ES2262374A1 - Electrical cell stimulation device for use in biochemical analysis and molecular biology has connection plates arranged adjacent to two opposite plates and connected to pulse current generator - Google Patents
Electrical cell stimulation device for use in biochemical analysis and molecular biology has connection plates arranged adjacent to two opposite plates and connected to pulse current generatorInfo
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Abstract
Description
Aparato eléctrico para la estimulación simultánea, controlable y duradera de células cultivadas en placas multipocillo.Electrical apparatus for stimulation Simultaneous, controllable and durable plaque cultured cells multiwell.
Esta invención se relaciona con en campo de los ensayos de bioquímica y biología molecular donde se estimulan eléctricamente células en cultivo.This invention relates to the field of biochemistry and molecular biology tests where they are stimulated Electrically cultured cells.
La excitación de células musculares o neuronales puede ser producida por estimulación eléctrica. La estimulación eléctrica continua de células aisladas en cultivo proporciona un excepcional modelo in vitro para el estudio de los subsiguientes cambios bioquímicos y moleculares. La excitabilidad en células musculares en cultivo provoca contracción muscular. En realidad, las células del músculo esquelético no contraen a menos que sean estimuladas, vía el nervio o eléctricamente. La excitación-contracción tiene numerosos efectos a corto y largo plazo en la funcionalidad y metabolismo de la célula muscular. La estimulación eléctrica in vivo causa efectos inmediatos en el metabolismo de los nutrientes, tales como la activación del transporte de glucosa y ácidos grasos, y la oxidación, tanto en músculos de contracción rápida, como de contracción lenta. Por otra parte, la actividad contráctil durante períodos largos mediante estimulación eléctrica a baja frecuencia, induce importantes cambios en los fenotipos metabólico y transcripcional, llegando a provocar la transformación de fibras glucolíticas de contracción rápida en fibras oxidativas de contracción lenta.The excitation of muscle or neuronal cells can be produced by electrical stimulation. The continuous electrical stimulation of isolated cells in culture provides an exceptional in vitro model for the study of subsequent biochemical and molecular changes. The excitability in muscle cells in culture causes muscle contraction. Actually, skeletal muscle cells do not contract unless stimulated, via the nerve or electrically. The excitation-contraction has numerous short and long term effects on the functionality and metabolism of the muscle cell. In vivo electrical stimulation causes immediate effects on nutrient metabolism, such as the activation of glucose and fatty acid transport, and oxidation, both in fast-contracting and slow-contracting muscles. On the other hand, the contractile activity during long periods by means of electrical stimulation at low frequency, induces important changes in the metabolic and transcriptional phenotypes, leading to the transformation of glycolytic fibers of rapid contraction into oxidative fibers of slow contraction.
Un primer intento de desarrollar un modelo in vitro de estimulación eléctrica en placas de 24 pocillos, fue un sistema compuesto por electrodos de plata/cloruro de plata para los pocillos de los extremos y por puentes salinos de agar para conectar los pocillos internos (cfr. A. Brevet et al., "Myosin synthesis increased by electrical stimulation of skeletal muscle cell cultures", Science 1976, vol. 193, pp. 1152-4). Sin embargo, la configuración eléctrica de este sistema no era fácilmente estandarizable ya que no proporcionaba la misma intensidad de corriente a cada pocillo de la placa de cultivo. Debido a sus dimensiones, los puentes salinos tenían una baja conductividad y la caída de voltaje en los puentes era mucho mayor que en el medio de cultivo. Además, los solutos difundían por el puente salino alterando los gradientes de concentración, y la preparación de los electrodos desechables consumía mucho tiempo. Más tarde, se desarrolló un sistema alternativo adaptable a frascos de cultivo de 175 cm^{2}, el cual incluía electrodos de grafito, incorporados en la tapa, y paralelos al lado más largo del frasco (cfr. WO 93/09838 A1). Desafortunadamente, este sistema con un único recipiente no era estandarizable. En primer lugar, requería recipientes especialmente diseñados para cada tipo de muestra de células, lo que dificultaba el análisis de un gran número de réplicas. En segundo lugar, el gran tamaño de los recipientes forzaba a la preparación de una gran cantidad de células para cada una de las condiciones de muestra, lo que dependiendo de la fuente y naturaleza de las células, no era factible.A first attempt to develop an in vitro model of electrical stimulation in 24-well plates was a system composed of silver / silver chloride electrodes for the end wells and agar bridges to connect the internal wells (cf. A. Brevet et al. , "Myosin synthesis increased by electrical stimulation of skeletal muscle cell cultures", Science 1976, vol. 193, pp. 1152-4). However, the electrical configuration of this system was not easily standardized since it did not provide the same current intensity to each well of the culture plate. Due to their dimensions, the salt bridges had a low conductivity and the voltage drop in the bridges was much greater than in the culture medium. In addition, solutes spread across the salt bridge by altering concentration gradients, and the preparation of disposable electrodes was time consuming. Later, an alternative system adaptable to 175 cm2 culture bottles was developed, which included graphite electrodes, incorporated in the lid, and parallel to the longer side of the bottle (cf. WO 93/09838 A1) . Unfortunately, this system with a single vessel was not standardizable. First, it required specially designed containers for each type of cell sample, which made it difficult to analyze a large number of replicas. Second, the large size of the containers forced the preparation of a large number of cells for each of the sample conditions, which, depending on the source and nature of the cells, was not feasible.
