ES2264642B1 - METHOD AND DETECTION KIT OF BACTERIAL SPECIES THROUGH DNA ANALYSIS. - Google Patents

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Abstract

Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de ADN. La presente invención se refiere a la detección e identificación de diferentes especies bacterianas por PCR múltiple. Más concretamente, el método proporciona los cebadores, las sondas, las regiones génicas o regiones intergénicas necesarias para llevar a cabo la detección simultánea de especies bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los géneros Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella por PCR múltiple.Method and kit for detecting bacterial species by DNA analysis. The present invention relates to the detection and identification of different bacterial species by multiple PCR. More specifically, the method provides the primers, probes, gene regions or intergenic regions necessary to carry out the simultaneous detection of bacterial species and bacterial groups belonging to the genera Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia and Francisella by Multiple PCR

Description

Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de ADN.Method and species detection kit bacterial by DNA analysis.

La presente invención se refiere a la detección e identificación de diferentes especies bacterianas, todas ellas causantes de zoonosis, basada en el análisis de ADN. Más concretamente, la invención proporciona un método y un kit para la detección simultánea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los géneros Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella mediante la amplificación de ADN.The present invention relates to the detection and identification of different bacterial species, all of which cause zoonosis, based on DNA analysis. More specifically, the invention provides a method and kit for the simultaneous detection of bacteria and bacterial groups belonging to the genera Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia and Francisella by means of DNA amplification.

Estado de la técnicaState of the art

Actualmente hay descritas unas 200 enfermedades zoonóticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme...) que el hombre puede padecer. En los países en vías de desarrollo, son una importante causa de mortandad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades.There are currently about 200 diseases described zoonotics (bartonellosis, leptospirosis, Lyme borreliosis ...) that Man can suffer. In developing countries, they are a major cause of death and involve large losses economic. The coexistence with animals, the absence of health infrastructure and low cultural level continue being the main allies of these diseases.

Determinadas zoonosis tienden a difundirse en países desarrollados como consecuencia del aumento de la población en zonas urbanas y periurbanas, así como del aumento del tráfico de animales a nivel internacional, que conlleva el riesgo de introducir enfermedades exóticas en nuestro entorno.Certain zoonoses tend to spread in developed countries as a result of population increase in urban and peri-urban areas, as well as increased traffic in animals internationally, which carries the risk of introduce exotic diseases in our environment.

Estas circunstancias unidas al hecho frecuente del hallazgo de artrópodos infectados por más de uno de los patógenos incluidos en esta invención, da lugar a que la transmisión de más de una de las especies bacterianas, objeto de identificación por la presente invención a un mismo paciente por la misma picadura, sea un suceso habitual.These circumstances together with the frequent fact of the finding of arthropods infected by more than one of the pathogens included in this invention, results in the transmission of more than one of the bacterial species, object of identification by the present invention to the same patient by the same sting, be a habitual event.

Así pues, cada vez son más comunes las hospitalizaciones debidas a cuadros clínicos producidos por el contacto del hombre con animales o con diferentes clases de artrópodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, ácaros, etc., los cuales actúan como vectores o como reservorios de patógenos. Dichos cuadros clínicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificación rápida y fiable del agente causante de la patología, por lo que un tratamiento especifico y rápido no es posible, y en ocasiones llega demasiado tarde. Esto justifica, sin dejar lugar a dudas, la necesidad de un método integrado de detección.Thus, the increasingly common are hospitalizations due to clinical pictures produced by the contact of man with animals or with different kinds of arthropods, such as mosquitoes, ticks, fleas, lice, mites, etc., which act as vectors or as reservoirs of pathogens These clinical pictures, due to their great similarity, do not allow rapid and reliable identification of the causative agent of the pathology, so a specific and rapid treatment is not possible, and sometimes it is too late. This justifies, without leave room for doubt, the need for an integrated method of detection.

Los métodos diagnósticos disponibles actualmente se limitan a la detección de anticuerpos que, por lo general, es retrospectiva y de escasa ayuda en el tratamiento de los pacientes en su fase aguda. El cultivo no es considerado un método diagnóstico, tanto por su dificultad tecnológica, que lo excluye de las prácticas habituales en un laboratorio de microbiología de hospital, como por la necesidad de instalaciones P3.The diagnostic methods currently available are limited to the detection of antibodies that, in general, is retrospective and of little help in the treatment of patients in its acute phase. Cultivation is not considered a method. diagnosis, both for its technological difficulty, which excludes it from the usual practices in a microbiology laboratory of hospital, as per the need for P3 facilities.

El diagnóstico molecular por amplificación de genoma mediante PCR supone una opción diagnóstica de gran valor. Sin embargo, no siempre se dispone de suficiente cantidad de muestra clínica como para ensayarla frente a una amplia batería de patógenos o no se dispone de la metodología necesaria para realizar diferentes ensayos.The molecular diagnosis by amplification of Genome by PCR is a valuable diagnostic option. However, there is not always enough of clinical sample to be tested against a large battery of pathogens or the necessary methodology to perform Different essays

Recientemente se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. et al. 2005. Oligo-based detection of tick-borne bacteria. FEMS Microbiology Letters 243:273-8), que describe un método para la detección de 5 de los 6 patógenos propuestos por la presente invención. Dicho método está basado en el análisis de ADN ribosomal y emplea cebadores universales, que amplifican material genético tanto de bacterias diana como de otras que no los son por lo que su sensibilidad es bastante reducida.Recently a work has been published (Blaskovic D. et al. 2005. Oligo-based detection of tick-borne bacteria. FEMS Microbiology Letters 243: 273-8), which describes a method for detection of 5 of the 6 pathogens proposed by the present invention. Saying method is based on ribosomal DNA analysis and employs universal primers, which amplify both genetic material of target bacteria like others that are not so its Sensitivity is quite reduced.

Otros métodos como el descrito por las patentes americanas US 6,300,072 y 6,518,020 son capaces de detectar e identificar bacterias del género Bartonella, mediante el empleo de la misma región de ADN (espacio intergénico 16S-23S) empleada por la presente invención. Sin embargo, el número de especies dentro de este género ha aumentado sensiblemente desde el registro de dichas patentes y su aproximación, que consiste en una discriminación entre especies según el tamaño del amplicón obtenido en una PCR, no es útil para determinadas especies del género actualmente conocidas que comparten un tamaño similar del fragmento amplificado.Other methods such as that described by US patents 6,300,072 and 6,518,020 are capable of detecting and identifying bacteria of the Bartonella genus, by using the same region of DNA (16S-23S intergenic space) employed by the present invention. However, the number of species within this genus has increased significantly since the registration of said patents and their approximation, which consists of a discrimination between species according to the size of the amplicon obtained in a PCR, is not useful for certain species of the genus currently known that share a similar size of the amplified fragment.

