ES2259024T3 - Factor estimulador de colona mieloide y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Método para aumentar el número de progenitores mieloides in vitro en una población de células, que comprende la etapa de poner en contacto dicha población de células con una CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1).

Description

Factor estimulador de colonia mieloide y usos del mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de que la hialuronidasa humana de la que se ha informado anteriormente, HYAL1, es en realidad un nuevo miembro de una clase de moléculas conocidas colectivamente como factores estimuladores de colonia mieloide.

Antecedentes de la invención

Los factores estimuladores de colonias son proteínas que pueden influir en el crecimiento y la diferenciación de las células responsables de los componentes celulares en la sangre del organismo. Los factores estimuladores de colonias se han definido tradicionalmente por su capacidad para estimular el crecimiento de colonias de células de la médula ósea en medios semisólidos. Los factores estimuladores de colonias de macrófagos son una subclase de factores estimuladores de colonias que desempeñan un papel en la regulación de las respuestas inmunitarias estimulando la proliferación y la diferenciación de los macrófagos a partir de células progenitoras hematopoyéticas inmaduras e induciendo las funciones efectoras de los macrófagos maduros incluyendo la secreción del interferón gamma, el factor de necrosis tumoral y actividades estimuladoras de colonias distintas a M-CSF.

La capacidad de ciertos factores producidos en concentraciones muy bajas en una variedad de tejidos para estimular el crecimiento y el desarrollo de células progenitoras de la médula ósea en granulocitos y/o macrófagos se conoce desde hace muchos años. La presencia de tales factores en sueros, muestras de orina y extractos tisulares de varias especies se puede demostrar utilizando ensayos que miden la estimulación de la formación de colonias mediante células de la médula ósea sembradas en placa en medio de cultivo semisólido. No se ha demostrado en ensayos in vivo. Todos estos factores inducen la formación de tales colonias, y los factores se han llamado colectivamente factores estimuladores de colonias (CSF).

Los factores estimuladores de colonias se han purificado a partir de varias fuentes tisulares y especies. La patente japonesa número 8.020.599 enseña una célula mieloide de rata derivada del factor estimulador de colonias que puede estimular macrófagos tímicos y células de microglía de rata. Algunos factores estimuladores de colonias son especies limitadas en su actividad, de manera que los CSF derivados de una especie pueden carecer de actividad formadora de colonias en especies vagamente relacionadas (Shanafelt et al J Biol Chem 1991 Jul 25; 266 (21): 13804-10).

Se ha demostrado que hay al menos tres subclases de proteínas CSF humanas definidas según los tipos de células encontradas en las colonias resultantes. Una subclase, CSF-1, da como resultado colonias que contienen predominantemente macrófagos. Otras subclases producen colonias tanto de granulocitos neutrófilos como de macrófagos; que contienen exclusivamente granulocitos neutrófilos; y que contienen granulocitos neutrófilos y eosinófilos y macrófagos.

En la publicación internacional PCT WO87/03204 y en la patente de los EE.UU. número 4.482.485 se informa del tratamiento de pacientes que padecen SIDA con factores estimuladores de colonias, solos o junto con eritropoyetina y/o un agente antivírico y/o IL-2. Estas referencias enseñan que los CSF pueden utilizarse para un papel de apoyo en el tratamiento del cáncer. Además, el documento EP 118.915 informa de la producción de CSF para prevenir y tratar granulocitopenia y macrofagocitopenia en pacientes que reciben tratamiento contra el cáncer, para prevenir infecciones y para tratar pacientes con implante de médula ósea. Además, los CSF estimulan actividad tumoricida no específica (Ralph et al, Immunobiol 172:194-204, 1986). Los CSF no tienen un papel directo inmediato en la activación de los macrófagos para actividades tumoricidas y microbiocidas frente a fibrosarcoma 1023, linfoma 18-8, y amastigotes de L. tropica (Ralph et al., 76: 10-21, 1983). La combinación de CSF-1 y linfocina tiene un efecto tumoricida añadido sobre las células diana TU5 de sarcoma murino (Ralph et al., Cell. Immunol. 105: 270-279, 1987). Warren et al. (J Immunol. 137: 2281-2285, 1986) describen que los CSF estimulan la producción por parte de los monocitos de interferón, TNF y actividad estimuladora de colonias. Lee et al. (J. Immunol. 138: 3019-3022, 1987) describen resistencia inducida por CSF a la infección vírica en macrófagos murinos.

Natowicz Marvin R et al. New England Journal of Medicine, vol. 335, nº 14, 1996, páginas 1029-1033, XP001007
461 ISSN: 0028-4793 describe un estado de enfermedad en un paciente humano asociado a deficiencia genética de hialuronidasa.

Triggs-Raine Barbara et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, vol. 96, nº 11, 25 de mayo de 1999 (1999-05-25), páginas 6296-6300, XP002172530 25 de mayo de 1999 ISSN: 0027-8484 demuestra que la enfermedad en un paciente humano asociada a la deficiencia genética de hialuronidasa en la que la actividad de la hialuronidasa humana está ausente del plasma (mucopolisacaridosis IX) se debe a dos tipos de mutaciones (de única base que da como resultado una sustitución de aminoácido no conservativa y la redisposición intragénica compleja que da como resultado un codón de terminación prematuro) en el gen de la HYAL1 que codifica para la hialuronidasa plasmática humana.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la proteína humana HYAL1, con actividad hialuronidasa notificada previamente, tiene una potente actividad estimuladora de colonias. Por este motivo, a esta molécula se le da en el presente documento el nuevo nombre de CSF5-hialuronidasa (HYAL-1).

Una realización de la invención es un método para aumentar el número de progenitores mieloides in vitro en una población de células, que comprende la etapa de poner en contacto la población de células con una CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1).

La invención proporciona además una CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1), para su uso en el aumento del número de progenitores mieloides en una población de células en un mamífero con un estado mielosuprimido. En una realización, CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) es para su uso junto con un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en cirugía, radioterapia y quimioterapia. En ciertas realizaciones, la mielosupresión está asociada con radiación, quimioterapia o infección vírica.

