ES2271253T3 - Biosensor con proteinas transmembrana unidas covalentemente. - Google Patents
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Abstract
Producto que comprende: una proteína transmembrana; una membrana lipídica formada a partir de moléculas anfifílicas y de moléculas de proteínas transmembrana; y un sustrato sólido: caracterizado porque la proteína de membrana incluye un aminoácido que contiene tiol a través del cual la proteína de membrana se acopla al sustrato mediante una unión covalente directa.
Description
Biosensor con proteínas transmembrana unidas
covalentemente.
La invención se refiere a un producto,
normalmente referido como biosensor, que comprende una proteína
transmembrana unida a un sustrato, incluyendo los métodos de
fabricación del producto y sus usos.
Es conocido que las moléculas anfifílicas, por
ejemplo los lípidos, se agregan en solución para formar estructuras
de membrana que pueden ser monocapas, micelas o liposomas. Se ha
demostrado que estas estructuras tienen propiedades semipermeables
que, en algunos casos, permiten el paso selectivo de moléculas (e.g.
iones, ligandos, antagonistas, agonistas). La permeabilidad
selectiva está relacionada con la química de los lípidos utilizados
en la construcción de las estructuras de membrana. También es
conocido que estas membranas sintéticas pueden incorporar moléculas
más grandes tales como polipéptidos o proteínas que actúan, por
ejemplo, facilitando el transporte de moléculas (por ejemplo, los
canales iónicos que facilitan el transporte de iones a través de
membranas son conocidos como ionóforos), actuando como receptores de
ligandos, formando poros a través de los cuales se pueden translocar
los polipéptidos (por ejemplo, estructuras que forman poros
nucleares, estructuras que importan proteínas mitocondriales). Estos
polipéptidos de membrana son conocidos como proteínas de
membrana.
Dado que las proteínas de membrana tienen la
capacidad intrínseca de acoplarse a interfases en combinación con
otras sustancias anfifílicas, son adecuadas para la construcción de
superficies biomimetizadas para el uso en dispositivos
biocompatibles y biosensores. Los biosensores que incorporan
polipéptidos de membrana tienen numerosas aplicaciones potenciales
incluyendo, por ejemplo y sin suponer una limitación, biosensores
basados en ligandos para el diagnóstico clínico; la detección de
contaminantes en el agua y en el medio ambiente; dispositivos de
memoria; dispositivos de cribado para aplicaciones farmacéuticas; el
suministro de superficies funcionalizadas biológicamente; centros
de unión y, de esta manera, sensores para moléculas pequeñas tales
como fármacos, pesticidas, moléculas que requieren ser analizadas
durante el control de procesos (i.e. alimentos, productos de
fermentación, productos químicos); moléculas más grandes tales como
proteínas para el cribado de compuestos en investigación (e.g.
tecnología matricial (en inglés "array technology") o
diagnóstico (marcadores para cáncer, marcadores para enfermedades
infecciosas, hormonas); ácidos nucleicos; polímeros de
carbohidratos; células tales como bacterias patogénicas; células
eucariotas tales como células cancerígenas y pequeños organismos
unicelulares o pluricelulares, en particular parásitos. Además, un
biosensor puede contener polipéptidos de membrana combinados con
otros componentes acoplados de de manera independiente a la
superficie del biosensor, los cuales actúan como centros de unión
específicos y para los que el polipéptido de membrana proporciona
una superficie estable no desnaturalizante y/o una función de sensor
dependiente de los canales iónicos. Los biosensores se pueden
utilizar en el cribado de alto rendimiento de compuestos para
aplicaciones farmacéuticas mediante la modulación del canal iónico
o mediante los otros métodos
descritos arriba.
descritos arriba.
Los biosensores pueden proporcionar un
ensamblaje inerte, estable, y biológicamente compatible de
superficies biológicamente funcionalizadas incluyendo péptidos,
ácidos nucleicos, proteínas y otras moléculas de gran tamaño. Estas
estructuras se pueden utilizar en el cribado de compuestos y en
sistemas de biosensores. También pueden utilizarse para crear
superficies compatibles con el cultivo celular o para su
implantación en tejido vivo.
Además, los enzimas se pueden modificar en los
polipéptidos de membrana o pueden coensamblarse con polipéptidos de
membrana de tal forma que puedan ensamblarse de manera funcional y
precisa en superficies. Esto podría tener aplicaciones en sistemas
de biorreactores, donde se necesitan superficies catalíticas, o en
sistemas de sensores, donde el producto enzimático se detecta más
fácilmente que el sustrato. El enzima junto con el polipéptido de
membrana se puede imprimir específicamente o se puede aplicar de
manera que se podrían definir conformaciones espaciales en 1, 2, e
incluso 3 dimensiones. Combinada con sistemas de flujo, podría
permitir la síntesis/degradación secuencial enzimática en un
biorreactor a pequeña escala.
Para el experto en la materia será evidente que
esta tecnología también tiene un amplia aplicación en el suministro
de superficies que permitan la unión de polipéptidos de membrana a
un sustrato en una orientación y densidad determinadas que permitan
a estas superficies actuar como superficies de unión para una
diversidad de moléculas de las que pueda seguirse su interacción
mediante métodos convencionales. Por ejemplo, métodos ópticos como
la resonancia de plasma superficial; la fluorescencia; la
elipsometría; o métodos eléctricos como la espectroscopia de
impedancia, la voltametría cíclica, la medida de la conductancia.
Los polipéptidos de membrana podrían ser utilizados en biosensores
en dispositivos para captar señales físicas como el voltaje, la
presión o la
temperatura.
temperatura.
La permeabilidad modificable del biosensor se
podría utilizar para permitir la liberación controlada de moléculas
a través de la superficie desde un reservorio bajo la capa. Una capa
compuesta por tiolípidos y polipéptidos de membrana también podría
utilizarse para almacenar moléculas en un reservorio, como por
ejemplo fármacos. Una señal biológica tal como el pH, la actividad
proteasa o la unión de ligandos, podría activar la liberación del
fármaco. Un ejemplo podrían ser microcápsulas dirigidas a tejidos
específicos que liberan fármacos a través del canal polipeptídico de
la membrana cuando entran o se unen a la célula diana. Los
polipéptidos de membrana se podrían modificar también para llevar
secuencias peptídicas que, al unirse a receptores celulares
específicos, dirijan las microcápsulas a tejidos específicos. Esto
puede sumarse o ser independiente de la función de liberación del
fármaco.
Los ionóforos son polipéptidos o estructuras
proteicas de estructura terciaria y en muchos casos cuaternaria que
forman poros incrustados en las membranas celulares. La función de
los ionóforos es controlar el flujo de corrientes iónicas en
respuesta a la excitación eléctrica (conocido como activación por
voltaje (en inglés "voltage gating")) o a la presencia
de ligandos estimulantes, por ejemplo neurotransmisores (conocido
como activación por ligandos (en inglés "ligand
gating")).
Un ejemplo de un grupo de proteínas de membrana
relacionadas funcionalmente son las porinas, que son un subgrupo de
los ionóforos. Otros grupos incluyen los GPCRs, los canales
pentaméricos activados por ligandos, los transportadores ABC,
etc.
Las propiedades de transducción de señal de los
canales iónicos, combinadas con su alta sensibilidad y su tamaño
mínimo, ha llevado al desarrollo de biosensores basados en
estructuras de membrana sintética que incorporan proteínas de canal
iónico. Aunque no existe dificultad en la fabricación de estas
membranas que incorporan canales iónicos, su preparación suele ser
costosa o resultan frágiles e inestables.
Los biosensores existentes en el estado de la
técnica (cfr. US 5.234.566; US 5.736.342; US 5.516.890; WO 9725616)
se basan en el acoplamiento de una biocapa a la superficie de un
sustrato de modo que una capa quede unida al sustrato (pe. mediante
el uso de tiolípidos). Estas bicapas sirven como sustrato en el que
se pueden insertar polipéptidos formadores de canal iónico durante o
después de la formación, proporcionando un transductor biológico
funcional. Un problema asociado con las membranas sintéticas de este
tipo es que, cuando se usan con proteínas integrales de membrana de
gran tamaño y de origen biológico, estas tienen poca duración, son
caras de fabricar y su densidad proteica y orientación están poco
controladas. En un caso concreto, el dispositivo de Cornell (Cornell
et al., 1997) utiliza una bicapa lipídica fluida compuesta
por lípidos que atraviesan media membrana (en inglés "half
membrane spanning lipids") y lípidos transmembrana que se
anclan a la superficie de tiolípidos. La membrana permite una
difusión fácil en el plano de la bicapa y esto se aprovecha mediante
el uso de péptidos gramicidina. Estos péptidos sintéticos ionóforos
que atraviesan media membrana sólo permiten el flujo de iones cuando
se forma un dímero que atraviese toda la membrana. Generalmente un
monómero está anclado al sustrato y el monómero superior está
conectado a una molécula receptora. La unión al receptor altera la
cantidad de dímeros conductores presentes provocando un cambio en la
conductancia. Esto permite que se fabriquen los biosensores de
alta
sensibilidad.
sensibilidad.