El método aportado por la presente invención propone también el empleo de la región intergénica 16S-23S para la detección de especies pertenecientes al género Bartonella, aunque se aplican mejoras respecto de procedimientos descritos, puesto que es capaz de detectar un grupo mucho más amplio de especies del mismo y otros géneros, utilizando sondas y cebadores completamente novedosos y con niveles de sensibilidad máximos.The method provided by the present invention also proposes the use of the intergenic region 16S-23S for the detection of species belonging to the genus Bartonella , although improvements are made with respect to the described procedures, since it is capable of detecting a much broader group of species of the same and other genera, using completely new probes and primers and with maximum sensitivity levels.

Para la detección de Coxiella burnetii, la presente invención emplea los mismos cebadores y la misma región de ADN (secuencia de inserción IS1111) que métodos anteriormente descritos. Como mejora, dicha detección es ahora combinada con otra serie de pruebas completamente novedosas para la identificación de otras especies bacterianas, que pueden ser transmitidas por los mismos vectores, y además aporta una nueva sonda de hibridación para la detección de Coxiella burnetii.For the detection of Coxiella burnetii , the present invention employs the same primers and the same region of DNA (insertion sequence IS1111) as previously described methods. As an improvement, said detection is now combined with another series of completely new tests for the identification of other bacterial species, which can be transmitted by the same vectors, and also provides a new hybridization probe for the detection of Coxiella burnetii .

Descripción de la invenciónDescription of the invention

Definiciones: PCR Múltiple o PCR Multiplex: la PCR es un sistema de amplificación o aumento en el número de copias de una secuencia de nucleótidos concreta de un organismo, mediante el uso de dos cebadores. La PCR múltiple o PCR multiplex es una variante de la PCR, que permite la amplificación simultanea de mas de una secuencia diana empleando mas de un par de cebadores.Definitions: Multiple PCR or Multiplex PCR: the PCR is a system of amplification or increase in the number of copies of a specific nucleotide sequence of an organism, by the use of two primers. Multiple PCR or multiplex PCR is a variant of the PCR, which allows simultaneous amplification of more of a target sequence using more than one pair of primers.

La presente invención consigue resolver el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado número de bacterias, que causan zoonosis que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit de detección para la identificación simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los géneros: Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella.The present invention manages to solve the problem of how tedious and complicated it is to detect a high number of bacteria, which cause zoonoses that can be clinically and / or epidemiologically indistinguishable, by developing a method and a detection Kit for the simultaneous identification of Bacterial species causing zoonoses belonging to the genera: Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia and Francisella .

La solución encontrada por la presente invención consiste en analizar diferentes regiones del ADN bacteriano simultáneamente para determinar en cada caso que especies se encuentran presentes. En concreto se analiza el gen 16S rRNA para la identificación de Anaplasma, Ehrlichia y Borrelia; el espacio intergénico 23S-5S rRNA para Rickettsia; el gen que codifica para el precursor de la proteína principal de membrana TUL4 para Francisella; el gen de la transposasa IS1111 para Coxiella y el espacio intergénico 16S-23S para Bartonella.The solution found by the present invention consists in analyzing different regions of the bacterial DNA simultaneously to determine in each case what species are present. Specifically, the 16S rRNA gene is analyzed for the identification of Anaplasma, Ehrlichia and Borrelia ; the 23S-5S rRNA intergenic space for Rickettsia ; the gene that codes for the precursor of the main TUL4 membrane protein for Francisella ; the transposase gene IS1111 for Coxiella and the intergenic space 16S-23S for Bartonella .

De acuerdo con lo mencionado, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para la detección de bacterias a partir de una muestra, que comprende los siguientes pasos:As mentioned, a first aspect of the invention relates to a method for the detection of bacteria from a sample, comprising the following Steps:

i)i)
poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene cebadores específicos para la realización de PCR Multiplex.put on contact the sample to be analyzed with a reaction mixture, which Contains specific primers for PCR Multiplex

ii)ii)
amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa.amplify by chain reaction of polymerase.

iii)iii)
Identificar la formación de los productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.Identify the formation of products of the previous step, said formation being indicative of the presence or absence of bacteria causing zoonosis

En relación con este primer aspecto de la invención, ésta proporciona un método para detectar simultáneamente:In relation to this first aspect of the invention, this provides a method to detect simultaneously:

\bullet?
Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. marginale, A. centrale y A. ovis. Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. marginale, A. centrale and A. ovis .

\bullet?
Ehrlichia chaffeensis y E. ewingii Ehrlichia chaffeensis and E. ewingii

\bullet?
Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subespecie berkhofii, B. vinsonii subespecie vinsonii, B. vinsonii subespecie aurupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B. doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori y B. tribocorum. Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subspecies berkhofii, B. vinsonii subspecies vinsonii, B. vinsonii subspecies aurupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B Doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori and B. tribocorum .

\bullet?
Todas las especies del género Borrelia.All species of the Borrelia genus.

\bullet?
Coxiella burnetii. Coxiella burnetii.

\bullet?
Cualquier subespecie de Francisella turalensis, incluyendo F. tularensis subesp. tularensis, F. tularensis subesp. holarctica y F. tularensis subesp. novicida, que se detectan conjuntamente, y la variante 3523 de la misma especie y los denominados endosimbiontes de diferentes especies de ixódidos y argásidos, que se detectan diferencialmente.Any subspecies of Francisella turalensis , including F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica and F. tularensis subsp. novicide, which are detected together, and variant 3523 of the same species and the so-called endosymbionts of different species of ixodids and archaeids, which are detected differentially.

\bullet?
El género Rickettsia, el grupo de las mismas causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tifus, las especies Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibirica, R. helvetica, R. felis, R. australis, R. prowazekii, y R. typhy (R. mooserii).The genus Rickettsia , the group of the same causes of spotted fevers and the group that causes typhus, the species Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibirica, R. helvetica, R. felis, R. australis, R. prowazekii, and R. typhy (R. mooserii) .

todas ellas capaces de provocar zoonosis, infectar conjuntamente a un individuo y difíciles de identificar por la observación de los cuadros clínicos, mediante la amplificación y análisis de genes o regiones génicas concretas presentadas en las tablas 1-6.all of them capable of provoking zoonosis, jointly infect an individual and difficult to identify by observing the clinical pictures, by means of amplification and analysis of genes or specific gene regions presented in the tables 1-6.

En una realización particular de este primer aspecto de la invención, se amplifican fragmentos de ADN incluidos o comprendidos en las secuencias cuyos números de acceso se muestran en las siguientes tablas 1-6.In a particular embodiment of this first aspect of the invention, included DNA fragments are amplified or included in the sequences whose access numbers are shown in the following tables 1-6.

