ES2265389T3 - Proteina humana que contiene repeticiones ricas en leucina expresada predominantemente en el intestino delgado, hlrrsi1. - Google Patents

Proteina humana que contiene repeticiones ricas en leucina expresada predominantemente en el intestino delgado, hlrrsi1. Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico constituido por una secuencia polinucleotídica seleccionada entre el grupo constituido por: (a) un polinucleótido constituido por los nucleótidos 78 a 1949 de la ID SEC nº 1; (b) un polinucleótido constituido por los nucleótidos 75 a 1949 de la ID SEC Nº 1; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 2 a 625 de la ID SEC Nº 2; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 1 a 625 de la ID SEC Nº 2; (e) un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 como se codifica por el clon de ADNc contenido en el depósito de la ATCC Nº PTA-2679; (f) un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 como se codifica por el clon de ADNc contenido en el depósito de la ATCC Nº PTA-2674; y la cadena complementaria del mismo.

Description

Proteína humana que contiene repeticiones ricas en leucina expresada predominantemente en el intestino delgado, HLRRSI1.
Campo de la invención
La presente invención proporciona polinucleótidos nuevos que codifican los polipéptidos HLRRSI1 y fragmentos de los mismos. También se proporcionan vectores, células hospedadoras, anticuerpos y procedimientos recombinantes y sintéticos para producir dichos polipéptidos. La invención además se refiere al uso de estos polipéptidos nuevos HLRRSI1 en la preparación de composiciones para diagnosis, tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades y/o trastornos relacionados con estos polipéptidos.
Antecedentes de la invención
Recientemente, se ha descrito una clase de proteínas de la superficie celular, tanto en plantas como en animales que están implicadas en la percepción de patógenos, transactivación del CPH de clase II, inflamación y la regulación de la apoptosis (Inohara, N., Nunez, G. Cell. Death. Differ., 6 (9): 823-4, (1999); Inohara, N., Koseki, T., del, Peso, L., Hu, Y., Yee, C., Chen, S., Carrio, R., Merino, J., Liu, D., Ni, J., Nunez, G, J. Biol. Chem. 21., 274 (21): 14560-7, (1999); Inohara, N., Nunez, G, Cell. Death. Differ., 7(5):509-10, (2000); Harton, JA., Ting, JP, Mol. Cell. Biol., 20 (17): 6185-94, (2000); Dixon, J., Brakebusch, C., Fassler, R., Dixon, MJ. Hum. Mol. Genet. 12., 9 (10):1473-80, (2000)). En la naturaleza, todas estas proteínas son modulares conteniendo uno o más dominios que funcionan en el reclutamiento de caspasas (CARD), unión a nucleótidos e interacciones proteína-proteína. Se encontró que las proteínas de este grupo representan un papel en la adhesión celular durante diversos procesos de desarrollo. Además, la solicitud de patente WO 01/42288 describe una proteína G unida al recepto GCREC y polinucleótidos que codifican el receptor unido a la proteína G que puede ser útil para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociada con expresión aberrante de GCREC.
Un aspecto común en todas estas proteínas es la presencia de una repetición rica en leucina (LLR) en el extremo carboxiterminal de la cadena polipeptídica. Las LLR son módulos proteicos cortos caracterizados por una distribución periódica de aminoácidos hidrófobos, especialmente restos de leucina separados por restos hidrófilos [Sean, 1996]. La estructura básica de la repetición es la siguiente:
X-L-X-X-L-X-L-X-X-N-X-a-X-X-X-a-X-X-L-X
donde X es cualquier aminoácido, L es leucina, N es asparragina y "a" indica un resto alifático. La asparragina de la posición 10 puede sustituirse por cisteína, treonina o glutamina. La longitud media de la repetición es de 24 aminoácidos pero puede variar de 22 a 29 aminoácidos, aunque se ha informado de algunos motivos LRR tan cortos como de 20 aminoácidos. A menudo, el motivo está compuesto de leucina o de otros restos alifáticos en las posiciones 2, 5, 7, 12, 16, 21 y 24 y asparragina, cisteína o treonina en la posición 10. La determinación de la estructura de rayos X de motivos LRR sugiere que cada LRR está compuesto de una lámina beta y una hélice alfa. La mayor subfamilia de proteínas que contiene un dominio rico en leucina está formada por proteínas extracelulares que tienen el siguiente motivo: LxxLxxLxLxxNxLxxLPxxOFxx, donde "x" es cualquier aminoácido y "O" es un resto no polar (Kajava, J. Mol. Biol. 277: 519 (1998)).
En las proteínas transmembrana, las LLR y sus secuencias flanqueantes siempre aparecen en las supuestas porciones extracelulares. En estas situaciones, las LLR generalmente están flanqueadas a cada lado por regiones ricas en cisteína. En general, estas cisteínas están presentes en la forma de enlace disulfuro oxidado. Un ejemplo de una proteína de transmembrana que contiene una LRR es Toll, un gen de Drosophila que actúa en el establecimiento del diseño dorso-ventral. Se han descrito mutantes ventralizantes dominantes que se mapean en las regiones ricas en cisteína alrededor del dominio LLR [Schneider, 1991]. De este modo, las regiones de cisteína asociadas con las LLR actúan regulando la actividad del receptor. Se ha demostrado que las LLR por sí mismas en la proteína Toll funcionan en la adhesión
celular heterotípica, un proceso requerido para un desarrollo motoneuronal y muscular apropiado [Halfon, 1995].
Otra proteína transmembrana de Drosophila que contiene LLR, la 18 wheeler, que se regula mediante genes homeóticos también promueve la adhesión celular heterófila en sucesos de migración celular durante el desarrollo (Eldon, E., Kooyer, S., D'Evelyn, D., Duman, M., Lawinger, P., Botas, J., Bellen, H, Development., 120 (4): 885-99, (1994)). Se piensa que el CD14 de mamíferos, que se une al lipopolisacárido (LPS) y transmite señales a través de NF-\kappaB, tiene analogías con la ruta de transducción de señales de Toll. El CD14 también contiene una región de LLR que, como se ha demostrado en mutantes de deleción, son responsables de la unión a LPS.
Slit es otra proteína que contiene LLR secretada por Drosophila que funciona en el desarrollo de las células gliales de la línea media y las extensiones del axón por la comisura que atraviesa la línea media. Esto se logra presumiblemente mediante sucesos de adhesión celular (Jacobs, JR, J. Neurobiol., 24 (5):611-26, (1993)) Se ha demostrado que homólogos de mamíferos de la slit de Drosophila se unen al proteoglicano de heparansulfato, glipican-1 (Liang, Y., Annan, RS., Carr, SA., Popp, S., Mevissen, M., Olis, RK., Olis, RU, J. Biol, Chem. 18., 274(25):17885-92, (1999)). En general, se ha demostrado que los proteoglicanos de heparansulfato se acumulan en los cerebros de enfermos de Alzheimer y específicamente, el glipican-1 es un componente tanto de las placas seniles como de los ovillos neurofibrilares (Verbeek, MM., Otte, Holler, I., van, den, Born, J., van, den, Heuvel, LP., David, G., Wesseling, P., de, Waal, RM, Am. J. Pathol., 155 (6): 2115-25 (1999)). Los proteoglicanos de heparansulfato también están implicados en la regulación de la señalización de citocinas en las células B a través de la activación de CD40 (van, der, Voort, R., Taher, TE., Derksen, PW., Spaargaren, M., van, der, Neut, R., Pals, ST, Adv. Cancer. Res., 79:39-90, (2000)).
p37NB es una proteína de 37 kDa con LRR identificada en células de neuroblastoma humano (Kim, D. y col. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1309: 183-188). Los estudios de hibridación de inmunotransferencia de ARN total y de RT-PCR muestran que p37NB se expresa de forma diferencial en diversas líneas celulares de neuroblastoma. Una proteína con LRR relacionada, la PRELP, se caracteriza como una proteína secretada de 42 kDa (Bengtsson, E. y col. (1995) J. Biol. Chem. 270: 25639-25644). La PRELP está compuesta de 10 motivos LRR con una longitud que oscila de 20 a 26 restos con asparragina en la posición 10. Los análisis de inmunotransferencia de ARN total muestran una expresión diferencial de PRELP en diversos tejidos.
Además, las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina también han estado implicadas en diversos aspectos de la interacción proteína-proteína, tal como la comunicación entre células y la transducción de señales (para revisión, véase Kobe y Deisenhofer, TIBS 19: 415 (1994); Kobe y Deisenhofer, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 409 (1995); Kajava, J. Mol. Biol. 277: 519 (1998)). Las proteínas que contienen un motivo LRR incluyen receptores de hormonas, subunidades enzimáticas, proteínas de adhesión celular y proteínas que se unen a ribosomas.
Una subfamilia de la superfamilia de LRR, denominada como la familia de pequeños proteoglicanos ricos en leucina, muestra las funciones críticas cumplidas por las proteínas que contienen un motivo LRR. Se cree que los miembros de esta subfamilia representan papeles biológicos esenciales durante la inflamación y la invasión del cáncer, un papel regulador en la formación de la fibrilla de colágeno, supresión del fenotipo maligno de las células cancerosas y una inhibición del crecimiento de ciertas células normales (véase, por ejemplo, Iozzo, Annu. Rev. Biochem. 67: 609 (1998)).
Kajava y col., J. Mol. Biol. 277: 519 (1998); dividen la superfamilia de LRR en subfamilias caracterizadas por longitudes y secuencias consenso diferentes de las repeticiones ricas en leucina. Sobre la base de este análisis estructural, Kajava concluyó que las proteínas LRR de subfamilias diferentes probablemente han surgido de forma independiente durante la evolución, lo que indica que las proteínas con el motivo LRR proporcionan una única solución para una amplia gama de funciones biológicas.
Se han identificado proteínas que contienen LLR en procariotas, plantas, levaduras y mamíferos. Aunque inicialmente se pensó que estas eran proteínas secretadas, ahora se aprecia que inhiben diversas localizaciones celulares y participan en un conjunto diverso de funciones críticas en el desarrollo y en la homeostasis celular.
Cuando estas LRR son extracelulares, son capaces de dirigir las interacciones proteína-proteína con otros receptores implicados en respuestas de apoptosis, de inflamación e inmunitarias. Las proteínas que contienen LLR también pueden unirse a otros ligandos extracelulares derivados de agentes infecciosos y participar en el desencadenamiento y/o la modulación de las respuestas inmunitarias, especialmente la apoptosis.
Los mecanismos que median en la apoptosis se han estudiado intensamente. Estos mecanismos implican la activación de proteasas endógenas, pérdida de función mitocondrial y cambios estructurales tal como la alteración del citoesqueleto, retracción celular, formación de ampollas en la membrana y condensación nuclear debida a la degradación del ADN.
Se piensa que las diversas señales que desencadenan la apoptosis dan lugar a estos sucesos por convergencia en una ruta de muerte celular común, cuyos componentes centrales están muy conservados desde gusanos, tales como C. elegans, a humanos. De hecho, los sistemas modelo de invertebrados han sido herramientas inestimables para identificar y caracterizar los genes que controlan la apoptosis. A pesar de esta conservación de ciertos componentes centrales, la señal apoptótica en mamíferos es mucho más compleja que en invertebrados. Por ejemplo, en los mamíferos hay múltiples homólogos de los componentes centrales en la ruta de señalización de muerte celular.
Las caspasas, una clase de proteínas centrales en el programa apoptótico, son responsables de la degradación de proteínas celulares que lleva a los cambios morfológicos observados en las células que experimentan apoptosis Las caspasas (proteinasas específicas de cisteinil aspartato) son cistein proteasas que tienen especificidad por aspartato en el sitio de escisión del sustrato. Generalmente, las caspasas se clasifican como caspasas iniciadoras o caspasas efectoras; siendo ambas zimógenos que se activan por proteolisis que genera una especie activa. Una caspasa efectora se activa por una caspasa iniciadora que escinde a la caspasa efectora.
Las caspasas iniciadoras se activan mediante un mecanismo autoproteolítico que a menudo depende de la oligomerización dirigida por la asociación de la caspasa con una molécula adaptadora.
La señalización apoptótica es dependiente de las interacciones proteína-proteína. Se han identificado al menos tres dominios diferentes de interacción proteína-proteína en las proteínas implicadas en la apoptosis, el dominio de muerte, el dominio efector de muerte y el dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). Recientemente, se ha identificado un cuarto dominio de interacción proteína-proteína en FLASH murina, el dominio de reclutamiento de muerte (DRD) (Imai y col. (1999) Nature 398: 777-85).
Las caspasas comprenden una familia multigénica que tiene al menos 12 miembros de la familia diferentes (Nicholson (1999) Cell Death and Differentiation 6: 1028). Se piensa que una fracción relativamente pequeña de polipéptidos celulares (menos de 200) sirven como dianas para la escisión de las caspasas. Debido a que muchas de estas dianas de las caspasas realizan funciones celulares claves, se piensa que su proteolisis es responsable de los sucesos celulares y morfológicos que tienen lugar durante la apoptosis. Los miembros de la familia de genes de caspasas pueden dividirse mediante análisis filogenético en dos subfamilias principales, sobre la base de sus relaciones con ICE (enzima que convierte interleucina 1p; caspasa-1) y CED-3. Se han hecho agrupamientos alternativos de las caspasas sobre la base de sus especificidades de sustrato. Muchas caspasas y proteínas que interaccionan con las caspasas poseen un dominio CARD.
El destino de una célula en los organismos multicelulares a menudo requiere elegir entre la vida y la muerte. Este proceso de suicidio celular, conocido como muerte celular programada o apoptosis, tiene lugar durante varios sucesos en un ciclo vital de los organismos, tales como por ejemplo, entre otros, en el desarrollo de un embrión, durante el transcurso de una respuesta inmunológica o en la muerte de células cancerosas tras el tratamiento con fármacos. El resultado final de supervivencia celular frente a apoptosis depende del equilibrio de dos sucesos que se contrarrestan, el inicio y la velocidad de activación de la cascada de caspasas (esencialmente una reacción en cadena de proteasas) y el suministro de factores antiapoptóticos que bloquean la actividad caspasa (Aggarwal B.B. Biochem. Pharmacol. 60, 1033-1039, (2000); Thornberry, N. A. y Lazebnik, Y. Science 281, 1312-1316, (1998)).
La producción de proteínas antiapoptóticas está controlada por el complejo del factor de transcripción NF-\kappaB. Por ejemplo, la exposición de células a la proteína del factor de necrosis tumoral (TNF) puede señalizar tanto la muerte como la supervivencia celular, e incluso jugar un papel principal en la regulación de las respuestas inmunológica e inflamatoria (Ghosh, S., May, M. J., Kopp, E. B. Annu. Rev. Immunol. 16, 225-260, (1998); Silverman, N. y Maniatis, T., Genes and Dev. 15, 2321-2342, (2001); Baud, V. y Karin, M., Trends Cell Biol. 11, 372-377, (2001)). La actividad antiapoptótica de NF-\kappaB también es crucial para la oncogénesis y para la quimio y radioresistencia del cáncer (Baldwin, A. S., J. Clin. Inves. 107, 241-246 (2001)).
El factor nuclear \kappaB (NF-\kappaB) está compuesto de complejos diméricos de p50 (NF-\kappaB1) o p52 (NF-\kappaB2) normalmente asociados con miembros de la familia Rel (p65, c-Rel, Rel B) que tienen potentes dominios de transactivación. Las diferentes combinaciones de las proteínas NF-\kappaB/Rel se unen a sitios \kappaB distintos para regular la transcripción de genes diferentes. Trabajos anteriores que implicaban a NF-\kappaB sugerían que su expresión se limitaba a tipos celulares específicos, estimulando especialmente la transcripción de los genes que codifican las inmunoglobulinas kappa en linfocitos B. Sin embargo, se ha descubierto que NK-\kappaB está, de hecho, presente y es inducible en muchos, sino en todos, los tipos celulares y que actúa como un mensajero intracelular capaz de jugar un amplio papel en la regulación génica como mediador de la transducción de señal es inducible. Específicamente, se ha demostrado que NF-\kappaB representa un papel principal en la regulación de las señales intracelulares en muchos tipos celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que NF-\kappaB regula positivamente el gen del interferón beta humano (IFN-beta) en muchos, sino en todos, tipos de células. Además, también se ha demostrado que NF-\kappaB sirve para la importante función de actuar como traductor intracelular de las influencias externas.
El factor de transcripción NK-\kappaB está secuestrado en forma inactiva en el citoplasma como un complejo con su inhibidor, I\kappaB, siendo el miembro más destacado de esta clase I\kappaBa. Se conoce que varios factores sirven para la función de estimuladores de la actividad NF-\kappaB, tales como, por ejemplo, TNF. Después de la exposición al TNF, el inhibidor se fosforila y se elimina proteolíticamente, liberando el NF-\kappaB en el núcleo y permitiendo su actividad transcripcional. Este factor de transcripción regula por incremento numerosos genes, entre ellos I\kappaBa. La proteína I\kappaBa recientemente sintetizada inhibe NF-\kappaB, parando de forma eficaz la activación transcripcional adicional de sus efectores después del extremo 3'. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la proteína I\kappaBa también puede inhibir NF-\kappaB sólo en ausencia de los estímulos I\kappaBa, tales como la estimulación TNF, por ejemplo. Otros agentes que se sabe estimulan la liberación de NF-\kappaB y, de este modo, la actividad de NF-\kappaB, son los lipopolisacáridos bacterianos, polipéptidos extracelulares, agentes químicos, tales como ésteres de forbol, que estimulan a las fosfoquinasas intracelulares, o citocinas inflamatorias, IL-1, los estreses oxidativo y mecánico por fluido y la radiación ionizante (Basu, S., Rosenzweig, K, R., Youmell, M., Price, B, D, Biochem, Biophys, Res, Commun., 247(1):79-83, (1998)). Por tanto, como norma general, cuanto más fuerte sea el estímulo agresor mayor será la activación de NF-\kappaB resultante y mayor el nivel de transcripción de I\kappaBa. Como consecuencia, puede usarse la medida del nivel de ARN de I\kappaBa como marcador de sucesos antiapoptóticos e, indirectamente, para el inicio y potencia de los sucesos
proapoptóticos.
Usando los ejemplos anteriores, está claro que la disponibilidad de una nueva proteína clonada que contiene repeticiones ricas en leucina proporciona una oportunidad de terapia adicional o de sustitución y puede ser útil para la identificación de agonistas o estimuladores de proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina (que podrían estimular y/o sesgar la acción de la proteína que contiene repeticiones ricas en leucina), así como, en la identificación de inhibidores de proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina. Por tanto, puede ser razonable que los agonistas y antagonistas de estas proteínas que contienen LLR serán útiles con fines terapéuticos.
La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención y a células hospedadoras que contienen los vectores recombinantes, así como a procedimientos para hacer estos vectores y células hospedadores, además de su uso en la producción de polipéptidos o péptidos HLRRSI1 usando técnicas recombinantes. Se proporcionan procedimientos sintéticos para producir los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención. También se proporcionan procedimientos diagnósticos para detectar enfermedades, trastornos y/o dolencias relacionadas con los polipéptidos y polinucleótidos HLRRSI1 y procedimientos terapéuticos para tratar estas enfermedades, trastornos y/o dolencias, así como procedimientos de análisis para identificar patrones de unión de los polipéptidos.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que están compuestas de un polinucleótido que codifica la proteína HLRRSI1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 1A-C (ID SEC Nº 2) o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc, HLRRSI1 (también denominado GPCR12Nº99, GPCR12Nº100, SILL1A y/o SILL1B), depositado con los números de depósito de la ATCC PTA-2679 y PTA-2674 el 15 de noviembre del 2000.
La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención y a células hospedadoras que contienen los vectores recombinantes, así como a procedimientos para hacer estos vectores y células hospedadores, además de su uso en la producción de polipéptidos o péptidos HLRRSI1 usando técnicas recombinantes. Se proporcionan procedimientos sintéticos para producir los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención. También se proporcionan procedimientos diagnósticos para detectar enfermedades, trastornos y/o dolencias relacionadas con los polipéptidos y polinucleótidos HLRRSI1 y procedimientos terapéuticos para tratar estas enfermedades, trastornos y/o dolencias.
La invención además proporciona un polipéptido HLRRSI1 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido descrito en este documento.
La invención además se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 2 a 625 de la ID SEC Nº 2.
La invención además se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 1 a 625 de la ID SEC Nº 2.
La invención además se refiere a un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 según lo codifica el clon de ADNc contenido en el Nº de depósito de la ATCC PTA-2679.
La invención además se refiere a un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 según lo codifica el clon de ADNc contenido en el Nº de depósito de la ATCC PTA-2674.
La invención además se refiere a un polinucleótido constituido por los nucleótidos 78-1949 de la ID SEC Nº 1.
La invención además se refiere a un polinucleótido constituido por los nucleótidos 75-1949 de la ID SEC Nº 1.
La invención además se refiere a una proteína de longitud completa de la ID SEC Nº 2 o de la secuencia codificada incluida en el clon depositado.
La invención además se refiere a un polinucleótido que represente la secuencia complementaria (antisentido) de la ID SEC Nº 1.
La invención además se refiere a una proteína de longitud completa de la ID SEC Nº 2 y de la secuencia codificada incluida en el clon depositado.
La invención además se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido aislado de la ID SEC Nº 2.
La invención además se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido aislado de la ID SEC Nº 2.
La invención además se refiere al uso del polipéptido de la ID SEC Nº 2 o al polinucleótido de la ID SEC Nº 1 para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad.
La invención además se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar una afección patológica y la susceptibilidad a una afección patológica en un sujeto que comprende las etapas de (a) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de la ID SEC Nº y (b) diagnosticar una dolencia patológica o la susceptibilidad a una afección patológica sobre la base de la presencia o ausencia de dicha mutación.
La invención además se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar una afección patológica o la susceptibilidad a una afección patológica en un sujeto, que comprende las etapas de (a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de la ID SEC Nº 2 en una muestra biológica; y diagnosticar una afección patológica o la susceptibilidad a una afección patológica sobre la base de la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.
La invención además se refiere a un procedimiento para hacer secuencias polinucleotídicas que codifican productos génicos que tienen alterada la actividad de la ID SEC Nº 2 que comprende las etapas de (a) mezclar de forma aleatoria una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1; (b) expresar las secuencias de nucleótidos mezcladas resultantes y (c) seleccionar la actividad alterada en comparación con la actividad del producto génico de dicha secuencia de nucleótidos sin modificar.
La invención además describe el uso del polipéptido proporcionado como ID SEC Nº 2, además de su ácido nucleico codificador, para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, en el que la enfermedad es un trastorno renal.
La invención además describe el uso del polipéptido proporcionado como ID SEC Nº 2, además de su ácido nucleico codificador, para la preparación de una composición farmacéutico para prevenir, tratar o mejorar una afección médica, en el que la afección médica es un trastorno neuronal.
La invención además describe el uso del polipéptido proporcionado como ID SEC Nº 2, además de su ácido nucleico codificador, para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir, tratar o mejorar una afección médica, en el que la afección médica es un trastorno relacionado con una regulación anómala del calcio.
La invención además describe el uso del polipéptido proporcionado como ID SEC Nº 2, además de su ácido nucleico codificador, para la preparación de una composición farmacéutico para prevenir, tratar o mejorar una afección médica, en el que la afección médica es un trastorno reproductivo.
Breve descripción de las figuras/dibujos
Las Figuras 1A-C muestran la secuencia de polinucleótidos (ID SEC Nº 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 2) de la nueva proteína humana que contiene repeticiones ricas en leucina, HLRRSI1, de la presente invención. Para ilustrar la secuencia de aminoácidos deducida se utilizan para los aminoácidos las abreviaturas convencionales de una letra. La secuencia de polinucleótidos contiene una secuencia de 2689 nucleótidos (ID SEC Nº 1), que codifica un polipéptido de 625 aminoácidos (ID SEC Nº 2). Un análisis del polipéptido HLRRSI1 determinó que tiene las siguientes características: tres dominios transmembrana localizados de aproximadamente el aminoácido 38 a aproximadamente el aminoácido 61, de aproximadamente el aminoácido 115 a aproximadamente el aminoácido 131 y/o de aproximadamente el aminoácido 151 a aproximadamente el aminoácido 167 de la ID SEC Nº 2 (Figuras 1A-C) representados subrayados; los restos de leucina conservados localizados en los aminoácidos 2, 9, 42, 45, 46, 51, 57, 68, 115, 118, 132, 154, 176, 179, 182, 199, 247, 264, 284, 356, 359, 408, 424, 444, 463, 485, 494, 496, 509, 537, 541, 547, 552, 557, 565, 569, 576, 579, 581, 586, 594, y 604 de la ID SEC Nº 2 se representan sombreados; restos de leucina conservados de forma diferencial localizados en los aminoácidos 8, 12, 56, 161, 204, 219, 240, 243, 310, 406, 428, 466, 491 y 550 de la ID SEC Nº 2 se representan en negrita y los restos de cisteína conservados localizados en los aminoácidos 29, 129, 299, 358, 396, 461, 518 y 574 de la ID SEC Nº 2 se representan con doble subrayado. Los restos de leucina conservados son característicos de proteínas con repeticiones ricas en leucina como se describe más especialmente en otro punto de este documento. Los restos de cisteína conservados son en las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina un diagnóstico de características estructurales conservadas de la proteína (especialmente las referenciadas en este documento) y puede ser indicativo de una función proteica conservada.
Las Figuras 2A-C muestran las regiones de identidad entre la proteína HLRRSI1 codificada (ID SEC Nº 2) y otras proteínas con repeticiones ricas en leucina, específicamente, la proteína humana de reclutamiento de caspasas, proteína 7 (proteína_reclutamiento_caspasa; Nº de Acceso a Genbank: gi|10198209; ID SEC Nº 3); la proteína humana del sitio de unión al nucleótido (sitio_unión_nucleótido; Nº de Acceso a Genbank: gi|10198207; ID SEC Nº 4) y la proteína humana criopirina (criopirina; Nº de Acceso a Genbank: gi|17027237; ID SEC Nº 33). El alineamiento se realizó usando el algoritmo CLUSTALW con los parámetros por defecto descritos en este documento (conjunto de programas Vector NTI). Los aminoácidos fuertemente sombreados representan regiones de identidad de coincidencias. Los aminoácidos ligeramente sombreados representan regiones de similitud de coincidencias. Los puntos ("\bullet") entre los restos indican regiones de huecos sin identidad entre los polipéptidos alineados. Se señalan los restos de leucina conservados entre HLRRSI1 y las otras proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina.
La Figura 3 muestra un gráfico de hidrofobicidad de HLRRSI1 según el algoritmo de Hidrofobicidad BioPlot de Vector NTI (versión 5.5). Se muestran los tres probables dominios transmembrana del polipéptido HLRRSI1.
La Figura 4 muestra un perfil de expresión de la nueva proteína que contiene repeticiones ricas en leucina, HLRRSI1. La figura ilustra el nivel de expresión relativa de HLRRS1 entre diversas fuentes tisulares de ARNm. Como se muestra, los transcritos que se corresponden con HLRRSI1 se expresaban de forma elevada predominantemente en el intestino delgado y, en menor grado, en hígado, nódulo linfático y bazo. Los datos de expresión se obtuvieron midiendo el nivel basal del ARNm de HLRRSI1 mediante PCR cuantitativa usando el par de cebadores para PCR proporcionados como ID SEC Nº 11 y 12, como se describe en este documento.
La Figura 5 muestra una tabla que ilustra el porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud entre el polipéptido HLRRSI1 de la presente invención con otras proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina, específicamente, la proteína humana de reclutamiento de caspasas, proteína 7 (proteína_reclutamiento_caspasa; Nº de Acceso de Genbank gi|10198209; ID SEC Nº 3); la proteína humana del sitio de unión al nucleótido (sitio_unión_nucleótido; Nº de Acceso a Genbank: gi|10198207; ID SEC Nº 4) y la proteína humana criopirina (criopirina; Nº de Acceso a Genbank: gi|17027237; ID SEC Nº 33). Los valores del porcentaje de identidad y del porcentaje de similitud se determinaron usando el algoritmo Gap con los parámetros por defecto (conjunto de programas del Genetics Computer Group; Needleman y Wunsch. J. Mol. Biol. 48; 443-453,1970)).
Descripción detallada de la invención
La presente invención puede entenderse más fácilmente en referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y de los Ejemplos incluidos en este documento.
La invención proporciona una nueva secuencia humana que codifica una nueva proteína que contiene repeticiones ricas en leucina, HLRRSI1, con homología sustancia con la clase de proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina conocidas como proteínas de reclutamiento de caspasas. Los miembros de esta clase de proteínas con repeticiones ricas en leucina se han implicado en numerosas enfermedades y/o trastornos, que incluyen, pero sin limitación, apoptosis y trastornos inflamatorios. El análisis de expresión indica que HLRRSI1 se expresa fuertemente de forma preferente en el intestino delgado y, en menor grado, en hígado, nódulo linfático y bazo. Sobre la base de esta información, hemos denominado provisionalmente al gen y a la proteína como HLRRSI1 (proteína humana con repeticiones ricas en leucina de intestino delgado-1). La especificidad con que se expresa la transcripción de HLRRSI1 sugiere que es importante en diversos procesos biológicos.
En la presente invención, "aislado" se refiere al material retirado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si está presente en la naturaleza) y, de este modo, es alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado podría ser parte de un vector o una composición en cuestión, o podría estar contenido en una célula y seguir "aislado" ya que este vector, composición en cuestión o célula en particular no es el entorno original del polinucleótido. El término "aislado" no se refiere a bibliotecas genómicas o de ADNc de células totales completas o preparaciones de ARNm, preparaciones de ADN genómico (incluyendo el separado mediante electroforesis y transferido a membranas), preparaciones de ADN genómico desnudo de células completas u otras composiciones donde la técnica no muestra características distinguibles de los polinucleótidos/secuencias de la presente invención.
Según se usa en este documento, un "polinucleótido" se refiere a una molécula que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en la ID SEC Nº 1 o en el ADNc contenido en el clon depositado en la ATCC. Además, según se usa en este documento, un "polipéptido" se refiere a una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos traducida generada a partir del polipéptido ampliamente definido.
En la presente invención, la secuencia de longitud completa identificada como ID SEC Nº 1 se genera a menudo mediante secuencias solapantes contenidas en uno o más clones (análisis de cóntigos). En la American Type Culture Collection ("ATCC") se depositó un clon representativo que contenía toda y la mayor parte de la secuencia ID SEC Nº 1 Como se muestra en la Tabla I, cada clon se identifica con un ID (identificador) del clon de ADNc y el número de depósito de la ATCC. La ATCC está localizada en el 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. El depósito de la ATCC se hizo según los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento de patente. El clon depositado se insertó en el plásmido pSport1 (Life Technlogies) usando los sitios de restricción SalI y NotI descritos en este documento.
A no ser que se indique lo contrario, en este documento todas las secuencias de nucleótidos determinados mediante secuenciación de una molécula de ADN se determinaron usando un secuenciador automático de ADN (tal como el Modelo 373 de Applied Biosytems, Inc.) y todas la secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas en este documento se predijeron mediante la traducción de una secuencia de ADN determinada anteriormente. Por lo tanto, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por este enfoque automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en este documento puede contener algunos errores. Típicamente, las secuencias de nucleótidos determinadas de forma automática son al menos aproximadamente el 90% idénticas, más típicamente al menos de aproximadamente el 95% a al menos aproximadamente el 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse de forma más precisa mediante otros enfoques, incluyendo procedimientos de secuenciación manual de ADN bien conocidos en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real causará un cambio de fase en la traducción de la secuencia de nucleótidos de modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una determinada secuencia de nucleótidos será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, empezando en el punto de esta inserción o deleción.
Usando la información proporcionada en este documento, tal como la secuencia de nucleótidos de las Figuras 1A-C (ID SEC Nº 1), puede obtenerse una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica el polipéptido HLRRSI1 usando procedimientos de clonación y análisis convencionales, tales como los que clonación de ADNc usando ARNm como material de partida. Como ilustración de la invención, la molécula de ácido nucleico descrita en las Figuras 1A-C (ID SEC Nº 1) se descubrió en una biblioteca de ADNc de cerebro y testículo humanos.
El polinucleótido de la presente invención puede estar constituido por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN sin modificar o un ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar constituidos por ADN de cadena sencilla y doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, ARN de cadena sencilla y doble y ARN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, moléculas híbridas constituidas por ADN y ARN que pueden ser de cadena sencilla o, más típicamente, de cadena doble o una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble. Además, el polinucleótido puede estar constituido por regiones de cadena triple que comprendan ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleótido también puede contener una o más bases modificadas o los esqueletos del ADN o ARN modificados por razones de estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases poco corrientes tales como inosina. Pueden hacerse diversas modificaciones del ADN y el ARN, de este modo, "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas.
El polipéptido de la presente invención puede estar compuesto de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o por enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y puede contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos que codifican un gen. Los polipéptidos pueden modificarse mediante procedimientos naturales, tales como procesamiento postraduccional o mediante modificación química, que son bien conocidos en la técnica. Estas modificaciones se han descrito bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden darse en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminales. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grado variable en varios sitios de un polipéptido dado. También un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de una ubiquitinación y pueden ser cíclicos con o sin ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados puede ser el resultado de procedimientos naturales postraduccionales o pueden obtenerse por procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de agentes de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclización, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación.
(Véase, por ejemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Edición., T. E. Creighton, W. H. Freeman y Compañía, Nueva York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983); Seifter y col., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan y col., Ann NY Acad. Sci. 663: 48-62 (1992).)
"ID SEC Nº 1" se refiere a una secuencia de polinucleótidos mientras que "ID SEC Nº 2" se refiere a una secuencia polipeptídica, ambas secuencias se identifican por un entero especificado en la Tabla I.
El término "organismo" como se refiere en este documento pretende abarcar a cualquier organismo referenciado en este documento, aunque preferiblemente a organismos eucarióticos, más preferiblemente a mamíferos y lo más preferiblemente a humanos.
El polinucleótido y los polipéptidos de la presente invención son útiles como sondas para la identificación y aislamiento de ADNc de longitud completa y/o ADN genómico que se corresponde con los polinucleótidos de la presente invención, como sondas para hibridar y descubrir nuevas secuencias de ADN relacionadas, como sondas para clonación posicional de esta o una secuencia relacionada, como sondas para "sustraer" secuencias conocidas en el proceso de descubrimiento de otros polinucleótidos nuevos, como sondas para cuantificar la expresión génica y como sondas para micromatrices.
Además, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más dominios de membrana.
La presente invención además se refiere a procedimientos par el refinado adicional de la función biológica de los polinucleótidos y/o polipéptidos de la presente invención.
Específicamente, la invención describe procedimientos para usar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención para identificar ortólogos, homólogos, parálogos, variantes y/o variantes alélicas de la invención. También se proporcionan procedimientos para usar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención para identificar la región codificadora completa de la invención, regiones no codificadoras de la invención, secuencias reguladoras de la invención y formas secretadas, maduras, pro, prepro de la invención (si es pertinente).
También se describen en este documento procedimientos para identificar los sitios de glicosilación inherentes en los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, y las consiguientes alteración, deleción y/o adición de dichos sitios para un número de características deseables que incluyen, pero sin limitación, aumento del plegamiento de la proteína, inhibición de la agregación de la proteína, regulación del tráfico intracelular a los orgánulos, aumento de resistencia a proteolisis, modulación de la antigenicidad de la proteína y mediación de la adhesión intercelular.
Polinucleótidos y polipéptidos de la invención Características del polipéptido codificado por el gen Nº 1
El polipéptido de este gen, proporcionado como ID SEC Nº 2 (Figuras 1A-C), codificado por la secuencia de polinucleótidos según la ID SEC Nº 1 (Figuras 1A-C) y/o codificado por el polinucleótido contenido en el clon depositado, HLRRSI1 (también denominado GPCR12Nº99, GPCR12Nº100, SILL1A y/o SILL1B), tiene una homología significativa a nivel del nucleótido y de aminoácidos con varias proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina, que incluyen, por ejemplo, la proteína humana de reclutamiento de caspasas, proteína 7 (proteína_reclutamiento_caspasa, Nº de Acceso a Genbank gi|10198209; ID SEC Nº 3); la proteína humana del sitio de unión al nucleótido (sitio_unión_nucleótido; Nº de Acceso a Genbank: gi|10198207; ID SEC Nº 4) y la proteína humana criopirina (criopirina; Nº de Acceso a Genebank:gi|17027237; ID SEC Nº 33). En las Figuras 2A-C se proporciona un alineamiento del polipéptido HLRRSI1 con estas proteínas.
La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc de HLRRSI1 de las Figuras 1A-C (ID SEC Nº 1) contiene una fase abierta de lectura que codifica una proteína de aproximadamente 625 restos con un peso molecular deducido de aproximadamente 68,9 kDa. La secuencia de aminoácidos predicha del polipéptido HLRRSI1 se muestra en las Figuras 1A-C (ID SEC Nº 2). Se determinó que la proteína HLRRSI1 mostrada en las Figuras 1A-C compartía identidad y similitud significativas con varias proteínas conocidas que contenían repeticiones ricas en leucina, especialmente proteínas que reclutan caspasas. Específicamente, se determinó que la proteína HLRRSI1, mostrada en las Figuras 1A-C, era aproximadamente el 36,3% idéntica y el 44,0% similar a la proteína humana de reclutamiento de caspasas, proteína 7 (proteína_reclutamiento_caspasa; Nº de Acceso de Genbank gi|10198209; ID SEC Nº 3), era aproximadamente el 35,0% idéntica y el 42,2% similar a la proteína humana del sitio de unión al nucleótido (sitio_unión_nucleótido; Nº de Acceso a Genbank gi|10198207; ID SEC Nº 4); y era aproximadamente el 35,7% idéntica y el 46,0% similar a la proteína humana criopirina (criopirina, Nº de Acceso a Genbank gi|17027237; ID SEC Nº 33) como se muestra en la Figura 5. La proteína del sitio de unión al nucleótido presumiblemente actúa en apoptosis y en inflamación [Bertin, 2000]. HLRRSI1 también es el 24% idéntica y el 40% similar a la proteína de ratón MATER, una proteína que se asocia con la insuficiencia ovárica prematura [Tong, 1999 Nº 35].
La proteína humana de reclutamiento de caspasas, proteína 7(proteína_reclutamiento_caspasa; Nº de Acceso a Genbank gi|10198209; ID SEC Nº 3) es una proteína con repeticiones ricas en leucina. Comprende un dominio pirina que es un dominio encontrado principalmente en proteínas implicadas en la apoptosis y en proteínas inflamatorias.
La proteína humana criopirina (criopirina; Nº de Acceso a Genbank gi|17027237; ID SEC Nº 33) es una proteína con repeticiones ricas en leucina que contiene un dominio pirina. Las mutaciones en la proteína criopirina se han asociado con la incidencia del síndrome autoinflamatorio familiar por frío (FCAS, MIM 120100), normalmente conocido como urticaria familiar por frío (FCU) que es una enfermedad inflamatoria sistémica dominante autosómica caracterizada por episodios intermitentes de erupción, artralgia, fiebre y conjuntivitis tras la exposición generalizada al frío. Además, las mutaciones en la proteína criopirina también se asocian con la incidencia del síndrome de Muckle-Wells (MWS; MIM 191900), que es un síndrome de fiebre periódico dominante autosómica con un fenotipo similar excepto por que los síntomas no se precipitan con la exposición al frío y porque frecuentemente también presentan pérdida de audición sensoneuronal. Adicionalmente, también se cree que la proteína criopirina representa un papel en la regulación de la inflamación y apoptosis.
El análisis del polipéptido HLRRSI1 indica que contiene un dominio de repetición rico en leucina en el extremo carboxiterminal con una asparragina en la posición 10 de la repetición que permite su sustitución por cisteína y una región adicional de leucinas no canónicas en su secuencia que flanquea el extremo aminoterminal. La proteína contiene dos regiones hidrófobas de longitud suficiente para atravesar la membrana, aunque se presentan tres posibles dominios transmembrana. El polipéptido HLRRSI1 no contiene una secuencia señal en el extremo amino terminal. HLRRSI1 se expresa espectacularmente en el intestino delgado y puede funcionar en la regulación de las respuestas inflamatorias y en la apoptosis en este tejido.
Usando el programa TMPRED, se predijo que el polipéptido HLRRSI1 estaba constituido por tres dominios transmembrana K Kofinnan, W Stoffel, Biol.(K Hofmann, W Stoffel, Biol. Chem., 347: 166, 1993). Los dominios transmembrana predichos del polipéptido HLRRSI1 se localizan de aproximadamente el aminoácido 38 a aproximadamente el aminoácido 61, de aproximadamente el aminoácido 115 a aproximadamente el aminoácido 131 y/o de aproximadamente el aminoácido 151 a aproximadamente el aminoácido 167 de las ID SEC Nº 2 (Figuras 1 A-C).
En este documento se describen los siguientes polipéptidos dominios transmembrana: GARVLGGLLSKALLPTA
LLLVTTR (ID SEC Nº 8), LFALCFVPFVCWIVCTV (ID SEC Nº 9) y/o SVYLLFITSVLSSAPVA (ID SEC Nº 10). También se proporcionan los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. La presente invención también abarca el uso del polipéptido dominio transmembrana de HLRRSI1 como un epítope inmunogénico y/o antigénico como se describe en otra parte de este documento.
Sobre la base de la fuerte homología con los miembros de las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina, se espera que el polipéptido HLRRSI1 comparta al menos alguna actividad biológica con las proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina, preferiblemente con miembros de la familia de proteínas que reclutan caspasas de las proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina, especialmente miembros de la familia de proteínas que reclutan caspasas referenciados en este documento y, más preferiblemente con proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina encontradas en las células y tejidos de la médula ósea.
Alternativamente, sobre la base de la fuerte homología con los miembros de las proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina, se espera que el polipéptido HLRRSI1 comparta al menos alguna actividad biológica con la proteína humana del sitio de unión al nucleótido y, posiblemente, con la proteína de ratón MATER descrita en este documento.
Además, sobre la base de la fuerte homología con los miembros de las proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina, se espera que el polipéptido HLRRSI1 comparta al menos alguna actividad biológica con las proteínas que contienen el dominio pirina, y particularmente con las proteínas que contienen el dominio pirina referenciadas en este documento.
También se determinó que el polipéptido HLRRSl1 comprende varios restos de leucina conservados en los aminoácidos 2, 9, 42, 45, 46, 51, 57, 68, 115, 118, 132, 154, 176, 179, 182, 199, 247, 264, 284, 356, 359, 408, 424, 444, 463, 485, 494, 496, 509, 537, 541, 547, 552, 557, 565, 569, 576, 579, 581, 586, 594, y 604 de la ID SEC Nº 2 (Figuras 1A-C). Además, también se ha determinado que el polipéptido HLRRSI1 comprende algunos restos de leucina diferencialmente conservados en los aminoácidos 8, 12, 56, 161, 204, 219, 240, 243, 310, 406, 428, 466, 491 y 550 de la ID SEC Nº 2 (Figuras 1A-C). La conservación de leucinas en los restos de aminoácidos claves es consistente con que el polipéptido HLRRSI1 es un miembro de la familia de proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina y puede ser indicativo de las características estructurales conservadas, que pueden estar correlacionadas con la conservación de la función y/o actividad de la proteína.
También se determinó que el polipéptido HLRRSI1 comprendía varias cisteínas conservadas en los aminoácidos 29, 129, 299, 358, 396, 461, 518 y 574 de la ID SEC Nº 2 (Figuras 1A-C). La conservación de cisteínas en restos de aminoácidos claves, es indicativa de características estructurales conservadas, que pueden estar correlacionadas con la conservación de la función y/o actividad de la proteína.
El perfil de expresión diseñado para medir los niveles basales de ARNm que codifican el polipéptido HLRRSI1 mostraba predominantemente niveles elevados de expresión en el intestino delgado y, en menor grado, en el hígado, ganglio linfático y tejido esplénico (Véase la Figura 4).
En consistencia con la fuerte homología de las proteínas de reclutamiento de caspasas, los ensayos complementarios mostraron que el polipéptido HLRRSI1 estaba implicado en la regulación del NF-\kappaB y las rutas de apoptosis en mamíferos. Sometiendo a las células A459 a una cantidad eficaz de una mezcla de cinco oligonucleótidos complementarios (ID SEC Nº 34, 35, 36, 37 y 38) dirigidos frente a la región codificadora del polinucleótido HLRRSI1 se originaba un aumento significativo de la expresión/actividad de I\kappaB\alpha que proporcionaba una evidencia convincente de que HLRRSI1 regula directa o indirectamente, al menos la actividad y/o expresión de I\kappaB\alpha. Además, los resultados sugieren que HLRRSI1 está implicada en la regulación negativa de la actividad y/o expresión de NF-\kappaB/I\kappaB\alpha, directa o indirectamente. El ensayo I\kappaB\alpha usado se describe en el Ejemplo 57 y se basaba en el análisis de la actividad I\kappaB\alpha como marcador después del extremo 5' para sucesos de transducción de señal proliferativa.
La regulación por incremento de I\kappaBa debida a la regulación por descenso de HLRRSI1 sitúa a esta proteína con repeticiones ricas en leucina en una ruta de señalización potencialmente implicada en sucesos apoptóticos. Esto da la oportunidad de regular los sucesos después del extremo 3' a través de la actividad de la proteína HLRRSI1 con polinucleótidos complementarios, polipéptidos o compuestos químicos de bajo peso molecular con el potencial para conseguir un efecto terapéutico en cáncer, enfermedades autoinmunes. Además del cáncer y de los trastornos inmunológicos, NF-\kappaB tiene funciones significativas en otras enfermedades (Baldwin, A.S., J. Clin. Invest. 107: 3-6 (2001)). NF-\kappaB es un factor clave en la patofisiología del daño por isquemia-reperfusión y crisis cardiaca (Valen, G., Yan, ZQ, Hansson, GK, J. Am. Coll. Cardiol. 38, 307-14 (2001)). Además, se ha encontrado que NF-\kappaB está activado en la enfermedad renal experimental (Guijarro C, Egido J, Kidney Int. 59, 415-425 (2001)). Como HLRRSI1 se expresa de forma elevada en el intestino delgado, existe una implicación potencial de HLRRSI1 en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales, especialmente para cánceres, mediante la administración de HLRRSI1 y/o agonistas de la misma.
Los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1, incluyendo fragmentos de los mismos, son útiles para tratar, diagnosticar y/o mejorar trastornos proliferativos, cánceres, daño por isquemia repercusión, crisis cardíacas, condiciones de inmunosupresión, infección por VIH y enfermedades gastrointestinales.
Además, los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1, incluyendo fragmentos de los mismos, son útiles para aumentar la actividad NF-\kappaB, aumentar los sucesos de apoptosis y/o disminuir los niveles de expresión o actividad de I\kappaB\alpha.
Los antagonistas dirigidos frente a HLRRSI1 son útiles para tratar, diagnosticar y/o mejorar trastornos autoinmunes, trastornos relacionados con actividad hiperinmune, dolencias inflamatorias, trastornos relacionados con respuestas anómalas en fase aguda, dolencias hipercongénitas, defectos de nacimiento, lesiones necróticas, heridas, rechazo de trasplante de órganos, dolencias relacionadas con el rechazo del trasplante de órganos, trastornos relacionados con una transducción de señal anómala, trastornos proliferativos, cánceres, VIH y propagación del VIH en células infectadas con otros virus.
Además, los antagonistas dirigidos frente a HLRRSI1 son útiles para disminuir la actividad NF-\kappaB, disminuir los sucesos de apoptosis y/o disminuir los niveles de expresión y actividad I\kappaB\alpha.
Los agonistas dirigidos frente a HLRRSI1 son útiles para tratar, diagnosticar y/o mejorar trastornos autoinmunes, trastornos relacionados con actividad hiperinmune, dolencias hipercongénitas, defectos de nacimiento, lesiones necróticas, heridas, trastornos relacionados con la transducción de señal anómala, condiciones de inmunosupresión, infección por VIH, trastornos proliferativos y/o cánceres.
Además, los agonistas dirigidos frente a HLRRSI1 son útiles para aumentar la actividad de NF-\kappaB, aumentar los sucesos de apoptosis y/o disminuir los niveles de expresión o actividad de I\kappaB\alpha, especialmente en el tejido gastrointestinal, por ejemplo, tal como en el intestino delgado.
Los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 de la presente invención, incluyendo agonistas y/o fragmentos de los mismos, tiene usos que incluyen detectar, pronosticar, tratar, prevenir y/o mejorar las siguientes enfermedades y/o trastornos, trastornos relacionados con la regulación anómala de la apoptosis, trastornos relacionados con regulación anómala de la adhesión celular y trastornos relacionados con la proliferación celular anómala, por ejemplo, además de trastornos inmunitarios y hepáticos.
Los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 de la presente invención, incluyendo agonistas y/o fragmentos de los mismos, tiene usos que incluyen modular la actividad de transducción de señales, en diversas células, tejidos y organismos y especialmente, en el intestino delgado, hígado, ganglio linfático y tejido esplénico de mamíferos, preferiblemente en tejido humano.
La fuerte homología con proteínas humanas que tienen repeticiones ricas en leucina, combinada con la expresión localizada predominante en el intestino delgado y su implicación en la modulación de I\kappaB, sugieren que los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 pueden ser útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y/o prevenir enfermedades y/o trastornos gastrointestinales, que incluyen, pero sin limitación, úlceras, síndrome de intestino irritable, diarrea, pólipos, trastornos de absorción, estreñimiento, diverticulitis, enfermedad vascular de los intestinos, obstrucción intestinal, infecciones intestinales, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, hemocromatosis hereditaria, gastroenteritis, isquemia mesentérica, infarto mesentérico, además de enfermedades y/o trastornos metabólicos.
La fuerte homología con proteínas humanas que contienen repeticiones ricas en leucina combinada con la expresión en el ganglio linfático y en el tejido esplénico, y su implicación en la modulación de I\kappaB, sugiere que los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 puede ser útil para tratar, diagnosticar, pronosticar y/o prevenir enfermedades y/o trastornos inmunitarios y hematopoyéticas, que incluyen, pero sin limitación, anemia, pancitopenia, leucopenia, trombocitopenia o leucemia ya que las células estromales son importantes en la producción de células de estirpes hematopoyéticas. Los usos representativos se describen a continuación en las secciones "actividad inmunitaria" y "enfermedad infecciosa", en los Ejemplos y en otras partes de este documento. Brevemente, los usos incluyen el cultivo ex vivo de células de la medula ósea, trasplante de médula ósea, reconstitución de médula ósea, radioterapia o quimioterapia de neoplasia. El producto génico también puede estar implicado en linfopoyesis, por tanto, puede usarse en trastornos inmunitarios, tales como infección, inflamación, alergia, inmunodeficiencia, etc. Además, este producto génico puede tener utilidad comercial para la expansión de células troncales y progenitores comprometidos de diversas estirpes sanguíneas y en la diferenciación y/o proliferación de diversos tipos celulares.
Además, el polipéptido HLRRSI1 puede ser útil para modular la producción de citocinas, la presentación del antígeno u otros procesos, tales como para estimular las respuestas inmunitarias, etc. La expresión en células de origen linfoide indica que el producto génico natural podría estar implicado en funciones inmunitarias. Por tanto, también podría ser útil como agente para trastornos inmunológicos, incluyendo artritis, asma, enfermedades por inmunodeficiencia tales como SIDA, leucemia, artritis reumatoide, enfermedad granulomatosa, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, acné, neutropenia, neutrofilia, psoriasis, hipersensibilidades, tales como citotoxicidad mediada por células T, reacciones inmunes frente a órganos y tejidos trasplantados, tales como enfermedades del huésped frente a injerto e injerto frente a huésped, o trastornos de autoinmunidad, tales como infertilidad autoinmune, lesión de tejido denso, desmielinización, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica inducida por fármaco, artritis reumatoide, enfermedad de Sjogren y escleroderma. Además, la proteína puede representar un factor secretado que influye en la diferenciación o comportamiento de otras células sanguíneas o que recluta células hematopoyéticas a los lugares del daño. De este modo, se piensa que este producto génico es útil para la expansión de células troncales y de progenitores comprometidos de diversas estirpes sanguíneas y en la diferenciación y/o proliferación de diversos tipos celulares. Además, la proteína también puede usarse para determinar la actividad biológica, producir anticuerpos, como marcadores tisulares, para aislar ligandos o receptores relacionados, para identificar agentes que modulan sus interacciones, además de su uso como un suplemento nutricional. La proteína, así como los anticuerpos dirigidos frente a la proteína, puede mostrar utilidad como marcador tumoral y/o diana inmunoterapéutica para los tejidos enumerados 
\hbox{anteriormente.}
Los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 y/o fragmentos de los mismos, como se especifica en las reivindicaciones tiene usos que incluyen, por ejemplo, modular la proliferación celular. Asimismo, los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 y/o fragmentos de los mismos, como se especifica en las reivindicaciones, pueden ser útiles para el tratamiento, detección, mejora y/o prevención de trastornos relacionados, o unidos directamente, con la proliferación celular anómala, tal como, por ejemplo, cánceres.
Además, los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1 puede tener usos que incluyen tratar, diagnosticar, pronosticar y/o prevenir trastornos hiperproliferativos, especialmente de los sistemas inmunitarios, hematopoyético, pulmonar y reproductor. Estos trastornos puede incluir, por ejemplo, cánceres y metástasis.
Los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1, incluyendo fragmentos y agonistas de los mismos, puede tener usos que incluyen, directa o indirectamente, la estimulación de respuestas inmunitarias.
Los polinucleótidos y polipéptidos HLRRSI1, incluyendo fragmentos de los mismos, como se especifica en las reivindicaciones, pueden tener usos que incluyen la identificación de moduladores de la función de HLRRSI1, incluyendo anticuerpos (para la detección o neutralización), moduladores naturales y pequeñas moléculas moduladoras. Los anticuerpos frente a dominios de la proteína HLRRSI1 podrían usarse como agentes diagnósticos de dolencias hematopoyéticas e inflamatorias en pacientes, son útiles para controlar la activación de las rutas de transducción de señales y pueden usarse como marcadores biológicos para la implicación de proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina
en estados patológicos y en la evaluación de inhibidores in vivo de proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina.
Los polipeptídicos y polinucleótidos HLRRSI1 tiene usos adicionales que incluyen el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la sobre e infraexpresión de HLRRSI1 identificando mutaciones en el gen HLRRSI1 mediante el uso de secuencias de HLRRSI1 como sondas y mediante la determinación de los niveles de expresión de la proteína HLRRSI1 o del ARNm. Los polipéptidos HLRRSI1 pueden ser útiles para analizar compuestos que afectan a la actividad de la proteína. Los péptidos HLRRSI1 también pueden usarse para la generación de anticuerpos específicos y como cebo en el análisis de dos híbridos de levadura para encontrar proteínas que interaccionan específicamente con HLRRSI1 (descritas en otro parte de este documento).
Recientemente, se ha implicado directamente a las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina en la patogénesis del síndrome de Bernard-Soulier (BSS), un trastorno cualitativo de plaquetas hereditario. El trastorno se ha asociado con la anomalía cualitativa o cuantitativa del complejo Ib/IX/V glicoproteína (GP) de plaquetas, que se forma por la agregación de varias proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina (Hayashi, T.; Suzuki, K., Semin. Thromb. Hemost., 26(1): 53-9 (2000).
En realizaciones preferidas, los polipéptidos HLRRSI1, incluyendo antagonistas y fragmentos de los mismos, tienen usos que incluyen, por ejemplo, el tratamiento, detección, prevención, pronóstico y/o mejora de trastornos de plaquetas, incluyendo, pero sin limitación, el síndrome de Bernard-Soulier (BSS).
Como se explica en otra parte de este documento, las proteínas Toll de Drosophila, que incluyen homólogos humanos de las mismas, se han implicado en la modulación del desarrollo y en una enfermedad no infecciosa (Schuster, JM., Nelson, PS, J. Leukoc, Biol., 67(6):767-73, (2000)).
Los polipéptidos HLRRSI1, incluyendo fragmentos de los mismos como se especifica en las reivindicaciones, tienen usos que incluyen, por ejemplo, el tratamiento, detección, prevención, pronóstico y/o mejora de trastornos del desarrollo y trastornos no infecciones, tales como inmunidad innata a patógenos bacterianos, respuestas inmunitarias adaptativas y otras según se enumeran en Schuster, JM y col., supra.
También se ha implicado a las proteínas con repeticiones ricas en leucina en la incidencia del lupus eritematoso sistémico (Koarada, S., Tada, Y., Ushiyama, O., Morito, F., Suzuki, N., Ohta, A., Miyake, K., Kimoto, M., Nagasawa, K., Arthritis. Rheum., 42(12): 2593-600, (1999)).
Los polipéptidos HLRRSI1, incluyendo antagonistas y fragmentos de los mismos, tienen usos que incluyen, por ejemplo, el tratamiento, detección, prevención, pronóstico y/o mejora de trastornos inmunitarios, que incluyen, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico.
Como se describe en otra parte de este documento, las proteínas con repeticiones ricas en leucina también están implicadas en varios procesos relacionados con la resistencia a patógenos y/o enfermedades en plantas. Esto es de particular significancia, ya que los mamíferos, incluyendo los humanos, tienen homólogos de algunas de estas proteínas que se piensa funcionan en respuestas inmunitarias innatas (Dixon, MS., Hatzixanthis, K., Jones, DA., Harrison, K., Jones, JD, Plant. Cell., 10(11):1915-25, (1998); Ellis, J., Jones, D, Curr. Opin. Plant. Biol., 1(4):288-93, (1998); Collins, N., Drake, J., Ayliffe, M., Sun, Q., Ellis, J., Hulbert, S., Pryor, T, Plant- Cell., 11(7):1365-76, (1999); Wang, ZX., Yano, M., Yamanouchi, U., Iwamoto, M., Monna, L., Hayasaka, H., Katayose, Y., Sasaki, T, Plant. J., 19(1):55-64, (1999); Richter, TE., Ronald, PC, Plant. Mol. Biol., 42(1):195-204, (2000); Graham, MA., k, LF., Lohnes, D., Cregan, P., Shoemaker, RC, Genome., 43(1):86-93, (2000) y He, Z., Wang, ZY., Li, J., Zhu, Q., Lamb, C., Ronald, P., Chory, J. Science. 30., 288 (5475): 2360-3, (2000)).
