ES2255869B1 - COMPOSITIONS OF NATURAL PRODUCTS FOR THE TREATMENT OF DIABETES. - Google Patents
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Abstract
Composiciones de productos naturales para el tratamiento de la diabetes.Compositions of natural products for Diabetes treatment
La presente invención se refiere a una composición para reducir los niveles de glucosa en sangre que comprende productos naturales, en particular, una composición farmacéutica o alimenticia que comprende mezclas de dos o más compuestos triterpenoides y dos o más compuestos de diterpeno fenol, procesos para obtener los compuestos triterpenoides y los compuestos de diterpeno fenol, composiciones que comprenden los compuestos triterpenoides y de diterpeno fenol y métodos para usar una composición hipoglucemiante, por ejemplo, en el tratamiento de la diabetes. En una realización preferida, los compuestos triterpenoides son obtenidos a partir de Anredera cordifolia (Basellaceae) y los compuestos de diterpeno fenol a partir de Salvia canariensis (Lamiaceae). Las composiciones de la presente invención que comprenden los productos naturales como ingredientes activos muestran un efecto en la reducción de los niveles de glucosa en sangre, por lo que son útiles para el tratamiento de la diabetes mellitus.The present invention relates to a composition for reducing blood glucose levels comprising natural products, in particular, a pharmaceutical or food composition comprising mixtures of two or more triterpenoid compounds and two or more diterpene phenol compounds, processes for obtaining triterpenoid compounds and diterpene phenol compounds, compositions comprising triterpenoid and diterpene phenol compounds and methods for using a hypoglycemic composition, for example, in the treatment of diabetes. In a preferred embodiment, the triterpenoid compounds are obtained from Anredera cordifolia ( Basellaceae ) and the diterpene phenol compounds from Salvia canariensis ( Lamiaceae ). The compositions of the present invention comprising natural products as active ingredients show an effect in the reduction of blood glucose levels, so they are useful for the treatment of diabetes mellitus.
Description
Composiciones de productos naturales para el tratamiento de la diabetes.Compositions of natural products for Diabetes treatment
La presente invención se refiere a una composición para reducir los niveles de glucosa en sangre que comprende productos naturales, en particular, a una composición farmacéutica o alimenticia para reducir los niveles de glucosa en sangre que comprende mezclas de dos o más compuestos triterpenoides obtenidos a partir de Anredera cordifolia (Basellaceae) y dos o más compuestos de diterpeno fenol obtenidos a partir de Salvia canariensis (Lamia- ceae).The present invention relates to a composition for reducing blood glucose levels comprising natural products, in particular, a pharmaceutical or food composition for reducing blood glucose levels comprising mixtures of two or more triterpenoid compounds obtained from of Anredera cordifolia ( Basellaceae ) and two or more diterpene phenol compounds obtained from Salvia canariensis ( Lamiaceae ).
La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica sistémica que se desarrolla debido a factores genéticos o ambientales y causada por la deficiencia total o absoluta de insulina en el cuerpo. El principal síntoma de la diabetes mellitus es el nivel anormalmente elevado de glucosa en sangre y orina con glucosa, inducido por el metabolismo alterado de azúcares, grasas y proteínas y un típico apetito excesivo, sed excesiva y orina excesiva que acompañan a una profunda fatiga.Diabetes mellitus is a disease systemic metabolic that develops due to genetic factors or environmental and caused by the total or absolute deficiency of insulin in the body The main symptom of diabetes mellitus is the abnormally high level of blood and urine glucose with glucose, induced by altered metabolism of sugars, fats and proteins and a typical excessive appetite, excessive thirst and urine excessive accompanying deep fatigue.
Mientras, cuando se utilizan el agente sustitutivo de insulina y el agente oral reductor de glucosa en sangre (sulfonilurea y biguanida) predominantes como agentes para el tratamiento de la diabetes, los niveles de glucosa en sangre aumentan rápidamente después de la comida; sin embargo, la aparición de insulina en sangre inducida por la administración de los fármacos es relativamente lenta. Como resultado, tiene lugar una desregulación entre el aumento de glucosa en sangre y la aparición de insulina en sangre. En particular, la insulina inyectada subcutáneamente es absorbida tan lentamente que la desregulación empeora, y aparecen los síntomas de hiperglucemia postprandial, hiperinsulinemia e hipoglucemia.Meanwhile, when the agent is used insulin substitute and oral glucose reducing agent in predominant blood (sulfonylurea and biguanide) as agents for Diabetes treatment, blood glucose levels increase rapidly after the meal; However, the appearance of insulin in the blood induced by the administration of The drugs is relatively slow. As a result, it takes place a deregulation between the increase in blood glucose and the appearance of insulin in the blood In particular, insulin injected subcutaneously is absorbed so slowly that the deregulation worsens, and symptoms of hyperglycemia appear postprandial, hyperinsulinemia and hypoglycemia.
La diabetes mellitus se clasifica en diabetes mellitus dependiente de insulina (Tipo I) y diabetes mellitus no dependiente de insulina (Tipo II).Diabetes mellitus is classified into diabetes insulin dependent mellitus (Type I) and diabetes mellitus no insulin dependent (Type II).
La diabetes mellitus dependiente de insulina, Tipo I, se desarrolla de repente debido a la deficiencia severa de insulina, en algunos casos con síntomas serios tales como cetoacidosis diabética. En Europa y en América, se estima que el 5-10% de los pacientes diabéticos pertenecen al Tipo I. Dado que se desarrolla en edades comprendidas entre 10-20 años, la Tipo I también es conocida como diabetes mellitus de aparición juvenil. En cuanto a la patogénesis, se ha sugerido un factor genético, el antígeno HLA (HLA, DR, DQ) como causa asociada con la diabetes, y factores ambientales, tales como virus y toxinas que convierten el antígeno de superficie de las células beta del páncreas secretoras de insulina en inmunogénicas, resultando en la producción de autoanticuerpos contra los islotes y la insulina. Se ha revelado que el autoinmune está involucrado en el desarrollo de la diabetes mellitus. En los últimos años, se ha intentado retrasar o prevenir el desarrollo de la diabetes mediante la detección precoz de dichos autoanticuerpos antes del desarrollo de la diabetes Tipo I.Insulin dependent diabetes mellitus, Type I, develops suddenly due to severe deficiency of insulin, in some cases with serious symptoms such as diabetic cetoacidosis. In Europe and America, it is estimated that the 5-10% of diabetic patients belong to Type I. Since it develops in ages between 10-20 years, Type I is also known as juvenile onset diabetes mellitus Refering to pathogenesis, a genetic factor, the HLA antigen, has been suggested (HLA, DR, DQ) as a cause associated with diabetes, and factors environmental factors, such as viruses and toxins that convert the antigen surface of the beta cells of the secretory pancreas of insulin in immunogens, resulting in the production of autoantibodies against islets and insulin. It has been revealed that the autoimmune is involved in the development of diabetes mellitus In recent years, attempts have been made to delay or prevent the development of diabetes through the early detection of these autoantibodies before the development of Type I diabetes.
