ES2278596T3 - Composiciones y procedimientos para la terapia genica intraductal. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro o ex vivo para la transducción selectiva de una célula mioepitelial en una población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales mezcladas, que comprende el paso de poner en contacto una célula mioepitelial con un vector vírico adeno-asociado recombinante que transduce la célula a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por la célula.
Description
Composiciones y procedimientos para la terapia
génica intraductal.
La presente invención se refiere al uso de
vectores específicos para células tanto en el diagnóstico como en
el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades de la
mama, en particular del cáncer.
Los cánceres de mama son una de las principales
causas de muerte entre las mujeres, el desarrollo de cáncer de mama
en mujeres presenta una incidencia acumulada de 1 cada 9. En
consecuencia, para los profesionales de la salud es de gran interés
entender los orígenes de estos desórdenes, así como la
identificación de nuevas modalidades terapéuticas.
La mama humana adulta comprende de seis a nueve
conductos principal es que proceden del pezón, se ramifican en
conductos y terminan en estructuras
lóbulo-alveolares (Russo et al., Lab. Invest.
62(3): 244-278 (1990)). La red ramificada de
conductos está compuesta de células epiteliales del lumen en una
matriz de soporte de tejido conectivo y células mioepiteliales. Los
tejidos que se extirpan de las mamas humanas femeninas durante la
cirugía y las autopsias han sido examinados en muchos estudios
sobre la naturaleza y lugar de origen del crecimiento neoplásico. El
amplio muestreo y la confirmación histológica han permitido la
caracterización patológica de mamas completas, que muestran que el
cáncer humano de mama surge en el sistema ductal de la mama
exclusivamente a partir de las células epiteliales del lumen. El
origen ductal está apoyado por la presencia de otras
proliferaciones epiteliales más extensas, presumiblemente
preneoplásicas, en mamas cancerosas extirpadas quirúrgicamente en
comparación con mamas no cancerosas extirpadas en autopsias.
Debido a la significativa incidencia acumulada
de desarrollo de cáncer de mama en mujeres existe una necesidad
urgente de desarrollar tanto métodos terapéuticos de tratamiento
que sean más efectivos, menos invasivos y que estén acompañados de
menos efectos secundarios, así como métodos profilácticos de
tratamiento que sean más efectivos que no solo el incremento y la
intensificación del seguimiento físico y mucho menos extremos que
la mastectomía radical. Los métodos profilácticos aún están
limitados al seguimiento físico y a la mastectomía profiláctica a
pesar del reciente descubrimiento del locus de susceptibilidad
hereditaria al cáncer de mama, que incluye el BRCA1 y otros genes
(ver, por ejemplo, Miki et al., Science
266:66-71 (1994)), y de la mejora de la capacidad de
los médicos de identificar mujeres con un riesgo elevado de
desarrollar cáncer.
En vista de lo anterior, en el campo de la
técnica se necesita la identificación de nuevos métodos que
contribuyan a la prevención y el tratamiento de los cánceres de
glándula mamaria. En este contexto, los métodos óptimos son
aquellos que tienen un amplio espectro de aplicación tanto en la
diagnosis del cáncer, como en el tratamiento terapéutico y
profiláctico del cáncer.
La presente invención se basa en las
observaciones de los respectivos roles de los linajes celulares
epiteliales y mioepiteliales en el desarrollo del cáncer de mama y
en el hecho de que estos tipos celulares expresan diferencialmente
productos genéticos que pueden ser dianas para vectores específicos
celulares. En este contexto, surgen nuevas estrategias que pueden
utilizarse como medio para la diagnosis del carcinoma de mama, su
profilaxis y su tratamiento. Una primera estrategia es intervenir
selectivamente en células del epitelio de la mama de manera que no
se desarrolle el carcinoma de mama. Una segunda estrategia consiste
en intervenir en las células mioepiteliales como medio de refuerzo
de la defensa mioepitelial de manera que, incluso si se desarrolla
un carcinoma ductal "in situ" (DCIS), este quedará
recluido en el sistema ductal indefinidamente.
El presente documento describe métodos
terapéuticos y profilácticos para tratar una enfermedad del
epitelio ductal de la glándula mamaria, en particular cáncer. En
este contexto, la presente invención proporciona métodos in
vitro y ex vivo dirigidos a la transducción selectiva de
una célula en un sistema ductal de una glándula mamaria que
comprenden la etapa de utilizar la canulación ductal para poner en
contacto selectivamente la célula con un vector que es específico
para esa célula. En una realización ilustrativa, la invención
consiste en un procedimiento para la transducción selectiva de una
célula mioepitelial, poniendo en contacto la célula con un vector
específico para una molécula de proteoglicano heparán sulfato que se
expresa en la célula mioepitelial.
En una realización específica de la invención,
el vector es un virus adeno-asociado recombinante
que es específico para una molécula expresada por una célula
mioepitelial y que comprende un polinucleótido que codifica un
polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer en las células
epiteliales. En una realización específica, el polipéptido del virus
adeno-asociado recombinante inhibe la angiogénesis
o la proliferación, la invasión o la metástasis de una célula
epitelial. En una realización concreta, el polipéptido es maspina,
trombospondina-1, TIMP-1, proteasa
nexina-II, \alpha-1 antitripsina
o el receptor soluble bFGF. En una realización más preferida, el
virus adeno-asociado recombinante contiene un
elemento cis, por ejemplo un promotor lactoalbumínico y el promotor
MUCI que estimula la replicación del virus
adeno-asociado recombinante en presencia de un
factor trans presente en la célula epitelial.
El documento describe un método para tratar
profilácticamente el epitelio ductal de una glándula mamaria contra
el cáncer, el método comprende el paso de poner en contacto,
mediante canulación ductal, el epitelio ductal de la glándula
mamaria con un vector específico para el tejido de manera que se
inhiba la formación del cáncer originado en el epitelio ductal.
Además, el documento describe métodos terapéuticos/profilácticos
combinados para tratar terapéuticamente la glándula mamaria mediante
cirugía, radiación y/o quimioterapia y, ya sea concomitantemente o
posteriormente, poniendo en contacto el epitelio ductal de la
glándula mamaria con un vector específico para células que sea
específico para una célula mioepitelial.
El documento también describe un procedimiento
para determinar el linaje de una célula en un sistema ductal en una
glándula mamaria seleccionada del grupo que consiste en una célula
epitelial del lumen y una célula mioepitelial, mediante la
utilización de la canulación ductal para poner en contacto la
célula con el vector que contiene un gen reportero, donde el vector
es específico para una molécula que se expresa en la célula
epitelial o en la célula mioepitelial.
La Figura 1 es un esquema que muestra la unidad
ductal-lobular de la mama e ilustra la posibilidad
de estrategias de terapia génica específicas para las células
epiteliales y/o las células mioepiteliales.
La Figura 2A es una fotografía que ilustra la
viabilidad del acceso a la totalidad del sistema ductal de la mama
mediante la identificación de los conductos del pezón y la
canulación.
La Figura 2B, una fotografía que muestra que
cuando los conductos del pezón se canulan individualmente, un tinte
inyectado alcanza cada uno de los orificios ductales.
La Figura 3A es una fotografía que muestra la
ausencia de expresión de la \beta-galactosidasa
en células mioepiteliales que han sido puestas en contacto con un
adenovirus recombinante (Ad2) que contiene una
\beta-galactosidasa para ilustrar cómo la
expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales en la
unidad ductal-lobular de la mama permite la
especificidad selectiva para las células epiteliales y cómo la
ausencia de CAR en las células mioepiteliales proporciona
resistencia a esta célula contra la infección adenoviral.
La Figura 3B es una fotografía que muestra la
intensa expresión de la \beta-galactosidasa en
células epiteliales que han sido puestas en contacto con un
adenovirus recombinante que contiene una
\beta-galactosidasa para ilustrar cómo la
expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales en la
unidad ductal-lobular de la mama permite la
especificidad selectiva para las células epiteliales.
La Figura 3C es una fotografía que muestra cómo
la expresión de CAR está totalmente ausente en las células
mioepiteliales (banda debajo de CAR) pero está presente en las
células del epitelio ductal y en otras líneas de carcinoma (otras
bandas).
La Figura 4A es una fotografía que muestra la
expresión del gen reportero en las células mioepiteliales que han
sido puestas en contacto con un virus
adeno-asociado recombinante que contiene un gen
reportero humano de fluorescencia verde que ilustra cómo la
expresión del proteoglicano heparina sulfato en la superficie de
las células mioepiteliales de la unidad
ductal-lobular de la mama permite la especificidad
selectiva para las células mioepiteliales.
La Figura 4B es una fotografía que muestra
únicamente la expresión del gen reportero en células epiteliales
puestas en contacto con un virus adeno-asociado
recombinante que contiene un gen reportero humano de fluorescencia
verde que ilustra cómo la expresión del proteoglicano heparina
sulfato en la superficie de las células mioepiteliales en la unidad
ductal-lobular de la mama permite la especificidad
para las células mioepiteliales.
La Figura 5 es una transferencia Southern de ADN
cortado con Hinf I y sondado utilizando la sonda
multi-locus Jefferys (33,6) y muestra los patrones
distintos e identificativos de un número de líneas celulares
mioepiteliales ilustrativas y los xenoinjertos descritos en el
presente documento (HMS-1, HMS-X,
HMS-3, HMS-3X,
HMS-4X). Todas las líneas celulares mioepiteliales
y los xenoinjertos mostraron la misma susceptibilidad a la
transfección viral con el adenovirus recombinante asociado y la
misma resistencia a la transfección adenoviral. Otras líneas
celulares mioepiteliales y xenoinjertos (HMS-5X,
HMS-6X, HMS-5,
HMS-6) no mostrados presentan las mismas
propiedades.
propiedades.