En una realización más particular de este primer aspecto de la invención, las regiones amplificadas tienen un tamaño de entre 99 y 686 nucleótidos y contienen regiones variables empleadas para la identificación. En una realización aun más preferida de la invención, las regiones variables contienen o están incluidas en las SEQ ID NO:55 a SEQ ID NO:93 o secuencias complementarias, cuyas posiciones se muestran en las tablas de 1 a 6.In a more particular embodiment of this first aspect of the invention, the amplified regions have a size between 99 and 686 nucleotides and contain variable regions used for identification. In an even more realization preferred of the invention, the variable regions contain or are included in SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 93 or sequences complementary, whose positions are shown in tables 1 to 6.

En otra realización de este primer aspecto de la invención, los productos de amplificación, que permiten identificar los diferentes especies y grupos bacterianos son detectados mediante el empleo de sondas. En una realización más preferida, estas sondas tienen una longitud de entre 15 y 25 nucleótidos. Y en una realización aun más preferida, las sondas tienen secuencias que comprenden o están incluidas en las secuencias SEQ ID NO:3-6; SEQ ID NO:9-24; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:33-35; SEQ ID NO:38-51; o secuencias complementarias (Tablas 1-6).In another embodiment of this first aspect of the invention, amplification products, which allow identification the different species and bacterial groups are detected by using probes. In a more preferred embodiment, These probes are between 15 and 25 nucleotides in length. And in an even more preferred embodiment, the probes have sequences that comprise or are included in the SEQ ID sequences NO: 3-6; SEQ ID NO: 9-24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33-35; SEQ ID NO: 38-51; or complementary sequences (Tables 1-6).

Los cebadores pueden ser diseñados mediante alineamiento múltiple con programas como CLUSTAL X, que permiten la identificación de regiones muy conservadas que sirven de molde. En otra realización particular de este primer aspecto de la invención los cebadores hibridan los genes indicados en las siguientes tablas de 1 a 6 y especialmente con secuencias cuyo número de acceso se muestra en las siguientes tablas 1-6. En una realización aun más particular los cebadores tienen secuencias que comprenden o están incluidas en las SEQ ID NO:1-2; SEQ ID NO:7-8; SEQ ID NO:25-26; SEQ ID NO:28-29; SEQ ID NO:31-32; SEQ ID NO:36-37; o secuencias complementarias.The primers can be designed by multiple alignment with programs such as CLUSTAL X, which allow Identification of highly conserved regions that serve as a template. In another particular embodiment of this first aspect of the invention the primers hybridize the genes indicated in the following tables from 1 to 6 and especially with sequences whose access number is shown in the following tables 1-6. In a even more particular embodiment the primers have sequences that comprise or are included in SEQ ID NO: 1-2; SEQ ID NO: 7-8; SEQ ID NO: 25-26; I KNOW THAT ID NO: 28-29; SEQ ID NO: 31-32; SEQ ID NO: 36-37; or complementary sequences.

Breve explicación de las tablas:Brief explanation of the tables:

\ding{226}\ ding {226}
En la columna 1 (organismo) se indica la especie o grupo de especies bacterianas que es detectado en cada caso.In column 1 (organism) indicates the species or group of bacterial species that is detected in each case.

\ding{226}\ ding {226}
En la columna 2 (gen) se indica el gen o región del genoma que es empleado para la detección de la especie o grupo de especies bacterianas de la columna 1.In column 2 (gene) you indicates the gene or region of the genome that is used for detection of the species or group of bacterial species in the column one.

\ding{226}\ ding {226}
En la columna 3 (cebador) se indica la secuencia del par de cebadores necesario para llevar a cabo la amplificación de regiones variables del gen o región genómica indicada en cada tabla (columna 2).In column 3 (primer) it indicates the sequence of the pair of primers necessary to carry perform amplification of variable regions of the gene or region genomic indicated in each table (column 2).

\ding{226}\ ding {226}
En la columna 4 (sonda) se indica la secuencia de las sondas que son empleadas para la detección de las la especie o grupo de especies bacterianas referidas en la columna 1 de cada tabla.In column 4 (probe) you indicates the sequence of the probes that are used for the detection of the species or group of bacterial species referred to in column 1 of each table.

\ding{226}\ ding {226}
En la columna 5 (secuencia 5'-3') se indican las referencias de las secuencias de las regiones variables que son amplificadas para llevar a cabo la detección de cada la especie o grupo de especies bacterianas.In column 5 (sequence 5'-3 ') sequence references are indicated of the variable regions that are amplified to carry out the detection of each species or group of species bacterial

\ding{226}\ ding {226}
En la columna 6 (posición 5'-3'):In column 6 (position 5'-3 '):

\circ\ circ
En la primera fila: se indica un código de secuencia referente a una región del gen o región genómica referido en la columna 2, así como la posición concreta de dicha secuencia en donde hibrida el cebador (columna 3).In the first row: a sequence code referring to a region of the gene or region genomics referred to in column 2, as well as the specific position of said sequence in which the primer hybridizes (column 3).

\circ\ circ
Desde la fila 2 hasta la última de cada tabla, se indica un código de secuencia referente a un gen o región genómica referido en la columna 2, así como la posición concreta de dicha secuencia a la que se une la sonda (columna 4).From row 2 to the last of Each table indicates a sequence code referring to a gene or genomic region referred to in column 2, as well as position concrete of said sequence to which the probe is attached (column 4). 

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

1one

22

33

55

77

88

Dada la gran abundancia de inhibidores de PCR, tales como los ácidos húmico y fúlvico, metales pesados, heparina, etc. que pueden dar lugar a falsos negativos, y aunque existen métodos que reducen la concentración este tipo de moléculas, es recomendable (cf. J. Hoorfar et al., "Making internal Ampllification control mandaory for diagnostic PCR" J. of Clinical Microbiology, Dec. 2003, pp.5835) que las pruebas de PCR contengan un Control Interno de Amplificación (CIA). Este CIA no es más que un fragmento de ADN, que se amplifica simultáneamente con la muestra diana, de tal modo que su ausencia al final de las pruebas es indicativa de la presencia de factores, que han provocado un indeseado desarrollo de la PCR.Given the abundance of PCR inhibitors, such as humic and fulvic acids, heavy metals, heparin, etc. which can lead to false negatives, and although there are methods that reduce the concentration of this type of molecules, it is recommended (cf. J. Hoorfar et al. , "Making internal Ampllification control mandaory for diagnostic PCR" J. of Clinical Microbiology, Dec 2003, pp. 5835) that the PCR tests contain an Internal Amplification Control (CIA). This CIA is nothing more than a DNA fragment, which is amplified simultaneously with the target sample, so that its absence at the end of the tests is indicative of the presence of factors, which have caused an undesired development of the PCR.