Así, es muy deseable tener un dispositivo que supere algunas de las limitaciones de estimuladores eléctricos de células conocidos en la técnica, que sea capaz de estimular eléctrica y simultáneamente células cultivadas, de manera controlable, para diferentes grupos de células, y durante un largo periodo de tiempo.Thus, it is very desirable to have a device that overcome some of the limitations of electric stimulators of cells known in the art, which is capable of stimulating electrically and simultaneously cultured cells, so controllable, for different groups of cells, and for a long time frame.
Los inventores de la presente invención proporcionan un nuevo montaje de estimulación eléctrica adecuado para la estimulación uniforme y continua de un gran número de pocillos independientes en placas estándar multipocillo. El montaje permite la estimulación a largo plazo, efectiva y sin dañar, en condiciones estándar de incubación. La principal aplicación del nuevo montaje es la inducción de la contracción de células y el subsiguiente estudio de cambios bioquímicos.The inventors of the present invention they provide a suitable new electrical stimulation assembly for uniform and continuous stimulation of a large number of independent wells in standard multiwell plates. The montage allows long-term, effective and undamaged stimulation, in standard incubation conditions. The main application of new assembly is the induction of cell contraction and the subsequent study of biochemical changes.
Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo para ser usado como parte de un montaje de estimulación eléctrica de células excitables. Este montaje tiene un generador de pulsos de corriente (6) con dos polos de salida (21) y medios (18) para conectar apropiadamente los polos (21). El generador de pulsos (6) es un generador de pulsos de corriente alterna o un generador de pulsos de corriente continua. Cuando es un generador de pulsos de corriente continua, uno de las dos placas de conexión comprende un condensador (1) para evitar la electrólisis. En una realización particular, el generador de pulsos (6) produce una salida de voltaje hasta 150 V y una frecuencia de pulso hasta 1000 Hz.Thus, one aspect of the present invention is refers to a device to be used as part of a mounting of electrical stimulation of excitable cells. This assembly has a current pulse generator (6) with two output poles (21) and means (18) for properly connecting the poles (21). He pulse generator (6) is a current pulse generator alternating or a direct current pulse generator. When is a DC generator, one of the two plates connection includes a capacitor (1) to avoid electrolysis. In a particular embodiment, the pulse generator (6) produces a voltage output up to 150 V and a frequency of pulse up to 1000 Hz.
El montaje de estimulación tiene también una placa de cultivo multipocillo cuadrada o rectangular (17) con una o más filas de pocillos susceptibles de ser llenados con medio de cultivo celular. En una realización particular, la forma del pocillo de la placa de cultivo multipocillo es circular (cfr. Fig. 5A) y más particularmente, la placa de cultivo multipocillo se selecciona de placas estándar de cultivo de seis, doce o veinticuatro pocillos. En otra realización, la forma del pocillo de la placa de cultivo multipocillo es cuadrada (cfr. Fig. 5B).The stimulation assembly also has a square or rectangular multi-well culture plate (17) with one or more rows of wells that can be filled with medium cell culture. In a particular embodiment, the shape of the The well of the multi-well culture plate is circular (cf. Fig. 5A) and more particularly, the multiwell culture plate is select from standard culture plates of six, twelve or twenty four wells. In another embodiment, the shape of the well of The multiwell plate is square (cfr. Fig. 5B).