La Figura 6 es una transferencia sourthern de
ADN escindido con Hae III y sondado mediante la sonda
multi-locus Jefferys (33,6) y muestra los patrones
distintos e identificativos de un número de líneas celulares
mioepiteliales ilustrativas y los xenoinjertos descritos en el
documento (HMS-1, HMS-X,
HMS-3, HMS-3X,
HMS-4X). Todas las líneas celulares mioepiteliales y
los xenoinjertos mostraron la misma susceptibilidad a la
transfección viral con el adenovirus recombinante asociado y la
misma resistencia a la transfección adenoviral. Otras líneas
celulares mioepiteliales y xenoinjertos (HMS-5X,
HMS-6X, FD4S-5,
HMS-6) no mostrados presentan las mismas
propiedades.
La Figura 7 es un gráfico de barras que compara
la invasión de las células
MDA-MB-231 de carcinoma de mama en
Matrigel en presencia de células no mioepiteliales (control), de
células mioepiteliales HMS (HMS), de células mioepiteliales HMS
transfectadas con rAAV
(rAAV-maspina-HMS). Los resultados
demuestran que las células mioepiteliales que sobreexpresan maspina
son muy efectivas bloqueando la invasión de las células de
carcinoma en Matrigel. Particularmente, el efecto de los clones
mioepiteliales transfectados que expresan la maspina recombinante
provocó un 200% de incremento de la inhibición de la invasión en
los ensayos de inhibición de la invasión.
El término "transducir" se utiliza en su
sentido más amplio y se refiere a un proceso en el que un vector
entra en el interior de una célula de manera que los
polinucleótidos del vector se liberan en la célula.
El término "secuencias de control" se
refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo
hospedador particular. Las secuencias de control apropiadas para
procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un punto de unión ribosómico. Es conocido
que las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación, y potenciadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando se relaciona de manera funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN correspondiente a
una presecuencia o guía secretora se une operativamente al ADN
correspondiente a un polipéptido si este se expresa como una
preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o potenciador se enlaza operativamente a una secuencia de
codificación si esta influye en la transcripción de la secuencia; o
un punto de unión ribosómico se enlaza operativamente a una
secuencia de codificación si se posiciona de tal manera que
facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente"
implica que las secuencias de ADN que se relacionan son contiguas
y, en el caso de una guía secretora, contiguas y en fase para la
lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos.
El enlace puede lograrse mediante la unión en las dianas de
restricción apropiadas. Si tales dianas no existen, los adaptadores
sintéticos oligonucleotídicos o los conectores pueden usarse según
la práctica convencional.
"Polinucleótido" y "ácido nucleico" se
refiere a moléculas de cadena simple o doble que pueden ser ADN,
comprendiendo las bases nucleotídicas A, T, C y G, o ARN,
comprendiendo las bases A, U (en lugar de T), C, y G. El
polinucleótido puede ser una cadena codificante o su complementaria.
Las moléculas de polinucleótido pueden ser idénticas en secuencia a
la secuencia que se encuentra de manera natural o puede incluir
codones alternativos que codifican el mismo aminoácido tal como se
encuentra en la secuencia en forma natural (ver, Lewin "Genes
V" Oxford University Press Chapter 7, pp.
171-174 (1994)). Además, las moléculas de
polinucleótido pueden incluir codones que representen las
sustituciones conservativas de los aminoácidos tal y como se
describe. El polinucleótido puede ser ADN genómico o ADNc.
"Polipéptido" se refiere a una molécula
compuesta de aminoácidos que corresponden a aquellos codificados
por una secuencia de polinucleótidos natural. El polipéptido puede
incluir sustituciones conservativas en las que el aminoácido
presente de forma natural sea reemplazado por otro con propiedades
similares, donde tales sustituciones conservativas no alteran la
función del polipéptido (ver, Lewin "Genes V" Oxford
University Press Chapter 1, pp. 9-13 (1994)).
Las estrategias de terapia génica descritas en
el presente documento se basan en la destrucción selectiva de la
célula epitelial de la mama (donde surgen los cánceres) y/o en la
potenciación de las funciones de las células mioepiteliales (que
son supresores naturales del cáncer). La presente invención se basa
en las observaciones de los diferentes papeles que juegan los
linajes celulares del epitelio y mioepitelio ductal en el desarrollo
del cáncer de mama y en el hecho de que estos tipos celulares
expresan diferencialmente productos génicos que pueden ser dianas
para vectores específicos de células. En este contexto, surgen
nuevas estrategias que pueden utilizarse como medio para la
diagnosis del carcinoma de mama, su profilaxis y su tratamiento.
Una primera estrategia es transducir selectivamente células
epiteliales del lumen de manera que no se desarrolle el carcinoma
de mama. Una segunda estrategia consiste en transducir células
mioepiteliales como un medio de reforzar la defensa mioepitelial de
manera que incluso si se desarrolla un DCIS, este quede confinado en
el sistema ductal indefinidamente.
La presente invención se beneficia de la
observación de que el cáncer de mama temprano puede tomarse como
una enfermedad del sistema ductal que surge del epitelio ductal y
de que el cáncer de mama humano surge en el sistema ductal de la
mama exclusivamente a partir de células epiteliales que están
localizadas en los conductos mamarios. A lo largo de la presente
descripción, las células epiteliales de los conductos mamarios son
denominadas con varios nombres aceptados en el campo de la técnica,
por ejemplo células epiteliales ductales, células epiteliales
acinares, células epiteliales del lumen, etc. (ver, por ejemplo
Virchows et al., Arch. 391(1): 45-51
(1981); Cristov et al., Am. J. Pathol. 138(6):
1371-7 (1991); Lochter, Biochem. Cell Biol.
76(6): 997-1008 (1998); Lakhani et
al., I. Pathol. 189(4): 496-503 (1999)).
Las diferentes denominaciones se utilizan con el objetivo de dar
claridad en el contexto en el que se utilizan y todas se refieren a
células epiteliales que pueden ser selectivamente transducidas
mediante vectores que son específicos para el CAR que expresan
estas células. Preferiblemente, dichas células residen en el
sistema ductal de la mama. Cuando el cáncer queda confinado en
dicho sistema se denomina carcinoma ductal in situ o DQS.
Recientes pruebas sugieren que los determinantes de la progresión
del DCIS a cáncer invasivo son más de carácter epigenético que de
carácter genético y consiste en una intensa regulación de la
paracrina a causa de la vecindad de células mioepiteliales (T.
Kuukasjarvi et al. (1997) Am. J. Pathol.,
150:1465-1471). Las células mioepiteliales son
células que rodean este sistema ductal y mantienen confinado el
cáncer en desarrollo denominado carcinoma ductal in situ
(DCIS). A causa de su proximidad, se espera que las células
mioepiteliales ejerzan una importante influencia paracrinal en la
progresión del DCIS. Las células mioepiteliales cumplen este
cometido mediante la producción y secreción de varios inhibidores
proteinasa.
Las células mioepiteliales de la mama difieren
en varios aspectos de las células ductales del lumen y de las
células epiteliales acinares: carecen de la expresión del receptor
hormonal común, ER-1, y de sus genes de respuesta
tales como el PR; están localizadas al lado de la membrana basal y
contribuyen a la síntesis de esta estructura; raramente se
transforman o proliferan y cuando lo hacen, sólo aparecen
neoplasmas benignos de grado leve (M.D. Sternlicht y S.H Barsky
(1997) Medical Hypotheses, 48:37-46). Las células
mioepiteliales son omnipresentes en los conductos normales, en las
proliferaciones benignas tales como la adenosis y en las
proliferaciones precancerosas, por ejemplo en DCIS. Estos estudios
acumulativos sugieren que el DCIS es un cáncer de mama en todo el
sentido genético, biológico y clínico de la palabra, pero limitado
en los confines del sistema ductal por las células mioepiteliales.
Tanto las células mioepiteliales como las células epiteliales
pueden ser dianas para la terapia génica ductal ya que se pueden
identificar vectores específicos que sean específicos selectivamente
para cada uno de los tipos de célula.
Los descubrimientos descritos en este documento
permiten aproximaciones específicas a la terapia génica para llevar
a cabo las estrategias discutidas arriba. Un primer descubrimiento
es la posibilidad de tener acceso a la totalidad del sistema ductal
de la mama a través de la identificación y la canulación de los
conductos del pezón. Un segundo descubrimiento es que las células
epiteliales ductales primarias de la mama expresan el receptor
coxsackievirus-Ad (CAR, ver por ejemplo, J.