Además, el polipéptido HLRRSI1 comparte homología significativa con proteínas de reclutamiento de caspasas Las anomalías de estas proteínas están implicadas en la incidencia de varios trastornos relacionados con la regulación anómala de la apoptosis y en diversos trastornos inflamatorios (Srinivasula, SM., Ahmad, M., Lin, JH., Poyet, JL., Fernandes, Alnemri, T., Tsichlis, PN., Alnemri, ES, J. Biol, Chem. 18., 274 (25):17946-54, (1999)).
Aunque se cree que el polipéptido codificado puede compartir al menos algunas actividades biológicas con las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucinas (especialmente con proteínas de reclutamiento de caspasas), se conocen en la técnica o se describen en otra parte de este documento varios procedimientos de determinación de la función biológica exacta de este clon. Brevemente, la función de este clon puede determinarse aplicando la metodología de micromatrices. Los ácidos nucleicos correspondientes con los polinucleótidos HLRRSI1, además de otros clones de la presente invención, puede ordenarse en microchips para realizar el perfil de su expresión. Dependiendo de qué sonda polinucleotídica se use para hibridar con las láminas, un cambio en la expresión de un gen específico puede proporcionarse una mejor comprensión adicional de la función de este gen sobre la base de las condiciones que están siendo estudiadas. Por ejemplo, un aumento o descenso observado en los niveles de expresión cuando la sonda polinucleotídica usada procede de un tejido de intestino delgado enfermo, en comparación con el tejido normal, podría indicar, por ejemplo, una función en la modulación de la función inmunitaria y/o hematopoyético. En el caso de HLRRSI1, podría usarse tejido de intestino delgado, hígado, ganglio linfático y bazo, por ejemplo, para extraer el ARN y preparar la sonda.
Además, la función de la proteína puede valuarse aplicando, por ejemplo, la metodología de PCR cuantitativa. La PCR cuantitativa en tiempo real proporcionaría, por ejemplo, la capacidad para seguir la expresión del gen HLRRSI1 a lo largo del desarrollo. La metodología de PCR cuantitativa requiere sólo una cantidad nominal de tejido de cada etapa importante del desarrollo que es necesaria para realizar estos experimentos. Por tanto, la presente invención abarca la aplicación de la metodología de PCR cuantitativa para depurar la función biológica de este polipéptido. En el caso de HLRRSI1, puede hacerse una correlación de la enfermedad en relación con HLRRSI1 comparando el nivel de expresión del ARNm de HLRRSI1 en tejido normal cuando se compara con el tejido enfermo (especialmente tejido enfermo aislado de los siguientes tejidos: tejido de intestino delgado, hígado, ganglio linfático y bazo). Niveles de expresión de HLRRSI1 significativamente mayores o menores en l tejido enfermo pueden sugerir que HLRRSI1 representa un papel en la progresión de la enfermedad y los antagonistas frente a polipéptidos HLRRSI1 podría ser terapéuticamente útiles para tratar, prevenir y/o mejorar la enfermedad. Alternativamente, niveles de expresión de HLRRSI1 significativamente mayores o menores en el tejido enfermo pueden sugerir que HLRRSI1 representa un papel defensivo frente a la progresión de la enfermedad y los agonistas de los polipéptidos HLRRSI1 pueden ser terapéuticamente útiles para tratar, prevenir y/o mejorar la enfermedad. La presente invención también abarca sondas de PCR
cuantitativa que se corresponden con la secuencia polinucleotídica proporcionada como ID SEC Nº 1 (Figuras 1 A-C).
La función de la proteína también puede evaluarse a través de ensayos por complementación en levaduras. Por ejemplo, en el caso de la HLRRSI1, la transformación de levaduras deficientes en la actividad de la proteína que contiene repeticiones ricas en leucina, preferiblemente en la actividad, por ejemplo, de proteína de reclutamiento de caspasas y la evaluación de su capacidad para crecer proporcionaría una evidencia convincente de que el polipéptido HLRRSI1 tiene actividad de proteína que contiene repeticiones ricas en leucinas y, potencialmente, actividad de proteína de reclutamiento de caspasas. Son conocidos en la técnica las condiciones y procedimientos de ensayo adicionales que pueden usarse en la evaluación de la función de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención, algunos de los cuales se describe en otra parte de este documento.
Alternativamente, la función biológica del polipéptido codificado puede determinarse alterando un homólogo de este polipéptido en ratones y/o ratas y observando los fenotipos resultantes. Son conocidos en la técnica estos experimentos de silenciamiento de genes, algunos de los cuales se describen en otra parte de este documento.
Además, la función biológica de este polipéptido puede determinarse mediante la aplicación de metodología complementaria y/o sentido y la generación resultante de ratones y/o ratas transgénicas. La expresión de un gen en particular en orientación sentido o complementaria en un ratón o rata transgénica podría llevar a niveles de expresión respectivamente mayores o menores de este gen en particular. La alteración de los niveles de expresión endógena de un gen puede llevar a la observación de un fenotipo en particular, que, a continuación, puede usarse para obtener indicaciones sobre la función del gen. El gen puede sobreexpresarse o infraexpresarse en cualquier célula del organismo en todo momento usando un promotor potente ubicuo o puede expresarse en una o más partes distintas del organismo usando un promotor específico de tejido bien caracterizado (por ejemplo, un promotor específico de tejido del intestino delgado, hígado, ganglio linfático y bazo) o puede expresarse en un momento específico del desarrollo usando un promotor inducible y/o regulado durante el desarrollo.
En el caso de ratones o ratas transgénicas para HLRRSI1, si el fenotipo no es aparente en condiciones de crecimiento normales, la observación del organismo en condiciones de enfermedad (trastornos gastrointestinales, hepáticos, inmunitarios, hematopoyéticos, además de cánceres, etc.) puede llevar a entender la función del gen. Por tanto, la presente invención abarca la aplicación de la metodología complementaria y/o sentido a la creación de ratones o ratas transgénicas para depurar la función del polipéptido.
En una realización preferida, la presente invención abarca el mutante de deleción N-terminal, L2-F625.
Sobre la base del algoritmo Motif (Genetics Computer Group, Inc.) se determinó que los polipéptidos HLRRSI1 de la presente invención comprendían varios sitios de fosforilación. La fosforilación de estos sitios puede regular alguna actividad biológica del polipéptido HLRRSI1. Por ejemplo, la fosforilación en sitios específicos puede estar implicada en la regulación de la capacidad de las proteínas para asociarse o unirse a otras moléculas (por ejemplo, proteínas, ligandos, sustratos, ADN, etc.). En el caso actual, la fosforilación puede modular la capacidad del polipéptido HLRRSI1 para asociarse con otros polipéptidos, ligandos especialmente relacionados con HLRRSI1, o su capacidad para modular ciertas rutas celulares de señalización.
Usando el algoritmo Motif (Genetics Computer Group, Inc.), se predijo que el polipéptido HLRRSI1 comprendía nueve sitios de fosforilación de PKC. La proteína quinass C, in vivo, muestra una preferencia por la fosforilación de restos de serina o treonina. Los sitios de fosforilación de PKC tiene el siguiente patrón consenso: [ST]-x-[RK], donde S o T representan el sitio de fosforilación y "x" un resto de aminoácido intermedio. Puede encontrarse información adicional con respecto a los sitios de fosforilación de PKC en Woodget J.R., Gould K.L., Hunter T., Eur. J. Biochem. 161:177-184 (1986) y Kishimoto A., Nishiyama K., Nakanishi H., Uratsuji Y., Nomura H., Takeyama Y., Nishizuka Y., J. Biol. Chem., 260:12492-12499 (1985).
En este documento se describen los siguientes sitios polipeptídicos de fosforilación de PCK: ALLLVTTRAAAPG (ID SEC Nº 16), EVRGFSDKDKKKY (ID SEC Nº 17), RDLSRTSKTTTSV (ID SEC Nº 18), QTLFLSKKELPGV (ID SEC Nº 19), SHLVLTTRFLFGL (ID SEC Nº 20), FGCMVSERVKQEA (ID SEC Nº 21), ALRLISCRLVAAQ (ID SEC Nº 22), GSSQGTTKQLPAS (ID SEC Nº 23) y/o QCRVQTVRVQLPD (ID SEC Nº 24). También se proporcionan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. La presente invención también abarca el uso de los sitios polipeptídicos de fosforilación de PKC de HLRRSI1 como epítopes inmunogénicos y/o antigénicos como se describe en otra parte de este documento.
Específicamente, usando el algoritmo Motif (Genetics Computer Group, Inc.) se predijo que el polipéptido HLRRSI1 comprendía un sitio de fosforilación de tirosina. Estos sitios se fosforilan en el resto aminoacídico tirosina. Los patrones consenso para los sitios de fosforilación de tirosina son los siguientes: [RK]-x(2)-[DE]-x(3)-Y o [RK]-x(3)-[DE]-x(2)-Y, donde Y representa el sitio de fosforilación y "x" representa un resto aminoacídico intermedio. Puede encontrarse información adicional específica sobre los sitios de fosforilación de tirosina en Patschinsky T., Hunter T., Esch F.S., Cooper, J.A., Sefton B.M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:973-977(1982); Hunter T., J. Biol. Chem. 257:4843-4848(1982) y Cooper J.A., Esch F.S., Taylor S.S., Hunter T., J. Biol. Chem. 259:7835-7841(1984).
En este documento se describen los siguientes sitios polipeptídicos de fosforilación de tirosina: FFRDERRAERAYRFVKE (ID SEC Nº 14). También se proporcionan los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. La presente invención también abarca el uso de los sitios polipeptídicos de fosforilación de PKC de HLRRSI1 como epítopes inmunogénicos y/o antigénicos como se describe en otra parte de este documento.
Según el algoritmo Motif (Genetics Computer Group, Inc.) se ha demostrado que el polipétido HLRRSI1 comprendía un sitio de glicosilación. Como se describe más específicamente en este documento, se piensa que la glicosilación de la proteína sirve para diversas funciones incluyendo: aumento del plegamiento de la proteína, inhibición de la agregación de la proteína, regulación del tráfico intracelular a los orgánulos, aumento de la resistencia a proteolisis, modulación de la antigenicidad de la proteína y mediación en la adhesión intercelular.
Los sitios de fosforilación de asparragina tienen el siguiente patrón consenso, N-{P}-{ST}-{P}, en donde N representa el sitio de glicosilación. Sin embargo, es bien conocido que estos potenciales sitios de N-glicosilación son específicos para la secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr. Sin embargo, la presencia del tripéptido consenso no es suficiente para concluir que un resto de asparragina está glicosilado, debido al hecho de que el plegamiento de la proteína representa un papel importante en la regulación de la N-glicosilación. Se ha demostrado que la presencia de prolina entre Asn y Ser/Thr inhibirá la glicosilación, esto se ha confirmado mediante un análisis estadístico reciente de sitios de glicosilación que también demostró que aproximadamente el 50% de los sitios que tenían un cambio de la prolina C-terminal a Ser/Thr, no estaban glicosilados. Puede encontrarse información adicional en relación con la glicosilación de asparragina en referencia a las publicaciones siguientes: Marshall R.D., Annu. Rev. Biochem. 41:673-702(1972); Pless D.D., Lennarz W.J., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:134-138(1977); Bause E., Biochem. J. 209:331-336(1983), Gavel Y., von Heijne G., Protein Eng. 3:433-442(1990) y Miletich J.P., Broze, G.J. Jr., J. Biol. Chem. 265:11397-11404(1990).
En este documento se describe el siguiente sitio polipeptídico de asparragina: RFVKENETLFALCF (ID SEC Nº 14). También se proporcionar los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. El uso de los sitios polipeptídicos de glicosilación de asparragina de HLRRSI1 como epítopes inmunogénicos y/o antigénicos se describe en otra parte en este documento.
En realizaciones preferidas, la presente invención abarca un polinucleótido carente del codon de iniciación, además del polipéptido codificado de HLRRSI1 resultante. Específicamente, la presente invención abarca el polinucleótido que se corresponde con los nucleótidos 78 a 1949 de la ID SEC Nº 1 y el polipéptido que se corresponde con los aminoácidos 2 a 625 de la ID SEC Nº 2. También abarca vectores recombinantes que comprenden esta secuencia codificadora y células hospedadores que comprende dicho vector.
Muchas secuencias polinucleotídicas, tales como las secuencias EST, están a disponibilidad del público y son accesibles a través de bases de datos de secuencias. Algunas de estas secuencias están relacionadas con la ID SEC Nº 1 y pueden haber estado a disponibilidad del público antes de la concepción de la presente invención. Preferiblemente, estos polinucleótidos relacionados se excluyen específicamente del alcance de la presente invención. Sería difícil enumerar cada secuencia relacionada. Por consiguiente, preferiblemente están excluidos de la presente invención uno o más polinucleótidos constituidos por una secuencia de nucleótidos descrita por la fórmula general a-b, donde a es cualquier número entero entre 1 y 2675 de la ID SEC Nº 1, b es un número entero entre 15 y 2689, donde tanto a como b se corresponden con las posiciones de los restos de nucleótidos mostrados en las ID SEC Nº 1, y donde b es mayor o igual a +14.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
1 
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La tabla I resume la información correspondiente a cada "Gen Nº" descrito anteriormente. La secuencia de nucleótidos identificadas como "ID SEC NT Nº 1" se ensambló a partir de secuencias parcialmente homólogas ("solapantes") obtenidas a partir del "ID del clon de ADNc" identificado en la Tabla I y, en algunos casos, a partir de clones de ADN relacionados. Las secuencias solapantes se ensamblaron en una única secuencia contigua de alta redundancia (normalmente varias secuencias solapantes para cada posición nucleotídica), dando lugar a una secuencia final identificada como ID SEC Nº 1.
La "ID del clon de ADNc" se depositó en la fecha y con el correspondiente número de depósito dado enumerado en "Nº de depósito de ATCC Z y fecha". "Vector" se refiere al tipo de vector contenido en la ID del clon de ADNc.
"Sec NT total del clon" se refiere al número total de nucleótidos en el cóntigo del clon identificado por el "Gen Nº". El clon depositado puede contener toda o la mayoría de la secuencia de ID SEC Nº 1. La posición de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 del posible codon de iniciación (metionina) se identifica como "NT 5' del codon de iniciación de ORF".
La secuencia de aminoácidos traducida, empezando con la metionina se identifica como "ID SEC AA Nº 2", aunque también pueden traducirse fácilmente otras fases de lectura usando técnicas de biología molecular conocidas. La presente invención contempla específicamente los polipéptidos producidos por estas fases de lectura abierta alternativas.
El número total de aminoácidos en la fase de lectura abierta de la ID SEC Nº 2 es idéntico al "Total de AA de ORF".
La ID SEC Nº 1 (donde X puede ser cualquiera de las secuencias polinucleotídicas descritas en el listado de secuencias) y la traducida ID SEC Nº 2 (donde Y puede ser cualquiera de las secuencias polipeptídicas descritas en el listado de secuencias) son suficientemente exactas y, por otro lado, adecuadas para diversos usos bien conocidos en la técnica y descritas con más detalle en este documento. Por ejemplo, la ID SEC Nº 1 es útil para diseñar sondas de hibridación de ácidos nucleicos que detectarán secuencias de ácido nucleico contenidas en las ID SEC Nº 1 o el ADNc contenido en el clon depositado. Estas sondas también hibridarán con las moléculas de ácido nucleico de muestras biológicas, permitiendo de este modo diversos procedimientos forenses y diagnósticos de la invención. De forma similar, los polipéptidos identificados a partir de la ID SEC Nº 2 pueden usarse, por ejemplo, para generar anticuerpos que se unan específicamente a las proteínas que contienen los polipéptidos y a las proteínas codificadas por los clones de ADNc identificados en la Tabla I.
Sin embargo, las secuencias de ADN generadas mediante reacciones de secuenciación pueden contener errores de secuenciación. Los errores existen como nucleótidos mal identificados o como inserciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de ADN generada. Los nucleótidos insertados o delecionados erróneamente pueden causar cambios de fase en las fases de lectura de la secuencia de aminoácidos predicha. En estos casos, la secuencia de aminoácidos predicha diverge de la secuencia de aminoácidos real, aunque la secuencia de ADN generado puede ser más del 99,9% idéntica a la secuencia de ADN real (por ejemplo, inserción o deleción de una base en una fase de lectura abierta de más de 1.000 bases).
Por consiguiente, para estas aplicaciones que requieren precisión en la secuencia de nucleótidos y en la secuencia de aminoácidos, la presente invención proporciona no sólo la secuencia de nucleótidos generada identificada como ID SEC Nº 1 y la secuencia de aminoácidos traducida predicha identificada como ID SEC Nº 2, sino también una muestra de ADN plasmídico que contiene un ADNc de la invención depositado en la ATCC, como se muestra en la Tabla I. La secuencia de nucleótidos de cada clon depositado puede determinarse fácilmente secuenciando el clon depositado según procedimientos conocidos. A continuación, puede verificarse la secuencia de aminoácidos predicha a partir de estos depósitos. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por un clon en particular también puede determinarse directamente mediante la secuenciación peptídica o mediante la expresión de la proteína en una célula hospedadora adecuada que contenga el ADNc depositado, recogiendo la proteína y determinando su
secuencia.
La presente invención también se refiere a los genes correspondientes a las ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 2 o el clon depositado. El gen correspondiente puede aislarse según procedimientos conocidos usando la información de la secuencia descrita en este documento. Estos procedimientos incluyen preparar sondas o cebadores a partir de la secuencia descrita e identificar o amplificar el gen correspondiente de fuentes apropiadas de material genómico.
Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Estos polipéptidos incluyen polipéptidos naturales, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar estos polipéptidos se conocen bien en la técnica.
Los polipéptidos pueden estar en forma de proteína o puede ser parte de una proteína mayor, tal como una proteína de fusión (véase a continuación). A menudo es ventajoso incluir una secuencia adicional de aminoácidos que contenga secuencias secretoras o líderes, prosecuencias, secuencias que ayuden en a la purificación, tales como restos múltiples de histidina o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante.
Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada y, preferiblemente están sustancialmente purificados. Una versión de un polipéptido producido recombinantemente, puede purificarse sustancialmente usando técnicas descritas en este documento o, por otro lado, conocidas en la técnica, tal como, por ejemplo, el procedimiento en una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Los polipéptidos de la invención también pueden purificarse a partir de fuentes naturales, sintéticas o recombinantes usando protocolos descritos en este documento o, por otro lado, conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, anticuerpos de la invención obtenidos frente a la forma de longitud completa de la proteína.
La presente invención proporciona un polinucleótido constituido por la secuencia identificada como ID SEC Nº 1 y/o un ADNc proporcionado en el depósito de la ATCC Nº Z. La presente invención también proporciona un polipéptido constituido por la secuencia identificada como ID SEC Nº 2 y/o un polipéptido codificado por el ADNc proporcionado en el depósito de la ATCC Nº Z. La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende, o alternativamente está constituido por el polipéptido de la secuencia de ID SEC Nº 2 y/o un polipéptido codificado por el ADNc contenido en el depósito de la ATCC Nº Z.
La presente invención abarca polinucleótidos con secuencias complementarias a las de los polinucleótidos de la presente invención descritos en este documento. Estas secuencias pueden ser complementarias de la secuencia descrita como ID SEC Nº 1, la secuencia contenida en un depósito y/o la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia descrita como ID SEC Nº 2.
La invención abarca la aplicación de la metodología de PCR a las secuencias polinucleotídicas de la presente invención, el clon depositado en la ATCC y/o el ADNc que codifica los polipéptidos de la presente invención. Las técnicas de PCR para la amplificación de ácidos nucleicos se describen en la patente de EE.UU. Nº 4.683.195 y Saiki y col., Science, 239:487-491 (1988). La PCR, por ejemplo, puede incluir las siguientes etapas: de desnaturalización del ácido nucleico molde (si es de doble cadena), hibridación del cebador con la diana y polimerización. El ácido nucleico incubado con la sonda o usado como molde en la reacción de amplificación puede ser ADN genómico, ADNc, ARN o un APN. La PCR puede usarse para amplificar secuencias específicas a partir del ADN genómica, secuencias de ARN específico y/o ADNc transcrito a partir del ARNm. Las referencias para el uso general de técnicas de PCR, que incluyen parámetros de un procedimiento específico, incluyen Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989; Ehrlich y col., Science, 252:1643-1650, (1991) y "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Editores, Innis y col., Academic Press, Nueva York, (1990).
De este modo, un aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico constituida por (a) un polinucleótido constituido por los nucleótidos 78 a 1949 de la ID SEC Nº 1; (b) un polinucleótido constituido por los nucleótidos 75 a 1949 de la ID SEC Nº 1; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 2 a 625 de la ID SEC Nº 2; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 1 a 625 de la ID SEC Nº 2; (e) un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 como el codificado por el clon de ADNc contenido en el depósito de la ATCC Nº PTA-2679; (f) un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRS1 como el codificado por el clon de ADNc del depósito de la ATCC Nº PTA-2674, un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por: una secuencia de nucleótidos complementario a cualquiera de las secuencias nucleotídicas de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) anteriores.
Un procedimiento preferido para determinar la mejor coincidencia total entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia en cuestión, también referida como alineamiento de secuencia global, puede determinarse usando el programa de ordenador CLUSTALW (Thompson, J. D. y col., Nucleic Acids Research, 2(22):4673-4680, (1994)), que se basa en el algoritmo de Higgins, D.G. y col., Computer Applications in the Biosciences (CABIOS ), 8(2):189-191, (1992). En un alineamiento de secuencia, las secuencias problema y en cuestión son ambas secuencias de ADN. Puede compararse una secuencia de ARN convirtiendo las T en U. Sin embargo, el algoritmo CLUSTALW convierte automáticamente las T en U cuando se comparan secuencias de ARN con secuencias de ADN. El resultado de dicho alineamiento global de secuencia es un porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en un alineamiento CLUSTALW de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad mediante el alineamiento por parejas son: Matriz=IUB, k-tuple=1; número de diagonales superiores=5, penalización por hueco=3, penalización por hueco abierto=10, penalización por extensión del hueco = 0,1, procedimiento de puntuación=porcentaje, tamaño de la ventana=5 o la longitud de la secuencia de nucleótidos en cuestión, el que sea más corto. Para alineamientos múltiples, se prefieren los siguientes parámetros de CLUSTALW: penalización por apertura de hueco=10, parámetro de extensión de hueco=0,05; intervalo de penalización por separación de hueco=8, penalización por separación del extremo del hueco=desactivada; % de identidad para retraso de alineamiento=40%, huecos específicos de resto: desactivado, hueco de resto hidrófilo=desactivado y ponderación de la transición=0. Los parámetros anteriores de alineamiento por parejas y múltiple proporcionados para CLUSTALW representan los parámetros por defecto que proporciona el programa AlignX (grupo de programas Vector NTI,
versión 6.0).
La presente invención abarca la aplicación de una corrección manual a los resultados de porcentajes de identidad, en el caso en que la secuencia en cuestión es más corta que la secuencia problema debido a deleciones 5' o 3', no por deleciones internas. Si sólo se requiere el porcentaje de identidad local por parejas, no es necesaria la corrección manual. Sin embargo, puede aplicarse una corrección manual para determinar el porcentaje global de identidad a partir de un alineamiento global de un polinucleótido. A menudo se prefieren los cálculos de porcentajes de identidad sobre la base de alineamientos globales de polinucleótidos ya que reflejan el porcentaje de identidad entre las moléculas polinucleotídicas en su totalidad (es decir, incluyendo cualquier prolongación y no sólo las regiones solapantes) en oposición a polinucleótidos que coinciden sólo a nivel local. Se requieren correcciones manuales para las determinaciones de porcentajes globales de identidad ya que el programa CLUSTALW no tiene en cuenta los truncamientos 5' y 3' de la secuencia en cuestión cuando calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias en cuestión truncadas en los extremos 5' y 3', en relación con la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia problema que es el 5' y el 3' de la secuencia sujeto, que no coincide/se alinea, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Si un nucleótido coincide/se alinea se determina mediante los resultados del alineamiento de secuencia de CLUSTALW. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa CLUSTALW anterior usando los parámetros especificados, hasta llegar a un valor final de porcentaje de identidad. Este valor corregido puede usarse para los fines de la presente invención. Para los fines del ajuste manual del valor del porcentaje de identidad, sólo se calculan las bases fuera de las bases de 5' a 3' de la secuencia sujeto, como se muestra en el alineamiento CLUSTALW, que no coinciden/se alinea con la secuencia problema.
Por ejemplo, se alinea una secuencia sujeto de 90 bases con una secuencia problema de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones tienen lugar en el extremo 5' de la secuencia sujeto y, por tanto, el alineamiento CLUSTALW no muestra coincidencia/alineamiento de las 10 primeras bases del extremo 5'. Las 10 bases desapareadas representan el 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no apareadas/número total de bases en la secuencia problema), por lo que se resta el 10% del valor del porcentaje de identidad calculado mediante el programa CLUSTALW. Si las 90 bases restantes se apareaban perfectamente, el porcentaje final de identidad sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 bases con una secuencia problema de 100 bases. Esta vez, las deleciones son deleciones internas de modo que estas no son bases de los extremos 5' o 3' de la secuencia sujeto que no coinciden/se alinean con la problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado mediante CLUSTALW no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las bases 5' y 3' de la secuencia sujeto que no coinciden/se alinean con la secuencia problema se corrigen manualmente. No se requieren otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.
Además del procedimiento anterior de alineamiento de dos o más secuencias de polinucleótidos o polipéptidos para llegar a un valor de porcentaje de identidad de las secuencias alineadas, en algunas circunstancias, puede desearse usar una versión modificada del algoritmo CLUSTALW que tiene en cuenta características estructurales conocidas de las secuencias que se van a alinear, tales como, por ejemplo, las designaciones SWISS-PROT para cada secuencia. El resultado de este algoritmo CLUSTALW modificado puede proporcionar un valor más exacto del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos. La ayuda para esta versión modificada de CLUSTALW se proporciona con el algoritmo CLUSTALW y un experto en bioinformática podría apreciarlo
fácilmente.
La invención abarca polipéptidos que tienen un grado de identidad menor pero que tienen similitud suficiente como para realizar una o más de las mismas funciones realizadas por el polipéptido de la presente invención. La similitud se determina mediante la sustitución de aminoácidos conservados. Estas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares (por ejemplo, propiedades químicas). Según lo anterior Cunningham y col., probablemente estas sustituciones conservativas son fenotípicamente silentes. Las directrices adicionales con respecto a qué cambios de aminoácidos probables son fenotípicamente silentes se encuentran en Bowie y col., Science 247:1306-1310 (1990).
Las sustituciones de aminoácidos conservativos toleradas de la presente invención implican la sustitución de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e Ile; la sustitución de los restos hidroxilo de Ser y Thr, la sustitución de los restos ácidos de Asp y Glu; la sustitución de los restos amida de Asn y Gln, la sustitución de los restos básicos de Lys, Arg e His; la sustitución de los restos aromáticos de Phe, Tyr y Trp y la sustitución de los aminoácidos más pequeños Ala, Ser, Thr, Met y Gly.
Además, la presente invención también abarca las sustituciones conservadoras proporcionadas a continuación en la Tabla III.
TABLA III
Para el aminoácido Código Sustituido por cualquiera de:
Alanina A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn,
D-Orn
Asparragina N D-Asn, Asp, D-Asp, Gly, D-Glu, Gln, D-Gln
Ácido aspártico D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Cisteína C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Ácido Glutámico E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Glicina G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, \beta-Ala, Acp
Isoleucina I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucina L D-leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lisina K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn,
D-Orn
Metionina M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-leu, Val, D-Val
Fenilalanina F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-dopa, His, D-his, Trp, D-Trp, Trans-3,4 ó 5-fenilprolina,
cis-3,4 ó 5-fenilprolina
Prolina P D-Pro, ácido L-1-tiazolidin-4-carboxílico o ácido L-1-oxazolidin-4-carboxílico
Serina S D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L- Cys, D-Cys
Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Tirosina Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valina V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met 
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Aparte de los usos descritos anteriormente, estas sustituciones de aminoácidos también pueden aumentar la estabilidad de la proteína o del péptido. La invención abarca sustituciones de aminoácidos que contienen, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que sustituyen a los enlaces peptídicos) en la secuencia de la proteína o del péptido. También se incluyen sustituciones que incluyen restos de aminoácidos diferentes de los L-aminoácidos naturales, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos no naturales o sintéticos, por ejemplo, \beta o \gamma-aminoácidos.
Tanto la identidad como la similitud pueden calcularse fácilmente con referencia a las siguientes publicaciones: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., editor Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., editor, Academic Press, Nueva York, 1993; Informatics Computer Analysis of Sequence Data, 1ª parte, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., editores., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., editores., M Stockton Press, Nueva York, 1991.
Además, la presente invención también abarca sustituciones de aminoácidos sobre la base de la probabilidad de que una sustitución de aminoácidos tenga como resultado la conservación de la función. Estas probabilidades se determinan mediante el alineamiento de genes múltiples con función relacionada y la evaluación de la penalización relativa de cada sustitución sobre la función propia del gen. Estas probabilidades se describen a menudo en una matriz y se usan en algunos algoritmos (por ejemplo, BLAST, CLUSTALW, GAP, etc.) para calcular el porcentaje de similitud, en donde similitud se refiere al grado al cual un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido sin pérdida de función. Un ejemplo de esta matriz es la matriz PAM250 o la BLOSUM62.
Aparte de las sustituciones canónicas químicamente conservadoras referenciadas anteriormente, la invención también abarca sustituciones que típicamente no se clasifican como conservadoras pero que pueden ser químicamente conservadoras en ciertas circunstancias. El análisis de la catálisis enzimática por proteasas, por ejemplo, ha demostrado que ciertos aminoácidos del centro activo de algunas enzimas puede tener el pKa muy alterado debido al microentorno único del centro activo. Este pKa alterado podría permitir que algunos aminoácidos se sustituyan por otros aminoácidos siempre que se conserve la estructura y la función enzimática. Los ejemplos de aminoácidos para los que se conoce que tienen aminoácidos con pKa alterado son el resto Glu-35 de la lisozima, el resto Ile-16 de la quimiotripsina, el resto His-159 de la papaína, etc. La conservación de la función se refiere a la protonación anómala o desprotonación anómala de estos aminoácidos, relativo a su pKa canónico no alterado. La alteración del pKa puede permitir que estos aminoácidos participen activamente en la catálisis ácido-base general debido al entorno de ionización único en el centro activo de la enzima. De este modo, la sustitución de un aminoácido capaz de servir como un ácido general o una base general en el microentorno de un centro o cavidad activa de la enzima, como puede ser el caso, con la misma similar o capacidad que el aminoácido de tipo silvestre, podría servir de forma eficaz como una sustitución de amino conservadora.
Fragmentos de polinucleótidos y polipéptidos
Como apreciará un experto en la materia, y como se explica a continuación, los polipéptidos de la presente invención que comprende un epítope inmunogénico o antigénico pueden fusionarse con otras secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse con el dominio constante de las inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) o porciones de las mismas (CH1, CH2, CH3 o cualquier combinación de los mismos y porciones de los mismos) que dan lugar a polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación y pueden aumentar la semivida in vivo. Esto se ha demostrado en proteínas quiméricas constituidas por los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de mamíferos. Véase, por ejemplo, el documento EP 394.827; Traunecker y col., Nature, 331:84-86 (1988). Se ha demostrado un suministro potenciado de un antígeno al sistema inmunitario a través de la barrera epitelial para antígenos (por ejemplo, insulina) conjugados con un patrón de unión FcRn tales como IgG o fragmentos Fc (véase por ejemplo, las publicaciones PCT WO 96/22024 y WO 99/04813). Se ha encontrado que las proteínas de fusión de IgG que tienen una estructura dimérica unida por puentes disulfuro debido a los puentes disulfuro de la porción IgG, son más eficaces uniéndose y neutralización a otras moléculas que los polipéptidos monoméricos o fragmentos de los mismos aislados. Véase, por ejemplo, Fountoulakis y col., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995). También pueden combinarse los ácidos nucleicos que codifican los epítopes anteriores con un gen de interés como una etiqueta de epítope (por ejemplo, la etiqueta de hemaglutinina ("HA") o la etiqueta flag) para ayudar a la detección y purificación del polipéptido expresado. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht y col. permite la purificación fácil de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972- 897). En este sistema, el gen de interés se subclonó en un plásmido de recombinación de vaccinia de modo que la fase de lectura abierta del gen se fusionaba traduccionalmente con una etiqueta en el extremo aminoterminal constituido por seis restos de histidina. La etiqueta sirve como dominio de unión de la proteína de fusión a la matriz. Los extractos de las células infectadas con el virus vaccinia recombinante se cargaron en una columna de agarosa-ácido nitriloacético Ni^{2+} y las proteínas etiquetadas con histidina pueden eluirse de forma selectiva con tampones que contengan imidazol.
Pueden generarse proteínas de fusión de la invención adicionales mediante las técnicas de mezcla aleatoria de genes, mezcla aleatoria de motivos, mezcla aleatoria de exones y/o mezcla aleatoria de codones (denominados en conjunto como "mezcla aleatoria de ADN"). La mezcla aleatoria de ADN puede emplearse para modular las actividades de los polipéptidos de la invención, estos procedimientos puede usarse para generar polipéptidos con actividad alterada, así como agonistas y antagonistas de los polipéptidos. Véase, en general, las patentes de EE.UU. Nº 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 y 5.837.458, y Patten y col., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82 (1998); Hansson y col., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999) y Lorenzo y Blasco, Biotechniques 24 (2):308-13 (1998). En una realización, puede conseguirse la alteración de los polinucleótidos correspondientes con la ID SEC Nº 1 y los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos mediante mezcla aleatoria del ADN. La mezcla aleatoria del ADN implica el ensamblaje de dos o más segmentos de ADN mediante recombinación homóloga o específica de sitio para generar variación en la secuencia de polinucleótidos. En otra realización, los polinucleótidos de la invención, o los polipéptidos codificados, puede alterarse sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante PCR susceptible de error, inserción aleatoria de nucleótidos u otros procedimientos previos a la recombinación. En otra realización, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, puede combinarse con un o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Anticuerpos
Los polipéptidos adicionales de la invención se refieren a anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de la presente invención (como se determinó mediante inmunoensayos bien conocidos en la técnica para analizar la unión específica antígeno-anticuerpo). Los anticuerpos de la invención incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotipo (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id frente a anticuerpos de la invención) y fragmentos que se unen al epítope de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Además, la expresión "anticuerpo" (Ac) o "anticuerpo monoclonal" (Acm) pretende incluir moléculas intactas, así como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')_{2}) que son capaces de unirse específicamente a la proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carentes del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación del animal o la planta y pueden tener menor unión no específica al tejido que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). De este modo, se prefieren estos fragmentos así como los productos de un FAB u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados.
Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos humanos de la presente invención e incluye, pero sin limitación, Fab, Fab' y F(ab')2, Fc, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por puentes disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos del anticuerpo de unión al antígeno, incluyendo los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la región(es) variable(s) sola o en combinación con la totalidad o una porción de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos de unión al antígeno que también comprenden cualquier combinación de región(es) variable(s) con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo pájaros y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos (por ejemplo, de ratones y ratas), burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo. Como se usa en este documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulina humana y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describen infra y, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 5.939.598 de Kucherlapati y col.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos tanto de un polipéptido de la presente invención así como un epítope heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt y col., J. Immunol. 147:60-69 (1991); las patentes de EE.UU. Nº 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny y col., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).
Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en términos del epítope(s) o porción(es)
de un polipéptido de la presente invención que reconocen o al que se unen específicamente. El epítope(s) o la porción(es) polipeptídica(s) pueden especificarse como se describe en este documento, por ejemplo, por las posiciones N-terminal y C-terminal, por el tamaño de restos de aminoácidos contiguos o enumerados en las Tablas y Figuras. También pueden excluirse anticuerpos que se unen específicamente a cualquier epítope o polipéptido de la presente invención Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos que específicamente se unen a polipéptidos de la presente invención y permite la exclusión de los mismos.
Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o una Kd menor de 5 X 10^{-2} M, 10^{-2} M, 5 X 10^{-3} M, 10^{-3} M, 5 X 10^{-4} M, 10^{-4} M, 5 X 10^{-5} M, 10^{-5} M, 5 X 10^{-6} M, 10^{-6} M, 5 X 10^{-7} M, 10^{-7} M, 5 X 10^{-8} M, 10^{-8} M, 5 X 10^{-9} M, 10^{-9} M, 5 X 10^{-10} M, 10^{-10} M, 5 X 10^{-11} M, 10^{-11} M, 5 X 10^{-12} M, 10^{-12} M, 5 X 10^{-13} M, 10^{-13} M, 5 X 10^{-14} M, 10^{-14} M, 5 X 10^{-15} M o 10^{-15} M.
Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, pero sin limitación, para purificar, detectar y dirigirse hacia los polipéptidos de la presente invención, incluyendo tanto procedimientos diagnósticos como terapéuticos in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos se usan en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente los niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edición, 1988).
Como se explica con más detalle a continuación, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden además fusionarse de forma recombinante a un extremo N o C-terminal con un polipéptido heterólogo o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes o no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse de forma recombinante o conjugarse con moléculas útiles como marcadores para ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos o toxinas. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente de EE.UU. Nº 5.314.995 y el documento EP 396.387.
Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, mediante la unión covalente al anticuerpo de cualquier tipo de molécula de modo que la unión covalente no previene de la generación de respuesta antiidiotípica frente al anticuerpo. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular o a otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos policlonales. Los expertos conocen procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales (Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª Edición. (1988)). Por ejemplo, puede administrarse un polipéptido de la invención a diversos animales hospedadores incluyendo, pero sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos específicos policlonales para el antígeno. La administración de los polipéptidos de la presente invención puede implicar uno o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Pueden usarse diversos adyuvantes dependiendo de la especie hospedadora para aumentar la respuesta inmunológica, e incluyen, pero sin limitación, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancia activas superficiales tales como lisolecitina, polioles Plurónic, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes potencialmente útiles en humanos tales como BCG (bacillo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Estos adyuvantes también son bien conocidos en la técnica. Para los fines de la invención, un "agente inmunizante" puede definirse como un polipéptido de la invención, incluyendo fragmentos, variantes y/o derivados de los mismos, además de fusiones con polipéptidos heterólogos y otras formas de los polipéptidos descritos en este documento.
Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones por vía subcutánea o intraperitoneal múltiple, aunque también puede administrarse por vía intramuscular y/o por vía i.v. El agente inmunizante puede incluir polipéptidos de la presente invención, una proteína de fusión o variantes de los mismos. Dependiendo de la naturaleza de los polipéptidos (es decir, porcentaje de hidrofobicidad, porcentaje de hidrofilicidad, estabilidad, carga neta, punto isoeléctrico, etc.), puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en los mamíferos inmunizados. Esta conjugación incluye la conjugación química derivatizando grupos funcionales químicos activos tanto del polipéptido de la presente invención como de la proteína inmunogénica de modo que se forme un enlace covalente, a través de metodología basada en la fusión de proteínas u otros procedimientos conocidos por los expertos. Ejemplos de estas proteínas inmunogénicas incluyen, pero sin limitación, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soja. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, incluyen, pero sin limitación, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes potencialmente útiles en humanos tales como BCG (bacillo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los ejemplos adicionales de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato trehalosa sintética). Un experto en la materia puede seleccionar el protocolo de inmunización sin realizar experimentación.
Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando procedimientos de hibridomas, tales como los descritos por Kholer y Milstein, Nature, 256:495 (1975) y la patente de EE.UU. Nº 4.376.110, por Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edición (1988), por Hammerling y col., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N. Y. (1981)) u otros procedimientos conocidos por el experto. Otros ejemplos de procedimientos que pueden emplearse para producir anticuerpos monoclonales incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridomas de células B humanas (Kosbor y col., 1983, Immunology Today 4:72; Cole y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) y la técnica del hibridoma-EBV (Cole y col., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el Acm de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de valores altos de Acm in vivo hace de este el procedimiento de producción preferido actualmente.
En un procedimiento de hibridoma, un ratón, un ratón humanizado, un ratón con un sistema inmunitario humano, hámster u otro animal hospedador apropiado, típicamente se inmunizar con un agente inmunizante para provocar que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
Típicamente, el agente inmunizante incluirá polipéptidos de la presente invención o una proteína de fusión de los mismos. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o células esplénicas o células de ganglio linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilénglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pág. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de mamífero transformadas, especialmente células de mieloma de roedores, bovinas o de origen humano. Normalmente se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que, preferiblemente, contiene una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previene el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan de forma eficaz, mantiene un nivel de expresión estable elevado del anticuerpo por parte de las células que producen el anticuerpo seleccionado y son sensibles a medios tales como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que puede obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Como se deduce de la descripción, también se han descrito líneas celulares de mieloma humana y líneas celulares de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pág. 51-63).
A continuación puede ensayarse la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a los polipéptidos de la presente invención en el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). Estas técnicas son conocidas en la materia y entre los expertos. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollart, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Después de que se han identificado las células del hibridoma deseado, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución límite y crecerse por procedimientos convencionales (Goding, supra). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco y RPMI 1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del líquido ascítico por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, Sepharose-proteína A, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de exclusión en gel, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad.
El experto podría comprender que existen diversos procedimientos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales y, de este modo, la invención no se limita únicamente a su producción en los hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de EE.UU. Nº 4.816.567. En este contexto, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon eucariótico, de fago o procariótico. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos, o estas cadenas de humano, humanizados u otras fuentes). Las células de hibridoma de la invención sirven con una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transforman en células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. También puede modificarse el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humana en el lugar de las secuencias de ratón homólogas (patente de EE.UU. Nº 4.816.567, Morrison y col., supra) o mediante unión covalente de toda o parte de la secuencia que codifica la inmunoglobulina con la secuencia codificadora de un polipéptido no inmunoglobulina. Este polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. Generalmente, la cadena pesada está trucada en cualquier punto de la región Fc de modo que se previene el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los restos relevantes de cisteína se sustituyen por cualquier otro resto de aminoácido o se delecionan para prevenir el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro son también adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, especialmente, fragmentos Fab, puede lograrse usando técnicas rutinarias conocidas en la materia. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando una amplia diversidad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo el uso de tecnologías de hibridomas, recombinante y de despliegue de fagos o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridomas incluyendo las conocidas en la técnica y mostradas, por ejemplo, en Harlow y col. Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edición, 1988); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981). La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o fago y no al procedimiento por el cual se produce.
Los procedimientos para producir y analizar los anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica, y se explican en detalle en los Ejemplos de este documento. En un ejemplo no limitante, puede inmunizarse a ratones con un polipéptido de la invención o con una célula que expresa este péptido. Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidos con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible en la ATCC. Se seleccionan los hibridomas y se clonan mediante dilución límite. A continuación, se ensaya las células de los clones de hibridomas que secretan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención por procedimientos conocidos en la técnica. Puede generarse líquido ascítico, que generalmente contiene niveles elevados de anticuerpos, inmunizando a los ratones con clones de hibridomas positivos.
Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos para generar anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el procedimiento que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en el que, preferiblemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la invención o con células de mieloma y, a continuación, se analizan los hibridomas resultantes de la fusión que secretan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')_{2} de la invención pueden producirse por escisión proteolítica de las moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaina (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando diversos procedimientos de despliegue de fagos conocidos en la técnica. En los procedimientos de despliegue de fagos, se despliegan dominios de anticuerpo funcionales en la superficie de las partículas de los fagos que llevan las secuencias polinucleotídicas que las codifican. En una realización en particular, este fago puede utilizarse par desplegar dominios de unión al antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria del anticuerpo (por ejemplo, humano o murino). Pueden seleccionarse o identificarse fagos que expresen un dominio de unión al antígeno que se une al antígeno de interés con el antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie sólida o perla. Los fagos usados en estos procedimientos típicamente son fagos filamentosos que incluyen dominios de unión de fd y M13 expresados en fagos con dominios Fab, Fv o anticuerpo Fv estabilizados por puentes disulfuro fusionados recombinantemente con el gen III del fago o con el gen de la proteína VII. Los ejemplos de los procedimientos de despliegue de fagos que pueden usarse para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman y col., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames y col., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough y col., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic y col., Gene 187 9-18 (1997); Burton y col., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); solicitud PCT Nº PCT/GB91/01134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 y las patentes de EE.UU. Nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, pueden aislarse del fago las regiones que codifican el anticuerpo y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')_{2} usando procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax y col., BioTechniques 12 (6):864-869 (1992) y Sawai y col., AJRI 34:26-34 (1995); y Better y col., Science 240:1041-1043 (1988). Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv y anticuerpos de cadena sencilla incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston y col., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu y col., PNAS 90:7995-7999 (1993) y Skerra y col., Science 240:1038-1040 (1988).
En algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos e in vitro en ensayos de detección, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tiene una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de la inmunoglobulina humana. En la técnica se conocen procedimientos para producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies y col., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; las patentes de EE.UU. Nº 5.807.715; 4.816.567 y 4.816.397. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de un anticuerpo de una especie no humana que se unen al antígeno deseado y tienen una o más regiones de determinación de complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones estructurales de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los restos estructurales en las regiones estructurales humanas se sustituirán por el resto correspondiente del CDR del anticuerpo donador para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante modelado de las interacciones de los CDR y de los restos estructurales para identificar restos estructurales importantes para la unión al antígeno y para la comparación de secuencia para identificar restos estructurales poco frecuentes en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen y col., patente de EE.UU. Nº 5.585.089; Riechmann y col., Nature 332:323; (1988)). Los anticuerpos pueden humanizarse usando diversas técnicas conocidas en la materia incluyendo, por ejemplo, injertos de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT WO 91/09967, patentes de EE.UU. Nº 5.225.539; 5.530,101 y 5.585.089), sustitución o modelado de aminoácidos de la superficie (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498 (1991); Studnicka y col., Protein Engineering 7 (6):805-814 (1994); Roguska y col., PNAS 91:969-973 (1994)), y mezcla aleatoria de cadenas (patente de EE.UU. Nº 5.565.332). Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan como restos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo los procedimientos de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-1536 (1988), sustituyendo los CDR o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. Nº 4.816.567), en los que sustancialmente se ha sustituido menos de un dominio humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido restos CDR y posiblemente algunos restos FR, por los sitios análogos de los anticuerpos del roedor.
En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo un dominio variable, y típicamente dos, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. Óptimamente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Los anticuerpos completamente humanos son especialmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Pueden hacerse anticuerpos humanos mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo los procedimientos de despliegue de fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humana. Véase también, las patentes de EE.UU. Nº 4.444.887 y 4.716.111 y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Las técnicas de Cole y col. y de Boerder y col., también están disponible para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)).
También pueden producirse anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes humanos de inmunoglobulinas. Por ejemplo, pueden introducirse de forma aleatoria o por recombinación homóloga complejos génicos de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina humana en células troncales embriónicas de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en células troncales embriónicas de ratón además de los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Los genes de las cadenas pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales separada o simultáneamente con la introducción de loci de la inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región JH previene la producción endógena del anticuerpo. Las células troncales embriónicas modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se cruzan para producir descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno a partir de ratones transgénicos inmunizados usando tecnología convencional de hibridomas. Los transgenes de la inmunoglobulina humana portados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de las células B y, posteriormente, experimentan cambio de clase y mutación somática. De este modo, usando esta técnica, es posible producir anticuerpo IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para una descripción detallada de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y de los protocolos para producir estos anticuerpos, véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; patente europea Nº 0 598 877; Patentes de EE.UU. Nº 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771 y 5.939.598. Además, puede encargarse a compañías como Abgenix, Inc. (Freemont, CA), Genpharm (San Jose, CA) y Medarex, Inc. (Princeton, NJ) el suministro de anticuerpos humanos dirigidos frente a un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.
De forma similar, pueden hacerse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, por ejemplo, en ratones en los que los genes de la inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras la estimulación, se observa la producción de un anticuerpo humano que a todos los respectos, recuerda bastante a los observados en humanos, incluyendo reordenamientos génico, ensamblaje y creación de un repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.106 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Biotechnol., 10:779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368:856-859 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnol., 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol., 14:826 (1996); Lonberg y Huszer, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995).
Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado usando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconozca el mismo epítope. (Jespers y col., Bio/technology 12:899-903 (1988)).
Adicionalmente, puede utilizarse, en definitiva, anticuerpos frente a los polipéptidos de la invención para generar anticuerpos antiidiotipo que "mimeticen" a los polipéptidos de la invención usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (Véase, por ejemplo, Greenspan y Bona, FASEB J. 7 (5):437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol.147 (8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen e inhiben competitivamente la multimerización del polipéptido y/o la unión de un polipéptido de la invención a un ligando, para genera anticuerpo antiidiotipo que "mimeticen" la multimerización del polipéptido y/o el dominio de unión y, en consecuencia, se unan y neutralicen al polipéptido y/o su ligando. Estos antiidiotipos neutralizantes o fragmentos Fab de estos antiidiotipos pueden usarse en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando polipeptídico. Por ejemplo, estos anticuerpos antiidiotipo pueden usarse para unir un polipéptido de la invención y/o para unir estos ligandos/receptores y bloquear de este modo su actividad biológica.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En la presente invención, una de las especificidades de unión puede estar dirigida hacia un polipéptido de la presente invención, la otra puede ser por cualquier otro antígeno y, preferiblemente, por una proteína de la superficie celular, receptor, subunidad de receptor, antígeno específico de tejido, proteína derivada de virus, proteína de la envuelta codificada por virus, proteína derivada de bacteria o proteína de la superficie bacteriana, etc.
En la técnica se conocen procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas diferentes de anticuerpo de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta normalmente se consigue mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias de dominios constantes de la inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se transforman conjuntamente en un organismo hospedador adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Meth. In Enzym., 121:210 (1986).
También se contemplan en la presente invención anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados están constituidos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto que estos anticuerpos, por ejemplo, se dirijan a las células del sistema inmunitario frente a células no deseadas (patente de EE.UU. Nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360; WO 92/20373 y EP03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando procedimientos conocidos de métodos químicos de síntesis de proteínas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio disulfuro o formando un enlace tioéster. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.676.980.
Procedimientos de producción de anticuerpos
Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier procedimiento para la síntesis de anticuerpos conocido en la técnica, en particular, mediante síntesis química o, preferiblemente, mediante técnicas de expresión recombinante.
La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, fragmento, derivado o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención o un anticuerpo de cadena sencilla de la invención), requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o porción del mismo (conteniendo preferiblemente el dominio variable de la región pesada o ligera) de la invención, puede producirse el vector para la producción de la molécula de anticuerpo por tecnología de recombinación de ADN, usando técnicas bien conocidas en la materia. De este modo, se describen en este documento procedimientos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo. Pueden usarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican el anticuerpo y señales de control de la transcripción y de la traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, las técnicas de recombinación de ADN in vitro, técnicas sintéticas y de recombinación genética in vivo. La invención proporciona, de este modo, vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención o una cadena pesada o ligera del mismo, o un domino variable de la cadena pesada o ligera, unida de forma operativa a un promotor. Estos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 86/05807, publicación PCT WO 89/01036 y la patente de EE.UU. Nº 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en este vector de expresión de la cadena pesada o ligera completa.
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales y, a continuación, las células transfectadas se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. De este modo, la invención incluye células hospedadoras que contiene un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o una cadena pesada o ligera del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla de la invención, unido de forma operativa a un promotor heterólogo. En realizaciones preferidas para la expresión de anticuerpos de cadena doble, puede expresarse conjuntamente en una célula hospedadora vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.
Pueden utilizarse una diversidad de sistemas de vectores de expresión en el hospedador para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Estos sistemas de expresión en el hospedador representan vehículos por los cuales pueden producirse las secuencias codificadoras de interés y, posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden expresar, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiadas, una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN del cósmido que contienen secuencias codificadoras del anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias codificadoras del anticuerpo; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras del anticuerpo, sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificadoras del anticuerpo o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que portan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus, el promotor 7,5 K del virus vaccinia). Preferiblemente, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante células bacterianas, tales como Escherichia coli, y más preferiblemente, células eucarióticas, especialmente para la expresión de la molécula completa de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster chico (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor génico principal temprano intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking y col., Gene 45:101 (1986); Cockett y col., Bio/Technology 8:2 (1990)).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse de forma ventajosa varios vectores de expresión dependientes del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de esta proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser convenientes vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos proteicos de fusión que se purifican fácilmente. Estos vectores incluyen, pero sin limitación, al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y col., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el que puede ligarse individualmente en el vector la secuencia que codifica el anticuerpo en fase con la región codificadora lac Z de manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985); Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) y similares; también pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y puede purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a una matriz de perlas de glutatión-agarosa seguido de la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan incluyendo sitios de escisión de proteasas de trombina o del factor Xa de modo que el producto génico diana clonado puede liberarse del resto GST.
En un sistema de insecto, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (ACNP) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificadora del anticuerpo puede clonarse individualmente dentro de regiones no esenciales (por ejemplo, el gen polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor polihedrina).
En células hospedadoras de mamíferos, puede utilizarse varios sistemas de expresión basada en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia que codifican el anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, las secuencias promotoras y líderes tripartidas de este último. A continuación, este gen quimérico puede insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en hospedadores infectados. (por ejemplo, véase Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Las señales de iniciación específica también puede requerir la traducción eficaz de secuencias codificadoras del anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codon de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Adicionalmente, el codon de iniciación debe estar en fase con la fase de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegura la traducción de la inserción completa. Estas señales de control de traducción exógena y codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos apropiados potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (véase Bittner y col., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).
Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras que modulen la expresión de las secuencias insertadas, o modificadas, y procese el producto génico en el modo específico deseado. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Se han caracterizado células hospedadoras diferentes y mecanismos específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares y sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria, glicosilación y fosforilación del producto génico. Estas células hospedadoras de mamíferos incluyen, pero sin limitación, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 292, 3T3, WI38 y, en particular, líneas celulares de cáncer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D y una línea celular de glándula mamaria normal, tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo. Antes que usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación vírico, pueden transformarse células hospedadoras con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, puede dejarse que las células modificadas genéticamente crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y, a continuación, se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para forman focos que sucesivamente puede clonarte y expandirse en líneas celulares. Puede ser ventajoso usar este procedimiento para modificar genéticamente líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo. Estas líneas celulares modificadas genéticamente pueden ser especialmente útiles para analizar y evaluar compuestos que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Pueden usarse varios sistemas de selección que incluyen, pero sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szyvalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22:817 (1980)) pueden emplearse en células tk^{-}, hgprt^{-} y aprt^{-}, respectivamente. También, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como la base de la selección de los siguientes genes: Dhfr, que confiere resistencia a metotretaxo (Wigler y col., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2071 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993) y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); mayo, 1993, TIB TECH 11 (5):155-215) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., Gene 30:147 (1984)). Los procedimientos conocidos normalmente en la técnica de la tecnología de ADN recombinante puede aplicarse de forma rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado y estos procedimientos se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Hijos, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) y en los capítulos 12 y 13 de Dracopoli y col. (editores), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley e Hijos, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150:1 (1981).
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Volumen 3 (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema del vector que expresa el anticuerpo es amplificable, aumenta el nivel de inhibición presente en el cultivo de células hospedadoras aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, también se aumentará la producción del anticuerpo (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
La célula hospedadora puede transfectarse conjuntamente con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de una cadena pesada y codificando el vector secundario un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan la expresión igual de los polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un vector único que codifica, y es capaz de expresar, ambos polipéptidos de la cadena pesada y ligera. En estas situaciones, la cadena ligera debería colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Köhler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Las secuencias que codifican las cadenas pesada y ligera puede comprende ADNc o ADN genómico.
Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención se ha producido en un animal, sinterizado químicamente o expresado de forma recombinante, puede purificarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, especialmente afinidad por el antígeno específico en proteína A y cromatografía de columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en este documento o, por otro lado, conocidas en la técnica, para facilitar la purificación.
La presente invención abarca anticuerpos fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes y no covalentes) a un polipéptido de la presente invención para generar proteínas de fusión. La fusión no necesita necesariamente estar dirigida, pero puede hacerte mediante secuencias enlazadoras. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para dirigir los polipéptidos de la presente invención a tipos de célula en particular, in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para receptores particulares de la superficie celular. Los anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la presente invención también pueden fusionarse in vitro en procedimientos de inmunoensayo y purificación usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harbor y col., y la publicación PCT WO 93/21232, documento EP 439.095; Naramura y col., Immunol. Lett. 39: 91-99 (1994); patente de EE.UU. 5.474.981; Gillies y col., PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell y col., J. Immunol. 146: 2446-2452(1991).
La presente invención además incluye composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo distintos de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse o conjugarse con una región Fc de un anticuerpo o una porción del mismo. La porción de anticuerpo fusionado con un polipéptido de la presente invención puede comprende la región constante, región bisagra, dominio CH1, dominio CH2 y dominio CH3 o cualquier combinación de dominios completos o porciones de los mismos. Los polipéptidos también pueden fusionarse o conjugarse con las porciones anteriores del anticuerpo para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas con los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros a través de puentes disulfuro entre las porciones Fc. Pueden hacerse formas multiméricas más grandes fusionando los polipéptidos con porciones de IgA e IgM. Se conocen en la técnica procedimientos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención con porciones de anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; documento EP 307.434; documento EP 367.166; publicaciones PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng y col., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995) y Vil y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992).