La invención incluye además un ácido nucleico que codifica operativamente para la CSF5-hialuronidasa (HYAL-1), de manera que la CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) se exprese en un mamífero, para tratar un mamífero con un estado mielosuprimido. El ácido nucleico puede estar ventajosamente en un vector de expresión, preferiblemente unido operativamente a un promotor, que puede ser, por ejemplo, un promotor exógeno, un promotor inducible, un promotor vírico, un promotor constitutivo o un promotor humano heterólogo.

Un aspecto adicional de la presente invención es un método para estimular la producción de citocinas por las células mieloides in vitro, que comprende la etapa de poner en contacto dichas células mieloides con CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1). La invención proporciona además una CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1) para su uso en la estimulación de la producción de citocinas por las células mieloides en un mamífero que padece una inmunodeficiencia. Las citocinas contempladas en la presente invención incluyen, por ejemplo, interferón, interleucina, factor de necrosis tumoral y factor estimulador de colonias mieloides.

La presente invención proporciona además el uso de CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) o ADN que codifica para la CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) en la preparación de un medicamento para tratar la insuficiencia de células mieloides.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de la actividad estimuladora de colonias asociada con una proteína conocida en la bibliografía como HYAL1. Esta proteína representa un nuevo miembro de la familia del factor estimulador de colonias de la subclase monocítica, y tiene una única función dual porque la proteína recombinante y purificada bioquímicamente también posee actividad de degradación de glucosaminoglucanos hacia sulfatos de condroitina y hialuronano en condiciones ácidas. Esta proteína, conocida anteriormente como HYAL1, se ha purificado, clonado y secuenciado recientemente en virtud de su actividad de degradación de glucosaminoglucanos o actividad hialuronidasa (Frost et al, Biochem. Binphys. Res. commun. 236: 5-10, 1997). Se han identificado seis secuencias parálogas para HYAL1 en el genoma humano (Csoka et al, Genomics 1999 Sep 15; 60 (3): 356-61). Se han identificado genes similares a los de la hialuronidasa en otras especies de mamíferos, incluyendo el ratón y la rata (Strobl et al, Genomics 1998 Oct 15; 53(2): 214-9) (Número de registro de Genbank 4104235). La relación ortóloga entre tales genes no se ha establecido en algunas especies.

Antes de la presente invención, no se había atribuido actividad mieloestimuladora o estimuladora de colonias a esta enzima de degradación de glucosaminoglucanos. La enzima HYAL1 tiene alta especificidad y está presente predominantemente en el plasma humano a una concentración de 20-50 \mug/ml (Frost et al, 1997). Debido a su actividad CSF, el producto del gen de la HYAL1 debe volver a definirse como CSF5-hialuronidasa.

La CSF5-hialuronidasa humana ayuda la proliferación y/o diferenciación de monocitos in vitro. Esta propiedad novedosa del producto génico se identificó a partir del tratamiento de monocitos de sangre periférica humana in vitro con CSF5-hialuronidasa recombinante producida tal como se describe en los ejemplos más adelante. Basándose en este descubrimiento, la CSF5-hialuronidasa y los vectores que codifican para esta proteína son adecuados para su uso en el apoyo de la hematopoyesis in vivo, y en el tratamiento de deficiencias inmunitarias asociadas con quimioterapia o infección vírica.

La CSF5-hialuronidasa también se utiliza en la presente invención para aumentar el número de monocitos en una población de células al poner en contacto la población de células con una cantidad efectiva de la proteína. Esta cantidad efectiva está, en general, entre aproximadamente 0,01 \mug/ml y 100 mg/ml, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 \mug/ml y 10 mg/ml, y más preferiblemente entre aproximadamente 1 \mug/ml y 1 mg/ml. Estas cantidades pueden optimizarse para cualquier población de células utilizando curvas patrón dosis-respuesta. Esto es útil para producir grandes números de monocitos cultivados que pueden utilizarse terapéuticamente o para ensayos de detección para descubrir compuestos que puedan estimular la liberación de las citocinas de los monocitos. También pueden utilizarse in vivo para tratar la insuficiencia de células mieloides.

Debe observarse que las realizaciones referidas de la presente invención utilizan CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente. "Derivada exógenamente", en el contexto del tratamiento de una población de células o un mamífero, se define como la CSF5-hialuronidasa que se ha introducido en un sistema, tal como la CSF5-hialuronidasa producida de forma recombinante, la CSF5-hialuronidasa purificada o aislada, la CSF5-hialuronidasa producida a partir de otro organismo o la CSF5-hialuronidasa purificada previamente a partir de tejidos o fluidos del mismo organismo, en un punto de tiempo diferente. La CSF5-hialuronidasa producida por un polinucleótido introducido exógenamente que codifica para esa proteína también se define como "derivada exógenamente" para los fines de la presente invención.

Aunque en el presente documento se describen diversos métodos de tratamiento de poblaciones de células y mamíferos (incluyendo seres humanos y mamíferos no humanos), se apreciará que la presente invención también contempla la CSF5-hialuronidasa (o el polinucleótido que codifica para la CSF5-hialuronidasa) para su uso en todos y cada uno de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento. La presente invención también contempla el uso de la CSF5-hialuronidasa (o el polinucleótido que codifica para la CSF5-hialuronidasa) en la preparación de un medicamento para la práctica de todos y cada uno de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento. Tales medicamentos se preparan normalmente mediante la formulación de la CSF5-hialuronidasa con un vehículo farmacéuticamente aceptable, o de un tipo bien conocido. Tales vehículos normalmente son vehículos inyectables, aunque también se contemplan las formulaciones inhalables y otros métodos de administración de proteínas.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos para estimular la producción de citocinas por los monocitos, particularmente el interferón, el factor de necrosis tumoral y el CSF mieloide, mediante el tratamiento de los monocitos con una cantidad efectiva de CSF5, ya sea natural o recombinante. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para estimular la destrucción de las células diana por los macrófagos, para estimular la producción de glóbulos blancos a partir de las células madre o estimular el sistema inmunitario de un sujeto, para inducir resistencia a las infecciones víricas en macrófagos, para promover la curación de heridas y para tratar las células tumorales utilizando una cantidad efectiva para tratar el tumor de CSF5-hialuronidasa de la presente invención. Además, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas y terapéuticas que comprenden CSF5-hialuronidasa, y a la mezcla de las mismas con un excipiente o una citosina o linfocina.

