con rAAV específicos para células mioepiteliales. Ya que rAAV es opuesto a las integraciones de rAd en el genoma, pero requiere una segunda síntesis de la cadena durante la división celular antes de que ocurra la expresión (ya que rAAV es monocatenario), se podría esperar que se necesitara un tiempo mayor después de la transfección para observar la expresión pero con un descenso más suave o sin descenso. En este contexto, se observa que la expresión máxima ocurre a las 3 semanas con un descenso negligible.
También se ha comparado la expresión del reportero en las células mioepiteliales con la de las células epiteliales. Se han evaluado los virus competentes en la replicación y los de replicación potenciada, en los que la producción de partículas virales puede potenciarse mediante las interacciones de un promotor cis/trans y monitorizar la Tisis de las células epiteliales y la resistencia a la lisis de las células mioepiteliales. Se observa una lisis significativa, visualmente o mediante un procedimiento de exclusión del tinte (azul de tripano) o mediante un procedimiento de monitorización de viabilidad como el MTT. Se han llevado a cabo experimentos cinéticos similares. En el caso del rAd con replicación potenciada, los agentes exógenos tales como la dexametasona y/o la LPS, diseñados para incrementar la transcripción del potenciador/promotor utilizado (MUC1 y Lactoalbúmina) en nuestras células epiteliales de mama transfectadas (HMEC) se han monitorizado para realizar una valoración viral y se ha observado un incremento de 10 veces con un 50% de incremento de la lisis celular. Las células mioepiteliales continuaron siendo completamente resistentes a los efectos de este virus lítico competente en la replicación.
Ejemplo 4 Verificación de la viabilidad de Transfectar Moléculas Supresoras como Maspina
Se ampliaron los experimentos in vitro descritos arriba mediante la utilización de rAd y rAAV con defectos en la replicación que no contenían genes reporteros sino genes nativos tales como maspina y se llevaron a cabo estudios cinéticos similares. Específicamente, se repitieron los estudios de arriba en los que se utilizaron genes reporteros y en vez de éstos se utilizaron genes supresores endógenos como maspina para establecer que nuestra aproximación es fisiológicamente viable.
Transfección de maspina en células mioepiteliales a través de vectores rAAV. Los mecanismos de actuación de maspina en la inhibición de la invasión y de la motilidad son totalmente desconocidos. Maspina se identificó inicialmente mediante hibridación sustractiva y el procedimiento de representación diferencial para identificar genes supresores tumorales candidatos que fueran defectivos en las células humanas de carcinoma de mama. Es interesante que incluso en estas líneas celulares normales de mama que se utilizaron para clonar la maspina y en esas líneas normales de mama donde fue identificado, sólo está presente intracelularmente y no se secreta. A diferencia de las células epiteliales, nuestras líneas celulares mioepiteliales secretan maspina. La presencia de maspina secretado en células mioepiteliales en comparación con las células epiteliales normales y nuestros resultados de la inhibición de la invasión y de la motilidad de las células de carcinoma de mama por maspina apoyan la hipótesis de que maspina está actuando como un supresor tumoral paracrino y no como autocrino.
Las células mioepiteliales parecían tener la capacidad única de secretar esta serpina. Por lo tanto se explotó esta propiedad del mioepitelio mediante la transfección in vitro de maspina en HMS-1 a través de rAAV para conseguir la sobreexpresión de maspina. Por ejemplo, el rAAV que contenía el promotor CMV se utilizó para modular un ADNc maspina de secuencia completa insertado en este vector. Los niveles de rmaspina secretado se determinaron mediante transferencia Western después de varias semanas. Tal como se muestra en la figura 7, las células mioepiteliales que sobreexpresan maspina son más efectivas bloqueando la invasión celular del carcinoma en Matrigel. Tales ensayos en Matrigel son conocidos en el campo de la técnica y proporcionan un modelo para los sistemas de cáncer de mama (ver, por ejemplo, Bae et al., Breast Cancer Res. Tret. 24(3). 241-55 (1993). Específicamente, los efectos de los clones mioepiteliales transfectados que expresan rmaspina en los ensayos de inhibición de la invasión mostraron un incremento del 200% en la inhibición de la invasión. En consecuencia, estos resultados demuestran la viabilidad de la utilización de la sobreexpresión de maspina en el mioepitelio como una estrategia de terapia génica in vivo.