Heyse et al. (1998) ofrecen una revisión
de las técnicas emergentes para la investigación de interacciones
moleculares en membranas lipídicas. En un ejemplo, una superficie de
soporte de oro se funcionaliza alternando las regiones de tiolípidos
que exhiben carbohidratos y regiones con tioles que exhiben
carboxilos en las que se ensambla la proteína fotorreceptora
rodopsina. En otro ejemplo, una proteína receptora de OmpF se
ensambla en una bicapa lipídica, la cual está unida a una superficie
de soporte de oro utilizando derivados de fosfolípidos
funcionalizados
con tiol.
con tiol.
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La presente invención inmoviliza directamente
proteínas transmembrana, por ejemplo proteínas de membrana que
forman canales iónicos, a la superficie de un sustrato sólido para
formar una capa de proteínas acopladas de alta densidad a la que se
le añade una capa lipídica para formar una estructura de membrana.
La combinación de la proteína absorbida químicamente y la capa
lipídica anfifílica proporciona una capa estable en la que se
conservan la estructura proteica y la función proteica normales.
Esto es contrario a lo conocido en el estado de la técnica, que
enseñaba que el acoplamiento directo de las proteínas de membrana a
un sustrato provocaría la desnaturalización del polipéptido y de ese
modo se obtendría una proteína de membrana no funcional.
Los biosensores construidos según la invención
se fabrican fácilmente, son más robustos y se pueden aplicar más
ampliamente que los sensores del estado de la técnica, ya que además
de las aplicaciones para biosensores basados en membranas, el método
permite un ensamblaje denso en sustratos sólidos, imitando a las
capas de proteína nativa con una orientación controlada. Las
proteínas pueden modificarse para incorporar funciones específicas
en sus superficies expuestas.
Por ejemplo, según la invención, hemos
manipulado genéticamente una proteína que forma un canal iónico de
tal manera que pueda unirse directamente a una superficie metálica,
en este ejemplo oro, a la que se le añaden tiolípidos, completando
la estructura de membrana y proporcionando un biosensor funcional.
En un ejemplo se utiliza un polipéptido OmpF bacteriano que está
modificado para incorporar un aminoácido cisteína que facilita la
unión del polipéptido a un sustrato tratado. Es evidente que esta
tecnología se puede aplicar a otros polipéptidos que forman canales
iónicos y a otros polipéptidos de membrana utilizando aminoácidos
que contengan tiol. En particular, cualquier proteína que presente
una superficie plana cerca de la interfase de membrana (tales como
las proteínas externas de membrana bacterianas o de la
bacteriorodopsina) pueden considerarse adecuadas para este método.
Los polipéptidos pueden incluir, de manera natural un aminoácido que
contenga tiol o pueden ser modificados genéticamente para incluir un
aminoácido que contenga tiol. Los aminoácidos pueden ser los que se
encuentran de manera natural o ser aminoácidos modificados.
En comparación con el antecedente de Cornell, la
presente invención se basa en proteínas integrales de membrana de
gran tamaño fijadas directamente a la superficie del sustrato y no
se produce una difusión lateral en la bicapa. Por lo tanto, el papel
de la bicapa es estabilizar la capa proteica ensamblada, reducir
uniones no específicas a la superficie del sustrato y proporcionar
aislamiento eléctrico. Ya que no se necesita que la bicapa sea
fluida, los lípidos anclados pueden comprender el 100% de los
lípidos en la mitad de la bicapa al lado de la superficie. La mitad
superior de la bicapa se completa de esta manera con fosfolípidos
de membrana tales como difitanoilo-fosfatidilcolina.
Sin embargo, como todas las proteínas empleadas atraviesan
completamente la bicapa lipídica en vez de atravesar sólo la mitad
de la membrana (como en el estado de la técnica de Cornell), existe
la opción de formar toda la membrana con lípidos anclados capaces
atravesar todo el espesor de la membrana. Los cambios de
conductancia observados mediante espectroscopia de impedancia cuando
se utilizan porinas como las proteínas transmembrana en la presente
invención, se deben a cambios en el poro de cada proteína y depende
de la activación intrínseca de canales individuales más que de la
formación e interrupción de dímeros. Además, debido a que se pueden
utilizar proteínas de membrana recombinantes purificadas, el método
ofrece una técnica amplia para crear superficies de proteínas
inmovilizadas manipuladas genéticamente que no sería posible
conseguir con los péptidos sintéticos de Cornell. La familia de
proteínas barril-\beta de membrana son buenas
dianas para la manipulación genética de proteínas y por lo tanto, de
este modo se puede construir una amplia variedad de interfases de
proteína.
En el contexto de la presente invención
"proteínas transmembrana" se refiere a los polipéptidos que se
unen directamente al sustrato. La implicación de esto es que los
polipéptidos generalmente no son simples secuencias lineales cortas
de aminoácidos sintéticos con poca o ninguna estructura
secundaria/terciaria (pe. plegamiento de proteínas). La implicación
es también que la proteína tiene un tamaño y una configuración que
indica que residiría en una membrana y que se extendería al menos en
su mayoría a través del ancho de la bicapa lipídica. Generalmente,
se espera que los polipéptidos que se ubican esencialmente solo en
una, o en una u otra periferia de una bicapa de membrana no sean
ventajosamente útiles en esta invención. De manera similar, es poco
probable que sean ventajosamente útiles en la invención proteínas
muy grandes o complejos de proteínas que se ubican principalmente
en el exterior de la bicapa de membrana pero que puedan extenderse
parcialmente en la bicapa. Los expertos en la materia entenderán que
el término "transmembrana" no debería interpretarse tan
estrictamente como para excluir de esta invención las proteínas que
se extienden parcialmente más allá de los límites de la membrana o
las que se extienden únicamente a través de la mayoría de la región
entre los límites de la membrana.
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Según un primer aspecto de la invención se
proporciona un producto que comprende: una proteína transmembrana;
una membrana lipídica formada por moléculas anfifílicas y moléculas
de proteína transmembrana; y un sustrato sólido: caracterizado
porque la proteína de membrana incluye un aminoácido que contiene
tiol a través del cual la proteína de membrana se une al sustrato
sólido mediante una unión covalente directa.
En una realización preferida de la invención el
producto es un biosensor o una matriz de proteínas.
En otra realización preferida de la invención la
proteína transmembrana comprende una estructura hélice á o una
estructura barril \beta.
Las porinas son proteínas de membrana externa
que, en forma monomérica, dimérica o trimérica, constituyen un canal
transmembrana lleno de agua ("poro"). Este poro permite el paso
de iones y de otras numerosas moléculas no específicas a través de
una membrana. Las porinas se encuentran en la membrana externa de la
mitocondria y en varias bacterias Gram-negativas.
Las porinas incluyen la familia OmpA de polipéptidos que tienen ocho
barriles \beta entrelazados, y la OmpF que es un homotrímero con
16 barriles \beta entrelazados.
Los transportadores de membrana externa
dependientes de TonB y los relacionados también están incluidos en
el ámbito de esta invención. Estas proteínas son polipéptidos
normalmente monoméricos, no forman canales y son altamente
específicas para nutrientes concretos.
Las proteínas transmembrana se pueden modificar
para facilitar el acoplamiento del polipéptido al sustrato.
Hemos modificado genéticamente las OmpF mediante
la mutación de glutamato 183 a cisteína (E183C). La inserción de una
cisteína, u otro aminoácido que contenga tiol, en cualquiera de los
giros (en inglés "turns") periplasmáticos del
polipéptido OmpF dará resultados similares a los descritos. Se
podría añadir más de un residuo de cisteína a cada proteína para
aumentar la interacción con la superficie, de esta manera se podría
confeccionar para necesidades particulares. La inserción de cisteína
en las extremos de los bucles extracelulares también funcionaría
pero resultaría en una capa proteica con la orientación opuesta.
\newpage
- Los sinónimos de OmpF son:
- Porina OmpF
- \quad
- Proteína 1 A de membrana externa
- \quad
- Proteína 1 A de membrana externa
- \quad
- Proteína B de membrana externa
- Los nombres de los genes son:
- OMPF o TOLF o CMLB o COA o CRY o B0929.
\vskip1.000000\baselineskip
También hemos modificado genéticamente los OmpA
para insertar un residuo Cys.