En otra realización de la presente invención, se proporcionan métodos para la estimulación de las células del linaje monocítico por medio de la transferencia de genes de los ácidos nucleicos que codifican para la CSF5-hialuronidasa. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, hay numerosos métodos disponibles para expresar un gen, todos los cuales se contemplan para su uso según la presente invención. En un aspecto particular de la presente invención, se lleva a cabo la expresión génica de la CSF5-hialuronidasa mediante la introducción de ADNc que codifica para la CSF5-hialuronidasa en un constructo génico (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 8 para la secuencia del ARNm de la CSF5 hialuronidasa humana). La expresión de CSF5 por medio de la transferencia mediada por virus (por ejemplo retrovirus, adenovirus), ácido nucleicos desnudos y otros medios conocidos por los expertos en la técnica son métodos disponibles para transferir el gen de la CSF5-hialuronidasa en un paciente. Felgner et al. (Hum. Gene Ther. 8:511-512, 1997) describen los sistemas de administración de genes e incluyen sistemas de administración catiónicos basados en lípidos (lipoplex), sistemas de administración basados en policationes (polyplex) y una combinación de los mismos (lipopolyplex), todos los cuales se contemplan para su uso en la presente invención.

Los sistemas vector-huésped para la expresión de CSF5-hialuronidasa pueden ser procariotas o eucariotas, aunque se prefieren los vectores de expresión eucariotas. Muchos de tales vectores de expresión se conocen y están comercialmente disponibles. Las técnicas convencionales para la construcción de estos vectores de expresión son bien conocidas y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook et al., o en cualquiera de los manuales de laboratorio ampliamente disponibles sobre la tecnología de ADN recombinante. La expresión puede llevarse a cabo, por ejemplo, transformando células procariotas o eucariotas con un vector adecuado que codifique para la CSF5-hialuronidasa. La secuencia de ADN puede expresarse directamente en células de mamífero bajo el control de un promotor adecuado. Pueden utilizarse promotores heterólogos bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de tales promotores incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor de SV40, el promotor del virus herpes simple (HSV), el promotor del gen de la timidina cinasa (TK), el promotor del gen temprano inmediato del adenovirus y repeticiones terminales largas de retrovirus. El uso de promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejidos está dentro del alcance de la presente invención. El vector de expresión también contiene normalmente un marcador seleccionable, tal como de resistencia a antibióticos, para seleccionar las células que están expresando la proteína. Pueden incorporarse otros elementos de secuencia de nucleótidos en los vectores de expresión para facilitar la integración del ADN en los cromosomas, la expresión del ADN y la clonación del vector. Por ejemplo, la presencia de potenciadores (enhancers) en el sentido de 5' del promotor o de terminadores en el sentido de 3' de la región codificante puede facilitar la expresión del ácido nucleico contenido dentro del vector de
expresión.

Con el fin de expresar la CSF5-hialuronidasa en células procariotas o de levaduras, normalmente se elimina la secuencia líder (o secuencia de secreción). Esto puede realizarse utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Una vez que se obtiene el clon deseado de ADNc de la CSF5-hialuronidasa, se utilizan medios conocidos y apropiados para expresar la proteína CSF, por ejemplo, la inserción en un vector apropiado y la transfección del vector en una célula huésped apropiada, la selección de las células transformadas y el cultivo de estos transformantes para expresar la actividad del CSF. Tales métodos se describen en detalle por Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, última edición y por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, última edición. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, por ejemplo E. coli, levaduras, células de mamífero por ejemplo CHO, y de insectos, por ejemplo las células Sf9. La proteína CSF5-hialuronidasa así producida puede tener un grupo metionina en el extremo N-terminal de la proteína (denominado en el presente documento Met-CSF). La proteína madura producida por las células procariotas y eucariotas será idéntica, por lo demás, en la secuencia de aminoácidos, pero el producto eucariota puede glucosilarse en un grado igual o diferente al del producto natural. En los ejemplos descritos más adelante se ilustran diversos métodos de obtener la proteína CSF según la convención. Pueden utilizarse diversos métodos de transfección celular, incluyendo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección y fusión celular. Otros métodos o materiales, por ejemplo, vectores, serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica partiendo de la base de los ejemplos y de la descripción anterior.

Pueden usarse composiciones farmacéuticamente aceptables de CSF5-hialuronidasa para tratar mamíferos que padecen monocitopenia, particularmente los asociados con radiación, quimioterapia e infecciones víricas. La monocitopenia se define como una disminución anómala en la proporción de monocitos en la sangre. Puede tratarse una variedad de huésped mamíferos según la invención objeto. Tales huéspedes incluyen mamíferos poco comunes o valiosos, mascotas y ganado, seres humanos, y similares.