La diabetes mellitus Tipo II se desarrolla prácticamente a partir de los cuarenta y la mayoría de pacientes diabéticos en Europa y América pertenecen a diabetes mellitus Tipo II. La diabetes mellitus Tipo II es conocida como diabetes mellitus de aparición adulta en comparación con el Tipo I y se sabe que se desarrolla por causas asociadas con factores tanto genéticos como ambientales. En cuanto a los factores genéticos, se ha observado agregación familiar. Con respecto a los factores ambientales, están asociados con la diabetes mellitus la ingesta de alimentos altamente calóricos, el ejercicio físico insuficiente, la obesidad, el estrés y el abuso de drogas. De acuerdo con la patogénesis de la diabetes mellitus Tipo II, se observan tanto el desorden en la secreción de insulina en las células beta del páncreas como el defecto de la actividad de la insulina en las células diana (resistencia a insulina). Sin embargo, no está claro cual es el factor crítico primario.Type II diabetes mellitus develops practically after forty and most patients Diabetics in Europe and America belong to diabetes mellitus Type II. Type II diabetes mellitus is known as diabetes Adult onset mellitus compared to Type I and it is known that develops due to causes associated with both genetic factors as environmental As for the genetic factors, it has observed family aggregation. Regarding the factors environmental, are associated with diabetes mellitus intake of highly caloric foods, insufficient physical exercise, Obesity, stress and drug abuse. According to the pathogenesis of type II diabetes mellitus, both the disorder in the secretion of insulin in beta cells of the pancreas as the defect of insulin activity in the target cells (insulin resistance). However, it is not clear What is the primary critical factor.
La tasa de prevalencia de la diabetes mellitus aumenta asombrosamente en estos días y se observa que la terapia más efectiva es la prevención de complicaciones dosificando los excelentes agentes reductores de glucosa en sangre en los estados iniciales.The prevalence rate of diabetes mellitus surprisingly increases these days and it is observed that the therapy more effective is the prevention of complications by dosing the excellent blood glucose reducing agents in the states initials.
Los agentes orales reductores de glucosa en
sangre para el tratamiento de la diabetes mellitus incluyen las
sulfonilureas, las biguanidas y acarbosa y similares. En el caso de
las sulfonilureas, se utilizan generalmente los productos de segunda
generación debido al tiempo de acción más corto y un excelente
efecto en la reducción de glucosa en sangre. Las sulfonilureas se
utilizan en pacientes con diabetes de adquisición adulta que no
estén obesos, mientras que las biguanidas y acarbosa con pacientes
que están obesos por encima del peso normal. Una de las diferencias
remarcables entre las biguanidas y acarbosa respecto a las
sulfonilureas es la baja frecuencia de hipoglucemia
inducida.Oral blood glucose reducing agents for the treatment of diabetes mellitus include sulfonylureas, biguanides and acarbose and the like. In the case of sulfonylureas, second generation products are generally used due to the shorter time of action and an excellent effect on the reduction of blood glucose. Sulfonylureas are used in patients with adult-acquired diabetes who are not obese, while biguanides and acarbose with patients who are obese above normal weight. One of the remarkable differences between biguanides and acarbose with respect to sulfonylureas is the low frequency of hypoglycemia
induced.
El agente reductor de glucosa en sangre ideal es un fármaco seguro y que se pueda administrar oralmente que tenga no sólo la acción rápida que permita la prevención del incremento de glucosa en sangre después de la ingesta y pierda la actividad en un tiempo corto para evitar la inducción de hipoglucemia, sino que también sea capaz de tratar los desórdenes del metabolismo que acompañan particularmente a la diabetes. Actualmente, la importancia de desarrollar dicho agente reductor de glucosa en sangre ha sido cada vez más reconocida y se ha puesto la atención en el tratamiento de la diabetes mellitus con productos farmacéuticos tradicionales y productos naturales.The ideal blood glucose reducing agent is a safe drug that can be administered orally that has not only the rapid action that allows the prevention of the increase of blood glucose after ingestion and lose activity in a short time to avoid inducing hypoglycemia, but that also be able to treat metabolism disorders that They accompany diabetes in particular. Currently, the importance of developing said glucose reducing agent in blood has been increasingly recognized and attention has been paid in the treatment of diabetes mellitus with products Traditional pharmacists and natural products.
Además, la insulina administrada mediante inyección tiene un efecto notable en la reducción de glucosa en sangre, pero sin embargo, es incómodo de utilizar y debe tenerse en cuenta la posibilidad de complicaciones tales como la hipoglucemia. En particular, deben tenerse precauciones adecuadas con las personas mayores ya que son susceptibles de sufrir hipoglucemia.In addition, insulin administered by injection has a remarkable effect on reducing glucose in blood, but nevertheless, it is uncomfortable to use and should be taken in account for the possibility of complications such as hypoglycemia In particular, adequate precautions must be taken with the elderly as they are susceptible to suffering hypoglycemia
Además de estas terapias con fármacos, existen alrededor de 160 terapias populares que se llevan a cabo en Europa y América. Se ha descrito que más del 70% de los pacientes adultos con diabetes mellitus han probado una o más de estas terapias populares.In addition to these drug therapies, there are around 160 popular therapies that are carried out in Europe and America It has been described that more than 70% of adult patients with diabetes mellitus have tried one or more of these therapies popular.
El estudio de los fármacos para el tratamiento
de la diabetes se está focalizando en la prevención y tratamiento
de la diabetes, y en el caso de la diabetes dependiente de
insulina, el estudio para prevenir el cáncer debido a insulitis y
el tratamiento de la diabetes se lleva a cabo con modelos animales
de la enfermedad; la mayoría de las estrategias para el tratamiento
de la diabetes se concentran en la inhibición y regulación de la
respuesta inmune para prevenir la destrucción de las células beta.
Una enfermedad autoinmune, la diabetes dependiente de insulina es
debida al aumento anormal de la función inmune, y se aplican varias
terapias inmunes para prevenir la destrucción de las células beta.
Se ha encontrado que la eliminación de las células T mediante el
tratamiento con anticuerpos contra las células T y la eliminación
de los macrófagos resulta en la inhibición del desarrollo de la
diabetes. Se ha descrito que la diabetes mellitus puede ser
inhibida mediante la inhibición de la generación y actividad de
radicales libres tales como el NO secretado en inmunocitos con
antioxidantes tales como nicotina, vitamina E, probucol, MDL29311
y
U78518F.The study of drugs for the treatment of diabetes is focusing on the prevention and treatment of diabetes, and in the case of insulin-dependent diabetes, the study to prevent cancer due to insulitis and the treatment of diabetes are carried out with animal models of the disease; Most of the strategies for the treatment of diabetes focus on the inhibition and regulation of the immune response to prevent the destruction of beta cells. An autoimmune disease, insulin-dependent diabetes is due to the abnormal increase in immune function, and various immune therapies are applied to prevent the destruction of beta cells. It has been found that the removal of T cells by treatment with antibodies against T cells and the removal of macrophages results in the inhibition of the development of diabetes. It has been described that diabetes mellitus can be inhibited by inhibiting the generation and activity of free radicals such as NO secreted in immunocytes with antioxidants such as nicotine, vitamin E, probucol, MDL29311 and
U78518F.