Bergelson et al. (1997) Science
275:1320-1323) y se transducen fácilmente con
vectores que tienen acceso al interior de la célula a través del
canal mediado por CAR (como ciertos grupos de adenovirus)
considerando que las células mioepiteliales carecen de CAR y son
completamente resistentes a la transducción mediante vectores que
son específicos para esta molécula. Tal como se ilustra en la Tabla
I a continuación, un tercer descubrimiento es que las células
mioepiteliales no expresan CAR y, en cambio, expresan el
proteoglicano heparán sulfato en la superficie de la célula (ver,
por ejemplo, Summerford et al., J.Virol. 72(2),
1438-1445 (1998)) y se transducen fácilmente con
vectores tales como el rAAV, que acceden al interior de la célula a
través del canal mediado por el proteoglicano heparán sulfato
considerando que las células epiteliales ductales no expresan este
proteoglicano y son resistentes a la transducción mediante vectores
que son específicos para esta molécula. Estos descubrimientos están
apoyados por varios experimentos con xenoinjertos mioepiteliales y
líneas celulares establecidas (tanto inmortalizadas como en un
episodio limitado de corta duración), que además demuestran la
selectividad del rAAV para la diana mioepitelial.
La Tabla 1 muestra un alto contenido de
proteoglicano heparán sulfato en la superficie celular de células
mioepiteliales (HMS-1)
Todos los datos representan valores medios
obtenidos a partir de dos o más determinaciones sobre la misma
muestra. El ácido urónico se midió en microgramos por miligramo de
tejido (peso seco) y en microgramos por microgramo de ADN. CS,
sulfato de condroitina; HA, ácido hialurónico; HS Sulfato de
heparán; DS, Sulfato de dermatán; KS, sulfato de queratina; no
determinado.
Los descubrimientos descritos en el presente
documento ilustran la posibilidad de que, utilizando una
aproximación ductal y vectores virales específicos para células tal
como rAD, se intervenga selectivamente y se destruya el epitelio
mamario in vivo mientras que el mioepitelio subyacente se
preserve. Además, estos descubrimientos ilustran la posibilidad de,
utilizando la aproximación intraductal y diferentes vectores
virales específicos como el rAAV, que son específicos para el
mioepitelio in vivo, con un vector que contiene una molécula
capaz de inhibir el crecimiento de las células epiteliales del
lumen y la invasión como un medio de apoyar los efectos supresores
de estas células. Adicionalmente, estos descubrimientos permiten la
utilización de genes reporteros que contienen rAd y rAAV deficientes
en la replicación para estudios de diagnóstico que evalúan la
expansión de un tipo celular específico. Mientras que varias de las
realizaciones de los métodos descritos en el presente documento
pueden utilizarse para el tratamiento de cualquier glándula
exocrina, son particularmente útiles en el tratamiento de la
glándula mamaria.
Los procedimientos descritos en el presente
documento superan varias de las limitaciones de los procedimientos
conocidos en el campo de la técnica. Concretamente, cuando una
variedad de vectores (por ejemplo, vaccina, sindbis y ciertos
vectores adenovirales y retrovirales) exhiben un amplio tropismo
tisular y se utilizan para transducir varios linajes celulares
incluyendo células epiteliales y mioepiteliales, la amplia
especificidad de estos vectores incluso puede llegar a limitar su
utilidad. En particular, aunque los vectores que presentan un
amplio tropismo tisular están favorecidos en ciertas
circunstancias, esta propiedad es una desventaja en situaciones
donde es deseable transducir selectivamente un linaje celular
específico que está presente en una población de diferentes linajes
celulares mezclados. Por ejemplo, los técnicos que utilizan in
vivo vectores con un amplio tropismo tisular pueden verse
obligados a utilizarlos únicamente en circunstancias donde una
respuesta inmunológica rápida del hospedador evite que escapen del
medio en el que han sido introducidos. Los vectores y los
procedimientos descritos en el presente documento superan tales
problemas permitiendo al experto transducir selectivamente un
linaje concreto (tal como células epiteliales o mioepiteliales) que
está presente en una población de células de diferentes linajes
mezclados. Concretamente, los procedimientos que utilizan vectores
que transducen selectivamente un linaje específico restringen la
capacidad de tales vectores para acceder al interior de las células
de diferentes linajes próximos (los cuales no están transducidos
por el vector), y en consecuencia inhibir la salida de tales
vectores del medio en el que se han introducido.
Una característica significativa de los
procedimientos descritos en el documento es la identificación y la
utilización de vectores específicos para células que tienen la
capacidad de transducir selectivamente células epiteliales y no
transducir células mioepiteliales. Concretamente, ya que estos
vectores acceden al interior de la célula diana a través de una
molécula que se expresa en las células epiteliales pero no en las
mioepiteliales, éstos pueden utilizarse para transducir
selectivamente células epiteliales en una población de células
epiteliales y mioepiteliales mezcladas.
Pueden utilizarse varios vectores diferentes que
acceden al interior de células a través de la molécula de CAR para
transducir selectivamente las células epiteliales. Las cepas de los
virus coxsakie B (tales como coxsakie B3 y R4) entran, por ejemplo,
en las células a través de los canales mediados por CAR (ver, por
ejemplo, Bergelson et al., J.Virol. 72(1),
415-419 (1998)). Por lo tanto, los vectores víricos
coxsackie pueden utilizarse para transducir selectivamente una
célula epitelial en un sistema ductal de una glándula mamaria que
expresa moléculas CAR. Además, ciertos subgrupos de adenovirus
también acceden al interior de la célula a través de CAR. En
particular, todos los serotipos de los subgrupos A (por ejemplo,
Ad12), C (por ejemplo, Ad1, Ad2, Ad5 y Ad6), D (por ejemplo, Ad9,
Ad15, Ad30 y Ad37), E (por ejemplo, Ad4), y F (por ejemplo, Ad40 y
Ad41) utilizan CAR como receptor celular fibroso (ver, por ejemplo,
Roelvink et al., J. Virol. 72(10):
7909-7915 (1998)).Sin embargo, es importante indicar
que los adenovirus pueden ser específicos para diferentes moléculas
que se expresan en las células diana y que no todas las cepas de
adenovirus pueden utilizarse para transducir selectivamente células
epiteliales que expresen CAR (ver, por ejemplo, Nalbantoglu et
al., Hum. Gene Ther. 10(6): 1009-1019
(1999)). Por ejemplo, los adenovirus del subgrupo B (por ejemplo,
Ad3, Ad7 y Ad35) parecen interactuar con las células diana a través
de un receptor celular distinto a CAR y pueden no funcionar en los
procedimientos descritos (ver, por ejemplo, Stevenson et
al., J. Virol. 69(5): 2850-2857 (1995)).
Así, es importante establecer que cualquier vector (adenovirus u
otros) utilizados en los procedimientos descritos pueden transducir
selectivamente células epiteliales mientras no transduzcan las
células mioepiteliales próximas.
Adicionalmente a los vectores con un tropismo
natural hacia CAR, es conocido en la técnica que se pueden
construir una amplia variedad de vectores específicos para una
molécula concreta, como es CAR, de una célula. En particular, la
especificidad para la célula diana de los vectores de inserción
puede proporcionarse mediante la incorporación de un dominio de
unión específico para la célula diana mediante la utilización de
cualquier dominio de unión, que se una específicamente a un punto
de unión de la célula diana (ver, por ejemplo, Patente U.S. N°
5,834,589). Ya que se ha identificado el CAR que se une con los
residuos de las proteínas fibrosas adenovirales (ver, por ejemplo,
Santis et al., J. Gen. Virol. 80(Pt 6):
1519-1527 (1999)) y ya que la actividad de unión de
CAR con adenovirus se ha localizado en el dominio amino terminal
relacionado con IgV de la molécula, el experto en la materia puede
preparar vectores específicos para este dominio de enlace.
Tal como se indica arriba, ciertos vectores
virales pueden acceder al interior de las células a través de
múltiples receptores expresados en la superficie de la célula. Por
ejemplo, ciertos subtipos adenovirales pueden acceder al interior
de las células a través del dominio I \alpha2 de clase MHC o de
los pertenecientes a la familia de las integrinas \beta2 (ver, por
ejemplo, Davison et al., J. Virol. 73(5):
4513-4517 (1999) y Huang et al. J. Virol.
70(7): 4502-4508 (1996)). Así, es importante
establecer que cualquier vector (adenovirus u otro) utilizado para
transducir selectivamente las células epiteliales no transducirá
las células mioepiteliales próximas. En particular, ya que ciertos
vectores son capaces de acceder a la célula diana a través de más de
un receptor, es razonable comprobar la especificidad celular de
cualquier vector candidato. Los procedimientos para comprobar la
especificidad de un vector candidato son conocidos en la técnica y
simplemente consisten en poner en contacto una célula diana de
interés con un vector candidato y observar si ocurre la
transducción. En estas circunstancias, la Figura 3 proporciona un
ejemplo ilustrativo de la comprobación del vector adenoviral
utilizado en los ejemplos descritos. En particular, la Figura 3A
muestra la ausencia de expresión de la
\beta-galactosidasa en las células mioepiteliales
que han sido puestas en contacto con un adenovirus recombinante que
contiene \beta-galactosidasa para ilustrar como
la expresión de CAR en la superficie de las células epiteliales
permite seleccionar específicamente las células epiteliales y como
la ausencia de CAR en las células mioepiteliales aporta resistencia
a la célula contra la infección adenoviral. En contraste, la Figura
3B muestra la intensa expresión de la
\beta-galactosidasa en las células epiteliales
que han sido puestas en contacto con un adenovirus recombinante que
contiene una \beta-galactosidasa como ilustración
de como la expresión de CAR en la superficie de las células
epiteliales permite la transducción selectiva de las células
epiteliales.