Tal como se trató anteriormente, los métodos objeto dan como resultado el aumento en las células del linaje monolítico mediante la administración de una proteína recombinante de CSF5-hialuronidasa o ácido nucleico que codifica para la misma. La CSF5-hialuronidasa puede usarse en combinación con modalidades de tratamiento adicionales, incluyendo cirugía, radioterapia y quimioterapia. Los expertos en la técnica conocen los métodos de cirugía para biopsia y reducción o eliminación de la masa tumoral. Los expertos en la técnica también conocen la radioterapia, e incluye radiación electromagnética, por ejemplo, rayos X de alta frecuencia, y radiación de partículas subatómicas, por ejemplo, partículas alfa, partículas beta, neutrones, protones, mesones, e iones pesados. Finalmente, se conoce una variedad de agentes quimioterápicos y métodos para su uso en el tratamiento contra el cáncer, e incluyen: algentes alquilantes, por ejemplo, clorhidrato de mecloretamina (mostaza nitrogenada, Mustargen, HN2), ciclofosfamida (Cytovan, Endoxana), ifosfamida (IFEX), clorambucilo (Leukeran), melfalano (mostaza de fenilalanina, L-sarcolisina, Alkeran, LPAM), busulfano (Myleran), tiotepa (trietilentiofosforamida), carmustina (BiCNU, BCNU), lomustina (CeeNU, CCNU), estreptozocina (Zanosar), y similares; alcaloides vegetales, por ejemplo, vincristina (Oncovin), vinblastina (Velban, Velbe), paclitaxel (Taxol), y similares; antimetabolitos, por ejemplo, metotrexato (MTX), mercaptopurina (Purinethol, 6-MP), tioguanina (6-TG), fluorouracilo (5-FU), citarabina (Cytosar-U, Ara-C), azacitidina (Mylosar, 5-AZA), y similares; antibióticos, por ejemplo, dactinomicina (actinomicina D Cosmegen), doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina (daunomicina, Cerubidine), idarrubicina (Idamycin), bleomicina (Blenoxane), plicamicina (Mithramycin, Mithracin), mitomicina (Mutamycin), y similares, y otros agentes proliferativos anticelulares, por ejemplo, hidroxiurea (Hydrea), procarbazina (Matulane), dacarbazina (DTIC-Dome), cisplatino (Platinol), carboplatino (Paraplatin), asparaginasa (ELspar) etopósido (VePesid, VP-16213), amsacrina (AMSA, m-AMSA), mitotano (Lysodren), mitoxantrona (Novatrone), y similares.

Mediante el uso de los métodos objeto en combinación con una o más de las modalidades de tratamiento convencionales revisadas anteriores, puede controlarse la sincronización de las diferentes modalidades, de manera que se obtengan resultados óptimos con respecto a los efectos beneficiosos en las células del linaje monocítico.

Las composiciones farmacéuticamente aceptables contempladas para su uso en la práctica de la presente invención pueden utilizarse en la forma de un sólido, una disolución, una emulsión, una dispersión, una micela, un liposoma, y similares, en los que la composición resultante contiene uno o más de los compuestos activos contemplados para su uso en el presente documento, como principios activos de los mismos, en mezcla con un vehículo orgánico o inorgánico o excipiente adecuado para aplicaciones nasales, enterales o parenterales. Los principios activos pueden combinarse, por ejemplo, con vehículos habituales no tóxicos, farmacéutica o fisiológicamente aceptables para comprimidos, grageas, cápsulas, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o gránulos, supositorios, soluciones, emulsiones, suspensiones, cápsulas duras o blandas, comprimidos oblongos o jarabes o elixires y cualquier otra forma adecuada para su uso. Los vehículos que pueden usarse incluyen glucosa, lactosa, goma arábiga, gelatina, manitol, pasta de almidón, trisilicato de magnesio, talco, almidón de maíz, queratina, sílice coloidal, almidón de patata, urea, triglicéridos de longitud de cadena media, dextranos, y otros vehículos adecuados para su uso en la obtención de las preparaciones, en forma sólida, semisólida o líquida. Además, también pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes y colorantes. Los compuestos activos contemplados para su uso en el presente documento se incluyen en la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado sobre el proceso, estado o enfermedad objetivo.

Además, tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados de agentes aromatizantes (tales como menta, esencia de gaulteria o cereza), agentes colorantes, agentes conservantes, y similares, con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables. Los comprimidos que contienen los principios activos en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos también pueden obtenerse mediante métodos conocidos. Los excipientes utilizados pueden ser, por ejemplo, (1) diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, lactosa, fosfato de calcio, fosfato de sodio, y similares; (2) agentes de granulación y disgregación, tales como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares, (3) agentes aglutinantes, tales como goma tragacanto, almidón de maíz, gelatina, goma arábiga, y similares; y (4) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, y similares. Los comprimidos pueden estar no recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregación y la absorción en el tracto gastrointestinal, proporcionando así la acción sostenida durante un periodo más largo. Por ejemplo, puede utilizarse un material de retraso en el tiempo, tal como el monoestearato de glicerol o el diestearato de glicerol. Los comprimidos también pueden recubrirse mediante las técnicas descritas en las patentes de los EE.UU. números 4.256.108; 4.160.452; y 4.265.874, para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para la liberación controlada.

Cuando las formulaciones para el uso oral están en la forma de cápsulas de gelatina duras, los principios activos pueden mezclarse con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio, caolín, o similares. También pueden estar en la forma de cápsulas de gelatina blandas, en las que los principios activos se mezclan con agua o un medio aceitoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida, aceite de oliva y similares.

Las formulaciones también pueden estar en la forma de una suspensión inyectable estéril. Tal suspensión puede formularse según métodos conocidos utilizando agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una suspensión o solución inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,4-butanodiol. Los aceites estériles y fijos se emplean convencionalmente como medio disolvente o de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite blando y fijo, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos (incluyendo el ácido oleico), aceites vegetales que se producen en la naturaleza como aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, etc., o vehículos grasos sintéticos, como oleato de etilo o similares. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes, y similares, según se requiera.

Las formulaciones contempladas para su uso en la práctica de la presente invención también pueden administrarse en la forma de supositorios para la administración rectal de los principios activos. Estas composiciones pueden prepararse mezclando los principios activos con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos de polietilenglicoles (que son sólidos a temperaturas ordinarias, pero que se licuan y/o disuelven en la cavidad rectal para liberar los principios activos), y similares.