En una realización de la invención, la proteína
transmembrana puede ser rica en hélices \alpha y no tener
proyecciones adicionales de gran tamaño fuera de la membrana en, por
lo menos, una de las dos superficies de membrana. Ejemplos de los
que se conocen las estructuras con alta resolución incluyen la
bacteriorodopsina y el canal de potasio bacteriano KcsA. Esta forma
de inmovilización puede aplicarse a muchos miembros de la familia de
los
GPCR.
GPCR.
La proteína transmembrana se puede seleccionar
entre las que se presentan en la Tabla 1 o Tabla 2.
La unión de una proteína transmembrana
directamente a un sustrato puede conseguirse mediante la reacción de
un átomo de azufre (que, por ejemplo, se encuentra en la cisteína)
con un sustrato, por ejemplo oro, mediante un enlace directo
azufre-oro. Esto resulta en una proteína que
mantiene su actividad funcional. El sustrato puede convertirse en
hidrofóbico mediante la preincubación con un tiol hidrofílico
pequeño, por ejemplo \beta-mercaptoetanol o
tioglicerol.
tioglicerol.
Las porinas son proteínas estables y se pueden
añadir a la superficie en soluciones detergentes (tales como SDS o
dodecilglucósido) que no desnaturalizan la proteína pero aseguran
que no se anulen o se reduzcan las interacciones hidrofóbicas no
específicas con la superficie.
La naturaleza cooperativa de la reacción de la
cisteína implica que la proteína OmpF reacciona fácilmente con la
superficie pretratada y que no se inhibe en presencia de tioles. La
cooperación puede surgir al tener tres cisteínas por trímero, o más
de una cisteína por monómero. En general, es probable que las
propiedades de autoensamblaje de las proteínas sean importantes a la
hora de crear una monocapa de proteína con contactos no polares
entre las proteínas vecinas. Esto puede explicar la alta densidad
que se puede conseguir. Además, el contacto de los bucles
hidrofílicos de la proteína con la superficie hidrofílica no es
desnaturalizante y separa el núcleo de la proteína de la
superficie.
superficie.
La capa proteica se estabiliza más, de esta
manera, añadiendo anfífilos a la superficie, preferiblemente
tiolípidos, que se unirán a través de un enlace oro azufre y
llenarán los espacios entre las proteínas. Esto proporciona un
entorno similar a membrana que satisface las necesidades de los
polipéptidos de superficies hidrofílicas e hidrofóbicas y así se
asegura la estabilidad de la proteína.
En otra realización de la invención el lípido es
un tiolípido.
Los tiolípidos son un grupo muy variable. Por
ejemplo, el ZD16, se basa en el ácido dipalmitoilfosfatídico, que se
extiende al fosfato del lípido mediante una cadena espaciadora
hidrofílica de grupos etoxilo de longitud variable, con un grupo
disulfuro terminal en el extremo del espaciador hidrofílico. Estos
Atiolípidos portadores de punto de anclaje se pueden unir a
sustratos formando un enlace sustrato-azufre
estable. De esta manera, podemos unir bicapas lipídicas a sustratos,
con la posibilidad de conservar una capa de agua entre el sustrato
y la primera monocapa.
Los tiolípidos sin espaciadores tales como el
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotioetanol
también tienen utilidad en relación al biosensor de la invención. La
parte lipídica puede ser cualquier ácido graso que incluya una
cadena ramificada (pe. grupos fitanoilo) o insaturada (pe. oleoilo)
o un esterol tal como el colesterol o el lípido puede basarse en una
ceramida. La parte lipídica también puede consistir en lípidos tales
como los que provienen de los archaea, en los cuales la
membrana contiene lípidos que atraviesan todo su espesor desde una
fase acuosa a la
otra.
otra.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tiolípidos basados en este diseño enlazarán
covalentemente toda la membrana a la superficie. Ejemplos de este
diseño son los tetraéteres de
di-bi-fitanilglicerol que se
encuentran en especies como la Methanobacterium, la
Methanobrevibacter, la Sulfolobus, la
Thermoplasma, la Thermoproteus. Los grupos
hidrofílicos pueden ser cualquier tipo de unidad química que enlace
el grupo tiol a los grupos hidrofóbicos. Preferiblemente el
esqueleto carbonado es hifrofílico para estabilizar los bucles
hidrofílicos de la proteína adyacentes.
Preferentemente, el tiolípido se selecciona
entre:
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotioetanol;
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato];
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato];
N-(14'-mercapto-1',11'-dioxo-3'-6'-9'-trioxa-12'-azatetradecilo)-2-oleoil-1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidileta-
nolamina;
nolamina;
ácido
(8'-mercapto-3',6'-dioxa-octilo)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico.
La invención también incluye el uso de moléculas
anfifílicas diferentes de los lípidos. Las moléculas anfifílicas
tienen una o dos cabezas hifrofílicas y al menos una región
hidrofóbica y son denominados comúnmente surfactantes. Como
ejemplos, surfactantes catiónicos (e.g. sales cuaternarias de
amonio); surfactantes aniónicos (e.g. sales orgánicas de sulfatos) y
surfactantes zwitteriónicos (e.g. fosfatidilcolinas). Otras
moléculas anfifílicas incluyen detergentes, ácidos grasos. Pueden
ser apropiadas moléculas menos solubles en agua tales como los
alcanotioles. Estos pueden terminar con un tiol en un extremo y con
un grupo soluble en agua tal como un grupo hidroxilo o un azúcar en
el otro extremo. Estos pueden tener, por ejemplo, longitudes de
cadena de carbono de entre 10 y 18.
En otra realización de la invención el sustrato
es un metal. El metal puede seleccionarse entre: oro; cromo;
platino; plata.
En una realización más de la invención el
sustrato se selecciona entre: vidrio, silicio, silicio terminado en
hidrógeno o polímeros plásticos.
Para el experto en la materia, resultarán
evidentes métodos que generen mutaciones que delecionen o cambien el
uso del codón. La modificación de una proteína transmembrana (tal
como un polipéptido formador de canal iónico) significa la deleción,
la adición o la sustitución de por lo menos un residuo de
aminoácido, en el que la modificación proporciona una proteína capaz
de unirse directamente a un sustrato para proporcionar un producto
según la invención.
En una realización de la invención, OmpF está
modificada en la posición 183 de la secuencia de aminoácidos
mediante la mutación de glutamato a cisteína. Esto corresponde a la
posición 205 del polipéptido OmpF no procesado y a la posición 183
del polipéptido maduro.
Se proporciona un método para la producción de
la proteína modificada utilizada en la invención, que comprende:
- i)
- proporcionar una célula transformada/transfectada con una molécula de ácido nucleico que forma parte de un vector adaptado para facilitar la expresión recombinante de la proteína;
- ii)
- hacer crecer dicha célula en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína; y
- iii)
- purificar dicha proteína de dicha célula, o de su medio de crecimiento.
El vector puede codificar, y por lo tanto se le
proporciona a dicha proteína recombinante modificada, una señal de
secreción para facilitar la purificación de la proteína.
Según otro aspecto de la invención se
proporciona un producto que comprende un biosensor.
El producto puede ser un biosensor de un solo
elemento que se sirva de métodos electroquímicos u ópticos para
detectar la interacción específica de un analito definido, proteína,
ácido nucleico, azúcar, esteroide, etc, con la capa proteica
modificada genéticamente. Puede consistir en una capa
proteica/lipídica en una superficie de oro combinada con circuitos
electrónicos o como parte de un dispositivo de resonancia de plasma
superficial. La capa proteica contendría, por ejemplo, puntos de
unión para un anticuerpo específico para el diagnóstico de una
infección. Se podría aplicar una muestra de sangre u otro fluido
biológico en la superficie a través de un filamento que filtre
partículas grandes, células, etc. Al llegar a la capa proteica la
unión causaría un cambio en las propiedades eléctricas u ópticas que
podrían leerse mediante un dispositivo electrónico de salida.
Otro producto relacionado podría ser un sensor
implantado en el cuerpo para controlar a tiempo real los niveles de
biomoléculas específicas en sangre o tejido. El dispositivo puede
consistir en un componente eléctrico que contiene un electrodo de
oro pequeño (e.g. << 1 mm de diámetro) cubierto con la capa de
membrana proteica. La unión de moléculas específicas se podría leer
como un cambio en las propiedades de impedancia.
El producto también puede ser un dispositivo
para construir y analizar dos matrices dimensionales de proteínas
para cribados analíticos. El dispositivo incluiría un aparato para
la impresión de proteínas modificadas sobre superficies para la
creación de las matrices. Las matrices se utilizarían para cribar
muestras que contengan proteínas, moléculas pequeñas, células,
inhibidores enzimáticos, ácidos nucleicos, que se enlazarán a sitios
específicos en la matriz. Los puntos donde se ha unido la proteína
se detectaría mediante resonancia de plasma superficial,
fluorescencia, espectrometría de masas, métodos electroquímicos,
etc.