Como se describe, supra, los polipéptidos que se corresponde con un polipéptido, fragmento polipeptídico o variante de la ID SEC Nº 2 puede fusionarse o conjugarse con las porciones anteriores del anticuerpo para aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos o para su uso en inmunoensayos usando procedimientos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los polipéptidos correspondientes con la ID SEC Nº 2 pueden fusionarse o conjugarse con las porciones anteriores del anticuerpo para facilitar la purificación. Un ejemplo recogido describe proteínas quiméricas constituidas por los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas de mamíferos (documento EP 394.827; Traunecker y col., Nature 331:84-86 (1988)). Los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con un anticuerpo que tiene estructuras diméricas unidas por puentes disulfuro (debido a la IgG) también puede unirse y neutralizar a otras moléculas de forma más eficaz que la proteína o el fragmento proteico monomérico secretado sólo. (Fountoulakis y col., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es beneficiosa para terapia y diagnóstico y, de este modo, puede dar lugar a, por ejemplo, la mejora de las propiedades farmacocinéticas (documento EP A 232.262). Alternativamente, podría ser deseable la deleción de la parte Fc después de que se haya expresado, detectado y purificado la proteína de fusión. Por ejemplo, la porción Fc puede entorpecer la terapia y el diagnóstico si la proteína de fusión se usa como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, proteínas humanas, se han fusionados tales como la hIL-5, con porciones Fc con el fin de realizar ensayos de análisis de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5 (Véase, Bennett y col., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); Johanson y col., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995).
Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención pueden fusionarse con secuencias marcadores, tales como un péptido, para facilitar su purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, la etiqueta "HA" que se corresponde con un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson y col., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta "flag".
La presente invención además comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados como un agente diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse en diagnóstico, por ejemplo, para controlar el desarrollo o progresión de un tumor como parte de un procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse conjugando el anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones y metales iónicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede unirse o conjugarse directamente al anticuerpo (o a un fragmento del mismo) o indirectamente, mediante un intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.741.900 para metales iónicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como agentes diagnósticos, según la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa, los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, floresceina de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo y ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluye ^{125}I, ^{131}I, ^{111}In o ^{99}Tc.
Adicionalmente, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ión metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa tal como, por ejemplo, ^{213}Bi. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, porcaina, tetracaina, lidocaina, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercatopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo dacarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-dicloro diamino platino (II) cisplatino (DDP), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Los conjugados de la invención pueden usarse para modifican una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o el resto farmacéutico no se construye para limitar a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica, una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón-\alpha, interferón-\beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (Véase la publicación internacional Nº WO 97/33899), AIM II (Véase la publicación internacional Nº WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi y col., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Véase la publicación internacional Nº WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiagiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias granulocito-macrófago ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Los anticuerpos también pueden unirse a soportes sólidos, que son especialmente útiles para inmunoensayos o para la purificación del antígeno diana. Estos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, polivinilcloruro o polipropileno.
Las técnicas para conjugar estos restos terapéuticos a los anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (editores.) pág. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Edición.), Robinson y col. (editores.) pág. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (editores.) pág. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (editores.) pág. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como describe Segal en la patente de EE.UU. Nº 4.676.980.
Puede usarse como agente terapéutico un anticuerpo, con o sin un resto terapéutico conjugado a éste, administrado sólo o en combinación con un factor(es) citotóxico(s) y/o citocina(s).
La presente invención también abarca la creación de anticuerpos sintéticos dirigidos frente a los polipéptidos de la presente invención. Un ejemplo de anticuerpos sintéticos se describe en Radrizzani, M. y col., Medicina (Aires), 59(6):753-8, (1999)). Recientemente, se ha descrito una nueva clase de anticuerpos sintéticos y se han denominado como polímeros molecularmente impresos (PMI) (Semorex. Inc.). A menudo se usan anticuerpos, péptidos y enzimas como elementos de reconocimiento molecular en sensores químicos y biológicos. Sin embargo, la pérdida de su estabilidad y de los mecanismos de transducción de señal, limitan su uso como dispositivos sensibles. Los polímeros molecularmente impresos (PMI) son capaces de mimetizar la función de los receptores biológicos pero con menos limitaciones de estabilidad. Estos polímeros proporcionan alta sensibilidad y selectividad mientras que mantienen una excelente estabilidad térmica y mecánica. Los PMI tienen la capacidad de unirse a moléculas pequeñas y dirigirse a moléculas tales como moléculas orgánicas y proteínas con igual o mayor potencia que la de los anticuerpos naturales. Estos "super" PMI tienen afinidades mayores para sus dianas y, de esta manera, requieren concentraciones menores para una unión eficaz.
Durante la síntesis, los PMI se imprimen de modo que tengan un tamaño, forma, carga y grupos funcionales complementarios con la diana seleccionada usando la molécula diana en si (tal como un polipéptido, anticuerpo, etc.) o una sustancia que tenga una estructura muy similar, como su "cuño" o "molde". Los PMI puede derivatizarse con los mismos reactivos permitidos para los anticuerpos Por ejemplo, pueden recubrirse perlas o pocillos con "super" PMI fluorescentes para su uso en separaciones o ensayos muy sensibles, o para su uso en análisis de proteínas de alto rendimiento.
Además, los PMI basados en la estructura del polipéptido(s) de la presente invención pueden ser útiles para el análisis de compuestos que se unen al polipéptido(s) de la invención. Estos PMI podría servir para el papel de "receptor" sintético mimetizando la arquitectura nativa del polipéptido. De hecho, se ha demostrado de hecho la capacidad de un PMI para servir a la función de receptor sintético para el receptor de estrógenos (Ye, L., Yu, Y., Mosbach, K., Analyst., 126(6):7605, (2001); Dickert, F, L., Hayden, O., Halikias, K, P, Analyst., 126(6):766-71, (2001)). Un receptor sintético puede mimetizar en su totalidad (por ejemplo, como la proteína completa) o mimetizarse como una serie de péptidos cortos que se corresponden con la proteína (Rachkov, A., Minoura, N, Biochim, Biophys, Acta., 1544 (1-2):255-66, (2001)). Este PMI receptor sintético puede emplearse en uno o más de los procedimientos de análisis descritos en otra parte de este documento.
También se ha demostrado que los PMI son útiles para "detectar" la presencia de su molécula mimetizada (Cheng, Z., Wang, E., Yang, X, Biosens, Bioelectron., 16 (3):179-85, (2001); Jenkins, A, L., Yin, R., Jensen, J. L, Analyst., 126 (6):798-802, (2001); Jenkins, A, L., Yin, R., Jensen, J. L, Analyst., 126 (6):798-802, (2001)). Por ejemplo, puede usarse un PMI diseñado usando un polipéptido de la presente invención en ensayos diseñados para identificar y, potencialmente, cuantificar, el nivel de dicho polipéptido en una muestra. Este PMI puede usarse con sustituto para cualquier componente descrito en los ensayos o kits, proporcionados en este documento (por ejemplo, ELISA, etc.).
Pueden emplearse varios procedimientos para crear PMI para un receptor, ligando, polipéptido, péptido, molécula orgánica especifica. Esteban y col describen varios procedimientos preferidos en J. Anal. Chem. 370(7):795-802, (2001). En la técnica se conocen procedimientos adicionales y están incluidos en la presente invención, tales como, por ejemplo, Hart, B, R., Shea, K, J., J. Am. Chem, Soc., 123(9)2072-3, (2001) y Quaglia, M., Chenon, K., Hall, A, J., De, Lorenzi, E., Sellergren, B, J. Am. Chem, Soc., 123(10):2146-54, (2001).
Usos de anticuerpos dirigidos frente a polipéptidos de la invención
Los anticuerpos de la presente invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden usarse en ensayos diagnósticos para detectar la presencia o cuantificación de los polipéptidos de la invención en una muestra. Este ensayo diagnóstico puede comprende al menos dos etapas. La primera, someter una muestra con el anticuerpo, en donde la muestra es un tejido (por ejemplo, humano, animal, etc.), fluido biológico (por ejemplo, sangre, orina, esputo, semen, líquido amniótico, saliva, etc.), extracto biológico (por ejemplo homogeneizado tisular o celular, etc.) a un microchip de proteína (por ejemplo, véase Arenkov P y col., Anal Biochem., 278(2):123-131 (2000)) o a una columna cromatográfica, etc. Y una segunda etapa que implica la cuantificación del anticuerpo unido al sustrato. Alternativamente, el procedimiento puede implicar adicionalmente una primera etapa de unión del anticuerpo, covalente, electrostática o reversiblemente a un soporte sólido y una segunda etapa de sujetar el anticuerpo unido a la muestra, como se define anteriormente y en otra parte de este documento.
Se conocen en la materia diversas técnicas diagnósticas de ensayo, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., (1987), pág. 147-158). Los anticuerpos usados en los ensayos diagnósticos pueden estar marcados con un resto detectable. El resto detectable podría ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{2}H, ^{14}C, ^{32}P o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceina, rodamina o luciferina, o una enzima, tal como, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde o peroxidasa de rábano picante. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con el resto detectable, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochem., 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Metho., 40:219(1981) y Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30: 407 (1982).
Los anticuerpos dirigidos frente a los polipéptidos de la presente invención son útiles para la purificación por afinidad de estos polipéptidos a partir de cultivos de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos frente a un polipéptido en particular se inmovilizan en un soporte adecuado, tales como una resina de Sephadex o un papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Entonces, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene los polipéptidos que se van a purificar y, a continuación el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra, excepto los polipéptidos deseado, que se unen al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el polipéptido deseado del anticuerpo.
Ensayos para la unión del anticuerpo
Puede ensayarse la unión inmunoespecífica de los anticuerpos de la invención mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los inmunoensayos que puede usarse incluyen, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas tales como inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción unido a enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos con proteína A, por nombrar algunos. Estos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel y col., editores, 1994; Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York). A continuación se describen brevemente ejemplos de inmunoensayos (pero no pretender ser limitantes).
Los protocolos de inmunoprecipitación generalmente comprenden lisar una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (NP-40 o Triton X-100 al 1%, deoxicolato sódico al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 0,15 M, fosfato sódico 0,01 M a pH 7,2, Trasilol al 1%), suplementado con inhibidores de proteínfosfatasas o de proteasas (por ejemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato sódico), añadir el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 1-4 horas) a 4ºC, añadir perlas de proteína A y/o proteína G Sepharose al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 4ºC, lavar las perlas en tampón de lisis y resuspender las perlas en tampón de muestra con SDS. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno en particular puede evaluarse, por ejemplo, mediante análisis por inmunotransferencia. Un experto en la materia conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la unión del anticuerpo a un antígeno y disminuir el fondo (por ejemplo, preaclarando el lisado celular con perlas de sepharose). Para una descripción adicional, con respecto a los protocolos de inmunoprecipitación, véase, por ejemplo, Ausubel y col, editores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York en 10.16.1.
Los análisis por inmunotransferencia generalmente comprenden preparar las muestras de proteína, someter las muestras de proteína a electroforesis en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE al 8%-20% dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como de nitrocelulosa, PVDF o nailon, bloquear la membrana en solución de bloqueo (por ejemplo, PBS con BSA o leche desnatada al 3%), lavar la membrana en tampón de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloquear la membrana con el anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce al anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano) conjugado con un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o molécula radiactiva (por ejemplo, ^{32}P o ^{125}I) diluida en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado y detectar la presencia del antígeno. Un experto en la materia conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para una descripción adicional con respecto a los protocolos de inmunoprecipitación, véase, por ejemplo, Ausubel y col, editores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York en 10.8.1.
Los ELISA comprende preparar el antígeno, recubrir el pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable tales como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) al pocillo, incubar durante un periodo de tiempo y detectar la presencia del antígeno. En los ELISA, el anticuerpo de interés no tiene que estar conjugado con un compuesto detectable; en su lugar, puede añadirse al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable. Adicionalmente, en lugar de recubrir el pocillo con el antígeno, éste puede estar recubierto de anticuerpo. En este caso, puede añadirse al pocillo recubierto un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable tras la adición del antígeno de interés. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada así como otras variaciones de los ELISA, conocidas en la técnica. Para una descripción adicional con respecto a los ELISA, véase, por ejemplo, Ausubel y col, editores, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York en 11.2.1.
La afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno y la velocidad de interacción anticuerpo-antígeno pueden determinarse mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de un antígeno marcado (por ejemplo, ^{3}H o ^{125}I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno sin marcar y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo de interés por un antígeno en particular y las velocidades de unión pueden determinarse a partir de los datos del análisis de las gráficas de Scatchard. La competición con un anticuerpo secundario también puede determinarse usando radioinmunoensayos. En este caso, el antígeno se incuba con un anticuerpo de interés conjugado con un compuesto marcado (por ejemplo, ^{3}H o ^{125}I) en presencia de cantidades crecientes de un anticuerpo secundario sin marcar.
Administración terapéutica/profiláctica y composiciones
También se describen los procedimientos de tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto o composición farmacéutica de la invención.
Anteriormente se describen formulaciones y procedimientos de administración que pueden emplearse cuando el compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobulina; pueden seleccionarse formulaciones y vías de administración apropiadas adicionales a partir de las descritas a continuación en este documento.
Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc. Los procedimientos de introducción incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos o composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección intravenosa rápida, mediante absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser por vía sistémica u oral. Además, puede desearse introducir los compuestos o composiciones farmacéutica de la invención en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular e intratecal, la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommanya. También puede emplearse administración pulmonar, por ejemplo, usando un inhalador o un nebulizador, y formulación con un agente de aerosolización.
En una realización específica, puede desearse administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesita del tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito tras la cirugía, por inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio, o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas de silastic o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una proteína, incluyendo un anticuerpo, de la invención, debe tenerse la precaución de usar materiales en los que no se absorba la proteína.
En otra realización, el compuesto o composición puede administrarse en una vesícula, en particular, un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein y Fidler (editores.), Liss, Nueva York, pág. 353-365 (1989); López-Berestein, ibid., pág. 317-327; véase generalmente ibid).
Aún en otra realización, el compuesto o composición puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (editores), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (editores.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 61 (1983); véase también Levy y col., Science 228: 190 (1985); During y col., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Aún en otra realización, puede colocarse un sistema de liberación controlada en la proximidad de la diana terapéutica, es decir, en el cerebro, requiriendo, de esta manera, sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pág. 115-138 (1984)).
Otros sistemas de liberación controlada se explican en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
En una realización específica donde el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndola como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarse de modo que se convierta en intracelular, por ejemplo, usando un vector retrovírico (véase la patente de EE.UU. Nº 4.980.286), mediante inyección directo, o usando bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica, Biolístic, Dupont) o recubriendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo unido a un péptido similar a una caja homeótica que se sabe entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, puede introducirse intracelularmente un ácido nucleico e incorporarse al ADN de la célula hospedadora para su expresión, mediante recombinación homóloga.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o Estatal, o incluido en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más en particular, en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Estos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se prefiere el agua como vehículo cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse como vehículos líquidos, especialmente para soluciones inyectables, soluciones salinas y soluciones acuosas dextrosa y glicerol. Los excipientes farmacéuticamente adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes y emulsionantes o agentes de tamponamiento de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación mantenida, y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo de modo que se proporciona la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de
administración.
En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada par a la administración por vía intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración por vía intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para reducir el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran separadamente o mezclados en forma de unidad de dosificación, por ejemplo, como un polvo liofilizado en seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sello que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición es para su administración mediante infusión, puede suministrase con una botella de infusión que contenga agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.
Los compuestos de la invención pueden formularse como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y las formadas con cationes tales como los derivados de hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico, férrico, isoproliamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad del compuesto de la invención que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad anómala de un polipéptido de la invención, puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptima. La dosis exacta que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y se decidirá según la valoración del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces puede extrapolarse a las curvas dosis-respuestas derivadas de los sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales.
Para los anticuerpos, típicamente, la dosificación administrada a un paciente es 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificación administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente, de 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga en el cuerpo humano que los anticuerpos de otra especie debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos extraños. De este modo, a menudo es posible administrar dosis menores y menos frecuentes de anticuerpos humanos. Adicionalmente, la dosificación y frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención pueden reducirse potenciando la captación y penetración tisular (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
La invención además se refiere a envases o kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos d uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente, asociado con este recipiente(s) puede haber una nota en la forma establecida por una agencia gubernamental para la regulación de la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para la administración en humanos.
Diagnóstico y adquisición de imágenes con anticuerpos
Pueden usarse anticuerpos marcados, derivados y análogos de los mismos, que se unen específicamente a un polipéptido de interés, con fines diagnósticos para detectar, diagnosticar o controlar enfermedades, trastornos y/o dolencias asociadas con la expresión anómala y/o actividad de un polipéptido de la invención. La invención proporciona la detección de expresión anómala de un polipéptido de interés, que comprende (a) ensayar la expresión del polipéptido de interés en las células o en el fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos específicos del polipeptídico de interés y (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génico patrón, en donde un aumento o disminución del nivel de expresión génica del polipéptido ensayado en comparación con el nivel de expresión patrón es indicativo de la expresión anómala.
La invención proporciona un ensayo diagnóstico in vitro para diagnosticar un trastorno que comprende (a) ensayar la expresión del polipéptido de interés en las células o en el fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos específicos del polipeptídico de interés y (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génico patrón, en donde un aumento o disminución del nivel de expresión génica del polipéptido ensayado en comparación con el nivel de expresión convencional es indicativo de la expresión anómala. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de transcripción en una biopsia de tejido a partir de un individuo puede indicar una predisposición al desarrollo de la enfermedad o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamientos agresivos tempranos para prevenir, por tanto, el desarrollo o progresión adicional del cáncer.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse para medir los niveles de proteína en una muestra biológica usando procedimientos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Jalkanen y col., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen y col., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros procedimientos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica proteica incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Se conocen en la técnica marcadores para el ensayo de anticuerpos adecuados e incluyen marcadores enzimáticos, tales como oxidasa glucosa; radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio (^{99}Tc); marcadores luminiscentes, tales como luminol y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceina y rodamina, y biotina.
Un aspecto de la invención es la detección y diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anómala de un polipéptido de interés en una animal, preferiblemente un mamífero y, más preferiblemente, un humano. En una realización, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de una molécula marcada que se une específicamente al polipéptido de interés; b) esperar un intervalo de tiempo tras la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en el sujeto en sitios donde se expresa el polipéptido (y para que la molécula marcada no unida se aclare del nivel de fondo); c) determinar el nivel de fondo y d) detectar la molécula marcada en el sujeto, de modo que la detección de una molécula marcada sobre el nivel basal indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno en particular asociado con la expresión anómala del polipéptido de interés. El nivel de fondo puede determinarse mediante diversos procedimientos que incluyen, comparar la cantidad de molécula marcada detectada con un valor patrón determinado previamente en un sistema en particular.
Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de adquisición de imagen usado, determinarán la cantidad de resto de formación de imagen necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada normalmente oscilará de aproximadamente 5 a 20 milicurios de ^{99m}Tc. A continuación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará preferiblemente en una localización de células que contiene la proteína específica. La adquisición de imágenes tumorales in vivo se describen en S.W. Burchiel y col., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B.A. Rhodes, editores., Masson Publishing Inc. (1982)).
Dependiendo de diversas variables, incluyendo el tipo de marcador usado y el modo de administración, el intervalo de tiempo que sigue a la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferiblemente en sitios del sujeto y para que la molécula marcada no unida se aclare hasta un nivel de fondo es de 6 a 48 horas, de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otra realización, el tiempo de intervalo tras la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días.
En una realización, el control de la enfermedad o trastorno se realiza repitiendo el procedimiento de diagnostico de la enfermedad o la enfermedad, por ejemplo, un mes después del diagnóstico iniciales, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.
La presencia de la molécula marcada puede detectarse en el paciente usando procedimientos de exploraciones in vivo conocidos en la técnica. Estos procedimientos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos serán capaces de determinar el procedimiento apropiado para detectar un marcador en particular. Los procedimientos y dispositivos que pueden usarse en los procedimientos diagnósticos de la invención incluyen, pero sin limitación, tomografía computerizada (CT), exploración del organismo completo, tal como tomografía por emisión de positrones (PET); adquisición de imágenes por resonancia magnética (MRI) y sonografía.
En una realización específica, la molécula se marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación (Thurston y col., patente de EE.UU. Nº 5.441.050). En otra realización, la molécula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de exploración sensible a la fluorescencia. En otra realización, la molécula está marcada con un metal emisor de positrones y se detecta en la patente usando tomografía por emisión de positrones. Aún en otra realización, la molécula se marca con un marcador paramagnético y se detecta en un paciente usando adquisición de imágenes por resonancia magnética (MRI).
Proteínas de fusión
Un polipéptido de la presente invención puede usarse para generar proteínas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención, cuando se fusiona con una segunda proteína, puede usarse como una etiqueta antigénica. Pueden usarse anticuerpos obtenidos frente al polipéptido de la presente invención para detectar indirectamente la segunda proteína mediante la unión al polipéptido. Además, debido a que ciertas proteínas se dirigen a localizaciones celulares sobre la base de señales de transporte, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse como moléculas de dirección una vez que se fusiona con otras proteínas.
Los ejemplos de dominios que puede fusionarse con los polipéptidos de la presente invención incluyen no sólo secuencias señal heterólogas, sino también otras regiones funcionales heterólogas. La fusión no necesita necesariamente estar dirigida, pero esto puede hacerte mediante secuencias enlazadoras.
Además, las proteínas de fusión también pueden manipularse genéticamente para mejorar las características del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, puede añadirse al extremo N-terminal del polipéptido una región de aminoácidos adicionales, aminoácidos especialmente cargados, para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación a partir de la célula hospedadora, o en la manipulación y conservación posteriores. Pueden añadirse al polipéptido restos peptídicos para facilitar la purificación. Estas regiones pueden retirarse antes de la preparación final del polipéptido. De forma similar, pueden introducirse sitios de escisión de péptidos entre estos restos peptídicos, que adicionalmente pueden someterse a la actividad proteasa para retirar dicho péptido(s) de la proteína de la presente invención. La adición de los restos peptídicos, incluyendo los sitios de escisión peptídico, para facilitar el manejo de los polipéptidos son técnicas familiares y rutinarias de la materia.
Además, los polipéptidos de la presente invención, incluyendo fragmentos y, específicamente epítopes, pueden combinarse con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgM) o porciones de los mismos (CH1, CH2, CH3 y cualquier combinación de los mismos, incluyendo dominios completos y porciones de los mismos) dando lugar a polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran in vivo una semivida aumentada. Un ejemplo recogido describe proteínas quiméricas constituidas por los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de mamíferos (documento EP A 394.827; Traunecker y col., Nature 331:84-86 (1988).) Las proteínas de fusión que tiene estructuras diméricas unidas por puentes disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficaces en la unión y neutralización de otras moléculas que la proteína monomérica secretada o el fragmento proteico sólo. (Fountoulakis y col., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995).)
De forma similar, el documento EP-A-0 464 533 (equivalente al documento canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de la región constante de moléculas de inmunoglobulinas junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es beneficiosa para terapia y diagnóstico y, de este modo, puede dar lugar a, por ejemplo, la mejora de las propiedades farmacocinéticas (documento EP A 0232 262). Alternativamente, podría ser deseable la deleción de la parte Fc de la proteína de fusión después de que se haya expresado, delecionado y purificado la proteína de fusión. Por ejemplo, la porción Fc puede entorpecer la terapia y el diagnóstico si la proteína de fusión se usa como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionados proteínas humanas, tales como la hIL-5, con porciones Fc con el fin de realizar ensayos de análisis de alto rendimiento para identificar antagonistas de la hIL-5 (Véase, D. Bennett y col., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson y col., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)).
Además, los polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse con secuencias marcadoras (también denominadas "etiquetas"). Debido a la disponibilidad de anticuerpos específicos para estas "etiquetas", la purificación del polipéptido de fusión de la invención y/o su identificación se facilitan significativamente debido a que no se requieren anticuerpos específicos de los polipéptidos de la invención. Esta purificación puede ser en forma de una purificación por afinidad en la que está presente un anticuerpo antietiqueta u otro tipo de matriz de afinidad (por ejemplo, un anticuerpo antietiqueta unido a la matriz de una columna de flujo) que se una a la etiqueta epítope presente. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona purificación conveniente de la proteína de fusión. Otro péptido etiqueta útil para la purificación, la etiqueta "HA", se corresponde con un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson y col., Cell 37:767 (1984)).
El experto conocerá la existencia de otras "etiquetas" que podrían sustituirse fácilmente a las etiquetas referidas anteriormente para la purificación y/o identificación de polipéptidos de la presente invención (Jones C. y col., J. Chromatogr A. 707(1):3-22 (1995)). Por ejemplo, la etiqueta c-myc y los anticuerpos para la misma 8F9, 3C7, 6E10, G4m B7 y 9E10 (Evan y col., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616 (1985)); la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y sus anticuerpos (Paborsky y col., Protein Engineering, 3 (6):547-553 (1990), el péptido Flag (es decir, el octapéptido de secuencia DYKDDDDK (ID SEC Nº 27), (Hopp y col., Biotech. 6:1204-1210 (1988); el epítope peptídico KT3 (Martin y col., Science, 255:192-194 (1992)); el epítope peptídico \alpha-tubulina (Skinner y col., J. Biol. Chem., 266:15136-15166, (1991)); la etiqueta peptídica de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Sci. USA, 87:6363-6397 (1990)), el epítope FITC (Zymed, Inc.), el epítope GFP (Zymed, Inc.) y el epítope Rodamina (Zymed, Inc.).
La presente invención también abarca la unión a la región codificadora de un polinucleótido de la presente invención de hasta nueve codones que codifican una serie repetida de hasta nueve aminoácidos arginina. La invención también abarca la derivatización química de un polipéptido de la presente invención con una serie repetida de hasta nueve aminoácidos arginina. Recientemente se ha demostrado que cuando esta etiqueta se une a un polipéptido, sirve como pase universal, que permite a los compuestos acceder al interior de las células sin derivatización ni manipulación adicional (Wender, P. y col., datos no publicados).
Las fusiones de proteínas que implican a polipéptidos de la presente invención, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, pueden usarse para los siguientes ejemplos no limitantes, localización subcelular de proteínas, determinación de interacciones proteína-proteína por medio de inmunoprecipitación, purificación de proteínas por medio de cromatografía de afinidad, caracterización funcional y/o estructural de proteínas. La presente invención también abarca la aplicación de anticuerpos específicos de hapteno para cualquiera de los usos referenciados anteriormente para epítopes de proteínas de fusión. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención podría derivatizarse químicamente para unir moléculas de hapteno (por ejemplo, DNP, (Zymed, Inc.)). Debido a la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos para estos haptenos, la proteína podría purificarse fácilmente usando, por ejemplo, inmunoprecipitación.
Los polipéptidos de la presente invención, además de anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos, pueden fusionarse con cualquiera de las diversas toxinas conocidas, y aún por determinar, tales como ricina, saponina (Mashiba H y col., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999; 886:233-5) o toxina de HC (Tonukari NJ y col., Plant Cell. 2000 Feb; 12(2):237-248), por ejemplo. Estas fusiones podrían usarse para administrar las toxinas a los tejidos deseados en los cuales existe un ligando o una proteína capaz de unirse a los polipéptidos de la invención.
La invención abarca la fusión de anticuerpos dirigidos frente a polipéptidos de la presente invención, incluyendo variantes y fragmentos de los mismos, con dichas toxinas para administrar la toxina a localizaciones específicas en una célula, a tejidos específicos y/o a especies específicas. Estos anticuerpos bifuncionales son conocidos en la técnica, aunque se puede encontrar una revisión que describe fusiones ventajosas adicionales, que incluye citas de procedimientos de producción en P. J. Hudson, Curr. Opp. In. Imm. 11:548-557, (1999). En este contexto, el término "toxina" puede extenderse para incluir cualquier proteína heteróloga, una molécula pequeña, radionucleótidos, fármacos citotóxicos, liposomas, moléculas de adhesión, glicoproteínas, ligandos, ligandos específicos de células o tejidos, enzimas, de agentes bioactivos, modificadores de la respuesta biológica, agentes antifúngicos, hormonas, esteroides, vitaminas, péptidos, análogos de péptidos, agentes antialergénicos, agentes antituberculosos, agentes antivirales, antibióticos, agentes antiprotozoos, quelatos, partículas radioactivas, iones radioactivos, agentes de contraste para rayos X, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y material genético. En vista de la presente descripción, un experto en la materia podría determinar si se puede usar cualquier "toxina" en particular en los compuestos de la presente invención. Los ejemplos de las "toxinas" adecuadas enumeradas anteriormente son sólo ilustrativos y no pretenden limitar las "toxinas" que pueden usarse en la presente invención.
De este modo, cualquiera de estas fusiones anteriores puede diseñarse usando los polinucleótidos o los polipéptidos de la presente invención.
Vectores, células hospedadoras y producción de proteínas
La presente invención también se refiere a vectores que contienen el polinucleótido de la presente invención, células hospedadoras y a la producción de polipéptidos mediante técnicas de recombinación. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, un plásmido, viral o un vector retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación defectiva. En el último caso, la propagación viral generalmente se produce sólo en células hospedadoras de complementación.
Los polinucleótidos pueden unirse a un vector que contenga un marcador seleccionable para la propagación en un hospedador. Generalmente, se introduce un vector plasmídico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empaquetar in vitro usando una línea celular empaquetadora apropiada y translucirse a continuación en células hospedadoras.
La inserción de polinucleótido debería unirse operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de los LTR retrovirales, por nombrar algunos. Los expertos conocerán otros promotores adecuados. Las construcciones de expresión contendrán, además, sitios para el inicio de la transcripción, terminación y en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificadora de las transcripciones expresados por las construcciones incluirán preferiblemente un codon de inicio de la transcripción al principio y un codon de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente al final del polipéptido que se va a traducir.
Como se indica, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Estos marcadores incluyen genes de dihidrofolato reductasa, G418 o de resistencia a neomicina para el cultivo de células eucarióticas y de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para el cultivo en E. coli y en otras bacterias. Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen, pero sin limitación, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium, células de hongos, tales como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (Nº de acceso de la ATCC 201178)); células de insecto, tales como células S2 de Drosophila y células Sf9 de Spodoptera; células animales, tales como CHO, COS, 293 y células de melanoma Bowes; y células vegetales. Se conocen en la técnica medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospedadoras descrita anteriormente.
Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles en QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene Cloning Systems, Inc. y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Los vectores de expresión preferidos para su uso en sistemas de levaduras incluyen, pero sin limitación, pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalfa, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, y PAO815 (todos disponibles en Invitrogen, Carlsbad, CA). Otros vectores adecuados serán fácilmente aparentes para los expertos en la materia.
La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede efectuarse mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Estos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis y col., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Se contempla específicamente que los polipéptidos de la presente invención pueden expresarse de hecho por una célula hospedadora carente de un vector recombinante.
Un polipéptido de esta invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Más preferiblemente, se emplea para la purificación cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC").
Los polipéptidos de la presente invención, y preferiblemente la forma secretada, también se pueden recuperar a partir de: Los productos purificados de fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células, aislados directamente o cultivados; productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas de recombinación a partir de un hospedador procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un resto de metionina inicial modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedador. De este modo, es bien conocido en la técnica que la metionina N-terminal codificado por el codon de inicio de la traducción se elimina generalmente con alta eficacia de cualquier proteína después de la traducción en todas las células eucarióticas. Mientras que la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas se elimina eficazmente en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas, este proceso de eliminación procariótico es ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al cual está unido covalentemente la metionina N-terminal.
En una realización, la levadura Pichia pastoris se usa para expresar el polipéptido de la presente invención en un sistema eucariótico. Pichia pastoris es una levadura metilotrófica que puede metabolizar metanol como su única fuente de carbono. La oxidación de metanol a formaldehído usando O_{2} es una etapa principal en la ruta de metabolización del metanol. Esta reacción está catalizada por la enzima alcohol oxidasa. Para metabolizar el metanol como su única fuente de carbono, Pichia pastoris debería generar altos niveles de alcohol oxidasa debido, en parte a la relativa baja afinidad de la alcohol oxidasa por el O_{2}. Por consiguiente, en un medio de crecimiento que depende del metanol como única fuente de carbono, la región promotora de uno de los dos genes de la alcohol oxidasa (AOX1) es muy activa. En presencia de metanol, la alcohol oxidasa producida por el gen AOX1 comprende hasta aproximadamente el 30% de la proteína soluble total en Pichia pastoris. Véase Ellis, S. B. y col., Mol. Cell. Biol. 5:1111-21 (1985); Koutz, P. J y col., Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J. F. y col., Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987). De este modo, una secuencia codificadora heteróloga, tal como, por ejemplo, un polinucleótido de la presente invención, bajo la regulación transcripcional de toda o parte de la secuencia reguladora de AOX1 se expresa a niveles excepcionalmente altos en la levadura Pichia que crece en presencia de metanol.
En un ejemplo, el vector plasmídico pPIC9K se usa para expresar el ADN que codifica un polipéptido de la invención, como se explica en este documento, en un sistema de la levadura Pichia esencialmente como se describe en "Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology", D. R. Higgins y J. Cregg, editores. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Este vector de expresión permite la expresión y secreción de una proteína de la invención en virtud del fuerte promotor de AOX1 unido al péptido señal (es decir, líder) de la secreción de la fosfatasa alcalina (PHO) de Pichia pastoris localizado antes del extremo 5' de un sitio de clonación múltiple.
Podrían usarse muchos otros vectores de levadura en lugar de pPIC9K, tales como, pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalfa, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K y PAO815, como fácilmente apreciará un experto en la materia, siempre que la construcción de expresión propuesta proporcione señales para la transcripción, traducción y secreción (si se desea) y similares localizadas apropiadamente, incluyendo un AUG en fase, si es necesario.
En otra realización, puede conseguirse un alto nivel de expresión de una secuencia codificadora heteróloga, tal como, por ejemplo, un polinucleótido de la presente invención, clonando el polinucleótido de la presente invención en un vector de expresión tal como, por ejemplo, pGAPZ o pGAPZalfa, y creciendo el cultivo de lavadura en ausencia de metanol.
Además de abarcar las células hospedadoras que contienen las construcciones del vector descritas en este documento, la invención también abarca células primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, especialmente de origen mamífero, que han sido manipuladas genéticamente para delecionar o sustituir material genético endógeno (por ejemplo, secuencia codificadora) y/o incluir material genético (por ejemplo, secuencias polinucleotídicas heterólogas) que se asocian de forma operativa con los polinucleótidos de la invención y que activa, altera y/o amplifica los polinucleótidos endógenos. Por ejemplo, se pueden usar técnicas conocidas en la materia para asociar de forma operativa regiones de control heterólogas (por ejemplo, promotores y/o potenciadores) y secuencias polinucleotídicas endógenas por medio de recombinación homóloga, que tiene como resultado la formación de una nueva unidad de transcripción (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.641.670, concedida el 24 de junio de 1997; la patente de EE.UU. Nº 5.733.761, concedida el 31 de marzo de 1998; la publicación internacional Nº WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; la publicación internacional Nº WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989) y Zijlstra y col., Nature 342: 435-438 (1989).
Además, los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, véase Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman y Co., N. Y. y Hunkapiller y col., Nature, 310:105-111 (1984)). Por ejemplo, se puede sintetizar un polipéptido que corresponde a un fragmento de una secuencia polipeptídica de la invención mediante el uso de un sintetizador peptídico. Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en la secuencia polipeptídica. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitación, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido \alpha-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahr, ácido 6-aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina, ácidos fluoroaminos, aminoácidos de diseño tales como aminoácidos \beta-metilo, aminoácidos Ca-metilo, aminoácidos Na-metilo y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro).
La invención describe polipéptidos que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas pueden realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.
Las modificaciones postraduccionales adicionales abarcadas por la invención incluye, por ejemplo, cadenas de carbohidratos unidas en N u O, procesamiento de extremos N-terminales o C-terminales, unión de restos químicos al esqueleto del aminoácido, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos unidos en N u O y la adición o deleción de un resto de metionina N-terminal como resultado de la expresión en la célula hospedadora procariótica. Los polipéptidos también pueden modificarse con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad que permite la detección y aislamiento de la proteína, la adición de fragmentos peptídicos etiquetados con un epítope (por ejemplo, FLAG, HA, GST, tiorredoxina, proteína de unión a maltosa, etc.), unión de etiquetas de afinidad, tales como biotina y/o estreptavidina, la unión covalente de restos químicos al esqueleto del aminoácido, procesamiento N o C-terminal de los extremos de los polipéptidos (por ejemplo, procesamiento proteolítico), deleción del resto de metionina N-terminal, etc.
La invención también proporciona derivados modificados químicamente de los polipéptidos de la invención que pueden proporcionar ventajas adicionales, tales como aumento de la solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido, o disminución de la inmunogenicidad (véase la patente de EE.UU. Nº 4.179.337). Los restos químicos para derivatización pueden seleccionarse a partir de polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol, copolímeros de etilénglicol/propilénglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Los polipéptidos pueden modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y puede incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.
La invención además describe la derivatización química de los polipéptidos de la presente invención, preferiblemente cuando el compuesto químico es un resto de polímero hidrófilo. Ejemplos de polímeros hidrófilos, incluyendo derivados, pueden ser aquellos que incluyen polímeros en los que las unidades de repetición contienen uno o más grupos hidroxi (polímeros polihidroxi), que incluyen, por ejemplo, alcohol polivinílico; polímeros en los las unidades de repetición contienen uno o más grupos amino (polímeros poliamina), que incluyen, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, proteínas y lipoproteínas, tales como albúmina y lipoproteínas naturales; polímeros en los que las unidades de repetición contienen uno o más grupos carboxi (polímeros policarboxi), que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa, ácido algínico y sus sales, tales como alginato sódico y cálcico, glicosaminoglicanos y sus sales, que incluyen sales del ácido hialurónico, derivados fosforilados y sulfonados de carbohidratos, material genético, tal como interleucina 2 e interferón, y oligómeros de fosforotioato; y polímeros en los que las unidades de repetición contienen uno o más restos de sacáridos (polímeros polisacáridos), que incluyen, por ejemplo, carbohidratos.
El peso molecular de los polímeros hidrófilos puede variar y generalmente es de aproximadamente 50 a aproximadamente 5.000.000, siendo preferidos los polímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 50.000. Los polímeros pueden estar ramificados o no. Los polímeros más preferidos tienen un peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 10.000, siendo los más preferidos los que tienen un peso molecular de 200 a aproximadamente 8.000.
Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más y otras menos que el peso molecular indicado) para su fácil manipulación y fabricación. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación mantenida deseada, los efectos, si tiene alguno sobre la actividad biológica, la fácil manipulación, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol en una proteína o análogo terapéutico).
Los polímeros adicionales preferidos que pueden usarse para derivatizar polipéptidos de la invención incluyen, por ejemplo, poli(etilénglicol) (PEG), poli(vinilpirrolidona), polioxómeros, polisorbato y alcohol polivinílico, siendo especialmente preferidos los polímeros PEG. Entre los polímeros PEG preferidos están los polímeros PEG que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 10.000. Más preferiblemente, los polímeros PEG tienen un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 8.000, siendo aún más preferidos los PEG 2.000, PEG 5.000 y PEG 8.000, que tienen pesos moleculares de 2.000, 5.000 y 8.000 respectivamente. Otros polímeros hidrófilos adecuados, además de los ejemplos anteriores, serán fácilmente aparentes a un experto en la materia en función de la presente descripción. En general, los polímeros usados pueden incluir polímeros que se pueden unir a los polipéptidos de la invención por medio de reacciones de alquilación o acilación.
Las moléculas de polietilenglicol (u otros restos químicos) deben unirse a la proteína teniendo en consideración los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Hay varios procedimientos de unión disponibles para los expertos en la materia, por ejemplo, el documento EP 0 401 384, incorporado en este documento como referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik y col., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (que describe la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilénglicol puede unirse covalentemente a través de restos de aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que puede unirse una molécula de polietilénglicol activada. Entre los restos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluirse restos de lisina y los restos de aminoácidos del extremo N-terminal; entre los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluirse restos de ácido aspártico y restos de aminoácidos del extremo C-terminal. También pueden usarse grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para la unión a moléculas de polietilénglicol. Para fines terapéuticos se prefiere la unión a un grupo amino, tal como la unión al grupo N-terminal o a la lisina.
Pueden desearse específicamente proteínas modificadas químicamente en el extremo N-terminal. Cuando se usa polietilénglicol como ejemplo de la presente composición, puede seleccionarse una molécula de polietilénglicol a partir de diversas moléculas (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción entre moléculas de polietilénglicol y moléculas de proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a realizar y el procedimiento para obtener la proteína seleccionada pegilada en el extremo N-terminal. El procedimiento de obtención de la preparación pegilada en el extremo N-terminal (es decir, separar si es necesario este resto de otros restos no monopegilados) puede ser mediante la purificación de material pegilado en el extremo N-terminal a partir de una población de moléculas de proteínas pegiladas. La modificación en el extremo N-terminal de proteínas seleccionadas modificadas químicamente pueden obtenerse mediante alquilación reductora, que explota la diferente reactividad de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al extremo N-terminal) disponibles para la derivatización en una proteína en particular. En las condiciones de reacción apropiadas, la derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N-terminal se consigue con un polímero que contiene un grupo carboxilo.
Como con los diversos polímeros ilustrado anteriormente, se contempla que los restos poliméricos pueden contener grupos funcionales además de, por ejemplo, los típicamente implicados en la unión de los restos poliméricos a los polipéptidos de la presente invención. Estas funcionalidades incluyen, por ejemplo, grupos carboxilo, amino, hidroxi y tiol. Estos grupos funcionales de los restos poliméricos pueden reaccionar posteriormente, si se desea, con materiales que generalmente son reactivos con estos grupos funcionales y que puede ayudar a la unión dirigida específica a tejidos en el organismo incluyendo, por ejemplo, tejidos enfermos. Los ejemplos de materiales que pueden reaccionar con grupos funcionales adicionales incluyen, por ejemplo, proteínas, incluyendo anticuerpos, carbohidratos, péptidos, glicopéptidos, glicolípidos, lectinas y nucleósidos.
Además de los restos de polímeros hidrófilos, el grupo químico usado para derivatizar los polipéptidos de la presente invención puede ser un resto sacárido. Los ejemplos de sacáridos que puede derivarse incluyen, por ejemplo, monosacáridos o alcoholes de azúcar, tales como eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, fructosa, sorbitol, manitol y sedoheptulosa, siendo los monosacáridos preferidos fructosa, manosa, xilosa, arabinosa, manitol y sorbitol y disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. Otros sacáridos incluyen, por ejemplo, inositol y grupos de cabeza del gangliósido. Otros sacáridos adecuados, además de los ejemplos anteriores, serán fácilmente aparentes para un experto en la materia en función de la presente descripción. En general, los sacáridos que pueden usarse para la derivatización incluyen sacáridos que pueden unirse a los polipéptidos de la invención por medio de reacciones de alquilación o acilación.
Además, la invención también abarca la derivatización de los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, con lípidos (incluyendo catiónicos, aniónicos, polimerizados, cargados, sintéticos, saturados, insaturados y cualquier combinación de los anteriores, etc.), agentes estabilizantes.
La invención abarca la derivatización de los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, con compuestos que pueden servir a una función estabilizante (por ejemplo, para aumentar la semivida de los polipéptidos en solución, para hacer que los polipéptidos sean más solubles en agua, para aumentar el carácter hidrófilo o hidrófobo de los polipéptidos, etc.). Los polímeros útiles como materiales estabilizantes pueden ser de origen natural, semisintéticos (natural modificado) o sintético. Los ejemplos de polímeros naturales incluyen polisacáridos naturales, tales como, por ejemplo, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos (tales como, por ejemplo, inulina), levano, fucoidano, carragenano, galatocarolosa, ácido péctico, pectinas, incluyendo amilosa, pululano, glicógeno, amilopectina, celulosa, dextrano, dextrina, dextrosa, glucosa, poliglucosa, polidextrosa, pustulano, quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma xantina, almidón y otros homopolímeros o heteropolímeros naturales diversos, tales como los que contienen uno o más de las siguientes aldosas, cetosas, ácidos o aminas: eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, dextrosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa, manitol, sorbitol, lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina y ácido neuramínico y derivados naturales de los mismos. Por consiguiente, los polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, proteínas, tales como albúmina, polialginatos y polímeros polilactida coglicolida. Los ejemplos de polímeros semisintéticos incluyen carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa y metoxicelulosa. Los ejemplos de polímeros sintéticos incluyen polifosfacenos, hidroxiapatitas, polímeros de fluoroapatita, polietilenos (tales como, por ejemplo, polietilénglicol (incluyendo, por ejemplo, la clase de compuestos denominados Pluronics. RTM, disponibles en el mercado en BASF, Parsippany, N.J.)), polioxietileno y polietilén tereftalato, polipropilenos (tales como, por ejemplo, polipropilénglicol), poliuretanos (tales como, por ejemplo, alcohol de polivinilo (PVA), cloruro de polivinilo y polivinilpirrolidona), poliamidas incluyendo nailon, poliestireno, ácidos polilácticos, polímeros de hidrocarburos fluorados, polímeros de carbono fluorado (tales como, por ejemplo, politetrafluoroetileno), acrilato, metacrilato y polimetilmetacrilato, y derivados de los mismos. Los procedimientos para la preparación de polipéptidos derivatizados de la invención que emplean polímeros como compuestos estabilizadores serán fácilmente aparentes para un experto en la materia, a la vista de la presente descripción, cuando se una a la información conocida en la técnica, tal como la que se describe y referencia en la Patente de EE.UU. Nº 5.205.290 de Unger.
Además, la invención abarca modificaciones adicionales de los polipéptidos de la presente invención. En la técnica se conocen tales modificaciones adicionales y se proporcionan específicamente, además de los procedimientos de derivatización, etc., en la patente de EE.UU. 6.028.066.
Los polipéptidos de la invención pueden ser monómeros o multímeros (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). Por consiguiente, la presente invención se refiere a monómeros y multímeros de los polipéptidos de la invención, su preparación y composiciones (preferiblemente terapéuticas) que los contienen. En realizaciones específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En realizaciones adicionales, los multímeros de la invención son al menos dímeros, al menos trímeros o al menos tetrámeros.
Los multímeros abarcados por la invención pueden ser homómeros o heterómeros. Según se usa en este documento, el término homómero se refiere a un multímero que contiene sólo polipéptidos correspondientes con la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2 o con la codificada por el ADNc contenido en un clon depositado (incluyendo fragmentos, variantes, variantes de ayuste o proteínas de fusión, correspondientes a estos polipéptidos descritos en este documento). Estos homómeros pueden contener polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes. En una realización específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene sólo polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica. En otra realización específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente. En realizaciones específicas, el multímero de la invención es un homodímero (por ejemplo, que contiene polipéptidos que tiene secuencias de nucleótidos idénticas o diferentes) y un homotrímero (por ejemplo, que contiene polipéptidos que tiene secuencias de aminoácidos idénticas y/o diferentes). En realizaciones adicionales, el multímero homomérico de la invención es al menos un homodímero, al menos un homotrímero o al menos un homotetrámero.
Según se usa en este documento, el término heterómero se refiere a un multímero que contiene uno o más polipéptidos heterólogos (es decir, polipéptidos de proteínas diferentes) además de los polipéptidos de la invención). En una realización específica, el multímero de la invención es un heterodímero, un heterotrímero o un heterotetrámero. En realizaciones adicionales, el multímero heteromérico de la invención es al menos un heterodímero, al menos un heterotrímero o al menos un heterotetrámero.
Los multímeros de la invención pueden ser el resultado de asociaciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes, y/o pueden unirse indirectamente mediante, por ejemplo, formación de liposomas. De este modo, en una realización, los multímeros de la invención, tales como, por ejemplo, homodímeros u homotrímeros, se forman cuando los polipéptidos de la invención entran en contacto uno con el otro en solución. En otra realización, los heteromultímeros de la invención, tales como, por ejemplo, heterotrímeros o heterotetrámeros, se forman cuando los polipéptidos de la invención ponen en contacto anticuerpos con los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos frente a la secuencia polipeptídica heteróloga de una proteína de fusión de la invención) en solución. En otras realizaciones, los multímeros de la invención se forman mediante asociaciones covalentes con y/o entre los polipéptidos de la invención. Estas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más restos de aminoácidos contenidos en la secuencia polipeptídica (por ejemplo, los que se enumeran en el listado de secuencias o contenidos en el polipéptido codificado por un clon depositado). En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entrecruzamientos entre restos de cisteína localizados en las secuencias polipeptídicas que interaccionan en el polipéptido nativo (es decir, que aparece de forma natural). En otro ejemplo, las asociaciones covalentes son la consecuencia de manipulación química o recombinante. Alternativamente, estas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más restos de aminoácidos contenidos en la secuencia polipeptídica heteróloga en una proteína de fusión de la invención.
En un ejemplo, las asociaciones covalentes se dan entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión de la invención (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. número 5.478.925). En un ejemplo específico, las asociaciones covalentes se dan entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión Fc de la invención (como se describe en este documento). En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de proteínas de fusión de la invención se dan entre la secuencia polipeptídica heteróloga de otra proteína que es capaz de forman multímeros asociados covalentemente, tal como por ejemplo, osteoprotegerina (véase, por ejemplo, la publicación internacional Nº WO 98/49305; cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad en este documento). En otra realización, se unen dos o más polipéptidos de la invención mediante enlaces peptídicos. Los ejemplos incluyen los enlazadores peptídicos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.073.627. Pueden producirse proteínas que comprende polipéptidos múltiples de la invención separados por enlazadores peptídicos usando tecnología convencional de ADN recombinante.
Otro procedimiento para preparar polipéptidos multiméricos de la invención implica el uso de polipéptidos de la invención fusionados con una secuencia polipeptídica en cremallera de leucina o en cremallera de isoleucina. Los dominios en cremallera de leucina y cremallera de Isoleucina son polipéptidos que promueven la multimerización de las proteínas en la que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en diversas proteínas de unión a ADN (Landschulz y col., Science 240:1756, (1988)) y desde entonces se ha encontrado en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas están péptidos naturales y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios en cremallera de leucina adecuados para producir proteínas multiméricas solubles de la invención son los descritos en la solicitud PCT WO 94/10308. Las proteínas de fusión recombinante que comprende un polipéptido de la invención fusionado con una secuencia polipeptídica que se dimeriza o trimeriza en solución, se expresan en células hospedadoras adecuadas y la proteína de fusión multimérica soluble resultantes se recupera del sobrenadante del cultivo usando técnicas conocidas en la materia.
Los polipéptidos triméricos de la invención pueden ofrecer la ventaja de una actividad biológica potenciada. Los restos de cremallera de leucina y restos de isoleucina preferidos son los que preferiblemente forman trímeros. Un ejemplo es una cremallera de leucina derivada de la proteína del surfactante pulmonar D (SPD), como se describe en Hoppe y col. (FEBS Letters 344:191, (1994) y en la solicitud de patente de EE.UU. Nº de Serie 08/446.922. Otros péptidos derivados de proteínas triméricas naturales puede emplearse para preparar los polipéptidos triméricos de la invención.
En otro ejemplo, las proteínas de la invención se asocian mediante interacciones entre las secuencias polipeptídicas Flag® contenidas en las proteínas de fusión de la invención que contienen la secuencia polipeptídica Flag®. En una realización adicional, las asociaciones de las proteínas de la invención se asocian mediante interacciones entre la secuencia polipeptídica heteróloga contenida en las proteínas de fusión Flag® de la invención y un anticuerpo anti-Flag®.
Los multímeros de la invención pueden generarse usando técnicas químicas conocidas en la materia. Por ejemplo, los polipéptidos que se desea estén contenidos en los multímeros de la invención puedan entrecruzarse químicamente usando moléculas enlazadoras y las técnicas de optimización de la longitud de moléculas enlazadoras son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. número 5.478.925). Adicionalmente, los multímeros de la invención pueden generarse usando técnicas conocidas en la materia para formar uno o más entrecruzamientos intermolecular entre los restos de cisteína localizados en la secuencia de los polipéptidos que se desea estén contenidos en el multímero (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. número 5.478.925). Adicionalmente, los polipéptidos de la invención pueden modificarse de forma rutinaria mediante la adición de cisteína o biotina al extremo C-terminal o N-terminal del polipéptido y pueden aplicarse técnicas conocidas en la materia para generar multímeros que contengan uno más de estos polipéptidos modificados (véase, por ejemplo la patente de EE.UU. número 5.478.925). Adicionalmente, puede aplicarse técnicas conocidas en la material para generar liposomas que contengan los componentes que se desea estén contenidos en el multímero de la invención (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. número 5.478.925).
Alternativamente, los multímeros de la invención pueden generarse usando técnicas de ingeniería genética conocidas en la materia. En una realización, los polipéptidos contenidos en los multímeros de la invención se producen de forma recombinante usando tecnología de proteína de fusión descrita en este documento o, por otro lado, conocido en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 5.478.925). En una realización específica, los polinucleótidos que codifican un homodímero de la invención se generan ligando una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de la invención a una secuencia que codifica un polipéptido enlazador y, a continuación, además a un polinucleótido sintética que codifica el producto traducido del polipéptido en orientación complementaria del extremo C-terminal original al extremo N-terminal (carente de la secuencia líder) (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.478.925. En otra realización, la técnicas recombinantes descritas en este documento o conocido, por otro lado, en la técnica, se aplican a la generación de polipéptidos recombinantes de la invención que contiene un dominio transmembrana (o péptido hidrófobo o señal) y que puede incorporar mediante técnicas de reconstitución de membranas en liposomas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 5.478.925).
Además, la inserción polinucleotídica de la presente invención podría estar unida de forma operativa a promotores "artificiales" o quiméricos y a factores de transcripción. Específicamente, el promotor artificial comprendería, o alternativamente estaría compuesto, cualquier combinación de elementos de secuencia de ADN que actúan en cis que son reconocidos por factores de transcripción que actúan en trans. Preferiblemente, los elementos de secuencia de ADN que actúan en cis y los factores de transcripción que actúan en trans son operativos en mamíferos. Adicionalmente, los factores de transcripción de actúan en trans de estos "promotores" artificiales también podrían ser de diseño "artificial" o quimérico en si y podrían actuar como activadores o represores de dicho promotor "artificial".
Usos de los polinucleótidos
Cada uno de los polinucleótidos identificados en este documento puede usarse como reactivos de numerosas maneras. La descripción siguiente podría considerarse como un ejemplo y utiliza técnicas conocidas.
Los polinucleótidos de la presente invención son útiles para la identificación de cromosomas. Existe una necesidad creciente de identificar nuevos marcadores cromosómicos, ya que actualmente se dispone de pocos reactivos marcadores de cromosomas, basados en los datos de secuencia real (polimorfismos repetidos). Cada polinucleótido de la presente invención puede usarse como un marcador cromosómico.
Brevemente, las secuencias pueden mapearse en los cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir de las secuencias mostradas en la ID SEC Nº 1. Los cebadores pueden seleccionarse usando análisis por ordenador de modo que los cebadores no se extiendan a más de un exón predicho del ADN genómico. A continuación, estos cebadores se usan para el análisis por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano que se corresponde con la ID SEC Nº 1 producirá un fragmento amplificable.
De forma similar, los híbridos somáticos proporcionan un procedimiento rápido de mapeo por PCR de los polinucleótidos en cromosomas en particular. Puede asignarse tres o más clones al día usando un único termociclador. Además, puede lograrse la sublocalización de los polinucleótidos con paneles de fragmentos cromosómicos específicos. Otras estrategias de mapeo génico que pueden usarse incluyen la hibridación in situ, preselección con cromosomas marcados separados por citometría de flujo y preselección mediante hibridación con bibliotecas de ADNc específicas de construcciones cromosómicas.
También puede lograrse la localización cromosómica precisa de los polinucleótidos usando hibridación fluorescente in situ (FISH) de una extensión cromosómica en metafase. Esta técnica usa polinucleótidos de no más de 500 ó 600 bases, sin embargo, se prefieren polinucleótidos de 2.000-4.000 pb. Para una revisión de esta técnica, véase Verma y col., "Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques", Pergamon Press, Nueva York (1988).
Para el mapeo de cromosomas, pueden usarse los polinucleótidos por separado (para marcar un único cromosoma o un único sitio de este cromosoma) o en paneles (para marcar múltiples sitios y/o cromosomas múltiples). Los polinucleótidos preferidos se corresponden con las regiones no codificadoras de los ADNc debido a que las secuencias codificadoras están más fácilmente conservadas en las familias de genes, aumentando de este modo la posibilidad de hibridación cruzada durante el mapeo cromosómico.
Una vez que se ha mapeado un polinucleótido en una localización cromosómica precisa, puede usarse la posición física del polinucleótido para el análisis de ligamiento. El análisis de ligamiento establece la coheredabilidad entre una localización cromosómica y la presentación de una enfermedad en particular. Se conocen en la técnica datos del mapeo de enfermedades- Asumiendo una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen cada 20 kb, un ADNc localizado con precisión en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de los 50-500 genes potencialmente causante.
De este modo, una vez que se establece la coheredabilidad, pueden examinarse diferencias en el polinucleótido y en el gen correspondiente entre organismos afectados y no afectados. En primer lugar, las alteraciones estructurales visibles en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones, se examinan en extensiones cromosómicas y mediante PCR. Si no existen alteraciones estructurales, se determina la presencia de mutaciones puntuales. Las mutaciones observadas en algunos o en todos los organismos afectados, pero no en organismos normales, indican que la mutación puede causa la enfermedad. Sin embargo, se requiere la secuenciación completa del polipéptido y del gen correspondiente a partir de varios organismos normales para distinguir la mutación de un polimorfismo. Si se identifica un nuevo polimorfismo, puede usarse este polipéptido polimórfico para análisis adicionales de ligamiento.
Además, usando polinucleótidos de la presente invención, puede evaluarse la expresión aumentada o disminuida del gen en organismos afectados en comparación con organismos no afectados. Puede usarse cualquiera de estas alteraciones (expresión alterada, reordenamiento cromosómico o mutación) como marcador de diagnóstico o pronóstico.
De este modo, la invención también proporciona un procedimiento diagnóstico in vitro útil durante el diagnóstico de un trastorno, que implica medir del nivel de expresión de los polinucleótidos de la presente invención en células o fluidos corporales de un organismo y comparar el nivel de expresión génica medida con un nivel patrón de nivel de expresión del polinucleótido, por el cual un aumento o descenso en el nivel de expresión génica en comparación con el patrón es indicativo de un trastorno.