Además, también pueden usarse sistemas de liberación sostenida, incluyendo matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos conformados (por ejemplo, películas o microcápsulas) para la administración del compuesto activo empleado en el presente documento. La CSF5-hialuronidasa también puede proporcionarse como una dosis unitaria, tal como un vial sellado con septo, o bien liofilizada o en solución acuosa.

La cantidad de CSF5-hialuronidasa administrada a un paciente variará dependiendo del estado que vaya a tratarse, la gravedad del estado y la respuesta del paciente al tratamiento. En general, la cantidad de CSF5-hialuronidasa administrada está entre aproximadamente 0,01 \mug/kg y 1.000 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 \mug/kg y 100 mg/kg, y más preferiblemente entre aproximadamente 1 \mug/kg y 10 mg/kg. La optimización de la dosis puede realizarse usando curvas patrón dosis - respuesta.

Ejemplo 1 Purificación de la hialuronidasa-CSF5 humana

En dos litros de plasma humano (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA), se disolvió azida sódica al 0,02%, NaCl 50 mM, sacarosa al 5% y Triton X-114 al 7,5% (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) a 4ºC con agitación durante 90 min, seguido por centrifugación a 10.000 x g durante 30 min. El plasma se sometió entonces a extracción de fases inducida por temperatura a 37ºC. El extracto se centrifugó a 10.000 x g durante 30 min a 37ºC para clarificar las dos fases. Se extrajo la fase rica en detergente y se diluyó hasta 2 L con ácido (N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-[2-etanosulfónico]) (HEPES) 50 mM helado, pH 7,5, NaCl 0,15 M, seguido por repartición a 37Cº con centrifugación. Este procedimiento de lavado se repitió tres veces. La fase de detergente final se diluyó seis veces con ácido (2-[N-morfolino]etanosulfónico) (MES) 25 mM, pH 6,0, y se añadieron 20 mL de resina de intercambio catiónico SP-Sepharose equilibrada (Pharmacia, Piscataway NJ) y se agitó durante la noche a 4ºC. Las perlas se recogieron por centrifugación y se lavaron con MES 25 mM, pH 6,0, que contenía octilglucósido 46 mM (Boehringer Mannheim). La CSF5-hialuronidasa se eluyó a partir de las perlas por la adición de NaCl 0,3 M en tampón MES, pH 6,0 con varios lavados. El eluyente de SP-Sepharose se concentró por ultrafiltración utilizando una membrana YM3 (Amicon, Beverly, MA) y se desaló en PO_{4} 10 mM, pH 7,4 con NaCl 25 mM, octilglucósido 46 mM sobre FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas). Fast-Desalting column (columna de desalación rápida) (Pharmacia). La preparación de hialuronidasa se combinó entonces con 10 mL de resina de hidroxiapatita (Biorad, Richmond, CA) equilibrada en el mismo tampón, y se dejó sobre un oscilador durante la noche a 4ºC. La CSF5-hialuronidasa no se adsorbió a la resina y se recuperó en el sobrenadante. El sobrenadante se concentró entonces hasta 0,5 mL en un concentrador Centriplus YM3 (Amicon, Beverly, MA), y se aplicó a un gel de poliacrilamida al 12,5% en un Phast Gel System (electroforesis en gel con gradiente de pH) (Pharmacia), después se tiñó con plata según las instrucciones del fabricante para garantizar la pureza. Las determinaciones de proteína se midieron durante toda la purificación utilizando los ensayos de Lowry (Pierce, Rockford, IL) o Bradford (Biorad) con BSA como patrón.

La CSF5-hialuronidasa se repartió en la fase de detergente de Triton X-114 inducida por la temperatura y dio un enriquecimiento de 60 veces. La actividad fue muy estable a 37ºC en presencia de detergentes no iónicos. Se realizó la eliminación del Triton X-114 mediante la absorción discontinua en una resina de intercambio catiónico SP-Sepharose. La preparación posterior a la SP-Sepharose pudo purificarse hasta la homogeneidad tal como se determina por la tinción con plata. La adsorción discontinua utilizando resina de hidroxiapatita dio como resultado una purificación global de 1,5 millones de veces. La actividad específica de la actividad enzimática de la CSF5-hialuronidasa (100.000 rTRU/mg (unidades de reducción de la turbidez relativa/mg)) fue aproximadamente equivalente a los valores notificados para la hialuronidasa de esperma, PH-20 (Harrison, Biochem. J. 252: 865-874, 1988), por lo que se descartó la contaminación del factor enzimático con un contaminante menor del factor estimulador de colonias. La proteína migró en SDS-PAGE con una masa molecular relativa de 57 kDa.

Ejemplo 2 Generación de anticuerpos monoclonales anti-CSF5-hialuronidasa

Se inmunizaron ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad utilizando el antígeno purificado a partir de la etapa tras la hidroxiapatita descrita en el ejemplo 1 usando procedimientos establecidos (Harlow, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Se obtuvieron hibridomas mediante la fusión de células del bazo con células de mieloma utilizando el patrón Ed Harlow, D. L Antibodies: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1988). Se seleccionaron los hibridomas que secretaban anticuerpos anti-CSF5-hialuronidasa mediante un ensayo de captura de enzimas modificado. El sustrato de enzimas bHA (Frost et al. 1997a Anal Biochem. 251:263-9.) se recubrió con placas Covalink (Placerville, NJ) en las mismas condiciones que las descritas para el ensayo enzimático basado en microtítulo (Frost et. al 1997a) excepto en que se incluyeron 1,25 \mug/pocillo de IgG de cabra anti-ratón (Jackson Immunolabs, West Grove, PA) con la bHA, de manera que tanto bHA como la IgG de cabra anti-ratón estuvieran covalentemente unidas a las placas. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con plasma humano diluido durante 60 min a 37ºC seguido por incubación en las placas de bHA/IgG anti-ratón durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron 5 veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contenía Triton X-100 al 1%, y BSA (albúmina de suero bovino) 10 mg/ml, seguido por la adición de tampón de ensayo de formiato e incubación a 37ºC durante 60 min. Se detectó bHA digerido como resultado de la CSF5-hialuronidasa inmunoprecipitada como en el ensayo patrón.