Mientras, la terapia con inhibidores inmunes ha sido ampliamente estudiada. Sin embargo, el tratamiento con glucocorticoides no muestra una eficiencia significativa y aunque la ciclosporina A, la rapamicina y el FK506 se han sugerido como agentes curativos de la diabetes, se requiere una mayor verificación. La terapia con inhibidores inmunes puede causar una excesiva inhibición inmune que lleve a una infección secundaria, toxicidad hepática y renal, de forma que existen muchos problemas que deben resolverse para utilizarlos como agentes curativos de la diabetes. Además, la terapia con dosis a largo plazo puede inducir cáncer. Recientemente, el estudio sobre la prevención y tratamiento de la diabetes con reguladores inmunes, no inhibidores inmunes, está en proceso y se ha descrito que el tratamiento de citoquinas tales como IL-4 y IL-l0 inhibe la diabetes mellitus en ratones enfermos. Los reguladores inmunes tales como OK-432. LZ-8, BCG y CFA han sido descritos como capaces de tratar la diabetes mellitus. Sin embargo, el mecanismo es todavía desconocido.Meanwhile, immune inhibitor therapy has Been widely studied. However, treatment with glucocorticoids do not show significant efficiency and although the cyclosporine A, rapamycin and FK506 have been suggested as curative agents of diabetes, greater check. Therapy with immune inhibitors can cause a excessive immune inhibition leading to a secondary infection, liver and kidney toxicity, so there are many problems which must be resolved to use them as curative agents of the diabetes. In addition, long-term dose therapy can induce Cancer. Recently, the study on prevention and treatment of diabetes with immune regulators, not immune inhibitors, is in process and it has been described that the treatment of cytokines such as IL-4 and IL-10 inhibits diabetes mellitus in sick mice. Immune regulators such as OK-432. LZ-8, BCG and CFA They have been described as capable of treating diabetes mellitus. Without However, the mechanism is still unknown.
Como agentes curativos de la diabetes mellitus no dependiente de insulina, se está intentando desarrollar agentes que no tengan efectos adversos y sean capaces de tratar tanto la diabetes mellitus dependiente de insulina como la no dependiente de insulina simultáneamente.As curative agents of diabetes mellitus not insulin dependent, agents are trying to develop that have no adverse effects and are able to treat both the insulin-dependent diabetes mellitus as non-dependent diabetes insulin simultaneously.
Es conocido que los productos farmacéuticos latinoamericanos usados tradicionalmente presentan baja toxicidad y una variedad de eficacias curativas. Existen informes que indican que la prescripción de uno o más productos farmacéuticos orientales permite el tratamiento de la diabetes mellitus y, en algunos casos, de la diabetes mellitus dependiente y o dependiente de insulina simultáneamente.It is known that pharmaceutical products Traditionally used Latin Americans have low toxicity and A variety of healing efficiencies. There are reports that indicate that the prescription of one or more oriental pharmaceutical products allows the treatment of diabetes mellitus and, in some cases, of insulin dependent and insulin dependent diabetes mellitus simultaneously.
La Anredera cordifolia y otras plantas de la familia botánica Basellaceae ha sido utilizada como medicina tradicional, en Colombia y Taiwán, usada como analgésico, para curar heridas y para el tratamiento sintomático de la diabetes mellitus. Anredera cordifolia and other plants of the Basellaceae botanical family have been used as traditional medicine, in Colombia and Taiwan, used as an analgesic, to heal wounds and for the symptomatic treatment of diabetes mellitus.
La Salvia canariensis, una Lamiaceae endémica de las Islas Canarias, ha sido utilizada en la medicina popular para las dolencias estomacales y el tratamiento de la tos, y se ha descrito que presenta un contenido muy alto de compuestos de diterpeno fenol los cuales se ha demostrado que son capturadores muy eficientes de los radicales libres y de las especies de oxígeno en estado singulete que causan procesos degenerativos en mamíferos. Salvia canariensis , an endemic Lamiaceae from the Canary Islands, has been used in folk medicine for stomach ailments and cough treatment, and has been described as having a very high content of diterpene phenol compounds which has been shown which are very efficient captors of free radicals and singlet oxygen species that cause degenerative processes in mammals.
La presente invención proporciona composiciones
hipoglucemiantes que comprenden dos o más de los compuestos
triterpenoides elegidos entre el grupo formado por: ácido
3-O-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow3)-O-\beta-D-glucuropiranosil]-30-noroleana-12,20(29)-dien-28-oico,
3\beta-hidroxi-30-noroleana-12,20(29)-dien-28-oico,
3\beta-hidroxi-30-noroleana-12,20(29)-dien-28-oico,
Momordin Ib, Momordin
Ib-28-\beta-glucopiranosil éster, ácido
3-O-[\beta-D-glucuronopiranosil]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oico,
Larreagenina A,
3\beta,20\xi-dihidroxi-30-norolean-12-en-28-oico,
ácido
3\beta-hidroxi-30-norolean-12,19-dien-28-oico,
3\beta-hidroxi-30-norolean-12,19-dien-28-oato,
3-O-[\beta-D-glucuronopiranosil]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-O-[\beta-D-glucopiranosil]
éster,
3-O-[\beta-D-glucopiranosil]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-O-[\beta-D-glucopiranosil]
éster,
3-O-[\beta-D-glucuronopiranosil]-30-norolean-12,20(29)-dien-23-hidroxi-28-oico,
ácido
3-\beta-[O-\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow3)-O-\beta-D-glucopiranuronosil]oxi)-olean-12-ene-28-oico,
3-O-[\beta-D-glucuronopiranosil]-20(29)-eno-30
norhederagenin
28-O-[\beta-D-glucopiranosil]
éster, Quinoasaponina-9, ácido ursólico y ácido
oleanólico, obtenidos en una realización preferente a partir de
Anredera cordifolia, o sus sales farmacéuticamente
aceptables para utilizarlos como agentes hipoglucemiantes, es
decir, para reducir la glucosa en sangre o tratar la diabetes
mellitus, en mamíferos; y dos o más de los compuestos de diterpeno
fenol elegidos entre el grupo formado por:
7-ceto-ferruginol,
6,7-didehidro-ferruginol, ácido
carnósico, carnosol, isocarnosol, rosmanol, isorosmanol,
epirosmanol, galdosol y isogaldosol obtenidos en una realización
preferida a partir de Salvia canariensis; o sus sales
farmacéuticamente aceptables para utilizarlos como agentes
hipoglucemiantes, es decir, para reducir la glucosa en sangre o
tratar la diabetes mellitus, en mamíferos. Dichas composiciones
contienen opcionalmente un vehículo o portador farmacéuticamente
aceptable y opcionalmente otro agente o agentes hipoglucemiantes
útiles para el tratamiento de la
diabetes.The present invention provides hypoglycemic compositions comprising two or more of the triterpenoid compounds chosen from the group consisting of: 3- O - [β-D-xylopyranosyl- (1? 3) -O-? -D-glucuropyranosyl] -30-norolean-12.20 (29) -dien-28-oico, 3β-hydroxy-30-norolean-12.20 (29) -dien-28-oico, 3β-hydroxy-30-norolean -12.20 (29) -dien-28-oico, Momordin Ib, Momordin Ib- 28 - β-glucopyranosyl ester, 3- O - [β-D-glucuronopyranosyl] -30-norolean-12.20 ( 29) -dien-28-oico, Larreagenin A, 3β, 20 \ xi-dihydroxy-30-norolean-12-en-28-oico, 3β-hydroxy-30-norolean-12,19-dien -28-oico, 3β-hydroxy-30-norolean-12,19-dien-28-oato, 3- O - [β-D-glucuronopyranosyl] -30-norolean-12.20 (29) -dien -28- O - [β-D-glucopyranosyl] ester, 3- O - [β-D-glucopyranosyl] -30-norolean-12.20 (29) -dien-28- O - [β-D -glucopyranosyl] ester, 3- O - [β-D-glucuronopyranosyl] -30-norolean-12.20 (29) -dien-23-hydroxy-28-oic, 3-? - [O-? -D-xilop iranosyl- (1 → 3) -O-? -D-glucopyranosuronosyl] oxy) -olean-12-jan-28-oico, 3- O - [β-D-glucuronopyranosyl] -20 (29) -eno- 30 norhederagenin 28- O - [β-D-glucopyranosyl] ester, Quinoasaponin-9, ursolic acid and oleanolic acid, obtained in a preferred embodiment from Anredera cordifolia , or its pharmaceutically acceptable salts for use as hypoglycemic agents, ie , to reduce blood glucose or treat diabetes mellitus, in mammals; and two or more of the diterpene phenol compounds chosen from the group consisting of: 7-keto-ferruginol, 6,7-didehydro-ferruginol, carnosic acid, carnosol, isocarnosol, rosmanol, isorosmanol, epirosmanol, galdosol and isogaldosol obtained in one preferred embodiment from Salvia canariensis ; or its pharmaceutically acceptable salts for use as hypoglycemic agents, that is, to reduce blood glucose or treat diabetes mellitus, in mammals. Said compositions optionally contain a pharmaceutically acceptable carrier or carrier and optionally another hypoglycemic agent or agents useful for the treatment of the
diabetes.