El producto permitiría un cribado rápido de
muestras para una diversidad de proteínas y de esta manera se
incrementaría la productividad en laboratorios clínicos o de
investigación.
Otro producto sería un biorreactor que utilice
superficies catalíticas creadas insertando dominios catalíticos en
la proteína de membrana. Las muestras se bombearían mediante
microfluídicos a lo largo de los canales revestidos de proteínas
catalíticas inmovilizadas. En este sentido, se podría conseguir la
modificación secuencial de muestras y la síntesis o la modificación
precisas de moléculas biológicas. Un biorreactor de este tipo se
podría montar en una estructura micromecanizada de silicio para
modificar pequeñas cantidades de muestra que puedan ser utilizadas,
a continuación, para el posterior análisis. Las fusiones de enzimas
con las proteínas de membrana permitirán que las matrices del
biorreactor sean utilizadas en cribados de alto rendimiento.
Un producto adicional podría ser la creación de
superficies biocompatibles para la implantación in vitro o
para la tecnología de cultivos celulares. Por ejemplo, podría
mejorarse la biocompatibilidad de una prótesis coronaria
recubriéndola con una monocapa de proteínas modificadas
genéticamente que mejoren la interacción con las células
epiteliales. Otros ejemplos son las articulaciones artificiales o
los aparatos de monitorización continua in vivo para la
liberación controlada de fármacos.
Otro ejemplo más serían las placas para cultivos
celulares que se modifican con una monocapa proteica para favorecer
patrones de crecimiento celular definidos. El tamaño de éstas puede
ir desde el tamaño de una placa de Petri hasta el de aparatos
micromecanizados de silicio. Las aplicaciones del producto pueden
implicar la inducción de cambios morfológicos en células,
especialmente células nerviosas o en los patrones de crecimiento de
diferentes líneas celulares adyacentes a otras para poder estudiar y
aprovechar la comunicación célula-célula en
investigación y en análisis. El producto consistiría en monocapas
diseñadas de proteínas modificadas que presentan superficies
reconocidas por cada tipo de célula. Las monocapas diseñadas podrían
incorporarse en recipientes para cultivo celular de diversos
tamaños.
El producto de la invención se podría producir a
partir de una solución preparada previamente (no necesariamente
acuosa) de proteínas de membrana, opcionalmente también con un
anfífilo (detergente/lípido), que puede utilizarse para crear
superficies proteicas monomoleculares controladas. La solución
podría consistir en una mezcla definida de proteínas que
proporcionaría una mezcla definida de manera similar de proteínas
modificadas en la superficie. Esto permitiría la fabricación de
sustratos con una densidad controlada de puntos de unión que se
aplicaría mediante autoensamblaje con proteínas no enlazantes que
actúan de espaciadores.
Un producto según la invención serían
superficies de oro ya preparadas con capas definidas de
proteína/lípido que podrían utilizarse en un biosensor de resonancia
de plasma superficial.
Según todavía un aspecto más de la invención se
proporciona un método para la preparación de un producto que
comprende:
- i)
- tratar un sustrato sólido con un agente de recubrimiento hidrofílico;
- ii)
- proporcionar al menos una proteína transmembrana que incluye un aminoácido que contiene tiol;
- iii)
- poner en contacto la proteína con el sustrato sólido tratado, en condiciones para el acoplamiento directo de la proteína al sustrato sólido tratado a través del aminoácido que contiene tiol;
- iv)
- añadir moléculas anfifílicas al sustrato sólido acoplado a proteína para formar una membrana lipídica.
En un método de la invención el producto es un
biosensor. En otro método de la invención la proteína de membrana es
una proteína de membrana externa, por ejemplo una porina.
En el método de la invención el agente de
recubrimiento hidrofílico se puede seleccionar de entre:
2-mercaptoetanol; ácido mercaptopropiónico;
1-mercapto-2-propanol;
2,3-dimercapto-1-propanol;
2-mercapto-3-butanol;
ditioeritritol
(eritro-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol,
DTE); ditiotreitol (reactivo de Cleland,
treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol,
(DTT); mezclas de DTE y DTT; tioglicerol.
Preferiblemente, el agente de recubrimiento es
2-mercaptoetanol.
Las condiciones para el recubrimiento de
sustratos pueden ser variadas. Por ejemplo, la concentración del
agente hidrofílico de recubrimiento está entre aproximadamente 1 mM
y 1 M, preferiblemente entre aproximadamente 50 mM y 500 mM, más
preferiblemente entre aproximadamente 100 mM y 200 mM. El tiempo de
incubación puede también variar desde horas a muchos días sin tener
efectos perjudiciales para la superficie preparada.
Preferiblemente, el sustrato es oro y el
polipéptido de membrana externa es una porina. Más preferiblemente
la porina es OmpF u OmpF modificada. Preferiblemente la molécula
anfifílica es un lípido, idealmente un tiolípido.
Según un aspecto de la invención se proporciona
un biosensor obtenible mediante el método según la invención.
Según un aspecto más de la invención se
proporciona el uso del biosensor según la invención para detectar al
menos una de las siguientes moléculas: Dominio R de colicina N;
polipéptidos; polipéptidos antigénicos; anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos; receptores; ligandos; antibióticos; fármacos;
pesticidas; azúcares; aminoácidos; ácidos grasos; péptidos;
hormonas; esteroides; ácidos nucleicos (ADN, ARN, ADNc); ácidos
nucleicos peptídicos; metales; iones inorgánicos.
A continuación se proporciona una realización de
la invención únicamente a modo de ejemplo y haciendo referencia a
las siguientes Figuras y Tablas, donde:
La Tabla 1 representa genes de porina de
bacteria Gram negativa;
La Tabla 2 representa los receptores
dependientes de Ton B de varias especies bacterianas;
La Figura 1 es la secuencia de ácido nucleico
que codifica para OmpF (natural) y la secuencia proteica de OmpF
codificada; [SEC ID No. 1] y [SEC No. 2];
La Figura 2 representa la unión de los
anticuerpos policlonales anti-OmpF a
OmpF-Cys enlazados.
Se preparó OmpF natural
(OmpF-WT) de E coli BE3000 según se ha
descrito previamente utilizando el plásmido pGBF96 (Bainbridge, G.,
Mobasheri, H., Armstrong, G. A., Lea, E. J. A. y Lakey, J. H.
(1998)) y se purificó en detergente SDS o se resuspendió a
continuación en POE-Octilo. El mutante de OmpF con
una sola cisteína en la vuelta 1 (OmpF-CYS) se creó
utilizando el método QuikChange^{TM} (Stratagene).
En la mutagénesis se emplearon dos
oligonucleótidos 37mero complementarios que codificaban un codón de
cisteína TGT en vez de un codón de glutamato GAA.
| Sentido | 5'-GGTTCTATCAGCTAC TGT TACGAAGGCTTTGGTATCG-3' | [SEQ ID No. 3] | |
| Antisentido | 3'-CCAAGATAGTAGATGACAATGCTTCCGAAACCATAGC-5' | [SEQ ID No. 4] |
Estos cebadores mutagénicos fueron utilizados
con el plásmido pGBF96 en el protocolo QuikChange descrito en el kit
QuikChange suministrado por Stratagene. Se utilizaron las
transformantes en células E Coli XL1-Blue
para generar ADN plasmídicodo puro mediante la utilización de kits
Promega Wizard SV miniprep. El gen OmpF fue secuenciado mediante un
instrumento ABI-Prism 377 en la University of
Newcastle Facility for Molecular Biology.
La mutación en el gen OmpF BE3000 provocada por
nuestra introducción de una diana de restricción XbaI es la de
Lisina 279 a arginina (K279R). Así, aunque la secuencia de ADN es
diferente en posiciones "oscilantes" de la secuencia de ADN de
OmpF de E. Coli de la base de datos, la proteína utilizada en
el ejemplo se diferencia del ejemplo de esta base de datos sólo por
las mutaciones E183C y K279R.
Los fosfolípidos utilizados fueron el
dioleilfosfatidilcolina (de Sigma Chemical Company, Fancy Road
Poole
Dorset GB) o la di-fitanoilfosfatidil colina (de Avanti Polar Lipids Birmingham Alabama EEUU). El tiolípido (designación de laboratorio ZD16) tenía la formula siguiente y fue sintetizado mediante los métodos previamente descritos en Lang (1994).
Dorset GB) o la di-fitanoilfosfatidil colina (de Avanti Polar Lipids Birmingham Alabama EEUU). El tiolípido (designación de laboratorio ZD16) tenía la formula siguiente y fue sintetizado mediante los métodos previamente descritos en Lang (1994).