Una característica significativa de los
procedimientos de la invención descritos en el documento es la
identificación y la utilización de vectores celulares específicos
que tienen la capacidad de transducir selectivamente células
mioepiteliales y no transducir células epiteliales. Concretamente,
ya que estos vectores acceden al interior de las células diana a
través de una molécula que se expresa en las células mioepiteliales
pero no en las epiteliales, pueden utilizarse para transducir
selectivamente células mioepiteliales en una población de células
mioepiteliales y epiteliales mezcladas.
Pueden utilizarse distintos vectores que acceden
al interior de células a través de la molécula de proteoglicano
sulfato de heparán para transducir selectivamente las células
mioepiteliales. El parvovirus humano, el virus
adenoasociado-2 (AAV), puede, por ejemplo, entrar en
las células a través del canal mediado por el proteoglicano heparán
sulfato (ver, por ejemplo, C. Summerford y R.J. Samulski, J.
Virology 72:1438-1445)). Adicionalmente, se cree
que la especificidad celular de los virus del herpes viene dada por
sus moléculas de proteoglicano heparán sulfato (ver, por ejemplo,
Zhu et al., P.N.AS. 92(8): 3546-3550
(1995)). Sin embargo, es importante indicar que los vectores
virales pueden unirse a diferentes moléculas que se expresan en las
células diana y/o que pueden utilizar coreceptores para acceder a
una célula (ver, por ejemplo, Summerford et al., Nat. Med.
5(1): 78-82 (1999) y Qing et al.,
Nat. Med. 5(1):71-11 (1999)). Por lo tanto,
es importante establecer que cualquiera de los vectores (virus
adenoasociado-2 u otros) utilizados en los
procedimientos descritos puede transducir selectivamente células
mioepiteliales siempre que no transduzca las células epiteliales
próximas.
Adicionalmente a los vectores con un tropismo
natural hacia el proteoglicano heparán sulfato, es conocido en la
técnica que se pueden construir una amplia variedad de vectores
específicos para una molécula concreta de una célula tal como el
proteoglicano heparán sulfato. En particular, la especificidad de
los vectores de inserción para la célula diana puede proporcionarse
mediante la incorporación de un dominio de unión específico para la
célula diana mediante la utilización de cualquier dominio de unión,
el cual se una específicamente a un punto de unión de la célula
diana (ver, por ejemplo, Patente U.S. N° 5.834.589).
Tal como se indica arriba, ciertos vectores
virales pueden acceder al interior de las células a través de
múltiples receptores expresados en la superficie de la célula. Por
ejemplo, el virus adeno-asociado 2 puede acceder al
interior de las células a través del receptor 1 del factor de
crecimiento del fibroblasto humano o de las integrinas
\alphaV\beta (ver, por ejemplo, Summerford et al., Nat.
Med. 5(1): 78-82 (1999) y Qing et al.,
Nat. Med. 5(1): 71-11 (1999)). Así, es
importante establecer que cualquier vector (virus
adeno-asociado 2 u otro) utilizado para transducir
selectivamente las células mioepiteliales no transducirá las
células epiteliales próximas. En particular, ya que ciertos
vectores son capaces de acceder a la célula diana a través de más de
un receptor, es razonable comprobar la especificidad celular de
cualquier vector candidato. Los procedimientos para comprobar la
especificidad de un vector candidato son conocidos en el campo de
la invención y simplemente consisten en poner en contacto la célula
diana de interés con un vector candidato y observar si ocurre la
transducción. En estas circunstancias, la Figura 4 proporciona un
ejemplo ilustrativo de la valoración del virus
adeno-asociado 2 utilizado en los ejemplos
descritos. En particular, la Figura 4A muestra la expresión del gen
reportero en células mioepiteliales puestas en contacto con un
virus adeno-asociado recombinante que contiene un
gen reportero humano de fluorescencia verde que ilustra cómo la
expresión del proteoglicano sulfato de heparán en la superficie de
las células mioepiteliales permite la selección específica de las
células mioepiteliales. En comparación, la Figura 4B muestra
únicamente la expresión de fondo del gen reportero en células
epiteliales puestas en contacto con un virus
adeno-asociado recombinante que contiene un gen
reportero humano de fluorescencia verde e ilustra cómo la expresión
del proteoglicano heparán sulfato en la superficie de las células
mioepiteliales permite la transducción selectiva de las células
mioepiteliales.
Los procedimientos para la preparación y la
manipulación de vectores tales como los virus
adeno-asociados recombinantes descritos en el
presente documento son conocidos en campo de la invención, por
ejemplo se describen en las patentes U.S. Nos. 5.681.731,
5.585.362, 5.756.283 y 5.843.742. Tal como se describe a
continuación, en la práctica de las realizaciones de la invención
descritas en el presente documento pueden utilizarse varias técnicas
aceptadas en el campo de la invención. Aunque los vectores de la
invención puedan ser conocidos, también pueden manipularse para
facilitar su utilización en los procedimientos descritos en el
presente documento. Por ejemplo, un ácido nucleico (por ejemplo,
ADNc o ADN genómico) que contenga una región de regulación, tal
como un promotor o un potenciador, puede insertarse en el interior
de un vector específico para células para la clonación
(amplificación del ADN) o para la expresión. Alternativamente, en
un vector específico para una célula puede insertarse un ácido
nucleico que codifique un gen de interés tal como un gen suicida o
un gen supresor tumoral para su expresión en una célula diana.
La secuencia de ácido nucleico de interés puede
insertarse en un vector mediante una variedad de procedimientos.
Generalmente, el ADN se inserta en un(os) sitio(s) de
restricción endonucleasa apropiado(s) utilizando las
técnicas conocidas en el campo de la invención. Los componentes
vectoriales generalmente incluyen, pero no están limitados a, una o
más secuencias de señalización, un origen de replicación, uno o más
genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una
secuencia de terminación de la transcripción. En la construcción de
los vectores apropiados que contienen uno o más de estos
componentes se emplean técnicas estándar de unión que son conocidas
para el experto en la materia.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación pueden contener una secuencia de ácido nucleico que
permita la replicación del vector en uno o más hospedadores
seleccionados. Estas secuencias son bien conocidas para varios
mamíferos, bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación
del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias
Gram negativas, el origen del plásmido 2: es apropiado para
levaduras, y varios orígenes de virus (SV40, polioma, adenovirus,
VSV o BPV) son útiles para la clonación de vectores en células de
mamífero.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación normalmente contendrán un gen de selección, también
denominado marcador selectivo. Los genes de selección típicos
codifican proteínas que (a) proporcionan resistencia a los
antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina,
metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias
auxotróficas, o (c) proporciona nutrientes críticos no disponibles
en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la
d-Alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcador selectivo para células de
mamífero son aquellos que permiten la identificación de células
apropiadas como portadoras de un ácido nucleico de interés, por
ejemplo Neomicina, DHFR o timidina quinasa. Cuando se emplea DHFR
natural, una célula hospedadora apropiada es la línea celular CHO
deficiente en actividad DHFR, preparada y desarrollada como
describe Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216
(1980). Un gen de selección apropiado para su utilización en
levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7
[Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et
al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157
(1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una
cepa mutante de levadura sin la capacidad de desarrollarse en
triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1
[Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación normalmente pueden contener un promotor unido
funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico para dirigir la
síntesis de ARNm. Se conocen los promotores reconocidos por varias
de las potenciales células hospedadoras. Los promotores apropiados
para su utilización con hospedadores procariotas incluyen la
\beta-lactamasa y los sistemas de promotores
lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et
al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, sistema de
promotor triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057
(1980); EP 36.776], y promotores híbridos como el promotor tac
[deBoer et al., Proc. Natl. Acad Sci USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para el uso en
sistemas bacterianos también contendrán una secuencia
Shine-Dalgamo (S.D.) unida funcionalmente al ADN que
codifica el ácido nucleico de interés.
La transcripción a partir de vectores en células
hospedadoras de mamífero puede controlarse, por ejemplo, mediante
promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el virus
polioma, el virus fowipox (UK 2.211.504 publicada en Julio 1989),
adenovirus (como el adenovirus 2), el virus papiloma bovino, virus
sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus hepatitis B y
el virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores mamíferos
heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de
inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, ya que
tales promotores son compatibles con los sistemas celulares
hospedadores. Adicionalmente, un polinucleótido de interés puede
estar bajo la regulación transcripcional de un promotor inductor
como el promotor Tet. Alternativamente, puede estar bajo el control
de un promotor específico para la célula o el tejido epitelial. Los
promotores específicos para las células epiteliales, tales como la
proteína ácida sérica (wap), puede utilizarse en la expresión
específica de un gen dado, por ejemplo, un gen suicida, en las
células epiteliales ductales. También pueden utilizarse promotores
que controlen los genes supresores tumorales naturales, tales como
Maspina, p53 o Mcs-1 (rata), los genes de caja
homeótica que se expresan en las células normales pero no en las
células cancerosas.
La transcripción mediante las células de
mamífero de un ADN que codifica un polinucleótido de interés puede
incrementarse insertando la secuencia de un potenciador en el
vector. Los potenciadores son elementos de ADN con actividad cis,
normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pb, que
actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. A partir
de los genes de mamífero actualmente se conocen muchas secuencias
de potenciadores (globina, elastasa, albúmina, ``-fetoproteína, e
insulina). Sin embargo, normalmente se utilizará un potenciador
proveniente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen
el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador temprano del promotor del
citomegalovirus, el potenciador polioma en el lado tardío del
origen de replicación, y los potenciadores adenovirales. El
potenciador puede estar insertado en el vector en la posición 5' o
3' de la secuencia de codificación, pero preferiblemente está
localizado en un punto 5' desde el promotor.