La invención también abarca métodos para la obtención de los compuestos triterpenoides, procesos para la obtención de los compuestos de diterpeno fenol, composiciones que comprenden los compuestos de triterpeno y diterpeno fenol y métodos para utilizar las composiciones que comprenden los compuestos de triterpeno y diterpeno como agentes hipoglucemiantes.The invention also encompasses methods for obtaining triterpenoid compounds, processes for obtaining diterpene phenol compounds, compositions that they comprise the triterpene and diterpene phenol compounds and methods to use the compositions comprising the compounds of triterpene and diterpene as hypoglycemic agents.
La presente invención puede comprenderse mejor haciendo referencia a las figuras, descripción detallada y ejemplos dirigidos a ejemplificar realizaciones no limitativas de la invención.The present invention can be better understood. referring to the figures, detailed description and examples aimed at exemplifying non-limiting realizations of the invention.
El material de las plantas de la familia Basellaceae, preferentemente Anredera cordifolia, o de Salvia canariensis, se extraen en primer lugar con un solvente orgánico, incluyendo solventes orgánicos apolares, solventes orgánicos polares, o sus mezclas, para obtener una solución de los presentes compuestos triterpenoides. Como "material de las plantas" se entiende cualquier parte de la planta tal como las hojas, raíces, flores o el tallo, preferentemente las hojas. Los solventes orgánicos apolares útiles incluyen, pero no se limitan a, tetracloruro de carbono, diclorometano, benceno, tolueno, xileno, pentano, heptano y similares. Los solventes orgánicos polares útiles incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, isopropanol, acetona, 2-butanona, acetato de etilo, éter dietílico, tetrahidrofurano, cloroformo, dimetilformamida, N-metilpirrolidinona, dimetil sulfóxido, y sus mezclas entre ellos o con agua. Preferentemente el solvente utilizado para extraer los compuestos triterpenoides de la Baselloid ssp. es un solvente orgánico polar, más preferentemente n-butanol. Preferentemente el solvente utilizado para extraer los compuestos de diterpeno fenol de Salvia canariensis es un solvente orgánico polar, más preferentemente acetona. Antes de la extracción con el solvente orgánico polar el material de las plantas puede ser opcionalmente molido, rallado, macerado o tratado de cualquier otra forma para aumentar el área de superficie total.The material of the Basellaceae family plants, preferably Anredera cordifolia , or Salvia canariensis , is first extracted with an organic solvent, including apolar organic solvents, polar organic solvents, or mixtures thereof, to obtain a solution of the present compounds triterpenoids "Plant material" means any part of the plant such as leaves, roots, flowers or the stem, preferably the leaves. Useful nonpolar organic solvents include, but are not limited to, carbon tetrachloride, dichloromethane, benzene, toluene, xylene, pentane, heptane and the like. Useful polar organic solvents include, but are not limited to, methanol, ethanol, isopropanol, acetone, 2-butanone, ethyl acetate, diethyl ether, tetrahydrofuran, chloroform, dimethylformamide, N-methylpyrrolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixtures thereof. or with water Preferably the solvent used to extract the triterpenoid compounds from Baselloid ssp . It is a polar organic solvent, more preferably n-butanol. Preferably the solvent used to extract the diterpene phenol compounds from Salvia canariensis is a polar organic solvent, more preferably acetone. Prior to extraction with the polar organic solvent the plant material can optionally be ground, grated, macerated or treated in any other way to increase the total surface area.
La extracción de Baselloid spp. o
Salvia canariensis con el solvente orgánico polar o apolar
puede llevarse a cabo con un aparato de extracción tipo soxhlet en
el que se colocan los fragmentos pequeños de Baselloid spp.
o Salvia canariensis dentro de un dedal poroso y se extraen
de forma continua con el solvente orgánico polar o apolar a
temperatura de reflujo durante entre varias horas a varios días, o
preferentemente, colocando simplemente pequeños fragmentos de
Baselloid spp. o Salvia canariensis en un recipiente
que contiene el solvente orgánico polar o apolar y dejando la
mezcla resultante macerar o agitarse a temperatura ambiente durante
entre varias horas y varias
semanas.The extraction of Baselloid spp . o Salvia canariensis with polar or apolar organic solvent can be carried out with a soxhlet type extraction apparatus in which small fragments of Baselloid spp . or Salvia canariensis inside a porous thimble and extracted continuously with the polar organic solvent or apolar at reflux temperature for several hours to several days, or preferably, simply placing small fragments of Baselloid spp . o Salvia canariensis in a container containing polar or nonpolar organic solvent and leaving the resulting mixture to macerate or stir at room temperature for several hours to several
weeks
Después de la extracción, la solución orgánica se concentra (es decir, se evapora), opcionalmente al vacío, o se liofiliza, para obtener un extracto polar o apolar que comprende los compuestos triterpenoides de la Baseloid spp. o un extracto polar o apolar que comprende los compuestos de diterpeno fenol de Salvia canariensis.After extraction, the organic solution is concentrated (ie, evaporated), optionally in vacuo, or lyophilized, to obtain a polar or apolar extract comprising the triterpenoid compounds of Baseloid spp . or a polar or apolar extract comprising the diterpene phenol compounds of Salvia canariensis .
El extracto polar o apolar se purifica a
continuación para obtener la mezcla de los compuestos
triterpenoides de Baselloid ssp. en forma purificada, o los
diterpeno fenoles de Salvia canariensis en forma purificada.