El dispositivo para ser usado como parte del montaje de estimulación eléctrica comprende dos placas de conexión (2) para ser conectadas respectivamente a los polos (21) del generador de pulsos de corriente (6), y para ser colocadas adyacentemente a dos lados opuestos de la placa multipocillo, cada placa comprendiendo suficientes lugares de conexión (20) para el número de filas de pocillos a ser estimuladas. El dispositivo también comprende dos tipos de electrodos metálicos inocuos. En primer lugar, comprende suficientes electrodos de pocillo de los extremos (4) para ser conectados en los lugares de conexión (20) de las dos placas de conexión (2) y para ser introducidos en los pocillos de los extremos de las filas a estimular. Cada electrodo de pocillo de los extremos (4) comprende un extremo de conexión (10) y un extremo sumergible (12), donde el extremo sumergible tiene una porción inferior horizontal con una forma que se adapta a la forma de la pared del pocillo. En segundo lugar, el dispositivo comprende suficientes electrodos-puente (5) para conectar todos los pares de pocillos adyacentes de cada fila a estimular, donde cada electrodo-puente (5) comprende dos extremos sumergibles (12). Los extremos sumergibles tienen una porción inferior horizontal con una forma que se adapta a la forma de la pared del pocillo. En una realización particular, tanto los electrodos de pocillo de los extremos como los electrodos-puente del dispositivo están hechos de hilo de platino y preferiblemente, el diámetro del hilo de platino es de aproximadamente 0.25 centímetros. Más particularmente, la forma de la porción inferior horizontal de tanto los electrodos de pocillo de los extremos como los electrodos-puente se adapta a las paredes de pocillos circulares (11) o a las paredes de pocillos cuadrados (13). Los electrodos de pocillo de los extremos se conectan a las placas adyacentes y son sumergidos en cada pocillo de los extremos (cfr. Fig. 4A). Los electrodos de pocillo interno o electrodos-puente se sumergen en los pocillos intermedios de cada fila y se conectan en serie de dos en dos. De esta manera, las placas quedan divididas en filas independientes equivalentes con un campo eléctrico resultante homogéneo en cada fila.The device to be used as part of the Electrical stimulation assembly comprises two connection plates (2) to be connected respectively to the poles (21) of the current pulse generator (6), and to be placed adjacent to two opposite sides of the multiwell plate, each plate comprising sufficient connection places (20) for the number of rows of wells to be stimulated. The device It also comprises two types of harmless metal electrodes. In first, it comprises enough well electrodes of the ends (4) to be connected at the connection places (20) of the two connection plates (2) and to be introduced in the wells of the ends of the rows to be stimulated. Each electrode Well end (4) comprises a connecting end (10) and a submersible end (12), where the submersible end has a lower horizontal portion with a shape that adapts to the shape of the wall of the well. Second, the device comprises enough bridge electrodes (5) to connect all pairs of adjacent wells in each row to stimulate, where each bridge electrode (5) comprises two submersible ends (12). The submersible ends have a horizontal bottom portion with a shape that fits the shape from the wall of the well. In a particular embodiment, both the end well electrodes such as device-bridge electrodes are made of platinum thread and preferably, the diameter of the platinum thread It is about 0.25 centimeters. More particularly, the shape of the horizontal bottom portion of both the electrodes of end well as bridge electrodes adapts to the walls of circular wells (11) or to the walls of square wells (13). Well electrodes of ends connect to adjacent plates and are submerged in each well of the ends (cf. Fig. 4A). Electrodes internal well or bridge electrodes are immersed in the intermediate wells of each row and are connected in series of two in two. In this way, the plates are divided into rows equivalent independent with a resulting electric field homogeneous in each row.
En una realización particular de la invención, las células excitables son células musculares, y más particularmente, células de músculo esquelético. Pero el montaje puede tener un amplio rango de aplicaciones en otros tipos de células musculares, de músculo liso o cardíaco, o en células neuronales. Con el montaje de la invención, la estimulación eléctrica es la misma para todas las células cultivadas en una fila. Este hecho es esencial en ensayos que requieren las mismas condiciones de cultivo para un conjunto de células.In a particular embodiment of the invention, excitable cells are muscle cells, and more particularly, skeletal muscle cells. But the assembly it can have a wide range of applications in other types of muscle, smooth or heart muscle cells, or in cells Neural With the assembly of the invention, stimulation electrical is the same for all cells grown in a row. This fact is essential in trials that require the same culture conditions for a set of cells.