Los procedimientos de la invención descritos en
el presente documento permiten la transducción selectiva de las
células mioepiteliales. Una realización ilustrativa de la invención
es un procedimiento para la transducción selectiva de una célula
entre una población de células ductales epiteliales y
mioepiteliales mezcladas, que comprende el paso de poner en
contacto la célula con un vector específico para la célula que
transduce la célula a través de una molécula que solamente se
expresa en la célula mioepitelial. En una realización preferida de
la presente invención, la población de células ductales epiteliales
y mioepiteliales mezcladas está en el sistema ductal de una
glándula mamaria y las células que van a ser transducidas se ponen
en contacto con el vector mediante canulación ductal.
En una realización preferida de la presente
invención, la célula es una célula mioepitelial que se transduce
con un vector (por ejemplo un virus adeno-asociado
recombinante) que comprende un gen que codifica un polipéptido que
inhibe el desarrollo del cáncer. En una realización específica de
la presente invención, el vector contiene un elemento cis que
modula la expresión del gen en presencia de un factor trans
presente en la célula mioepitelial. En realizaciones preferidas de
este procedimiento, el polipéptido inhibe la proliferación de una
célula epitelial ductal, la invasión de la célula epitelial ductal,
la migración endotelial, la angiogénesis o los incrementos de la
producción de óxido nítrico de la célula mioepitelial. Los
polipéptidos ilustrativos incluyen maspina,
trombospondina-1, TIMP-1, proteasa
nexina-II, antitripsina \alpha-1
y receptor bFGF soluble. Preferiblemente, el polipéptido induce la
muerte (por ejemplo mediante apoptosis) de una célula epitelial
ductal.
El documento también describe un procedimiento
para transducir selectivamente una célula en un sistema ductal en
una glándula mamaria seleccionada del grupo que consiste en una
célula epitelial ductal y en una célula mioepitelial ductal, que
comprende poner en contacto, mediante canulación ductal, a la
célula con un vector que es específico para la molécula de
proteoglicano heparán sulfato que se expresa en la célula
mioepitelial. El documento también describe un procedimiento para
transducir selectivamente una célula mioepitelial en un sistema
ductal en una glándula mamaria, que comprende poner en contacto,
mediante canulación ductal, la célula con un vector que es
específico para la molécula de proteoglicano heparán sulfato que
expresa la célula.
En otra realización relacionada, la invención
consiste en un procedimiento para transducir células mioepiteliales
en una población de células ductales epiteliales y mioepiteliales
mezcladas, sin transducir las células epiteliales ductales
próximas, a través de poner en contacto a las células
mioepiteliales con un vector que accede a las células mioepiteliales
a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada
por las células mioepiteliales. En otra realización relacionada, la
invención consiste en un procedimiento para transducir células
mioepiteliales en una población de células ductales epiteliales y
mioepiteliales mezcladas, sin transducir las células epiteliales
ductales, a través de poner en contacto las células mioepiteliales
con un vector que accede a las células mioepiteliales a través de
una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada por las
células mioepiteliales pero no expresada por las células
epiteliales.
Los métodos profilácticos descritos en el
documento incluyen métodos para tratar profilácticamente y
selectivamente a una célula en el conducto de una mama contra una
enfermedad que afecta al epitelio ductal de la mama como es el
cáncer. Una realización de estos métodos consiste en transducir
selectivamente tanto una célula epitelial del lumen como una célula
mioepitelial (o ambas, la célula epitelial del lumen y la célula
mioepitelial) en el conducto de una mama, mediante la utilización
de la canulación ductal para poner en contacto la célula de interés
con un vector que es específico para una molécula que se expresa
tanto en la célula epitelial del lumen como en la célula
mioepitelial. Dependiendo de cual sea la célula puesta en contacto,
los vectores utilizados en estos métodos se utilizan para provocar
una actividad biológica deseada por ejemplo la citólisis o la
expresión de una molécula efectora soluble.
En una realización de ejemplo, el método
comprende poner en contacto, preferiblemente mediante canulación
ductal, a una célula mioepitelial con un vector que suprime el
crecimiento de las células cancerosas o provoca la destrucción de
epitelio ductal en parte o en su totalidad de manera que se inhiba
la formación de cáncer de origen epitelial ductal. En otra
realización ilustrativa, la invención consiste en un método de
tratamiento del epitelio ductal de una glándula mamaria contra el
cáncer de origen epitelial ductal, el cual comprende el paso de
poner en contacto, mediante canulación ductal, una célula en el
epitelio ductal de la glándula mamaria seleccionada del grupo que
consiste en una célula epitelial ductal y una célula mioepitelial,
con un vector que accede a la célula a través de una molécula de
proteoglicano heparán sulfato que expresa la célula mioepitelial,
donde la expresión de polinucleótidos del vector transducido de esta
manera inhibe la formación de cáncer originado en células
epiteliales ductales.
El documento describe métodos de tratamiento
profiláctico donde las células mioepiteliales de una glándula
mamaria se tratan profilácticamente con un vector específico para
células que comprende un polinucleótido que codifica una molécula
supresora de manera que se inhibe la formación del cáncer originado
en el epitelio ductal.
Los métodos profilácticos para tratar una
glándula mamaria que se describen en el presente documento son
particularmente útiles para el tratamiento de una glándula mamaria
en un mamífero con riesgo de desarrollar cáncer de mama. La
glándula mamaria puede estar caracterizada por no haber tenido
nunca un tumor, por haber tenido un tumor previamente pero que ya
no es detectable gracias a otro tratamiento terapéutico previo, o
que tenga un tumor incipiente u oculto, preneoplasia o hiperplasia
ductal. Normalmente, las hiperplasias y los tumores incipientes u
ocultos no son detectables mediante el examen físico o la
radiología. En consecuencia, el método profiláctico será utilizado
en los casos en los que existan razones para tomar medidas
profilácticas, tales como cuando existen factores hereditarios de
predisposición al cáncer, cuando existan lesiones sospechosas en la
mama con la posibilidad de que desarrollen malignidad, cuando ha
habido exposición a agentes carcinogénicos ambientales, cuando la
edad predispone al cáncer, cuando aparece cáncer en otra glándula,
por ejemplo, en la glándula mamaria de la mama contralateral,
sugiere propensión al desarrollo del cáncer, o cuando existe una
temor o sospecha de metástasis.
Los métodos descritos en el documento también
pueden combinarse con otros métodos de tratamiento profiláctico y
terapéutico adicionales a los citados en el presente documento, por
ejemplo los métodos que se basan en la destrucción de células
cancerosas, por ejemplo, siendo específicos para marcadores de la
superficie celular, ligandos de receptores, por ejemplo, ligandos
de los receptores de los liberadores peptídicos de gastrina, los
antígenos asociados a tumores, por ejemplo la citoqueratina de 57 kD
o el antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal GB24, la
matriz extracelular glicoproteica tenascina, oncogenes antisentido
tales como c-fos, genes de caja homeótica que se
expresan en células cancerosas pero no en células normales,
linfocitos infiltrados en el tumor que expresan citoquinas,
péptidos y proteínas que contienen RGD, los cuales se administran a
posteriormente a la cirugía, liposomas que contienen fármacos
Iipofílicos que están conjugados covalentemente con anticuerpos
monoclonales para ser específicos para células cancerosas, dieta
baja en grasa, ejercicio físico moderado y modulación hormonal.
El epitelio ductal preferiblemente se pone en
contacto con el agente mediante la introducción del agente a través
del conducto del epitelio ductal exocrino, por ejemplo mediante
canulación ductal. En la glándula mamaria hay de 6 a 9 conductos
mayores que se originan en el pezón y que se ramifican en otros
conductos, y acaban en las estructuras
lóbulo-alveolares (Russo et al. (1990),
supra). En consecuencia, en algunas circunstancias, como por
ejemplo en las que se necesita o se desea un tratamiento más
localizado, por ejemplo, por la elección de un agente anticáncer,
puede ser preferible acceder al epitelio ductal de la glándula
exocrina a través de uno de estos conductos mayores que conectan
con la estructura lóbulo-alveolar. En este aspecto,
la canulación ductal permite la inyección intratumoral.
Los procedimientos para la canulación ductal son
conocidos en campo de la invención (ver por ejemplo S.M. Love y
S.H. Barsky (1996) The Lancet, 348:997-999; Makita
et al., Breast Cancer Res. Treat.18:179-188
(1991) y Okazaki et al., Jpn. Clin. Oncol.
21:188-193 (1991)). En resumen, una mama puede
preparase y cubrirse, con los orificios de los conductos de la mama
identificados con lupas de magnificación o mediante los
procedimientos descritos a continuación. A continuación se pueden
canular uno o más conductos con una cánula de las conocidas en el
campo de la técnica tal como una sonda ductal de metal rígido (6 FR
Taber-Rothschild Galacrography Kit, Manan Medical
Products Inc., Northbrook, Illinois).
Para facilitar la localización de cada uno de
los orificios en un pezón de una mama se pueden emplear
procedimientos para marcar temporalmente y localizar cada uno de los
orificios en un pezón de una mama como se describe en el documento
U.S. 09/153,564. Además, en los documentos U.S. 09/067.661 y
09/301.058 se describen procedimientos adicionales para acceder y
evaluar las células de un conducto de la mama. Por ejemplo, se
puede introducir una sustancia detectable, como por ejemplo un
agente de marcaje, tinte, o similar, en el pezón de manera que la
sustancia queda localizada y/o acumulada en el orificio o cerca de
él para permitir la detección visual, automatizada u de otro tipo.