Un segundo aspecto de la invención se relaciona con un método similar al descrito en el primer aspecto de la misma, incluyendo al menos un CIA, preferentemente constituido por una secuencia de ADN del gen de la Tetrahidrocannabinólico Sintasa de la especie Cannabis sativa y más preferentemente con la secuencia con número de acceso AB183705.A second aspect of the invention relates to a method similar to that described in the first aspect thereof, including at least one CIA, preferably constituted by a DNA sequence of the Tetrahydrocannabinolic Syntase gene of the Cannabis sativa species and more preferably with the sequence with access number AB183705.

En una realización más preferida se amplifica una región de la secuencia AB183705 cuya secuencia comprende o está incluida en la SEQ ID NO 94 o secuencias complementarias (Tabla 7).In a more preferred embodiment it is amplified a region of sequence AB183705 whose sequence comprises or is included in SEQ ID NO 94 or complementary sequences (Table 7).

En una realización también preferida, la amplificación de la región se lleva a cabo mediante cebadores específicos cuyas secuencias comprenden o están incluidas en las SEQ ID NO 52 y SEQ ID NO 53 o secuencias complementarias.In a also preferred embodiment, the amplification of the region is carried out by primers specific whose sequences comprise or are included in the SEQ ID NO 52 and SEQ ID NO 53 or complementary sequences.

A lo largo de la descripción, el termino "específicos" implica que los cebadores comprenden una secuencia nucleotídica totalmente complementaria a los genes o fragmentos génicos empleados por la presente invención.Throughout the description, the term " specific " implies that the primers comprise a nucleotide sequence completely complementary to the genes or gene fragments employed by the present invention.

Los términos "regiones variables" hacen referencia a secuencias de ADN a que permiten la identificación de las especies y grupos bacterianos, que son identificados por la presente invención.The terms " variable regions " refer to DNA sequences that allow the identification of bacterial species and groups, which are identified by the present invention.

99

En otra realización del segundo aspecto de la invención, la detección de la amplificación del CIA se realiza mediante hibridación con sondas. En una realización más preferida, estas sondas tienen una longitud de entre 15 y nucleótidos. Y en una realización aun más preferida, las sondas tienen una secuencia que comprenden o están incluidas en la SEQ ID NO 54 o secuencias complementarias.In another embodiment of the second aspect of the invention, the detection of the amplification of the CIA is performed by hybridization with probes. In a more preferred embodiment, These probes have a length of between 15 and nucleotides. And in an even more preferred embodiment, the probes have a sequence that comprise or are included in SEQ ID NO 54 or sequences complementary.

Con el método proporcionado por la presente invención es posible detectar las bacterias y grupos bacterianos mencionados, independientemente de la procedencia de las muestras. Dichas muestras pueden haber sido obtenidas a partir de biopsias, raspados, insectos, fluidos biológicos (sangre, orina, saliva, etc.), campo, etc. La muestra una vez tomada es pretratada para poder llevar a cabo una PCR Múltiple y una posterior identificación de los amplicones.With the method provided herein invention it is possible to detect bacteria and bacterial groups mentioned, regardless of the origin of the samples. Such samples may have been obtained from biopsies, scrapes, insects, biological fluids (blood, urine, saliva, etc.), field, etc. The sample once taken is pretreated to to be able to carry out Multiple PCR and subsequent identification of the amplicons.

La invención también proporciona kits de diagnostico para llevar a cabo el método descrito por la invención que comprenden:The invention also provides kits diagnosis to carry out the method described by the invention which include:

\ding{226}\ ding {226}
Cebadores específicos de secuencia: SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37 y opcionalmente SEQ ID 52 y 53 como CIA.Specific primers of Sequence: SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37 and optionally SEQ ID 52 and 53 as CIA.

\ding{226}\ ding {226}
Las sondas de secuencia: SEQ ID 3-6, SEQ ID 9-24, SEQ ID 27, SEQ ID 30, SEQ ID 33-35, SEQ ID 38-51 y opcionalmente SEQ ID 54 (S-Cl2) como CIA.Sequence probes: SEQ ID 3-6, SEQ ID 9-24, SEQ ID 27, SEQ ID 30, SEQ ID 33-35, SEQ ID 38-51 and optionally SEQ ID 54 (S-Cl2) as CIA.

Del mismo modo, los kits pueden incluir todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos. Esto incluye, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad optima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización.Similarly, the kits can include all those reagents necessary to carry out any of the described methods. This includes, without any limitation, the use of buffers, polymerases, cofactors to obtain an activity optimal of these, agents to prevent contamination, etc. By on the other hand the kits can include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization.

Las ventajas del presente método y de los kits para llevarlo a cabo son: velocidad (posible detectar 39 especies y grupos bacterianos en menos de 8 horas), especificidad (los iniciadores empleados son específicos de cada especie o grupo de bacterias) y la elevada sensibilidad.The advantages of this method and kits to carry it out are: speed (possible to detect 39 species and bacterial groups in less than 8 hours), specificity (the used primers are specific to each species or group of bacteria) and high sensitivity.

A lo largo de toda la descripción y reivindicaciones de la especificación, la palabra "comprende" y las variaciones de la misma, tal como "comprendiendo", no pretende excluir otros aditivos, componentes, integrantes o etapas. Tanto el ejemplo de realización, como los dibujos que acompañan no pretenden ser limitantes de la invención, sino que deben ser tomados como un apoyo para la mejor compresión de ésta.Throughout the description and Specification claims, the word "comprises" and variations thereof, such as "understanding", not intends to exclude other additives, components, members or stages. Both the embodiment example and the accompanying drawings do not they are intended to be limiting of the invention, but must be taken as a support for the best compression of it.

Descripción de las figurasDescription of the figures

Figura 1.- Membrana de hibridación muestra la validación de los cebadores, las sondas y las regiones variables para la detección de especies de Anaplasma y Ehrlichia (A), Borrelia (B), Francisella (C), Bartonella (D) y Coxiella (E), mediante el uso de sondas especificas (Tablas 1-5). La sonda S-Cl2 hace referencia a la sonda (Tabla 7) que es empleada para el CIA.Figure 1.- Hybridization membrane shows the validation of primers, probes and variable regions for the detection of Anaplasma and Ehrlichia (A), Borrelia (B), Francisella (C), Bartonella (D) and Coxiella ( E), through the use of specific probes (Tables 1-5). The S-Cl2 probe refers to the probe (Table 7) that is used for the CIA.