Los chips de oro para el Biacore eran tanto
chips normales de oro del tipo Biacore J1 (Biacore AB, St. Albans
GB) como chips Biacore reciclados limpiados con solución Piranha.
Los portaobjetos de vidrio de índice de refracción 1,7 se limpiaron
mediante sonicación en un baño de agua sonicador en un 2% de
solución limpiadora Helmanex (Helma GmbH Alemania), seguido de un
aclarado abundante con agua Nanopure, y se almacenaron en etanol,
con o sin 2-mercaptoetanol, hasta el momento de
utilizarse. El etanol residual fue evaporado bajo nitrógeno y se
colocó el portaobjetos en un evaporador Edwards High Vacuum
Evaporator. Cuando el vacío alcanzó los 5x10^{-6} milibares, el
portaobjetos fue cubierto en una de sus caras con una capa de cromo
de 3 nm mediante evaporación de cromo. Se dejó enfriar el sistema
durante 15 minutos antes de evaporar una capa de oro de 100 nm sobre
el sustrato de cromo. Después de 15 minutos más de enfriamiento, se
rompió el vacío con argón y se montó el portaobjetos en el aparato
de SPR. El montaje consistió en colocar el portaobjetos con la cara
dorada de forma que quedara como el lado libre de una cubeta de
Teflón que quedara abierta en su parte superior para el intercambio
de fluidos. Se colocó un prisma Leica de 601 en el lado opuesto del
portaobjetos con el espacio entre ellos relleno de un fluido con el
índice de refracción correspondiente. Se fijó el montaje y se
colocó en el aparato de SPR. Las soluciones se añadieron y se
retiraron de la cubeta mediante pipeta Pasteur o jeringa graduada.
El mínimo de luz del láser reflejada se detectó mediante el escaneo
de la señal reflejada con un fotodiodo conectado a un ordenador
personal. El mínimo exacto se calculó mediante regresión. Para
seguir los cambios en función del tiempo de la señal SPR, el ángulo
del diodo se ajustó a un valor aproximadamente 2 grados por debajo
del mínimo inicial, donde la variación de intensidad por unidad
angular es grande. Así, los incrementos en el ángulo del mínimo
fueron representados como incrementos en la intensidad de señal.
Los experimentos Biacore se realizaron con la
máquina en modo normal. Los chips tratados con mercaptoetanol se
colocaron en la máquina y se bombearon sobre el chip las soluciones
necesarias a un caudal determinado. Los caudales son 1 \mul por
minuto para los pasos de ensamblaje proteína/tiolípido y 30 \mul
por minuto para los ensayos de unión con dominio R de colicina N. Se
utilizaron dos carriles en serie. Los cambios de la señal SPR en
función del tiempo se midieron como cambios en unidades de
resonancia tal como se define en el Manual del Usuario de
Biacore.
Biacore.
\newpage
La espectroscopia de impedancia se llevó a cabo
en una celda electroquímica que comprendía un electrodo de membrana
recubierto de oro y un electrodo de referencia de Ag/AgCl en KCl 0,1
M, una solución tampón de fosfato de sodio 5 mM a pH 7,4. La
superficie del electrodo de oro en forma de disco era de
3,34x10^{-2} cm^{2}. No se aplicó voltaje de corriente continua.
A la celda se le aplicó un voltaje sinusoidal de 10 mV (RMS) a 199
frecuencias sucesivas igualmente separadas entre sí en base a una
escala logarítmica de 1 Hz a 20 kHz. La corriente resultante se
monitorizó mediante un amplificador lock-in
sensible a la fase para calcular la impedancia compleja y la
admitancia.
Las muestras para el análisis FTIR se montaron
en los portaobjetos de vidrio Helmanex para microscopio limpios
sobre los cuales se evaporaron 3 nm de cromo seguido de 100 nm de
oro de la misma manera que en el experimento de SPR excepto por el
espesor del oro. El pretratamiento con mercaptoetanol se llevó a
cabo de la misma manera que en el caso de los portaobjetos de vidrio
para SPR. El ensamblaje de proteína, de tiolípido, o de fosfolípido
se realizó dejando la solución encima del portaobjetos colocado en
una cápsula de Petri de plástico y se cubrió para prevenir la
evaporación. Se añadieron capas sucesivas mediante el reemplazo de
la solución inicial por las subsiguientes soluciones sin secarlas o
aclararlas. Antes de obtener los espectros, se lavaron los
portaobjetos con corriente de agua Nanopure, se secaron bajo argón y
se colocaron inmediatamente en el espectrómetro. El espectro de
infrarrojos se tomó mediante un espectrómetro Bruker IFS 28 equipado
con un detector HgCdTe. Se realizaron mil barridos a una resolución
de 1 cm^{-1} y se corrigieron con una función boxcar. Se tomaron
los espectros de fondo de los respectivos soportes vacíos. Los
espectros corregidos se suavizaron por Fourier a una resolución de 1
cm^{-1} con una corrección triangular. Se tomó el espectro de
reflectancia y absorbancia de capas moleculares de oro con un ángulo
de incidencia de 85º utilizando únicamente luz polarizada
paralelamente. Todas las posiciones de los picos derivaban de un
segundo espectro de derivación. Para más detalles de la técnica,
véase Boucheva (1997).
La Figura 2 muestra la unión del anticuerpo
policlonal de conejo del bucle 6 anti-OmpF (a dos
concentraciones) con OmpF-Cys unida al oro y
sumergido en la bicapa híbrida fluida de DOPC (la capa superior,
frente a la solución) y los tiolípidos (capa inferior, unida al
oro). Los sensogramas se tomaron en una corriente de tampón PBS con
un caudal de 30 \mul/min en un Biacore X (Biacore AB, Uppsala,
Suecia). Las curvas negras ajustadas a un modelo de unión Langmuir
1:1 están superpuestas. La constante de velocidad de asociación
K_{a} se estimó en 4,4x10^{4} M^{-1}s^{-1}, y la constante
de velocidad de disociación K_{d} en 6,0x10^{-5}s^{-1} para
una constante de afinidad calculada K_{D} de 1,4 nM. La
interacción de la unión indica que la proteína está inmovilizada con
sus bucles extracelulares expuestos.
Se trata una superficie lisa de oro primero con
\beta-mercaptoetanol (1 mM en tampón A (100 mM
NaCl, 100 mM Na-fosfato pH 7,0.)), seguido de un
lavado con tampón A. Se aplicó OmpF-Cys en
Octilo-POE (0,3 mg/ml) a la superficie y se unió
rápidamente a la superficie llegando a un equilibrio. El lavado con
Tampón A elimina el efecto del tampón anterior y deja una señal
incrementada de 1000 unidades de resonancia (la cual puede
incrementarse con una incubación más prolongada). A continuación, la
superficie se lava con 0,05% de SDS hasta que no se elimina más
proteína. OmpF es estable en SDS y este tratamiento elimina la OmpF
unida no específicamente y deja trímeros de OmpF unidos
covalentemente a la superficie de oro. Mediante este tratamiento se
elimina cualquier proteína natural que se úna no específicamente a
las superficies de oro. El tiolípido (ZD16) añadido mediante la
solución de octilo-glucósido al 1% se une a la
superficie restante de oro a través de su grupo tiol y completa una
monocapa de lípido y proteína unidos covalentemente. La adición de
tiolípido a una capa control de oro muestra un nivel de unión del
lípido mucho mayor, confirmando que OmpF-Cys y ZD16
compiten por la capa superficial. La adición de vesículas de
fosfatidilcolina completa la bicapa ya que se unen y deshacen en la
superficie hidrofóbica expuesta. Hemos descubierto que la capa más
completa se consigue mediante incubación
ex-situ durante la noche seguida de lavado en
el aparato Biacore. Tratamientos posteriores con
\beta-mercaptoetanol no modifican las capas,
indicando que las proteínas y los lípidos autoensamblados están
unidos efectivamente e irreversiblemente a la superficie.
Los datos del aparato SPR se muestran
directamente en variaciones del ángulo de la señal SPR sobre un eje
de tiempo. Los resultados son similares a los datos del Biacore,
pero pueden relacionarse directamente con densidades superficiales
que pueden ser utilizadas para calcular la media del grosor de la
capa.
La inmovilización de la proteína dio una
variación del ángulo de 0,31º \pm 0,17, ya estuviera disuelta la
proteína en SDS o en Octilo-POE (0,3 mg/ml). El
resultado fue altamente reproducible y confirma la eficiencia del
proceso de autoensamblaje. La variación del ángulo esperada de un
cristal de dos dimensiones de OmpF es 0,75º por lo tanto la proteína
está inmovilizada en un 40% de la cobertura máxima. Este es un nivel
muy alto considerando que no se toman precauciones especiales para
maximizar el autoensamblaje, como la formación previa de cristales
de dos dimensiones.