Por "medir el nivel de expresión de un polinucleótido de la presente invención" se pretende medir o estimar cualitativa o cuantitativa el nivel del polipéptido de la presente invención o el nivel del ARNm que codifica el polipéptido en una primera muestra biológica directa (por ejemplo, determinando o estimando el nivel absoluto de proteína o el nivel de ARNm) o relativamente (por ejemplo, comparando con el nivel del polipéptido o el nivel del ARNm en una segunda muestra biológica). Preferiblemente, se mide o estima el nivel de polipéptido o el nivel de ARNm en la primera muestra biológica, y se comparan con un nivel de polipéptido o ARNm patrón, tomándose el patrón de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno y habiéndose determinado promediando los niveles de una población de organismos que no tienen el trastorno. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel del polipéptido o el nivel de ARNm patrón, puede usarse repetidamente como patrón para comparación.
Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida a partir de un organismo, fluidos corporales, línea celular, cultivo tisular u otra fuente que contiene el polipéptido o ARNm de la presente invención. Como se indica, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como los siguientes ejemplos no limitantes, esputo, líquido amniótico, orina, saliva, leche materna, secreciones, líquido intersticial, sangre, suero, líquido espinal, etc.) que contienen el polipéptido de la presente invención, y otras fuentes de tejido donde se encuentra que se expresa el polipéptido de la presente invención. Se conocen en la técnica procedimientos para obtener biopsias de tejidos y de fluidos corporales. Cuando la muestra biológica incluye ARNm, la fuente preferida es una biopsia de tejido.
El procedimiento(s) proporcionado anteriormente puede, preferiblemente aplicarse, en un procedimiento diagnóstico y/o kits en los que los polinucleótidos y/o polipéptidos se unen a un soporte sólido. En un procedimiento ilustrativo, el soporte puede ser un "chip génico" o un "chip biológico" como se describe en la patentes de EE.UU. 5.837.832, 5.874.219 y 5.856.174. Adicionalmente, este chip génico con polinucleótidos de la presente invención unidos puede usarse para identificar polimorfismos entre las secuencias polinucleotídicas, con polinucleótidos aislados de un sujeto de ensayo. El conocimiento de estos polimorfismos (es decir, su localización, así como su existencia) podría ser beneficiosa para identificar los loci de la enfermedad de muchos trastornos, incluyendo enfermedades y dolencias proliferativas. Este procedimiento se describe en las patentes de EE.UU. 5.858.659 y 5.856.104.
La presente invención abarca polinucleótidos de la presente invención que se sintetizan químicamente o se reproducen como ácidos nucleicos peptídicos (APN) o según otros procedimientos conocidos en la técnica. El uso de APN podría servir como la forma preferida si se incorporan los polinucleótidos a un soporte sólido o a un chip génico. Para los fines de la presente invención, un ácido nucleico peptídico (APN) es un análogo de ADN de tipo poliamida y la unidades monoméricas de adenina, guanina, timina y citosina se encuentran en el mercado (Perceptive Biosystems). Ciertos componentes del ADN, tal como derivados de fósforo, óxidos de fósforo o desoxirribosa, no están presentes en los APN. Como describen P. E. Nielsen, M. Egholm, R.H. Berg y O. Buchardt, Science 254, 1497 (1991) y M. Egholm, O., Buchardt, L. Christensen, C., Behrens, S. M. Freier, D. A. Driver, R. H. Berg, S. K. Kim, B. Norden y P. R. Nielsen, Nature 365, 666 (1993), los APN se unen específica y fuertemente a cadenas de ADN complementarias y no son degradadas por nucleasas. De hecho, el APN se une al ADN más fuertemente que el ADN en sí. Esto probablemente es porque no hay repulsión electrostática entre las dos cadenas y también el esqueleto poliamida es más flexible. Debido a esto, los dupletes APN/ADN se unen en un intervalo más amplio de condiciones rigurosas que los dupletes ADN/ADN, haciendo más fácil realizar la hibridación multiplete. Pueden usarse sondas más pequeñas que con ADN, debido a las características de unión más fuerte de los híbridos APN:ADN. Además, es más probable que puedan determinarse errores de apareamiento de una única base con hibridación APN/ADN debido a que un único error de apareamiento en un APN/ADN 15 mer disminuye el punto de fusión (T_{m}) de 8º-20ºC frente a 4º-16ºC para el duplete ADN/ADN 15-mer. También, la ausencia de grupos cargados en APN significa que la hibridación puede darse a fuerzas iónicas bajas y reduce la posible interferencia de la sal durante el análisis.
Además de lo anterior, puede usarse un polinucleótido para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ADN o ARN complementario. Las técnicas complementarias se explican, por ejemplo, en Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); ``Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988). La formación de triple hélice se explica en, por ejemplo, Lee y col., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney y col., Science 241:456 (1988) y Dervan y col., Science 251:1360 (1991). Ambos procedimientos dependen de la unión del polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Para estas técnicas, los polinucleótidos preferidos normalmente son oligonucleótidos de 20 a 40 bases de longitud y son complementarios de la región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, véase Lee y col., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney y col., Science 241:456 (1988) y Dervan y col., Science 251:1360 (1991)) y con el ARNm en sí (complementario - Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); ``Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). La formación de triple hélice óptimamente da lugar a un corte en la transcripción de ARN a partir de ADN, mientras que la hibridación con ARN complementario bloquea la traducción de una molécula de ARNm a polipéptido. Ambas técnicas son eficaces en sistemas modelo y la información descrita en este documento puede usarse para diseñar polinucleótidos complementarios o de triple hélice en un esfuerzo por tratar o prevenir una enfermedad.
La presente invención abarca la adición de una señal de localización nuclear unida de forma operativa al extremo 5', extremo 3' o a cualquier localización de éste, de cualquiera de los oligonucleótidos, oligonucleótidos complementarios, oligonucleótidos de triple hélice, ribozimas, oligonucleótidos APN y/o polinucleótidos de la presente invención. Véase, por ejemplo, G. Cutrona y col., Nat. Biotech., 18:300-303, (2000).
Los polinucleótidos de la presente invención son también útiles en terapia génica. Un objetivo de la terapia génica es insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectuoso, en un esfuerzo por corregir el defecto genético. Los polinucleótidos descritos en la presente invención ofrecen un medio para dirigirse hacia estos defectos génicos de manera muy exacta. Otro objetivo es insertar un nuevo gen que no estaba presente en el genoma del hospedador, produciendo de este modo una nueva característica en la célula hospedadora. En un ejemplo, las secuencias polinucleotídicas de la presente invención pueden usarse para construir oligonucleótidos de ARN/ADN quiméricos que se corresponden con estas secuencias, diseñados específicamente para inducir los mecanismos de reparación de falta de apareamiento de la célula hospedadora en un organismo tras una inyección sistémica, por ejemplo (Bartlett, F., J. y col., Nat. Biotech, 18:615-622 (2000). Estos oligonucleótidos de ADN/ADN podrían diseñarse para corregir defectos genéticos en ciertas cepas hospedadoras y/o introducir fenotipos deseados en el hospedador (por ejemplo, la introducción de un polimorfismo específico en un gen endógeno correspondiente con un polinucleótido de la presente invención que puede mejorar y/o prevenir un síntoma de una enfermedad y/o un trastorno, etc.). Alternativamente, los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para construir oligonucleótidos dupletes correspondientes con dicha secuencia, diseñadas específicamente para corregir defectos genéticos en ciertas cepas hospedadoras y/o para introducir fenotipos deseados en el hospedador (por ejemplo, la introducción de un polimorfismo específico en un gen endógeno correspondiente con un polinucleótido de la presente invención que puede mejorar y/o prevenir un síntoma de una enfermedad y/o un trastorno, etc.). Estos procedimientos para usar oligonucleótidos dupletes son conocidos en la técnica y la presente invención los abarca (véase el documento EP 1007712).
Los polinucleótidos también son útiles para identificar organismos a partir de pequeñas muestras biológicos. El ejército de los Estados Unidos, por ejemplo, está considerando el uso de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para la identificación de su personal. En esta técnica, el ADN genómico de un individuo se digiere con una o más enzimas de restricción y se incuba con una sonda en una transferencia de ADN para producir bandas únicas para una identificación personal. Este procedimiento no sufre las limitaciones actuales de las "Placas de identificación" que puede perderse, cambiarse o se robadas, haciendo difícil la identificación positiva. Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse como marcadores de ADN adicionales para RFLP.
Los polinucleótidos de la presente invención también pueden usarse como alternativa al RFLP, determinando la secuencia de ADN real base por base de porciones seleccionadas de un genoma de organismos. Estas secuencias pueden usarse para preparar cebadores de PCR para amplificar y aislar este ADN seleccionado, que puede ser entonces secuenciado. Usando esta técnica, pueden identificarse organismos porque cada organismo tendrá un único grupo de secuencias de ADN. Una vez que se establece una base de datos de ID única para un organismo, se puede hacer la identificación positiva de ese organismo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas. De forma similar, los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse como marcadores polimórficos, además de para la identificación de células y/o tejidos trasformados o no transformados.
También existe la necesidad de reactivos capaces de identificar la fuente de un tejido en particular. Esta necesidad surge, por ejemplo, cuando se presenta un tejido de origen desconocido. Los reactivos apropiados pueden comprender, por ejemplo, sondas de ADN o cebadores específicos de un tejido en particular, preparados a partir de secuencias de la presente invención. Los paneles de estos reactivos pueden identificar el tejido por especie y/o por tipo de órgano. De forma similar, estos reactivos pueden usarse para analizar la contaminación de cultivos titulares. Además, como se menciona anteriormente, estos reactivos pueden usarse para analizar y/o identificar células y/o tejidos transformados y no transformados.
Como mínimo, los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse como marcadores de peso molecular en geles de transferencia de ADN, como sondas diagnósticas para la presencia de un ARNm específico en un tipo celular en particular, como sonda para "extraer" secuencias conocidas en el proceso de descubrir nuevos polinucleótidos, para seleccionar y hacer oligómeros para unir a un "chip génico" u otro soporte, para obtener anticuerpos anti-ADN usando técnicas de inmunización con ADN y como antígeno para provocar una respuesta inmunitaria.
Uso de los polipéptidos
Cada uno de los polipéptidos identificados en este documento puede usarse de numerosas formas. La siguiente descripción podría considerarse ilustrativo y utiliza técnicas conocidas.
Puede usarse un polipéptido de la presente invención para ensayar niveles de proteína en una muestra biológica, usando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, se puede estudiar la expresión de proteínas en tejidos con procedimientos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M. y col., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M. y col., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros procedimientos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de una proteína incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores adecuados para ensayos con anticuerpos son conocidos en la técnica e incluyen marcadores enzimáticos, tales como. glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Además de ensayar los niveles de proteína en una muestra biológica, también pueden detectarse proteínas in vivo mediante adquisición de imágenes. Las etiquetas o marcadores de anticuerpos para la adquisición de imágenes in vivo de proteínas incluyen los detectables mediante rayos X, RMN o REE. Para rayos X, los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no son abiertamente perjudiciales para el sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y REE incluyen aquellos con un espín característico detectable, tal como deuterio, que puede incorporarse en el anticuerpo marcando los nutrientes del hibridoma relevante.
Se introduce (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en un mamífero un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico de una proteína que se ha marcado con un resto para adquisición de imágenes detectable apropiado, tal como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}I, ^{112}In, ^{99m}Tc), una sustancia radioopaca o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de adquisición de imágenes usado determinarán la cantidad de resto de adquisición de imágenes necesario para producir imágenes diagnósticas. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada oscilará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicurios de ^{99m}Tc. A continuación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará, preferentemente en la localización de las células que contengan la proteína específica. La adquisición de imágenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel y col., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments". (Capítulo13 de Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B.A. Rhodes, editores, Masson Publishing Inc. (1982)).
De este modo, la invención proporciona un procedimiento diagnóstico in vitro de un trastorno, que implica (a) ensayar la expresión de un polipéptido de la presente invención en las células o fluido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel patrón del nivel de expresión génica, por el cual un aumento o disminución en el nivel de expresión génica del polipéptido ensayado comparado con el nivel de expresión patrón es indicativo de un trastorno. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de la transcripción en la biopsia del tejido de un individuo puede indicar una predisposición al desarrollo de la enfermedad o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales sanitarios emplear medidas preventivas o un tratamiento agresivo más temprano previniendo de ese modo el desarrollo o progresión adicional del cáncer.
Además, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad. Por ejemplo, puede administrarse a los pacientes un polipéptidos de la presente invención en un esfuerzo por sustituir la ausencia o la disminución de los niveles del polipéptidos (por ejemplo, insulina), para suplementar niveles ausentes o disminuidos de un polipéptido diferente (por ejemplo, hemoglobina B por hemoglobina S, SOD, catalasa, proteínas de reparación de ADN), para inhibir la actividad de un polipéptido (por ejemplo, un oncogén o un supresor tumoral), para activar la actividad de un polipéptido (por ejemplo, mediante la unión a un receptor), para reducir la actividad de un receptor unido a membrana compitiendo con él por el ligando libre (por ejemplo, receptores solubles de TNF usados en la reducción de la inflamación) o para provocar una respuesta deseada (por ejemplo, inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos, potenciación de la respuesta inmunitaria en células o tejidos proliferativos).
Como mínimo, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse como marcadores de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de exclusión molecular por filtración en gel, usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Los polipéptidos pueden usarse también para obtener anticuerpos, que en definitiva se usan para medir la expresión proteica de una célula recombinante, como forma de evaluar la transformación de la célula hospedadora. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para analizar las siguientes actividades biológicas.
Procedimientos de terapia génica
Otro aspecto de la descripción son los procedimientos de terapia génica para tratar o prevenir trastornos, enfermedades y dolencias. Los procedimientos de terapia génica se refieren a la introducción de secuencias de ácido nucleico (ADN, ARN y ADN o ARN complementario) en un animal para conseguir la expresión de un polipéptido de la presente invención. Este procedimiento requiere un polinucleótido que codifique un polipéptido de la invención que se una de forma operativa a un promotor y a cualquier otro elemento genético necesario para la expresión del polipéptido por el tejido diana. Esta terapia génica y técnicas de administración son conocidas en la materia, véase, por ejemplo, el documento WO 90/11092.
De este modo, por ejemplo, las células de un paciente pueden manipularse genéticamente con un polinucleótido (ADN o ARN) que comprenda un promotor unido de forma operativa ex vivo a un polinucleótido de la invención, proporcionando posteriormente las células manipuladas genéticamente a un paciente que tiene que ser tratado el polipéptido. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase Belldegrun y col., J. Natl. Cancer Inst., 85:207-216 (1993); Ferrantini y col., Cancer Research, 53: 107-1112 (1993); Ferrantini y col., J. Immunology 153:4604-4615 (1994); Kaido, T. y col., Int. J. Cancer 60: 221-229 (1995); Ogura y col., Cancer Research 50:5102-5106 (1990); Santodonato y col., Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato y col., Gene Therapy 4:1246-1255 (1997) y Zhang y col., Cancer Gene Therapy 3:31-38 (1996)). En una realización, las células que se manipulan genéticamente son células arteriales. Las células arteriales pueden volver a introducirse en el paciente a través de la inyección directa a la arteria, los tejidos circundantes en la arteria o a través de inyección por catéter.
Como se explica con más detalle a continuación, las construcciones de polinucleótidos pueden administrarse por cualquier procedimiento que administre materiales inyectables a las células de un animal, tal como, inyección en el especio intersticial de los tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado y similares). Las construcciones de polinucleótidos pueden administrarse en un vehículo líquido o acuoso farmacéuticamente aceptable.
En una realización, el polinucleótido de la invención se administra como un polinucleótido desnudo. El término polinucleótido, ADN o ARN "desnudo" se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de administración que actúe para ayudar, promover o facilitar la entrada en la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina o agentes de precipitación y similares. Sin embargo, los polinucleótidos de la invención también pueden suministrarse en formulaciones de liposomas y formulaciones de lipofectina y similares que pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº 5.593.972, 5.589.466 y 5.580.859.
Las construcciones de vectores polinucleotídicos de la invención usadas en el procedimiento de terapia génica son construcciones que preferiblemente no se integrarán en el genoma del hospedador ni contendrá secuencias que permitan la replicación. Los vectores apropiados incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia y pEF1/V5, pcDNA3.1 y pRc/CMV2 disponible en Invitrogen. Otros vectores adecuados serán fácilmente aparentes para los expertos en la materia.
Se puede usar cualquier promotor potente conocido por los expertos en la materia para dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica de la invención. Los promotores adecuados incluyen promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral, o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus respiratorio sincitial (VRS); promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de la metalotioneina, los promotores de choque térmico, el promotor de la albúmina, el promotor de Apoya; los promotores de la globina humana, los promotores de la timidita quinasa viral, tales como el promotor de la timidina quinasa del herpes simple, las LTR retrovirales; el promotor de \beta-actina y los promotores de la hormona de crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo de los polinucleótidos de la invención.
A diferencia de otras técnicas de terapia génica, una ventaja principal de la introducción de secuencias de ácido nucleico desnudo en las células diana es la naturaleza transitoria de la síntesis del polinucleótido en las células. Los estudios han demostrado que se pueden introducir secuencias de ADN no replicativas dentro de células para proporcionar la producción del polipéptido deseado durante periodos de hasta 6 meses.
La construcción del polinucleótido de la invención puede administrarse al espacio intersticial de tejidos en un animal, incluyendo el músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago intestino, testículos ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, tejido glandular y conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende la matriz mucopolisacárida intercelular liquida entre las fibras reticulares de los tejidos de los órganos, fibras elásticas en las paredes de los vasos o cámaras, fibras de colágeno de tejidos fibrosos o esa misma matriz en el tejido conectivo que envuelve las células musculares o en el espacio óseo. El espacio ocupado por el plasma de la circulación es similar al del líquido linfático de los canales linfáticos. Se prefiere la administración al especio intersticial del tejido muscular por las razones explicadas a continuación. Se pueden administrar de forma conveniente mediante inyección en los tejidos que comprenden estas células. Preferiblemente, se suministran y se expresan en células persistentes que no están en división, que están diferenciadas, aunque se puede conseguir la administración y expresión en células no diferenciadas o diferenciadas menos completamente, tales como, por ejemplo, células troncales sanguíneas o fibroblastos de la piel. Las células musculares in vivo son particularmente competentes por su capacidad para captar y expresar
polinucleótidos.
Para la inyección de secuencias de ácido nucleico desnudo, una cantidad de dosificación eficaz de ADN o ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Preferiblemente, la dosis será de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg y, más preferiblemente, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Por supuesto, como el experto apreciará, esta dosis variará según el sitio de inyección en el tejido. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente la dosis eficaz y apropiada de la secuencia de ácido nucleico y puede depender de la dolencia que se está tratando y de la vía de administración.
La vía de administración preferida es la vía de inyección parenteral en el especio intersticial de los tejidos. Sin embargo, se pueden usar otras vías parenterales, tales como, inhalación de una formulación en aerosol especialmente para la administración a los pulmones o a tejidos bronquiales, garganta o membranas mucosas de la nariz. Además, las construcciones de ADN desnudo pueden suministrarse a arterias durante la angioplastia por el catéter usado en el procedimiento.
Los polinucleótidos desnudos se suministran por cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitación, inyección directa en el sitio de administración, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter y las llamadas "pistolas génicas". Estos procedimientos de administración son conocidos en la técnica.
Las construcciones también pueden suministrarse con vehículos de administración tales como secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina, agentes de precipitación, etc. Estos procedimientos de administración son conocidos en la técnica.
En ciertas realizaciones, las construcciones de polinucleótido de la invención forman complejos con una preparación de liposomas. Las preparaciones de liposomas para su uso en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Sin embargo, los liposomas catiónicos son especialmente preferidos porque se puede formar un complejo fuertemente cargado entre el liposoma catiónico y el ácido nucleico polianiónico. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median en el suministro intracelular de ADN de plásmido (Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7416 (1987); ARNm (Malone y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6077-6081 (1989) y factores de transcripción purificados (Debs y col., J. Biol. Chem., 265:10189-10192 (1990) en forma funcional.
Se dispone fácilmente de liposomas catiónicos. Por ejemplo son especialmente útiles los liposomas de N[1-2,3-dioleiloxi)propil] N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y están disponible con la marca Lipofectina de GIBCO BRL, Grand Island, N. Y. (véase también, Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7416 (1987). Otros liposomas disponibles en el mercado incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boehringer).
Pueden prepararse otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo la publicación PCT Nº WO 90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis (oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano). En la bibliografía se explica la preparación de liposomas de DOTMA, véase, por ejemplo, Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417. Pueden usarse procedimientos similares para preparar liposomas a partir de otros materiales lipídicos catiónicos.
De forma similar, se dispone fácilmente de liposomas aniónicos y neutros, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.) o pueden prepararse fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Estos materiales incluyen, entre otros, fosfatidilo, colina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Estos materiales también pueden mezclarse con los materiales iniciales DOTMA y DOTAP en proporciones apropiadas. Se conocen bien en la técnica procedimientos para hacer liposomas usando estos materiales.
Por ejemplo, pueden usarse dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) comerciales, en diversas combinaciones para hacer liposomas convencionales, con o sin la adición de colesterol. De este modo, puede prepararse, por ejemplo, vesículas DOPG/DOPC secando DOPG y DOPC, 50 mg de cada, bajo un chorro de nitrógeno gaseoso en un vial de sonicación. La mezcla se pone en una bomba de vacío durante una noche y al día siguiente se hidrata con agua desionizada. A continuación, la muestra se sonica durante 2 horas en un vial tapado, usando un sonicador modelo 350 de Heat Systems, equipado con un recipiente de sonda invertido (tipo baño) dispuesto al máximo mientras que el baño circula a 15ºC. Alternativamente, pueden prepararse vesículas cargadas negativamente sin sonicación para producir vesículas multilamelares y mediante extrusión a través de membranas Nucleopore para producir vesículas unilamelares de tamaño discreto. Se conocen otros procedimientos y están disponibles para los expertos en la materia.
Los liposomas pueden comprender vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequeñas (SUV) o vesículas unilamerales grandes (LUV) siendo las preferidas las SUV. Los diversos complejos liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger y col., Methods of Immunology, 101:512-527 (1983). Por ejemplo, pueden prepararse MLV que contiene un ácido nucleico depositando una fina película de fosfolípidos en las paredes de un tubo de vidrio e hidratando, posteriormente, con una solución del material que se va a encapsular. Las SUV se preparan mediante sonicación prolongada de las MLV para producir una población homogénea de liposomas unilamelares. El material que va a ser atrapado se añade a una suspensión de MLV formadas previamente y, a continuación, se sonica. Cuando se usan liposomas que contienen lípidos catiónicos, la película lipídica seca se resuspende en una solución apropiada, tal como agua estéril o una solución tamponadora, isotónica tal como Tris 10 mM/NaCl; se sonica y, a continuación, los liposomas preformados se mezclan directamente con el ADN. El liposoma y el ADN forman un complejo muy estable debido a la unión de los liposomas cargados positivamente al ADN catiónico. Las SUV encuentran su uso con pequeños fragmentos de ácido nucleico. Las LUV se preparan por varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos usados normalmente incluyen la quelación de Ca^{2+} con EDTA (Papahadjopoulos y col., Biochim. Biophys. Acta, 394: 483 (1975); Wilson y col., Cell, 17:77 (1979)); inyección de éter (Deamer y col., Biochim. Biophys. Acta, 443: 629 (1976); Ostro y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 76:836 (1977); Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348 (1979)); diálisis con detergente (Enoch y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:145 (1979)) y evaporación en fase inversa (REV) (Fraley y col., J. Biol. Chem., 255:10431 (1980); Szoka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 145 (1978); Schaefer-Ridder y col., Science, 215:166 (1982)).
Generalmente, la proporción de ADN y liposomas será de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10. Preferiblemente, la proporción será de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5. Más preferiblemente, la proporción será de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:3. Aún más preferiblemente, la proporción será de aproximadamente 1:1.
La patente de EE. UU. Nº 5.679.954 informa de la inyección de material genético, complejado con vehículos de liposomas catiónicos, en ratones. Las patentes de EE.UU. Nº 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055 y la publicación internacional Nº WO 94/9469 proporcionan lípidos catiónicos para su uso en la transferencia de ADN a células y a mamíferos. Las patentes de EE.UU. Nº 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055 y la publicación internacional Nº WO 94/9469 proporciona procedimientos para administrar complejos ADN-lípido catiónicos a mamíferos.
En ciertas realizaciones, las células se manipulan genéticamente, ex vivo o in vivo, usando partículas retrovirales que contienen ARN que comprende una secuencia que codifica los polipéptidos de la invención. Los retrovirus a partir de los cuales pueden derivarse los vectores plasmídicos retrovirales incluyen, pero sin limitación, el virus de la leucemia murina de Moloney, virus de la necrosis esplénica, virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia del gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativa y virus del tumor mamario.
El vector plasmídico retroviral se emplea para transducir líneas celulares empaquetadora y formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células empaquetadoras que pueden transfectarse incluyen, pero sin limitación, la líneas celulares PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAml2 y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990). El vector puede transducirse en las células empaquetadoras mediante cualquier medio conocido en la materia. Estos medios incluyen, pero sin limitación, electroporación, el uso de liposomas y precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede encapsularse en un liposoma, o unirse a un lípido y después administrarse a un hospedador.
La línea celular productora genera partículas de vectores retrovirales infecciosas que incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención. A continuación, estas partículas del vector retroviral pueden emplearse para transducir células eucarióticas, in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán los polipéptidos de la invención.
En ciertas otras realizaciones, las células se manipulan genéticamente, ex vivo o in vivo, con los polinucleótidos de la invención contenidos en un vector de adenovirus. Puede manipularse el adenovirus de modo que codifique y exprese los polipéptidos de la invención y al mismo tiempo sea inactivo en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo vital de virus lítico normal. La expresión del adenovirus se logra sin la integración del ADN vírico en el cromosoma de la célula hospedadora, mejorando de este modo la preocupación con respecto a la mutagénesis inserción. Además, se ha usado adenovirus como vacunas entéricas vivas durante muchos años con un excelente perfil de seguridad (Schwartz y col., Am. Rev. Respir. Dis., 109: 233-238 (1974)). Finalmente, se ha demostrado la transferencia de genes mediada por adenovirus en varios ejemplos, incluyendo la transferencia de alfa-1-antitripsina y CFTR en los pulmones de ratas algodoneras (Rosenfeld y col., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld y col., Cell, 68:143-155 (1992)). Además, los estudios extensos para intentar establecer el adenovirus como un agente causal del cáncer humano fueron uniformemente negativos (Green y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:6606 (1979)).
Los vectores adenovirales adecuadas útiles en la presente invención se describen, por ejemplo, en Kozarsky y Wilson, Curr. Opin. Genet. Devel, 3:499-503 (1993); Rosenfeld y col., Cell, 68:143-155 (1992); Engelhardt y col., Human Genet. Ther., 4:759-769 (1993); Yang y col., Nature Genet., 7:362-369 (1994); Wilson y col., Nature, 365:691-692 (1993) y la patente de EE.UU. Nº 5.652.224. Por ejemplo, el vector de adenovirus Ad2 es útil y puede crecer en células humanas 293. Estas células contienen la región E1 del adenovirus y expresan constitutivamente E1a y E1b, que complementan a los adenovirus defectuosos proporcionando los productos de los genes delecionados del vector. Además de Ad2, también son útiles en la presente invención otras variedades de adenovirus (por ejemplo, Ad3, Ad5 y Ad7).
Preferiblemente, los adenovirus usados en la presente invención son deficiente en replicación. Los adenovirus deficientes en replicación requieren de la ayuda de un virus colaborador y/o de una línea celular empaquetadora para forma partículas infecciosas. El virus resultante es capaz de infectar a células y puede expresar un polinucleótido de interés que se une de forma operativa a un promotor, pero que no puede replicarse en la mayoría de las células. Los adenovirus deficientes para la replicación puede tener deleciones en uno o más de todos o una porción de los siguientes genes: E1a, E1b, E3, E4, E2a o de L1 a L5.
En ciertas otras realizaciones, las células se manipulan genéticamente, ex vivo o in vivo, usando un virus adenoasociado (AAV). Los AAV son virus defectuosos naturales que requieren de virus colaboradores para producir partículas infecciosas (Muzyczka, Curr. Topics in Microbiol. Immunol., 158:97 (1992)). También es uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en célula que no están en división. Los vectores que contiene no más de 300 pares de bases de AAV puede empaquetarse e integrarse, pero el espacio para ADN exógeno se limita a aproximadamente 4,5 kb. En la técnica se conocen procedimientos para producir y usar estos AAV. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.139.941, 5.173.414, 5.354.678, 5.436.146, 5.474.935, 5.478.745 y 5.589.377.
Por ejemplo, un vector AAV apropiada para su uso en la presente invención incluirá todas las secuencias necesarias para la replicación, encapsulación, replicación e integración del ADN en la célula hospedadora. La construcción del polinucleótido que contiene polinucleótidos de la invención se inserta en el vector AAV usando procedimientos de clonación convencionales, tales como los encontrados en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989). A continuación el vector AAV recombinante se transfecta en células empaquetadoras que están infectadas con un virus colaborador, usando cualquier técnica convencional, que incluye lipofección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, etc. Los virus colaboradores apropiados incluyen adenovirus, citomegalovirus, virus vaccinia o virus del herpes. Una vez que las células empaquetadoras se han transfectado e infectado, pueden producir partículas virales de AAV infecciosas que contienen la construcción polinucleotídica de la invención. A continuación, estas partículas virales se usan para transducir ex vivo o in vivo células eucarióticas. Las células transducidas contendrán la construcción polinucleotídica integrada en su genoma y expresará el producto génico
deseado.
Otro procedimiento de terapia génica implica a regiones de control heterólogo y a secuencias de polinucleótidos endógenas (por ejemplo, que codifican la secuencia polipeptídica de interés) asociadas de forma operativa por medio de recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.641.670, concedida el 24 de junio de 1997; publicación internacional Nº W0 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; publicación internacional Nº WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de1994; Koller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8932-8935 (1989) y Zijlstra y col., Nature 342:435-438 (1989). Este procedimiento implica la activación de un gen que está presente en las células diana, pero que normalmente no se expresa en las células o se expresa a menor nivel del deseado.
Las construcciones de polinucleótidos se hacen, usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, que contienen el promotor con las secuencias dirigidas que flanquean al promotor. En este documento se describen promotores adecuados. La secuencia dirigida es suficientemente complementaria con una secuencia endógena como para permitir recombinación homóloga de la secuencia dirigida promotora con la secuencia endógena. La secuencia dirigida estará suficientemente cerca del extremo 5' de la secuencia polinucleotídica endógeno deseada como para que el promotor se una de forma operativa a la secuencia endógena tras la recombinación homóloga.
El promotor y las secuencias dirigidas pueden amplificarse usando PCR. Preferiblemente, el promotor amplificado contiene diferentes sitios para enzimas de restricción en los extremos 5' y 3'. Preferiblemente, el extremo 3' de la primera secuencia dirigida contiene el mismo sitio para enzima de restricción que el extremo 5' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia dirigida contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3' del promotor amplificado. El promotor amplificado y las secuencias dirigidas se digieren y se ligan conjuntamente.
La construcción promotor-secuencia dirigida se administra a las células como un polinucleótido desnudo o junto con agentes que facilitan la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, virus completos, lipofección, agentes precipitantes, etc., descritas con más detalle anteriormente. El promotor P-secuencia dirigido puede administrarse mediante cualquier procedimiento, incluyendo la inyección directa, inyección por vía intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, aceleradores de partículas, etc. Los procedimientos se describen con más detalle a continuación.
La construcción promotor-secuencia dirigida entra en las células. La recombinación homóloga entre la construcción y la secuencia endógena tiene lugar, de modo que una secuencia endógena se coloca bajo el control del promotor. A continuación, el promotor dirige la expresión de la secuencia endógena.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención pueden administrarse junto con otros polinucleótidos que codifican proteínas angiogénicas. Las proteínas angiogénicas incluyen, pero sin limitación, factores de crecimientos de fibroblastos ácido y básico, VEGF-1, VEGF-2 (VEGF-C), VEGF-3 (VEGF-B), factores de crecimiento epidérmico alfa y beta, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de necrosis tumoral alfa, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de colonias granulocito/macrófago y óxido nítrico sintasa.
Preferiblemente, el polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención contiene una secuencia señal secretora que facilita la secreción de la proteína. Típicamente, la secuencia señal se coloca en la región codificadora del polinucleótido para que se exprese hacia o en el extremo 5' de la región codificadora. La secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga con el polinucleótido de interés y puede ser homóloga o heteróloga con respecto a las células que se transfectan. Adicionalmente, la secuencia señal puede sintetizarse químicamente usando procedimientos conocidos en la técnica.
Puede usarse cualquier modo de administración de cualquiera de las construcciones polinucleotídicas descritas anteriormente siempre que el modo de lugar a la expresión de una o más moléculas en cantidad suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Esto incluye la inyección directa, inyección sistémica, infusión por catéter, inyectores de bombardeo de partículas, aceleradores de partículas (es decir, "pistolas génicas"), depósitos de esponja de gelfoam, otros materiales de depósito disponibles en el mercado, bombas osmóticas (por ejemplo, minibombas Alza), formulaciones farmacéuticas sólidos (comprimidos o pastillas) orales o supositorios y aplicaciones por decantación o tópicas durante la cirugía. Por ejemplo, la inyección directa del plásmido desnudo precipitado con fosfato cálcico en el hígado de la rata y en el bazo de la rata o de un plásmido recubierto de proteínas en la vena porta han dado lugar a la expresión del gen extraño en los hígados de la rata (Kaneda y col., Science, 243:375 (1989)).
Un procedimiento preferido de administración local es la inyección directa. Preferiblemente, se administra una molécula recombinante de la presente invención complejada con un vehículo de administración mediante inyección directa o localmente en el área de las arterias. La administración local de una composición en el área de las arterias se refiere a la inyección de la composición a centímetros, y preferiblemente, milímetros de las arterias.
Otro procedimiento de administración local es poner en contacto una construcción polinucleotídica de la presente invención con o alrededor de una herida quirúrgica. Por ejemplo, un paciente puede experimentar cirugía y puede cubrirse la superficie del tejido interno de la herida con la construcción de polinucleótido o ésta puede inyectarse en las áreas del tejido dentro de la herida
Las composiciones terapéuticas útiles en la administración sistémica, incluye moléculas recombinantes de la presente invención complejadas con un vehículo de administración dirigida de la presente invención. Los vehículos de administración adecuados para su uso con administración sistémica comprenden liposomas que comprende ligandos para dirigir el vehículo a un sitio en particular.
Los procedimientos preferidos de administración sistémica, incluyen la inyección por vía intravenosa, aerosol, administración por vía oral o percutánea (tópica). Las inyecciones intravenosas puede realizarse usando procedimientos convencionales en la técnica. También puede realizarse la administración mediante aerosol usando procedimientos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 189:11277-11281 (1992), que se incorpora en este documento como referencia). La administración oral puede realizarse complejando una construcción del polinucleótido de la presente invención con un vehículo capaz de resistir a la degradación por las enzimas digestivas en el intestino de un animal. Los ejemplos de estos vehículos incluyen cápsulas de plástico o comprimidos, tales como los conocidos en la técnica. La administración tópica puede realizarse mezclando una construcción de polinucleótido de la presente invención con un agente lipófilo (por ejemplo, DMSO) que es capaz de atravesar la piel.
La determinación de una cantidad eficaz de sustancia para administrar puede depender de varios factores incluyendo, por ejemplo, la estructura química y la actividad biológica de la sustancia, la edad y el peso del animal, la dolencia precisa que requiere tratamiento y su gravedad, y la vía de administración. La frecuencia de tratamiento dependerá de varios factores, tales como la cantidad de construcción de polinucleótido administrado por dosis, así como la salud e historia del sujeto. El médico o veterinario asistente determinará la cantidad precisa, número de dosis y tiempo de dosificación. Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden administrarse a cualquier animal, preferiblemente a mamíferos y pájaros. Los mamíferos preferidos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas, conejos, ovejas, ganado, caballos y cerdos, siendo especialmente preferidos los humanos.
Actividad inmunitaria
Los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención puede ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias del sistema inmunitario, activando o inhibiendo la proliferación, diferenciación o movilización (quimiotáxis) de células inmunitarias. Las células inmunitarias se desarrollan por medio de un procedimiento denominado hematopoyesis, que produce células mieloides (plaquetas, eritrocitos, neutrófilos y macrófagos) y linfoides (linfocitos B y T) a partir de células troncales pluripotentes. La etiología de estas enfermedades, trastornos y/o dolencias inmunitarios puede ser genéticas, somáticas, como en el cáncer o en algunas enfermedades, trastornos y/o dolencias autoinmunes, adquirida (por ejemplo, mediante quimioterapia o toxinas) o infecciosa. Además, pueden usarse polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la presente invención como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario.
Los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención puede ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias de células hematopoyéticas. Los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención podrían usarse para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células troncales pluripotentes, en un esfuerzo por tratar o prevenir estas enfermedades, trastornos y/o dolencias asociadas con un descenso en ciertos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas. Los ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológica incluyen, pero sin limitación: enfermedades, trastornos y/o dolencias de proteínas sanguíneas (por ejemplo, agammaglobulinemia, disgammaglobulinemia), ataxia-telangiectasia, inmunodeficiencia variable normal, síndrome de DiGeorge, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, síndrome de deficiencia de adhesión de leucocitos, linfopenia, disfunción de la actividad bactericida de los fagocitos, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), trastorno de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia o hemoglobinuria.
Además, los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención también podrían usarse para modular la actividad hemostática (la parada de la hemorragia) y trombolítica (formación del coágulo). Por ejemplo, para aumentar la actividad hemostática o trombolítica, podría usarse los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la presente invención para tratar o prevenir enfermedades, trastornos y/o dolencias de la coagulación sanguínea (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factores, trombosis arterial, trombosis venosa, etc.), enfermedades, trastornos y/o dolencias de las plaquetas sanguíneas (por ejemplo, trombocitopenia) o las heridas como resultado de traumas, cirugía u otras causas. Alternativamente, los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas, de la presente invención que pueden disminuir la actividad hesmostática o trombolítica, podrían usarse para inhibir o disolver el coágulo. Los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas, de la presente invención también puede ser útiles para la detección, pronóstico, tratamiento y/o prevención de ataques al corazón (infarto), ictus, cicatrización, fibrinolisis, hemorragia incontrolada, coagulación incontrolada, fijación de complemento incontrolado y/o inflamación.
Los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención también pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias autoinmunes. Muchas enfermedades, trastornos y/o dolencias autoinmunes resultan del reconocimiento inadecuado por las células inmunitarias de lo propio como material extraño. Este reconocimiento inadecuado da lugar a una respuesta inmunitaria que lleva a la destrucción del tejido hospedador. Por tanto, la administración de polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la presente invención que inhiben una respuesta inmunitaria, especialmente la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de enfermedades, trastornos y/o dolencias autoinmunes.
Los ejemplos de enfermedades, trastornos y/o dolencias que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse o detectarse por la presente invención incluyen, pero sin limitación: enfermedad de Addison, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípido, artritis reumatoide, dermatitis, encefalomielitis alérgica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, esclerosis múltiple, miastenia gravis, neuritis, oftalmia, penfigoide bollusa, pénfigo, poliendocrinopatías, púrpura, enfermedad de Reiter, síndrome de la persona rígida, tiroiditis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillian-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune.
De forma similar, también pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonista de la presente invención reacciones y dolencias alérgicas, tales como asma (especialmente asma alérgica) u otros problemas respiratorios. Además, estas moléculas pueden usarse para tratar anafilaxis, hipersensibilidad a una molécula antigénica o incompatibilidad de grupo sanguíneo.
Los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención también pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar el rechazo de un órgano o la enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD). El rechazo de un órgano tiene lugar por la destrucción por parte de las células del sistema inmunitario del tejido trasplantado mediante una respuesta inmunitaria. De forma similar, también está implicada una respuesta inmunitaria en la GVHD, pero, en este caso, las células inmunitarias trasplantadas extrañas destruyen los tejidos del hospedador. La administración de polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la presente invención que inhibe una respuesta inmunitaria, especialmente la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención del rechazo de un órgano o de GVHD.
De forma similar, los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención, también puede usarse para modular la inflamación. Por ejemplo, el polipéptido o polinucleótido pueden inhibir la proliferación y diferenciación de células implicadas en una respuesta inflamatoria. Estas moléculas pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar dolencias inflamatorias, tanto dolencias crónicas como agudas, incluyendo prostatitis crónica, prostatitis granulomatosa y malacoplasia, inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque séptico, sepsis o síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), lesión por isquemia reperfusión, letalidad por endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o como resultado de la sobreproducción de citocinas (por ejemplo, TNF o IL-1).
Trastornos hiperproliferativos
Los polinucleótidos o polipéptidos de la invención pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativas, incluyendo neoplasmas. Los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención pueden inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Alternativamente, los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención puede hacer proliferar otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.
Por ejemplo, aumentado una respuesta inmunitaria, especialmente aumentado las cualidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o mediante la proliferación, diferenciación o movilización de células T, pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativas. Esta respuesta inmunitaria puede aumentarse potenciando una respuesta inmunitaria existente o iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Alternativamente, la disminución de la respuesta inmunitaria también puede ser un procedimiento para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativas, tal como un agente quimioterapéutico.
Los ejemplos de enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativas que puede tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, los neoplasmas localizados en: colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroides, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), linfático, pélvico, piel, tejido blando, bazo, torácico y urogenital.
De forma similar, también puede tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse otras enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativos mediante los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de estas enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativas incluyen, pero sin limitación: hipergammaglobulinemia, enfermedades, trastornos y/o dolencias linfoproliferativas, paraproteínemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldestron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, localizadas en un sistema u órgano enumerado anteriormente.
Una realización preferida utiliza polinucleótidos de la presente invención para inhibir la división celular anómala, mediante terapia génica usando la presente invención, y/o fusiones de proteínas o fragmentos de la misma.
De este modo, la presente solicitud describe un procedimiento para tratar o prevenir enfermedades, trastornos y/o dolencias de proliferación celular insertando en una célula que prolifera de forma anómala un polinucleótido de la presente invención, en el que dicho polinucleótido reprime dicha expresión.
También se describe un procedimiento para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y/o dolencias de proliferación celular en individuos que comprende la administración de una o más copias de un gen activo de la presente invención a una célula o células que proliferan de forma anómala. En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención son una construcción de ADB que comprende un vector de expresión recombinante eficaz para expresar una secuencia de ADN que codifica dichos polinucleótidos. En otra realización preferida de la presente invención, la construcción de ADN que codifica los polinucleótidos de la presente invención se inserta en las células que se van a tratan utilizando un retrovirus, o más preferiblemente, un vector adenoviral (Véase G. J. Nabel y col., PNAS 1999 96:324-326). En una realización más preferida, el vector viral es defectuoso y no podrá transformar a células que no proliferan, sólo a células en proliferación. Además, en una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención, insertados en células en proliferación solos o en combinación con o fusionados con otros polinucleótidos, pueden modularse entonces a través de un estímulo externo (es decir, administración de una molécula magnética, pequeña molécula específica, compuesto químico o fármaco, etc.) que actúan antes del extremo 5' del promotor de dichos polinucleótidos para inducir la expresión del producto proteico codificado. De este modo, el efecto terapéutico beneficioso afectado por la presente invención puede modularse expresamente (es decir, aumentar, disminuir o inhibir la expresión de la presente invención) sobre la base de dicho estímulo externo.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser útiles para reprimir la expresión de genes o antígenos oncogénicos. Por "represión de la expresión de los genes oncogénicos" se pretende la supresión de la transcripción del gen, la degradación de la transcripción génica (ARN premensajero), la inhibición del ayuste, la destrucción del ARN mensajero, la prevención de las modificaciones postraduccionales de la proteína, la destrucción de la proteína o la inhibición de la función normal de la proteína.
Para la administración local a células que proliferan de forma anómala, los polinucleótidos de la presente invención puede administrarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia, pero sin limitación, transfección, electroporación, microinyección de células, o con vehículos tales como liposomas, lipofectina, o como polinucleótidos desnudos o cualquier otro procedimiento descrito durante la descripción. El polinucleótido de la presente invención puede administrase mediante sistemas de administración de genes conocidos tales como, pero sin limitación, vectores retrovirales (Gilboa, J. Virology 44:845 (1982); Hocke, Nature 320:275 (1986); Wilson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:3014), sistema de virus vaccinia (Chakrabarty y col., Mol. Cell Biol. 5:3403 (1985) u otros sistemas eficaces de administración de ADN (Yates y col., Nature 313:812 (1985)) conocidos por los expertos en la materia. Estas referencias son sólo ilustrativas. Para administrar o transfectar células específicamente que proliferan de forma anómala y dejar las células que no se dividen, es preferible utilizar un retrovirus o un sistema de administración adenoviral (como se describe en la técnica y en otra parte de este documento) conocidos por los expertos en la materia. Puesto que se requiere la replicación del ADN del hospedador para que el ADN retroviral se integre y el retrovirus será incapaz de autoreplicarse debido a la carencia de los genes del retrovirus necesarios para su ciclo vital. Utilizando este sistema de administración retroviral para los polinucleótidos de la presente invención dicho gen y las construcciones se dirigirán a células que proliferan de modo anómalo y se dejarán las células normales que no se dividen.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden administrarse directamente a sitios de trastorno/enfermedad de célula proliferativa en órganos internos, cavidades corporales y similares usando dispositivos de adquisición de imágenes para dirigir una inyección directamente al sitio de la enfermedad. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden administrarse a los sitios de la enfermedad durante la intervención quirúrgica.
Por "enfermedad de proliferación celular" se entiende cualquier enfermedad humana o animal o trastorno, que afecta a cualquiera o a una combinación de órganos, cavidades o partes del organismo que se caracteriza por proliferaciones anómalas locales únicas o múltiples de células, grupos de células o tejidos, benignos o malignos.
Puede administrarse cualquier cantidad de los polinucleótidos de la presente invención siempre que tenga un efecto biológico inhibidor en la proliferación de las células tratadas. Además, es posible administrar más de uno de los polinucleótidos de la presente invención simultáneamente al mismo sitio. Por "inhibir biológicamente" se entiende la inhibición parcial o total del crecimiento así como el descenso en la tasa de proliferación o crecimiento de las células. La dosis biológicamente inhibidora puede determinarse evaluando los efectos de los polinucleótidos de la presente invención en el crecimiento de células diana malignas o que proliferan de forma anómala en un cultivo tisular, crecimiento de un tumor en animales y cultivos celulares o cualquier otro procedimiento conocido por un experto en la materia.
Además, los polipéptidos de la presente invención pueden ser útiles para la inhibición de la angiogénesis de células o tejidos proliferativos, solos, como una proteína de fusión o en combinación con otros polipéptidos directa o indirectamente, como se describe en otro parte de este documento. En una realización más preferida, dicho efecto antiangiogénico puede lograrse indirectamente, por ejemplo, a través de la inhibición de células hematopoyéticas específicas del tumor, tales como macrófagos asociados al tumor (Véase Joseph IB y col. J Natl Cancer Inst. 90(21):1648-53 (1998). Los anticuerpos dirigidos frente a polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención también pueden dar lugar a la inhibición de la angiogénesis directa o indirectamente (Véase Witte L. y col., Cancer Metastasis Rev. 17 (2):155-61 (1998)).
Los polipéptidos, incluyendo fusiones de proteínas, descritos en la presente invención, o fragmentos de los mismos, pueden ser útiles para inhibir células o tejidos proliferativos a través de la inducción de la apoptosis. Dichos polipéptidos pueden actuar directa o indirectamente para inducir apoptosis de células o tejidos proliferativos, por ejemplo, en la activación de un receptor de domino muerte, tal como el receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) 1, CD95 (Fas/APO-1), proteína mediada por apoptosis relacionada con el receptor de TNF (TRAMP) y receptores 1 y 2 del ligando de inducción de apoptosis relacionado con TNF (TRIAL) (Véase Schulze Osthoff K y col., Eur J Biochem 254(3):439-59 (1998). Además, en otra realización preferida de la presente invención, dichos polipéptidos pueden inducir apoptosis a través de otros mecanismos, tales como con la activación de otras proteínas que activarán la apoptosis, o a través de la estimulación de la expresión de dichas proteínas, solos o en combinación con pequeñas moléculas de fármacos o adyuvantes, tales como apoptonina, galectinas, tiorredoxinas, proteínas antiinflamatorias (véase por ejemplo, Mutat Res. 400 (1-2):447-55 (1998), Med. Hypotheses 50 (5):423-33 (1998), Chem. Biol. Interact. abr 24; 111-112:23-34 (1998), J Mol Med. 76 (6):402-12 (1998), Int. J. Tissue React. 20(1):3-15 (1998)).
Los polipéptidos, incluyendo fusiones de proteínas, o fragmentos de los mismos, descritos en la presente invención son útiles para inhibir la metástasis de células o tejidos proliferativos. La inhibición puede darse como resultado directo de los polipéptidos administrados o anticuerpos dirigidos frente a dichos polipéptidos, como se describe en otra parte de este documento, o indirectamente, tal como activando la expresión de proteína conocidos por que inhiben la metástasis, por ejemplo integrinas alfa 4 (Véase, por ejemplo, Curr Top Microbiol. Immunol. 1998, 231:125-41). Estos efectos terapéuticos de la presente invención pueden lograrse bien solo o en combinación con pequeñas moléculas de fármacos o adyuvantes.
En este documento se describe un procedimiento para administrar composiciones que contienen los polipéptidos de la invención (por ejemplo, composiciones que contienen polipéptidos o anticuerpos del polipéptido asociados con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas o profármacos) a células dirigidas que expresan el polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos o anticuerpos del polipéptido de la invención pueden asociarse con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas o profármacos a través de interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes.
Los polipéptidos, fusiones de proteínas o fragmentos de las mismas, de la presente invención son útiles para potenciar la inmunogenicidad y/o antigenicidad de células o tejidos en proliferación, directamente tal como podría ocurrir si se "vacunara" al sistema inmunitario con los polipéptidos de la presente invención para responder a antígenos e inmunógenos proliferativos o, indirectamente, tal como activando la expresión de proteínas que se conoce potencian la respuesta inmunitaria (por ejemplo, quimiocinas) a dichos antígenos e inmunógenos.
Trastornos cardiovasculares
Los polinucleótidos o polipéptidos de la invención pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias cardiovasculares, incluyendo enfermedad arterial periférica, tal como isquemia de las extremidades.
Las enfermedades, trastornos y/o dolencias cardiovasculares incluyen anomalías cardiovasculares, tales como fístula arterioarterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos cardíacos congénitos, atresia pulmonar y síndrome de la cimitarra. Los defectos cardíacos congénitos incluyen coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón con ventrículos entrecruzados, dextrocardia, conducto arterial patente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de los grandes vasos, ventrículo derecho con doble salida, atresia tricúspide, tronco arterial persistente y defectos del septo cardíaco, tales como defecto del septo aortopulmonar, defectos de la almohadilla endocárdica, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot y defectos septales cardíacos ventriculares.
Las enfermedades, trastornos y/o dolencias cardiovasculares también incluyen enfermedades cardíacas, tales como arritmias, enfermedad cardiaca carcinoide, salida cardiaca alta, salida cardiaca baja, tamponamiento cardíaco, endocarditis (incluyendo bacteriana), aneurisma cardíaco, parada cardiaca, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxismal, edema cardíaco, hipertrofia cardiaca, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, rotura cardiaca postinfarto, rotura septal ventricular, enfermedades valvulares cardíacas, enfermedades miocárdicas, isquemia miocárdica, efusión pericárdica, pericarditis (incluyendo constrictiva y tuberculosa), neumopericardio, síndrome postpericardiotomia, enfermedad cardiaca pulmonar, enfermedad cardiaca, reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares durante el embarazo, síndrome de la cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.
Las arritmias incluyen sinus arritmia, fibrilación atrial, flúter atrial, bradicardia, extrasístole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo sinoatrial, síndrome del QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolf-Parkinson-White, síndrome del seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxismal, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia atrioventricular nodal de reentrada, taquicardia atrial ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia sinoatrial nodal de reentrada, taquicardia del seno, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular.
La enfermedad valvular cardiaca incluye insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula
tricúspide.
Las enfermedades miocárdicas incluyen cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva, cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restrictiva, cardiomiopatía de Chagas, fibroelastosis endocardial, fibrosis endomiocardial, síndrome de Kearns, lesión por reperfusión miocárdica y miocarditis.
Las isquemias miocárdicas incluyen enfermedades coronarias, tales como angina de pecho, aneurisma coronario, arteriosclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio y miocardio aturdido.
Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau, síndrome de Klippl-Desayunaren-Deber, síndrome de Surge-Deber, edema neuróticos, enfermedades aórticas, artritis de Subrayase, cortisona, síndrome de Guariches, enfermedades oclusivas arteriales, artritis, enarteritis, poliarteritis nodosas, enfermedades, trastornos y/o dolencias cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatías diabéticas, embolismos, trombosis, eritromialgia, hemorroides, enfermedad venooclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión venosa retiniana, síndrome de la cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, ataxia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa.
Los aneurismas incluyen aneurismas disecantes, aneurismas falsos, aneurismas infectados, roturas de aneurismas, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrales, aneurismas coronarias, aneurismas cardíacos y aneurismas ilíacos.
Las enfermedades oclusivas arteriales incluyen arteriosclerosis, claudicación intermitente, estenosis de la carótida, displasias fibromusculares, oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción de la arteria renal, oclusión de la arteria retiniana y tromboangitis obliterante.
Las enfermedades, trastornos y/o dolencias cerebrovasculares incluyen enfermedades de la arteria carótida, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioscleresis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de la arteria cerebral, embolismo y trombosis cerebral, trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnoide, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluyendo transitoria) síndrome del robo de la subclavia, leucomalacia periventricular, dolor de cabeza vascular, dolor de cabeza, migraña e insuficiencia vertebrobasilar.
Los embolismos incluyen embolismos gaseosos, embolismos de líquido amniótico, embolismos por colesterol, síndrome del dedo del pie azul, embolismos grasos, embolismos pulmonares y tromboembolismos. Las trombosis incluyen trombosis coronaria, trombosis de la vena hepática, oclusión de la vena retiniana, trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, síndrome de Wallenberg y tromboflebitis.
La isquemia incluye isquemia cerebral, colitis isquémica, síndromes de compartimiento, síndrome del compartimiento anterior, isquemia miocárdica, daños por reperfusión e isquemia periférica de las extremidades. La vasculitis incluye aortitis, arteritis, síndrome de Behcet, síndrome de Churg-Strauss, síndrome del ganglio linfático mucocutáneo, tromboangitis obliterantes, vasculitis hipersensitiva, púrpura de Schoenlein-Henoch, vasculitis cutánea alérgica y granulomatosis de Wegener.
Los polinucleótidos o polipéptidos de la invención son especialmente eficaces para el tratamiento de la isquemia crítica de las extremidades y de enfermedad coronaria.
Los polipéptidos pueden administrarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, inyección con aguja directa en el lugar de administración, inyección por vía intravenosa, administración por vía tópica, infusión por catéter, inyectores de bombardeo de partículas, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de gelfoam, otros materias de depósito disponibles en el mercado, bombas osmóticos, formulaciones farmacéuticas sólidas por vía oral o supositorios, aplicaciones por decantación o tópicas durante la cirugía, administración por aerosol. Estos procedimientos son conocidos en la técnica. Los polipéptidos de la invención pueden administrarse como parte de un agente terapéutico, descrito con mayor detalle a continuación. Los procedimientos para administrar los polinucleótidos de la invención se describen con más detalle en este documento.
Actividad antiangiogénica
El equilibrio natural entre estimuladores e inhibidores endógenos de angiogénesis es aquel en que predomina las influencias inhibidoras. Rastinejad y col., Cell 56:345-355 (1989). En aquellos casos raros en que tiene lugar neuvascularización en condiciones fisiológicas normales, tales como curación de heridas, regeneración de órganos, desarrollo embrionario y procesos de reproducción femenina, la angiogénesis está regulada rigurosamente y delimitada espacio y temporalmente. En condiciones de angiogénesis patológica, tales como las que caracterizan al crecimiento de un tumor sólido, estos controles reguladores fallan. La angiogénesis no regulada se vuelve patológica y ayuda a la progresión de muchas enfermedades neoplásicas y no neoplásicas. Varias enfermedades graves están dominadas por una neovascularización anómala, incluyendo crecimiento de tumor sólido y metástasis, artritis, algunos tipos de enfermedades, trastornos y/o dolencias oculares, y psoriasis. Véase, por ejemplo, las revisiones de Moses y col., Biotech. 9:630-634 (1991); Folkman y col., N. Engl. J. Med., 333:1757-1763 (1995); Auerbach y col., J. Microvasc. Res. 29:401-411 (1985); Folkman, Advances in Cancer Research, editores. Klein y Weinhouse, Academic Press, Nueva York, pág. 175-203 (1985); Patz, Am. J. Opthalmol. 94:715-743 (1982) y Folkman y col., Science 221:719-725 (1983). En varias condiciones patológicas, el proceso de angiogénesis contribuye al estado de la enfermedad. Por ejemplo, se han acumulado datos significativos que sugieren que el crecimiento de tumores sólidos depende de la angiogénesis. Folkman y Klagsbrun, Science 235:442-447 (1987).
También se describe en este documento el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o dolencias asociadas con neovascularización mediante la administración del los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención. Las dolencias cancerosas y metastásicas que pueden tratarse con los polinucleótidos y polipéptidos de la invención incluyen, pero sin limitación, malignidades, tumores sólidos y cánceres descritos en este documento o conocidos por otro lado en la técnica (para revisión de estos trastornos, véase Fishman y col., Medicine, 2ª Edición, J.B. Lippincott C., Filadelfia (1985)). De este modo, la presente solicitud describe un procedimiento para tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad y/o trastorno relacionado con angiogénesis, que comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un polinucleótido y/o polipéptido de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos y/o polipéptidos puede utilizarse en diversos procedimientos adicionales para tratar o prevenir terapéuticamente un cáncer o tumor. Los cánceres que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse con los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas incluyen, pero sin limitación, tumores sólidos, incluyendo próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículo, hígado, parótidas, conducto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vesícula, cáncer de tiroides, tumores primarios y metástasis, melanomas, glioblastoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, enfermedades malignas avanzadas y tumores de distribución sanguínea tales como leucemias. Por ejemplo, los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden administrarse por vía tópica, para tratar o prevenir cánceres tales como cáncer de piel, tumores de cabeza y cuello, tumores de mama y sarcoma de Kaposi.