Figura 2: A) Membrana de hibridación muestra la validación de los cebadores, las sondas y las regiones variables para la detección de especies de Rickettsia; B) Membrana de hibridación que muestra un ejemplo de la realización de detección la simultánea de especies pertenecientes a los 7 géneros. En este ejemplo: A. phagocytophilum, A. marginale. E. chaffeensis, E. ewingi, B. henselae, B. burgdorferi, F. tularensis tularensis, R. conorii y R. prowazekii, ensayados a 10^{3}, 10^{2} y 10 equivalentes de genoma/copias. En ambos casos (A y B) se emplea la sonda S-Cl2 que hace referencia a la sonda (Tabla 7) que es empleada para el CIA.Figure 2: A) Hybridization membrane shows the validation of primers, probes and variable regions for the detection of Rickettsia species; B) Hybridization membrane showing an example of the simultaneous detection of species belonging to the 7 genera. In this example: A. phagocytophilum, A. marginale. E. chaffeensis, E. ewingi, B. henselae, B. burgdorferi, F. tularensis tularensis, R. conorii and R. prowazekii , tested at 10 3, 10 2 and 10 genome equivalents / copies. In both cases (A and B) the S-Cl2 probe is used that refers to the probe (Table 7) that is used for the CIA.

Figura 3: Membrana de hibridación que muestra los resultados de la realización de un estudio de especificidad del grupo de sondas indicadas (Tablas 1-7) frente a diferentes especies bacterianas, artrópodos y mamíferos. El resultado muestra que en ningún caso las sondas se unen a muestras procedentes de los organismos ensayados. La sonda S-Cl2 hace referencia a la sonda (Tabla 7) que es empleada para el CIA.Figure 3: Hybridization membrane showing the results of conducting a specificity study of the group of probes indicated (Tables 1-7) versus different bacterial species, arthropods and mammals. He result shows that in no case the probes are attached to samples from the organisms tested. Probe S-Cl2 refers to the probe (Table 7) which is used for the CIA.

Ejemplo de realizaciónExample of realization

Alineamientos, diseños de cebadores y sondasAlignments, primer designs and probes

Por comparación y alineamientos múltiples de secuencias obtenidas a partir de bases de datos públicas como Genbank (http://www.ncbi.nim.nih.gov), se identificaron regiones conservadas, a partir de las cuales se diseñaron cebadores específicos (Tablas 1-6) para su empleo en PCR múltiple. La compatibilidad entre los cebadores, así como la concentración óptima, se comprobó empíricamente, igual que se realizó con la concentración de sales de magnesio y albúmina bovina sérica.By comparison and multiple sequence alignments obtained from public databases such as Genbank ( http://www.ncbi.nim.nih.gov ), conserved regions were identified, from which specific primers were designed (Tables 1 -6) for use in multiple PCR. The compatibility between the primers, as well as the optimal concentration, was empirically tested, as was done with the concentration of magnesium salts and serum bovine albumin.

A partir de los alineamientos de las secuencias seleccionadas se identificaron regiones variables, que permitieron el diseño de sondas para la diferenciación entre las diferentes especies bacterianas y grupos génicos (Tablas 1 - 6), mediante RLB (Reverse Line Blotting) (kaufhold A, Podbielski A, Baumgarten G, Blokpoel M, Top J, Schouls L. Rapad typing of group-a streptococci by the use of DNA amplification and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters 119: 19-25 (1994)).From sequence alignments selected variable regions were identified, which allowed Probe design for differentiation between different bacterial species and gene groups (Tables 1-6), using RLB (Reverse Line Blotting) (kaufhold A, Podbielski A, Baumgarten G, Blokpoel M, Top J, Schouls L. Rapad typing of group-a streptococci by the use of DNA amplification and nonradioactive allele-specific oligonucleotide you try FEMS Microbiology Letters 119: 19-25 (1994)).

Un primer análisis de la especificidad de cada uno de las sondas se realizó mediante su comparación de su secuencia con bases de datos públicas (genbanck) empleando programas tales como BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast/). La especificidad se demostró posteriormente con ensayos frente una variedad de muestras de ADN de diferentes especies bacterianas y eucarióticas (Figura 3).A first analysis of the specificity of each of the probes was performed by comparing their sequence with public databases (genbanck) using programs such as BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast /). Specificity was subsequently demonstrated with assays against a variety of DNA samples of different bacterial and eukaryotic species (Figure 3).

Medio de cultivo y aislamiento de ADNCulture medium and DNA isolation

Las especies y grupos génicos seleccionados para su identificación se obtuvieron de colecciones privadas, de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y/o el banco de muestras disponibles en el Centro Nacional de Microbiología (CNM). Todas las especies analizadas se muestran en la tabla 8.The species and gene groups selected for their identification were obtained from private collections, from the Spanish Type Culture Collection (CECT) and / or the sample bank available at the National Center for Microbiology (CNM). All analyzed species are shown in table 8.

El aislamiento del material genético fue realizado por procedimientos disponibles comercialmente y sobradamente conocidos en el estado de la técnica (DNA Mini Kit, Qiagen, N. Referencia: 51304).The isolation of the genetic material was performed by commercially available procedures and well known in the state of the art (DNA Mini Kit, Qiagen, N. Reference: 51304). 

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
TABLA 8TABLE 8 Origen de los ADN utilizados en la invenciónOrigin of the DNA used in the invention

Organismo Organism DNA nativo (origen)Native DNA (origin) DNA sintético*Synthetic DNA * Anaplasma phagocytophllumAnaplasma phagocytophllum X (1)X (one) A. marginaleTO. marginale X (1)X (1) Ehrlichia chaffeensisEhrlichia chaffeensis XX E. ewingiiE. ewingii XX Borrelia burgdorferiBorrelia burgdorferi X (2)X (2) B. gariniiB. garinii X (2)X (2) B. afzeliiB. afzelii X (2)X (2) B. lusitaniaeB. lusitaniae X (2)X (2) B. japónicaB. japan X (2)X (2) B. hermsiiB. hermsii X (2)X (2) B. parkeriB. parkeri X (2)X (2) Francisella tularensis tularensisFrancisella tularensis tularensis X (3)X (3) F. tularensis subespecie holarcticaF. tularensis subspecies holarctica X (3)X (3) F. tularensis subesp. NovicidaF. tularensis subsp. Novice X (3)X (3) Francisella variante 3523Francisella variant 3523 XX Francisella EndosimbiontesFrancisella Endosymbionts XX Bartonella alsaticaBartonella alsatica X (4)X (4) B. bacilliformisB. bacilliformis X (4)X (4) B. bovisB. bovis X (4)X (4) B. clarridgeiaeB. clarridgeiae X (4)X (4) B. doshiaeB. doshiae X (4)X (4) B. elizabethaeB. elizabethae X (4)X (4) B. grahamiiB. grahamii X (4)X (4) B. henselaeB. henselae X (4)X (4) B. koehleraeB. koehlerae X (4)X (4)

TABLA 8 (continuación)TABLE 8 (continuation)