Como "forma purificada" se entiende una forma del compuesto
aislada y que no se encuentra de forma natural, que tiene un grado
de pureza de al menos el 50%, preferentemente al menos el 90%, y
más preferentemente al menos el 95%. El extracto polar o apolar
puede ser purificado mediante cristalización o preferentemente, por
cromatografía en columna, incluyendo cromatografía convencional con
gel de sílice, cromatografía en columna Sephadex, cromatografía
flash al vacío y cromatografía líquida de alta resolución
preparativa o semipreparativa. Cuando se usa la cromatografía en
columna para purificar los compuestos del extracto polar o apolar,
puede ser necesario utilizar varias iteraciones de la cromatografía
en columna para obtener la mezcla de compuestos triterpenoides de
Basellaceae spp. en forma purificada o los compuestos de
diterpeno fenol de Salvia canariensis, que tengan el grado
deseado de pureza. Preferentemente, el extracto polar o apolar se
purifica en primer lugar utilizando cromatografía Sephadex
HL-20 convencional para obtener una serie de
fracciones que están enriquecidas con la mezcla de triterpenoides
de Basellaceae spp. o los diterpeno fenoles de Salvia
canariensis. Estas fracciones son preferentemente
repurificadas, más de una vez si es necesario, para obtener la
mezcla de triterpenoides de Basellaceae spp. o los diterpeno
fenoles de Salvia canariensis, en forma sustancialmente
purificada. Como "forma sustancialmente purificada" se
entiende una forma aislada que no ocurre de forma natural de la
mezcla de triterpenoides de Basellaceae spp. o los diterpeno
fenoles de Salvia canariensis, que tiene un grado de pureza
de al menos el 95%. Las formas purificada y sustancialmente
purificada de los triterpenoides de Basellaceae spp.,
preferentemente Anredera cordifolia, pueden obtenerse
mediante purificación de materiales aislados por extracción de
fuentes naturales de plantas, o por purificación de compuestos
obtenidos a partir de un proceso de síntesis químico. Las formas
purificada y sustancialmente purificada de los diterpeno fenoles de
Salvia canariensis, pueden obtenerse mediante purificación
de materiales aislados por extracción de fuentes naturales de
plantas, o por purificación de compuestos obtenidos a partir de un
proceso de síntesis
químico.The polar or apolar extract is then purified to obtain the mixture of Baselloid ssp triterpenoid compounds. in purified form, or the diterpene phenols of Salvia canariensis in purified form. By "purified form" is meant a form of the isolated compound and which is not found naturally, which has a degree of purity of at least 50%, preferably at least 90%, and more preferably at least 95%. The polar or apolar extract may be purified by crystallization or preferably, by column chromatography, including conventional silica gel chromatography, Sephadex column chromatography, vacuum flash chromatography and preparative or semi-preparative high resolution liquid chromatography. When column chromatography is used to purify the polar or apolar extract compounds, it may be necessary to use several iterations of column chromatography to obtain the mixture of triterpenoid compounds from Basellaceae spp . in purified form or the diterpene phenol compounds of Salvia canariensis , having the desired degree of purity. Preferably, the polar or apolar extract is first purified using conventional Sephadex HL-20 chromatography to obtain a series of fractions that are enriched with the Basellaceae spp triterpenoid mixture. or the diterpene phenols of Salvia canariensis . These fractions are preferably repurified, more than once if necessary, to obtain the Basellaceae spp triterpenoid mixture. or the diterpene phenols of Salvia canariensis , in substantially purified form. By "substantially purified form" is meant an isolated form that does not occur naturally from the Basellaceae spp triterpenoid mixture. or the diterpene phenols of Salvia canariensis , which has a purity degree of at least 95%. The purified and substantially purified forms of the triterpenoids of Basellaceae spp ., Preferably Anredera cordifolia , can be obtained by purification of isolated materials by extraction from natural sources of plants, or by purification of compounds obtained from a chemical synthesis process. The purified and substantially purified forms of the diterpene phenols of Salvia canariensis can be obtained by purification of isolated materials by extraction from natural sources of plants, or by purification of compounds obtained from a synthesis process
chemical.
Debido a la actividad hipoglucemiante de los
compuestos triterpenoides de Anredera cardifolia y la
actividad antioxidante (capturadores eficientes de los radicales
libres y de las especies de oxígeno en estado singulete que causan
procesos degenerativos en mamíferos) de los diterpeno fenoles de
Salvia canariensis, las mezclas adecuadas combinadas de
ambos tipos de compuestos es ventajosamente útil en veterinaria y
medicina humana para el tratamiento terapéutico de la diabetes
mellitus. Adicionalmente, estas mezclas combinadas pueden ser
ventajosamente utilizadas como agente hipoglucemiante para reducir
los niveles de glucosa en sangre en situaciones de estrés agudo tal
como se ha experimentado en animales o pacientes con hipertermia,
trauma, sepsis, y quemaduras y sometidos a anestesia general. La
hiperglucemia asociada a veces con dolor agudo de cabeza, trombosis
cerebral, encefalitis y choque térmico pueden también ser tratados
terapéuticamente con estas mezclas combinadas de triterpenos de
Anredera cordifolia y diterpeno fenoles de Salvia
canariensis. Adicionalmente, estas mezclas combinadas son
útiles como agente hipoglucemiante para la enfermedad de
almacenamiento de glucógeno metabólico congénita rara asociada con
la
hiperglucemia.Due to the hypoglycemic activity of the triterpenoid compounds of Anredera cardifolia and the antioxidant activity (efficient captors of free radicals and singlet oxygen species that cause degenerative processes in mammals) of diterpene phenols of Salvia canariensis , the appropriate mixtures Combined of both types of compounds is advantageously useful in veterinary and human medicine for the therapeutic treatment of diabetes mellitus. Additionally, these combined mixtures can be advantageously used as a hypoglycemic agent to reduce blood glucose levels in situations of acute stress as experienced in animals or patients with hyperthermia, trauma, sepsis, and burns and undergoing general anesthesia. Hyperglycemia sometimes associated with acute headache, cerebral thrombosis, encephalitis and thermal shock can also be treated therapeutically with these combined mixtures of triterpenes of Anredera cordifolia and diterpene phenols of Salvia canariensis . Additionally, these combined mixtures are useful as a hypoglycemic agent for the rare congenital metabolic glycogen storage disease associated with the
hyperglycemia
Aunque la presente invención no pretende estar limitada a ningún mecanismo de acción particular para explicar la actividad hipoglucemiante de la mezcla combinada de triterpenoides y diterpeno fenoles de la presente invención, se prevé que pueda ser ventajosamente útil para el tratamiento tanto de la diabetes dependiente de insulina o Tipo I (antes denominada diabetes de aparición juvenil o propensa a cetosis) y de la diabetes no dependiente de insulina o Tipo II (antes denominada diabetes de aparición adulta, de aparición en la madurez o no cetótica).Although the present invention is not intended to be limited to any particular mechanism of action to explain the hypoglycemic activity of the combined triterpenoid mixture and diterpene phenols of the present invention, it is envisioned that it can be advantageously useful for the treatment of both diabetes insulin dependent or Type I (formerly called diabetes youthful appearance or prone to ketosis) and non-diabetes insulin dependent or Type II (formerly called diabetes adult appearance, appearance at maturity or non-ketosis).