Aun dentro de otros aspectos, los polinucleótidos y/o polipéptidos pueden utilizarse para tratar formas superficiales de cáncer de vejiga mediante, por ejemplo, administración por vía intravesical. Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas puede administrarse directamente en el tumor o próximo al sitio del tumor, por inyección o un catéter. Por supuesto, como apreciará el experto en la materia, el modo apropiado de administración variará según el cáncer que se va a tratar. En este documento se explican otros modos de administración.
Los polinucleótidos y/o polipéptidos pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar otras enfermedades, trastornos y/o dolencias, además de cánceres, que implican angiogénesis. Estas enfermedades, trastornos y/o dolencias incluyen, pero sin limitación: tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas biogénicos, placas arteroscleróticas, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplastia retolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y pterigia (crecimiento anómalos de vasos sanguíneos) del ojo, artritis reumatoide, psoriasis, curación de heridas retrasada, endometriosis, vasculogénesis; granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas sin unión, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, angiogénesis miocárdicas, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de extremidades isquémicas, síndrome de Osler-Webber, neovascularización de placa, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, displasia fribromuscular, granulación de heridas, enfermedad de Crohn y
aterosclerosis.
Por ejemplo, se proporcionan procedimientos para tratar, prevenir y/o diagnosticar cicatrices hipertróficas y queloides, que comprende la etapa de administrar un polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista de la invención a una cicatriz hipertrófica o queloide.
Los polinucleótidos y/o polipéptidos pueden inyectarse directamente en una cicatriz hipertrófica o queloide para prevenir la progresión de estas lesiones. Esta terapia es de especial valor en el tratamiento profiláctico de dolencias que se sabe dan lugar al desarrollo de cicatrices hipertróficas y queloides (por ejemplo, quemaduras) y preferiblemente se inician tras la fase proliferativa, que ha tenido tiempo para progresar (aproximadamente 14 días después de la lesión inicial), pero antes del desarrollo de escaras hipertrófica o queloide. Como se señala anteriormente, la presente invención también proporciona procedimientos para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades neovasculares del ojo que incluyen, por ejemplo, neovascularización corneal, glaucoma neurovascular, retinopatía diabética proliferativa, fibroplasia retrolental y degeneración macular.
Además, las enfermedades, trastornos y/o dolencias oculares asociadas con la neovascularización que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse con los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención (incluyendo agonistas y/o antagonistas) incluyen, pero sin limitación: glaucoma neurovascular, retinopatía diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolental, uveítis, retinopatía de degeneración macular del prematuro, neovascularización de injerto de córnea, así como otras enfermedades inflamatorias del ojo, tumores oculares y enfermedades asociadas con la neovascularización coroidal o del iris. Véanse, por ejemplo, las revisiones de Waltman y col., Am. J. Ophthal. 85:704-710 (1978) y Gartner y col., Surv. Ophthal. 22:291-312 (1978).
De este modo, se proporciona un procedimiento para el tratamiento o prevención de enfermedades neovasculares del ojo, tales como neovascularización corneal (incluyendo neovascularización del injerto corneal), que comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto (como se describe anteriormente) a la córnea, inhibiendo de este modo la formación de vasos sanguíneos. Brevemente, la cornea es un tejido que normalmente carece de vasos sanguíneos. Sin embargo, en ciertas condiciones patológicas, a partir del plexo vascular pericorneal del limbo pueden extenderse capilares a la cornea. Cuando la cornea se vasculariza, también se enturbia, dando lugar a un descenso en la agudeza visual del paciente. La pérdida visual puede hacerse completa si la córnea se vuelve completamente opaca. Una amplia diversidad de enfermedades, trastornos y/o dolencias pueden dar lugar a la neovascularización corneal, incluyendo, por ejemplo, las infecciones de la córnea (por ejemplo, tracoma, queratitis por herpes simple, leismaniasis y oncocerquiasis), procesos inmunológicos (por ejemplo, rechazo de injerto y síndrome de Stevens-Johnson), quemaduras alcalinas, trauma, inflamación (por cualquier causa), estados de deficiencia tóxica y nutricional y, como complicación del uso de lentes de contacto.
Los compuestos de la invención, pueden prepararse para administración por vía tópica en solución salina (combinada con cualquiera de los conservantes y agentes antimicrobianos usados normalmente en preparaciones oculares) y administrarse en forma de colirio. La solución o suspensión puede prepararse en su forma pura y administrarse varias veces al día. Alternativamente, las composiciones antiangiogénicas, preparados como se describe anteriormente, también pueden administrarse directamente a la córnea. Dentro de realizaciones preferidas, la composición antiangiogénica se prepara con un polímero mucoadhesivo que se une a la córnea. Dentro de realizaciones adicionales, los factores antiangionéicas o las composiciones antiangiogénicas puede utilizarse como adicional a la terapia esteroide convencional. La terapia tópica también puede usarse de forma profiláctica en lesiones de córnea que se sabe tiene una alta probabilidad de inducir una respuesta angiogénica (tal como quemaduras químicas). En estos casos, el tratamiento, probablemente en combinación con esteroides, pueden instituirse inmediatamente para ayudar a prevenir complicaciones posteriores.
Los compuestos descritos anteriormente pueden ser inyectados directamente en el estroma corneal por un oftalmólogo con ayuda del microscopio. El sitio preferido de inyección puede variar con la morfología de la lesión individual, pero el objetivo de la administración sería colocar la composición en el frente de avance de la vasculatura (es decir, intercalado entre los vasos sanguíneos y la córnea normal). En muchos casos esto podría implicar la inyección en la cornea perilímbica para "proteger" la córnea del avance de los vasos sanguíneos. Este procedimiento también puede utilizarse inmediatamente después de un ataque a la córnea para prevenir de forma prolifáctica la neovascularización de la córnea. En esta situación el material podría inyectarse en la córnea perilímbica interpuesto entre la lesión corneal y su suministro de sangre límbica potencial indeseado. Estos procedimientos también pueden utilizarse de forma similar para prevenir la invasión capilar de corneas trasplantadas. En una forma de administración mantenida podrían requerirse sólo inyecciones 2-3 veces al año. También podría añadirse un esteroide a la solución de inyección para reducir la inflamación resultante de la inyección en sí.
En este documento se describen procedimientos para tratar o prevenir el glaucoma neovascular, que comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en el ojo, inhibiendo así la formación de vasos sanguíneos. En una realización, el compuesto puede administrarse por vía tópica en el ojo para tratar o prevenir formas tempranas de glaucoma neovascular. Entre otras realizaciones, el compuesto puede implantarse mediante inyección en la región del ángulo de la cámara anterior. Entre otras realizaciones, el compuesto también puede colocarse en cualquier localización de modo que el compuesto se libera de forma continua en el humor acuoso. Se proporcionar procedimientos para tratar o prevenir la proliferación de retinopatía diabética, que comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en los ojos, inhibiendo así la formación de vasos sanguíneos.
La retinopatía diabética proliferativa puede tratarse mediante la inyección en el humor acuoso o en el vítreo, para aumentar la concentración local del polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en la retina. Preferiblemente, este tratamiento podría iniciarse previamente a la adquisición de una enfermedad grave que requiera de fotocoagulación.
En este documento también se describen procedimientos para tratar o prevenir la fibroplasia retrolental, que comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en el ojo, inhibiendo así la formación de vasos sanguíneos. El compuesto puede administrarse por vía tópica, mediante inyección intravítrea y/o mediante implantes intraoculares.
Adicionalmente, las enfermedades, trastornos y/o dolencias que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse con los polinucleótidos, polipéptidos y/o anticuerpos incluyen, pero sin limitación, hemangioma, artritis, psoriaris, angiofibroma, placas ateroscleróticas, heridas de cicatrización retrasada), granulaciones, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, escleroderma, tracoma y adhesiones vasculares.
Además, las enfermedades, trastornos y/o dolencias y/o estados que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse con los polinucleótidos, polipéptidos, y/o anticuerpos incluyen, pero sin limitación, tumores sólidos, tumores transmitidos por sangre, tales como leucemias, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicas, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de cornea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, retinoblastoma y uveítis, cicatrización de heridas retrasada, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas sin unión, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, angiogénesis miocárdica, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de extremidades isquémicas, síndrome de Osler -Weber, neovascularización de placa, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulación de heridas, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, agente anticonceptivo mediante la prevención de vascularización requerida para la implantación del embrión controlando la menstruación, enfermedades que tiene a la angiogénesis como una consecuencia patológica, tal como enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonellosis y angiomatosis bacilar.
En un aspecto del procedimiento de control de nacimiento, se administra una cantidad del compuesto suficiente para bloquear la implantación del embrión antes o después de la relación sexual y de que haya tenido lugar la fertilización, de modo que se proporciona un procedimiento eficaz de anticoncepción, posiblemente un procedimiento del "día después". Los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y/o agonistas también pueden usarse para controlar la menstruación o administrarse como un líquido de lavado peritoneal o para implantación peritoneal en el tratamiento de la endometriosis.
Los polinucleótidos, polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención pueden incorporarse a suturas quirúrgicas para prevenir granulomas por puntos de sutura.
Los polinucleótidos, polipéptidos y/o anticuerpos puede utilizarse en una amplia diversidad de procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, la presente invención describe composiciones (en forma de, por ejemplo, un aerosol o una película) que pueden utilizarse para recubrir o pulverizar un área antes de eliminar un tumor para aislar los tejidos circundantes normales del tejido maligno, y/o para prevenir la difusión de la enfermedad a tejidos circundantes. Las composiciones descritas en este documento (por ejemplo, en forma de un pulverizador) pueden administrarse mediante procedimientos endoscópicos para recubrir los tumores o inhibir la angiogénesis en un lugar deseado. Pueden utilizarse mallas quirúrgicas que se han recubierto con composiciones antiangiogénicas de la presente invención en cualquier procedimiento en el que puede utilizarse una malla quirúrgica. Por ejemplo, puede utilizarse una malla quirúrgica cubierta con una composición antiangiogénica, durante la cirugía de resección de cáncer abdominal (por ejemplo, después de la resección de colon) para proporcionar apoyo a la estructura y para liberar una cantidad del factor antiangiogénico.
Los procedimientos que se describen en este documento para tratar los sitios de escisión del tumor, que comprenden la administración de polinucleótido, polipéptido, agonista y/o agonista a los márgenes de resección de un tumor después de la escisión, de modo que se inhibe la recurrencia local del cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio. El compuesto antiangiogénico se administra directamente al sitio de escisión del tumor (por ejemplo, aplicado mediante impregnado, frotando o recubriendo de cualquier otra forma los márgenes de la resección del tumor con el compuesto de la antiangiogénico). Alternativamente, los compuestos antiangiogénico puede incorporarse antes de la administración a adhesivos quirúrgicos conocidos. Los compuestos antiangiogénicos se aplican al cáncer tras las resecciones hepáticas y tras las operaciones neuroquirúrgicas.
Los polinucleótidos, polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención pueden administrarse en el margen de resección de una amplia diversidad de tumores, incluyendo, por ejemplo, tumores de mama, colon, cerebro y hepáticos. Por ejemplo, pueden administrarse compuestos angiogénicos en el lugar de un tumor neurológico posteriormente a su escisión, de modo que se inhiba en el lugar la formación de nuevos vasos sanguíneos.
Los polinucleótidos, polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención también pueden administrarse junto con otros factores antiangiogénicos. Los ejemplos representativos de otros factores antiangiogénicos incluyen: factor antiinvasivo, ácido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel, Suramin, inhibidor tisular de metaloproteinasa-1, inhibidor tisular de metaloproteinasa-2, inhibidor del activador del plasminógeno 1, inhibidor del activador del plasminógeno-2 y diversas formar de metales de transición ligeros del "grupo d".
Los metales de transición ligeros del "grupo d" incluyen, por ejemplo, especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio y tántalo. Estas especies de metales de transición pueden formar complejos de metales de transición. Los complejos adecuados de las especies de metales de transición mencionados anteriormente incluyen complejos oxo de metales de transición.
Los ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen complejos oxo de vanadio, tales como complejos vanadato y vanadilo. Los complejos de vanadato adecuados incluyen complejos metavanadato y ortovanadato, tales como, por ejemplo, metavanadato amónico, metavanadato sódico y ortovanadaro sódico. Los complejos de vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanadilo, incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo, tales como mono y trihidratos de sulfato de vanadilo.
Los ejemplos representativos de los complejos de tungsteno y molibdeno también incluyen complejos oxo. Los complejos oxo de tungsteno adecuados incluyen complejos de tungstato y de óxido de tugnsteno. Los complejos de tungstato adecuados incluyen tungstato amónico, tungstato cálcico, dihidrato de tungstato sódico y ácido túngstico. Los óxidos de tungsteno adecuados incluyen el óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI). Los complejos oxo de molibdeno adecuados incluyen molibdato, óxido de molibdeno y complejos de molibdenilo. Los complejos de molibdato adecuados incluyen molibdato amónico y sus hidratos, molibdato sódico y sus hidratos y molibdato potásico y sus hidratos. Los óxidos de molibdeno adecuados incluyen óxido de molibdeno (VI), óxido de molibdeno (VI) y ácido molíbdico. Los complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetona de molibdenilo. Otros complejos de tungsteno y molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo de, por ejemplo, glicerol, ácido tartárico y azúcares.
También puede utilizarse, en el contexto de la presente invención, una amplia diversidad de otros factores antiangiogénicos. Los ejemplos representativos incluyen factor plaquetario 4, sulfato de protamina, derivados de quitina sulfatada (preparados a partir de conchas de cangrejo reina), (Murata y col., Cancer Res, 51:22-26, 1991), complejo peptidoglicano polisacárido sulfatado (SP-PG) (la función de este compuesto puede potenciarse con la presencia de esteroides tales como estrógeno y citrato de tamoxifeno); estaurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo, por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d,L-3,4-dehidroprolina, tiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4-piridinil)-2-(3H)-oxazolona, metotrexato; mitoxantrona, heparina, interferones, 2 macroglobulina sérica, ChIMP-3 (Pavloff y col., J. Biol. Chem. 267:17321-17326, 1992); quimostatina (Tomkinson y col., Biochem J. 286:475-480. 1992), tetradecasulfato de ciclodextrina; eponemicina, camptotecina, fumagilina (Ingber y col., Nature 348:555-557, 1990); tiomalato sódico de oro ("GST", Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79:144-1445, 1987); anticolagenasa sérica; alfa-2 antiplasmina (Holmes y col., J. Biol. Chem. 262 (4):1659-1664, 1987); bisantreno (Instituto Nacional del Cáncer); lobenzarit disódico (ácido N-(2)-carboxifenil1-4-cloroantronílico disódico o "CCA"; Takeuchi y col., Agents Actions 36:312-316, 1992); talidomida, esteroides angostáticos; AGM-1470, carboxiaminolimidazol e inhibidores de metaloproteinasas tales como BB94.
Enfermedades a nivel celular
Las enfermedades asociadas con una supervivencia celular aumentada o con la inhibición de la apoptosis que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53 y tumores dependientes de hormonas, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario), enfermedades, trastornos y/o dolencias autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario, y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus del herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad injerto frente a huésped, rechazo de injerto agudo y rechazo de injerto crónico. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención pueden usarse para inhibir el crecimiento, progresión y/o metástasis de cánceres, en particular los enumerados anteriormente.
Las enfermedades o dolencias asociadas con la supervivencia celular aumentada que podrían tratarse, prevenirse o diagnosticarse mediante los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la invención, incluyen, pero sin limitación, la progresión y/o metástasis de cánceres y enfermedades relacionadas tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluyendo mieloblástica, promieloblástica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica (granulocítica) crónica y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad de no-Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada y tumores sólidos incluyendo, pero sin limitación, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de células basal, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervicouterino, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de célula pequeña, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Las enfermedades asociadas con una apoptosis aumentada que podrían tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante los polinucleótidos o polipéptidos, y/o agonistas o antagonistas de la invención, incluyen SIDA, enfermedades, trastornos y/o dolencias neurodegenerativas (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad previa asociada); enfermedades, trastornos y/o dolencias autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario y artritis reumatoide), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad injerto contra huésped, lesión por isquemia (por ejemplo, lesión hepática relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/repercusión, colestosis (lesión del tracto biliar) y cáncer de hígado), enfermedad hepática inducida por toxina (tal como la causada por el alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.
Curación de heridas y proliferación de células epiteliales
En este documento también se describe un procedimiento para utilizar los polinucleótidos o polipéptidos, y/o agonistas o antagonistas de la invención, con fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación de células epiteliales y de queratinocitos basales con el fin de curar la herida y estimular la producción de folículos pilosos y la curación de heridas dérmicas. Los polinucleótidos o polipéptidos, así como agonistas o antagonistas de la invención, pueden usarse clínicamente para estimular la curación de heridas incluyendo heridas quirúrgicas, heridas excisionales, heridas profundas que implican el daño de la dermis y la epidermis, heridas en el tejido ocular, heridas en el tejido dental, heridas en la cavidad oral, úlceras diabéticas, úlceras dérmicas, úlceras de cúbito, úlceras arteriales, úlceras por estasis venosa, quemaduras resultantes de exposición al calor o a agentes químicos, y otras condiciones de curación de heridas anómalas tales como uremia, malnutrición, deficiencias en vitaminas y complicaciones asociadas con el tratamiento sistémico con esteroides, terapia con radiación y fármacos antineoplásicos y antimetabolitos. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían usarse para promover el reestablecimiento dérmico posterior a la pérdida dérmica.
Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención podría usarse para aumentar la adherencia de los injertos de piel al lecho de una herida y estimular la reepitelización del lecho de la herida. A continuación aparece una lista no exhaustiva de injertos en los que podrían usarse polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención para aumentar la adherencia al lecho de una herida: autoinjertos, piel artificial, aloinjertos, autoinjerto autodérmico, injertos autoepidérmicos, injertos avasculares, injertos de Blair-Browm, injerto de hueso, injertos brefoplasticos, injerto de cutis, injerto retrasado, injerto dérmico, injerto epidérmico, injerto muscular, injerto de grosor completo, injerto heterólogo, xenoinjerto, injerto homólogo, injerto hiperplásico, injerto lamelar, injerto de malla, injerto mucoso, injerto de Ollier-Thiersch, injerto omental, injerto en parche, injerto pedicular, injerto penetrante, injerto de piel en hendidura, injerto en hendidura grueso. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención pueden usarse para promover tersura de la piel y para mejorar la apariencia de piel envejecida.
Se cree que los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención también podrían producir cambios en la proliferación de hepatocitos y en la proliferación de células epiteliales en el pulmón, mama, páncreas, estómago, intestino delgado e intestino grueso. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención podrían promover la proliferación de células epiteliales tales como sebocitos, folículos pilosos, hepatocitos, neumocitos de tipo II, células goblet productoras de mucina y otras células epiteliales y sus progenitores contenidos en la piel, pulmón, hígado y tracto gastrointestinal. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención puede promover la proliferación de células endoteliales, queratinocitos y queratinocitos basales.
Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, también podrían usarse para reducir los efectos secundarios de la toxicidad intestinal que tienen lugar tras la radiación, tratamientos de quimioterapia o infecciones virales. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de la invención, pueden tener un efecto citoprotector en la mucosa del intestino delgado. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, también pueden estimular la curación de mucositis (úlceras en la boca) que es resultado de quimioterapia e infecciones virales.
Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían además usarse en la regeneración completa de la piel en defectos dérmicos de grosor completo y parcial, incluyendo quemaduras (es decir, repoblación de folículos pilosos, glándulas sudoríparas y glándulas sebáceas), tratamiento de otros defectos de la piel tales como psoriasis. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían usarse para tratar la epidermolisis bullosa, un defecto en la adherencia de la epidermis a la dermis subyacente que da lugar a ampollas frecuentes, abiertas y dolorosas acelerando la reepitelización de estas lesiones. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían también usarse para tratar úlceras gástricas y duodenales y ayudar a curar mediante la formación de cicatrices de la capa mucosa y en la regeneración de la capa mucosa glandular y mucosa duodenal más rápidamente. Enfermedades intestinales inflamatorias, tales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, son enfermedades que dan lugar a la destrucción de la superficie mucosa del intestino delgado o grueso, respectivamente. De este modo, los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían usarse para promover el revestimiento de la superficie mucosa para ayudar a la curación más rápida y prevenir la progresión de la enfermedad inflamatoria intestinal. Se espera que el tratamiento con los polinucleótidos o polipéptidos, y/o anticuerpos de la invención tenga un efecto significativo en la producción de moco a lo largo del tracto gastrointestinal y podría usarse para proteger la mucosa intestinal de sustancias dañinas que se ingieran o después de la cirugía. Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían usarse para tratar enfermedades asociadas con la infraexpresión de los polinucleótidos de la invención.
Además, los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención podrían usarse para prevenir y curar el daño en los pulmones debido a diversos estados patológicos. Un factor de crecimiento tal como los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, que podrían estimular la proliferación y diferenciación y promover la reparación del epitelio alveolar y bronquial para prevenir o tratar el daño pulmonar agudo o crónico. Por ejemplo, el enfisema, que da lugar a la pérdida progresiva de alveolos y a daños por inhalación, es decir, resultado de la inhalación de humo y quemaduras, que causa necrosis del epitelio bronquial y de los alveolos, podría tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse de forma eficaz usando los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención. También, los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podrían usarse para estimular la proliferación y diferenciación de neumocitos de tipo II, que pueden ayudar a tratar o prevenir enfermedades tales como las enfermedades de la membrana hialina, tales como el síndrome de estrés respiratorio infantil y la displasia broncopulmonar en niños prematuros.
Los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podría estimular la proliferación y diferenciación de hepatocitos y, de este modo, podría usarse para aliviar o tratar enfermedades y afección patológicas hepáticas tales como insuficiencia hepática fulminante causada por cirrosis, daño hepático causado por hepatitis viral y sustancias tóxicas (por ejemplo, acetaminofeno, tetracloruro de carbono y otras hepatotoxinas conocidas en la técnica).
Además, los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podría usarse para tratar o prevenir el inicio de la diabetes mellitus. En pacientes con diabetes de tipos I y II recién diagnosticas, donde siguen funcionando algunas células del islote, los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podría usarse para mantener la función del islote de modo que se alivie, retrase o prevenga la manifestación permanente de la enfermedad. También, los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la invención, podría usarse como auxiliares en el trasplante de células del islote para mejorar o promover la función de las células del islote.
Trastornos neurológicos
Las enfermedades, trastornos y/o dolencias del sistema nervioso, que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse con las composiciones de la invención (por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos y/o anticuerpos), incluyen, pero sin limitación, daños del sistema nervioso y enfermedades, trastornos y/o dolencias que dan lugar a desconexión de axones, una disminución o degeneración de neuronas o a desmielinización. Las lesiones del sistema nerviosos que puede tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse en un pacientes (incluyendo pacientes mamíferos humanos y no humanos) según la invención, incluyen pero sin limitación, las lesiones siguientes de los sistemas nervioso central (incluyendo la espinal dorsal, cerebro) o el periférico: (1) lesiones isquémicas, en las que una carencia de oxigeno en una porción del sistema nervioso da lugar a lesión o muerte neuronal, incluyendo infarto o isquemia cerebral, o infarto o isquemia de la médula espinal; (2) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones causadas por lesión física o asociado con cirugía, por ejemplo, lesiones que afectan a una porción del sistema nervioso o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que una porción del sistema nervioso se destruye o daña por el tejido maligno que es un cáncer asociado con el sistema nervioso o un cáncer derivado del tejido del sistema nervioso; (4) lesiones infecciosas, en las que una porción del sistema nervios se destruye o daña como resultado de una infección, por ejemplo, por un absceso o asociada con infección del virus de la inmunodeficiencia humana, virus del herpes zoster o virus del herpes simple, o con la enfermedad de Lyme, tuberculosis, sífilis; (5) lesiones degenerativas, en las que una porción del sistema nervioso se destruye o daña como resultado de un proceso degenerativo que incluye, pero sin limitación, la degeneración asociada con enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington o esclerosis lateral amiotrófica (ALS); (6) lesiones asociadas con enfermedades, trastornos y/o dolencias nutricionales, en las que una porción de sistema nervioso se destruye o daña por un trastorno nutricional o trastorno del metabolismo incluyendo, pero sin limitación, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Werniche, ambliopía de tabaco y alcohol, enfermedad de Marchiafava-Bignami (degeneración primaria del cuerpo calloso) y degeneración cerebelar alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas con enfermedad sistémica incluyendo, pero sin limitación, diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritomatoso sistémico, carcinoma o sarcoidosis; (8) lesiones causadas por sustancias tóxicas incluyendo alcohol, plomo o neurotoxinas en particular y (9) lesiones desmielinizantes en las que una porción del sistema nervioso se destruye o lesiona por una enfermedad desmielinizante que incluye, pero sin limitación, esclerosis múltiple, mielopatía asociada con el virus de la inmunodeficiencia humana, mielopatía transversa o diversas etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva y mielinolisis pontina central.
Los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de la invención pueden usarse para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia cerebral. Según esta realización, las composiciones de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar lesiones en células neurales asociadas con hipoxia cerebral. En un aspecto de esta realización, los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar lesiones de células neurales asociadas con isquemia cerebral. En otro aspecto de esta realización, los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnostico de lesión de células neurales asociada con infarto cerebral. En otro aspecto de esta realización, los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar o prevenir la lesión de células neurales asociada con un ictus. En un aspecto adicional de esta realización, los polipéptidos, polinucleótidos o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar la lesión de células neurales asociada con un ataque al corazón.
Las composiciones de la invención que son útiles para tratar o prevenir un trastorno del sistema nervioso pueden seleccionarse ensayando la actividad biológica de promoción de la supervivencia o diferenciación de neuronas. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las composiciones de la invención que provoca cualquiera de los siguientes efectos puede ser útiles según la invención: (1) aumento del tiempo de supervivencia de neuronas en cultivo; (2) aumento de la proliferación de neuronas en cultivo o in vivo; (3) aumento de la producción de una molécula asociada a neuronas en cultivo o in vivo, por ejemplo, colina acetiltransferasa o acetilcolinesterasa con respecto a neuronas motoras o (4) descenso de los síntomas de la disfunción de neuronas in vivo. Estos efectos pueden medirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En realizaciones preferidas no limitantes, el aumento de supervivencia de neuronas puede medirse de forma rutinaria usando un procedimiento mostrado en este documento o, por otro lado, conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, el procedimiento mostrado en Arakawa y col. (J. Neurosci. 10:3507-3515 (1990)); aumento de la proliferación de neuronas puede detectarse mediante procedimientos de la técnica, tal como, por ejemplo, los procedimientos mostrados en Pestronk y col. (Exp. Neurol. 70:65-82 (1980)) o Brown y col. (Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42 (1981); el aumento de la producción de moléculas asociadas a neuronas puede medirse mediante bioensayos, ensayos enzimáticos, unión a anticuerpo, ensayo de inmunotransferencia de ARN total, etc., usando técnicas conocidas en la materia y dependientes de la molécula que se mide y la disfunción de las neuronas motoras puede medirse evaluando la manifestación física del trastorno de neuronas motoras, por ejemplo, debilidad, velocidad de conducción de las neuronas motoras o discapacidad funcional.
En realizaciones específicas, las enfermedades, trastornos y/o dolencias de neuronas motoras, que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse incluyen, pero sin limitación, enfermedades, trastornos y/o dolencias tales como infarto, infección, exposición a toxina, trauma, daño quirúrgico, enfermedad degenerativa o cáncer que pueden afectar a neuronas motoras así como otros componentes del sistema nervioso, así como enfermedades, trastornos y/o condiciones que selectivamente afectan a neuronas, tales como esclerosis lateral amiotrófica, e incluyen, pero sin limitación, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva infantil (síndrome de Fazio-Londe), poliomelitis y el síndrome de postpolio y neuropatía motorsensorial hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth).
Enfermedad infecciosa
Un polipéptido o polinucleótido y/o anticuerpo de la presente invención pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar agentes infecciosos. Por ejemplo, aumentando la respuesta inmunitaria, aumentado especialmente la proliferación y diferenciación de células B y/o células T, pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticar enfermedades infecciosas. La respuesta inmunitaria puede aumentarse potenciando una respuesta inmunitaria existente o iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Alternativamente, el polipéptido o polinucleótido y/o agonista o antagonista de la presente invención también pueden inhibir directamente el agente infeccioso, sin provocar necesariamente una respuesta inmunitaria.
Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede causar enfermedades o síntomas que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de virus incluyen, pero sin limitación los siguientes virus de ADN y ARN y familias virales: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, dengue, VEB, VIH, Flaviviridae, Hepadnaviridae (hepatitis), Herpesviridae (tales como, citomegalovirus, herpes simple, herpes zoster), mononegavirus (por ejemplo Paramyxoviridae, morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo influenza A, influenza B y parainfluenza), papilomavirus, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tales como viruela o vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, lentivirus) y Togaviridae (por ejemplo, rubivirus). Los virus incluidos en estas familias pueden causar diversas enfermedades o síntomas, incluyendo, pero sin limitación: artritis, broquiolitis, virus sincitial respiratorio, encefalitis, infecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis, queratitis), síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, activa crónica, delta), encefalitis japonesa B, Junin, Chikungunya, fiebre de Rift Valley, fiebre amarilla, meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabia, el catarro común, polio, leucemia, rubeola, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la piel (por ejemplo, Kaposi, verrugas) y viremia, Los polinucleótidos o polipéptidos, o anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En realizaciones específicas, los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar: meningitis, dengue, EBV y/o hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). En una realización específica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la invención se usa para tratar pacientes no sensibles a una o más vacunas para la hepatitis, disponibles en el mercado. En una realización específica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar el SIDA.
De forma similar, los agentes bacterianos y fúngicos que pude causar enfermedades o síntomas y puede tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención incluyen, pero no con limitación, las siguientes bacterias Gram negativas y Gram positivas y familias de bacterias y hongos: Actinomycetales (por ejemplo Corynebacterium, Mycobacterium, Norcardia), Cryptococcus neoformans, Aspergillosis, Bacillaceae (por ejemplo, Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (por ejemplo Borrelia burgdorferi), Brucellosis, Candidiasis, Campylobacter, Coccidioidomycosis, Cryptococcosis, Dermatocycoses, E. coli (por ejemplo, E. coli enterotoxinogénica y E. coli enterohemorrágica), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi), Serratia, Yersinia), Erysipelothrix, Helicobacter, legionelosis, leptospirosis, Listeria, Mycoplasmatales, Mycobacterium leprae, Vibrio cholerae, Neisseriaceae (por ejemplo, Acinetobacter, Gonorrhea, meningococos), Meisseria meningitidis, infecciones por Pasteurellacea (por ejemplo, Actinobacillus, Heamophilus (por ejemplo, Heamophilus influenza de tipo B), Pasteurella), Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae, Syphilis, Shigella sp., estafilococos, meningococos, neumococos y estreptococos (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus del grupo B). Estas familias bacterianas o fúngicas puede causar las siguientes enfermedades o síntomas, incluyendo, pero sin limitación: bacteriemia, endocarditis, infecciones oculares (conjuntivitis, tuberculosis, uveítis), gingivitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, infecciones relacionadas con SIDA), paroniquia, infecciones relacionadas con prótesis, enfermedad de Reiter, infecciones del tracto respiratorio, tal como tosferina o enfisema, sepsis, enfermedad de Lyme, enfermedad del arañazo del gato, disentería, fiebre paratifoidea, envenenamiento por alimentos, tifóide, neumonía, gonorrea, meningitis (por ejemplo, meningitis de tipos A y B), clamidia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculosis, lupus, botulismo gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumatoide, escarlatina, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la piel (por ejemplo, celulitis, dermatomicosis), toxemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas. Los polinucleótidos o polipéptidos, agonistas o antagonistas de la invención pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En realizaciones específicas, los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar: tétano, difteria, botulismo y/o meningitis de tipo B.
Además, los agentes parsitos que causan enfermedades o síntomas que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse mediante un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, las siguientes familias o clases: amebiasis, babesiosis, coccidiosis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, durina, ectoparasíticos, giardiasis, helmintiasis, leismaniasis, teileriosis, toxoplasmosis, tripanosomiasis y tricomonas y esporozoos (por ejemplo Plasmodium virax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale). Estos parásitos pueden causar diversas enfermedades o síntomas, incluyendo, pero sin limitación: sarna, trombiculosis, infecciones oculares, enfermedad intestinal (por ejemplo, disentería, giardiasis), enfermedad hepática, enfermedad pulmonar, infecciones oportunistas (por ejemplo, relacionadas con SIDA), malaria, complicaciones del embarazo y toxoplasmosis. Los polinucleótidos o polipéptidos, o anticuerpos de la invención, pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En realizaciones específicas, los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar la malaria.
Preferiblemente, el tratamiento o prevención usando un polipéptido o polinucleótido y/o anticuerpos de la presente invención, podría hacerse administrando una cantidad eficaz de un polipéptido al paciente o eliminando células del paciente, administrando las células con un polinucleótido de la presente invención y devolviendo las células al paciente (terapia ex vivo). Además, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede usarse como un antígeno en una vacuna para producir una respuesta inmunitaria frente a una enfermedad infecciosa.
Regeneración
Un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención pueden usarse para diferenciar, proliferar y atraer células, llevando a la regeneración de tejidos (véase, Science 276:59-87 (1997)) La regeneración de tejidos podría usarse para reparar, sustituir o proteger un tejido dañado por defectos congénitos, trauma (heridas, quemaduras, incisiones o úlceras), edad, enfermedad (por ejemplo, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión por reperfusión o daño por citocina
sistémica.
Los tejidos que pueden regenerarse usando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardíaco), vasculatura (incluyendo vascular y linfáticos), tejido nervioso, hematopoyético y esquelético (hueso, cartílago, tendón y ligamiento). Preferiblemente, la regeneración tiene lugar sin o con cicatrización disminuida. La regeneración también puede incluir angiogénesis.
Además, un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención puede aumentar la regeneración de tejidos difíciles de curar. Por ejemplo, la regeneración aumentada del tendón/ligamento podría recuperarse en poco tiempo tras el daño Un polinucleótido o polipéptido y/o agonista o antagonista de la presente invención también podría usarse profilácticamente en un esfuerzo por evitar el daño. Las enfermedades específicas que pueden tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse incluyen tendinitis, síndrome del túnel carpiano y otros defectos de tendones o ligamientos. Un ejemplo adicional de regeneración del tejido de heridas no curadas incluye úlceras de presión, úlceras asociadas con heridas por insuficiencia vascular, quirúrgicas y traumáticas.
De forma similar, el tejido nervioso y cerebral también podría regenerarse usando un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención para proliferar y diferenciar células nerviosas. Las enfermedades que podrían tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse usando este procedimiento incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatía o enfermedades, trastornos y/o condiciones mecánicas y traumáticas (por ejemplo, trastornos de la espinal dorsal, trauma de cabeza, enfermedad cerebrovascular e ictus). Específicamente, las enfermedades asociadas con lesionas de nervios periféricos, neuropatía periférica (por ejemplo, resultante de quimioterapia u otras terapias médicas), neuropatías localizadas y enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager); podría tratarse, prevenirse y/o diagnosticarse todas usando los polinucleótidos o polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención.
Quimiotaxis
Un polinucleótido o polipéptido y/o agonista o antagonista de la presente invención pueden tener actividad quimiotáctica. Una molécula quimiotáctica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastocitos, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio en particular del cuerpo, tal como sitio de inflamación, infección o de hiperproliferación. A continuación, las células movilizadas pueden rechazar y/o curar el trauma o anomalía en particular.
Un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención puede aumentar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas moléculas quimiotácticas pueden, a continuación, usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar inflamación, infección, enfermedades, trastornos y/o dolencias hiperproliferativas o cualquier trastorno del sistema inmunitario aumentado el número de células dirigidas a una localización en particular en el organismo. Por ejemplo, las moléculas quimiotácticas pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar heridas y otros traumas de tejidos atrayendo células inmunitarias a la localización lesionada. Las moléculas quimiotácticas de la presente invención también pueden atraer fibroblastos que puede usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar
heridas.
También se contempla que un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención pueda inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas podrían además usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o dolencias. De este modo, un polinucleótido o polipéptido y/o anticuerpo de la presente invención podría usarse como inhibidor de quimiotaxis.
Otras realizaciones preferidas
También se describe en este documento una molécula de ácido nucleico en la que dicha secuencia de nucleótidos contiguos se incluye en la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 en el intervalo de posiciones que empiezan con el nucleótido de aproximadamente la posición del "NT 5' del codon de inicio de ORF" y termina con el nucleótido de aproximadamente la posición del "NT 3' de ORF", como se define para la ID SEC Nº 1 en la Tabla I.
También se describe un procedimiento in vitro para diagnosticar en un sujeto una dolencia patológica asociada con la estructura o expresión anómala de un gen que codifica una proteína idéntica a la de la Tabla I, el procedimiento comprende una etapa de detección en una muestra biológica obtenida a partir de las moléculas de ácido nucleico de dicho sujeto, si las hay, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por: una secuencia de nucleótidos de las ID SEC Nº 1 donde X es cualquier número entero como se define en la Tabla I; y una secuencia de nucleótidos codificada por un clon de ADNc identificado como un identificador del clon de ADNc en la Tabla I y contenido en el depósito de la ATCC, con número de depósito para dicho clon de ADNc mostrado en la tabla I.
El procedimiento para diagnosticar una dolencia patológica puede comprender una etapa de detección de moléculas de ácido nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos, en un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, en donde al menos una secuencia en dicho panel es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada entre dicho grupo.
También se describe en este documento una composición en cuestión que comprende moléculas de ácido nucleico aislado donde las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de ácido nucleico comprenden un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, en donde al menos una secuencia de dicho panel es la menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por: una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, donde X es cualquier número entero como se define en la Tabla I, y una secuencia de nucleótidos codificada por un clon de ADNc identificado por un identificador del clon de ADNc en la tabla I y contendido en el depósito de la ATCC con número de depósito para dicho clon de ADNc mostrado en la tabla I. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o moléculas de ARN.
También se describe en este documento un procedimiento para hacer un polipéptido aislado que comprende cultivar esta célula hospedadora recombinante en condiciones tal que dicho polipéptido se exprese, y recuperar dicho polipéptido, También se prefiere este procedimiento de obtener un polipéptido aislado en donde dicha célula hospedadora recombinante es una célula eucariótica y dicho polipéptido es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 donde Y es un número entero mostrado en la Tabla I y dicha posición del "total de AA de ORF" de la ID SEC Nº 2 se define en la Tabla I; y una secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por un clon de ADNc identificado mediante un identificador del clon de ADNc de la Tabla I y contenido en el depósito de la ATCC con número de mostrado de depósito para dicho clon de ADNc mostraod en la Tabla I. También se prefiere el polipéptido aislado producido por este procedimiento.
También se describe el uso de un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo reivindicado de la invención eficaz para aumentar el nivel de dicha actividad proteica para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un individuo que necesita de un aumento del nivel de una actividad proteica en dicho individuo,
Habiendo descrito la invención en general, se entenderá más fácilmente lo mismo en referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de orientación y no pretender ser limitantes.
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Ejemplos Descripción de las realizaciones preferidas Ejemplo 1 Análisis de Bioinformática
Una proteína que contiene un dominio con repeticiones ricas en leucina (LLR), denominada como receptor de angiotensina/vasopresina AII/AVP (número de acceso a Genbank: AAC39910; ID SEC Nº 25) y otras proteínas que contiene un dominio LLR, tal como KIAA0926 (Nº de acceso a Genbank NP_055737, ID SEC Nº 26) se usaron como sondas para buscar en las bases de datos EST de Incyte y del dominio público, además de la base de datos genómica del Proyecto del Genoma Humano. El programa de búsqueda usado fue BLAST (Basic Local Aligment Search Tool). A partir de este análisis, se identificaron EST y exones que codifican nuevos candidatos posibles, relacionados con el receptor de angiotensina/vasopresina, sobre la base de la homología de secuencia. Los candidatos potenciales (EST de Incyte: 1632960H1 y EST de dominio público GI número: g201045) se secuenciaron. Se identificaron dos clones, denominamos SILRR1A (ID SEC Nº 5 Nº de depósito de la ATCC PTA-2679) y SILRR1B (ID SEC Nº 6 Nº de depósito de la ATCC PTA-2674) que se obtuvieron usando la información de la secuencia EST. La secuencia de estos dos clones se combinó mediante procedimientos de análisis de cóntigos conocidos en la técnica para obtener el clon de longitud completa que codifica la nueva proteína HLRRSI1. Se analizaron los posibles dominios transmembrana de las secuencias proteicas completas de estas proteínas. Se usó el programa TMPRED (5) para la predicción de transmembrana. También, se analizaron los posibles motivos y dominios proteicos de estas proteínas. Se usó el programa de motivos de GCG (GCG es un paquete de software del Grupo de Ordenadores para Genética de Wisconsin) para identificar los posibles motivos de la proteína. Los dominios de la proteína se analizaron usando HMMER. HMMER es una implementación distribuida gratuitamente del software del modelo oculto de Markov (HMN) para análisis de secuencia de proteína (http://hmmer.wustl.edu/). El conjunto de búsqueda de dominio de proteína fue el Pfam (http://pfam.wustl.edu/). Pfam es una gran colección de alineamientos de secuencias múltiples y modelos ocultos de Markov de dominios de proteínas que cubre 2.478 familias de proteínas. Mediante estos análisis, se predijo que la proteína HLRRSI1 comprendía uno o más dominios de repeticiones ricos en leucinas.
Ejemplo 2 Procedimiento para construir una biblioteca de ADNc fraccionada de cerebro y testículos
El ARN poli A + de cerebro y testículos se obtuvo de Clontech y se convirtió en ADNc de doble cadena usando el sistema plasmídico SuperScript^{TM} para síntesis de ADNc y de clonación de plásmido (Life Technologies) excepto que no se incorporó un radioisótopo en ninguna de las etapas de síntesis del ADNc y que el ADNc se fracción por HPLC. Esto se logró en un sistema TransGenomics HPLC equipado con una columna de exclusión molecular (TosoHass) de dimensiones 7,8 mm x 30 cm y un tamaño de partícula de 10 \mum. Se usó como fase móvil solución salina tamponada con Tris y la columna se desarrolló con un caudal de 0,5 ml/min. Se analizaron los cromatogramas resultantes para determinar que fracciones podrían mezclarse para obtener los ADNc mayores; generalmente se mezclaron las fracciones que eluían en el intervalo de 12 a 15 minutos. Los ADNc se precipitaron antes del ligamiento en los sitios SalI/NotI en el vector pSport suministrado con el kit. Usando una combinación de PCR con cebadores dirigidos a los extremos del vector y la digestión con las enzimas de restricción de SalI/NotI de ADN mini-prep, se determinó que el tamaño medio de la inserción de la biblioteca era mayor de 3,5 Kb. La complejidad general de la biblioteca era mayor de 10^{7} clones independiente. La biblioteca se amplificó en agar semisólido durante 2 días a 30ºC.
Se inoculó una alícuota (200 microlitos) de la biblioteca amplificada en un cultivo de 200 ml para el aislamiento del ADN de cadena sencilla mediante la superinfección con un fago colaborador f1. Después del crecimiento durante una noche, las partículas del fago liberado se precipitaron con PEG y el ADN se aisló con proteinasa K, SDS y extracciones con fenol. El ADN circular de cadena sencilla se concentró por precipitación por etanol y se usó para los experimentos de captura de ADNc descrito a continuación.
Ejemplo 3 Clonación del nuevo polinucleótido humano HLRRSI1
Usando la secuencia EST siguiente, se diseñaron los siguientes pares de cebadores para PCR y los oligonucleótidos biotinilados 5' complementarios de 80 pb (mostrado en la Tabla III) y se obtuvieron de Genset Oligos (San Diego, CA) para su uso en los procedimientos de clonación descritos a continuación.
Clon BMS Nº 12
INCYTE 1632960H1
Secuencia EST:
\hskip0,7cm2 
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TABLA III Oligonucleótidos
3
Se añadió un microlitro (ciento cincuenta nanogramos) de un oligo biotinilado (ID SEC Nº 13) a seis microlitros (seis microgramos) de una mezcla de las bibliotecas de ADNc de cadena sencilla circular cerrado de forma covalente de cerebro y testículos descritos en este documento y a siete microlitos de formamida al 100% en un tubo de PCR de 0,5 ml. La mezcla se calentó en un termociclador a 95ºC durante 2 min. A la mezcla calentada de sonda/biblioteca de ADNc se añadieron cuarenta microlitos de tampón de hibridación x2 (formamida al 50%, NaCl 1,5 M, NaPO_{4} 0,04 M, pH 7,2, EDTA 5 mM, SDS al 0,2%) y se incubó a 42ºC durante 26 horas. Los híbridos entre el oligo biotilinado y el ADNc circular se aislaron diluyendo la mezcla de hibridación hasta 220 microlitos en una solución que contenía NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0 y se añadieron 125 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina. Esta solución se incubó a 42ºC durante 60 min, mezclando cada 5 minutos para resuspender las perlas. Las perlas se separaron de la solución con un imán y las perlas se lavaron tres veces en 200 microlitros de SSPE x 0,1, SDS al 0,1% a 45ºC.
Los ADNc de cadena sencilla se liberaron de los complejos oligo biotinilado/perlas magnéticas de estreptavidina añadiendo 50 microlitos de NaOH 0,1N e incubando a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadieron seis microlitros de acetato sódico 3 M junto con 15 microgramos de glicógeno y la solución se precipitó con etanol con 120 microlitros de etanol al 100%. El ADN se resuspendió en 12 microlitros de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0). El ADNc de cadena sencilla se convirtió en doble cadena en un termociclador mezclando 5 microlitos del ADN capturado con 1,5 microlitos de cebador patrón SP6, 10 micromolar (homólogo a una secuencia del vector de clonación del ADNc) y 1,5 microlitros de tampón de PCR x10. La mezcla de calentó a 95ºC durante 20 segundos, y a continuación, se bajó a 59ºC. En este momento, 15 microlitos de un mezcla reparadora, que se precalentó a 70ºC (la mezcla reparadora contiene 4 microlitos de dNTP 5 mM (1,26 mM de cada), 1,5 microlitos de tampón de PCR 10x, 9,25 microlitros de agua y 0,25 microlitros de polimerasa Taq). La solución se bajó a 73ºC y se incubó durante 23 min. El ADN reparado se precipitó con etanol y se resuspendió en 10 microlitos de TE. Se electroporaron dos microlitros en células DH12S de E. coli y las colonias resultantes se analizaron por PCR, usando un par de cebadores diseñaron a partir de las secuencias EST para identificar los ADNc adecuados. Los clones de ADNc que fueron positivos por PCR tenían las inserciones de dimensión adecuada y se eligieron dos clones por cada sonda para la secuenciación del ADN.
La secuencia nucleotídica de longitud completa y el polipéptido codificada de HLRRSI1 se muestra en las Figuras 1 A-C.
Ejemplo 4 Perfil de expresión del nuevo polipéptido humano HLRRSI1
El par de cebadores de PCR siguiente se usó para medir los niveles basales del ARNm de HLRRSI1 por PCR cuantitativa:
Sentido: 5'-CATGGTTTCAGAGCGTGTGAA-3' \hskip2cm (ID SEC Nº 11)
Complementaria: 5'-TCGTACAGGCAGTACAGCAACTC-3' \hskip0,4cm (ID SEC Nº 12)
Brevemente, la primera cadena del ADNc se hizo a partir de ARNm disponible en el mercado (Clontech) y se sometió a una PCR cuantitativa en tiempo real usando un aparato PE 5700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) que detecta la cantidad de ADN amplificado durante cada ciclo mediante la producción de fluorescencia verde de SYBR, un colorante que une específicamente a ADN de cadenas dobles. El par de cebadores proporcionado anteriormente se usó en la reacción de PCR. La especificidad del par de cebadores por su objetivo se verificó realizando un perfil de desnaturalización térmica al final del desarrollo que daba una indicación del número de complejos de hibridación de ADN diferente presentes mediante la determinación de la Tm de fusión. En el caso del par de cebadores del nuevo gen HLRRSI1, sólo se detectó un fragmento de ADN que tenía un punto de fusión homogéneo. Las contribuciones del ADN genómico contaminante a la evaluación de la abundancia de tejido se controle realizando la PCR con la primera cadena de ADNc hecha con y sin transcriptasa inversa. En todos los casos, la contribución del material amplificado en los controles sin transcriptasa inversa era despreciable.
Las pequeñas variaciones en la cantidad de ADNc usado en cada tubo se determinaron realizando un experimento paralelo usando un par de cebadores para un gen expresado en cantidades iguales en todos los tejidos, la ciclofilina. Estos datos se usaron para normalizar los datos obtenidos con los pares de cebadores de HLRRSI1 descritos en este documento. Los datos de PCR se convirtieron en una valoración relativa de la diferencia en la abundancia de transcripción entre los tejidos ensayados y los datos se presentan en forma de gráfico de barras en la Figura 4. Como se muestra, las transcripciones correspondientes con HLRRSI1 se expresaban mucho en el intestino delgado y, en menor grado, en el hígado, bazo y ganglio linfático.
Ejemplo 5 Procedimiento de valoración de la capacidad de HLRRSI1 para modular la apoptosis
El papel de los nuevos polipéptidos HLRRSI1 para promover o inhibir la apoptosis podría determinarse mediante la generación de líneas celulares transfectadas con los polinucleótidos HLRRSI1 de la presente invención, transitorios o estables, usando procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en este documento, y cualquier combinación de ensayos usados normalmente para la detección de fragmentación de ADN. Siendo un ejemplo representativa el ensayo de TUNEL (Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben, Sasson, SA, J. Cell. Biol., 199(3):493-501, (1992) que se incorpora a este documento en su integridad como referencia) que implica el marcaje final de los extremos rotos del ADN de cadena doble con dUTP conjugado con biotina usando transferasa terminal. A continuación, las células que experimentan muerte celular pueden detectarse fácilmente tiñendo con estreptavidina conjugada con FITC y cuantificación por citometría de flujo.
Alternativamente, puede expresarse HLRRSI1 transformando una línea celular de mamíferos, tales como, COS7, Hela o CHO, con un vector de expresión eucariótico que codifica HLRRSI1. Los vectores de expresión eucariótica están disponibles en el mercado y las técnicas para introducirlos en las células son bien conocidas por los expertos en la materia. Las células con y sin el vector de expresión de HLRRSI1 se incuban durante 48-72 horas tras la transformación en condiciones apropiadas para permitir que la línea celular exprese HLRRSI1. Posteriormente se usa un microscopio de fase para comparar el índice mitótico de las células transformadas frente a células control. Un aumento del índice mitótico donde HLRRSI1 estimula la proliferación celular indica actividad apoptótica. Asimismo, un descenso en el número de células donde HLRRSI1 estimula la apoptosis indica la actividad apoptótica.
La invención abarca otros procedimientos de ensayo conocidos en la técnica y/o descrito en este documento.
Ejemplo 6 Procedimiento de valoración de la capacidad de HLRRSI1 para modular la adhesión celular
El papel de los nuevos polipéptidos HLRRSI1 en la promoción de sucesos de adhesión celular podría determinarse mediante la generación de líneas celulares transfectadas con los polinucleótidos HLRRSI1 de la presente invención, de forma transitoria o estable, y someter a continuación a estas células a un ensayo hidrodinámico que puede evaluar la importancia relativa de diversas interacciones receptor/ligando en las adhesiones célula-célula y célula-sustrato. Los ensayos de adhesión dinámica pueden estimular las fuerzas encontradas en el torrente sanguíneo y pueden usarse para estimar la fuerza de las uniones entre células y ligandos. Un ensayo representativo se describe en Jones y col., 1994. El experto apreciaría que este ensayo podría fácilmente adaptarse para estudiar el potencial de HLRRSI1 para modular la adhesión celular.
La invención abarca otros procedimientos de ensayo conocidos en la técnica y/o descrito en este documento.
Ejemplo 7 Procedimiento de evaluación de la función fisiológica del polipéptido HLRRSI1 a nivel celular
La función fisiológica del polipéptido HLRRSI1 puede evaluarse mediante la expresión de las secuencias que codifican HLRRSI1 a niveles fisiológicamente elevados en sistemas de cultivo de células de mamíferos. El ADNc se subclona en un vector de expresión de mamíferos que contiene un potente promotor y lleva a altos niveles de expresión de ADNc (se proporcionan ejemplo en otra parte de este documento). Los vectores de elección incluyen pCMV SPORT (Life Technologies) y pCR3.1 (Invitrogen, Carlsbad CA), que contienen ambos el promotor de citomegalovirus. Se transfectaron de forma transitoria 5-10 \mug de vector recombinante en una línea celular humana, preferiblemente de origen hematopoyético o endotelial, usando formulaciones de liposomas o electroporación. Se cotransfectaron 1-2 \mug de un plásmido adicional que contenía las secuencias que codificaban una proteína marcadora. La expresión de una proteína marcadora proporciona un medio para distinguir células transfectadas de células no transfectadas y es un pronosticador fiable de la expresión de ADNc a partir del vector recombinante. Las proteínas marcadoras de elección incluyen, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP, Clontech), CD64 o una proteína de fusión CD64-GFP. La citometría de flujo (CFM), una técnica automática basada en óptica láser, se usa para identificar las células transfectada que expresan GFP o CD64-GFP y para evaluar el estado apoptótico de las células y otras propiedades celulares. La CMF detecta y cuantifica la captación de moléculas fluorescentes que diagnostica sucesos que preceden o coinciden con la muerte celular. Estos sucesos incluyen cambios en el contenido del ADN nuclear medido mediante la tinción del ADN con yoduro de propidio; cambios en el tamaño celular y granularidad medido dispersión de la luz hacia adelante y dispersión lateral de la luz 90º, regulación por disminución de la síntesis de ADN mediada por el descenso en la captación de bromodesoxiuridina; alteraciones en la expresión de las proteínas de la superficie celular e intracelulares medidas mediante reactividad con anticuerpos específicos y alteraciones en la composición de la membrana plasmática con medida de la unión de la proteína anexina V conjugada con fluoresceina a la superficie celular. Los procedimientos de citometría de flujo se explican en Ormerod, M. G (1994) Flow Cytometry, Oxford, Nueva York, NY.
La influencia de los polipéptidos HLRRSI1 en la expresión génica puede evaluarse usando poblaciones muy purificadas de células transfectadas con secuencias que codifican HLRRSI1 y CD64 o CD64-GFP. CD64 y CD64-GFP se expresan en la superficie de las células transfectadas y se unen a regiones conservada de la inmunoglobulina G humana (IgG). Las células transfectadas se separar de manera eficaz de las células no transfectadas usando perlas magnéticas recubiertas con IgG humana o un anticuerpo frente a CD64 (DYNAL, Lake Success, NY). El ARNm puede purificarse a partir de las células usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. La expresión de los ARNm que codifican los polipéptidos HLRRSI1 y otros genes de interés puede analizarse por análisis de inmunotransferencia del ARN total o por técnicas de micromatrices.
Ejemplo 12 Aislamiento de un clon específico a partir de la muestra depositada
El material depositado en la muestra asignada al número de depósito de la ATCC citado en la Tabla I para cualquier clon de ADNc dado también puede contener uno o más plásmidos adicionales, comprendiendo cada uno un clon de ADNc diferente del clon dado. De este modo, los depósitos que comparten el mismo número de depósito de la ATCC contienen al menos un plásmido para cada clon de ADNc identificado en la Tabla I. Típicamente, cada muestra depositada en la ATCC, citada en la Tabla I comprende una mezcla de cantidades aproximadamente iguales (en peso) de aproximadamente 1-10 plásmidos de ADNc, conteniendo cada uno un clon diferente de ADNc y/o un clon de ADNc parcial, pero esta muestra depósito puede incluir plásmidos para más o menos 2 clones de ADNc.
Para aislar un clon en particular de la citada muestra de ADN plasmídico(s) depositada para este clon en la Tabla I pueden usarse dos enfoques. En primer lugar, se aísla directamente un plásmido mediante análisis de los clones usando una sonda polinucleotídica correspondiente con la ID SEC Nº 1.
Especialmente, se sintetiza un polinucleótido específico con 30-40 nucleótidos usando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems de acuerdo con la secuencia indicada. El oligonucleótido se marca, por ejemplo, con ^{32}P-(-ATP) usando la polinucleótido quinasa de T4 y se purifica según procedimientos rutinarios (por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). La mezcla plasmídica se transforma en un hospedador adecuado, como se indica anteriormente (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, tal como aquellas que proporcionan el proveedor del vector o en la bibliografía o patentes relacionadas citadas anteriormente. Los transformantes se disponen en placas de agar al 1,5% (que contiene el agente de selección apropiado, por ejemplo, ampicilina), a una densidad de aproximadamente 150 transformantes (colonias) por placa. Estas placas se analizaron usando membranas de Nailon según procedimientos rutinarios para el análisis de colonias bacteriana (por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 1.93 a 1.104) u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Alternativamente, se sintetizan dos cebadores de 17-20 nucleótidos derivados de ambos extremos de la ID SEC Nº 1 (es decir, en la región de la ID SEC Nº 1 acotada por el NT 5' y el NT 3' del clon definido en la tabla I) y se usan para amplificar el ADNc deseado usando el plásmido de ADNc depositado como molde. La reacción en cadena de la polimerasa se realiza en condiciones rutinarias, por ejemplo, en 25 \mul de mezcla de reacción con 0,5 \mug del molde de ADNc anterior. Una mezcla de reacción conveniente es MgCl_{2} 1,5-5 mM, gelatina al 0,01% (p/v), dATP, dCTP, dGTP, dTTP 20 \muM de cada uno, 25 pmoles de cada cebador y 0,25 unidades de polimerasa Taq. Se realizaron treinta y cinco ciclos de PCR (desnaturalización a 94 grados C durante 1 min, hibridación a 55 grados C durante 1 min, elongación a 72ºC durante 1 min) con un termociclador automático de Perkin-Elmer Cetus. El producto amplificado se analiza por electroforesis en gel de agarosa, se corta la banda de ADN con el peso molecular esperado y se purifica. Se verifica que el producto de PCR es la secuencia seleccionada mediante subclonación y secuenciación del producto
de ADN.