Alternativamente, se pueden utilizar otros estímulos para inducir
una respuesta, cambio, o reacción en la localización del orificio
en el pezón o cerca de él. Por ejemplo, puede ser posible iluminar
el pezón con una luz determinada o con otros tipos de energía que
ayuden a distinguir entre el orificio y las otras superficies
tisulares. También puede ser posible la introducción de reactivos
químicos que reaccionen con las secreciones ductales en el orificio
para mejorar la visibilidad, por ejemplo para generar un producto
de reacción visible o detectable de otra manera.
En otra realización particular de los métodos de
tratamiento profiláctico descritos en el documento, el mioepitelio
de una glándula mamaria puede tratarse profilácticamente contra el
cáncer de manera que se inhiba la formación de cáncer originado en
el epitelio ductal. El método comprende poner en contacto,
preferiblemente mediante canulación ductal, el mioepitelio de la
glándula mamaria con un vector que comprende una molécula que
inhibe la formación del cáncer originado en el epitelio ductal, por
ejemplo maspina. En una realización preferida de la invención, el
vector es un virus adeno-asociado recombinante que
es específico para una molécula de proteoglicano heparán sulfato
expresada por la célula mioepitelial y comprende un polipéptido que
inhibe el desarrollo del cáncer celular epitelial. En una
realización específica, el polipéptido del virus
adeno-asociado recombinante inhibe la angiogénesis o
la proliferación, la invasión o la metástasis de una célula
epitelial del lumen. En una realización concreta, el polipéptido es
maspina, trombospondina-1, TIMP-1,
proteasa nexina-II, \alpha-1
antitripsina o el receptor soluble bFGF.
Además de los vectores virales
adeno-asociados descritos en el presente documento
se contemplan otros vectores. Por ejemplo, se cree que la
especificidad celular de los virus del herpes viene dada por sus
moléculas de proteoglicano heparán sulfato (ver, por ejemplo, Zhu
et al., P.N.AS. 92(8): 3546-3550
(1995)). Así, los vectores víricos de herpes como los conocidos en
el campo de la técnica (ver, por ejemplo, Levatte et al.,
Neuroscience 86(4): 1321-1336 (1998)),
también pueden utilizarse para transducir selectivamente una célula
en un sistema ductal en una glándula mamaria que expresa moléculas
de proteoglicano heparán sulfato. Además, es conocido en el campo
de la técnica que se pueden construir una amplia variedad de
vectores que sean específicos para una molécula en concreto, tal
como el proteoglicano heparán sulfato, en una célula. En
particular, la especificidad para la célula diana de los vectores
de inserción puede proporcionarse mediante la incorporación de un
dominio de enlace específico para la célula diana mediante la
utilización de cualquier dominio de enlace que se enlace
específicamente con un punto de unión de la célula diana (ver, por
ejemplo, la patente U.S. 5.834.589).
Las realizaciones de los métodos terapéuticos de
la presente descripción están relacionados y son similares a los
métodos profilácticos descritos arriba e incluyen tratar
terapéuticamente el epitelio ductal de una mama contra una
enfermedad que afecta al epitelio ductal. En una realización de los
métodos terapéuticos descritos en el documento, el epitelio ductal
de una glándula mamaria se trata terapéuticamente contra el cáncer
de manera que se destruyen las células epiteliales cancerosas y no
cancerosas del epitelio ductal y se inhibe la diseminación del
cáncer. En una realización ejemplar, el método comprende poner en
contacto, preferiblemente mediante canulación ductal, a una célula
mioepitelial con un vector que pueda suprimir el crecimiento de las
células cancerosas o provocar la destrucción de las células
cancerosas de origen epitelial ductal en parte o en su totalidad.
En otra realización específica de los métodos terapéuticos, las
células mioepiteliales de la glándula mamaria se ponen en contacto
con un vector específico para células que comprende un
polinucleótido que codifica una molécula supresora de manera que se
inhibe la progresión del cáncer originado en el epitelio ductal. En
tales métodos terapéuticos, el agente destructor del epitelio
podría suprimir el crecimiento o destruir todo el epitelio enfermo
o maligno. Adicionalmente, el epitelio ductal que rodea el epitelio
enfermo/maligno preferiblemente también debería ser suprimido o
destruido.
La descripción describe métodos de tratamiento
el epitelio ductal de una glándula mamaria utilizando métodos
terapéuticos y profilácticos conocidos en el campo de la técnica en
combinación con los métodos profilácticos y terapéuticos descritos
en el presente documento. Los ejemplos de estos métodos aceptados
en el campo de la técnica incluyen la extirpación quirúrgica del
tejido canceroso, la terapia con radiación y la quimioterapia. Tal
combinación de métodos comprendería métodos conocidos en el campo
tales como la extirpación quirúrgica del tejido canceroso y
adicionalmente, a continuación poner en contacto, ya sea
concomitantemente o posteriormente al tratamiento terapéutico, el
epitelio ductal de la glándula mamaria, por ejemplo mediante
canulación ductal, con los vectores específicos para células
descritos en la presente descripción, de manera que se suprima o se
destruya cualquier célula cancerosa o no cancerosa que quede y que
se inhiba la diseminación del cáncer.
La presente descripción además proporciona el
uso en los estudios diagnósticos que pueden evaluar la expansión de
un linaje celular concreto de los vectores específicos para la
célula que contienen genes reporteros. Específicamente, utilizando
los procedimientos de transducción descritos en el presente
documento, se puede determinar si un grupo de células (tales como
las células proliferativas) en el conducto de una mama pertenecen
tanto al linaje epitelial o al mioepitelial. Por ejemplo, se puede
utilizar la canulación ductal para exponer las células epiteliales
del lumen a un vector específico para una célula (como por ejemplo
el rAd de replicación defectuosa) que contiene un gen reportero con
el fin de evaluar la expansión de este linaje asociado al cáncer.
Alternativamente, se puede usar la canulación ductal para exponer
las células mioepiteliales a un vector específico para una célula
(por ejemplo rAAV) que contiene un gen reportero con el fin de
evaluar la expansión de este linaje. De esta manera, el experto en
la materia puede determinar si un grupo de células (por ejemplo un
grupo de células proliferativas) son propensas al cáncer, como en
el caso de las células epiteliales del lumen. Además, los
procedimientos en los que se utilizan vectores específicos para
células que contienen genes reporteros pueden utilizarse para
facilitar la comprobación de la presencia de células cancerosas
ocultas, y por tanto contribuyen en el tratamiento y la prognosis a
largo término.
En el campo de la técnica se conoce una amplia
variedad de genes reporteros y de ensayos que pueden ser adaptados
a los métodos de diagnóstico descritos en la presente descripción.
Por ejemplo, un gen reportero puede codificar un enzima que produce
un cambio colorimétrico o fluorimétrico en la célula hospedadora que
es detectable mediante el análisis in situ y que es una
función cuantitativa o semicuantitativa de la activación
transcripcional. Los enzimas de ejemplo incluyen esterasas,
fosfatasas, proteasas (activador del plasminógeno tisular o
uroquinasa) y otros enzimas capaces de ser detectados por la
actividad que genera un cromóforo o fluoróforo como es conocido
para el experto en la materia. Un ejemplo preferido es la E.
coli beta-galactosidasa descrita en el presente
documento. Este enzima produce un cambio de color al unir el
sustrato indigogénico
indolil-B-D-galactosido
con células que tienen beta-galactosidasa (ver, por
ejemplo, Goring et al., Science, 235:456-458
(1987) y Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,
84:156-160 (1987)). Este enzima es preferido porque
la actividad endógena \beta-galactosidasa en las
células de mamífero normalmente es bastante baja, el sistema
analítico de cribado utilizando
\beta-galactosidasa no está limitado por la señal
de fondo de la célula hospedadora.
Con la finalidad de facilitar la utilización de
los vectores útiles en la terapia génica que son específicos para
las células del conducto de la mama, se establecieron líneas
celulares mioepiteliales inmortalizadas y xenoinjertos
transplantables que provienen de mioepiteliomas humanos de la
glándula salivar benignos (HMS-1,
HMS-X, HMS-3,
HMS-3X), de mama (HMS-4,
HMS-4X) y de bronquios (HMS-6,
HMS-6X) (M.D. Sternlicht et aL (1996) In
Vitro, 32:550-563; MD. Sternlicht et al.
(1997) Clin. Cancer Res., 3:1949-1958; Z. Shao
et al. (1998) Exper. Cell Res., 241:394-403).
Estas líneas celulares y estos xenoinjertos expresan marcadores
mioepiteliales idénticos de la misma manera que sus
correspondientes in situ y muestran un cariotipo diploide
esencialmente normal. Las líneas celulares mioepiteliales y los
xenoinjertos y las células mioepiteliales in situ expresan
constitutivamente grandes cantidades de proteinasa e inhibidores de
la angiogénesis que incluyen TIMP-1, proteasa
nexina-II, \alpha-1 antitripsina,
trombospondina-1, receptores solubles bFGF, y
maspina. Estas moléculas supresoras son bien conocidas en el campo
de la técnica. (Ver en general, Sternlict et al., Lab.