Organismo Organism DNA nativo (origen)Native DNA (origin) DNA sintético*Synthetic DNA * B. quintanaB. quintana X (4)X (4) B. schoenbuchensisB. schoenbuchensis X (4)X (4) B. tayloriiB. Taylorii X (4)X (4) B. tribocorumB. tribocorum X (4)X (4) B. vinsonii subesp. ArupensisB. vinsonii subsp. Arupensis X (4)X (4) B. vinsonii subesp. BerkhofiiB. vinsonii subsp. Berkhofii X (4)X (4) B. vinsonii subesp. VinsoniiB. vinsonii subsp. Vinsonii X (4)X (4) Coxiella bumetiiCoxiella bumetii X (5)X (5) Rickettsia aeschlimanniiRickettsia aeschlimannii XX R. akariR. akari X (5)X (5) R. australisR. australis X (5)X (5) R. belliiR. bellii X (5)X (5) R. conoriR. conori X (5)X (5) R. felisR. felis X (5)X (5) R. HelveticaR. Helvetica X (5)X (5) R. rickettsiiR. rickettsii X (5)X (5) R. sibiricaR. sibirica XX R. slovacaR. slovaca X (5)X (5) R. prowazekiiR. prowazekii XX R. typhiR. typhi X (5)X (5) Brucella melitensisBrucella melitensis X (6)X (6) Chlamydia pneumoniaeChlamydia pneumoniae X (7)X (7) C. psittaciC. psittaci X (7)X (7) Escherichia coliEscherichia coli X (6)X (6) Legionella pneumophilaLegionella pneumophila X (8)X (8) Leptospira interrogansLeptospira interrogans X (4)X (4) Micoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniae X (7)X (7) Ochrobactrum antropiOchrobactrum anthropi X (4)X (4) Orientia tsutsugamushiOrientia tsutsugamushi X (5)X (5) Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa X (4)X (4) Salmonella enterica TyphiSalmonella enterica Typhi X (4)X (4)

TABLA 8 (continuación)TABLE 8 (continuation)

Organismo Organism DNA nativo (origen)Native DNA (origin) DNA sintético*Synthetic DNA * Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae X (6)X (6) Treponema pallidumTreponema pallidum X (7)X (7) Ixodes ricinusIxodes ricinus X (9)X (9) Dermacentor marginatusDermacentor marginatus X (9)X (9) Ripicephalus sanguineusRipicephalus sanguineus X (9)X (9) Apodemus sylvaticusApodemus sylvaticus X (9)X (9) ADN humanoHuman DNA X (10)X (10) Control InternoControl Internal XX

Origen del ADN naturalOrigin of natural DNA

1: one:
Muestra positivaPositive sample

2: 2:
Medio de cultivo axénico, según se describe en:Axene culture medium, as described in:

\quadquad
Benach JL, Coleman JL, and Golightly MG. 1988. A murine monoclonal antibody binds an antigenic determinant in outer surface protein A, an immunodominant basic protein of the Lyme disease spirochete. J. Immunol. 140:265-72.Benach JL, Coleman JL, and Golightly MG. 1988. A murine monoclonal antibody binds an antigenic determinant in outer surface protein A, an immunodominant basic protein of the Lyme disease spirochete. J. Immunol. 140: 265-72.

3: 3:
Medio de cultivo axénico, según se describe en:Axene culture medium, as described in:

\quadquad
Anda P, Segura del Pozo J, Diaz Garcia JM, Escudero R, Garcia Peña FJ, Lopez Velasco MC, Sellek RE, Jimenez Chillaron MR, Sanchez Serrano LP, Martinez Navarro JF. 2001. Waterborne outbreak of tularemia associated with crayfish fishing. Emerg. Infect. Dis. 7 (Suppl):575-82.Anda P, Segura del Pozo J, Diaz Garcia JM, Escudero R, Garcia Peña FJ, Lopez Velasco MC, Sellek RE, Jimenez Chillaron MR, Sanchez Serrano LP, Martinez Navarro JF. 2001. Waterborne outbreak of tularemia associated with crayfish fishing. Emerg Infect Dis. 7 (Suppl): 575-82.

4: 4:
Composición de los medios de cultivo axénicos específicos para cada especie disponible en:Composition of axenic culture media specific for each species available in:

\quadquad
\underbar{http://cip.pasteur.fr/index.html.en}\ underbar {http://cip.pasteur.fr/index.html.en}

5: 5:
Propagación en cultivos celulares mediante la técnica de "shell vial", según se describe en:Propagation in cell cultures by "road shell" technique, as described in:

\quadquad
Marrero M, Raoult D. 1989. Centrifugation-shell vial technique for rapid detection of Mediterranean spotted fever rickettsía in blood culture. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: 197-9.Marrero M, Raoult D. 1989. Centrifugation-shell vial technique for rapid detection of Mediterranean spotted fever rickettsía in blood culture. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: 197-9.

6: 6:
Agar "Mueller Hinton" suplementado con 5% de sangre de carnero."Mueller Hinton" agar supplemented with 5% of sheep blood.

7: 7:
ADN extraído de portaobjetos para inmunofluorescencia indirecta de origen comercial.DNA extracted from slides for indirect immunofluorescence of commercial origin.

8: 8:
Medio de cultivo axénico según se describe en:Axene culture medium as described in:

\quadquad
Edeistein PH. 1981. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental samples. J. Clin. Microbiol. 14:298-303.Edeistein PH. 1981. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental samples. J. Clin. Microbiol 14: 298-303.

9: 9:
ADN extraído de ejemplares libres de patógenos.DNA extracted from free copies of pathogens

10: 10:
ADN extraído de muestras clínicas de pacientes con enfermedad no relacionada.DNA extracted from clinical samples of patients with unrelated disease
\bulletADN sintético synthetic DNA

El ADN sintético se preparó en base a las correspondientes secuencias citadas en las tablas 1 a 7 (Columna 6), mediante sucesiva elongación por PCR de la cadena de ADN, utilizando cebadores de aproximadamente 70 nucleótidos, solapados entre sí en aproximadamente 20 nucleótidos.Synthetic DNA was prepared based on the corresponding sequences cited in tables 1 to 7 (Column 6), by successive PCR elongation of the DNA chain, using primers of approximately 70 nucleotides, overlapping each other in approximately 20 nucleotides.

Amplificación, hibridación y validaciónAmplification, hybridization and validation

En este paso se procede a realizar el análisis experimental de las zonas variables detectadas anteriormente mediante PCR para su validación. El ADN aislado se amplificó por PCR (Saiki et al., (1985) Science 230, 1350;1354), aplicando el siguiente cuadro de ciclos de temperatura y composición de la mezcla de reacción, junto con los cebadores específicos que previamente habían sido diseñados para tal efecto.In this step we proceed to carry out the experimental analysis of the variable areas previously detected by PCR for validation. The isolated DNA was amplified by PCR (Saiki et al. , (1985) Science 230, 1350; 1354), applying the following chart of temperature and composition cycles of the reaction mixture, together with the specific primers that had previously been designed for this purpose.