El autoensamblaje de tiolípidos resulta en otro
incremento de 0,42º \pm 0,06 y la adición PC en aproximadamente
0,30º \pm 0,17.
Los valores son muy constantes y muestran que se
ha creado un sistema de autoensamblaje altamente reproducible.
Se tomó el espectro FTIR de trímeros de porina
autoensamblados directamente (1% octilo-POE 0,3
mg/ml OmpF-Cys) durante una hora a temperatura
ambiente y después de una segunda etapa de autoensamblaje utilizando
1 mg/ml de tiolípido ZD-16 en 90 mM de
octilo-glucósido. Ninguna de las muestras mostró un
espectro con restos de estructura beta.
El tratamiento previo del oro con
\beta-mercaptoetanol (10 mMetanol) (al menos 1
hora aunque ahora estas superficies se mantienen en
\beta-mercaptoetanol 10 mM hasta su uso) provoca
una mejora en la retención de la estructura secundaria de OmpF. A
continuación siguió el autoensamblaje de OmpF-Cys
tal como se describe arriba, seguido de una rápida sustitución de
esta solución por la solución de ZD16. Esto autoensambla la capa de
tiolípidos sin un paso de secado y además solubiliza y elimina la
proteína unida no específicamente. El resultado es un espectro que
concuerda en gran medida con el espectro publicado (Nabedryk et
al., 1988) y confirma que la estructura secundaria de OmpF se
mantiene a través de este procedimiento. La incubación con vesículas
de fosfatidilcolina 1 mg/ml en tampón A durante 1 hora proporciona
una intensidad extra en el pico a un número de onda de 1740
cm^{-1}. Esto es del lípido y dobla exactamente el pico existente
del tiolípido indicando que la capa superficial de la bicapa se ha
completado mediante este procedimiento. El espectro de proteína
muestra un ligero aumento de la estructura secundaria beta.
Incluso sin el subsiguiente ensamblaje del
tiolípido, el pretratamiento con
\beta-mercaptoetanol provoca una mejora
significativa de la retención de la estructura secundaria.
Utilizando otras moléculas hidrofílicas pequeñas con tiol pueden
conseguirse mejoras similares.
La densidad máxima de OmpF-Cys
autoensamblado seguido por tiolípido proporciona una capa que es muy
conductora y que no puede ser analizada mediante IS. La
espectroscopia de impedancia puede medirse a densidades inferiores
de proteína y pueden obtenerse resultados claros utilizando una capa
preparada mediante 1 hora de incubación con 0,003 mg/ml de solución
de OmpF-Cys, lo que significa una concentración 100
veces inferior a la utilizada arriba. A 100 Hz la resistencia de la
capa superficial domina la parte real de la señal. La adición de
10^{-6} M de colicina de dominio R provoca que la resistencia
aumente indicando que la capa está bloqueada por la interacción de
la proteína. Este efecto es dependiente de la concentración y
concuerda con la afinidad medida en el artículo anterior.
La unión del dominio R de la colicina N está
siendo estudiada mediante SPR en Newcastle y confirma los datos de
impedancia mostrados aquí.
Para utilizar proteínas receptoras de la
membrana externa en el desarrollo de monocapas de proteínas de
membrana para bionanotecnología, se necesita replegar las proteínas
in vitro antes de ensamblarlas en las superficies. Aquí
mostramos que la proteína OmpA de membrana externa plegada mediante
los métodos publicados puede ensamblarse a las capas de
proteína-tiolípido como ya se ha mostrado para OmpF.
El resultado también indica que las OMPs monoméricas como OmpA
pueden inmovilizarse utilizando los mismos métodos que para las
porinas triméricas.
La secuencia codificante de OmpA maduro
(1-147) se amplificó a partir del ADN genómico de
Escherichia coli XL-Blue (Stratagene)
utilizando colonia PCR y los siguientes cebadores Sentido
5'-TTTTCTCGAGCTGTGCTCC
GAAAGATAACACC-3' [SEQ ID No. 5], Antisentido 5'-TTTTGCGCAAAGTGCCACGGCCTCGACCTGG-3'
[SEQ ID No. 6]. Los cebadores incluyen respectivamente, las dianas de restricción MluI y XhoI, que permiten la clonación en el vector pET8c basado en el vector pET3c de Novagen. La proteína expresada contiene así una inserción N-terminal de una secuencia MHHHHHHSS [SEQ ID No. 7] codificada por el plásmido y un residuo de Cys adicional codificado por el cebador, y los aminoácidos 1-147 de la proteína OmpA madura. Al plásmido se le denominó pET8c-(CysOmpA1-147). La ausencia de la señal peptídica natural significa que la proteína se expresa en el citoplasma y forma cuerpos de inclusión (Arora et al., 2001; Pautsch & Schulz, 2000). La proteína se expresó en BL21 DE3 pLysE (Novagen) mediante la utilización de caldo Luria y 100 \mug/ml de ampicilina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se incubaron 6 litros de cultivo en matraces Erlenmeyer hasta que la OD alcanzó los 0,6 cuando la expresión de OmpA fue inducida mediante IPTG. Después de crecer durante tres horas más, las células se recogieron mediante centrifugación, se lisaron mediante Prensa Francesa y las células no lisadas se eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad (3000 rpm 10 mins). El sobrenadante se centrifugó a continuación a 10.000 rpm en un rotor Beckman 55.2 durante 1 hora a 4ºC. Esta muestra cruda de cuerpos de inclusión se lavó tres veces homogeneizándola en 20 mM Tris pH 8.0 1% Triton X-100 y centrifugando a 8000 rpm durante 1,5 horas (dos veces) y durante 30 min (final) para obtener una preparación pura de cuerpos de inclusión. Este pellet se resuspendió en 20 ml de tampón (20 mM Tris pH 8,0, 8,0 M urea) y 20 ml de isopropanol homogeneizado a 55ºC durante 30 min. El homogeneizado se centrifugó a 38.000 rpm durante 1,5 h a 4ºC. El sobrenadante contenía el His-Cys-OmpA1-147 solubilizado. La proteína se purificó adicionalmente utilizando una columna de Ni-agarosa e imidazol como eluente. La proteína fue una sola banda en SDS-PAGE y su identidad se confirmó por transferencia Western utilizando un anticuerpo de marcado anti-His (SIGMA). El isopropanol se eliminó mediante diálisis de la muestra de proteína en una solución 8 M urea, 20 mM Tris, pH 8,0 y 1% v/v Genapol (Fluka) utilizando una membrana de diálisis Spectra-Por 6-8.000 MW.
GAAAGATAACACC-3' [SEQ ID No. 5], Antisentido 5'-TTTTGCGCAAAGTGCCACGGCCTCGACCTGG-3'
[SEQ ID No. 6]. Los cebadores incluyen respectivamente, las dianas de restricción MluI y XhoI, que permiten la clonación en el vector pET8c basado en el vector pET3c de Novagen. La proteína expresada contiene así una inserción N-terminal de una secuencia MHHHHHHSS [SEQ ID No. 7] codificada por el plásmido y un residuo de Cys adicional codificado por el cebador, y los aminoácidos 1-147 de la proteína OmpA madura. Al plásmido se le denominó pET8c-(CysOmpA1-147). La ausencia de la señal peptídica natural significa que la proteína se expresa en el citoplasma y forma cuerpos de inclusión (Arora et al., 2001; Pautsch & Schulz, 2000). La proteína se expresó en BL21 DE3 pLysE (Novagen) mediante la utilización de caldo Luria y 100 \mug/ml de ampicilina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se incubaron 6 litros de cultivo en matraces Erlenmeyer hasta que la OD alcanzó los 0,6 cuando la expresión de OmpA fue inducida mediante IPTG. Después de crecer durante tres horas más, las células se recogieron mediante centrifugación, se lisaron mediante Prensa Francesa y las células no lisadas se eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad (3000 rpm 10 mins). El sobrenadante se centrifugó a continuación a 10.000 rpm en un rotor Beckman 55.2 durante 1 hora a 4ºC. Esta muestra cruda de cuerpos de inclusión se lavó tres veces homogeneizándola en 20 mM Tris pH 8.0 1% Triton X-100 y centrifugando a 8000 rpm durante 1,5 horas (dos veces) y durante 30 min (final) para obtener una preparación pura de cuerpos de inclusión. Este pellet se resuspendió en 20 ml de tampón (20 mM Tris pH 8,0, 8,0 M urea) y 20 ml de isopropanol homogeneizado a 55ºC durante 30 min. El homogeneizado se centrifugó a 38.000 rpm durante 1,5 h a 4ºC. El sobrenadante contenía el His-Cys-OmpA1-147 solubilizado. La proteína se purificó adicionalmente utilizando una columna de Ni-agarosa e imidazol como eluente. La proteína fue una sola banda en SDS-PAGE y su identidad se confirmó por transferencia Western utilizando un anticuerpo de marcado anti-His (SIGMA). El isopropanol se eliminó mediante diálisis de la muestra de proteína en una solución 8 M urea, 20 mM Tris, pH 8,0 y 1% v/v Genapol (Fluka) utilizando una membrana de diálisis Spectra-Por 6-8.000 MW.