Invest. 74(4):781-796 (1996) y Sternlict
et al., Med. Hypo. 48:37-46 (1997). Además,
acerca TIMP-1, ver U.S. Pat. No. 5.595.885, acerca
la proteasa nexina-II, ver U.S. Pat. No. 5.213.962,
acerca la \alpha-1 antitripsina ver U.S. Pat. No.
5.736.379, acerca la trombospondina-1 ver U.S. Pat.
No. 5.648.461, acerca los receptores bFGF ver 5.750.371, y acerca
maspina ver U.S. Pat. No. 5.470.970.
Las líneas celulares mioepiteliales humanas
inhiben tanto la invasión celular ER positiva como la ER negativa
del carcinoma de mama y la migración endotelial y la proliferación
(angiogénesis) in vitro. Las líneas celulares mioepiteliales
también inhiben la proliferación del carcinoma de mama a través de
la inducción de la apoptosis celular en el carcinoma de mama, un
fenómeno que en el DCIS ocurre a niveles altos (Z. Shao et
al. (1998) Exper. Cell Res., 241:394-403). En
base a los estudios de inmunoprecipitación, la maspina mioepitelial
parece ser la molécula efectora más importante que inhibe la
invasión, y la trombospondina-1 parece ser la
molécula efectora mas importante que inhibe la angiogénesis (S.
Bodis et al. (1996) Cancer, 77:1831-1835).
El óxido nítrico mioepitelial parece ser la molécula efectora más
importante que inhibe la proliferación del carcinoma de mama a
través de su efecto de inducción a la apoptosis (Z. Shao et
al. (1998) Multidiscip. Symposium on Breast Disease).
La presente invención se va a detallar
adicionalmente en los siguientes Ejemplos, que se ofrecen en modo
de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la
invención en modo alguno.
Este ejemplo está relacionado con el
descubrimiento de que las células epiteliales ductales primarias de
la mama expresan CAR, y se transducen fácilmente con rAd
considerando que las células mioepiteliales carecen de CAR y son
completamente resistentes. Se cree que CAR ejerce como mediador, en
parte, de la unión del adenovirus a la membrana celular (J.
Bergelson et al. (1997) Science
275:1320-1323). En este contexto, se pueden
utilizar los siguientes estudios con rAd como una ilustración de los
métodos de la presente invención.
Estudios rAd: se puede utilizar un rAd2 de
replicación deficiente (ver, por ejemplo, Hashimoto et al.,
Biochem. Biophys. Res. Comm., 240: 88-92 (1997))
con un reportero 6-galactosidasa y medir su
capacidad para transducir células epiteliales comparada con células
mioepiteliales a través de aproximaciones ex vivo e in
vivo. Adicionalmente, se pueden utilizar muestras que provienen
de mastectomías y administrar el rAd intracanalicularmente como se
hizo con el rAAV en el siguiente Ejemplo 2. Ya que rAd no se
integra (al contrario que rAVV), el periodo de incubación
probablemente sea menor (del orden de 72-96 horas).
Se puede detectar la \beta-galactosidasa mediante
un ensayo de sustrato en secciones congeladas de las muestras de
mastectomía. A continuación se puede comparar el desarrollo
colorimétrico mioepitelial y el epitelial. En los experimentos en
paralelo, se puede administrar rAd intracanalicularmente a conejos
anestesiados y después de unos pocos días observar la actividad
\beta-galactosidasa en las secciones de sus
mamas. En este punto, se puede comparar la actividad epitelial con
la actividad mioepitelial. Incluso en situaciones en las que se
utiliza un virus de replicación deficiente, se puede medir la
concentración de adenovirus en las heces y la orina de los ratones
mediante ELISA para evaluar cómo la capa mioepitelial ofrece una
barrera para la infección
sistémica.
sistémica.
Este ejemplo está relacionado con el
descubrimiento de que al contrario que en la expresión de CAR por
parte de la las células epiteliales, las células mioepiteliales por
su parte expresan proteoglicano heparán sulfato (HS) y se
transducen fácilmente con rAW. Como se ha descrito en el Ejemplo 1
anterior, las células epiteliales ductales primarias carecen de este
proteoglicano y son resistentes a rAAV. Se cree que el HS de la
superficie celular ejerce de receptor para rAAV lo que determina la
transductabilidad (C. Summerford y RJ. Samulski, J. Virology 72:
1438-1445). En este contexto, se pueden utilizar
los siguientes estudios con rAAV como ilustración de los
procedimientos de la presente invención. Hasta el momento en que se
estableció que rAAV podía utilizarse para transfectar con éxito las
células mioepiteliales (HMS-1), nuestras líneas
celulares fueron totalmente resistentes a la transfección mediante
cualquier otro procedimiento convencional.
Estudios rAAV: se puede partir de rAAV
(ver, por ejemplo, Flannery et al., P.N.A.S., 94:
6916-6921, (1997)). Este virus recombinante contiene
un promotor CMV y la proteína humana fluorescente verde. A
continuación se pueden inyectar concentraciones cada vez mayores de
este virus junto con un tinte supravital, por ejemplo, Lymphazurin
(el tinte del ganglio centinela) para ayudar a guiar las inyecciones
al centro del tumor. A continuación se puede inyectar los
xenoinjertos mioepiteliales descritos en el presente documento
(HMS-X, HMS-3X,
HMS-4X, HMS-6X) con un tamaño de 1
cm de diámetro y después de 1-3 semanas extirpar
estos tumores, cortarlos en secciones finas congeladas y estudiar
la distribución radial de la fluorescencia en relación con el tinte
azul celeste. Como controles, se pueden utilizar tumores carcinoma
no mioepiteliales en los que se podría esperar que la transducción
esté ausente o sea mínima. Mediante estos estudios de inyección
tumoral directa, se puede determinar cómo tiene lugar la
transducción de rAAV en células mioepiteliales seguida de la
expresión génica recombinante in vivo. Si se obtienen
resultados positivos, se puede administrar rAAV
intracanalicularmente a través de la canulación del pezón en
muestras humanas de mastectomía ex vivo y en los pezones de
ratón in vivo. Después de 24 horas se pueden iniciar
explantes de cultivos de órganos de las mastectomías y a
continuación, después de varias semanas, observar la fluorescencia
en las células mioepiteliales en comparación con las células
epiteliales ductales. Ya que los ratones tienen ocho pezones, cada
uno de ellos con 4 sistemas ductales, proporcionan un modelo animal
simple para probar la administración génica intracanalicular.
Después de tres semanas se pueden sacrificar los ratones, seccionar
sus mamas y comparar la fluorescencia epitelial con la
mioepitelial.
Utilizando experimentos in vivo,
expandimos los primeros descubrimientos y se perfilaron los
parámetros que iban a facilitar la práctica de la invención in
vivo. Estos parámetros incluyen la determinación de la dosis
(titración), frecuencia de la administración, periodo de incubación,
periodo de observación, etc. Los controles para todos estos
experimentos correlativos in vitro pueden incluir vectores
no reporteros como no incluir vectores.
Adicionalmente, se excluyó la posibilidad de que
se diera un fenómeno de pseudotransducción en estos ejemplos
(administración de proteína mediada por el vector en vez de
expresión génica) especialmente en los experimentos con rAAV donde
este fenómeno había sido observado por otros. Por ejemplo, en los
experimentos en los que se observó un producto correcto del gen
reportero, verificamos que era la expresión génica la que estábamos
administrando y no sólo proteína mediante un experimento de
dilución volumétrica. Específicamente, los efectos de la dilución
volumétrica deberían ser el descenso de la tinción proteica en
todas las células en el caso de que exista pseudotransfección; en
el caso de verdadera transfección, debería haber un descenso del
número de células que presentan la proteína de marcaje, pero la
intensidad del teñido en las células positivas no debería
descender. Nuestros resultados establecen que en nuestro caso se da
una verdadera transfección, ya que se han realizado las
observaciones anteriores. Además, en nuestros experimentos con rAAV
in vitro realizados hasta la fecha, la intensidad del teñido
indicador en comparación con la intensidad de la proteína humana
fluorescente verde en las células HMS-1
transfectadas se incrementó a las tres semanas contra 1 semana
después de la transfección. Este incremento del gen reportero con
un episodio incremental es indicativo de expresión génica real ya
que los genes rAAV administrados siempre son un poco lentos para
mostrar una expresión completa. Si hubiéramos estado experimentando
con la pseudotransfección (administración de proteínas mediada por
vector), la tinción indicadora descendería con el episodio.
Adicionalmente, hemos acumulado los ensayos de
expresión del gen marcador con un análisis genético molecular que
muestra la presencia de virus mediante estudios PCR.
Para ampliar los estudios iniciales se llevaron
a cabo estudios cinéticos de eficacia de los genes reporteros, a
través de sus vectores virales respectivos en células epiteliales y
mioepiteliales in vitro.
Adicionalmente, se ha confirmado la utilidad del
rAd borrado en E 1A que contiene dos promotores diferentes
conocidos en el campo de la técnica, es decir CMV y RSV LTR.
Se incluyen los estudios de respuesta a la
dosificación diseñados para determinar si existe una relación entre
la multiplicidad del vector de infección (moi) y la eficacia de la
transferencia del gen reportero
(\beta-galactosidasa) en las células epiteliales
de la mama (HMEC). Concretamente, se observó que un moi de 102
resultará en una eficacia de la transducción del 100%. AI mismo
tiempo se ha monitorizado la resistencia a la transducción rAd de
las células mioepiteliales y se ha determinado que su resistencia
es absoluta. Por ejemplo, son completamente resistentes a la
transcripción incluso con un moi de 104.