Se desarrolló un ensayo de captura de enzimas para seleccionar hibridomas que explotaba la carencia de actividad de la CSF5-hialuronidasa a pH neutro y el hecho de que la proteína no tenía afinidad de unión por HA por encima de pH 4,5, tal como se determina por la cromatografía de afinidad HA-Sepharose. Los sobrenadantes de los hibridomas se incubaron con plasma sin procesar a pH neutro en las placas de microtítulo de bHA/IgG anti-ratón para inmunoprecipitar el complejo anticuerpo-antígeno. Se identificaron ocho clones de veinte placas de fusión de hibridomas utilizando este procedimiento de detección. Se utilizó un clon de la clase de IgG2a, el 17E9, para generar ascitis. La adición de diluciones seriadas del anticuerpo 17E9 en plasma humano seguido por inmunoprecipitación con proteína-A dio como resultado la precipitación de toda la actividad hialuronidasa activa ácida detectable.

Ejemplo 3 Purificaciones por inmunoafinidad e inmunoprecipitación

Se utilizó la IgG2a purificada a partir del clon de hibridoma anti-CSF5-hialuronidasa 17E9 preparado tal como se describe en el ejemplo 2 para purificaciones e inmunoprecipitación habituales. Para la inmunoprecipitación de la CSF5-hialuronidasa a partir del plasma, se mezclaron diluciones seriadas de la IgG 17E9 purificada o de la IgG2a de ratón control con plasma diluido en tampón RIPA (NP40 al 1%, desoxicolato al 1 %, Triton X-100 1%, EDTA 5 mM en PBS), seguido por inmunoprecipitación con perlas de proteína A. Entonces se midió la actividad de la CSF5-hialuronidasa residual en el sobrenadante en el ensayo de microtítulo. Para la purificación por inmunoafinidad de la CSF5-hialuronidasa, se acoplaron 3 mg de IgG purificada a partir del clon de hibridoma 17E9 a 1 mL de columna activa Hi-Trap-NHS (Pharmacia). Plasma o medio condicionado recombinante de CSF5-hialuronidasa de células renales embrionarias humanas HEK-293 se diluyó 1:2 con tampón RIPA y se hicieron pasar a través de una columna con IgG anti-CSF5-hialuronidasa. La columna se lavó primero con PBS que contenía NaCl 2 M, octilglucósido 100 mM seguido por lavado con citrato 100 mM pH 4,0, NaCl 0,15 M y octilglucósido, y luego se eluyeron con el mismo tampón ajustado a pH 3,0.

La hialuronidasa pudo purificarse hasta la homogeneidad en una única etapa a partir de plasma humano por cromatografía de inmunoafinidad usando los anticuerpos 17E9. Tras el lavado de la columna en condiciones rigurosas, se eluyó la enzima a pH 4,0 y se purificó hasta la homogeneidad tal como se determina por SDS-PAGE y secuenciación de aminoácidos. Se obtuvieron tres secuencias a partir de digestos con CNBr de proteína inmunopurificada.

Ejemplo 4 Secuenciación de los aminoácidos de la CSF5-hialuronidasa

Para la secuenciación de los aminoácidos del extremo N-terminal, la proteína purificada por inmunoafinidad se sometió a electroinmunotransferencia (electroblotted) desde un gel de SDS hasta una membrana de PVDF (ABI, Foster City, CA) y se secuenció mediante degradación de Edman. Se obtuvieron los péptidos internos de CSF5-hialuronidasa purificados por inmunoafinidad mediante digestión con bromuro de cianógeno (CNBr) seguido por separación de fragmentos en una columna de HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) (Vydac C-18).

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la CSF5-hialuronidasa se muestran en SEQ ID NOS: 8 y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal e internas de la CSF5-hialuronidasa son idénticas al 100% a la traducción conceptual del ADNc. La alineación (Frohman et al., Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 85: 8998-9002, 1988)) de la traducción pronosticada del factor estimulador de colonias y la PH-20 humana indicó un 40% de identidad de secuencia y un 60% de homología en cuanto a los aminoácidos. PH-20 es una hialuronidasa activa neutra específica del esperma. La homología entre una hialuronidasa activa en medio estrictamente ácido y PH-20 sugiere que todas las hialuronidasas unidas mediante enlaces \beta,1-4 de mamífero pueden ser miembros de una familia conservada.

Ejemplo 5 Clonación del ADNc de la CSF5-hialuronidasa

Una búsqueda de homología TBLASTN (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) (compara una secuencia de proteína con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas en todos los marcos de lectura) de la base de datos de etiquetas de secuencia expresada (EST) (Lennon et al., Genomics 33: 151-152, 1996) reveló un clon de I.M.A.G.E. Consortium (Lennon et al., citado anteriormente.) (Número de registro de GenBank AA223264) que era idéntico al 100% con la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal determinada según el ejemplo 4. Esta EST está disponible de Genome Systems (St. Louis, MO) y son 2 kb que incluyen la cola de poli-A y el extremo 3'. Para obtener el extremo 5' del ADNc, se realizó 5' RACE (amplificación rápida de fragmentos de ADNc) (Boguski et al., Nature Genetics 4: 332.333, 1993) en una biblioteca de ADNc de corazón humano Marathon Ready^{MR} (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. En resumen, para la primera reacción de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), se utilizaron los cebadores siguientes: HPHRACE1 (5-ATCGAAGACACTGACATCCACGTCCACACC-3') (SEQ ID NO: 1) y el cebador adaptador 2 (AP2) de Clontech (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3') (SEQ ID NO: 2); la hibridación / extensión fue a 73ºC durante 40 ciclos. Se utilizó la mezcla de polimerasa KlenTaq de Advantage^{MR} (Clontech) para proporcionar un "inicio en caliente" ("hot start"). Se observó una banda difusa de 800 pb con electroforesis en gel de agarosa. La banda se escindió usando un kit de extracción en gel QlAquick (Qiagen Inc. Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN escindido se usó como molde para una segunda PCR anidada usando el cebador HPHRACE2 (5'-TGCCTCTCCAGGCACCACTGGGTGTTTGC-3') (SEQ ID NO: 3) con el cebador AP2 (SEQ ID NO: 2); la hibridación/extensión fue a 72ºC durante 15 ciclos. Se empleó un "inicio en caliente" tal como se describió anteriormente. Se observó una única banda fina de 800 pb con electroforesis en gel de agarosa. Se ligaron 120 ng de producto de PCR en el vector de clonación de TA, pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) y se utilizaron para transformar células competentes One Shot TOP10F' según las instrucciones del fabricante. Las colonias positivas se secuenciaron como anteriormente. El producto de 800 pb mostró un 100% de solapamiento con el extremo 5' de EST por 300 pb.