Debido a su ligereza, el montaje de estimulación puede colocarse en un incubador estándar para mantener las células en condiciones estándar permitiendo periodos de estimulación de medio a largo plazo como se requiere para ensayos bioquímicos y de biología molecular. Antes de la inmersión en el medio de cultivo, se pueden esterilizar los electrodos de hilo de platino. Las dos placas de conexión pueden rociarse con etanol antes de colocarlas en el incubador. El montaje de estimulación puede fijarse sobre un soporte de plástico transparente para trabajar mejor. Asimismo, el montaje puede comprender una tapa adaptadora opcional que sujeta el conjunto completo de electrodos para ser introducidos en los pocillos de la placa.Due to its lightness, the stimulation assembly can be placed in a standard incubator to keep cells under standard conditions allowing periods of stimulation of medium to long term as required for biochemical and molecular biology. Before immersion in the culture medium, Platinum wire electrodes can be sterilized. Both connection plates can be sprayed with ethanol before placing them in the incubator The stimulation assembly can be fixed on a transparent plastic support to work better. Also, the assembly can comprise an optional adapter cap that holds the complete set of electrodes to be introduced into plate wells.
Otro aspecto de la invención se refiere a un aparato para la estimulación eléctrica de células excitables, que comprende un generador de pulsos de corriente y medios para conectar el generador de pulsos de corriente, una placa de cultivo multipocillo, dos placas de conexión, y suficientes electrodos de pocillo de los extremos y electrodos-puente, todos estos componentes con las características arriba mencionadas.Another aspect of the invention relates to a apparatus for electrical stimulation of excitable cells, which comprises a pulse generator of current and means for connect the current pulse generator, a culture plate multiwell, two connection plates, and enough electrodes end well and bridge electrodes, all these components with the characteristics mentioned above.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. The summary of this application is incorporated here as reference. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following particular embodiments and drawings are provided to mode of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention
La Fig. 1 es una fotografía que da una perspectiva global del montaje de estimulación eléctrica, con las dos placas de conexión (2) flanqueando una placa estándar de 6 pocillos (17). Las dos placas de conexión están conectadas al generador de pulsos de corriente (no mostrado) con medios adecuados (18). Una de las placas de conexión comprende un condensador (1).Fig. 1 is a photograph that gives a global perspective of the electrical stimulation assembly, with the two connection plates (2) flanking a standard plate of 6 wells (17). The two connection plates are connected to the current pulse generator (not shown) with suitable means (18). One of the connection plates comprises a capacitor (one).
La Fig. 2 es una fotografía de las dos placas de conexión (2) y los dos tipos de electrodos metálicos inocuos: electrodos de pocillo de los extremos (4) y electrodos-puente (5). También se indican el condensador 1 y los seis lugares de conexión (20) para los electrodos de los extremos (cuatro lugares de conexión (19) por placa para placas de 24 pocillos, y dos lugares de conexión (19) por placa para placas de 6 pocillos). El conjunto completo de electrodos en una fila está marcado con una flecha longitudinal (3). (S_{1}-S_{6}) son los interruptores que permiten la selección de las filas de pocillos.Fig. 2 is a photograph of the two plates of connection (2) and the two types of harmless metal electrodes: end well electrodes (4) and bridge electrodes (5). The capacitor 1 and the six connection places (20) for the end electrodes (four connection locations (19) by 24-well plate plate, and two connection locations (19) per plate for 6-well plates). The complete set of electrodes in a row is marked with a longitudinal arrow (3). (S_ {1} -S_ {6}) are the switches that allow selection of well rows.