Las mezclas combinadas de compuestos de
triterpeno y diterpeno fenol de la presente invención pueden ser
administradas solas o en forma de una composición que comprende
cualquier portador fisiológicamente aceptable tal como agua, una
solución acuosa, suero salino u otro excipiente fisiológicamente
aceptable. En general, la dosis terapéuticamente efectiva estaría
en el rango entre alrededor de 10-1000 mg/kg/día,
preferentemente 1-250 mg/kg/día. Las mezclas
combinadas de compuestos de triterpeno y de diterpeno fenol de la
presente invención, pueden ser administradas por varias vías,
incluyendo, pero no limitadas a: vía oral, inyección, incluyendo,
pero no limitada a, vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea,
intramuscular, etc. La ruta de administración preferida es la vía
oral. Las composiciones pueden contener adicionalmente otros
agentes hipoglucemiantes tales como insulina; una biguanida tal
como metformina o buformina; una sulfonilurea tal como
acetohexamida, cloropropamida, tolazamida, tolbutamida, gliburida,
glipizida o gliclazida; una tiazolidinodiona tal como troglitazona;
un inhibidor de \alpha-glucosidasa tal como
acarbosa o miglatol; o un agonista del receptor adrenérgico P3 tal
como CL-316, 243, etc.; o sus
mezclas.The combined mixtures of triterpene and diterpene phenol compounds of the present invention can be administered alone or in the form of a composition comprising any physiologically acceptable carrier such as water, an aqueous solution, saline or other physiologically acceptable excipient. In general, the therapeutically effective dose would be in the range between about 10-1000 mg / kg / day, preferably 1-250 mg / kg / day. The combined mixtures of triterpene and diterpene phenol compounds of the present invention may be administered by several routes, including, but not limited to: oral, injection, including, but not limited to, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular. , etc. The preferred route of administration is the oral route. The compositions may additionally contain other hypoglycemic agents such as insulin; a biguanide such as metformin or buformin; a sulfonylurea such as acetohexamide, chloropropamide, tolazamide, tolbutamide, glyburide, glipizide or gliclazide; a thiazolidinedione such as troglitazone; an α-glucosidase inhibitor such as acarbose or miglatol; or a P3 adrenergic receptor agonist such as CL-316, 243, etc .; or their
mixtures
Las mezclas combinadas de compuestos de triterpeno y de diterpeno fenol de la presente invención, pueden ser administradas en una cantidad efectiva como una sal farmacéuticamente aceptable utilizando contraiones tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, zinc y hierro.The combined mixtures of compounds of triterpene and diterpene phenol of the present invention can be administered in an effective amount as a salt pharmaceutically acceptable using counterions such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, zinc and iron.
Además, las mezclas combinadas de compuestos de triterpeno y de diterpeno fenol de la presente invención o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizados para fines de investigación, por ejemplo, para investigar el mecanismo y la actividad de los agentes hipoglucemiantes.In addition, the combined mixtures of compounds of triterpene and diterpene phenol of the present invention or its pharmaceutically acceptable salts can be used for purposes of research, for example, to investigate the mechanism and activity of hypoglycemic agents.
La siguiente serie de ejemplos se presentan como medio de ilustración y no como medio de limitación en el alcance de la invención.The following series of examples are presented as means of illustration and not as a means of limitation in the scope of the invention.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
Ejemplo 1.1Example 1.1
Las purificaciones de los compuestos para
espectroscopia se realizaron en un equipo de cromatografía líquida
de alta eficiencia formado por dos bombas SHIMADZU
LC-9A y un detector espectrofotométrico
UV-VIS de longitud de onda variable SHIMADZU
SPD-6AV, equipado con una columna WATERS de 19 x 150
mm rellena de gel de sílice \muporasil con tamaño de partícula 10
\mum, utilizando siempre como eluyentes disolventes grado
Lichrosolv de la casa MERCK. Para la realización de los
experimentos de RMN, los productos fueron disueltos en CDCl_{3},
C_{6}C_{6}, Py-D_{5}, CD_{3}OD,
C_{2}D_{6}CO, usando Tms como referencia interna. Los espectros
de RMN ^{1}H fueron realizados en espectrómetros BRUKER
WP-200 SY (200 MHz) y BRUKER AMX 400 (400 MHz), y
los de RMN ^{13}C se efectuaron en un espectrómetro
WP-200 SY (200 MHz) y BRUKER AMX 400 (400 MHz),
WP-200 SY (50 MHz) y BRUKER AMX 400 (100 MHz). Los
espectros de IR se realizaron usando película o disolución en
CHCl_{3} del producto puro en células de NaCl, en un
espectrofotómetro PERKIN ELMER, modelo 1600 (FTIR). Los espectros
UV se efectuaron en un espectrofotómetro PERKIN ELMER 550 SE, con
células de cuarzo de 5 mm usando EtOH como disolvente. La
determinación de fórmulas moleculares de fragmentos y del ión
molecular fueron realizados en un espectrómetro de alta resolución
VG-MICROMASS, ZAB-2F, a potenciales
de ionización de 15 ó 70 eV. Los espectros de masa de baja
resolución se realizaron en un espectrómetro
HEWLETT-PAKARD, modelo 5995. La determinación de
las actividades ópticas se realizó en un polarímetro PERKIN ELMER,
modelo 141, usando la línea D del sodio, a 25ºC y en disolución de
CHCl_{3} con células de 1 dm. Las cromatografías en capa fina
fueron realizadas sobre cromatofolios de gel de sílice tipo G, con
indicador de luminiscencia a 254 nm, SCHLEICHER & SCHUELL,
F-1500/LS 254. Las placas se revelaron con oleum
(CH_{3}COOH 80%, H_{2}O 16% y H_{2}SO_{4} 4%),
calentándolas posteriormente a 120ºC. Para la cromatografía en capa
fina preparativa se usaron placas de 1 mm de espesor SCHLEICHER
& SCHUELL F-1510/LS 254 20 x 20 cm. Para las
columnas tanto húmedas como secas se utilizó gel de sílice (0.0063
- 0.0020 nm) ó 60 G de la casa MERCK, para las cromatografías en
SEPHADEX LH-20 de la casa PHARMACIA FINE CHEMICALS.