Para la generación de la secuencia codificante del ADNc de la CSF5-hialuronidasa, se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando la EST como molde con los cebadores siguientes: HPHF1 5'-GTGCCATGGCAGCCCACC-3' (SEQ ID NO: 4) y HPHR1 5'-ATCACCACATGCTCTTCCGC-3' (SEQ ID NO: 5) con hibridación a 58ºC durante 35 ciclos. Se clonaron 120 ng de producto de la PCR en el vector de expresión de TA, pCR3.1-Uni (Invitrogen, San Diego, CA) y se usaron para transformar las células competentes One Shot TOP1OF' según las instrucciones del fabricante. Se purificó el factor estimulador de colonias en el vector de expresión pCR3.1-Uni a partir de las colonias positivas y se verificó mediante mapeo de restricción con Pst I y Dra III. El inserto se secuenció mediante métodos habituales y se encontró que contenía un marco de lectura abierto completo que era idéntico en un 100% al del gen HYAL1 (SEQ ID NO: 8) descrito en (Frost et al 1997) y con el número de registro de GenBank U03056 (Wei et al.,
1996).

Ejemplo 6 Expresión de CSF5-hialuronidasa recombinante en células renales embrionarias humanas

Para comprobar la identidad del factor estimulador de colonias con el gen clonado, el ADNc se transfectó de manera estable en células renales embrionarias humanas (HEK-293). El ADNc se amplificó a partir de EST y después se subclonó en un vector de expresión unidireccional. Este vector se utilizó para generar clones de HEK-293 que sobreexpresaban la actividad hialuronidasa.

El vector que contenía la CSF5-hialuronidasa se transfectó en matraces T75 confluentes en un 75% de células renales embrionarias humanas (HEK-293) durante cinco horas en ausencia de suero utilizando 9 \mug de plásmido purificado y 60 \mul de lipofectina (Gibco BRL) en 20 mL de DME/F12 50/50. Las células transfectadas se hicieron crecer entonces durante 48 h adicionales en la mezcla de DME/F12 50/50 que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS). Tras 48 h, las células se sembraron mediante dilución limitada en placas de 24 pocillos en presencia de 500 \mug/ml de G418 para seleccionar por resistencia a neomicina. Tras 14 días, el medio condicionado de colonias resistentes se sometió a ensayo para determinar la actividad hialuronidasa usando el protocolo descrito en el presente documento. Las colonias con un alto nivel de expresión se expandieron entonces. Para el análisis de la CSF5-hialuronidasa recombinante y la comparación con la proteína bioquímicamente purificada, se hizo crecer una línea celular HEK 293 recombinante que sobreexpresaba hialuronidasa durante 48 h en medio libre de suero y el medio condicionado se hizo pasar sobre una columna de inmunoafinidad con 17E9 anti-CSF. La enzima recombinante se eluyó utilizando el mismo protocolo que para el plasma humano. La hialuronidasa recombinante purificada se sometió entonces a inmunotransferencia en PVDF y se sometió a secuenciación de aminoácidos del extremo N-terminal para garantizar su
autenticidad.

La línea celular HEK-293 parental produjo niveles indetectables de hialuronidasa en el medio condicionado y la capa de células, mientras que los clones transfectados de manera estable secretaban aproximadamente 15 rTRU/ml, un aumento de 3.000 veces. Para garantizar que la actividad hialuronidasa encontrada en los clones de células HEK-293 recombinantes era el producto del ADNc transfectado, la hialuronidasa se purificó por inmunoafinidad a partir de medio condicionado libre de suero del clon de sobreexpresión de HEK-293 y se secuenció el eluyente de la columna con 17E9. Esto dio el mismo extremo N-terminal procesado (FRGPLLVP) que el encontrado en el plasma humano y migró como una única banda en SDS-PAGE. Esta banda se alineó con el plasma purificado utilizando tanto tinción de plata como zimografía en gel como sustrato. Se hizo correr una preparación comercial de hialuronidasa testicular (3.000 TRU/mg sólido) para comparar la actividad específica. La curva de actividad según el pH del factor estimulador de colonias recombinante tiene el mismo perfil que la enzima plasmática purificada por inmunoafinidad, sin actividad in vitro por encima de pH 4,5, a diferencia de la hialuronidasa testicular bovina, que tiene una actividad máxima por encima de pH 7.

Ejemplo 7 Estudio de órgano de transcritos de CSF5-hialuronidasa

Se utilizaron cebadores de PCR anidada que amplificaban la región codificante de 1,3 kb del ADNc del factor estimulador de colonias para analizar la distribución tisular de los transcritos en bibliotecas de ADNc del fago \lambdagt10. Para la primera ronda de PCR se utilizaron los siguientes cebadores: HPHF2 (5'-AGGTTGTCCTCGACCAGTC-3') (SEQ ID NO: 6) y HPHR2 (5'-ATGTGCAACTCAGTGTGTGGC- 3') (SEQ ID NO: 7) a una temperatura de hibridación de 58ºC. La segunda reacción de PCR consistió en 15 ciclos a una temperatura de hibridación de 58ºC con los cebadores HPHF1 y HPHR1 (véase anteriormente). Los productos de la PCR se encontraron en corazón, riñón, hígado, pulmón, placenta, y músculo esquelético, pero no se detectaron en el cerebro.