La Fig. 3 muestra un esquema eléctrico del montaje de estimulación eléctrica. El número (6) es el generador de pulsos, (1) es el condensador desacoplador, que evita cualquier corriente continua que fluya a través del medio celular. (S_{1}-S_{6}) son los interruptores que permiten la selección de las filas de pocillos. (S_{1}), (S_{3}), (S_{4}) y (S_{6}) se utilizan para las placas de cuatro filas (24 pocillos), mientras que (S_{2}) y (S_{5}) se usan para las placas de dos filas (6 pocillos). Los puntos de control (7) situados al lado de los interruptores permiten controlar el voltaje aplicado, mientras que los puntos de control (8) y (9) conectados a las resistencias (R_{1}-R_{6}) permiten la medida de la intensidad de corriente eléctrica y la forma del pulso resultante en cada fila de pocillos.Fig. 3 shows an electrical diagram of the electrical stimulation assembly. The number (6) is the generator of pulses, (1) is the decoupling capacitor, which prevents any direct current flowing through the cellular medium. (S_ {1} -S_ {6}) are the switches that allow the selection of the rows of wells. (S_ {1}), (S_ {3}), (S_ {4}) and (S_ {6}) are used for four-row plates (24 wells), while (S2) and (S5) are used for two row plates (6 wells). The control points (7) located next to the switches allow to control the voltage applied, while the control points (8) and (9) connected to the resistors (R_ {1} -R_ {6}) allow the measurement of electric current intensity and pulse shape resulting in each row of wells.
La Fig. 4 muestra un diagrama de los electrodos en el montaje de estimulación. La Fig. 4A es un esquema lateral del diseño con la posición de los electrodos de pocillo de los extremos conectados en paralelo a las placas, y los electrodos-puente internos, conectados en series, en una fila de una placa de 24 pocillos. La Fig. 4B es una imagen amplificada del diseño de los electrodos, su posición dentro de los pocillos y el vector de intensidad de corriente (I).Fig. 4 shows a diagram of the electrodes in the stimulation assembly. Fig. 4A is a side scheme of the design with well electrode position of the ends connected in parallel to the plates, and the internal bridge electrodes, connected in series, in a row of a 24-well plate. Fig. 4B is an image amplified electrode design, its position within wells and the current intensity vector (I).
La Fig. 5 muestra el diseño de los electrodos de hilo de platino y el campo eléctrico generado a través de los pocillos de una placa. El número (4) son electrodos de pocillo de los extremos y (5) son electrodos-puente. La Fig. 5A muestra el diseño de los electrodos y el campo eléctrico generado cuando la forma de los pocillos es circular. La Fig. 5B muestra el diseño de los electrodos y la corriente generada cuando la forma de los pocillos es cuadrada. El símbolo (I) representa la intensidad de corriente y las flechas dentro de los pocillos indican la dirección de la corriente eléctrica. Los electrodos de pocillo de los extremos (4) comprenden un extremo de conexión (10) y un extremo sumergible (12) que tiene una porción inferior horizontal con forma circular (11) o forma cuadrada (13) dependiendo de la forma del pocillo. Los electrodos-puente (5) comprenden dos extremos sumergibles (12) que tienen una porción inferior horizontal con forma circular (11) o forma cuadrada (13) dependiendo de la forma del pocillo.Fig. 5 shows the design of the electrodes of platinum wire and the electric field generated through the wells of a plate. The number (4) are well electrodes of the ends and (5) are bridge electrodes. Fig. 5A shows the design of the electrodes and the generated electric field when the shape of the wells is circular. Fig. 5B shows the design of the electrodes and the current generated when the form of The wells is square. The symbol (I) represents the intensity of current and the arrows inside the wells indicate the Direction of electric current. Well electrodes of the ends (4) comprise a connection end (10) and a submersible end (12) having a horizontal lower portion with circular shape (11) or square shape (13) depending on the shape of the well. Bridge electrodes (5) they comprise two submersible ends (12) that have a portion horizontal bottom with circular shape (11) or square shape (13) depending on the shape of the well.
La Fig. 6 muestra un esquema de un posible montaje para una placa de 24 pocillos (17), incluyendo una tapa adaptora opcional (16). El número (2) son las dos placas de conexión, (3) es el conjunto completo de electrodos en una fila, y (14) es la cubierta de la placa de cultivo.Fig. 6 shows a schematic of a possible mounting for a 24-well plate (17), including a lid optional adapter (16). The number (2) are the two plates of connection, (3) is the complete set of electrodes in a row, and (14) is the cover of the culture plate.