La concentración de proteínas en este paso era
de 0,34 mM. La proteína se replegó mediante dilución en un exceso
molar de 200de DG
(n-dodecil-\beta-D-glucopiranósido,
Calbiochem) a pH 8,1 siguiendo los procedimientos de Kleinschmidt
et al. (1999). A continuación, la proteína replegada se
examinó mediante espectroscopia de dicroísmo circular que mostró
contener mucha estructura \beta, como se esperaba de un dominio de
transmembrana OmpA totalmente replegado. La proteína también era
resistente a la proteólisis, que es otra propiedad de un monómero
plegado de OmpA.
Finalmente, se mostró mediante SPR que la
proteína se ensambla en electrodos de oro, y que los tiolípidos
pueden añadirse para completar la monocapa como se ha mostrado para
las capas de OmpF. Los resultados demuestran que las porinas
monoméricas replegadas tales como OmpA pueden utilizarse de la misma
manera que se ha descrito para OmpF. El chip de oro J1 se limpió con
solución Piranha (9% v/v H_{2}O_{2} y 70% H_{2}SO_{4} Conc.)
aclarado con etanol y agua y secado con nitrógeno. En el
espectrómetro de resonancia de plasma superficial
Biacore-X, el chip se lavó con una solución 0,05% en
SDS y a continuación con \beta-mercaptoetanol 0,2%
para proporcionar la capa hidrofílica. Después de un segundo lavado
con SDS la proteína plegada
His-Cys-OmpA(1-147)
a 0,2 mg/ml de
n-dodecil-\beta-D-glucopiranósido
mostró una unión fuerte con la superficie. Un lavado adicional con
SDS eliminó la proteína enlazada no específicamente y a continuación
le siguió un segundo paso de ensamblaje del tiolípido
ZD-16 (0,5 mg/ml en
octilo-polioxietileno 1% (Bachem)) para completar la
capa lípido-proteica.
1. Stora, T., Lakey, J.H. and
Vogel, H. (1999). Ion-Channel Gating
in Transmembrane Receptor Proteins: Functional Activity in Tethered
Lipid Membranes. Angew. Chem. Int. Ed. 38(3),
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2. Cornell, B.A.,
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ion-channel switches. Nature 3876633),
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3. Bainbridge, G., Mobasheri, H.,
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cystine scanning mutagenesis study of loop 3. Journal Of
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Lakey, J. H. (1996). Direct measurement of the
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5. Nabedryk, E., Garavito, R. M.
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beta-sheets in porin - a polarized fourier transform
infrared spectroscopic investigation. Biophysical Journal
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6. Evans, L. J. A., Labeit, S.,
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(1996). The central domain of colicin N possesses the
receptor recognition site but not the binding affinity of the whole
toxin. Biochemistry 35(48),
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in Transmembrane Receptor Proteins: Functional Activity in Tethered
Lipid Membranes. Angew. Chem. Int. Ed. 38(3),
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7. Lang, H., Duschl, C., and
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attachment of lipid bilayers on gold surfaces." Langmuir,
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8. Boncheva, M,, and Vogel, H.
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interfaces: Controlling molecular conformation and orientation."
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9. Arora, A., Abildgaard, F.,
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Structure of outer membrane protein A transmembrane domain by NMR
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of E-coli folds into detergent micelles, but
not in the presence of monomeric detergent. Protein Science
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11. Pautsch, A. & Schulz, G.E.
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(1998). Emerging techniques for investigating molecular
interactions at lipid membranes. Biochimica et Biophysica
Acta 85507, 319-338.
Hay más de 340 genes identificados que codifican
porinas Gram-ve, de ellos muchos son variantes de
porinas de membrana externa de Neisseria meningitidis que
muestran una gran variabilidad en sus bucles externos. La siguiente
es una lista por especie. Porinas adicionales, que tienen una
homología de secuencia pequeña, se encuentran al final de la lista.
Las cifras entre paréntesis son el número total de genes similares a
los de las porinas que se han identificado en esas especies. Algunas
de las proteínas pueden no ser porinas verdaderas.
\vskip1.000000\baselineskip
| Especies (número total de proteínas de esta clase identificadas por el momento | |
| en estas especies) | |
| Siphoviridae pa (1) | |
| Grupo p21 de fago Lambda (1) | |
| Ectothiorhodospira vacuolata (1) | |
| Vibrio cholerae (1) | |
| Photobacterium profundum (1) | |
| Haemophilus influenzae (30) | |
| Pasteurella multocida (7) | |
| Rahnella aquatilis (2) | |
| Salmonella typhimurium (4) | |
| Enterobacter cloacae (1) | |
| Salmonella typhi (5) | |
| Citrobacter freundii (1) | |
| Calymmatobacterium granulomatis (1) | |
| Klebsiella pneumoniae (7) | |
| Yersinia pestis (2) | |
| Xenorhabdus nematophilus (1) | |
| Klebsiella oxytoca (1) | |
| Escherichia coli (9) | |
| Serratia marcescens (2) | |
| Burkholderia cepacia (1) | |
| Eikenella corrodens (1) | |
| Neisseria polysaccharea (1) | |
| Neisseria lactamica (2) | |
| Neisseria gonorrhoeae (91) | |
| Neisseria flavescens (2) | |
| Neisseria sicca (2) |
TABLA 1
(continuación)
| Neisseria meningitidis (160) | |
| Bordetella pertussis (1) | |
| Rhodobacter blastica (1) | |
| Rhodobacter capsulatus | |
| Brucella sp | |
| Chlamydia sp | |
| Shigella | |
| Comamonas acidovorans | |
| Aeromonas | |
| Thermotoga maritima |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Proteínas OmpA 8 con barriles
beta encadenados y proteínas de membrana
homólogas
| Especies (número total de proteínas de esta clase identificadas por el momento | |
| en estas especies) | |
| Chlamydophila pneumoniae (1) | |
| Chlamydia trachomatis (1) | |
| Helicobacter pylori (5) | |
| Haemophilus influenzae (4) | |
| Haemophilus sp (1) | |
| Pasteurella haemolytica (1) | |
| Haemophilus parainfluenzae (1) | |
| Pasteurella multocida (1) | |
| aemophilus somnus (1) | |
| Haemophilus ducreyi (3) | |
| Actinobacillus pleuropneumoniae (1) | |
| Actinobacillus actinomycetemcomitans (1) | |
| Vibrio alginolyticus (2) | |
| Vibrio cholerae (1) | |
| Vibrio parahaemolyticus (3) | |
| Methylococcus capsulatus (1) | |
| Aeromonas salmonicida (2) |
TABLA 1
(continuación)
| Pseudomonas syringae (1) | |
| Moraxella catarrhalis (1) | |
| Pseudomonas aeruginosa (3) | |
| Pseudomonas putida (2) | |
| Pseudomonas fluorescens (7) | |
| Escherichia vulneris (3) | |
| Escherichia hermannii (1) | |
| Escherichia fergusonii (1) | |
| Escherichia blattae (1) | |
| Salmonella typhimurium (2) | |
| Shigella dysenteriae (1) | |
| Serratia odorifera (1) | |
| Enterobacter aerogenes (2) | |
| Citrobacter freundii (1) | |
| Klebsiella pneumoniae (1) | |
| Serratia marcescens (1) | |
| Escherichia coli (6) | |
| Legionella pneumophila (1) | |
| Neisseria gonorrhoeae (1) | |
| Neisseria meningitidis (1) | |
| Leptothrix discophora (1) | |
| Bordetella avium (1) | |
| Brucella abortus (1) | |
| Bartonella bacilliformis (1) | |
| Sinorhizobium meliloti (1) | |
| Rickettsia prowazekii (1) | |
| Aquifex aeolicus (3) | |
| Treponema phagedenis (1) | |
| Borrelia burgdorferi (2) | |
| Treponema pallidum (3) |
\newpage
TABLA 1
(continuación)
Porinas selectivas de
azúcar
| Vibrio parahaemolyticus (1) | |
| Vibrio cholerae (1) | |
| Aeromonas salmonicida (1) | |
| Klebsiella pneumoniae (2) | |
| Salmonella typhimurium (2) | |
| Escherichia coli (2) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Proteína TSX formadora de
canales específicos de
nucleósido
| Especies (número total de proteínas de esta clase identificadas por el momento | |
| en estas especies) | |
| Klebsiella pneumonia | |
| Enterobacter aerogenenes | |
| Escherichia coli. | |
| Salmonella typhimurium |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Receptores dependientes de TonB que pueden inmovilizarse mediante el método han sido | |
| identificados en las siguientes especies de bacterias. | |
| Especies (número total de proteínas de esta clase identificadas por el momento | |
| en estas especies) | |
| Helicobacter pylori (6) | |
| Campylobacter coli (1) | |
| Haemophilus influenzae (17) | |
| Pasteurella haemolytica (1) | |
| Haemophilus ducreyi (3) | |
| Actinobacillus pleuropneumoniae (5) | |
| Vibrio vulnificus (1) | |
| Vibrio anguillarum (1) | |
| Vibrio orientalis (1) | |
| Vibrio cholerae (3) |
TABLA 2
(continuación)
| Aeromonas salmonicida (1) | |
| Pseudomonas stutzeri (1) | |
| Moraxella catarrhalis (4) | |
| Acinetobacter sp (1) | |