El polinucleótido(s) de la presente invención, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención o el polipéptido codificado por el clon depositado puede representar versiones parciales o incompletas de la región codificadora completa (es decir, el gen de longitud completa). Se conocen diversos procedimientos en la técnica para la identificación de las porciones no codificadoras y/o codificadoras 5' o 3' de un gen que pueden no estar presente en el clon depositado. Los procedimientos que siguen son ilustrativos y no deberán interpretarse como limitantes del alcance de la invención Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, incubación de filtros con sondas, enriquecimiento de clones usando sondas específicas y protocolos similares o idénticas a los protocolos "RACE" 5' y 3' que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se dispone de un procedimiento similar a RACE 5' para generar el extremo 5' perdido de una transcripción de longitud completa deseada. (Fromont-Racine y col., Nucleic Acids Res. 21 (7):1683-1684 (1993)).
Brevemente, se liga un oligonucleótido de ARN específico a los extremos 5' de una población de ARN que presumiblemente contiene transcripciones de ARN del gen de longitud completa. Para la amplificación por PCR de la porción 5' del gen de longitud completa deseada se usa un conjunto de cebadores que contiene un cebador específico para el oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de una secuencia conocida del gen de interés. A continuación, este producto amplificado puede secuenciarse y usarse para generar el gen de longitud completa.
Este procedimiento anterior se inicia con el aislamiento del ARN total a partir de la fuente deseada, aunque puede usarse ARN poli-A+. La preparación de ARN puede tratarse a continuación con fosfatasa si es necesario eliminar los grupos fosfato 5' del ARN degradado o dañado que puede interferir con la etapa posterior de la ARN ligasa. A continuación debería inactivarse la fosfatasa y tratarse el ARN con pirofosfatasa ácida del tabaco para retirar la estructura de caperuza presente en los extremos 5' de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo fosfato 5' en el extremo 5' del ARN con la caperuza escindida que, a continuación, puede ligarse con un oligonucleótido de ARN usando la ARN ligasa de T4.
Esta preparación de ARN modificada se usa como molde para la síntesis de la primera cadena de la ADNc usando un oligonucleótido específico del gen. La reacción de síntesis de la primera cadena se usa como molde para la amplificación por PCR del extremo 5' deseado usando un cebador específico del oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de la secuencia conocida del gen de interés. A continuación, se secuencia el producto resultante y se analiza para confirma que la secuencia del extremo 5' pertenece al gen deseado. Además, puede ser ventajoso optimizar el protocolo RACE para aumentar la probabilidad de aislar secuencias codificadoras y no codificadoras 5' o 3' adicionales. Se conocen en la técnica diversos procedimientos para optimizar protocolos RACE, aunque puede encontrarse una descripción detallada resumiendo estos procedimientos en B. C. Schaefer, Anal. Biochem., 227:255-273, (1995).
Frohman, M. A. y col, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 85:8998-9002 (1988) proporcionan un procedimiento alternativo para realizar RACE 5' o 3' en la identificación de secuencias codificadoras y no codificadoras. Brevemente, puede construirse un clon de ADNc carente de los extremos 5' o 3', para incluir los pares de bases ausentes mediante la extensión de los codones de inicio o final de traducción, respectivamente. En algunos casos, los ADNc han perdido por tanto el inicio de la traducción. A continuación se describe brevemente una modificación de este procedimiento RACE 5' original. Los ARN poli A+ y totales de transcriben de forma inversa con Superscript II (Gibco/BRL) y un cebador antisentido o complementario I específico de la secuencia de ADNc. El cebador de la reacción se elimina con una unidad de concentración Microcon (Amicon). A continuación, se añade una cola a la primera cadena del ADNc con dATP y la desoxinucleótido transferasa terminal (Gibco/BRL) De este modo, se produce una secuencia de anclaje que es necesaria para la amplificación por PCR. La segunda cadena se sintetiza a partir de la cola dA en tampón de PCR, ADN polimerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus), un cebador oligo-dT que contiene tres sitios de restricción adyacentes (XhoI, SaiI y ClaI) en el extremo 5' y un cebador que contiene sólo tres sitios de restricción. Este ADNc de doble cadena se amplifica por 40 ciclos de PCR con los mismos cebadores así como un cebador complementario específico de ADNc anidado. Los productos de PCR se separan por tamaño en un gel de agarosa con bromuro de etidio y se retira la región del gel que contiene los productos de ADNc del tamaño predicho del ADN que codifica la proteína perdida. El ADNc se purifica a partir de la agarosa con el kit Magic PCR Prep (Promega), se digiere por restricción con XhoI o SalI, y se liga a un plásmido tal como pBluscript SKII (Stratagene) en los sitios XhoI y EcoRV. Este ADN de transforma en bacterias y los clones plasmídicos se secuencian para identificar las inserciones que codifican la proteína correcta. Se confirma que los extremos 5' son correctos comparando esta secuencia con la identificada probablemente homóloga y se solapa con el clon de ADNc parcial. Se usan procedimientos similares conocidos en la técnica y/o kits comerciales para amplificar y recuperar los extremo 3'.
En el mercado pueden adquirirse varios kits de calidad controlada. Reactivos y procedimientos similares a los anteriores se suministran en forma de Kit en Gibco/BRL tanto para RACE 5' como para 3' para recuperar los genes de longitud completa. Se dispone de un segundo kit de Clontech que se una modificación de una técnica relacionada, SLIC (ligamiento de cadena sencilla a ADNc de cadena sencilla), desarrollado por Dumas y col., Nucleic Acids Res., 19:5227-32 (1991). Las diferencias principales en el procedimiento son que el ARN se hidroliza de forma alcalina tras la transcripción inversa y se usa la ligasa de ADN para unir un cebador de anclaje que contiene un sitio de restricción, al ADNc de cadena sencilla. Esto obvia la necesidad de la reacción de introducción de cola dA que da lugar a una extensión poli-T que es difícil de secuenciar más allá.
Una alternativa para generar ADNc 5' o 3' a partir de ARN es usar una biblioteca de ADNc de ADN de doble cadena. Se sintetiza una cadena de ADNc complementaria amplificada por PCR asimétrica con un ADNc complementario y un cebador anclado al plásmido. Estos cebadores se eliminan y se realiza una reacción de PCR asimétrica con un cebador complementario específico del ADNc anidado y el cebador anclado al plásmido.
Protocolo de ARN ligasa para generan las secuencias de los extremos 5' o 3' para obtener genes de longitud completa
Una vez que se identifica el gen de interés, se dispone de varios procedimientos para la identificación de las porciones 5' y 3' del gen que pueden no estar presente en el plásmido de ADNc original. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, incubación con sonda del filtro, enriquecimiento del clon usando sondas específicas y protocolos similares e idénticas a RACE 5' o 3'. Mientras que el gen de longitud completa puede estar presente en la biblioteca y puede identificarse mediante incubación con una sonda, un procedimiento útil para generar los extremos 5' o 3' se usa la información de secuencia existente a partir de la ADNc original para general la información perdida. Se dispone de un procedimiento similar a RACE 5' para generar el extremo 5' perdido de un gene de longitud completa deseado. (Este procedimiento se publico en Fromont-Racine y col., Nucleic Acids Res., 21 (7):1683-1684 (1993)). Brevemente, un oligonucleótido de ARN específico se liga a los extremos 5' de una población de ARN que presumiblemente contiene la transcripción del ARN del gen de longitud completa y un conjunto de cebadores que contienen un cebador específico de una secuencia conocida del gen de interés, se usa para amplificar por PCR la porción 5' del gen de longitud completa deseado que puede secuenciarse a continuación y usarse para generar el gen de longitud completa. Este procedimiento se inicia con el ARN total aislado a partir de la fuente deseada puede usarse ARN poli A pero no es un prerrequisito para este procedimiento. La preparación de ARN podría tratarse a continuación con fosfatasa si es necesario eliminar los grupos fosfato 5' del ARN degradado o dañado que puede interferir con la etapa de la ARN ligasa posterior. A continuación, se inactiva la fosfatasa si se usa y el ARN se trata con pirofosfatasa ácida del tabaco para retirar la estructura de caperuza presente en los extremos 5' de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo fosfato 5' en el extremo 5' del ARN con la caperuza escindida que puede ligarse a continuación con un oligonucleótido de ARN usando la ARN ligasa de T4. Esta preparación de ARN modificado puede usarse a continuación como molde para la síntesis de la primera cadena del ADNc usando un oligonucleótido específico del gen. La reacción de síntesis de la primera cadena puede usarse a continuación como molde para la amplificación por PCR del extremo 5' deseado usando un cebador específico del oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de la secuencia conocida de la apoptosis relacionada de interés. A continuación, se secuencia el producto resultante y se analiza para confirmar que la secuencia del extremo 5' pertenece a la apoptosis relevante
relacionada.
Ejemplo 13 Distribución tisular del polipéptido
La distribución tisular de la expresión del ARNm de los polinucleótidos de la presente invención se determina usando protocolos de análisis de transferencia de ARN total, descrito entre otros, por Sambrook y col. Por ejemplo, se marca una sonda de ADNc producido por el procedimiento descrito en el Ejemplo 11 con p32 usando el sistema de marcaje de ADN rediprime^{TM} (Amerhsam Life Science), según las instrucciones del fabricante. Tras el marcaje, la sonda se purificó usando una columna CHROMA SPIN0-100 (Clontech Laboratorios, Inc.) según el protocolo de los fabricantes número PT1200-1. La sonda marcada purificada se usa a continuación para examinar la expresión del ARNm en diversos tejidos.
Las transferencias de ARN total de tejido que contenían el ARNm unido de diversos tejidos se examinaron con la sonda marcada usando la solución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clonetech según el protocolo de los fabricantes número PT11990-1. Las transferencias de ARN total pueden producirse usando diversos protocolos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Sambrook y col.). Tras la hibridación y lavado, las transferencias se montaron y expusieron a una película durante una noche a -70ºC y las películas SE revelaron según los procedimientos convencionales.
Ejemplo 14 Mapeo cromosómico de los polinucleótidos
Un conjunto de cebadores oligonucleótidos se diseña según la secuencia del extremo 5' de la ID SEC Nº 1. Preferiblemente, este cebador tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos. A continuación, Este conjunto de cebadores se usa en una reacción en cadena de la polimerasa con el siguiente conjunto de condiciones: 30 segundos, 95 grados C; 1 minuto, 56 grados C, 1 minuto, 70 grados C. Este ciclo se repite 32 veces seguido de un ciclo de 5 minutos a 70 grados C. Se usa como molde ADN de mamífero, preferiblemente ADN humano, además de un panel de híbridos de células somáticas que contiene cromosomas individuales o fragmentos de cromosoma (Bios, Inc.). Las reacciones se analizaron en geles de poliacrilamida al 8% o en geles de agarosa al 3,5%. El mapeo de cromosomas se determinó por la presencia de un fragmento de PCR de aproximadamente 100 pb en el hibrido de célula somática en particular.
Ejemplo 15 Expresión bacteriana de un polipéptido
Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos para PCR que se corresponden con los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADN, como se destaca en el Ejemplo 11, para sintetizar fragmentos de inserción. Los cebadores usados para amplificar la inserción del ADNc podrían contener preferiblemente, sitios de restricción, tales como BamHI y XbaI, en el extremo 5' de los cebadores para clonar el producto de amplificación dentro del vector de expresión. Por ejemplo, BamHI y XbaI se corresponden con los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc. Charsworth, CA). Este vector plasmídico codifica resistencia a antibióticos (Ampr), un origen de replicación bacteriano (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosomas (RBS), una etiqueta histidina-6 (6-His) y sitios de clonación con enzimas de restricción.
El vector pQE-9 se digiere con BamHI y XbaI y el fragmento amplificado se liga en el vector pQE-9 manteniendo la fase de lectura iniciada en el RBS bacteriano. A continuación, la mezcla de ligamiento se usa para transforman la cepa M15/rep4 de E. coli (Qiagen, Inc.) que contienen múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (kanr). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecen en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. El ADN plasmídico se aísla y se confirma mediante análisis de restricción.
Los clones que contienen las construcciones deseadas se crecen durante una noche (O/N) en cultivos líquidos, en medio LB complementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como a Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo más grande a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se crecieron hasta una densidad óptica a 600 (D.O. 600) de entre 0,4 y 0,6. A continuación se añade IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido) a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce la inactivación del represor lacI aclarando la P/O que lleva a un aumento de la expresión génica.
Las células se crecen durante 3 ó 4 horas más. A continuación, las células se recogen por centrifugación (20 min a 6.000 x g). Los sedimentos celulares se solubilizaron en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar agitando durante 3-4 horas a 4ºC. Los restos celulares se retiraron por centrifugación y los sobrenadantes que contienen el polipéptido se carga en una columna de resina de afinidad de ácido nitrilo triacético-níquel ("Ni-NTA") (disponible en QIAGEN, Inc., supra). Las proteínas con una etiqueta His x 6 se unen a la resina Ni-NTA con alta afinidad y pueden purificarse en un procedimiento de una única etapa (para detalles, véase: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., supra).
Brevemente, el sobrenadante se carga en la columna en guanidina-HCl 6 M, pH 8, la columna se lava primero con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M, pH 8, a continuación se lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M pH 6 y, finalmente, el polipéptido se eluye con guanidina-HCl 6 M, pH 5.
A continuación, la proteína purificada se renaturaliza dializándola frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) o a tampón acetato sódico 50 mM, pH 6 más NaCl 200 mM. Alternativamente, la proteína puede replegarse con éxito mientras está inmovilizada en la columna de NTA-Ni. Las condiciones recomendadas son las siguientes: renaturalización usando un gradiente lineal de urea 6M-1M en NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl 20 mM, pH 7,4 que contiene inhibidores de proteasas. La renaturalización podría realizarse durante un periodo de tiempo de 1,5 horas o más. Tras la renaturalización, las proteínas se eluyen por la adición de imidazol 250 mM. El imidazol se elimina mediante una etapa final de diálisis frente a PBS o a tampón acetato sódico 50 mM, pH 6 más NaCl 200 mM. La proteína purificada se conserva a 4 grados C o se congela a -80 grados C.
Ejemplo 16 Purificación de un polipéptido a partir de un cuerpo de inclusión
Puede usarse el siguiente procedimiento alternativo para purificar un polipéptido expresado en E. coli cuando esté presente en forma de cuerpos de inclusión. A no se que se especifique otra cosa, todas las etapas siguientes se realizan a 4-10 grados C.
Tras la terminación de la fase de producción de la fermentación de E. coli, el cultivo celular se enfría a 4-10 grados C y las células se recogen por centrifugación continua a 15.000 rpm (Heraeus Sepatech). Sobre la base del rendimiento esperado de proteína por unidad de peso de las pasta de células y a la cantidad de proteína purificada requerida, se resuspende una cantidad apropiada de pasta de células, en peso, en una solución tampón que contiene Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7,4. Las células se dispersan en una suspensión homogénea usando un mezclador de alto cizallamiento.
A continuación, las células se lisan pasando la solución dos veces a través de un microfluidificador (Microfluidics, Corp. o APV Gaulin, Inc.) a 27.579,03-41.386,54 kPa. A continuación, el homogeneizado se mezcla con una solución de NaCl a una concentración final de NaCl de 0,5 M, seguida de centrifugación a 7.000 x g durante 15 min. El sedimento resultante se lava una vez más usando NaCl 5 M, Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7,4.
Los cuerpos de inclusión lavados resultantes se solubilizaron con clorhidrato de guanidina 1,5 M (GuHCl) durante 2-4 horas. Tras la centrifugación a 7.000 x g durante 15 min, el sedimento se desecho y el sobrenadante que contenía el polipéptido se incubó a 4 grados C durante una noche para permitir una extracción adicional con GuHCl.
Tras la centrifugación a alta velocidad (30.000 x g) para eliminar partículas insolubles, la proteína solubilizada con GuHCl se repliega mezclando rápidamente el extracto de GuHCl con 20 volúmenes de tampón que contenía sodio 50 mM, pH 4,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM por agitación vigorosa. La solución de la proteína diluida replegada se mantiene a 4 grados C sin mezclar durante 12 horas antes de etapas adicionales de purificación.
Para aclarar la solución del polipéptido replegado, se emplea una unidad de filtración tangencial preparada previamente, equipada con un filtro de membrana de 0,16 \mum con un área superficial apropiada (por ejemplo, Filtron) equilibrada con acetato sódico 40 mM, pH 6,0. La muestra filtrada se carga en una resina de intercambio catiónico (por ejemplo, Poros HS-50, Perceptive Biosystems). La columna se lava con acetato sódico 40 mM, pH 6,0 y se eluye por etapas con NaCl 250 mM, 500 mM, 1.000 mM y 1.500 mM en el mismo tampón. Se controla continuamente la absorbancia a 280 nm del eluido. Las fracciones se recogen y además se analizan por SDS-PAGE.
Las fracciones que contienen los polipéptidos se agregaron a continuación y se mezclaron con 4 volúmenes de agua. La muestra diluida se carga entonces en un conjunto de columnas en tándem preparadas previamente con resinas de intercambio fuertemente aniónico (Poros HQ-50, Perceptive Biosystems) y débilmente aniónico (Poros CM-20, Perceptive Biosystems). Las columnas se equilibran con acetato sódico 40 mM, pH 6,0. Todas las columnas se lavan con acetato sódico 40 mM, pH 6,0, NaCl 200 mM. La columna CM-20 se eluye entonces usando un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna de NaCl 0,2 M, acetato sódico 50 mM, pH 6,0 a NaCl 1,0 M, acetato sódico 50 mM, pH 6,5. Las fracciones se recogieron con el control constante de A280 del eluido. A continuación, se mezclan las fracciones que contienen el polipéptido (determinado, por ejemplo, por SDS-PAGE al 16%).
El polipéptido resultante debería mostrar una pureza mayor del 95% después de las etapas de replegamiento y purificación. No se observarán bandas principales contaminantes en un gel SDS-PAGE al 16% teñido con azul de Coomassie cuando se cargan 5 \mug de proteína purificada. También puede ensayarse la contaminación por endotoxina/LPS en la proteína purificada y, típicamente, el contenido de LPS es menos de 0,1 ng/ml según los ensayos de LAL.
Ejemplo 17 Clonación y expresión de un polipéptido en un sistema de expresión de baculovirus
En este ejemplo, el vector plasmídico lanzadera pAc373 se usa para insertar un polinucleótido en un baculovirus para expresar un polipéptido. Un vector de expresión de baculovirus típico contiene el potente promotor polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV) seguido de sitios de restricción conveniente, que pueden incluir, por ejemplo BamHI, XbaI y Asp718. El sitio de poliadenilación del virus del simio 40 ("SV40") se usa a menudo para una poliadenilación eficaz. Para la selección fácil del virus recombinante, el plásmido contiene el gen de la beta-galactosidasa de E. coli, bajo el control de un promotor débil de Drosophila en la misma orientación, seguido de la señal de poliadenilación del gen polihedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos lados de secuencias virales para recombinación homóloga mediada por células con el ADN viral de tipo silvestre para generar un virus viable que exprese el polinucleótido clonado.
En lugar del vector anterior, pueden usarse muchos otros vectores de baculovirus, tales como pVL941 y pAcIM 1, como podrá apreciar fácilmente un experto en la materia, siempre que la construcción proporcione señales localizadas apropiadamente para la transcripción, traducción, secreción y similares, incluyendo un péptido señal y un AUG en fase como se requiere. Estos vectores se describen, por ejemplo, en Luckow y col., Virology 170:31-39 (1989).
Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos para PCR que se corresponden con los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADN, como se resume en el Ejemplo 11, para sintetizar fragmentos de inserción. Los cebadores usados para amplificar la inserción del ADNc podrían contener preferiblemente, sitios de restricción en el extremo 5' de los cebadores para clonar el producto de amplificación dentro del vector de expresión. Específicamente, la secuencia de ADNc contenida en el clon depositado, que incluye el codon de iniciación AUG y la secuencia líder natural asociada identificado en otra parte de este documento (si es pertinente), se amplifica usando el protocolo de PCR descrito en el Ejemplo 11. Si se usa la secuencia señal natural para producir la proteína, el vector usado no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, el vector puede modificarse para que incluya una secuencia líder de baculovirus, usando los procedimientos convencionales descritos en Summers y col., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº 1555 (1987).
El fragmento amplificado se aísla de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el mercado ("Geneclean", BIO 101 Inc. La Jolla, Ca.). A continuación, el fragmento se digiere con enzimas de restricción apropiadas y se purifica una vez más en un gel de agarosa al 1%.
El plásmido se digiere con las correspondientes enzimas de restricción y, opcionalmente, puede desfosforilarse usando fosfatasa intestinal de ternera, usando procedimientos rutinarios conocidos en la técnica. A continuación, se aísla el ADN de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el mercado ("Geneclean" BIO 101 Inc. La Jolla, Ca.).
El fragmento y el plásmido desfosforilado se ligan conjuntamente con la ADN ligasa de T4. Las células HB101 de E. coli u otros hospedadores adecuados de E. coli, tal como, XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se transforman con la mezcla de ligamiento y se extiende en placas de cultivo. Las bacterias que contiene el plásmido se identifican mediante digestión del ADN de colonias individuales y se analiza el producto de digestión por electroforesis en gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciación de ADN.
Se cotransforman 5 ug de un plásmido que contiene el polinucleótido con 1,0 ug de un ADN de baculovirus linearizado disponible en el mercado ("BaculoGold^{TM} baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA), usando el procedimiento de lipofección descrito por Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987). Se mezcla 1 ug de ADN del virus de BaculoGold^{TM} y 5 ug del plásmido en un pocillo estéril de una placa de microvaloración que contiene 50 ul de medio de Grace sin suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). A continuación, se añaden 10 ul de Lipofectina más 90 ul de medio Grace, se mezclan e incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de transfección se añade gota a gota a células de insectos Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo tisular de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. A continuación, la placa se incuba durante 5 horas a 27 grados C. Entonces, se retira la solución de transfección de la placa y se añade 1 ml de medio Grace de insecto suplementado con suero fetal de ternera al 10%. Después, se continúa el cultivo a 27ºC durante cuatro días.
Después de cuatro días se recoge el sobrenadante y se realiza un ensayo en placa, como describen Summers y Smith, supra. Se usa un gel de agarosa con "Gal Azul" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir la identificación y aislamiento fácil de los clones que expresan gal, lo que hace que las placas se tiñan de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo en placa" de este tipo también puede encontrarse en la guía de usuario para cultivos de células de insectos y baculovirología, distribuida por Life Technologies Inc. Gaithersburg, páginas 9-10). Tras la incubación apropiada, se pican las placas teñidas de azul con la punta de una micropipeta (por ejemplo, Eppendorf). El agar que contiene los virus recombinantes se resuspende a continuación en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 \mul de medio de Grace y la suspensión que contiene el baculovirus recombinante se usa para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días después, se recogen los sobrenadantes de estas placas de cultivo y, a continuación, se conservan a 4 grados C.
Para verificar la expresión del polipéptido, se crecen células Sf9 en medio de Grace suplementado con SFT inactivado por calor al 10%. Las células se infectan con el baculovirus recombinante que contiene el polinucleótido a una multiplicidad de infección ("MDI") de aproximadamente 2. Si se desean proteínas radiomarcadas, se retira el medio 6 horas después y se sustituye por medio SF900 II sin metionina ni cisteína (disponible en Life Technologies Inc., Rockville, MD). Después de 42 horas, se añaden 5 uCi de ^{35}S-metionina y 5 uCi de ^{35}S-cisteína (disponibles en Amersham). A continuación, las células se incubaron durante 16 horas y luego se recogieron por centrifugación. Las proteínas del sobrenadante, así como las proteínas intracelulares se analizar por SDS-PAGE seguido de autorradiografía (si están radiomarcadas).
La microsecuenciación de la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína purificada puede usarse para determinar la secuencia del extremo aminoterminal de la proteína producida.
Ejemplo 18 Expresión de un polipéptido en células de mamíferos
El polipéptido de la presente invención puede expresarse en una célula de mamífero. Un vector de expresión de mamífero típico contiene un elemento promotor, que media en la iniciación de la transcripción del ARNm, una secuencia que codifica una proteína y señales requeridas para la terminación de la transcripción y poliadenilación de la transcripción. Los elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para el ayuste del ARN. La transcripción muy eficaz se logra con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también pueden usarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de la actina humana).
Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluye, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhr (ATCC 37146), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 y pCMVSport 3.0. Las células hospedadoras de mamíferos que podrían usarse incluyen, células humanas Hela, 293, H9 y Jurkat humanas, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chico (CHO).
Alternativamente, el polipéptido puede expresarse en líneas celulares estables que contienen el polinucleótido integrado en un cromosoma. La cotransformación con un marcador seleccionable, tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y aislamiento de las células transformadas.
El gen transformado también puede amplificarse para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil en el desarrollo de líneas celulares que llevan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. (Véase, por ejemplo, Alt, F.W. y col., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin, J. L. y Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990); Page, M. J. y Sydenham, M. A., Biotechnology 9:64-68 (1991)). Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintetasa (GS) (Murphy y col., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington y col., Bio/Technology 10:169-175 (1992). Usando estos marcadores, las células de mamíferos se crecen en medio selectivo y se seleccionan las células con la resistencia más alta. Estas líneas celulares contiene el gen(es) amplificado integrado en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO se usan a menudo para la producción de proteínas.
Un polinucleótido de la presente invención se amplifica según el protocolo resumido en este documento. Si la secuencia señal natural se usa para producir la proteína, el vector no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, si no se usa la secuencia señal natural, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, el documento WO 96/34891). El fragmento amplificado se aísla de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el mercado ("Geneclean", BIO 101 Inc. La Jolla, Ca.). A continuación, el fragmento se digiere con enzimas de restricción apropiadas y se purifica una vez más en un gel de agarosa al 1%.
A continuación, el fragmento se digiere con la misma enzima de restricción y se purifica en un gel de agarosa al 1%. Entonces, el fragmento asilado y el vector desfosforilado se ligan con la ADN ligasa T4. A continuación se transforman en células HB101 y XL-1 de E. coli y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC6 usando, por ejemplo, análisis de enzimas de restricción.
Se usan células de hámster chino carentes de un gen DHFR activo para la transformación. Cinco \mug de un plásmido de expresión se transforman conjuntamente con 0,5 ug del plásmido pSVneo usando lipofectina (Felgner y col., supra). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en alfa menos MEM suplementado con G418 a 1 mg/ml. Después de 2 días, las células se tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) en medio alfa menos MEM suplementado con 10, 25 ó 50 ng/ml de metotrexato más G418 a 1 mg/ml. Después de aproximadamente 10-14 días se tripsinizan y, a continuación, se siembran en placas de petri de 6 pocillos o en frascas de 10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 uM, 100 uM, 200 uM, 400 uM, 800 uM). Después, los clones que crecieron a las concentraciones mayores de metotrexato se transfieren a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones incluso mayores de metotrexato (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 \muM, 20 \muM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración
de 100-200 uM. La expresión del producto génico deseado se analiza, por ejemplo, por SDS-PAGE e inmunotransferencia o por análisis de HPLC en fase inversa.
Ejemplo 19 Fusiones de proteínas
Los polipéptidos de la presente invención se fusionan preferiblemente con otras proteínas. Estas proteínas de fusión pueden usarse para diversas aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de los presente polipéptidos con etiqueta His, etiqueta HA, proteína A, dominios de IgG y proteínas que se unen a maltosa facilitan la purificación. (Véase el Ejemplo descrito en este documento, véase también el documento EP A 394.827; Traunecker y col., Nature 331:84-86 (1988)). De forma similar, la fusión con IgG-1, IgG-3 y albúmina aumenta la semivida in vivo. Las señales de localización nuclear fusionadas con los polipéptidos de la presente invención pueden dirigir la proteína a una localización subcelular específica, mientras que los heterodímeros u homodímeros covalentes puede aumentar o disminuir la actividad de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión también pueden crear moléculas quiméricas que tengan más de una función. Finalmente, las proteínas de fusión pueden aumentar la solubilidad y/o estabilidad de la proteína fusionada en comparación con la proteína sin fusionar. Todos los tipos de proteínas de fusión descritas anteriormente pueden hacerse modificando el siguiente protocolo, que explica la fusión de un polipéptido a una molécula
de IgG.
Brevemente, la porción Fc humana de la molécula de IgG puede amplificarse por PCR, usando cebadores que abarcan a los extremos 5' y 3' de la secuencia descrita a continuación. Estos cebadores también podrían tener sitios de enzimas de restricción convenientes que podrán facilitar la clonación en un vector de expresión, preferiblemente, un vector de expresión de mamíferos. Apréciese que el polinucleótido se clona sin un codon de terminación, ya que de otro modo no se producirá una proteína de fusión.
La secuencia señal natural puede usarse para producir la proteína (si es pertinente). Alternativamente, si no se usa la secuencia señal natural, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, el documento WO 96/34891 y/o la patente de EE.UU. Nº 6.066.781, supra).
Región Fc de la IgG humana
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Ejemplo 20 Producción de un anticuerpo a partir de un polipéptido
Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por diversos procedimientos. (Véase, Current Protocols, Capítulo 2). Como ejemplo de estos procedimientos, se administran a un animal células que expresan un polipéptido de la presenta invención para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales. En un procedimiento preferido, una preparación de la proteína se prepara y purifica para obtenerla sustancialmente libre de contaminantes. A continuación se introduce esta preparación en un animal para producir antisueros policlonales de mayor actividad específica.
En el procedimiento más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión a proteína de los mimos). Estos anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando tecnología de hibridomas. (Köhler y col., Nature 256:495 (1975); Köhler y col., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler y col., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., pág. 563-681 (1981)). En general, estos procedimientos implican la inmunización de un animal (preferiblemente un ratón) con polipéptido o, más preferiblemente, con una célula que expresa el polipéptido. Estas células se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo tisular adecuado; sin embargo, es preferible cultivar células en medio de Eagle modificado por Earle suplementado con el 10% de suero bovino fetal (inactivado a aproximadamente 56 grados C) y suplementado con aproximadamente 10 g/l de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1.000 U/ml de penicilina y aproximadamente 100 \mug/ml de estreptomicina.
Se extraen los esplenocitos de estos ratones y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier línea celular de mieloma adecuada según la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma parental (SP20), disponible en el ATCC. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y luego se clonan mediante dilución límite, como describen Wands y col. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de esta selección se analizan a continuación para identificar clones que secreten anticuerpos capaces de unir el polipéptido.
Alternativamente, pueden producirse anticuerpos adicionales capaces de unirse al polipéptido en un procedimiento de dos pasos usando anticuerpos antiidiotipo. Este procedimiento hace uso del hecho de que los anticuerpos son antígenos por sí mismos y, por tanto, es posible obtener un anticuerpo que se una a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este procedimiento, se usan anticuerpos específicos de proteínas para inmunizar un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de este animal se usan a continuación para producir células de hibridoma y las células de hibridoma se analizan para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de proteína puede bloquearse por el polipéptido. Estos anticuerpos comprenden anticuerpos antiidiotipo frente al anticuerpo específico de proteína y puede usarse para inmunizar un animal para inducir la formación de anticuerpos específicos de proteína adicionales.
Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos de la presente invención se pueden usar según los procedimientos descritos en este documento. Estos fragmentos se producen típicamente mediante escisión proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Alternativamente, los fragmentos de unión a proteína pueden producirse a través de la aplicación de la tecnología de ADN recombinante o a través de la química de síntesis.
Para el uso in vivo de anticuerpos en humanos, puede ser preferible usar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Estos anticuerpos pueden producirse usando construcciones genéticas derivadas de las células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales descritas anteriormente. En la técnica se conocen procedimientos para producir anticuerpos quiméricos. (Para revisión, véase Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y col., patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Taniguchi y col., documento EP 171496; Morrison y col., documento EP 173494; Neuberger y col., documento WO 8601533; Robinson y col., documento WO 8702671; Boulianne y col., Nature 312:643 (1984); Neuberger y col., Nature 314:268 (1985)).
Además, en otro procedimiento preferido, los anticuerpos dirigidos frente a los polipéptidos de la presente invención pueden producirse en plantas. En las patentes de EE.UU. Nº 5.959.177 y 6.080.560 se describen procedimientos específicos. Los procedimientos no sólo describen procedimientos de expresión de anticuerpos, sino también los medios de ensamblaje de proteínas multiméricas extrañas en plantas (es decir, anticuerpos, etc.) y la consiguiente secreción de estos anticuerpos a partir de la planta.
Ejemplo 21 Regulación de la expresión de proteína por medio de agregación controlada en el retículo endoplásmico
Como se describe más en particular en este documento, las proteínas regulan diversos procesos celulares en organismos superiores, oscilando desde cambios metabólicos rápidos a crecimiento y diferenciación. El aumento de la producción de las proteínas específicas se puede usar para prevenir ciertas enfermedades y/o estados de enfermedad. De este modo, la capacidad para modular la expresión de proteínas específicas en un organismo proporcionaría beneficios significativos.
Hasta la fecha se han desarrollado numerosos procedimientos para introducir genes extraños, bajo el control de un promotor inducible, constitutivamente activo o endógeno, en organismos. Los promotores inducibles son de particular interés (véase, M. Gossen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89:5547 (1992); Y. Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8180 (1994), D. No. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346 (1996) y V. M. Rivera y col., Nature Med, 2:1028 (1996); además de los ejemplos adicionales descritos en este documento). En un ejemplo, el gen de la eritropoyetina (Epo) se transfirió a ratones y primates bajo el control de una pequeña molécula inductora de la expresión (por ejemplo, tetraciclina o rapamicina) (véase, D. Bohl y col., Blood, 92:1512, (1998); K. G. Rendahl y col., Nat. Biotech, 16:757, (1998); V. M. Rivera y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:8657(1999) y X. Ye y col., Science, 283:88 (1999). Aunque estos sistemas permiten una inducción eficaz del gen de interés en el organismo tras la adición del agente inductor (es decir, tetraciclina, rapamicina, etc.), los niveles de expresión tienden a un máximo en 24 horas y va disminuyendo hasta los niveles basales después de 4 a 14 días. De este modo, la expresión transitoria controlada es virtualmente imposible usando estos sistemas, aunque este control sería deseable.
Se ha descrito un nuevo procedimiento alternativo de control de los niveles de expresión génica de una proteína a partir de un transgén (es decir, incluye transformantes estables y transitorios) (V. M. Rivera. y col., Science, 287:826-830, (2000)). Este procedimiento no controla la expresión génica a nivel del ARNm como los sistemas mencionados anteriormente. Por el contrario, el sistema controla el nivel de proteína en una forma secretada activa. En ausencia del agente inductor, la proteína se agrega en el RE y no se secreta. Sin embargo, la adición del agente inductor provoca la disgregación de la proteína y la consecuente secreción desde el RE. Estos sistemas permiten un alto nivel de secreción con secreción basal baja en presencia del agente inductor, y una rápida interrupción de la secreción tras la retirada del agente inductor. De hecho, la secreción de proteína alcanza un nivel máximo a los 30 minutos de la inducción y una rápida interrupción de la secreción en 1 hora tras la eliminación del agente inductor. El procedimiento también se puede aplicar para controlar el nivel de producción de proteínas de membrana.
En V.M. Rivera. y col., Science, 287:826-830, (2000)) presentan procedimientos detallados, brevemente:
Las construcciones de proteínas de fusión se crean usando secuencias polinucleotídicas de la presente invención con una o más copias (preferiblemente al menos 2, 3, 4 o más) de un dominio de agregación condicional (DAC), un dominio que interacciona consigo mismo de una manera reversible de ligando (es decir, en presencia de un agente inductor) usando procedimientos de biología molecular conocidos en la técnica y descritos en este documento. El dominio DAC puede ser el dominio mutante aislado a partir de la proteína FKBP12 (Phe^{36} a Met) humana (como se describe en V.M. Rivera. y col., Science, 287:826-830, (2000) o alternativamente, otras proteínas que tienen dominios con propiedades similares reversible de ligando y autoagregación. Como principio del diseño, el vector de la proteína de fusión contendría una secuencia de escisión para furina unida de forma operativa entre los polinucleótidos de la presente invención y los dominios DAC. Este sitio de escisión permitiría la escisión proteolítica de los dominios DAC a partir del polipéptido de la presente invención después de la secreción desde el RE y tras la entrada en el trans-Golgi (J.B. Denault y col., FEBS Lett., 379:113, (1996)). Alternativamente, los expertos reconocerán que cualquier secuencia escindida proteolíticamente podría ser sustituida por la secuencia para furina siempre que la secuencia sustituida se escinda de forma endógena (por ejemplo, la secuencia para furina) o exógena (por ejemplo, tras la secreción, tras la purificación, tras la producción, etc.). La secuencia preferida de cada elemento de la construcción de la proteína de fusión, desde la dirección 5' a la 3', estando cada elemento unido de forma operativa entre sí, sería un promotor, secuencia señal, un número "X" de dominios (DAC)x, la secuencia para furina (u otra secuencia proteolítica) y la secuencia codificadora del polipéptido de la presente invención. Los expertos apreciarán que el promotor y la secuencia señal, independiente la una de la otra, podría ser la secuencia señal o promotor endógeno de un polipéptido de la presente invención o, alternativamente, podrían ser una secuencia señal y promotor heterólogos.
Los procedimientos específicos descritos en este documento para controlar los niveles de secreción proteica a través del control de la agregación en el RE no significa que sea limitante y sería aplicable de forma general a cualquiera de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención, incluyendo variantes, homólogos, ortólogos y fragmentos de ellos.
Ejemplo 22 Alteración de los sitios de glicosilación proteica para potenciar las características de los polipéptidos de la invención
La superficie y las proteínas de muchas células eucarióticas se procesan postraduccionalmente para incorporar hidratos de carbono con enlace en N y O (Kornfeld y Kornfeld (1985) Annu. Rev. Biochem. 54:631-64; Rademacher y col., (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:785-838). La glicosilación proteica se piensa que cumple diversas funciones que incluyen: aumento del plegamiento proteico, inhibición de la agregación proteica, regulación del tráfico intracelular a orgánulos, aumento de la resistencia a la proteolisis, modulación de la antigenicidad proteica y mediación de la adhesión intercelular (Fieldler y Simons (1995) Cell, 81:309-312; Helenius (1994) Mol. Biol. Of the Cell 5:253-265; Olden y col., (1978) Cell, 13:461-473; Caton y col., (1982) Cell, 37:417-427; Alexander y Elder (1984), Science, 226:1328-1330; y Flack y col., (1994), J. Biol. Chem., 269:14015-14020). En organismos superiores, la naturaleza y grado de glicosilación puede afectar notablemente a la semivida en circulación y a la biodisponibilidad de proteínas por mecanismos que implican captación y aclaramiento mediados por receptor (Ashwell y Morrel), (1974), Adv. Enzymol., 41:99-128; Ashwell y Harford (1982), Ann. Rev. Biochem., 51:531-54). Se han identificado sistemas de receptor que se piensa que representan un papel importante en el aclaramiento de proteínas séricas a través del reconocimiento de diversas estructuras de hidratos de carbono en las glicoproteínas (Stockert (1995), Physiol.Rev., 75:591-609; Kery y col., (1992), Arch. Biochem. Biophys., 298:49-55). De este modo, las estrategias de producción que dan lugar a la unión incompleta de restos de ácido siálico terminales podrían proporcionar un medio de acortamiento de la biodisponibilidad y de la semivida de glicoproteínas. Por el contrario, las estrategias de expresión que dan lugar a la saturación de sitios de unión de ácido siálico terminales podrían alargar la biodisponibilidad y semivida proteica.
En el desarrollo de glicoproteínas recombinantes para su uso como productos farmacéuticos, por ejemplo, se ha especulado que la farmacocinética de las proteínas recombinantes se puede modular mediante la adición o deleción de los sitios de glicosilación de una estructura primaria de glicoproteínas (Berman y Lasky (1985a) Trends in Biotechnol., 3:51-53). Sin embargo, existen estudios que describen que la deleción de sitios de N-glicosilación a menudo perjudica el transporte intracelular y tiene como resultado la acumulación intracelular de variantes de sitios de glicosilación (Machamer y Rose (1988), J. Biol. Chem., 263:5955-5960; Gallagher y col., (1992), J. Virology., 66:7136-7145; Collier y col., (1993), Biochem., 32:7818-7823; Claffey y col., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1246:1-9; Dube y col., (1988), J. Biol. Chem.263:17516-17521). Mientras que las variantes de los sitios de glicosilación de las proteínas se pueden expresar intracelularmente, se ha probado que es difícil recuperar cantidades útiles a partir del medio de cultivo de crecimiento de células condicionadas.
Además, no esta claro hasta qué grado un sitio de glicosilación de una especie será reconocido por la maquinaria de glicosilación de otra especie. Debido a la importancia de la glicosilación en el metabolismo proteico, especialmente la secreción y/o expresión de la proteína, que una señal de glicosilación sea reconocida puede determinar en gran medida la capacidad de una proteína para se expresada, endógena o recombinantemente, en otro organismo (es decir, que se exprese una proteína humana en E. coli, levadura u organismos virales; o una proteína de E. coli, levadura o de virus en humanos, etc.). De este modo, puede ser deseable añadir, delecionar o modificar un sitio de glicosilación y añadir posiblemente un sitio de glicosilación de una especie a una proteína de otra especie para mejorar las características funcionales, de bioprocesos de purificación y/o estructurales de las proteínas (por ejemplo, un polipéptido de la presente invención).
Se pueden emplear varios procedimientos para identificar la localización de los sitios de glicosilación dentro de una proteína. Un procedimiento preferido es pasar la secuencia proteica traducida a través del programa de ordenador PROSITE (Swiss Institute of Bioinformatics). Una vez identificados, se pueden delecionar o alterar sistemáticamente los sitios a nivel de ADN usando metodología de mutagénesis conocida en la técnica y disponible para los expertos, usando preferiblemente mutagénesis dirigida por PCR (véase Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). De forma similar, se pueden añadir o modificar sitios de glicosilación a nivel del ADN usando procedimientos similares, preferiblemente procedimientos de PCR (Véase Maniatis, supra). Los resultados de la modificación de los sitios de glicosilación para una proteína en particular (por ejemplo, solubilidad, posible secreción, actividad, agregación, resistencia proteolítica, etc.) podrían entonces analizarse usando procedimientos conocidos en la técnica.
El experto reconocerá la existencia de otros algoritmos para ordenador capaces de predecir la localización de sitios de glicosilación en una proteína. Por ejemplo, el programa de ordenador Motif (grupo de programas de Genetics Computer Group) también proporcionan esta función.
Ejemplo 23 Procedimiento de potenciación de la actividad biológica/características funcionales de la invención a través de la evolución molecular
Aunque muchas de las proteínas conocidas más activas biológicamente son muy eficaces para su función específica en un organismo, a menudo poseen características que las hacen poco deseables para aplicaciones transgénicas, terapéuticas y/o industriales. Entre estos rasgos, una semivida fisiológica corta es el problema más prominente y se presenta a nivel de proteína o a nivel del ARNm de las proteínas. La capacidad para prolongar la semivida, por ejemplo, sería particularmente importante para el uso de proteínas en terapia génica, producción de animales transgénicos, bioproceso de producción y purificación de la proteína y el uso de la proteína como un modulador químico entre otros. Por lo tanto, hay necesidad de identificar variantes nuevas de características que poseen las proteínas aisladas que potencien su aplicación como agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades de origen animal, además de la aplicabilidad de proteínas a la industria común y aplicaciones farmacéuticas.
De este modo, un aspecto de la presente invención se refiere a la capacidad para potenciar características específicas de la invención a través de la evolución molecular dirigida. Dicha potenciación puede, en un ejemplo no limitante, beneficiar la utilidad de la invención como un componente esencial en un kit, las características físicas de la invención, tales como solubilidad, estructura u optimización de codones, la actividad biológica específica de la invención, que incluye cualquier actividad enzimática asociada, la cinética enzimática de proteínas, la Ki, Kcat, Km, Vmax, Kd de las proteínas, la actividad proteína-proteína, la actividad de unión proteína-ADN, la actividad antagonista/inhibidora (que incluye interacción directa o indirecta), actividad agonista (que incluye interacción directa o indirecta), la antigenicidad de proteínas (por ejemplo, cuando fuera deseable para aumentar o disminuir el potencial antigénico de la proteína), la inmunogenicidad de la proteína, la capacidad de la proteína para formar dímeros, trímeros o multímeros consigo mismo o con otras proteínas, la eficacia antigénica de la invención, que incluye su posterior uso como tratamiento preventivo para enfermedades o estados de enfermedad, o como un efector para el reconocimiento de genes asociados a enfermedades. Además, la capacidad para potenciar características específicas de una proteína también puede ser aplicable para cambiar la actividad caracterizada de una enzima a una actividad completamente independiente a su actividad caracterizada inicialmente. Otras potenciaciones deseables de la invención serían específicas para cada proteína individual y, de este modo, sería bien conocido en la técnica y contemplado por la presente invención.
Por ejemplo, una proteína con repeticiones ricas en leucina modificada genéticamente puede activarse constitutivamente tras la unión a su ligando afín. Alternativamente, una proteína con repeticiones ricas en leucina modificada genéticamente puede activarse constitutivamente en ausencia de la unión al ligando. Aún en otro ejemplo, una proteína con repeticiones ricas en leucina modificada genéticamente puede ser capaz de activarse sin todos los factores reguladores y/o condiciones típicamente necesarios para la activación de proteínas con repeticiones ricas en leucina (por ejemplo, unión a ligando, fosforilación, cambios conformacionales, etc.). Estas proteínas con repeticiones ricas en leucina serían útiles en la selección para identificar moduladores de proteínas con repeticiones ricas en leucina, entre otros usos descritos en este documento.
La evolución dirigida comprende varias etapas. La primera etapa es establecen una biblioteca de variantes para el gen o proteína de interés. La etapa más importante es seleccionar a continuación aquellas variantes que tengan la actividad que desee identificar. El diseño de la selección es esencial puesto que su selección debe ser suficientemente selectiva para eliminar variantes no útiles, pero no tan rigurosa como para eliminar todas las variantes. La última etapa es entonces repetir las etapas anteriores usando la mejor variante de la selección previa. Cada ciclo sucesivo puede entonces adaptarse según las necesidades, tal como, por ejemplo, incrementando la rigurosidad de la selección.
A lo largo de los años, se han desarrollado varios procedimientos para introducir mutaciones en macromoléculas. Algunos de estos procedimientos incluyen, mutagénesis aleatoria, PCR "propensa a error", mutagénesis química, mutagénesis dirigida a sitio y otros procedimientos bien conocidos en la técnica (para un listado completo de los procedimientos de mutagénesis actuales, véase Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). Típicamente, estos procedimientos se han usado, por ejemplo, como herramientas para identificar la región o regiones funcionales centrales de una proteína o la función de dominios específicos de una proteína (si es una proteína multidominio). Sin embargo, estos procedimientos se han aplicado más recientemente para la identificación de variantes macromoleculares con características específicas o potenciadas.
La mutagénesis aleatoria ha sido el procedimiento más ampliamente reconocido hasta la fecha. Típicamente, se ha realizado a través del uso de PCR "propensa a error" (como se describe en Moore, J. y col., Nature Biotechnology 14:458 (1996) o a través de la aplicación de oligonucleótidos sintéticos aleatorios que corresponden a regiones específicas de interés (como se describe en Derbyshire, K. M. y col., Gene, 46:145-152, (1986), y Hill, DE y col., Methods Enzymol., 55:559-568, (1987). Ambos enfoques tienen los límites en el nivel de mutagénesis que se puede obtener. Sin embargo, cualquiera de los enfoques permite al investigador controlar de forma eficaz la tasa de mutagénesis. Esto es especialmente importante considerando el hecho de que las mutaciones beneficiosas para la actividad de la enzima son bastante raras. De hecho, usando un nivel de mutagénesis demasiado alto puede antagonizar o inhibir el beneficio deseado de una mutación útil.
Mientras que ambos procedimientos mencionados anteriormente son eficaces para crear mezclas aleatorias de variantes de macromoléculas, recientemente se ha descrito un tercer procedimiento, denominado "combinación aleatoria de ADN" o "PCR sexual" (WPC, Stemmer, PNAS, 91:10747, (1994)). La combinación aleatoria de ADN también se ha denominado "evolución molecular dirigida", "combinación aleatoria de exones", "evolución enzimática dirigida", "evolución in vitro" y "evolución artificial". Estos términos de referencia son conocidos en la técnica y los abarca la invención. Este nuevo procedimiento preferido aparentemente supera las limitaciones de los procedimientos previos no sólo en que propaga rasgos positivos, sino que elimina simultáneamente rasgos negativos en la progenie resultante.
La combinación aleatoria de ADN consigue este propósito combinando lo principal de la recombinación in vitro, junto con el procedimiento de PCR "propensa a error". De hecho, se comienza con una mezcla digerida aleatoriamente de fragmentos pequeños del gen, creada por digestión con ADNasa I y luego se introducen dichos fragmentos aleatorios en una reacción de ensamblaje de PCR "propensa a error". Durante la reacción de PCR, los fragmentos de ADN de tamaño aleatorio no sólo hibridan con su hebra complementaria, sino que también pueden hibridar con otros fragmentos de ADN que corresponden a regiones diferentes del polinucleótido de interés, regiones típicamente inaccesibles a través de la hibridación del polinucleótido completo. Además, puesto que la reacción de ensamblaje de PCR utiliza las condiciones de reacción de la PCR "propensa a error", las mutaciones aleatorias se introducen durante la etapa de síntesis de ADN de la reacción de PCR para todos los fragmentos, diversificando adicionalmente los sitios potenciales de hibridación durante la etapa de hibridación de la reacción.
Se podrían utilizar diversas condiciones de reacción para realizar la reacción de combinación aleatoria de ADN. Sin embargo, las condiciones específicas de reacción para la combinación aleatoria de ADN se proporcionan, por ejemplo, en PNAS, 91:10747, (1994). Brevemente:
Se prepara el sustrato de ADN que va a ser sometido a la reacción de combinación aleatoria de ADN. La preparación puede estar en forma de ADN purificado simplemente a partir del material celular contaminante, agentes químicos, tampones, cebadores oligonucleótidos, desoxinucleótidos, ARN, etc., y puede implicar el uso de kits de purificación de ADN como los proporcionados por Qiagen, Inc., o por Promega, Corp., por ejemplo.
Una vez se ha purificado el sustrato de ADN, se someterá a la digestión con ADNasa I. Se digieren aproximadamente 2-4 ug del sustrato(s) de ADN con 0,0015 unidades de ADNasa I (Sigma) por \mul en 100 \mul de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4/MgCl_{2} 1 mM durante 10-20 min a temperatura ambiente. Los fragmentos resultantes de 10-50 pb podrían purificarse entonces aplicándolos en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% mediante electroforesis en papel de intercambio iónico DE81 (Whatmann) o podría purificarse usando concentradores Microcon (Amicon) del límite apropiado de peso molecular o podrían usarse columnas de purificación de oligonucleótidos (Qiagen), además de otros procedimientos conocidos en la técnica. Si se usa papel de intercambio iónico DE81, los fragmentos de 10-50 pb se podrían eluir de dicho papel usando NaCl 1 M, seguido por la precipitación con etanol.
Los fragmentos purificados resultantes podrían entonces someterse a una reacción de ensamblaje de PCR mediante la resuspensión en una mezcla de PCR que contenga: 2 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 2,2 mM, KCI 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, y Triton X-100 al 0,1%, a una concentración final de fragmentos de 10-30 ng/\mul. No se añaden cebadores en este punto. La ADN polimerasa Taq (Promega) se usaría a 2,5 unidades por 100 \mul de la mezcla de reacción. Un programa de PCR de 94ºC durante 60 s, 94ºC durante 30 s, 50-55ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s usando 30-45 ciclos, seguido por 72ºC durante 5 min usando un termociclador PTC-150 de MJ Research (Cambridge, MA). Una vez completada la reacción de ensamblaje, se podría introducir entonces una dilución 1:40 del producto sin cebador resultante en una mezcla de reacción (usando la misma mezcla de tampón usada para la reacción de ensamblaje) que contenga 0,8 um de cada cebador y sometiendo esta mezcla a 15 ciclos de PCR (usando 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s). Los cebadores mencionados serían cebadores correspondientes a las secuencias de ácido nucleico del polinucleótido(s) utilizado en la reacción de combinación aleatoria. Dichos cebadores podrían constar de pares de bases de ácido nucleico modificado usando procedimientos conocidos en la técnica y referidos en este documento, o podría contener secuencias adicionales (es decir, añadiendo sitios de restricción, mutando pares de bases específicas, etc.).
El producto combinado aleatoriamente, ensamblado y amplificado resultante puede purificarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, kits de purificación de PCR de Qiagen) y luego clonado posteriormente usando enzimas de restricción apropiadas.
Aunque se han publicado hasta la fecha diversas variaciones de la combinación aleatoria de ADN, estas variaciones serían obvias para los expertos y están incluidas en esta invención. El procedimiento de combinación aleatoria de ADN también se pude ajustar al nivel deseado de mutagénesis usando los procedimientos descritos por Zhao y col. (Nucl. Acid. Res., 25(6):1307-1308, (1997).
Como se describe anteriormente, una vez creada la mezcla aleatoria, a continuación puede someterse a un análisis específico para identificar la variante que posee la característica(s) deseada(s). Una vez identificada la variante, el ADN correspondiente a la variante podría usarse entonces como el sustrato de ADN para iniciar otra ronda de combinación aleatoria de ADN. Este ciclo de combinación aleatoria, que selecciona la variante optimizada de interés, y luego vuelve a combinarla aleatoriamente, se puede repetir hasta que se obtiene la última variante. En las siguientes publicaciones se pueden encontrar ejemplos de modelos de análisis aplicados para identificar variantes creadas usando la tecnología de combinación aleatoria de ADN: J.C., Moore y col., J. Mol. Biol., 272:336-347, (1997), F.R., Cross y col., Mol. Cell. Biol., 18:2923-2931, (1998), y A. Crameri. y col., Nat. Biotech., 15:436-438, (1997).
La combinación aleatoria de ADN tiene varias ventajas. En primer lugar, hace uso de mutaciones beneficiosas. Cuando se combina con la selección, la combinación aleatoria de ADN permite el descubrimiento de las mejores combinaciones mutacionales y no asume que la mejor combinación contiene todas las mutaciones en una población. En segundo lugar, la recombinación se produce simultáneamente a la mutagénesis puntual. Un efecto de forzar la ADN polimerasa a sintetizar genes de longitud completa a partir de una mezcla de fragmentos pequeños de ADN es una tasa de mutagénesis de fondo. En combinación con un procedimiento de selección riguroso, la actividad enzimática ha desarrollado un aumento de hasta 16.000 veces sobre la forma silvestre de la enzima. En esencia, la mutagénesis de fondo producía la variabilidad genética sobre la que actuaban la recombinación para potenciar la actividad.
Un tercer aspecto de la recombinación es que se puede usar para eliminar mutaciones deletéreas. Como se describe anteriormente, durante el proceso de la combinación aleatoria, para cada una de las mutaciones beneficiosas, puede haber al menos una o más mutaciones neutras o inhibidoras. Estas mutaciones se pueden eliminar incluyendo en la reacción de ensamblaje un exceso de los fragmentos silvestres de tamaño aleatorio, además de los fragmentos de tamaño aleatorio del mutante seleccionado a partir de la selección previa. Durante la siguiente selección, algunas de las variantes más activas del polinucleótido/polipéptido/enzima, deben haber perdido las mutaciones inhibidoras.
Finalmente, la recombinación permite el procesamiento paralelo. Esto representa una ventaja significativa puesto que hay probablemente múltiples características que harían a una proteína más deseable (por ejemplo, solubilidad, actividad, etc.). Puesto que es cada vez más difícil seleccionar más de un rasgo deseable a la vez, otros procedimientos de evolución molecular tienden a ser inhibidores. Sin embargo, usando la recombinación, sería posible combinar los fragmentos aleatorios de las variantes más representativas para los diversos rasgos, y luego seleccionar múltiples propiedades a la vez.
La combinación aleatoria de ADN también se puede aplicar a los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención para disminuir su inmunogenicidad en un hospedador específico. Por ejemplo, se puede crearse y aislarse una variante en especial de la presente invención usando la tecnología de la combinación aleatoria de ADN. Esta variante puede tener todas las características deseadas, aunque puede ser muy inmunogénica en un hospedador debido a su nueva estructura intrínseca. Específicamente, la característica deseada puede hacer que el polipéptido tenga una estructura no nativa que podría no ser reconocida ya como una molécula "propia", sino como una proteína "extraña", y de este modo activar una respuesta inmunitaria del hospedador dirigida contra la nueva variante. Esta limitación se puede superar, por ejemplo, incluyendo en uno o más ciclos de combinación aleatoria de ADN una copia de la secuencia del gen para un ortólogo xenobiótico de la proteína nativa con la secuencia génica del nuevo gen variante. La proporción molar de los ADN del ortólogo y de la nueva variante podría variar en consecuencia. Idealmente, la variante híbrida resultante identificada contendría al menos alguna de las secuencias codificadoras que permitirían a la proteína xenobiótica escaparse del sistema inmunitario del hospedador y, adicionalmente, la secuencia codificadora de la nueva variante original que proporcionaría las características deseadas.
Asimismo, la invención abarca la aplicación de la tecnología de combinación aleatoria de ADN a la evolución de polinucleótidos y polipéptidos de la invención, en la que uno o más ciclos de combinación aleatoria de ADN incluyen, además del ADN molde del gen, oligonucleótidos que codifican secuencias alélicas conocidas, secuencias de codones optimizados, secuencias variantes conocidas, secuencias de polimorfismo polinucleotídico conocidas, secuencias ortólogas conocidas, secuencias homólogas conocidas, secuencias homólogas adicionales, secuencias no homólogas adicionales, secuencias de otra especie y cualquier número y combinación de las anteriores.