La Fig. 7 es una sección esquemática de todo el montaje, incluyendo el generador de pulsos de corriente (6) con dos polos de salida (21). El generador de pulsos de corriente está conectado a las dos placas de conexión (2) con medios adecuados (18). Una de las dos placas de conexión comprende un condensador (1). El número (17) es una placa de 24 pocillos, (3) es el conjunto completo de electrodos en una fila, (16) es una tapa adaptadora opcional y (14) es la cubierta de la placa de cultivo. (S_{1}-S_{6}) son los interruptores que permiten la selección de las filas de pocillos.Fig. 7 is a schematic section of the entire assembly, including the current pulse generator (6) with two output poles (21). The current pulse generator is connected to the two connection plates (2) with suitable means (18). One of the two connection plates comprises a capacitor (one). The number (17) is a 24-well plate, (3) is the set full electrode in a row, (16) is an adapter cap optional and (14) is the cover of the culture plate. (S_ {1} -S_ {6}) are the switches that allow the selection of the rows of wells.
Los miotubos de ratón de la línea celular C2C12 se cultivaron en placas de cultivo estándar multipocillo de 6 o 24 pocillos. Para el crecimiento de los mioblastos se utilizó el medio de cultivo Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) conteniendo glucosa 25 mM y suplementado con suero fetal bovino (Gibco) al 10%. Como medio de diferenciación, las células se incubaron con DMEM conteniendo glucosa 25 mM y suplementado con suero de caballo al 10% (Gibco). Los miotubos (es decir, mioblastos fusionados) se utilizaron a partir de siete días tras la inducción de la diferenciación.The mouse myotubes of the C2C12 cell line were grown in standard multiwell plates of 6 or 24 wells. For the growth of myoblasts the medium was used of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) culture containing 25 mM glucose and supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco). As a means of differentiation, the cells were incubated with DMEM containing 25 mM glucose and supplemented with horse serum at 10% (Gibco). Myotubes (i.e., fused myoblasts) are used from seven days after induction of the differentiation.
El montaje de estimulación eléctrica consistía en dos placas de conexión (2), que se colocaron adyacentes a los lados cortos de la placa estándar de cultivo de 6 o 24 pocillos (17) (la Fig. 1 es una fotografía del montaje con una placa de cultivo de 6 pocillos). Estas placas de conexión estaban conectadas al generador de corriente comercial Grass modelo S-48 (6) (no mostrado en la Fig. 1 pero mostrado en la Fig. 7), el cual generaba los pulsos variables eléctricos. Las dimensiones del montaje eran de 24 y 16 cm en los ejes longitudinales y de 5 cm en el vertical. Las placas de conexión distribuían la señal eléctrica a hasta 6 lugares de conexión equivalentes. Para evitar la electrólisis del medio de cultivo, en una de las placas, se conectó en serie un condensador (1) (220 \muF), que producía una señal de corriente alterna. Los electrodos se construyeron con hilo de platino (0.25 cm \phi). Los electrodos de pocillo de los extremos (4) se conectaron a las placas de conexión adyacentes (2) y fueron sumergidos en el medio de cultivo (4 ml por pocillo en las placas de 6 pocillos y 1 ml en las placas de 24 pocillos) de cada pocillo de los extremos (Fig. 4A). La porción del electrodo sumergida en el medio de cultivo se diseñó con forma semicircular (11) que encajaba perfectamente con la forma de la pared de los pocillos (Fig. 2 y 5A). Las dimensiones de los arcos eran de 1 y 2.5 cm para los electrodos de las placas de 24 y 6 pocillos. Los electrodos internos o electrodos-puente (5) conectaban los pocillos internos de cada una de las filas, de dos en dos, de forma que la placa de cultivo quedaba dividida en varias filas independientes y equivalentes. Cada fila podía ser conectada/desconectada con la ayuda de 6 interruptores (S_{1}-S_{6}) incorporados en las placas de conexión (Fig. 1). La resistencia del medio de cultivo en una placa de 24 pocillos llenados con 1 mL era de 227 \Omega a 25°C y 100 Hz, y de 297 \Omega en una placa de 6 pocillos con llenados 4 ml. Se confirmó experimentalmente mediante medidas con un voltímetro, que el campo eléctrico era homogéneo en cada fila. Cuando se aplicaban 20 V a placas de 24 o 6 pocillos llenados con medio salino, la intensidad de corriente en cada fila era