1010

Composición de la mezcla de reacción para un volumen final de 50 \muL:Composition of the reaction mixture for a final volume of 50 µL:

--
H_{2}O: En función del volumen de ADNH_ {2} O: Depending on the volume of DNA

--
Buffer Taq Gold LD: \hskip0,75cm 9 \muLBuffer Taq Gold LD: \ hskip0.75cm 9 \ muL

--
Cl_{2}Mg [3 mM]: \hskip1,5cm 6 \muLCl 2 Mg [3 mM]: \ hskip1.5cm 6 \ muL

--
dNTPs [200 mM]: \hskip1,1cm 1 \muL x 4dNTPs [200 mM]: 1 x 1 x 4

--
BSA [0,8 ug/uL]: \hskip1,25cm 4 \muLBSA [0.8 ug / uL]: \ hskip1.25cm 4 \ muL

--
14 Cebadores específicos (SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37, SEQ ID 52-53) [50 pm/\muL]: 0,5 \muL de cada uno (7 \muL)14 Specific primers (SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37, SEQ ID 52-53) [50 pm / µL]:  0.5 µL of each (7 µL)

--
Taq Gold LD: \hskip1,75cm 0,5 \muL [2,5 unidades]Taq Gold LD: 0.5cm 0.5 [2.5 units]

--
ADN problema: \hskip1,45cm máximo de 800 ngDNA problem: \ hskip1,45cm maximum of 800 ng

Los amplicones se secuenciaron para su validación, comprobándose que la secuencia amplificada coincidía con las secuencias variables deducidas de los estudios bioinformáticos. Posteriormente los amplicones se hibridaron con las sondas específicas siguiendo el protocolo de RLB descrito por Sjoerd G. T. Rijpkema et al., Journal of Clinical Microbiology, Dec. 1995, p. 3091-3095, aunque aplicando las siguientes modificaciones (Figura 1 y 2A):The amplicons were sequenced for validation, verifying that the amplified sequence coincided with the variable sequences deduced from the bioinformatic studies. Subsequently, the amplicons were hybridized with the specific probes following the RLB protocol described by Sjoerd GT Rijpkema et al. , Journal of Clinical Microbiology, Dec. 1995, p. 3091-3095, although applying the following modifications (Figure 1 and 2A):

--
Sustrato: Super Signal West Dura (Pierce, Ref: 34075)Substrate: Super Signal West Dura (Pierce, Ref: 34075)

--
Sondas: se utilizan a una concentración entre 0,2 y 3,2 picomoles/microlitroProbes: used at a concentration between 0.2 and 3.2 picomoles / microliter

--
Incubación: a 55ºCIncubation: at 55 ° C

--
Lavados: a 52ºCWashings: at 52ºC

El resultado de las hibridaciones es mostrado en las figuras 1 y 2A donde se aprecia como cada una de las sondas de la invención se unen específicamente a cada uno de los amplícones de cada una de las especies bacterianas que se detectan mediante el método de la invención.The result of hybridizations is shown in Figures 1 and 2A where it is seen as each of the probes of the invention specifically bind to each of the amplitudes of each of the bacterial species that are detected by method of the invention

Preparación de muestras y PCR múltipleSample preparation and multiple PCR

Una de las ventajas de los sistemas de identificación basados en análisis por PCR y RLB consiste en que no es necesario partir de cultivos bacterianos puros. De este modo, y una vez realizada la validación de los cebadores y las sondas con muestras de ADN de las diferentes especies y subespecies citadas en las tablas 1-6, preparadas siguiendo los procedimientos citados en la tabla 8 y analizándolas por duplicado, se procedió a la realización de un análisis por PCR múltiple de una mezcla de ADN control preparada en laboratorio, seguido de la prueba de RLB, empleando los cebadores y sondas especificas diseñados, los ciclos de temperatura y la composición de mezcla de reacción indicados anteriormente cuyos resultados se muestran en la figura 2B. En la dicha figura se aprecia que es posible realizar la detección simultanea de aquellas especies bacterianas que estaban presentes en la muestra.One of the advantages of the systems of identification based on PCR and RLB analysis is that no It is necessary to start from pure bacterial cultures. In this way, and once the validation of the primers and probes has been carried out with DNA samples of the different species and subspecies cited in Tables 1-6, prepared following the procedures cited in table 8 and analyzed in duplicate, a multiple PCR analysis of a mixture of control DNA prepared in the laboratory, followed by RLB test, using primers and specific probes designed, temperature cycles and mixing composition of reaction indicated above whose results are shown in the figure 2B. This figure shows that it is possible to perform the simultaneous detection of those bacterial species that were present in the sample.

Detección de inhibidores de PCRPCR inhibitor detection

Para la detección de inhibidores de PCR, se construyó un control de interno de amplificación (CIA) que fuese amplificado junto los ADN diana, utilizando cebadores específicos (Tabla 7), que fueron diseñados a partir de regiones conservadas de la secuencia AB183705 (Tabla 7) perteneciente al gen de la THC sintasa de Cannabis sativa. Concretamente el amplicón que actúa como CIA se corresponde con una secuencia de 371 pares de bases para la cual se diseñó también una sonda (Tabla 7) para su detección durante el RLB.For the detection of PCR inhibitors, an internal amplification control (CIA) was constructed that was amplified together with the target DNAs, using specific primers (Table 7), which were designed from conserved regions of the AB183705 sequence (Table 7 ) belonging to the THC synthase gene of Cannabis sativa . Specifically, the amplicon that acts as CIA corresponds to a sequence of 371 base pairs for which a probe was also designed (Table 7) for detection during the RLB.

Especificidad del métodoSpecificity of the method

La alta especificidad del presente método está basada de la especificidad de los cebadores y sus sondas, los cuales fueron probados con otra serie de organismos (Tabla 9), siguiendo el método descrito por la presente invención, comprobándose que en ningún caso se detectaba la formación de amplicones detectables mediante hibridación (Figura 3).The high specificity of the present method is based on the specificity of the primers and their probes, the which were tested with another series of organisms (Table 9), following the method described by the present invention, verifying that in no case was the formation of amplicons detectable by hybridization (Figure 3).