Además de los procedimientos descritos anteriormente, hay varios procedimientos relacionados que también se pueden aplicar o que son deseables en ciertos casos. Entre éstos, son representativos los procedimientos descritos en las solicitudes PCT WO 98/31700 y WO 98/32845. Además, los procedimientos relacionados se pueden aplicar también a las secuencias de polinucleótidos de la presente invención para desarrollar la invención creando variantes ideales para su uso en terapia génica, manipulación génica de proteínas, evolución de células completas que contienen la variante o en la evolución de las rutas enzimáticas completas que contienen polinucleótidos de la invención como se describe en las solicitudes PCT WO 98/13485, WO 98/13487, WO 98/27230, WO 98/31837 y Crameri, A. y col., Nat. Biotech., 15:436-438, (1997), respectivamente.
Se pueden encontrar procedimientos adicionales de aplicación de la tecnología de "combinación aleatoria de ADN" a los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, incluyendo sus aplicaciones propuestas, en la patente de EE.UU. Nº 5.605.793; solicitud PCT Nº WO 95/22625; solicitud PCT Nº WO 97/20078; solicitud PCT Nº WO 97/35966 y la solicitud PCT Nº WO 98/42832; la solicitud PCT Nº WO 00/09727 proporciona específicamente procedimientos para aplicar la combinación aleatoria de ADN a la identificación de plantas selectivas para herbicidas que podrían aplicarse a los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención; adicionalmente, la solicitud PCT Nº WO 00/12680 proporciona procedimientos y composiciones para generar, modificar, adaptar y optimizar secuencias polinucleotídicas que confieran propiedades fenotípicas detectables en especies vegetales; cada una de las anteriores son incorporadas en su totalidad en este documento para todos los fines.
Ejemplo 24 Procedimiento de determinación de alteraciones en un gen correspondiente a un polipéptido
Se aísla el ARN de familias completas o de pacientes individuales que presentaban un fenotipo de interés (tal como una enfermedad). Se genera a continuación el ADNc a partir de estas muestras de ARN usando protocolos conocidos en la técnica. (Véase Sambrook.) El ADNc se usa entonces como molde para la PCR, empleando cebadores que circundan las regiones de interés en la ID SEC Nº 1. Las condiciones de PCR sugeridas constan de 35 ciclos a 95 grados C durante 30 segundos; 60-120 segundos a 52-58 grados C y 60-120 segundos a 70 grados C, usando soluciones tampón descritas en Sidransky y col., Science 252:706 (1991).
A continuación se secuencian los productos de PCR usando cebadores marcados en su extremo 5' con polinucleótido quinasa T4, empleando la polimerasa SequiTherm (Epicentre Technologies). También se determinan los límites intrón-exón de exones seleccionados y se analizan los productos genómicos de PCR para confirmar los resultados. A continuación, los productos de PCR que se sospeche que portan mutaciones se clonan y se secuencian para validar los resultados de la secuenciación directa.
Los productos de PCR se clonan en vectores con colas T como se describe en Holton y col. Nucleic Acids Research, 19:1156 (1991) y se secuencian con polimerasa T7 (United States Biochemical). Se identifican los individuos afectados por mutaciones que no están presentes en los individuos no afectados.
También se observan los reordenamientos genómicos como procedimiento para determinar alteraciones en un gen correspondiente a un polinucleótido. Los clones genómicos aislados según el Ejemplo 2 se traducen por desplazamiento de mella con digoxigenina-desoxiuridina 5'-trifosfato (Boehringer Manheim) y FISH, realizadas como se describe en Johnson y col., Methods Cell Biol.35: 73-99(1991). La hibridación con la sonda marcada se realiza usando un gran exceso de ADN cot-1 humano para la hibridación específica con el locus genómico correspondiente.
Los cromosomas se contrastan con 4,6-diamino-2-fenilindol y yoduro de propidio, produciendo una combinación de bandas C y R. Se obtienen las imágenes alineadas para el mapeo exacto usando un conjunto de filtros de triple banda (Chroma Technology, Brattleboro, VT) en combinación con una cámara con enfriamiento y carga acoplada (Photometrics, Tucson, AZ) y filtros de longitud de onda de excitación variable. (Johnson y col., Genet. Anal. Tech. Appl., 8:75 (1991)). La toma de imágenes, el análisis y las medidas de la longitud cromosómica fraccionada se realizaron usando el sistema ISee Graphical Program (Inovision Corporation, Durham, NC.) Las alteraciones cromosómicas de la región genómica hibridada con la sonda se identifican como inserciones, deleciones y translocaciones. Estas alteraciones se usan como marcador diagnóstico para una enfermedad asociada.
Ejemplo 25 Procedimiento de detección de niveles anómalos de un polipéptido en una muestra biológica
Se puede detectar un polipéptido de la presente invención en una muestra biológica, y si se detecta un aumento o disminución del nivel del polipéptido, este polipéptido es un marcador para un fenotipo en particular. Los procedimientos de detección son numerosos y, de este modo, se entiende que un experto en la materia puede modificar el siguiente ensayo para ajustarlo a sus necesidades particulares.
Por ejemplo, los ELISA de tipo sándwich de anticuerpo se usan para detectar polipéptidos en una muestra, preferiblemente una muestra biológica. Se recubren los pocillos de una placa de microvaloración con anticuerpos específicos, a una concentración final de 0,2 a 10 ug/ml. Los anticuerpos son monoclonales o policlonales y se producen por el procedimiento descrito en este documento. Los pocillos se bloquean para que la unión inespecífica del polipéptido al pocillo se reduzca.
Los pocillos recubiertos se incuban a continuación durante >2 horas a temperatura ambiente con un muestra que contiene el polipéptido. Preferiblemente, se deben usar diluciones seriadas de la muestra para validar los resultados. A continuación se lavan las placas tres veces con agua desionizada o destilada para eliminar el polipéptido no unido.
A continuación, se añaden 50 ul del anticuerpo específico conjugado con fosfatasa alcalina a una concentración de 25-400 ng y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavan las placas de nuevo tres veces con agua desionizada o destilada para eliminar el conjugado no unido.
Se añaden 75 ul de solución sustrato de 4-metilumbeliferil fosfato (MUP) o de p-nitrofenil fosfato (NPP) a cada pocillo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se mide la reacción con un lector de placas de microvaloración. Se prepara una curva patrón usando diluciones seriadas de una muestra control y se representa la concentración del polipéptido en el eje X (escala logarítmica) y la fluorescencia o absorbancia en el eje Y (escala lineal). Se interpola la concentración del polipéptido en la muestra usando la curva patrón.
Ejemplo 26 Formulación
La invención también proporciona procedimientos de tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos y/o dolencias (tales como, por ejemplo, una o más de las enfermedades o trastornos descritos en este documento) mediante al administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un agente terapéutico. Por agente terapéutico se entiende polinucleótidos o polipéptidos de la invención (incluyendo fragmentos y variantes), sus agonistas o antagonistas y anticuerpos dirigidos contra ellos, en combinación con un tipo de vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un vehículo estéril).
El agente terapéutico se formulará y dosificará de forma constante con buena práctica médica, teniendo en cuenta la enfermedad del paciente individual (especialmente los efectos adversos del tratamiento con el agente terapéutico solo), el sitio de administración, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad eficaz" para los fines en este documento se determina, de este modo, mediante tales consideraciones.
Como proposición general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz del agente terapéutico administrado por vía parenteral por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 ug/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se apunta anteriormente, esto se someterá a discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,01 mg/kg/día y lo más preferiblemente para humanos entre aproximadamente 0,01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se da de forma continua, el agente terapéutico se administra típicamente a una frecuencia de dosis de aproximadamente 1 ug/kg/hora a aproximadamente 50 ug/kg/hora, mediante 1-4 inyecciones al día o mediante infusión subcutánea continua, usando, por ejemplo, una minibomba. También se puede emplear una bolsa de solución intravenosa. La duración necesaria del tratamiento para observar cambios y el intervalo después del tratamiento para que se produzcan respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado.
Los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, geles, gotas o parches transdérmicos), bucal o como un spray oral o nasal. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a una carga no tóxica sólida, semisólida o líquida, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo. El término "parenteral" como se usa en este documento se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.
Los agentes terapéuticos de la invención también se administran adecuadamente mediante sistemas de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de agentes terapéuticos de liberación mantenida se administran por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, geles, gotas o parches transdérmicos), bucal o como un spray oral o nasal. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a una carga no tóxica sólida, semisólida o líquida, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo. El término "parenteral" como se usa en este documento se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.
Los agentes terapéuticos de la invención también pueden administrarse adecuadamente mediante sistemas de liberación mantenida. Ejemplos adecuados de agentes terapéuticos de liberación mantenida incluyen materiales poliméricos adecuados (tales como, por ejemplo, matrices de polímero semipermeables en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o microcápsulas), materiales hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en una aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico y derivados poco solubles (tales como, por ejemplo, una sal poco soluble).
Las matrices de liberación mantenida incluyen polilactidas (patente de EE.UU. Nº 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(2-hidroxietil metacrilato) (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer y col., Id.) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).
Los agentes terapéuticos de liberación mantenida también incluyen agentes terapéuticos de la invención incluidos en un liposoma (véase, en general, Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein y Fidler (editores.), Liss, Nueva York, pág. 317-327 y 353-365 (1989)). Los liposomas que contiene el agente terapéutico se preparan por procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); documento EP 52.322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949; documento EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de EE.UU. Nº 4.485.045 y 4.544.545 y documento EP 102.324. Generalmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en el que el contenido lipídico es mayor de aproximadamente el 30% del porcentaje molar de colesterol, estando la proporción seleccionada ajustada para el agente terapéutico óptimo.
Aún en una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran por medio de una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)).
Otros sistemas de liberación controlada se describen en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
Para la administración parenteral, en una realización, el agente terapéutico se formula en general mezclándolo al grado deseado de pureza en una unidad de dosificación en forma inyectable (solución, suspensión o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que sea no tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y que sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes ni otros compuestos que son conocidos por ser deletéreos para el agente terapéutico.
En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el agente terapéutico uniforme e íntimamente con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos. Entonces, si es necesario, el producto se configura en la formulación deseada. Preferiblemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de estos vehículos transportadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. También son útiles en este documento vehículos no acuosos tales como aceites fijados y oleato de etilo, así como liposomas.
El vehículo contiene adecuadamente cantidades menores de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Estos materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes, tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobilinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbital; contraiones, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.
El agente terapéutico se formulará típicamente en estos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de algunos de los excipientes, vehículos o estabilizadores anteriores tendrá como resultado la formación de sales del polipéptido.
Cualquier agente farmacéutico usado para la administración del agente terapéutico puede esterilizarse. La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Los agentes terapéuticos generalmente se colocan dentro de recipientes que tengan un acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un tapón que se pueda perforar con una aguja hipodérmica.
Los agentes terapéuticos se almacenaran generalmente en recipientes unidosis o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, viales de 10 ml se cargan con 5 ml de solución terapéutica acuosa al 1% (p/v) filtrada estéril y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo el agente terapéutico liofilizado usando agua bacteriostática para inyección.
La invención también proporciona un envase o kit farmacéuticos que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de los agentes terapéuticos de la invención. Asociado con este recipiente(s) puede haber una nota en la forma establecida por una agencia gubernamental para la regulación de la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para la administración en humanos. Además, los agentes terapéuticos pueden emplearse junto con otros compuestos terapéuticos.
Los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con adyuvantes. Los adyuvantes que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, alumbre, alumbre más deoxicolato (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG y MPL. En una realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con alumbre. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con QS-21. Adyuvantes adicionales que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, inmunomodulador monofosforil lípido, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio, MF-59 y tecnología de adyuvante virosomal. Las vacunas que pueden administrarse con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, vacunas dirigidas hacia la protección frente a SPR (sarampión, paperas, rubéola), polio, varicela, tétano/difteria, hepatitis A, hepatitis B, Haemophilus influenzae B, tos ferina, neumonía, gripe, enfermedad de Lyme, rotavirus, cólera, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, poliomielitis, rabia, fiebre tiroidea y pertussis. Las combinaciones se pueden administrar concomitantemente, por ejemplo, como una mezcla, independientemente pero simultánea o conjuntamente, o secuencialmente. Esto incluye presentaciones en la que los agentes combinados se administran junto con una mezcla terapéutica y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran independientemente pero simultáneamente, por ejemplo, a través de vías intravenosas distintas en el mismo individuo. La administración "en combinación" además incluye la administración independiente de uno de los compuestos o agentes primero seguido por el segundo.
Los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos que pueden administrarse en combinación con los agentes terapéuticos de la invención, incluyen, pero sin limitación, otros miembros de la familia TNF, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales, citocinas y/o factores de crecimiento. Las combinaciones se pueden administrar concomitantemente, por ejemplo, como una mezcla, independientemente pero simultánea o conjuntamente, o secuencialmente. Esto incluye presentaciones en la que los agentes combinados se administran junto con una mezcla terapéutica y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran independientemente pero simultáneamente, por ejemplo, a través de vías intravenosas distintas en el mismo individuo. La administración "en combinación" además incluye la administración independiente de uno de los compuestos o agentes primero seguido por el segundo.
En una realización, los agentes terapeúticos de la invención se administran en combinación con miembros de la familia TNF. El TNF, moléculas relacionadas o semejantes a TNF que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, formas solubles del TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, también conocida como TNF-beta), LT-beta (que se encuentra en heterotrímeros complejos LT-alfa2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-2BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (publicación internacional Nº WO 96/14328), AIM-I (publicación internacional Nº WO 97/33899), endocina-alfa (publicación internacional Nº WO 98/07880), TR6 (publicación internacional Nº WO 98/30694), OPG y neutrocina-alfa (publicación internacional Nº WO 98/18921), OX40 y factor de crecimiento nervioso (NGF) y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-1BB, TR2 (publicación internacional Nº WO/96/34095), DR3 (publicación internacional Nº WO 97/33904), DR4 (publicación internacional Nº WO 98/32856), TR5 (publicación internacional Nº WO 98/30693), TR6 (publicación internacional Nº WO 98/30694), TR7 (publicación internacional Nº WO 98/41629), TRANK, TR9 (publicación internacional Nº WO 98/56892), TR10 (publicación internacional Nº WO 98/54202), 312C2 (publicación internacional Nº WO 98/06842) y TR12 y formas solubles de CD154, CD70 y CD153.
En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con agentes antirretrovirales, inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos, inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos y/o inhibidores de proteasas. Los inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos que se pueden administrar en combinación con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, RETROVIR( (zidovudina/AZT), VIDEX( (didanosina/ddI), HIVID( (zalcitabina/ddC), ZERIT( (estavudina/d4T), EPIVIR( (lamivudina/3TC) y COMVIVIR( (zidovudina/lamivudina). Los inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos que se pueden administrar en combinación con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, VIRAMUNE( (nevirapina), RESCRIPTOR( (delavirdina) y SUSTIVA( (efavirenz). Los inhibidores de proteasas que se pueden administrar en combinación con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, CRIXIVAN( (indinavir), NORVIR( (ritonavir), INVIRASE( (saquinavir) y VIRACEPT( (nelfinavir). En una realización específica, los agentes antirretrovirales, inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos, inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos y/o inhibidores de proteasas se pueden usar en cualquier combinación con los agentes terapéuticos de la invención para tratar el SIDA y/o prevenir o tratar la infección por VIH.
En otra realización, los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes frente a infecciones oportunistas. Los agentes antioportunistas que se pueden administrar en combinación con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, TRIMETOPRIM-SULFAMETOXAZOL(, DAPSONA(, PENTAMIDINA(, ATOVACUONA(, ISONIAZIDA(, RIFAMPINA(, PIRAZINAMIDA(, ETAMBUTOL(, RIFABUTINA(, CLARITROMICINA(, AZITROMICINA(, GANCICLOVIR(, FOSCARNET(, CIDOFOVIR(, FLUCONAZOL(, ITRACONAZOL(, KETOCONAZOL(, ACICLOVIR(, FAMCICLOVIR(, PIRIMETAMINA(, LEUCOVORINA(, NEUPOGEN( (filgrastim/G-CSF) y LEUKINA( (sargramostim/GM-CSF). En una realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con TRIMETOPRIM-SULFAMETOXAZOL(, DAPSONA(, PENTAMIDINA( y/o ATOVACUONA( para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista de neumonía por Pneumocystis carinii. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con ISONIAZIDA(, RIFAMPINA(, PIRAZINAMIDA( y/o ETAMBUTOL( para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por el complejo de Mycobacterium avium. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con RIFABUTINA(, CLARITROMICINA( y/o AZITROMICINA( para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por Mycobacterium tuberculosis. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con GANCICLOVIR(, FOSCARNET( y/o CIDOFOVIR( para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por citomegalovirus. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con FLUCONAZOL(, ITRACONAZOL( y/o KETOCONAZOL( para tratar o prevenir profilácticamente una infección micótica oportunista. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con ACICLOVIR( y/o FAMCICLOVIR( para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por el virus del herpes simple de tipo I y/o de tipo II. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con PIRIMETAMINA( y/o LEUCOVORINA( para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por Toxoplasma gondii. En otra realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se usan en cualquier combinación con LEUCOVORINA( y/o NEUPOGEN( para tratar o prevenir profilácticamente una infección bacteriana oportunista.
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con un agente antiviral. Los agentes antivirales que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, aciclovir, ribavirina, amantadina y remantidina.
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con un agente antibiótico. Los agentes antibióticos que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, amoxicilina, beta-lactamasas, aminoglicósidos, beta-lactama (glicopéptido), beta-lactamasas, clindamicina, cloramfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacina, ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrólidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol y vancomicina.
Los agentes inmunosupresores inespecíficos convencionales que se pueden administrar en combinación con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida, metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15-desoxispergulina y otros agentes inmunosupresores que pueden actuar suprimiendo la función de respuesta de las células T.
En realizaciones específicas, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con inmunosupresores. Las preparaciones inmunosupresoras que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, ORTHOCLON( (OKT3), SANDIMMUNE(/NEORAL(/SANGDIA( (ciclosporina), PROGRAF( (tacrolimus), CELLCEPT( (micofenolato), Azatioprina, glucocorticoesteroides y RAPAMUNE( (sirolimus). En una realización específica, se pueden usar los inmunosupresores para prevenir el rechazo de órgano o el trasplante de médula ósea.
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran solos o en combinación con una o más preparaciones intravenosas de inmunoglobulina. Las preparaciones intravenosas de inmunoglobulina que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, GAMMAR(, IVEEGAM(, SANDOGLOBULINA(, GAMMAGARD S/D( y GAMIMUNE(. En una realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con preparaciones intravenosas de inmunoglobulina en terapia para trasplante (por ejemplo, trasplante de médula ósea).
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran solos en combinación con un agente antiinflamatorio. Los agentes antiinflamatorios que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, glucocorticoides y los antiinflamatorios no esteroideos, derivados del ácido aminoarilcarboxílico, derivados del ácido arilacético, derivados del ácido arilbutírico, ácidos arilcarboxílicos, derivados del ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados del ácido salicílico, tiazincarboxamidas, ácido e-acetamidocaproíco, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteína, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxim, procuazona, proxazol y tenidap.
En otra realización, las composiciones de la invención se administran en combinación con un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, derivados antibióticos (por ejemplo, doxorrubicina, bleomicina, daunorrubicina y dactinomicina); antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno); antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferón alfa-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina y 6-tioguanina); agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfán, cis-platino y sulfato de vincristina); hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, fosfato sódico de estramustina, etinilestradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno y testolactona); derivados de mostazas nitrogenadas (por ejemplo, mefaleno, clorambucil, mecloretamina (mostaza nitrogenada) y tiotepa); esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato sódico de betametasona) y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina y etopósido).
En una realización específica, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona) o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En otra realización, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con Rituximab. En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran con Rituximab y CHOP, o Rituximab o cualquier combinación de los componentes de CHOP.
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con citocinas. Las citocinas que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-gamma y TNF-alfa. En otra realización, los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar con cualquier interleucina, que incluyen, pero sin limitación, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 e IL-21.
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con proteínas angiogénicas. Las proteínas angiogénicas que se pueden administrar con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, factor de crecimiento derivado de glioma (GDGF), como se describe en la patente europea número EP-399816; factor de crecimiento derivado de plaquetas A (PDGF-A), como se describe en la patente europea número EP-682110; factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B), como se describe en la patente europea número EP-282317; factor de crecimiento placentario (PlGF), como se describe en la publicación internacional número WO 92/06194; factor de crecimiento placentario-2 (PlGF-2), como se describe en Hauser y col., Growth Factors, 4:259-268 (1993); factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), como se describe en la publicación internacional número WO 90/13649; factor de crecimiento endotelial vascular-A (VEGF-A), como se describe en la patente europea número EP-506477; factor de crecimiento endotelial vascular-2 (VEGF-2), como se describe en la publicación internacional número WO 96/39515, factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGF-3), factor de crecimiento endotelial vascular B-186 (VEGF-B186), como se describe en la publicación internacional número WO 96/26736; factor de crecimiento endotelial vascular-D (VEGF-D), como se describe en la publicación internacional número WO 98/02543; factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D), como se describe en la publicación internacional Nº WO 98/07832 y el factor de crecimiento endotelial vascular-E (VEGF-E), como se describe en la patente alemana número DE19639601.
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con factores de crecimiento hematopoyéticos. Los factores de crecimiento hematopoyéticos que pueden administrarse con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, LEUKINA, (SARGRAMOSTIM) y NEUPOGEN (FILGRASTIM).
En una realización adicional, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con factores de crecimiento de fibroblastos. Los factores de crecimiento de fibroblastos que pueden administrarse con los agentes terapéuticos de la invención incluyen, pero sin limitación, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 y FGF-15.
En una realización específica, las formulaciones de la presente invención pueden comprender además antagonistas de glicoproteína P (también referida como la proteína asociada a multirresistencia o GPP), que incluyen antagonistas de sus polinucleótidos codificadores (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios, ribozimas, proteínas con dedos de cinc, etc.). La glicoproteína P es bien conocida por disminuir la eficacia de diversas administraciones de fármacos debido a su capacidad para exportar niveles intracelulares de fármaco absorbido al exterior celular. Mientras que esta actividad es particularmente pronunciada en células cancerosas en respuesta a la administración de regímenes de quimioterapia, se ha apreciado en otros diversos tipos celulares y en la administración de otras clases de fármacos (por ejemplo, células T y fármacos anti-VIH). De hecho, ciertas mutaciones en el gen GPP reducen significativamente la función de GPP haciéndole menos capaz para forzar los fármacos fuera de las células. Las personas que tienen dos versiones del gen mutado, uno heredado de cada padre, tienen más de cuatro veces menos GPP que las personas con dos versiones normales del gen. Las personas también pueden tener un gen normal y otro mutado. Ciertas poblaciones étnicas tienen un aumento de la incidencia de estas mutaciones en GPP. Entre los individuos de Gana, Kenia y Sudán, así como afroamericanos, la frecuencia del gen normal oscilaba del 73% a 84%. Por el contrario, la frecuencia era del 34% al 59% entre las poblaciones británica blanca, portuguesa, del sudoeste de Asia, china, filipina y saudita. Como resultado, ciertas poblaciones étnicas pueden necesitar un aumento de la administración de antagonistas de GPP en la formulación de la presente invención para llegar a la dosis eficaz del agente terapéutico (por ejemplo, los descendientes de africanos). Por el contrario, ciertas poblaciones étnicas, especialmente las que tienen un aumento de la frecuencia de la GPP mutada (por ejemplo, de descendientes caucasianos o descendientes de no africanos) pueden necesitar menos composiciones farmacéuticas en la formulación debido a un aumento efectivo en la eficacia de estas composiciones como resultado del aumento de la absorción efectiva (por ejemplo, menos actividad GPP) de dichos compuestos.
Además, en otra realización específica, las formulaciones de la presente invención pueden comprender adicionalmente antagonistas de OATP2 (también referida como la proteína asociada a multirresistencia o MRP2), que incluyen antagonistas de sus polinucleótidos codificadores (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios, ribozimas, proteínas con dedos de cinc, etc.). La invención también comprende además cualquier antagonista adicional conocido para inhibir proteínas aunque sea atribuible a un fenotipo de resistencia cruzada en células en proliferación.
En realizaciones adicionales, los agentes terapéuticos de la invención se administran en combinación con otros regímenes terapéuticos o profilácticos, tales como, por ejemplo, terapia de radiación.
Ejemplo 27 Procedimiento de tratamiento de niveles disminuidos del polipéptido
La presente invención se refiere a un procedimiento para tratar un individuo que necesita un aumento del nivel de un polipéptido de la invención en el organismo, que comprende la administración a dicho individuo de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de la invención (incluyendo polipéptidos de la invención). Además, se apreciará que las dolencias causadas por una disminución en el nivel de expresión estándar o normal de una proteína secretada en un individuo puede tratarse mediante la administración del polipéptido de la presente invención, preferiblemente en la forma secretada. De este modo, la invención también proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo que necesita un aumento del nivel del polipéptido que comprende la administración a este individuo de un agente terapéutico que comprende una cantidad del polipéptido para aumentar el nivel de actividad del polipéptido en dicho individuo.
Por ejemplo, un paciente con niveles disminuidos de un polipéptido recibe una dosis diaria de 0,1-100 ug/kg del polipéptido durante seis días consecutivos. Preferiblemente, el polipéptido está en la forma secretada. Los detalles exactos del esquema de dosificación, en función de la administración y formulación, se proporcionan en este documento.
Ejemplo 28 Procedimiento de tratamiento de niveles incrementados del polipéptido
La presente invención también se refiere a un procedimiento para tratar a un individuo que necesita una disminución del nivel de un polipéptido de la invención en el organismo, que comprende la administración a dicho individuo de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de la invención (incluyendo polipéptidos y anticuerpos de la invención).
En un ejemplo, se usa la tecnología complementaria para inhibir la producción de un polipéptido de la presente invención. Esta tecnología es un ejemplo de un procedimiento de disminución de los niveles de un polipéptido, preferiblemente una forma secretada, debido a diversas etiologías, tales como cáncer. Por ejemplo, a un paciente diagnosticado con niveles incrementados anormalmente elevados de un polipéptido se le administra por vía intravenosa polinucleótidos complementarios a 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y 3,0 mg/kg/día durante 21 días. Este tratamiento se repite después de un periodo de descanso de 7 días si el tratamiento ha sido bien tolerado. La formulación del polinucleótido complementario se proporciona en este documento.
Ejemplo 29 Procedimiento de tratamiento usando terapia génica ex vivo
Un procedimiento de terapia génica trasplanta fibroblastos, que son capaces de expresar un polipéptido, en un paciente. Generalmente, los fibroblastos se obtienen de un sujeto mediante biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en medio de cultivo tisular y se divide en pequeños trozos. Los trozos pequeños de tejido se colocan sobre una superficie húmeda de una frasca de cultivo tisular; se colocan aproximadamente diez piezas en cada frasca. La frasca se pone boca abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente una noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, la frasca se invierte y los trozos de tejido permanecen pegados al fondo de la frasca y se añade medio nuevo (por ejemplo, medio F12 de Ham, con SBF al 10%, penicilina y estreptomicina). A continuación se incuban las frascas a 37 grados C durante aproximadamente una semana.
En este momento, se añade medio nuevo y posteriormente se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, surge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se lleva a frascas más grandes.
pMV-7 (Kirschmeier, P. T. y col., DNA, 7:219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus de sarcoma murino de Moloney, se digiere con EcoRI y HindIII y posteriormente se trata con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica usando perlas de vidrio.
El ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención puede amplificarse usando cebadores para PCR que corresponden a las secuencias de los extremos 5' y 3', respectivamente, como se explica en el Ejemplo 11 usando cebadores y con los sitios de restricción apropiados y los codones de inicio/parada, si es necesario. Preferiblemente, el cebador 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye un sitio HindIII. Se añadieron a la vez cantidades iguales del esqueleto lineal del virus de sarcoma murino de Moloney y el fragmento EcoRI y HindIII amplificado, en presencia de ADN ligasa T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para el ligamiento de los dos fragmentos. La mezcla de ligamiento se usa, a continuación, para transformar bacterias HB101, que se siembran después en placas sobre agar que contiene kanamicina con el propósito de confirmar que el vector tiene el gen de interés insertado apropiadamente.
El anfotrópico pA317 o células empaquetadoras GP+am12 se crecen en cultivo tisular hasta la confluencia en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con el 10% de suero de ternera (ST), penicilina y estreptomicina. A continuación, se añade al medio el vector MSV que contiene el gen y las células empaquetadoras se transducen con el vector. Las células empaquetadoras ahora producen partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células empaquetadoras ahora se denominan células productoras).
Se añade medio nuevo a las células productoras transducidas y, posteriormente, se recoge el medio de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio consumido, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtran a través de un filtro millipore para eliminar las células productoras que se han despegado y a continuación se usa este medio para infectar fibroblastos. Se retira el medio de una placa subconfluente de fibroblastos y se reemplaza rápidamente con el medio de las células productoras. Se retira este medio y se sustituye por medio nuevo. Si el valor del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos se infectarán y no será necesaria una selección. Si el valor es muy bajo, entonces es necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his. Una vez que se han infectado los fibroblastos eficazmente, se analizan para determinar si se produce la proteína.
Los fibroblastos manipulados genéticamente se trasplantan entonces en el hospedador, solos o después de haber sido crecidos hasta la confluencia en perlas de microvehículo cytodex 3.
Ejemplo 34 Producción de un anticuerpo a) Tecnología de hibridoma
Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por diversos procedimientos. (véase, Current Protocols, Capítulo 2). Como ejemplo de estos procedimientos, se administran a un animal células que expresan HLRRSI1 para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales. En un procedimiento preferido, se prepara y purifica una preparación de la proteína HLRRSI1 para obtenerla sustancialmente libre de contaminantes naturales. A continuación se introduce esta preparación en un animal para producir antisueros policlonales de mayor actividad específica.
Los anticuerpos monoclonales específicos para la proteína HLRRSI1 se prepara usando la tecnología de hibridoma. (Köhler y col., Nature 256:495 (1975); Köhler y col., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler y col., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., pág. 563-681 (1981)). En general, un animal (preferiblemente un ratón) se inmuniza con el polipéptido HLRRSI1 o, más preferiblemente, con una célula que expresa el polipéptido HLRRSI1 secretado. Estas células que expresan este polipéptido se cultivan en cualquier medio de cultivo tisular adecuado, preferiblemente en medio de Eagle modificado por Earle suplementado con el 10% de suero bovino fetal (inactivado a aproximadamente 56ºC) y suplementado con aproximadamente 10 g/l de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1.000 U/ml de penicilina y aproximadamente 100 \mug/ml de estreptomicina.
Se extraen los esplenocitos de estos ratones y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier línea celular de mieloma adecuada según la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma parental (SP20), disponible en la ATCC. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y luego se clonan mediante dilución límite, como describen Wands y col. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de esta selección se analizan a continuación para identificar clones que secreten anticuerpos capaces de unir el polipéptido HLRRSI1.
Alternativamente, los anticuerpos adicionales capaces de unirse al polipéptido HLRRSI1 pueden producirse en un procedimiento de dos pasos usando anticuerpos antiidiotipo. Este procedimiento hace uso del hecho de que los anticuerpos son antígenos por sí mismos y, por tanto, es posible obtener un anticuerpo que se una a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este procedimiento, se usan anticuerpos específicos de proteínas para inmunizar un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de este animal se usan a continuación para producir células de hibridoma y las células de hibridoma se analizan para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de la proteína HLRRSI1 puede bloquearse por HLRRSI1. Estos anticuerpos comprenden anticuerpos antiidiotipo frente al anticuerpo específico de la proteína HLRRSI1 y se usan para inmunizar un animal para inducir la formación de anticuerpos específicos de la proteína HLRRSI1 adicionales.
Para el uso in vivo de los anticuerpos en humanos, se "humaniza" un anticuerpo. Estos anticuerpos pueden producirse usando construcciones genéticas derivadas de las células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales descritas anteriormente. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados son conocidos en la técnica y se describen en este documento.(para una revisión, véase Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabilly y col., patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Taniguchi y col., documento EP 171496; Morrison y col., documento EP 173494; Neuberger y col., documento WO 8601533; Robinson y col., documento WO 8702671; Boulianne y col., Nature 312:643 (1984); Neuberger y col., Nature 314:268 (1985)).
b) Aislamiento de fragmentos de anticuerpo dirigido frente a HLRRSI1 a partir de una biblioteca de scFv
Se construyen los genes V naturales aislados de PBL humanos en una biblioteca de fragmentos de anticuerpo que contiene reactividades frente a HLRRSI1 a las cuales el donante puede o no haberse expuesto (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.885.793, incorporada en este documento como referencia en su totalidad).
Recuperación de la biblioteca. Se construye una biblioteca de scFv a partir de ARN de PBL humanos como se describe en la publicación PCT WO 92/01047. Para recuperar el fago que exhibe fragmentos de anticuerpo, se usan aproximadamente 10^{9} E. coli portadoras de fagémido para inocular 50 ml de 2xTY con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina (2xTY-AMP-GLU) y crecerlas hasta una D.O. de 0,8 con agitación. Se usaron 5 ml de este cultivo para inocular 50 ml de 2xTY-AMP-GLU, se añaden 2 x 10^{8} UT del gen delta 3 auxiliar (gen delta III de M13, véase la publicación PCT WO 92/01047) y el cultivo se incuba a 37ºC durante 45 minutos sin agitación y posteriormente a 37ºC durante 45 minutos con agitación. El cultivo se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 min y el sedimento se resuspende en 2 litros de 2xTY con 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de kanamicina y se crece una noche. El fago se prepara como se describe en la publicación PCT WO 92/01047.
El gen delta III de M13 se prepara como sigue: el gen delta III del fago auxiliar M13 no codifica la proteína del gen III, por tanto los fagémidos que exhiben fragmentos de anticuerpo tienen una mayor avidez de unión por el antígeno. Las partículas infecciosas del gen delta III de M13 se hacen creciendo el fago auxiliar en células que portan un derivado de pUC19 que suministra la proteína del gen III silvestre durante la morfogénesis del fago. El cultivo se incuba durante 1 hora a 37ºC sin agitación y luego durante 1 hora más a 37ºC con agitación. Se centrifugan las células (IEC-Centra 8.400 rpm durante 10 min), se resuspenden en 300 ml de medio 2xTY con 100 \mug de ampicilina/ml y 25 \mug de kanamicina/ml (2xTY-AMP-KAN) y se crecen una noche, en agitación a 37ºC. Las partículas de fago se purifican y se concentran a partir del medio de cultivo mediante dos precipitaciones con PEG (Sambrook y col., 1990), se resuspenden en 2 ml de PBS y se pasa a través de un filtro de 0,45 \mum (Minisart NML; Sartorius) para dar una concentración final de aproximadamente 10^{13} unidades de transducción/ml (clones resistentes a ampicilina).
Inmunopurificación de la biblioteca Inmunotubos (Nunc) en PBS se recubren durante una noche con 4 ml de un polipéptido de la presente invención a 100 \mug/ml o 10 \mug/ml. Se bloquean los tubos con Marvel al 2%-PBS durante 2 horas a 37ºC y luego se lavan 3 veces en PBS. Aproximadamente se aplican 10^{13} UT de fago al tubo y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente rotando en un agitador con movimiento sube y baja y luego se deja vertical durante 1,5 horas. Se lavan los tubos 10 veces con PBS, Tween-20 al 0,1% y 10 veces con PBS. El fago se eluye añadiendo 1 ml de trietilamina 100 mM y rotando 15 minutos en un agitador de movimiento sube y baja, tras lo cual la solución se neutraliza inmediatamente con 0,5 ml de Tris HCl 1,0 M, pH 7,4. A continuación, se usan los fagos para infectar 10 ml de E. coli TG1 en fase semilogarítmica incubando el fago eluído con bacterias durante 30 minutos a 37ºC. Se sembraron entonces las células de E. coli en placas TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina. La biblioteca bacteriana resultante se recupera a continuación con el gen delta 3 del fago auxiliar como se describe anteriormente para preparar el fago para una posterior ronda de selección. Este proceso se repite a continuación por un total de 4 rondas de purificación de afinidad con el lavado de tubos incrementado a 20 veces con PBS, Tween-20 al 0,1% y 20 veces con PBS de 3 a 4 rondas.
Caracterización de adhesivos. Se usan los fagos eluídos de la 3ª y 4ª rondas de selección para infectar E. coli HB 2151 y se produce scFv soluble (Marks y col., 1991) de colonias únicas para ensayo. Los ELISA se realizan con placas de microvaloración recubiertas con 10 pg/ml del polipéptido de la presente invención en bicarbonato 50 mM pH 9,6. Los clones positivos en ELISA se caracteriza además mediante huella genética por PCR (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 92/01047) y luego mediante secuenciación. Estos clones positivos en ELISA pueden caracterizarse adicionalmente mediante técnicas conocidas en la materia, tales como, por ejemplo, mapeo de epítopes, afinidad de unión, transducción de la señal del receptor, capacidad para bloquear o inhibir competitivamente la unión anticuerpo/antígeno y actividad agonista o antagonista.
Ejemplo 36 Ensayo de proliferación de células T
Se realiza un ensayo de proliferación inducida por CD3 en PBMC y se mide mediante la captación de ^{3}H-timidina. El ensayo se realiza como sigue. Se cubrieron placas de 96 pocillos con 100 \mul/pocillo de Acm frente a CD3 (HIT3a, Pharmingen) o un Acm del mismo isótopo (B33.1) durante una noche a 4 grados C (1 \mug/ml en tampón bicarbonato 0,05 M, pH 9,5), a continuación se lava tres veces con PBS. Los PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente F/H a partir de sangre periférica humana y se añaden a pocillos por cuadruplicado (5 x 10^{4}/pocillo) de placas cubiertas con Acm en RPMI con STF al 10% y penicilina/estreptomicina en presencia de concentraciones variables de polipéptidos de la invención (volumen total, 200 \mul). Los controles son el tampón de la proteína relevante y el medio solo. Después de 48 h a 37 grados C, se centrifugan las placas durante 2 min a 1.000 rpm y se retiran 100 \mul de sobrenadante y se conserva a -20 grados C para medir la IL-2 (u otras citocinas) si se observa efecto sobre la proliferación. Los pocillos se complementan con 100 \mul de medio con 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina y se cultiva a 37 grados C durante 18-24 h. Se recogen los pocillos y la incorporación de ^{3}H-timidina se usa como medida de la proliferación. El anticuerpo
anti-CD3 solo es el control positivo para la proliferación. También se usa la IL-2 (100 U/ml) como control que potencia la proliferación. Un anticuerpo control que no induce proliferación de células T se usa como los controles negativos de los efectos de los polipéptidos de la invención.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 37 Efecto de los polipéptidos de la invención sobre la expresión de moléculas de MHC de clase II, coestimuladoras y de adhesión y sobre la diferenciación de monocitos y células dendríticas humanas derivadas de monocitos
Las células dendríticas se generan mediante la expansión de precursores de la proliferación que se encuentran en sangre periférica: se cultivan PBMC adherentes o fracciones monocíticas elutriadas durante 7-10 días con GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml). Estas células dendríticas tienen el fenotipo característico de células inmaduras (expresión de antígenos CD1, CD80, CD86, CD40 y MHC de clase II). El tratamiento con factores de activación, tales como TNF-(, causan un rápido cambio en el fenotipo de la superficie (aumento de la expresión de moléculas de MHC de clase I y II, coestimuladoras y de adhesión, regulación por disminución de FC(RII, regulación por incremento de CD83). Estos cambios se correlacionan con un aumento de la capacidad de presentación antigénica y con la maduración funcional de las células dendríticas.
Al análisis por FACS de los antígenos de superficie se realiza como sigue. Se trataron las células durante 1-3 días con concentraciones crecientes de polipéptidos de la invención en LPS (control positivo), se lavaron con PBS con BSA al 1% y azida sódica 0,02 mM y se incubaron con una dilución 1:20 de los anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE apropiados durante 30 minutos a 4 grados C. Después de un lavado adicional, las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson).
Efecto sobre la producción de citocinas. Las citocinas generadas por las células dendríticas, en especial IL-12, son importantes en el inicio de las respuestas inmunitarias dependientes de células T. IL-12 influye en gran medida sobre el desarrollo de la respuesta inmunitaria de células T, Th1 cooperadoras e induce la función de células T citotóxicas y NK. Se usa un ELISA para medir la IL-12 liberada como sigue. Las células dendríticas (10^{6}/ml) se tratan con concentraciones crecientes de polipéptidos de la invención durante 24 horas. Se añade LPS (100 ng/ml) al cultivo celular como control positivo. Se recogen, a continuación, los sobrenadantes de los cultivos celulares y se analiza el contenido en IL-12 usando un kit de ELISA comercial (por ejemplo, R&D Systems (Minneapolis, MN)). Con los kits se proporcionan los protocolos convencionales.
Efecto sobre la expresión de moléculas de MHC de clase II, coestimuladoras y de adhesión. Se han identificado tres familias principales de antígenos de la superficie celular en monolitos: moléculas de adhesión, moléculas implicadas en la presentación antigénica y el receptor de Fc. La modulación de la expresión de los antígenos de MHC de clase II y otras moléculas coestimuladoras, tales como B7 e ICAM-1, puede tener como resultado cambios en la capacidad presentadora de antígeno de los monocitos y en la capacidad para inducir la activación de células T. El aumento de la expresión de receptores de Fc puede estar correlacionado con una mejora en la actividad citotóxica de monocito, en la liberación de citocinas y en la fagocitosis.
Se usó el análisis por FACS para examinar los antígenos de superficie como sigue. Se trataron los monocitos durante 1-5 días con concentraciones crecientes de polipéptidos de la invención o LPS (control positivo), se lavaron con PBS con BSA al 1% y azida sódica 0,02 mM y, a continuación, se incubaron con una dilución 1:20 de los anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE adecuados durante 30 minutos a 4 grados C. Tras un lavado adicional, las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson).
Activación de monocitos y/o aumento de la supervivencia. Se conocen en la técnica ensayos para moléculas que activan (o alternativamente, inactivan) monocitos y/o aumentar la supervivencia de monocitos (o alternativamente, disminuyen la supervivencia de monocitos y se pueden aplicar de forma rutinaria para determinar si una molécula soluble de la invención funciona como inhibidor o activador de monocitos. Los polipéptidos, agonistas o antagonistas de la invención se pueden analizar usando los tres ensayos descritos a continuación. Para cada uno de estos ensayos, se purifican células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de una fuente de leucocitos de un único donante (Cruz Roja Americana, Baltimore, MD) mediante centrifugación a través de un gradientes Histopaque (Sigma). Los monocitos se aíslan a partir de PBMC mediante elutriación centrífuga a contraflujo.
Ensayo de supervivencia de monocitos. Los monocitos de sangre periférica pierden progresivamente la viabilidad cuando están en cultivo en ausencia de suero u otros estímulos. Su muerte es el resultado de un proceso regulado internamente (apoptosis). La adición al cultivo de factores de activación, tales como TNF-alfa, mejora espectacularmente la supervivencia celular y previene la fragmentación del ADN. Se usa la tinción con yoduro de propidio (PI) para medir la apoptosis como sigue. Se cultivan los monocitos durante 48 horas en tubos de polipropileno en medio sin suero (control positivo), en presencia de 100 ng/ml de TNF-alfa (control negativo) y en presencia de concentraciones variables del compuesto que se va a ensayar. Las células se resuspenden a una concentración de 2 x 10^{6}/ml en PBS con PI a una concentración final de 5 \mug/ml, y luego se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos antes del análisis en el FACScan. Se ha demostrado que la captación de PI se correlaciona con la fragmentación de ADN en este modelo experimental.
Efecto sobre la liberación de citocina. Una función importante de los monocitos/macrófagos es su actividad reguladora sobre otras poblaciones celulares del sistema inmunitario a través de la liberación de citocinas tras la estimulación. Se realiza un ELISA para medir la liberación de citocinas como sigue. Se incuban monocitos humanos a una densidad de 5 x 10^{5} células/ml con concentraciones crecientes de un polipéptido de la invención y bajo las mismas condiciones, pero en ausencia del polipéptido. Para la producción de IL-12, las células se ceban una noche con IFN (100 U/ml) en presencia de un polipéptido de la invención. A continuación se añade LPS (10 ng/ml). Se recogen los medios condicionados después de 24 h y se conservan congelados hasta su uso. A continuación, se realiza la medida de TNF-alfa, IL-10, MCP-1 e IL-8, entonces, usando un kit de ELISA disponible en el mercado (por ejemplo, R&D Systems (Minneapolis, MN)) y aplicando los protocolos convencionales proporcionados con el kit.
Explosión oxidativa. Los monocitos purificados se siembran sobre placas de 96 pocillos a 2-1 x 10^{5} células/pocillo. Se añaden concentraciones crecientes de polipéptidos de la invención a los pocillos en un volumen total de 0,2 ml de medio de cultivo (RPMI 1640 + STF al 10%, glutamina y antibióticos). Después de 3 días de incubación, se centrifugan las placas y se retira el medio de los pocillos. Se añaden 0,2 ml por pocillo de solución de rojo fenol (NaCl 140 mM, tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,0, dextrosa 5,5 mM, rojo fenol 0,56 mM y 19 U/ml de HRPO) a las monocapas de macrófagos, junto con el estimulante (PMA 200 nM). Se incubaron las placas a 37ºC durante 2 horas y la reacción se paró añadiendo 20 \mul de NaOH 1 N por pocillo. La absorbancia se lee a 610 nm. Para calcular la cantidad de H_{2}O_{2} producido por los macrófagos, se realizó una curva patrón de una solución de H_{2}O_{2} de molaridad conocida para cada experimento.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 38 Efectos biológicos de los polipéptidos HLRRSI1 de la invención Ensayos de astrocitos y neuronales
En los polipéptidos recombinantes de la invención expresados en Escherichia coli y purificados como se describe anteriormente, se puede analizar la actividad para promover la supervivencia, prolongación axonal o diferenciación fenotípica de células neuronales corticales y para inducir la proliferación de células inmunopositivas para la proteína acídica fibrilar glial, astrocitos. La selección de células corticales para el bioensayo se basa en la expresión predominante de FGF-1 y FGF-2 en estructuras corticales y en la potenciación previamente descrita de la supervivencia de neuronas corticales como resultado del tratamiento con FGF-2. Se puede usar, por ejemplo, un ensayo de incorporación de timidina para dilucidar la actividad de un polipéptido de la invención sobre estas células.
Además, previos informes que describen los efectos biológicos in vitro de FGF-2 (FGF básico) sobre las neuronas corticales o del hipocampo han demostrado aumentos en la supervivencia de neuronas y prolongaciones axonales (Walicke y col., "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3012-3016. (1986), ensayo incorporado en este documento como referencia en su totalidad). Sin embargo, los informes de experimentos hechos en células PC-12 sugieren que estas dos respuestas no son necesariamente sinónimos y pueden depender no sólo de qué FGF se esté analizando, sino también de qué receptor(es) se exprese en la célula diana. Usando el modelo de cultivo neuronal cortical primario, se puede comparar la capacidad de un polipéptido de la invención para inducir prolongaciones axonales con la respuesta conseguida con FGF-2 usando, por ejemplo, un ensayo de incorporación de timidina.
Ensayos de fibroblastos y células endoteliales
Los fibroblastos de pulmón humano se obtienen de Clonetics (San Diego, CA) y se mantienen en medio de crecimiento de Clonetics. Las células endoteliales microvasculares dérmicas se obtienen de Cell Applications (San Diego, CA). Para los ensayos de proliferación, se pueden cultivar los fibroblastos de pulmón humano y células endoteliales microvasculares dérmicas a 5.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos durante un día en medio de cultivo. A continuación se incuban las células durante un día en medio basal BSA al 0,1%. Después de sustituir el medio con medio BSA al 0,1% nuevo, las células se incuban con las proteínas de ensayo durante 3 días. Se añade azul de alamar (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) a cada pocillo a una concentración final del 10%. Las células se incuban durante 4 h. La viabilidad celular se mide mediante la lectura en un lector de fluorescencia CytoFluor. Para los ensayos de PGE-2, los fibroblastos de pulmón humano se cultivan a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de un cambio de medio a medio basal BSA al 0,1%, las células se incuban con FGF-2 o polipéptidos de la invención con o sin IL-1( durante 24 horas. Se recogen los sobrenadantes y se analiza la PGE-2 mediante un kit de EIA (Cayman, Ann Arbor, MI). Para los ensayos de IL-6, los fibroblastos de pulmón humano se cultivan a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de un cambio de medio a medio basal BSA al 0,1%, las células se incuban con FGF-2 o polipéptidos de la invención con o sin IL-1( durante 24 horas. Se recogen los sobrenadantes y se analiza la IL-6 mediante un kit de ELISA (Endogen, Cambridge, MA).
Se cultivan los fibroblastos de pulmón humano con FGF-2 o polipéptidos de la invención durante 3 días en medio basal antes de la adición de azul de alamar para ensayar los efectos sobre el crecimiento de los fibroblastos. FGF-2 debe mostrar una estimulación a 10-2.500 ng/ml, que se puede usar para comprar la estimulación con los polipéptidos de la invención.
Modelos de Parkinson
La pérdida de la función motora en la enfermedad de Parkinson se atribuye a una deficiencia de la dopamina estriada que resulta de la degeneración de las neuronas con proyecciones nigroestriadas. Un modelo animal para la enfermedad de Parkinson que se ha caracterizado extensamente implica la administración sistémica de 1-metil-4-fenil 1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). En el SNC, la MPTP la cogen los astrocitos y se cataboliza por la monoamina oxidasa B a 1-metil-4-fenil piridina (MPP+) y se libera. Posteriormente, MPP+ se acumula activamente en las neuronas dopaminérgicas mediante un transportador de recaptación de alta afinidad para dopamina. MPP+ se concentra entonces en las mitocondrias mediante un gradiente electroquímico e inhibe selectivamente la nicotinamida adenina difosfato:ubiquinona oxidorreduccionasa (complejo I), interfiriendo, por tanto, con el transporte de electrones y generando eventualmente radicales de oxígeno.
Se ha demostrado en modelos de cultivos tisulares que FGF-2 (FGF básico) tiene actividad trófica hacia neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra (Ferrari y col., Dev. Biol. 1989). Recientemente, el grupo del Dr. Unsicker ha demostrado que administrando FGF-2 en implantes de espuma de gel en el cuerpo estriado tiene como resultado la protección casi completa de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra de la toxicidad asociada frente a la exposición a MPTP (Otto y Unsicker, J. Neuroscience, 1990).
Sobre la base de los datos con FGF-2, los polipéptidos de la invención se pueden evaluar para determinar si tienen una acción similar a la de FGF-2 para potenciar la supervivencia de neuronas dopaminérgicas in vitro y también se puede analizar in vivo la protección de neuronas dopaminérgicas en el cuerpo estriado frente al daño asociado con el tratamiento con MPTP. El efecto potencial de un polipéptido de la invención se examina primero in vitro en un modelo de cultivo celular de neuronas dopaminérgicas. Los cultivos se preparan disecando la placa ventral del mesencéfalo de embriones de ratas Wistar de 14 días de gestación. El tejido se diseca con tripsina y se siembra en placas a una densidad de 200.000 células/cm^{2} sobre cubreobjetos de cristal cubiertos de poliortinina-laminina. Las células se mantienen en medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio F12 con suplementos hormonales (NI). Los cultivos se fijaron con paraformaldehido después de 8 días in vitro y se procesaron para la tinción inmunohistoquímica con tirosina hidroxilasa, un marcador específico de neuronas dopaminérgicas. Los cultivos celulares disociados se prepararon a partir de embriones de ratas. El medio de cultivo se cambió cada tres días y los factores también se añaden al mismo tiempo.
Puesto que las neuronas dopaminérgicas se aíslan de animales en el día 14 de gestación, un momento del desarrollo en el que ya se ha pasado el estado en el que las células precursoras dopaminérgicas están proliferando, un aumento en el número de neuronas inmunopositivas para tirosina hidroxilasa representaría un aumento en el número de neuronas dopaminérgicas in vitro. Por tanto, si un polipéptido de la invención actúa para prolongar la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, sugeriría que el polipéptido puede estar implicado en la enfermedad de Parkinson.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 39 El efecto de los polipéptidos HLRRSI1 de la invención sobre el crecimiento de células endoteliales vasculares
El día 1, se siembran en placas células endoteliales de la vena umbilical (HUVEC) a una densidad de 2-5 x 10^{4} células/placa de 35 mm en medio M199 que contiene suero bovino fetal (SBF) al 4%, 16 unidades/ml de heparina y 50 unidades/ml de suplementos de crecimiento de células endoteliales (ECGS, Biotechnique, Inc.). El día 2, el medio se sustituye con M199 con SBF al 10%, 8 unidades/ml de heparina. Se añade un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, y controles positivos, tales como VEGF y FGF básico (bFGF) a concentraciones variables. Los días 4 y 6, se sustituye el medio. En día 8 se determina el número de células con un contador
Coulter.
Un aumento en el número de células HUVEC indica que el polipéptido de la invención puede inducir la proliferación de las células endoteliales vasculares.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 40 El efecto estimulador de los polipéptidos de la invención sobre la proliferación de células endoteliales vasculares
Para evaluar la actividad mitogénica de factores de crecimiento, se realizó el ensayo colorimétrico MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)2H-tetrazolio) con el reactivo de acoplamiento de electrones PMS (metosulfato de fenacina) (CellTiter 96 AQ, Promega). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5.000 células/pocillo) en 0,1 ml de medio suplementado con suero y se les permitió adherirse durante una noche. Después de 12 horas de privación de suero en SBF al 0,5%, se añadieron a los pocillos condiciones (bFGF, VEGF-165 o un polipéptido de la invención en SBF al 0,5%) con o sin heparina (8 U/ml) durante 48 horas. Se añadieron 20 mg de la mezcla de MTS/PMS (1:0,05) por pocillo y se dejó incubar durante 1 hora a 37ºC antes de medir la absorbancia a 490 nm en un lector de placas de ELISA. Se sustrajo la absorbancia de fondo de los pocillos control (medio sin células) y se realizaron siete pocillos en paralelo para cada condición. Véase, Leak y col. in vitro Cell. Dev. Biol. 30A:512-518 (1994).
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 41 Inhibición del efecto estimulador de la proliferación de células de músculo esquelético vascular inducido por PDGF
Se puede medir la proliferación de HAoSMC, por ejemplo, mediante la incorporación de BrdU. Brevemente, se transfectaron células quiescentes subconfluentes crecidas en portaobjetos de 4 cámaras con AT2-3LP marcado con CRP o FITC. A continuación, las células se pulsan con suero de ternera al 10% y 6 mg/ml de BrdU. Después de 24 h, se realizó una inmunohistoquímica usando el kit de tinción con BrdU (Zymed Laboratorios). Brevemente, las células se incuban con el anticuerpo de ratón anti-BrdU biotinilado a 4 grados C durante 2 h después de la exposición a una solución desnaturalizante y a continuación se incuba con estreptavidina-peroxidasa y diaminobencidina. Después de contrastar con hematoxilina, las células se montan para el examen microscópico y se cuentan las células BrdU positivas. El índice de BrdU se calcula como el porcentaje de las células BrdU positivas con respecto al número total de células. Además, se realiza la detección simultánea de la tinción con BrdU (núcleo) y la captación de FITC (citoplasma) en células individuales mediante el uso conjunto de iluminación de campo brillante e iluminación UV fluorescente de campo oscuro. Véase, Hayashida y col., J. Biol. Chem. 6:271 (36):21985-21992 (1996).
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 42 Estimulación de migración endotelial
Este ejemplo se usará para explorar la posibilidad de que un polipéptido de la invención puede estimular la migración de células endoteliales linfáticas.
Los ensayos de migración de células endoteliales se realiza usando una cámara de microquimiotaxis de 48 pocillos (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD; Falk, W. y col., J. Immunological Methods 1980; 33:239-247). Se cubren filtros sin polivinilpirrolidona con un tamaño de poro de 8 um (Nucleopore Corp. Cambridge, MA) con gelatina al 0,1% durante al menos 6 horas a temperatura ambiente y se seca en aire estéril. Las sustancias de ensayo se diluyen a las concentraciones apropiadas en M199 suplementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,25% y se colocan 25 ul de la dilución final en la cámara inferior del aparato de Boyden modificado. Los cultivos de HUVEC o BMEC subconfluentes de pocos pases (2-6) se lavaron y tripsinizaron durante el tiempo mínimo requerido para conseguir que las células se despeguen. Después de colocar el filtro entre la cámara inferior y superior, se siembran 2,5 x 10^{5} células suspendidas en 50 ul de M199 con SBF al 1% en el compartimiento superior. El aparato se incuba a continuación durante 5 horas a 37ºC en una cámara humidificada con CO_{2} al 5% para permitir la migración celular. Después del periodo de incubación, el filtro se retira y las células de la cara superior del filtro que no han migrado se despegan con un raspador de células. Los filtros se fijan con metanol y se tiñen con una solución Giemsa (Diff-Quick, Baxter, McGraw Park, IL). La migración se cuantifica contando las células de tres campos de gran aumento (40x) en cada pocillo y todos los grupos se realizan por cuadruplicado.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 43 Estimulación de la producción de óxido nítrico por células endoteliales
El óxido nítrico liberado por el endotelio vascular se cree que es un mediador de la relajación endotelial vascular. De este modo, la actividad de un polipéptido de la invención se puede ensayar determinando la producción de óxido nítrico por las células endoteliales en respuesta al polipéptido.
El óxido nítrico se mide en placas de 96 pocillos de células endoteliales microvasculares confluentes después de 24 horas de privación de suero y una exposición posterior de 4 horas a diversos niveles de un control positivo (tal como VEGF-1) y al polipéptido de la invención. El óxido nítrico del medio se determina mediante el uso del reactivo de Griess para medir el nitrito total tras la reducción del nitrato derivado del óxido nítrico por la nitrato reductasa. El efecto del polipéptido de la invención sobre la liberación del óxido nítrico se examina en HUVEC.