de 8.1 \pm 0.1 y 21.6 \pm 0.2 mA, respectivamente. Las placas de conexión (2) y la placa de cultivo (17) colocada entre ambas placas de conexión, se apoyaron sobre un soporte de plástico transparente. Antes de la inmersión en el medio de cultivo, los electrodos de hilo de platino se esterilizaron con etanol al 70% y se dejaron secar bajo luz UV. Las placas de conexión se conectaron mediante cables eléctricos estándar (18) al generador de corriente Grass S-48 (6) (Grass Instruments, Quincy, MA), produciendo voltajes hasta 100 V, duraciones de pulso hasta 100 ms y frecuencias de pulso hasta 10 Hz. Una vez preparado, el montaje de estimulación se colocó dentro de un incubador estándar de células para el mantenimiento de las células en condiciones controladas, permitiendo la realización de experimentos de media y larga duración.The electrical stimulation assembly consisted of two connection plates (2), which were placed adjacent to the sides short of the standard 6 or 24 well culture plate (17) (the Fig. 1 is a photograph of the assembly with a culture plate of 6 wells). These connection plates were connected to the generator Commercial grass model S-48 (6) (no shown in Fig. 1 but shown in Fig. 7), which generated the electric variable pulses. The dimensions of the assembly were 24 and 16 cm in the longitudinal axes and 5 cm in the vertical. The connection plates distributed the electrical signal to up to 6 equivalent connection locations. To avoid electrolysis of culture medium, in one of the plates, a series was connected capacitor (1) (220 µF), which produced a current signal alternate The electrodes were constructed with platinum wire (0.25 cm \ phi). The well electrodes of the ends (4) are connected to adjacent connection plates (2) and were immersed in the culture medium (4 ml per well in the plates 6 wells and 1 ml in 24 well plates) of each well of the ends (Fig. 4A). The portion of the electrode submerged in the culture medium was designed with semicircular shape (11) that fit perfectly with the shape of the wall of the wells (Fig. 2 and 5A). The dimensions of the arches were 1 and 2.5 cm for 24 and 6 well plate electrodes. Electrodes internal or bridge electrodes (5) connected the internal wells of each of the rows, two by two, so that the culture plate was divided into several rows independent and equivalent. Each row could be connected / disconnected with the help of 6 switches (S_ {1} -S_ {6}) incorporated in the plates connection (Fig. 1). The resistance of the culture medium on a plate of 24 wells filled with 1 mL was 227 Ω at 25 ° C and 100 Hz, and 297 Ω in a 6-well plate with 4 ml fillings. It was experimentally confirmed by measurements with a voltmeter, that the electric field was homogeneous in each row. When applied 20 V to 24 or 6 well plates filled with medium saline, the current intensity in each row was 8.1 ± 0.1 and 21.6 ± 0.2 mA, respectively. Connecting plates (2) and the culture plate (17) placed between both plates of connection, they leaned on a transparent plastic support. Before immersion in the culture medium, the electrodes of Platinum wire were sterilized with 70% ethanol and left dry under UV light. The connection plates were connected by standard electrical cables (18) to the grass current generator S-48 (6) (Grass Instruments, Quincy, MA), producing voltages up to 100 V, pulse durations up to 100 ms and pulse frequencies up to 10 Hz. Once prepared, assembly of stimulation was placed inside a standard incubator of cells for keeping cells in conditions controlled, allowing the performance of media experiments and Long duration.
La observación bajo el microscopio óptico reveló que la gran mayoría de las células de la monocapa contraían sincrónicamente a voltajes superiores a 15 V y duraciones de pulso por encima de 1 ms. La estimulación a diferentes frecuencias: baja (1 Hz), media (3 Hz) o alta (5 Hz) causaron la contracción sincrónica de la gran mayoría de las células de la monocapa de acuerdo con las condiciones programadas en el generador de corriente.The observation under the optical microscope revealed that the vast majority of monolayer cells contracted synchronously at voltages higher than 15 V and pulse durations above 1 ms. Stimulation at different frequencies: low (1 Hz), medium (3 Hz) or high (5 Hz) caused the contraction synchronous of the vast majority of monolayer cells of according to the conditions programmed in the generator stream.