También se llevó a cabo un estudio del tiempo de
exposición a rAd durante 1-10 horas para determinar
si la eficacia de la transfección mejora con un tiempo de
exposición mayor. No mejora.
En el caso del rAd, se monitorizó la expresión
del gen reportero en función del tiempo a partir de la infección
para determinar la proporción de la expresión y su descenso. Se
encontró que la vida media de la expresión fue de 48 horas. Se
repitieron estos estudios in vitro con rAAV específicos para
células mioepiteliales. Ya que rAAV es opuesto a las integraciones
de rAd en el genoma, pero requiere una segunda síntesis de la
cadena durante la división celular antes de que ocurra la expresión
(ya que rAAV es monocatenario), se podría esperar que se necesitara
un tiempo mayor después de la transfección para observar la
expresión pero con un descenso más suave o sin descenso. En este
contexto, se observa que la expresión máxima ocurre a las 3 semanas
con un descenso negligible.
También se ha comparado la expresión del
reportero en las células mioepiteliales con la de las células
epiteliales. Se han evaluado los virus competentes en la
replicación y los de replicación potenciada, en los que la
producción de partículas virales puede potenciarse mediante las
interacciones de un promotor cis/trans y monitorizar la Tisis de las
células epiteliales y la resistencia a la lisis de las células
mioepiteliales. Se observa una lisis significativa, visualmente o
mediante un procedimiento de exclusión del tinte (azul de tripano)
o mediante un procedimiento de monitorización de viabilidad como el
MTT. Se han llevado a cabo experimentos cinéticos similares. En el
caso del rAd con replicación potenciada, los agentes exógenos tales
como la dexametasona y/o la LPS, diseñados para incrementar la
transcripción del potenciador/promotor utilizado (MUC1 y
Lactoalbúmina) en nuestras células epiteliales de mama transfectadas
(HMEC) se han monitorizado para realizar una valoración viral y se
ha observado un incremento de 10 veces con un 50% de incremento de
la lisis celular. Las células mioepiteliales continuaron siendo
completamente resistentes a los efectos de este virus lítico
competente en la replicación.
Se ampliaron los experimentos in vitro
descritos arriba mediante la utilización de rAd y rAAV con defectos
en la replicación que no contenían genes reporteros sino genes
nativos tales como maspina y se llevaron a cabo estudios cinéticos
similares. Específicamente, se repitieron los estudios de arriba en
los que se utilizaron genes reporteros y en vez de éstos se
utilizaron genes supresores endógenos como maspina para establecer
que nuestra aproximación es fisiológicamente viable.
Transfección de maspina en células
mioepiteliales a través de vectores rAAV. Los mecanismos de
actuación de maspina en la inhibición de la invasión y de la
motilidad son totalmente desconocidos. Maspina se identificó
inicialmente mediante hibridación sustractiva y el procedimiento de
representación diferencial para identificar genes supresores
tumorales candidatos que fueran defectivos en las células humanas
de carcinoma de mama. Es interesante que incluso en estas líneas
celulares normales de mama que se utilizaron para clonar la maspina
y en esas líneas normales de mama donde fue identificado, sólo está
presente intracelularmente y no se secreta. A diferencia de las
células epiteliales, nuestras líneas celulares mioepiteliales
secretan maspina. La presencia de maspina secretado en células
mioepiteliales en comparación con las células epiteliales normales y
nuestros resultados de la inhibición de la invasión y de la
motilidad de las células de carcinoma de mama por maspina apoyan la
hipótesis de que maspina está actuando como un supresor tumoral
paracrino y no como autocrino.
Las células mioepiteliales parecían tener la
capacidad única de secretar esta serpina. Por lo tanto se explotó
esta propiedad del mioepitelio mediante la transfección in
vitro de maspina en HMS-1 a través de rAAV para
conseguir la sobreexpresión de maspina. Por ejemplo, el rAAV que
contenía el promotor CMV se utilizó para modular un ADNc maspina de
secuencia completa insertado en este vector. Los niveles de
rmaspina secretado se determinaron mediante transferencia Western
después de varias semanas. Tal como se muestra en la figura 7, las
células mioepiteliales que sobreexpresan maspina son más efectivas
bloqueando la invasión celular del carcinoma en Matrigel. Tales
ensayos en Matrigel son conocidos en el campo de la técnica y
proporcionan un modelo para los sistemas de cáncer de mama (ver, por
ejemplo, Bae et al., Breast Cancer Res. Tret. 24(3).
241-55 (1993). Específicamente, los efectos de los
clones mioepiteliales transfectados que expresan rmaspina en los
ensayos de inhibición de la invasión mostraron un incremento del
200% en la inhibición de la invasión. En consecuencia, estos
resultados demuestran la viabilidad de la utilización de la
sobreexpresión de maspina en el mioepitelio como una estrategia de
terapia génica in vivo.
Los descubrimientos in vivo descritos en
los Ejemplos 1-4 anteriores ilustran como es
posible, usando una aproximación intracanalicular, seleccionar
específicamente y destruir el epitelio de la mama in vivo y
proteger el mioepitelio in vivo con rAAV y reforzar sus
defensas con genes como la maspina.
Específicamente, utilizando los estudios
preliminares ex vivo e in vivo descritos en el
presente documento se puede seleccionar específicamente el
mioepitelio de la mama y el epitelio de la mama con estas
aproximaciones vectoriales específicas. Así, se puede proceder de
la siguiente forma: utilizar un adenovirus lítico competente en la
replicación o un adenovirus lítico competente en la replicación que
contiene elementos cis que estimulan la replicación cuando
los factores trans específicos presentes en el epitelio de la
mama se encuentran (un elemento cis candidato podría ser el
promotor lactoalbumínico o el promotor MUCI). A continuación se
puede evaluar la destrucción del epitelio de la mama con riesgo de
desarrollar cáncer y para realizar una "mastectomía
profiláctica" sin tener que extirpar la mama. Puede
determinarse, mediante un análisis ELISA de la orina y las heces, si
la capa mioepitelial serviría como una barrera efectiva contra la
infección sistémica cuando se utiliza un adenovirus lítico
competente en la replicación. La resistencia de las células
mioepiteliales a la infección con adenovirus sugiere que esta capa
ofrece una defensa contra las infecciones sistémicas.
Alternativamente puede utilizarse rAAV para seleccionar
específicamente el mioepitelio y administrarle un gen candidato tal
como maspina para reforzar sus capacidades defensivas.
Claims (23)
1. Procedimiento in vitro o ex
vivo para la transducción selectiva de una célula mioepitelial
en una población de células epiteliales ductales y células
mioepiteliales mezcladas, que comprende el paso de poner en contacto
una célula mioepitelial con un vector vírico
adeno-asociado recombinante que transduce la célula
a través de una molécula de proteoglicano heparán sulfato expresada
por la célula.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde la población de células epiteliales ductales y células
mioepiteliales mezcladas está en el sistema ductal de una glándula
mamaria.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde la célula mioepitelial se pone en contacto mediante
canulación ductal.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde el vector comprende un gen que codifica un polipéptido que
inhibe el desarrollo del cáncer.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde una secuencia de control en el virus
adeno-asociado recombinante contiene un elemento
cis que modula la expresión del gen en presencia de un
factor trans presente en la célula mioepitelial.
6. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido inhibe la proliferación de una célula
epitelial ductal.
7. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido inhibe la invasión de una célula epitelial
ductal.
8. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido inhibe la migración endotelial.
9. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido inhibe la angiogénesis.
10. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido incrementa la producción de oxido nítrico de
la célula mioepitelial.
11. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido induce la apoptosis en una célula epitelial
ductal.
12. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en
maspina, trombospondina-1, TIMP-1,
proteasa nexina-II, \alpha-1
antitripsina y receptor bFGF soluble.
13. Uso de un vector vírico
adeno-asociado recombinante que comprende un gen
que codifica un polipéptido que inhibe el desarrollo del cáncer para
la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento del
cáncer mediante la transducción selectiva de una célula
mioepitelial a través de la molécula de proteoglicano heparán
sulfato en una población de células epiteliales ductales y células
mioepiteliales mezcladas, en el que el método comprende el paso de
poner en contacto la célula mioepitelial con dicho vector.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la
población de células epiteliales ductales y células mioepiteliales
mezcladas está en el sistema ductal de una glándula mamaria.
15. Uso según la reivindicación 13, donde la
célula mioepitelial se pone en contacto mediante canulación
ductal.
16. Uso según la reivindicación 13, donde una
secuencia de control del virus adeno-asociado
recombinante contiene un elemento cis que modula la
expresión del gen en presencia de un factor trans presente en
la célula mioepitelial.
17. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido inhibe la proliferación de una célula epitelial
ductal.
18. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido inhibe la invasión de una célula epitelial ductal.
19. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido inhibe la migración endotelial.
20. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido inhibe la angiogénesis.
21. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido incrementa la producción de oxido nítrico de la célula
mioepitelial.
22. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido induce la apoptosis en una célula epitelial ductal.
23. Uso según la reivindicación 13, donde el
polipéptido se selecciona del grupo que consiste en maspina,
trombospondina-1, TIMP-1, proteasa
nexina-II, \alpha-1 antitripsina y
receptor bFGF soluble.
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