Ejemplo 8 Estimulación de formación de colonias de monocitos por la CSF5-hialuronidasa

Se determinó la actividad estimuladora de colonias de la CSF5-hialuronidasa en cultivo libre de suero usando sobrenadante de CSF5-hialuronidasa recombinante procedente de las células HEK293. En resumen, se recogió sangre completa de donantes normales en EDTA. La sangre se diluyó 1:2 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se recubrió en una razón 2:1 en Lymphoprep. Las muestras se centrifugaron a 1.500 x g durante 20 min y se eliminó la banda de linfocitos. Las células se lavaron dos veces con Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) libre de suero y se sembraron libres de suero en placas de 24 pocillos en DMEM durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron entonces dos veces con DMEM libre de suero y las células mononucleares de sangre periférica adherentes que permanecieron se utilizaron para los ensayos de formación de colonias.

Con el fin de determinar la actividad formadora de colonias de la CSF5-hialuronidasa, se hicieron crecer células HEK293 que sobreexpresaban CSF5-hialuronidasa tal como se describe en el ejemplo 6 libres de suero en medio HEK293SFM (Gibco BRL) durante seis días con un inóculo de 1 x 10^{5} células/ml. Como control, se hicieron crecer células HEK293 que no expresaban CSF5 en condiciones idénticas con el mismo inóculo durante seis días. La cantidad de actividad de CSF5-hialuronidasa presente en el medio tras seis días se determinó mediante un ensayo enzimático basado en una actividad específica aproximada de 100.000 TRU/mg de proteína (Frost et al. 1997a). Los resultados se muestran en la tabla 3. La mitad de la estimulación máxima de la formación de colonias de monocitos se produjo a aproximadamente 5 ng/ml de hialuronidasa.

Concentración de	Formación de colonias	Medio HEK de control	Formación de colonias
HYAL1 (ng/ml) mediante	de monocitos % de FBS	Diluciones	de monocitos
actividad específica
100 ng (10 TRU/ml)	+ + + +	1:1 (0 TRU/ml)	0
50 ng/ml (5 TRU/ml)	+ + + +	1:2 (0 TRU/ml)	0
25 (2,5 TRU/ml)	+ + + +	1:4 (0 TRU/ml)	0
12,5 (1,25 TRU/ml)	+ +	1:8 (0 TRU/ml)	0
6,26 (0,625 TRU/ml)	+	1:16 (0 TRU/ml)	0
1 ng/ml (0,1 TRU/ml)	0	1:32 (0 TRU/ml)	0

Los medios de CSF5-hialuronidasa o medios control correspondientes a partir de células control HEK se aplicó en diluciones seriadas en HEK293SFM a células mononucleares en sangre periférica (CMSP) adherentes. Las células se cultivaron en CSF5-hialuronidasa diluida durante diez días. Se observó proliferación celular en el día 10 mediante fijación de células en metanol que contenía el 1% de cristal violeta y se observó bajo un microscopio invertido Leitz. Se determinó que las colonias resultantes eran de morfología monolítica mediante tinción nuclear con Giemsa.

Claims (17)

1. Método para aumentar el número de progenitores mieloides in vitro en una población de células, que comprende la etapa de poner en contacto dicha población de células con una CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente
(HYAL-1).

2. CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1), para su uso en el aumento del número de progenitores mieloides en una población de células en un mamífero con un estado mielosuprimido.

3. CSF5-hialuronidasa (HYAL-1), según la reivindicación 2, en la que el estado mielosuprimido comprende monocitopenia.

4. CSF5-hialuronidasa (HYAL-1), según la reivindicación 2 o 3, junto con un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en cirugía, radioterapia y quimioterapia.

5. CSF5-hialuronidasa (HYAL-1), según la reivindicación 2 o 3, en la que dicha mielosupresión está asociada con radiación, quimioterapia o infección vírica.

6. Ácido nucleico que codifica operativamente para la CSF5-hialuronidasa (HYAL-1), de manera que la CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) se exprese en un mamífero, para tratar un mamífero con un estado mielosuprimido.

7. Ácido nucleico, según la reivindicación 6, que está en un vector de expresión.

8. Ácido nucleico, según la reivindicación 7, que está unido operativamente a un promotor.

9. Método para estimular la producción de citocinas por las células mieloides in vitro, que comprende la etapa de poner en contacto dichas células mieloides con CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1).

10. CSF5-hialuronidasa derivada exógenamente (HYAL-1), para su uso en la estimulación de la producción de citocinas por las células mieloides en un mamífero que padece una inmunodeficiencia.

11. CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) según la reivindicación 10, en la que la inmunodeficiencia está asociada con quimioterapia o infección vírica.

12. Método según la reivindicación 9, o CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) según la reivindicación 10 u 11, en el que dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en interferón, interleucina, factor de necrosis tumoral y factor estimulador de colonias mieloides.

13. Uso de CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) o ADN que codifica para la CSF5-hialuronidasa (HYAL-1) en la preparación de un medicamento para tratar insuficiencia de células mieloides.

14. Uso, según la reivindicación 13, en el que dicha insuficiencia de células mieloides es la mielosupresión.

15. Uso, según la reivindicación 14, en el que dicha insuficiencia de células mieloides resulta de radioterapia, quimioterapia, o infección vírica.

16. Uso, según la reivindicación 13, en el que dicha insuficiencia de células mieloides se caracteriza por producción insuficiente de al menos una citocina, y el medicamento facilita la producción de esa citocina.

17. Uso, según la reivindicación 16, en el que dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en interferón, interleucina, factor de necrosis tumoral y factor estimulador de colonias mieloides.