Brevemente, la liberación de NO de la monocapa de HUVEC en cultivo se mide con un electrodo polarográfico específico de NO conectado a un medidor de NO (Iso-NO, World Precision Instruments Inc.) (1049). La calibración de los elementos de NO se realiza según la siguiente ecuación:
2 KNO_{2} + 2 KI + 2 H_{2}SO_{4} + 2 NO + I_{2} + 2 H_{2}O + 2K_{2}SO_{4}
La curva patrón de calibración se obtiene añadiendo concentraciones graduales de KNO_{2} (0, 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 500 nmol/l) en la solución de calibración que contiene KI y H_{2}SO_{4}. La especificidad del electrodo Iso-NO para NO se determina previamente midiendo el NO a partir del gas NO auténtico (1050). Se elimina el medio de cultivo y las HUVEC se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Se lavan las células en 5 ml de solución de Krebs-Henseleit filtrada en placas de 6 pocillos y las placas de célula se conservan en un incubador de portaobjetos (Lab Line Instruments Inc.) para mantener la temperatura a 37ºC. La sonda sensora de NO se inserta verticalmente dentro de los pocillos, manteniendo la punta del electrodo 2 mm por debajo de la superficie de la solución, antes de la adición de las diferentes condiciones. Se usa S-nitroso acetil penicilamina (SNAP) como control positivo. La cantidad de NO liberado se expresa en picomoles por 1 x 10^{6} células endoteliales. Todos los valores dados son las medias de cuatro a seis medidas en cada grupo (número de pocillos de cultivo celular). Véase, Leak y col. Biochem. y Biophys. Res. Comm. 217:96-105 (1995).
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 44 Efecto de los polipéptidos HLRRSI1 de la invención sobre la formación del cordón en la angiogénesis
Otra etapa en la angiogénesis es la formación del cordón, marcado por la diferenciación de las células endoteliales. Este bioensayo mide la capacidad de las células endoteliales microvasculares para formar estructuras semejantes a capilares (estructuras huecas) cuando se cultivan in vitro.
Las células CADMEC (células endoteliales microvasculares) se adquieren en Cell Applications, Inc. como células en proliferación (pase 2), se cultivan en medio de crecimiento CADMEC de Cell Applications y se usan en el pase 5. Para los ensayos de angiogénesis in vitro, se cubren los pocillos de una placa de cultivo de 48 pocillos con medio de factor de unión de Cell Applications (200 ml/pocillo) durante 30 min a 37ºC. Las células CADMEC se siembran en los pocillos recubiertos a 7.500 células/pocillo y se cultivan durante una noche en medio de crecimiento. El medio de crecimiento se sustituye con 300 mg de medio de formación de cordón de Cell Applications con tampón control o un polipéptido de la invención (0,1 a 100 ng/ml) y las células se cultivan durante 48 h adicionales. Los números y longitudes de los cordones semejantes a capilares se cuantifican a través del uso del analizador de imágenes de vídeo Boeckeler VIA-170. Todos los ensayos se hacen por triplicado.
Se usa VEGF (50 ng/ml) comercial (R&D) como control positivo. Se usa b-estradiol (1 ng/ml) como control negativo. También se usa el tampón apropiado (sin proteína) como control.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 45 Efecto angiogénico sobre la membrana corioalantoidea de pollo
La membrana corioalantoidea de pollo (CAM) es un sistema bien establecido para estudiar la angiogénesis. La formación de vasos sanguíneos en la CAM es fácilmente visible y cuantificable. Se puede examinar la capacidad de los polipéptidos de la invención para estimular la angiogénesis en CAM.
Se incubaron huevos fertilizados de gallina White Leghorn (Gallus gallus) y de codorniz japonesa (Coturnix coturnix) a 37,8ºC y 80% de humedad. Se estudia la CAM diferenciada de embriones de pollo de 16 días y de embriones de codorniz de 13 días con los siguientes procedimientos.
En el día 4 de desarrollo, se hace una ventana en la cáscara de los huevos de pollo. Se comprueba el normal desarrollo de los embriones y se sellan los huevos con celo. Se incuban adicionalmente hasta el día 13. Se cortan cubreobjetos Thermanox (Nunc, Naperville, IL) en discos de aproximadamente 5 mm de diámetro. Se disuelven factores de crecimiento estériles y sin sales en agua destilada y se pipetean sobre los discos aproximadamente 3,3 mg/5 ml. Después de secarlos al aire, se aplican los discos invertidos sobre las CAM. Después de 3 días, las muestras se fijan en glutaraldehído al 3% y formaldehído al 2% y se aclaran en tampón cacodilato sódico 0,12 M. Se fotografían con un microscopio estéreo [Wild M8] y se incluyen para hacer cortes semi y ultradelgados como se describe anteriormente. Los controles se realizan con los discos portadores solos.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 46 Ensayo de angiogénesis usando un implante de matrigel en ratón
El ensayo de angiogénesis in vivo de un polipéptido de la invención mide la capacidad de una red capilar existente para formar nuevos vasos en una cápsula implantada de material de matriz extracelular murino (Matrigel). La proteína se mezcla con el Matrigel líquido a 4ºC y la mezcla se inyecta por vía subcutánea en ratones donde solidifica. Después de 7 días, se retira el "parche" sólido de Matrigel y se examina la presencia de vasos nuevos. El Matrigel se adquiere en Becton Dickinson Labware/Collaborative Biomedical Products.
Cuando está descongelado, el material del Matrigel es líquido a 4ºC. El matrigel se mezcla con un polipéptido de la invención a 150 ng/ml a 4 grados C y se aspira en jeringas frías de 3 ml. Se inyectan Ratones C57Bl/6 hembra de aproximadamente 8 semanas de edad con la mezcla de Matrigel y la proteína en experimentación en 2 sitios en el lado medioventral del abdomen (0,5 ml/sitio). Después de 7 días, los ratones se sacrifican por dislocación cervical, se retiran los parches de Matrigel y se limpian (es decir, se eliminan todas las membranas y tejido fibroso pegados). Se fijan parches completos replicados en formaldehído al 10% tamponado neutro, se incluyen en parafina y se usan para hacer cortes para el examen histológico después de teñir con tricromo de Masson. Se procesan cortes transversales de 3 regiones diferentes de cada parche. La presencia de vWF se analiza en cortes seleccionados teñidos. El control positivo para este ensayo es FGF básico bovino (150 ng/ml). Se usa Matrigel solo para determinar los niveles basales de angiogénesis.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 47 Recuperación de la isquemia en el modelo de extremidades inferiores de conejo
Para estudiar los efectos in vivo de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención sobre la isquemia, se crea un modelo de isquemia de las extremidades traseras de conejo mediante la eliminación quirúrgica de una arteria femoral, como se describe previamente (Takeshita y col., Am J. Pathol 147:1649-1660 (1995)). La escisión de la arteria femoral da lugar a la propagación retrógrada de trombos y la oclusión de la arteria iliaca externa. Por consiguiente, el flujo sanguíneo a la extremidad isquémica depende de los vasos colaterales que se originan a partir de la arteria iliaca interna (Takeshita y col. Am J. Pathol 147:1649-1660 (1995)). Se deja un intervalo de 10 días para la recuperación postoperatoria de los conejos y el desarrollo de vasos colaterales endógenos. Diez días después de la operación (día 0), después de realizar un angiograma basal, la arteria iliaca interna de la extremidad isquémica se transfecta con 500 mg de plásmido de expresión desnudo que contiene un polinucleótido de la invención mediante la tecnología de transferencia génica arterial usando un catéter de balón recubierto con hidrogel, como se describe (Riessen y col. Hum Gene Ther. 4:749-758 (1993); Leclerc y col. J. Clin. Invest. 90:936-944 (1992)). Cuando se usa un polipéptido de la invención en el tratamiento, se administra una única inyección intravenosa rápida de 500 mg de polipéptido de la invención o control en la arteria iliaca interna de la extremidad isquémica por un periodo de 1 min a través de un catéter de infusión. El día 30 se miden diversos parámetros en estos conejos. (a) Relación de PA - La relación de la presión arterial entre la presión sistólica de la extremidad isquémica y la de la extremidad normal; (b) Flujo sanguíneo y flujo inverso - Flujo en reposo: El flujo sanguíneo durante la situación de no dilatación y el flujo máximo: El flujo sanguíneo durante la situación de dilatación completa (también una medida indirecta de la cantidad de vasos sanguíneos) y el flujo inverso se reflejan por la relación de flujo máximo:flujo en reposo; (c) Valoración angiográfica - Esto se mide mediante el angiograma de los vasos colaterales. La puntuación se determina por el porcentaje de círculos en una rejilla superpuesta que se corresponden con la intersección de arterias contrastadas dividido entre el número total m del muslo de conejo; (d) Densidad capilar - El número de capilares colaterales determinados en cortes para microscopía óptica tomado de las extremidades traseras.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 48 Efecto de los polipéptidos de la invención sobre la vasodilatación
Puesto que la dilatación del endotelio vascular es importante en la reducción de la presión arterial, se examina la capacidad de los polipéptidos de la invención para afectar la presión arterial en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Se administran dosis crecientes (0, 10, 30, 100, 300 y 900 mg/kg) de los polipéptidos de la invención a ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de 13-14 semanas de edad. Los datos se expresan como la media +/ ETM. El análisis estadístico se realizó con una prueba t pareada y la significancia estadística se definió como p<0,05 frente a la respuesta al tampón solo.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 49 Modelo de colgajo cutáneo isquémico en rata
Los parámetros de evaluación incluyen el flujo sanguíneo cutáneo, temperatura cutánea y la inmunohistoquímica del factor VIII o la reacción de la fosfatas alcalina endotelial. La expresión de los polipéptidos de la invención, durante la isquemia cutánea, se estudia usando hibridación in situ.
En este modelo, el estudio se divide en tres partes como sigue:
a) Piel isquémica
b) Heridas cutáneas isquémicas
c) Heridas normales
El protocolo experimental incluye:
a) Obtención de un colgajo cutáneo aleatorio de grosor completo de 3x4 cm con un único pedículo (colgajo miocutáneo sobre el lomo inferior del animal).
b) Una herida por escisión (4-6 mm de diámetro) en la piel isquémica (colgajo cutáneo).
c) Tratamiento tópico con un polipéptido de la invención de las heridas por escisión (días 0, 1, 2, 3, 4 tras la herida) a los siguientes intervalos de dosificación: 1 mg a 100 mg.
d) Recogida de los tejidos de la herida los días 3, 5, 7, 10, 14 y 21 después de hacer la herida para los estudios histológicos, inmunohistoquímicos e in situ.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 50 Modelo de enfermedad arterial periférica
La terapia angiogénica usando un polipéptido de la invención es una nueva estrategia terapéutica para conseguir el restablecimiento del flujo sanguíneo alrededor de la isquemia en caso de enfermedades arteriales periféricas.
El protocolo experimental incluye:
a) Se liga un lado de la arteria femoral para provocar la isquemia muscular de la extremidad trasera; el otro lado de la extremidad trasera sirve como control.
b) se administra un polipéptido de la invención, en un intervalo de dosis de 20 mg-500 mg por vía intravenosa y/o intramuscular 3 veces (quizás más) por semana durante 2-3 semanas.
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c) se recoge el tejido muscular isquémico después del ligamiento de la arteria femoral las semanas 1, 2 y 3 para el análisis de la expresión de un polipéptido de la invención e histología. La biopsia también se realiza en el otro lado del músculo normal de la extremidad trasera contralateral.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 51 Modelo de enfermedad miocárdica isquémica
Se evalúa un polipéptido de la invención como un potente mitógeno capaz de estimular el desarrollo de vasos colaterales y reestructuración de nuevos vasos tras la oclusión de la arteria coronaria. La alteración de la expresión del polipéptido de la invención se investiga in situ. El protocolo experimental incluye:
a) Se expone al corazón a través de una toracotomía lateral izquierda en la rata. Inmediatamente, se ocluye la arteria coronaria izquierda con sutura fina (6-0) y se cierra el tórax.
b) Se administra un polipéptido de la invención, en un intervalo de dosis de 20 mg-500 mg por vía intravenosa y/o intramuscular 3 veces (quizás más) por semana durante 2-4 semanas.
c) Treinta días después de la cirugía, se extrae el corazón y se corta transversalmente para los análisis morfométricos e in situ.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 52 Modelo de cicatrización de heridas de la cornea en rata
Este modelo animal muestra el efecto de un polipéptido de la invención sobre la neovascularización. El protocolo experimental incluye:
a) Hacer un incisión larga de 1-1,5 mm desde el centro de la córnea en la capa estromal.
b) Insertar una espátula bajo el borde de la incisión frente a la esquina exterior del ojo.
c) Hacer un bolsillo (su base es de 1-1,5 mm desde el borde del ojo).
d) Colocar un botón, que contenga 50 ng-50 ug de un polipéptido de la invención dentro del bolsillo.
e) El tratamiento con el polipéptido de la invención también se puede aplicar por vía tópica a la herida de la córnea a un intervalo de dosis de 20 mg-500 mg (tratamiento diario durante cinco días).
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 53 Modelos de ratones diabéticos y cicatrización de heridas alterada por glucocorticoides A. Modelo de ratones diabéticos db+/db+
Para demostrar que un polipéptido de la invención acelera el proceso de cicatrización, se usa el modelo de cicatrización de heridas en ratones genéticamente diabéticos. El modelo de cicatrización de heridas de grosor completo en el ratón db+/db+ es un modelo bien caracterizado, clínicamente relevante y reproducible de cicatrización alterada de heridas. La cicatrización de la herida diabética depende de la formación de tejido de granulación y reepitelización antes que de la contracción (Gartner, M.H. y col., J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D. G. y col., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)).
Los animales diabéticos tienen muchos de los rasgos característicos observados en la diabetes mellitas de tipo II. Los ratones homocigotos (db+/db+) son obesos en comparación con los ratones heterocigotos (db+/+m) de la misma camada. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen una única mutación recesiva autonómica en el cromosoma 4 (db+) (Coleman y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982)). Los animales muestran polifagia, polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen la glucosa en sangre elevada, los niveles de insulina incrementados o normales y la inmunidad celular suprimida (Mandel y col., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. y col., Clin. Exp. Immunol. 51(1):1-7 (1983); Leiter y col., Am. J. of Pathol. 114:46-55 (1985)). En estos animales se ha descrito neuropatía periférica, complicaciones miocárdicas y lesiones microvasculares, engrosamiento de la membrana basal y anomalías de la filtración glomerular (Norido, F. y col., Exp. Neurol. 83(2):221-232 (1984); Robertson y col., Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli y col., Lab Invest. 40 (4): 460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Supl):1-6 (1982)). Los ratones diabéticos homocigotos desarrollan una hiperglicemia que es resistente a la insulina análoga a la diabetes de tipo II humana (Mandel y col., J. Immunol. 120:1375-1377 (1978)).
Las características observadas en estos animales sugiere que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la cicatrización observada en la diabetes humana (Greenhalgh y col., Am. J. of Pathol. 136:1235-1246 (1990)).
En este estudio se usan ratones hembra genéticamente diabéticos C57BL/KsJ (db+/db+) y los ratones de la misma camada heterocigotos no diabéticos (db+/+m) (Jackson Laboratories). Los animales se adquirieron con 6 semanas de edad y tenían 8 semanas al inicio del estudio. Los animales se ponían en jaulas individuales y recibieron agua y comida ad libitum. Todas las manipulaciones se realizaron usando técnicas asépticas. Los experimentos se realizan según las reglas y directrices del Comité institucional para el cuidado y uso de animales de la empresa Bristol-Myers Squibb y las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
El protocolo para hacer la herida se realiza según los procedimientos publicados previamente (Tsuboi, R. y Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990)). Brevemente, el día que se hace la herida, los animales se anestesian con una inyección intraperitoneal de Avertin (0,01 mg/ml), 2,2,2-tribromoetanol y 2-metil-2-butanol disuelto en agua destilada. Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con soluciones de etanol al 70% y de yodo. Se seca el área quirúrgica con una gasa estéril antes de hacer la herida. Se crea, entonces, una herida de grosor completo de 8 mm usando un sacabocados para tejido. Inmediatamente después de hacer la herida, la piel circundante se estira suavemente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejan abiertas durante el tiempo que dura el experimento. La aplicación del tratamiento se hace por vía tópica durante 5 días consecutivos comenzando el día que se hace la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la cirugía y posteriormente a intervalos de dos días. El cierre de la herida se determina midiendo diariamente los días 1-5 y el día 8. Las heridas se miden horizontal y verticalmente con un calibrador Jameson. Las heridas se consideran cicatrizadas si el tejido de granulación ya no es visible y la herida está cubierta por un epitelio continuo.
Se administra un polipéptido de la invención a intervalos de dosis diferentes, desde 4 mg a 500 mg por herida por día durante 8 días en vehículo. Los grupos control del vehículo recibieron 50 ml de solución vehículo.
Los animales se sacrificaron el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). Las heridas y la piel circundante se recogen para histología e inmunohistoquímica. Las muestras de tejido se colocan en formol tamponado neutro al 10% en casetes para tejido entre esponjas para biopsia para el procesamiento adicional.
Se evaluaron tres grupos de 10 animales cada uno (5 diabéticos y 5 controles no diabéticos): 1) Control placebo del vehículo, 2) grupo no tratado y 3) grupo tratado.
Se analizan las heridas cerradas midiendo el área en el eje vertical y horizontal y se obtiene el área cuadrada total de la herida. La contracción se estima estableciendo las diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y la de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es de 64 mm^{2}, el tamaño correspondiente al sacabocados dérmico. Los cálculos se hacen usando la fórmula siguiente:
[Área abierta el día 8] - [Área abierta el día 1] / [Área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en formol tamponado al 10% y los bloques incluidos en parafina se cortan perpendiculares a la superficie de la herida (5 mm) usando un microtomo de Reichert-Jung. Se realiza una tinción con hematoxilina-eosina (H&E) de rutina en los cortes transversales de las heridas bisecadas. El examen histológico de las heridas se usa para valorar si el proceso de cicatrización y la apariencia morfológica de la piel reparada se alteran por el tratamiento con un polipéptido de la invención. Esta valoración incluye la verificación de la presencia de acumulación celular, células inflamatorias, capilares, fibroblastos, reepitelización y madurez epidérmica (Greenhalgh, D.G. y col., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). Un observador a ciegas utiliza un micrómetro óptico calibrado.
Los cortes de tejido también se tiñen inmunohistoquímicamente con un anticuerpo policlonal de conejo antiqueratina humana usando el sistema de detección ABC Elite. Se usa piel humana como control de tejido positivo mientras que se usa IgG no inmunitario como control negativo. El crecimiento de queratinocitos se determina evaluando el grado de reepitelización de la herida usando un micrómetro óptico calibrado.
El antígeno nuclear de células en proliferación/ciclina (PCNA) en muestras cutáneas se demuestra usando un anticuerpo anti-PCNA (1:50) con el sistema de detección ABC Elite. Como control positivo de tejido puede servir cáncer de colon humano y como control negativo de tejido puede usarse tejido de cerebro humano. Cada muestra incluye un corte sin el anticuerpo primario que se sustituye por una IgG no inmunitario de ratón. La valoración de estos cortes se basa en el grado de proliferación en una escala de 0-8, reflejando el extremo inferior de la escala una ligera proliferación y el extremo superior una proliferación intensa.
Los datos experimentales se analizan usando una prueba t no pareada. Un valor p <0,05 se considera significativo.
B. Modelo de rata alterado por esteroides
La inhibición de la cicatrización de heridas por esteroides se ha documentado bien en diversos sistemas in vitro e in vivo (Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. En: Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl y col., J. Immunol. 115:476-481 (1975); Werb y col., J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978)). Los glucocorticoides retardan la cicatrización de heridas inhibiendo la angiogénesis, disminuyendo la permeabilidad vascular (Ebert y col., An. Intern. Med. 37:701-705 (1952)), la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno (Beck y col., Growth Factors 5:295-304 (1991); Haynes y col., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978)) y provocando una reducción transitoria de monocitos circulantes (Haynes y col., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, Nueva York, pág. 280-302 (1989)). La administración sistémica de esteroides para alterar la cicatrización de heridas es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck y col., Growth Factors 5:295-304 (1991); Haynes y col., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, Nueva York, pág. 280-302 (1989); Pierce y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2229-2233 (1989)).
Para demostrar que un polipéptido de la invención puede acelerar el proceso de cicatrización, se evalúan los efectos de múltiples aplicaciones tópicas del polipéptido en heridas cutáneas por escisión de grosor completo en ratas cuya cicatrización se ha alterado mediante la administración de metilprednisolona.
En este ejemplo se usan ratas machos Sprague Dawley adultas con un peso de 250-300 g (Charles River Laboratorios). Los animales se adquieren con 8 semanas de edad y tienen 9 semanas al inicio del estudio. La respuesta de las ratas a la cicatrización se altera por la administración sistémica de metilprednisolona (17 mg/kg/rata por vía intramuscular) en el momento de hacer la herida. Los animales se alojan en jaulas individuales y reciben agua y comida ad libitum. Todas las manipulaciones se realizaron usando técnicas asépticas. Este estudio se realizaría según las reglas y directrices de Bristol-Myers Squibb Corporations y de las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Se sigue el protocolo para hacer la herida según la sección A anterior. El día que se hace la herida, los animales se anestesian con una inyección intramuscular de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con una solución de etanol al 70% y yodo. Se seca el área quirúrgica con una gasa estéril antes de hacer la herida. Se crea, entonces, una herida de grosor completo de 8 mm usando un sacabocados para tejido de Keyes. Las heridas se dejan abiertas durante el tiempo que dura el experimento. Las aplicaciones de los materiales de ensayo se hacen por vía tópica una vez al día durante 7 días consecutivos comenzando el día que se hace la herida y después de la administración de metilprednisolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día que se hace la herida y al final del tratamiento. El cierre de la herida se determina midiendo diariamente los días 1-5 y el día 8. Las heridas se miden horizontal y verticalmente con un calibrador Jameson. Las heridas se consideran cicatrizadas si el tejido de granulación ya no es visible y la herida está cubierta por un epitelio continuo.
Se administra el polipéptido de la invención a intervalos de dosis diferentes, desde 4 mg a 500 mg por herida por día durante 8 días en vehículo. Los grupos control del vehículo recibieron 50 ml de la solución vehículo.
Los animales se sacrificaron el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). Las heridas y la piel circundante se recogen para histología. Las muestras de tejido se colocan en formol tamponado neutro al 10% en casetes para tejido entre esponjas para biopsia para el procesamiento adicional.
Se evaluaron cuatro grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 sin glucocorticoides): 1) grupo no tratado, 2) control placebo del vehículo, 3) grupos tratados.
Se analizan las heridas cerradas midiendo el área en el eje vertical y horizontal y se obtiene el área total de la herida. A continuación se estima el cierre de la herida estableciendo las diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y la de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es 64 mm^{2}, el tamaño correspondiente al sacabocados dérmico. Los cálculos se hacen usando la fórmula siguiente:
[Área abierta el día 8] - [Área abierta el día 1] / [Área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en formol tamponado al 10% y los bloques incluidos en parafina se cortan perpendiculares a la superficie de la herida (5 mm) usando un microtomo de Olimpus. Se realiza una tinción con hematoxilina-eosina (H&E) de rutina en los cortes transversales de las heridas bisecadas. El examen histológico de las heridas permite valorar si el proceso de cicatrización y la apariencia morfológica de la piel reparada mejora por el tratamiento con un polipéptido de la invención. Un observador a ciegas usa un micrómetro óptico calibrado para determinar la distancia del hueco de la herida.
Los datos experimentales se analizan usando una prueba t no pareada. Un valor p <0,05 se considera significativo.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 54 Modelo animal de linfedema
El propósito de este enfoque experimental es crear un modelo de linfedema apropiado y reproducible para el análisis de los efectos terapéuticos de un polipéptido de la invención en linfangiogénesis y reestablecimiento del sistema circulatorio linfático en la extremidad trasera de rata. La eficacia se mide por el volumen de tumefacción de la extremidad afectada, cuantificación de la cantidad de vasculatura linfática, proteína plasmática total en sangre e histoafección patológica. Se observa linfedema agudo durante 7-10 días. Quizás lo más importante, el progreso crónico del edema se sigue hasta 3-4 semanas.
Antes de comenzar la cirugía, se toma una muestra de sangre para el análisis de la concentración de proteína. Se administró pentobarbital a ratas machos de un peso aproximado de 350 g. Posteriormente, se les afeita la pata trasera derecha desde la rodilla hasta el muslo. El área afeitada se limpia con una gasa empapada en EtOH al 70%. Se saca sangre para el análisis de la proteína total en suero. Las medidas de circunferencia y volumétricas se hacen antes de inyectar colorante en las patas después de hacer 2 niveles de medida (0,5 cm por encima del talón, en el punto medio del dorso de la pata). Se inyecta el dorso intradérmico tanto de la pata derecha como izquierda con 0,05 ml de azul de Evan al 1%. Las medidas de circunferencia y volumétricas se hacen a continuación tras la inyección de colorante en las patas.
Usando la articulación de la rodilla como punto de referencia, se hace una incisión inguinal en el perímetro medio de la pata permitiendo la localización del vaso femoral. Se usan pinzas y hemostáticos para disecar y separa los colgajos de piel. Tras la localización de los vasos femorales, se localiza el vaso linfático que corre paralelo por debajo del vaso(s). Los vasos linfáticos principales de esta área se ligan con sutura coagulada eléctricamente.
Usando un microscopio, se diseccionan directamente los músculos de la parte posterior de la pata (cerca de los semitendinosos y aductores). A continuación se localizan los ganglios linfáticos poplíteos. A continuación los 2 vasos proximales y los 2 distales y el suministro sanguíneo distal del ganglio poplíteo se ligan mediante sutura. Se retira EL ganglio linfático poplíteo y cualquier tejido adiposo acompañante cortando los tejidos conectivos.
Hay que tener cuidado para controlar cualquier leve hemorragia como resultado de este proceso. Después de ocluir los vasos linfáticos, los colgajos cutáneos se sellan usando piel líquida (Vetbond) (AJ Buck). Los bordes separados de la piel se sellan al tejido muscular subyacente mientras que se deja un hueco de \sim0,5 cm alrededor de la pata. La piel también se puede anclar mediante sutura al músculo subyacente cuando es necesario.
Para evitar una infección, los animales se alojan en jaulas individuales con una malla (sin lecho). Los animales en recuperación se chequean diariamente durante el pico edematoso óptimo, que se produce típicamente los días 5-7. Entonces se observa la meseta del pico edematoso. Para evaluar la intensidad del linfedema, se miden la circunferencia y los volúmenes de 2 placas designadas en cada pata antes de la operación y diariamente durante 7 días. Se determina el efecto de las proteínas plasmáticas sobre el linfedema y, si el análisis proteico es un perímetro de ensayo útil, también se investiga. Se evalúan los pesos tanto de la extremidad control como de la edematosa en 2 sitios. Se realiza un análisis ciego.
Medidas perimétricas: Bajo una breve anestesia con gas para prevenir el movimiento de la extremidad, se usa una cinta de tela para medir el perímetro de la extremidad. Las medidas se hacen en el hueso del tobillo y en el dorso de la pata por 2 personas diferentes y posteriormente se promedian las dos lecturas. Las lecturas se toman tanto de la extremidad control como de la edematosa.
Medidas volumétricas: El día de la cirugía, los animales se anestesian con pentobarbital y se analizan antes de la cirugía. Para las medidas volumétricas diarias, los animales se sometieron a una breve anestesia con halotano (inmovilización rápida y recuperación rápida) se afeitan las patas y se marcan igualmente usando rotuladores resistentes al agua. Se sumergen primero las patas en agua, a continuación se sumergen en el instrumento hasta cada nivel marcado y luego se mide con el programa para edema Buxco (Chen/Victor). Los datos los registra una persona, mientras que la otra sumerge las extremidades hasta el área marcada.
Medidas de la proteína plasmática en sangre: Se extrae la sangre, se centrifuga y se separa el suero antes de la cirugía y posteriormente a la conclusión para la comparación de la proteína plasmática y Ca^{2+}.
Comparación del peso de las extremidades: Después de la extracción de sangre, los animales se preparan para la toma de muestras de tejido. Las extremidades se amputan usando una guillotina; se corta tanto la extremidad experimental como el control en la ligadura y se pesan. Se hace una segunda ponderación cuando la articulación tibio-calcánea se desarticula y se pesa el pie.
Preparaciones histológicas: Se diseca el músculo transversal localizado detrás del área de la rodilla (poplítea) y se coloca en un molde de metal, se rellena con freezeGel, se sumerge en metilbutano frío, se coloca en bolsas de muestra marcadas a -80ºC hasta que se corta. Después de cortarlo, se observan los elementos linfáticos en el músculo al microscopio de fluorescencia.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 55 Supresión de la expresión de moléculas de adhesión inducida por TNF-alfa por un polipéptido de la invención
El reclutamiento de linfocitos en las áreas de inflamación y angiogénesis implica interacciones específicas receptor-ligando entre moléculas de adhesión de la superficie celular (CAM) en los linfocitos y el endotelio vascular. El proceso de adhesión, tanto en un contexto normal como patológico, sigue una cascada de etapas múltiples que implican la expresión de células endoteliales (CE) de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), la molécula de adhesión de células vasculares-1 (VCAM-1) y la molécula de adhesión endotelial de leucocitos (E-selectina). La expresión de estas moléculas y otras en el endotelio vascular determina la eficacia con que los leucocitos se pueden adherir a la vasculatura local y extravasarse en el tejido local durante el desarrollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citocinas y factor de crecimiento participan en la modulación de la expresión de estas CAM.
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), una potente citocina proinflamatoria, es un estimulador de las tres CAM de las células endoteliales y puede estar implicado en una amplia diversidad de respuestas inflamatorias, que a menudo dan lugar a consecuencias patológicas.
Se puede examinar el potencial de un polipéptido de la invención para mediar la supresión de la expresión de CAM inducida por TNF-\alpha. Se emplea un ensayo de ELISA modificado que usa CE como fase sólida absorbente para medir la cantidad de expresión de CAM en CE tratadas con TNF-\alpha cuando se coestimulaban con un miembro de la familia de FGF de proteínas.
Para realizar el experimento, se obtienen cultivos de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) a partir de una mezcla de cordones recogidos y mantenidos en medio de crecimiento (EGM-2; Clonetics, San Diego, CA) suplementado con STF al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% en un incubador humidificado a 37 grados C con 5% de CO_{2}. Las HUVEC se siembran en placas de 96 pocillos a concentraciones de 1 x 10^{4} células/pocillo en medio EGM a 37 grados C durante 18-24 horas o hasta la confluencia. Posteriormente, las monocapas se lavan 3 veces con una solución sin suero de RPMI 1640 suplementado con 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina y se trata con una determinada citocina y/o factor(es) de crecimiento durante 24 h a 37 grados C. Tras la incubación, se evalúa la expresión de CAM en las células.
Se crecen las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en una placa convencional de 96 pocillos hasta la confluencia. Se retira el medio de crecimiento de las células y se sustituye con 90 \mul de medio M199 (SBF al 10%). Las muestras se añaden por triplicado a la placa para analizar y los controles positivo y negativo a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 \mul). Las placas se incubaron a 37 grados C durante 5 h (expresión de selectina e integrina) o durante 24 h (expresión sólo de integrina). Se aspiran las placas para eliminar el medio y se añaden a cada pocillo 100 \mul de paraformaldehido al 1%-PBS (con Ca^{++} y Mg^{++}). Las placas se mantienen a 4ºC durante
30 min.
Se elimina, entonces, el fijador de los pocillos y se lavan una vez con PBS (+Ca y Mg) + BSA al 0,5% y se escurren. No debe permitirse que se sequen los pocillos. Se añaden 10 \mul de anticuerpo primario diluido a los pocillos de ensayo y control. Se usaron anti-ICAM-1-biotina, anti-VCAM-1-biotina y anti-E-selectina-biotina a una concentración de 10 \mug/ml (dilución 1:10 de una solución madre de anticuerpo a 0,1 mg/ml). Las células se incubaron a 37ºC durante 30 min en un ambiente humidificado. Se lavan los pocillos 3 veces con PBS (+Ca y Mg) + BSA al 0,5%.
Luego se añaden 20 \mul de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida (dilución 1:5,000) a cada pocillo y se incuba a 37ºC durante 30 min. Los pocillos se lavan 3 veces con PBS (+ Ca y Mg) + BSA al 0,5%. Se disuelve una comprimido de p-nitrofenol fosfato pNPP en 5 ml de tampón glicina (pH 10,4). Se añaden 100 \mul de sustrato pNPP en tampón glicina a cada pocillo de ensayo. Se preparan los pocillos patrón por triplicado a partir de la dilución de trabajo de la estreptavidina-fosfatasa alcalina en tampón glicina 1:5.000 (100) > 10-0,5 > 10-1 > 10-1,5. Se añaden 5 \mul de cada dilución a pocillos por triplicado y el contenido de FA resultante en cada pocillo es 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng y 0,18 ng. A continuación deben añadirse 100 \mul de reactivo pNPP a cada uno de los pocillos patrón. Las placas se deben incubar a 37ºC durante 4 h. Se añade un volumen de NaOH 3 M a todos los pocillos. Los resultados se cuantifican en un lector de placas a 405 nm. Se usa la opción de sustracción de fondo sobre pocillos blanco llenos con tampón glicina sólo. Se establece la plantilla para indicar la concentración de conjugado-FA en cada pocillo patrón [5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng]. Los resultados se indican como la cantidad de conjugado-FA unido en cada muestra.
Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia génica), agonistas y/o antagonistas de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Ejemplo 56 Procedimiento para crear mutantes de delación N y C-terminales correspondientes al polipéptido HLRRSI1 de la presente invención
Como se describe en este documento, la presente invención abarca la creación de mutantes de deleción N y C-terminales, además de cualquier combinación de deleciones N y C-terminales de los mismos, correspondiente al polipéptido HLRRSI1 de la presente invención. Un experto en la materia dispone de varios procedimientos para crear estos mutantes. Estos procedimientos pueden incluir una combinación de amplificación por PCR y metodología de clonación génica. Aunque un experto en biología molecular, a través del uso de las explicaciones proporcionadas o referenciadas en este documento, y/o por otro lado conocidas en la técnica como procedimientos convencionales, podría crear fácilmente cada mutante de deleción de la presente invención, a continuación se describen procedimientos ilustrativos.
Brevemente, usando el clon de ADNc aislado que codifica la secuencia de longitud completa del polipéptido HLRRSI1 (como se describe en el Ejemplo 12, por ejemplo), Se pueden diseñar cebadores apropiados de aproximadamente 15-25 nucleótidos derivados de las posiciones 5' y 3' deseadas de la ID SEC Nº 1 para amplificar por PCR, y posteriormente clonar, el mutante de deleción N y/o C-terminal deseado. Estos cebadores podrían comprender, por ejemplo, un codon de inicio y parada para el cebador 5' y 3', respectivamente. Estos cebadores también pueden comprender sitios de restricción para facilitar la clonación del mutante de deleción después de la amplificación. Además, los cebadores pueden comprender secuencias adicionales, tales como, por ejemplo, secuencias marcadas con Flag, secuencias Kozac y otras secuencias descritas o referenciadas en este documento.
Por ejemplo, en el caso del mutante de deleción N-terminal D168 a F625, podrían usarse los siguientes cebadores para amplificar un fragmento de ADNc correspondiente a este mutante de deleción.
Cebador 5' 5'-GCAGCA GCGGCCGC GACGGGCCCCGGTTGCAGGGCGACC-3' (ID SEC Nº 29)
\hskip-6,5cmNotI
Cebador 3' 5'-GCAGCA GTCGAC GAAGGTCGAGATGAGTTCCTTGGG-3' (ID SEC Nº <30)
\hskip-6,3cmSalI
Por ejemplo, en el caso del mutante de deleción C-terminal M1 a D551, podrían usarse los siguientes cebadores para amplificar un fragmento de ADNc correspondiente a este mutante de deleción.
Cebador 5' 5'-GCAGCA GCGGCCGC ATGCTGGCCCAGCCGCAGCGGCTGC-3' (ID SEC Nº 31)
\hskip-6,5cmNotI
Cebador 3' 5'-GCAGCA GTCGAC ATCCAGGGTGGTCAGGGCGGGGCTC-3' (ID SEC Nº 32)
\hskip-6,3cmSalI
A continuación se proporcionan condiciones de amplificación por PCR representativas, aunque un experto en la materia apreciaría que pueden ser necesarias otras condiciones para una amplificación eficaz. Puede prepararse una mezcla de reacción de PCR de 100 \mul usando 10 ng del ADN molde (clon de ADNc de HLRRSI1), 200 \muM de los 4 dNTP, 1 \muM de cebadores, 0,25 U de ADN polimerasa Taq (PE) y tampón estándar de ADN polimerasa Taq. Las condiciones típicas de los ciclos de PCR son las siguientes:
20-25 ciclos: 45 s, 93 grados
2 min, 50 grados
2 min, 72 grados
1 ciclo: 10 min, 72 grados
Después de la etapa de extensión final de PCR, se pueden añadir 5 U de fragmento Klenow y se incuba durante 15 min a 30 grados.
Tras la digestión del fragmento con las enzimas de restricción NotI y SalI, se podría clonar el fragmento en un vector de expresión y/o clonación apropiado que se ha digerido de forma similar (por ejemplo, pSport1, entre otros). El experto en la materia apreciará que otros plásmidos podrían sustituirse igualmente y puede ser deseable en ciertas circunstancias. Se ligan, a continuación, el fragmento y vector digeridos usando una ADN ligasa, y luego se usa para transformar células E. coli competentes usando procedimientos proporcionados en este documento y/o por otro lado conocidos en la técnica.
La secuencia del cebador 5' para amplificar cualquier mutante de deleción N-terminal adicional puede determinarse por referencia a la siguiente fórmula:
(S+ (X * 3)) a ((S+ (X * 3)) +25),
donde "S" es igual a la posición del nucleótido inicial del codon de inicio del gen HLRRSI1 (ID SEC Nº 1), y "X" es igual a la mayoría de los aminoácidos N-terminales del mutante de deleción N-terminal deseado. El primer término proporcionaría el nucleótido de la posición 5' inicial del cebador 5', mientras que el segundo término proporcionaría el nucleótido de la posición 3' final del cebador 5' correspondiente a la cadena sentido de la ID SEC Nº 1. Una vez se han determinado las correspondientes posiciones de los nucleótidos del cebador, se puede crear la secuencia nucleotídica final mediante la adición de secuencias de sitios de restricción aplicables al extremo 5' de la secuencia, por ejemplo. Como se referencia en este documento, la adición de otras secuencias al cebador 5' puede ser deseable en ciertas circunstancias (por ejemplo, secuencias Kozac, etc.).
La secuencia del cebador 3' para amplificar cualquier mutante de deleción N-terminal adicional puede determinarse por referencia a la siguiente fórmula:
(S+ (X * 3)) a ((S+ (X * 3))-25),
donde "S" es igual a la posición del nucleótido inicial del codon de inicio del gen HLRRSI1 (ID SEC Nº 1) y "X" es igual a la mayoría de aminoácidos C-terminales del mutante de deleción N-terminal deseado. El primer término proporcionará el nucleótido de la posición 5' inicial del cebador 3', mientras que el segundo término proporcionará el nucleótido de la posición 3' final del cebador 3' correspondiente a la cadena complementaria de la ID SEC Nº 1. Una vez se han determinado las correspondientes posiciones de los nucleótidos del cebador, se puede crear la secuencia de nucleótidos final mediante la adición de secuencias de sitios de restricción aplicables al extremo 5' de la secuencia, por ejemplo. Como se referencia en este documento, la adición de otras secuencias al cebador 3' puede ser deseable en ciertas circunstancias (por ejemplo, secuencias de codon de parada, etc.). El experto apreciará que pueden ser necesarias las modificaciones de las posiciones de nucleótidos anteriores para optimizar la amplificación
por PCR.
Las mismas formulas generales proporcionadas anteriormente se pueden usar en la identificación de secuencias de cebadores 5' y 3' para amplificar cualquier mutante de deleción C-terminal de la presente invención. Además, las mismas formulas generales proporcionadas anteriormente se pueden usar en la identificación de secuencias de cebadores 5' y 3' para amplificar cualquier combinación de mutante de deleción N-terminal y C-terminal de la presente invención. El experto apreciará que pueden ser necesarias las modificaciones de las posiciones de nucleótidos anteriores para optimizar la amplificación por PCR.
Ejemplo 57 Polinucleótidos complementarios
Las moléculas o secuencias de ácido nucleico complementarias, que son complementarias a la secuencia codificadora de la proteína HLRRSI1, o cualquier parte de ella, se usan para disminuir o inhibir la expresión de la HLRRSI1 natural. Aunque se describe el uso de oligonucleótidos complementarios que comprenden aproximadamente 15 a 35 pares de bases, se usa esencialmente el mismo procedimiento con fragmentos de secuencias de ácido nucleico más pequeñas o más grandes. Un oligonucleótido basado en la secuencia codificadora de la proteína HLRRSI1, como se muestra en las Figuras 1A-C o como se muestra en la ID SEC Nº 1, por ejemplo, se usa para inhibir la expresión de la HLRRSI1 natural. Los oligonucleótidos complementarios se diseñan típicamente a partir de la secuencia 5' auténtica y se usa para inhibir la transcripción previniendo la unión del promotor a la secuencia codificadora, o inhibiendo la traducción previniendo la unión del ribosoma a la transcripción que codifica la proteína HLRRSI1, entre otros. Sin embargo, otras regiones pueden ser el objetivo.
Usando una porción apropiada de la secuencia señal y 5' de la ID SEC Nº 1, un oligonucleótido complementario eficaz incluye cualquiera de aproximadamente 15-35 nucleótidos que abarque la región que se traduce en la secuencia señal o 5', entre otras regiones, del polipéptido como se muestra en las Figuras 1A-C (ID SEC Nº 2). Se diseñan oligonucleótidos apropiados usando el programa OLIGO 4.06 y la secuencia codificadora de la proteína HLRRSI1 (ID SEC Nº 1). Los oligonucleótidos preferidos tienen base didesoxi y se proporcionan a continuación. Los oligonucleótidos se sintetizaron usando esencialmente procedimientos químicos como se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.849.902.
\newpage
5
Se ha demostrado que el polipéptido HLRRSI1 está implicado en la regulación de NF-\kappaB y rutas de apoptosis de mamíferos. Someter a las células a una cantidad eficaz de una mezcla de los cinco oligonucleótidos complementarios anteriores tiene como resultado un incremento significativo en la expresión/actividad de I\kappaB\alpha proporcionando evidencias convincentes de que HLRRSI1 regula al menos la actividad y/o expresión de I\kappaB\alpha directa o indirectamente. Además, los resultados sugieren que HLRRSI1 está implicada en la regulación negativa de la actividad y/o expresión de NF-\kappaB/I\kappaB\alpha, directa o indirectamente. A continuación se describe el ensayo usado para I\kappaB\alpha que se basó en el análisis de la actividad I\kappaB\alpha como marcador a favor de corriente para sucesos de transducción de señal
proliferativa.
Transfección de células A549 postquiescentes con oligonucleótidos complementarios Materiales necesarios
\bullet
Células A549 mantenidas en DMEM con alto contenido en glucosa (Gibco-BRL) suplementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina 1X.
\bullet
Opti-MEM (Gibco-BRL)
\bullet
Lipofectamina 2000 (Invitrogen)
\bullet
Oligómeros complementarios (Sequitur)
\bullet
Tubos de poliestireno
\bullet
Placas de cultivo celular tratadas.
Las células quiescentes se preparan como sigue:
Día 0: Se siembran 300.000 células A549 en una frasca de cultivo tisular T75 en 10 ml de medio de A549 y se incuba a 37ºC, 5% de CO_{2} en un incubador humidificado durante 48 horas.
Día 2: Las frascas T75 se mantienen en movimiento para eliminar cualquier célula que haya perdido la adherencia y el medio de crecimiento de A549 se retira y se reemplaza con 10 ml de medio de A549 nuevo. Las células se cultivaron durante seis días sin cambiar el medio para crear una población de células quiescentes.
Día 8: Las células quiescentes se sembraron en placas con formato multipocillo y se transfectaron con oligonucleótidos complementarios.
Las células A549 se transfectaron como sigue:
1. Se tripsiniza la frasca T75 que contiene la población quiescente de células A549.
2. Se cuentan las células y se siembran en placas de 24 pocillos con 60.000 células A549 quiescentes por pocillo.
3. Se deja que las células se adhieran a la placa de cultivo tisular (aproximadamente 4 horas).
4. Se transfectan las células con oligonucleótidos complementario y control como sigue:
a.
Se prepara una solución madre de lipofectamina 2000 10X (10 \mug/ml es 10X) y el lípido diluido se deja reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
La solución madre de lipofectamina 2000 era de 1 mg/ml.
La solución 10X para la transfección era de 10 \mug/ml.
Para preparar la solución 10X, se diluyen 10 \mul de la solución madre de lipofectamina 2000 por 1 ml de Opti-MEM (medio sin suero).
b.
Se prepara una solución madre 10X de cada oligómero para usarla en la transfección.
Las soluciones madre de oligómeros estaban a 100 \muM en HEPES 200 mM, pH 7,5.
La concentración 10X de oligómero estaba a 0,25 \muM.
Para preparar las soluciones 10X, se diluyen 2,5 \mul de oligómero por 1 ml de Opti-MEM.
c.
Se mezclaron bien volúmenes iguales de solución madre 10X de lipofectamina 2000 y de soluciones 10X de oligómeros y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos del oligómero y el lípido. La mezcla resultante era 5X.
d.
Después de 15 minutos de formación de complejos, se añadieron 4 volúmenes de medios de crecimiento completos a los complejos oligómero/lípido (la solución era 1X).
e.
Los medios de las células se aspiraron y se añadieron a cada pocillo 0,5 ml de complejos oligómero/lípido 1X.
f.
Las células se incubaron durante 16-24 horas a 37ºC en un incubador de CO_{2} humidificado.
g.
Se recogieron los sedimentos de células para el aislamiento de ARN y el análisis con TaqMan de los genes marcadores después del extremo 3'.
Reacciones de TaqMan
El análisis cuantitativo por RT-PCR se realizó en preparaciones de ARN total que había sido tratado con ADNasa I o en ARN seleccionado para poliA. El tratamiento con ADNasa se realizó usando procedimientos conocidos en la técnica, aunque usando preferiblemente un kit Qiagen RNeasy para purificar las muestras de ARN, en el que el tratamiento con ADNasa I se realiza en la columna.
Brevemente, se prepara una mezcla estándar de reactivos según la siguiente tabla:
Tratamiento con ADNasa I
Reactivo Por reacción (en \mul)
Tampón 10X 2,5
ADNasa I (1 unidad/ul, a 1 unidad por ug de muestra) 2,0
H_{2}O tratada con DEPC 0,5
Muestra de ARN a 0,1 ug/ul (2-3 ug total) 20,0
Total 25,0
A continuación, se hicieron alícuotas de 5 ul de la mezcla estándar por pocillo de una placa de reacción de PCR de 96 pocillos (PE parte Nº N801-0560). Las muestras de ARN se ajustaron a 0,1 ug/ul con H_{2}O tratada con DEPC (si era necesario) y se añadieron 20 ul a la mezcla patrón alicuotada para un volumen de reacción final de
25 ul.
Los pocillos se cubrieron usando tapas para pocillos en tiras (PE parte Nº N801-0935), colocados en una placa y centrifugados brevemente en una centrífuga para recoger todo el volumen en el fondo de los tubos. En general, una corta centrifugación de hasta 500 rpm en una Sorvall RT es suficiente.
Las placas se incubaron a 37ºC durante 30 min. A continuación, se añade un volumen igual de EDTA 0,1 mM en Tris 10 mM a cada pocillo y se inactiva por calor a 70ºC durante 5 min. Las placas se conservan a -80ºC hasta la conclusión.
Reacción de RT
Se prepara una mezcla estándar de reactivos según la siguiente tabla:
Reacción de RT Reactivo RT Por reacción (en \mul) No RT Por reacción (en \mul)
Tampón RT 10X 5,00 2,500
MgCI_{2} 11,00 5,500
Mezcla de dNTP 10,00 5,000
Hexámero aleatorio 2,50 1,250
Inhibidores de ARNasa 1,25 0,625
Enzima RT 1,25 -
ARN total 500 ng (100 ng no RT) 19,00 máx 10,125 máx
H_{2}O tratada con DEPC - -
Total 50,00 ul 25,000 ul 
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras se ajustaron a una concentración de modo que 500 ng de ARN se añadían a cada reacción RT (100 ng para la no RT). Se puede añadir un máximo de 19 \mul a la mezcla de reacción de RT (10,125 ul para la no RT). Cualquier volumen restante hasta los valores máximos se completan con H_{2}O tratada con DEPC, de modo que el volumen de reacción total era 50 ul (RT) o 25 ul (no RT).
En una placa de reacción de PCR de 96 pocillos (PE parte Nº N801-0560), se alicuotaron 37,5 ul de la mezcla estándar (22,5 ul de la mezcla estándar no RT) y se añadió la muestra de ARN hasta un volumen de reacción total de 50 ul (25 ul, no RT). Las muestras control se cargaron en dos o incluso tres pocillos diferentes para tener suficiente información para la generación de una curva patrón.
Los pocillos se cubrieron usando tapas para pocillos en tiras (PE parte Nº N801-0935), se colocaron en una placa y se centrifugaron brevemente en una centrífuga para recoger todo el volumen en el fondo de los pocillos. En general, una corta centrifugación de hasta 5.000 rpm en una Sorvall RT es suficiente.
Para la reacción de RT-PCR se usó el siguiente perfil de temperaturas:
\bullet
25ºC durante 10 min
\bullet
48ºC durante 30 min
\bullet
95ºC durante 5 min
\bullet
Mantenido a 4ºC (durante 1 hora)
\bullet
Las placas se conservan a -20ºC o menos hasta la conclusión.
Reacción de TaqMan (el molde procede de la placa de RT)
Se prepara una mezcla estándar según la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
Reacción de TaqMan (por pocillo)
Reactivo Por reacción (en \mul)
Mezcla estándar de TaqMan 4,170
Sonda 100 uM (ID SEC Nº 41) 0,025
Cebador sentido 100 uM (ID SEC Nº 39) 0,050
Cebador complementario 100 uM (ID SEC Nº 40) 0,050
Molde -
H_{2}O tratada con DEPC 18,210
Total 22,500 
\newpage
Los cebadores usados para la reacción de RT-PCR son los siguientes:
Cebador y sondas de I\kappaB\alpha:
Cebador sentido: GAGGATGAGGAGAGCTATGACACA (ID SEC Nº 39)
Hibridación entre los restos 558 y 577 con una Tm de 59º.
Cebador complementario: CCCTTTGCACTCATAACGTCAG (ID SEC Nº 40)
Hibridación entre los restos 639 y 619 con una Tm de 60º.
Sonda TaqMan: AAACACACAGTCATCATAGGGCAGCTCGT (ID SEC Nº 41)
Hibridación entre los restos 579 y 600 con una Tm de 68º.
Usando una pipeta de repetición Gilson P-10, se alicuotaron 22,5 ul de la mezcla estándar por pocillo de una placa óptica de 96 pocillos. A continuación, usando la pipeta P-10, se añadieron 2,5 ul de la muestra a los pocillos individuales. En general, las muestras de RT se procesan por triplicado con cada grupo de cebador/sonda usado y las muestras no RT se procesan una vez y sólo con un grupo cebador/sonda, a menudo GADPH (u otro control interno).
Se construye, entonces, la curva patrón y se carga en la placa. La curva tenía cinco puntos más un control sin molde (CSM = H_{2}O tratada con DEPC). La curva se hizo con un punto alto de 50 ng de muestra (dos veces la cantidad de ARN en las muestras desconocidas) y sucesivas muestras de 25, 10, 5 y 1 ng. La curva se hace a partir de una muestra(s) control (véase anteriormente).
Los pocillos se cubrieron usando tapas para pocillos en tiras ópticas (PE parte Nº N801-0935), se colocaron en una placa y se centrifugaron en una centrífuga para recoger todo el volumen en el fondo de los tubos. En general, una corta centrifugación de hasta 5.000 rpm en una Sorvall RT es suficiente.
Las placas se cargaron en un detector de secuencias PE 5700 asegurándose que la placa está correctamente alineada con la muesca en la esquina superior derecha. Se ajusta la tapa y se procesa usando el 5700 y el programa de cuantificación 5700 y la sonda SYBR usando el siguiente perfil de temperaturas:
\bullet
50ºC durante 2 min
\bullet
95ºC durante 10 min
\bullet
y las siguientes durante 40 ciclos:
\bullet
95ºC durante 15 s
\bullet
60ºC durante 1 min
\bullet
Cambio del volumen de reacción a 25 ul.
Una vez concluida la reacción, se ajustó un umbral manual de aproximadamente 0,1 para minimizar la señal de fondo. Se puede encontrar información adicional relativa al funcionamiento del aparato GeneAmp 5700 en referencia a los siguientes manuales: "GeneAmp 5700 Sequence Detection System Operator Training CD" y "User's Manual for 5700 Sequence DetectionSystem"; disponibles en Perkin-Elmer.
Es claro que la invención puede ser realizada de otra manera a la descrita particularmente en la descripción y ejemplos precedentes. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en vista de la explicaciones anteriores y, por tanto, están dentro del alcance se las reivindicaciones adjuntas.
<110> Bristol-Myers Squibb Company
\vskip0.400000\baselineskip
<120> UNA NUEVA PROTEÍNA HUMANA QUE CONTIENE REPETICIONES RICAS EN LEUCINA EXPRESADA PREDOMINANTEMENTE EN EL INTESTINO DELGADO, HLRRSI1
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D0066PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/257.774
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 22-12-200
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2689
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75) . . (1949)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
6
7
8
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 625
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
10
11
12
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
14
15
16
17
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1033
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2763
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
23
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2054
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc-característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (198) . . (229)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> donde "n" es igual a A, C, G o T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ala Arg Val Leu Gly Gly Leu Leu Ser Lys Ala Leu Leu Pro Thr}
\sac{Ala Leu Leu Leu Val Thr Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Phe Ala Leu Cys Phe Val Pro Phe Val Cys Trp Ile Val Cys Thr}
\sac{Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Tyr Leu Leu Phe Ile Thr Ser Val Leu Ser Ser Ala Pro Val}
\sac{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catggtttca gagcgtgtga a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtacaggc agtacagcaa ctc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Phe Val Lys Glu Asn Glu Thr Leu Phe Ala Leu Cys Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Phe Arg Asp Glu Arg Arg Ala Glu Arg Ala Tyr Arg Phe Val Lys}
\sac{Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Leu Leu Val Thr Thr Arg Ala Ala Ala Pro Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Arg Gly Phe Ser Asp Lys Asp Lys Lys Lys Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Leu Ser Arg Thr Ser Lys Thr Thr Thr Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Leu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Leu Pro Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Leu Val Leu Thr Thr Arg Phe Leu Phe Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Cys Met Val Ser Glu Arg Val Lys Gln Glu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211>13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Arg Leu Ile Ser Cys Arg Leu Val Ala Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Ser Gln Gly Thr Thr Lys Gln Leu Pro Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Cys Arg Val Gln Thr Val Arg Val Gln Leu Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
33
34
35
36
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> bacteriófago T7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 733
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcagcgg ccgcgacggg ccccggttgc agggcgacc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcagtcg acagaaggtc gagatgagtt ccttggg 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcagcgg ccgcatgctg gcccagccgc agcggctgc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcagtcg acatccaggg tggtcagggc ggggctc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctctcatcc cggaagaacu uguag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcctcctgc uucacacgcu cugaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aactcctgga agcucugguc gauga 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgcactu uggagccacg aagct 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctccttca cgaagcggua ggcgc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggatgagg agagctatga caca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 39
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccctttgcac tcataacgtc ag 
\hfill
22 
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<210> 40
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 40
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\hskip-.1em\dddseqskip
aaacacacag tcatcatagg gcagctcgt 
\hfill
29

Claims (12)

1. Una molécula de ácido nucleico constituido por una secuencia polinucleotídica seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) un polinucleótido constituido por los nucleótidos 78 a 1949 de la ID SEC nº 1;
(b) un polinucleótido constituido por los nucleótidos 75 a 1949 de la ID SEC Nº 1;
(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 2 a 625 de la ID SEC Nº 2;
(d) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los aminoácidos 1 a 625 de la ID SEC Nº 2;
(e) un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 como se codifica por el clon de ADNc contenido en el depósito de la ATCC Nº PTA-2679;
(f) un polinucleótido que codifica el polipéptido HLRRSI1 como se codifica por el clon de ADNc contenido en el depósito de la ATCC Nº PTA-2674;
y la cadena complementaria del mismo.
2. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
3. Una célula hospedadora recombinante que comprende la secuencia del vector de la reivindicación 2.
4. Un polipéptido codificado por los polinucleótidos de la reivindicación 1.
5. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 4.
6. Una célula hospedadora recombinante que expresa el polipéptido de la reivindicación 4.
7. Un procedimiento para hacer un polipéptido que comprende:
(a) cultivar la célula hospedadora recombinante de la reivindicación 6 en condiciones tales que se exprese dicho polipéptido; y
(b) recuperar dicho polipéptido.
8. Composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleido de la reivindicación 1, el polipéptido de la reivindicación 4 o el anticuerpo de la reivindicación 5.
9. Uso del polipéptido de la reivindicación 4 o del polinucleótido de la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica que disminuya el nivel de expresión del inhibidor del factor nuclear Kappa B alfa (I\kappaB\alpha) en una célula en la cual se expresa dicha proteína.
10. Un procedimiento in vitro para diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica en un sujeto que comprende:
(a) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de la reivindicación 1; y
(b) diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica sobre la base de la presencia o ausencia de dicha mutación.
11. Un procedimiento in vitro para diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica en un sujeto que comprende:
(a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de la reivindicación 5 en una muestra biológica; y
(b) diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica sobre la base de la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.
12. Un procedimiento para hacer secuencias polinucleotídicas que codifican un producto génico que tiene la actividad de unión a caspasas alterada que comprende,
(a) mezclar de forma aleatoria una secuencia nucleotídica de la reivindicación 1;
(b) expresar las secuencias de nucleótidos mezclada de forma aleatoria resultantes y
(c) seleccionar para la actividad de unión a caspasas alterada en comparación con la actividad fosfatasa del producto génico de dicha secuencia nucleotídica modificada.
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