Ejemplo 5 Estudios in vivo
Los descubrimientos in vivo descritos en los Ejemplos 1-4 anteriores ilustran como es posible, usando una aproximación intracanalicular, seleccionar específicamente y destruir el epitelio de la mama in vivo y proteger el mioepitelio in vivo con rAAV y reforzar sus defensas con genes como la maspina.
Específicamente, utilizando los estudios preliminares ex vivo e in vivo descritos en el presente documento se puede seleccionar específicamente el mioepitelio de la mama y el epitelio de la mama con estas aproximaciones vectoriales específicas. Así, se puede proceder de la siguiente forma: utilizar un adenovirus lítico competente en la replicación o un adenovirus lítico competente en la replicación que contiene elementos cis que estimulan la replicación cuando los factores trans específicos presentes en el epitelio de la mama se encuentran (un elemento cis candidato podría ser el promotor lactoalbumínico o el promotor MUCI). A continuación se puede evaluar la destrucción del epitelio de la mama con riesgo de desarrollar cáncer y para realizar una "mastectomía profiláctica" sin tener que extirpar la mama. Puede determinarse, mediante un análisis ELISA de la orina y las heces, si la capa mioepitelial serviría como una barrera efectiva contra la infección sistémica cuando se utiliza un adenovirus lítico competente en la replicación. La resistencia de las células mioepiteliales a la infección con adenovirus sugiere que esta capa ofrece una defensa contra las infecciones sistémicas. Alternativamente puede utilizarse rAAV para seleccionar específicamente el mioepitelio y administrarle un gen candidato tal como maspina para reforzar sus capacidades defensivas.

Claims (23)

1. Procedimiento in vitro o ex vivo para la transducción selectiva de una célula mioepitelial en una población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales mezcladas, que comprende el paso de poner en contacto una célula mioepitelial con un vector vírico adeno-asociado recombinante que transduce la célula a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por la célula.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales mezcladas está en el sistema ductal de una glándula mamaria.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la célula mioepitelial se pone en contacto mediante canulación ductal.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el vector comprende un gen que codifica un polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde una secuencia de control en el virus adeno-asociado recombinante contiene un elemento cis que modula la expresión del gen en presencia de un factor trans presente en la célula mioepitelial.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido inhibe la proliferación de una célula epitelial ductal.
7. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido inhibe la invasión de una célula epitelial ductal.
8. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido inhibe la migración endotelial.
9. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido inhibe la angiogénesis.
10. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido incrementa la producción de oxido nítrico de la célula mioepitelial.
11. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido induce la apoptosis en una célula epitelial ductal.
12. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en maspina, trombospondina-1, TIMP-1, proteasa nexina-II, \alpha-1 antitripsina y receptor bFGF soluble.
13. Uso de un vector vírico adeno-asociado recombinante que comprende un gen que codifica un polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer para la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la transducción selectiva de una célula mioepitelial a través de la molécula de proteoglicano heparán sulfato en una población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales mezcladas, en el que el método comprende el paso de poner en contacto la célula mioepitelial con dicho vector.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales mezcladas está en el sistema ductal de una glándula mamaria.
15. Uso según la reivindicación 13, donde la célula mioepitelial se pone en contacto mediante canulación ductal.
16. Uso según la reivindicación 13, donde una secuencia de control del virus adeno-asociado recombinante contiene un elemento cis que modula la expresión del gen en presencia de un factor trans presente en la célula mioepitelial.
17. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido inhibe la proliferación de una célula epitelial ductal.
18. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido inhibe la invasión de una célula epitelial ductal.
19. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido inhibe la migración endotelial.
20. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido inhibe la angiogénesis.
21. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido incrementa la producción de oxido nítrico de la célula mioepitelial.
22. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido induce la apoptosis en una célula epitelial ductal.
23. Uso según la reivindicación 13, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en maspina, trombospondina-1, TIMP-1, proteasa nexina-II, \alpha-1 antitripsina y receptor bFGF soluble.
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