TABLA 9TABLE 9 Especificidad: especies bacterianas no relacionadas y de artrópodos y mamíferos utilizadas durante la puesta a punto del métodoSpecificity: unrelated bacterial species and  of arthropods and mammals used during the commissioning of the method

Especie Species Resultado RLBRLB result BacteriasBacteria 1one \hskip0,35cmBrucella melitensis \ hskip0,35cm Brucella melitensis NegativoNegative 22 \hskip0,35cmChlamydia penumoniae \ hskip0.35cm Chlamydia penumoniae NegativoNegative 33 \hskip0,35cmC. psittaci C. psittaci NegativoNegative 44 \hskip0,35cmEscherichia coli Escherichia coli NegativoNegative 55 \hskip0,35cmLegionella pneumophila \ hskip0,35cm Legionella pneumophila NegativoNegative 66 \hskip0,35cmLeptospira interrogans \ hskip0,35cm Leptospira interrogans NegativoNegative 77 \hskip0,35cmMycoplasma penumoniae \ hskip0.35cm Mycoplasma penumoniae NegativoNegative 88 \hskip0,35cmOchrobactrum antropi \ hskip0,35cm Ochrobactrum antropi NegativoNegative 99 \hskip0,35cmOrientia tsutsugamushi \ hskip0,35cm Orientia tsutsugamushi NegativoNegative 1010 \hskip0,35cmPseudomonas aeruginosa \ hskip0.35cm Pseudomonas aeruginosa NegativoNegative 11eleven \hskip0,35cmSalmonella enterica Typhi \ hskip0,35cm Salmonella enterica Typhi NegativoNegative 1212 \hskip0,35cmStreptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae NegativoNegative 1313 \hskip0,35cmTreponema pailidum \ hskip0.35cm Treponema pailidum NegativoNegative ArtrópodosArthropods 1414 \hskip0,35cmIxodes ricinos \ Ixodes ricinus hskip0,35cm NegativoNegative 15fifteen \hskip0,35cmDermacentor margínatus \ hskip0,35cm Dermacentor margínatus NegativoNegative 1616 \hskip0,35cmRipicephalus sanguineus \ hskip0.35cm Ripicephalus sanguineus NegativoNegative MamíferosMammals 1717 \hskip0,35cmApodemus sylvaticus Apodemus sylvaticus NegativoNegative 1818 \hskip0,35cm Humano\ hskip0,35cm Human NegativoNegative

Claims (15)

1. Método para la detección simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los géneros: Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, Francisella y Rickettsia que comprende:1. Method for the simultaneous detection of bacterial species that cause zoonosis belonging to the genera: Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, Rickettsia and Francisella comprising:
a.to.
Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que comprenda cebadores específicos que amplifiquen las secuencias: SEQ ID 55-93.Put on contact the sample to be analyzed with a reaction mixture that comprise specific primers that amplify the sequences: SEQ ID 55-93.
b.b.
Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa.Amplify by chain reaction of polymerase.
c.C.
Identificar la formación de productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.Identify product formation of the previous step, said formation being indicative of the presence or absence of bacteria causing zoonosis.
2. Método según la reivindicación 1 donde las especies bacterianas detectadas son:2. Method according to claim 1 wherein the Bacterial species detected are:
a.to.
Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. marginale, A. centrale y A. ovis. Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. marginale, A. centrale and A. ovis .
b.b.
Ehrlichia chaffeensis y E. ewingii. Ehrlichia chaffeensis and E. ewingii .
c.C.
Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subespecie berkhofii, B. vinsonii subespecie vinsonii, B. vnisonii subespecie arupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B. doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori y B. tribocorum. Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subspecies berkhofii, B. vinsonii subspecies vinsonii, B. vnisonii subspecies arupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B Doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori and B. tribocorum .
d.d.
Especies del género Borrelia.Species of the genus Borrelia .
e.and.
Coxiella burnetii. Coxiella burnetii .
f.F.
Francisella turalensis subesp. holarctica y F. tularensis subesp. novicida, la variante 3523 de Francisella turalensis y el grupo endosimbionte de Francisella. Francisella turalensis subsp. holarctica and F. tularensis subsp. novicide , variant 3523 of Francisella turalensis and the endosymbiont group of Francisella .
g.g.
Especies causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tifus, las especies Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibirica, R. helvetica, R. felis, R. australis, R. prowazekii, y R. typhy.Species causing spotted fevers and the causative group of typhus, Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibirica, R. helvetica, R. felis, R. australis, R. prowazekii, and R. typhy .
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los cebadores comprenden las secuencias SEQ ID 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36, 37.3. Method according to any of the previous claims, wherein the primers comprise the SEQ ID sequences 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36, 37. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la detección simultanea de los productos de amplificación se realiza mediante sondas que comprenden las secuencias SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35, 38-51.4. Method according to any of the previous claims wherein the simultaneous detection of amplification products are performed using probes that comprise the sequences SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35, 38-51. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende al menos un control de amplificación interno.5. Method according to any of the previous claims comprising at least one control of internal amplification 6. Método según la reivindicación 5, en donde el control de amplificación interno comprende:6. Method according to claim 5, wherein the Internal amplification control comprises:
a.to.
La amplificación de la SEQ ID 94 con cebadores específicos.The amplification of SEQ ID 94 with specific primers.
b.b.
Detección de la formación del producto de amplificación del paso anterior.Product formation detection of amplification of the previous step.
7. Método según la reivindicación 6, en donde los cebadores específicos tienen las secuencias 52 y 53.7. Method according to claim 6, wherein specific primers have sequences 52 and 53. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde la detección del producto de amplificación es llevada a cabo mediante la sonda de SEQ ID 54.8. Method according to any of the claims 5-7, wherein the detection of amplification product is carried out by the probe SEQ ID 54. 9. Cebadores de SEQ ID 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, caracterizados porque son capaces de amplificar las secuencias definidas según la reivindicación 1.9. Primers of SEQ ID 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 and 37, characterized in that they are capable of amplifying the sequences defined according to claim 1. 10. Cebador de SEQ ID 52 y 53, caracterizados porque son capaces de amplificar la secuencia definida según la reivindicación 6.10. Primer of SEQ ID 52 and 53, characterized in that they are capable of amplifying the sequence defined according to claim 6. 11. Sondas de secuencia SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35 y 38-51, caracterizadas porque son capaces de hibridar con las secuencias definidas según la reivindicación 1.11. Sequence probes SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35 and 38-51, characterized in that they are capable of hybridizing with the sequences defined according to claim 1. 12. Sonda de SEQ ID 54, caracterizada porque es capaz de hibridar con la secuencia definida según la reivindicación 8.12. Probe of SEQ ID 54, characterized in that it is capable of hybridizing with the sequence defined according to claim 8. 13. Kit de diagnostico capaz de llevar a cabo el método según las reivindicaciones 1 a 8.13. Diagnostic kit capable of carrying out the method according to claims 1 to 8. 14. Kit según la reivindicación anterior que comprende cebadores según las reivindicaciones 9 y 10.14. Kit according to the preceding claim that It comprises primers according to claims 9 and 10. 15. Kit según la reivindicación anterior que comprende sondas según las reivindicaciones 11 y 12.15. Kit according to the preceding claim that It comprises probes according to claims 11 and 12.
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