Se evaluó si la estimulación eléctrica de larga duración podía afectar a la viabilidad celular. Con este propósito, el generador se puso a 50 V, 30 ms y 3 Hz, condiciones eléctricas que producen una contracción efectiva. El período de estimulación fue de 90 min. Al final del período de estimulación, se analizó la liberación de lactato deshidrogenasa en el medio de cultivo. Esta actividad fue usada como marcador de alteraciones en la integridad de la membrana celular. La actividad lactato deshidrogenasa se midió espectrofotométricamente en tampón fosfato 100 mM (pH 7.4) que contenía NADH 0.1 mM y piruvato 0.3 mM. La actividad lactato deshidrogenasa fue equivalente en medio de cultivo de células en reposo (no estimuladas eléctricamente) y células en contracción (estimuladas eléctricamente) (17.9 \pm 0.6 y 17.3 \pm 0.3 U/I, respectivamente, valores presentados como la media \pm EEM). Para los análisis estadísticos se utilizó el test de la t de Student. Un valor de P< 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Estos datos demostraron que los electrodos de platino, que tiene una baja resistencia y es un material inocuo, permitían períodos de media y larga duración de estimulación eléctrica sin comprometer la viabilidad celular.It was evaluated whether long-term electrical stimulation could affect cell viability. For this purpose, the generator was set at 50 V, 30 ms and 3 Hz, electrical conditions that produce an effective contraction. The stimulation period was 90 min. At the end of the stimulation period, the release of lactate dehydrogenase in the culture medium was analyzed. This activity was used as a marker of alterations in the integrity of the cell membrane. Lactate dehydrogenase activity was measured spectrophotometrically in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM NADH and 0.3 mM pyruvate. Lactate dehydrogenase activity was equivalent in culture medium of resting cells (not electrically stimulated) and contracting cells (electrically stimulated) (17.9 ± 0.6 and 17.3 ± 0.3 U / I, respectively, values presented as the mean ± EEM). For the statistical analyzes, the Student t test was used. A value of P <0.05 was considered statistically significant. These data showed that platinum electrodes, which have a low resistance and are an innocuous material, allowed periods of medium and long duration of electrical stimulation without compromising cell viability.
Los miotubos de la línea celular C2C12 se incubaron con medio que contenía glucosa 25 mM para inducir la máxima acumulación de glicógeno, debido a que el glicógeno es la principal reserva para proporcionar energía para la contracción. A continuación, se cambiaron las células a un medio con glucosa 5 mM y fueron sometidas a estimulación eléctrica a 50 V, 30 ms y 3 Hz, o no estimuladas, durante 90 min. Al final del período de estimulación se analizó la retirada de la glucosa del medio de cultivo. La concentración de glucosa se analizó enzimáticamente en un autoanalizador Cobas Fara II (Roche) utilizando el kit GlucoQuant (Roche Molecular Biochemicals). La retirada de glucosa del medio de cultivo fue mayor en las células estimuladas eléctricamente (3.3 \pm 0.2 \mumol glucosa/mg proteína/h) que en células en reposo (2.1 \pm 0.4 \mumol glucosa/mg proteína/h). Los datos se presentan como la media \pm EEM. Para los análisis estadísticos se utilizó el test de la t de Student. Un valor de P< 0.05 se consideró estadísticamente significativo.The C2C12 cell line myotubes were incubated with medium containing 25 mM glucose to induce maximum glycogen accumulation, because glycogen is the main reserve to provide energy for contraction. The cells were then changed to a medium with 5 mM glucose and subjected to electrical stimulation at 50 V, 30 ms and 3 Hz, or not stimulated, for 90 min. At the end of the stimulation period, the withdrawal of glucose from the culture medium was analyzed. The glucose concentration was analyzed enzymatically in a Cobas Fara II (Roche) autoanalyzer using the GlucoQuant kit (Roche Molecular Biochemicals). The removal of glucose from the culture medium was greater in electrically stimulated cells (3.3 ± 0.2 µmol glucose / mg protein / h) than in resting cells (2.1 ± 0.4 µmol glucose / mg protein / h). Data are presented as the mean ± SEM. For the statistical analyzes, the Student t test was used. A value of P <0.05 was considered statistically significant.
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2003
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| WO2022079330A1 (en) * | 2020-10-13 | 2022-04-21 | Universidad De Murcia | Device for the in vitro application of needle electrolysis |
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