Las columnas se montaron de la siguiente forma: durante al menos
una noche se dejó la cantidad de SEPHADEX deseada en suspensión con
metanol (1 g para 3,9-4,1 cm^{3}) y se vertió en
la columna dejándola reposar. Cada vez que se cambió el disolvente
empleado como eluyente se pasó al menos, unas tres veces, una
cantidad equivalente al volumen muerto de la columna. El producto
se deposita en la parte superior disuelto en una cantidad de
disolvente no inferior al 5% del volumen muerto de la
columna.The purifications of the spectroscopy compounds were performed in a high-efficiency liquid chromatography equipment consisting of two SHIMADZU LC-9A pumps and a SHIMADZU SPD-6AV variable wavelength UV-VIS spectrophotometric detector, equipped with a WATERS column of 19 x 150 mm filled with 10 µm silica gel with particle size, always using LKrosolv grade solvent eluents from the MERCK house. For the performance of the NMR experiments, the products were dissolved in CDCl 3, C 6 C 6, Py-D 5, CD 3 OD, C 2 D 6 CO , using Tms as internal reference. 1 H NMR spectra were performed on BRUKER WP-200 SY (200 MHz) and BRUKER AMX 400 (400 MHz) spectrometers, and 13 C NMR spectrometers were performed on a WP-200 SY spectrometer ( 200 MHz) and BRUKER AMX 400 (400 MHz), WP-200 SY (50 MHz) and BRUKER AMX 400 (100 MHz). IR spectra were made using CHCl 3 film or solution of the pure product in NaCl cells, in a PERKIN ELMER spectrophotometer, model 1600 (FTIR). UV spectra were performed on a PERKIN ELMER 550 SE spectrophotometer, with 5 mm quartz cells using EtOH as solvent. The determination of molecular formulas of fragments and molecular ion were performed on a high resolution spectrometer VG-MICROMASS, ZAB-2F, at ionization potentials of 15 or 70 eV. Low resolution mass spectra were performed on a HEWLETT-PAKARD spectrometer, model 5995. The determination of optical activities was performed on a PERKIN ELMER polarimeter, model 141, using sodium D line, at 25 ° C and in CHCl_ solution. {3} with 1 dm cells. Thin layer chromatographs were performed on G-type silica gel chromatopholics, with luminescence indicator at 254 nm, SCHLEICHER & SCHUELL, F-1500 / LS 254. Plates were developed with oleum (CH 3 COOH 80%, H 2 O 16% and H 2 SO 4 4%), subsequently heating them to 120 ° C. For preparative thin layer chromatography, 1 mm thick plates SCHLEICHER & SCHUELL F-1510 / LS 254 20 x 20 cm were used. For both wet and dry columns, silica gel (0.0063 - 0.0020 nm) or 60 G of the MERCK house was used, for SEPHADEX LH-20 chromatographs of the PHARMACIA FINE CHEMICALS house. The columns were mounted as follows: for at least one night the desired amount of SEPHADEX was left in suspension with methanol (1 g for 3.9-4.1 cm 3) and poured into the column leaving it to stand . Each time the solvent used as an eluent was changed, at least three times, an amount equivalent to the dead volume of the column was passed. The product is deposited on top dissolved in an amount of solvent not less than 5% of the dead volume of the
column.
Ejemplo 1.2Example 1.2
El aislamiento de los compuestos de triterpeno
se resume más adelante en el Esquema I. El material de plantas
fresco (156.8 g) se sometió a un proceso de liofilización y después
de 36 horas se obtuvo la planta deshidratada. La planta
deshidratada se extrajo con 200 al de hexano (3 repeticiones), y se
dejó durante 6 horas a temperatura ambiente. La evaporación del
hexano rindió 235.5 mg de extracto hexánico. Este extracto se pasó
a través de una columna cromatográfica de gel de sílice. La elución
del residuo se hizo con un gradiente de polaridad creciente de
hexano y EtOAc, recogiendo 200 fracciones (50 ml cada una). En base
al análisis por TLC, se combinaron en tres fracciones
F-1, F-2 y F-3, la
fracción F-1 contenía las ceras, la
F-2 los ácidos grasos y la F-3 los
diterpenos. Una segunda extracción con CH_{2}Cl_{2} (tres
repeticiones de 200 ml cada una), rindió un extracto verdoso de
diclorometano (228 mg). La cromatografía de este extracto sobre gel
de sílice, utilizando gradientes de elución de polaridad creciente
de hexano-EtOAc y en base al análisis por TLC se
combinaron en cuatro fracciones F-1,
F-2, F-3 y F-4. Las
purificaciones continuas por cromatografía con gel de sílice y
cromatografía preparativa además de análisis por ^{1}H y ^{13}C
- NMR verificaron en las F-1 y F-2
la presencia de ácidos grasos y triterpenos en las fracciones
F-3
y F-4.The isolation of the triterpene compounds is summarized below in Scheme I. The fresh plant material (156.8 g) was subjected to a lyophilization process and after 36 hours the dehydrated plant was obtained. The dehydrated plant was extracted with 200 hexane (3 repetitions), and left for 6 hours at room temperature. Hexane evaporation yielded 235.5 mg of hexane extract. This extract was passed through a silica gel chromatographic column. Elution of the residue was done with a gradient of increasing polarity of hexane and EtOAc, collecting 200 fractions (50 ml each). Based on the TLC analysis, they were combined in three fractions F-1, F-2 and F-3, fraction F-1 contained waxes, F-2 fatty acids and F-3 diterpenes. A second extraction with CH 2 Cl 2 (three repetitions of 200 ml each) yielded a green dichloromethane extract (228 mg). Chromatography of this extract on silica gel, using elution gradients of increasing hexane-EtOAc polarity and based on TLC analysis, were combined in four fractions F-1, F-2, F-3 and F-4. Continuous purifications by silica gel chromatography and preparative chromatography in addition to 1 H and 13 C-NMR analysis verified in the F-1 and F-2 the presence of fatty acids and triterpenes in the F fractions -3
and F-4.
El material de plantas que quedó después de la extracción continua con CH_{2}Cl_{2} se sometió a una tercera extracción con una mezcla de MeOH-H_{2}O (50%). Después de la evaporación del MeOH en un rotavapor se obtuvo una fase acuosa (3.964 g). La fase acuosa se extrajo 5 veces con n-butanol (200 ml cada una) y la evaporación del n-butanol utilizando evaporación rotativa a alto vacío utilizando nitrógeno líquido, dio un extracto butanólico (910 mg) y un resto de fase acuosa (3.050 g). Cromatografías repetidas del extracto butanólico sobre Sephadex LH-20 (MeOH) además de los análisis por ^{1}H y ^{13}C-NMR verificaron la presencia de compuestos de triterpeno glicosilados (480 mg) y compuestos glicosilados aromáticos.The plant material that remained after the Continuous extraction with CH2Cl2 was subjected to a third Extraction with a mixture of MeOH-H2O (50%). After evaporation of MeOH in a rotary evaporator, a aqueous phase (3,964 g). The aqueous phase was extracted 5 times with n-butanol (200 ml each) and evaporation of n-butanol using rotary evaporation at high vacuum using liquid nitrogen, gave a butanolic extract (910 mg) and an aqueous phase residue (3,050 g). Repeated chromatographs of the butanolic extract on Sephadex LH-20 (MeOH) in addition to the 1 H and 13 C-NMR analyzes verified the presence of glycosylated triterpene compounds (480 mg) and aromatic glycosylated compounds.
El residuo de la fase acuosa se sometió a purificaciones repetidas sobre Sephadex LH-20 (MeH:H_{2}O 7:3) para dar la mezcla de compuestos glicosilados (2.500 g). El material de plantas (primer residuo) del extracto de MeH:H_{2}O se extrajo posteriormente con H_{2}O. Este extracto fue liofilizado, obteniéndose un polvo amarillento pálido. El análisis por ^{1}H-NMR indicó la presencia de una mezcla de glicosilados.The residue of the aqueous phase was subjected to repeated purifications on Sephadex LH-20 (MeH: H2O 7: 3) to give the mixture of glycosylated compounds (2,500 g). The plant material (first residue) of the extract of MeH: H2O was subsequently extracted with H2O. This extract It was lyophilized, obtaining a pale yellowish powder. He 1 H-NMR analysis indicated the presence of a glycosylated mixture
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(Esquema pasa a página siguiente)(Scheme turns to page next)
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Esquema 1Scheme one
Aislamiento de los principios activos de Anredera c. Isolation of the active ingredients of Anredera c.