| Pseudomonas aeruginosa (11) | |
| Pseudomonas putida (2) | |
| Shewanella sp (1) | |
| Stenotrophomonas maltophilia (1) | |
| Salmonella typhimurium (2) | |
| Shigella dysenteriae (1) | |
| Pectobacterium chrysanthemi (1) | |
| Yersinia pseudotuberculosis (1) | |
| Citrobacter freundii (1) | |
| Yersinia enterocolitica (4) | |
| Erwinia amylovora (1) | |
| Salmonella paratyphi (1) | |
| Salmonella cholerae (1) | |
| Yersinia pestis (2) | |
| Serratia marcescens (1) | |
| Escherichia coli (17) | |
| Neisseria gonorrhoea (3) | |
| Neisseria meningitidis (12) | |
| Bordetella pertussis (1) | |
| Bordetella bronchiseptica (3) | |
| Paracoccus denitrificans (1) | |
| Sphingomonas aromaticivorans (3) | |
| Bradyrhizobium japonicum (1) | |
| Rhizobiaceae sp (1) | |
| Synechocystis sp (3) | |
| Proteobacteria sp (1) |
<110> University of Newcastle Upon
Tyne
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Biosensor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 44061.PCT/JMD/MAR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1089
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1089)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttctatca gctactgtta cgaaggcttt ggtatcg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagatagt agatgacaat gcttccgaaa ccatagc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttctcgag ctgtgctccg aaagataaca cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgcgcaa agtgccacgg cctcgacctc g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la etiqueta
N-terminal codificada por el vector pET8c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met His His His His His His Ser Ser}
Claims (38)
1. Producto que comprende: una proteína
transmembrana; una membrana lipídica formada a partir de moléculas
anfifílicas y de moléculas de proteínas transmembrana; y un sustrato
sólido: caracterizado porque la proteína de membrana incluye
un aminoácido que contiene tiol a través del cual la proteína de
membrana se acopla al sustrato mediante una unión covalente
directa.
2. Producto según la reivindicación 1, en el que
por lo menos algunas de las moléculas anfifílicas están unidas al
sustrato sólido mediante una unión covalente directa.
3. Producto según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la proteína se acopla al sustrato sólido mediante al menos un
residuo expuesto de cisteína, localizado en el lado periplasmático
de la proteína.
4. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el producto es un
biosensor.
5. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el producto es una matriz
proteica.
6. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína comprende un
polipéptido de más de 20 residuos L-aminoacídicos
purificados procedentes de un extracto celular.
7. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína comprende una
estructura barril \beta.
8. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que la proteína
comprende una estructura hélice \alpha.
9. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína es una proteína
integral de membrana en la que las unidades estructurales
secundarias atraviesan al menos una vez la membrana y unen regiones
expuestas a una fase acuosa.
10. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína es una proteína
que forma un canal iónico, un iónoforo.
11. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que la proteína es un
receptor de un ligando o una familia de ligandos.
12. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que la proteína es un
enzima.
13. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la proteína es una
proteína recombinante manipulada genéticamente que comprende una
proteína transmembrana y un polipéptido sintético.
14. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la proteína es una
proteína recombinante modificada genéticamente que comprende una
proteína transmembrana y toda o parte de una proteína soluble de más
de 20 residuos L-aminoacídicos purificados
procedentes de un extracto celular.
15. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la proteína es una
proteína recombinante manipulada genéticamente a la que se le ha
introducido, por inserción o mutación, al menos un residuo expuesto
de cisteína localizado en el lado periplasmático de la proteína.
16. Producto según la reivindicación 10, en el
que la proteína es una porina.
17. Producto según la reivindicación 16, en el
que la porina se selecciona de la Tabla 1.
18. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las moléculas anfifílicas
comprenden o consisten en tiolípido.
19. Producto según la reivindicación 18, en el
que el tiolípido se selecciona del grupo que consiste en:
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotioetanol;
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato];
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato]; N-(14'-mercapto-1',11'-dioxo-3',6',
9'-trioxa-12'-azatetradecilo)-2-oleoil-1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina;
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato]; N-(14'-mercapto-1',11'-dioxo-3',6',
9'-trioxa-12'-azatetradecilo)-2-oleoil-1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina;
ácido
(8'-mercapto-3',6'-dioxa-octilo)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico.
20. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-19, en el que el sustrato sólido
es un metal.
21. Producto según la reivindicación 20, en el
que el metal se selecciona entre: oro, cromo, platino, plata.
22. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-21, en el que el sustrato sólido
tiene una superficie modificada para reaccionar con grupos tiol.
23. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-19, en el que el sustrato sólido
se selecciona entre: vidrio, plástico, silicio, silicio con
terminaciones de hidrógeno.
24. Método para la preparación de un producto
según cualquiera de las reivindicaciones 1-23 que
comprende:
- i)
- tratar un sustrato sólido con un agente de recubrimiento hidrofílico,
- ii)
- proporcionar al menos una proteína transmembrana que incluya un aminoácido que contiene tiol,
- iii)
- poner en contacto la proteína con el sustrato sólido tratado, en condiciones para la unión de la proteína directamente al sustrato sólido tratado a través del aminoácido que contiene tiol,
- iv)
- añadir moléculas anfifílicas a la proteína unida al sustrato para formar una membrana lipídica.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
el agente hidrofílico es un tiol.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
el tiol es de fórmula general
OH-(CH_{2})_{n}-SH, donde n es un número
entero y la cadena alquilo es lineal o ramificada.
27. Método según la reivindicación 24, en el que
el sustrato se trata con un agente hidrofílico seleccionado entre:
2-mercaptoetanol; ácido mercaptopropiónico;
1-mercapto-2-propanol;
2,3-dimercapto-1-propanol;
2-mercapto-3-butanol;
eritro-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol,
(DTE);
treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol,
(DTT); mezclas de DTE y DTT; tioglicerol
28. Método según la reivindicación 27, en el que
el agente hidrófilo es 2-mercaptoetanol.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24-28, en el que el sustrato sólido
es oro.
30. Método según la reivindicación 29, en el que
las moléculas anfifílicas están unidas al sustrato de oro mediante
un enlace oro-azufre.
31. Método según la reivindicación 30, en el que
las moléculas anfifílicas son tiolípidos.
32. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24-31, en el que la proteína es un
ionóforo.
33. Un método según la reivindicación 32, en el
que la proteína es una porina.
34. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24-33, en el que se proporciona al
menos un residuo expuesto de cisteína en el lado periplasmático de
la proteína, de manera que la unión de la proteína al sustrato
sólido tiene lugar mediante la unión de por lo menos una cisteína a
por lo menos un grupo tiol en el sustrato sólido.
35. Método según la reivindicación 34, en el
que la porina es OmpA modificada, formada por la adición
N-terminal de MHHHHHHSSCys- a la proteína OmpA
madura.
36. Método según la reivindicación 34, en el que
la porina es OmpF modificada, formada por la mutación del glutamato
183 a cisteína.
37. Producto obtenido mediante el método según
cualquiera de las reivindicaciones 24-36.
38. Uso del producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-23 para interaccionar con al
menos una de las siguientes moléculas: polipéptidos; polipéptidos
antigénicos; anticuerpos o fragmentos de anticuerpos; receptores;
ligandos; antibióticos; fármacos; pesticidas; azúcares; aminoácidos;
ácidos grasos; péptidos; hormonas; esteroides; ácidos nucleicos
(ADN, ARN, ADNc); ácidos nucleicos peptídicos; metales; iones
inorgánicos.
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