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El aislamiento de los diterpeno fenoles de S. canariensis se resume más adelante en el Esquema 2. 1,5 Kg de la parte aérea seca de S. canariensis cultivada, de la cual un espécimen se encuentra depositado en el Herbolario del Departamento de Botánica de la Facultad de Biología de la Universidad de La Laguna. El material vegetal seco fue finamente triturado y macerado con acetona destilada a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida a 40ºC, obteniéndose 112,65 gr de extracto.The isolation of the diterpene phenols of S. canariensis is summarized below in Scheme 2. 1.5 Kg of the dry aerial part of cultivated S. canariensis , of which a specimen is deposited in the Herbalist of the Department of Botany of the Faculty of Biology of the University of La Laguna. The dried plant material was finely crushed and macerated with acetone distilled at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure at 40 ° C, obtaining 112.65 g of extract.
El extracto así obtenido se disolvió en 250 ml de acetato de etilo, y se extrajo 5 veces con una disolución acuosa de NaOH 1N. Cada fracción acuosa (por separado) se aciduló usando una disolución de HCl al 5%. Las fases acuosas aciduladas se extrajeron cada una 3 veces con porciones de 100 ml de acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtraron y el disolvente se eliminó a presión reducida en el rotavapor, obteniéndose de esta manera 5 fracciones, de las cuales después de realizar un análisis por capa fina se decidió reunir de la 2ª a la 5ª y desecharse la 1ª.The extract thus obtained was dissolved in 250 ml. of ethyl acetate, and extracted 5 times with an aqueous solution of 1N NaOH. Each aqueous fraction (separately) was acidified using a solution of 5% HCl. The acidified aqueous phases are each extracted 3 times with 100 ml portions of acetate ethyl. The organic extracts were dried over Na2SO4 anhydrous, filtered and the solvent was removed under reduced pressure in the rotary evaporator, thus obtaining 5 fractions, of the which after performing a thin layer analysis it was decided gather from the 2nd to the 5th and discard the 1st.
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Las fracciones 2 a la 5 se cromatografiaron en una columna de Sephadex LH-20, usando como mezcla eluyente n-Hexano/CH_{2}Cl_{2}/MeOH en la proporción 2:1:1. Tras realizar el correspondiente análisis en cromatografía en capa fina, se reunieron aquellas fracciones donde el carnosol era el producto mayoritario y se pusieron a cristalizar en la mezcla acetona/diclorometano. De este modo, el proceso rindió 1,73 gr de carnosol puro.Fractions 2 through 5 were chromatographed on a column of Sephadex LH-20, using as a mixture eluent n-Hexane / CH 2 Cl 2 / MeOH in the 2: 1: 1 ratio. After performing the corresponding analysis in thin layer chromatography, those fractions where carnosol was the majority product and began to crystallize in the acetone / dichloromethane mixture. In this way, the process yielded 1.73 gr of pure carnosol.
Esquema 2Scheme 2
Estos ejemplos ilustran la efectividad de la mezcla hipoglucemiante de triterpenos y diterpenos, reduciendo la concentración de glucosa en sangre en ratones obesos db/db, un reconocido modelo de la diabetes no insulinodependiente, usado en ensayos sobre actividad hipoglucemiante en mamíferos, incluidos los humanos.These examples illustrate the effectiveness of the hypoglycemic mixture of triterpenes and diterpenes, reducing blood glucose concentration in obese mice db / db, a recognized model of non-insulin dependent diabetes, used in trials on hypoglycemic activity in mammals, including humans.
Se adquirieron ratones obesos y diabéticos alterados genéticamente (C57BUKs-db/db) al Laboratorio Jackson (The Jackson Laboratory, Bar Harbour Me., USA) que sirvieron como animales de experimentación.Obese and diabetic mice were acquired genetically altered (C57BUKs-db / db) at Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor Me., USA) They served as experimental animals.
Se escogieron machos con edades comprendidas entre las 7 y 9 semanas, para el estudio. Los animales se distribuyeron en jaulas (4 ratones/jaula) que se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio a 22ºC y se alimentaron con pienso Purina® para roedores, y agua a demanda. Se usaron 15 animales seleccionados aleatoriamente, sin tener en cuenta previamente su nivel de glucosa en sangre.Males with ages included were chosen between 7 and 9 weeks, for the study. The animals are distributed in cages (4 mice / cage) that were kept in standard laboratory conditions at 22 ° C and fed with I think Purina® for rodents, and water on demand. 15 were used randomly selected animals, regardless previously your blood glucose level.
A 11 ratones diabéticos C57BUKs-db/db, se les administró, mediante inyección intraperitoneal, 0.5 ml de mezcla de diterpenos y triterpenos con una dosis de 2 g/kg peso. Los 4 restantes sirvieron de control, inyectándoles 0.5 ml de suero fisiológico (NaCl 0.9%).11 diabetic mice C57BUKs-db / db, were administered by intraperitoneal injection, 0.5 ml of diterpene mixture and triterpenes with a dose of 2 g / kg weight. The remaining 4 served control, injecting 0.5 ml of physiological serum (NaCl 0.9%)
Cuatro horas más tarde (tiempo = 0) se tomó una muestra de sangre de la cola, sobre la cual se determino la concentración de glucosa, para después administrar a cada ratón del ensayo una carga de glucosa de 150 mg/ratón, mediante sonda gástrica.Four hours later (time = 0) a blood sample from the tail, on which the glucose concentration, then administer to each mouse of the test a glucose load of 150 mg / mouse, by probe gastric
Se tomaron muestras de sangre de las colas, a los 30, 60 y 120 minutos, además de a las 16 horas, en condiciones de ayuno tras las administración inicial de glucosa (150 mg/ratón). Las muestras de sangre fueron analizadas mediante el medidor de glucosa Glucocard G Meter® (Menarini Diagnostics) y sus correspondientes tiras reactivas Glucocard G Sensor® (Menarini Diagnostics).Blood samples were taken from the tails, to 30, 60 and 120 minutes, in addition to at 16 hours, in conditions fasting after initial glucose administration (150 mg / mouse). Blood samples were analyzed by Glucocard G Meter® glucose meter (Menarini Diagnostics) and its corresponding Glucocard G Sensor® test strips (Menarini Diagnostics).
Analizando los datos estadísticamente (ANOVA) se puede observar como existen evidencias estadísticamente significativas de la actividad hipoglucemiante de la mezcla de triterpenos y diterpenos objeto de esta patente.Analyzing the data statistically (ANOVA) is You can see how there is evidence statistically significant hypoglycemic activity of the mixture of triterpenes and diterpenes object of this patent.
Como se puede observar en la Fig. 1, la administración intraperitoneal de la mezcla hipoglucemiante de triterpenos y diterpenos en ratones obesos y diabéticos alterados genéticamente (C57BUKs-db/db) a una dosis de 2 g/kg peso, produjo una reducción de la glucemia estadísticamente significativa, en relación con los ratones control tratados con suero fisiológico, a los 0 y 60 minutos, y a las 16 horas tras la administración de glucosa.As can be seen in Fig. 1, the intraperitoneal administration of the hypoglycemic mixture of triterpenes and diterpenes in obese and diabetic altered mice genetically (C57BUKs-db / db) at a dose of 2 g / kg weight, produced a reduction in blood glucose statistically significant, in relation to control mice treated with physiological serum, at 0 and 60 minutes, and at 16 hours after glucose administration
Se adquirieron ratones obesos y diabéticos modificados genéticamente (C57BUKs-db/db) al Laboratorio Jackson (The Jackson Laboratory, Bar Harbour Me., USA) que sirvieron como animales de experimentación.Obese and diabetic mice were acquired genetically modified (C57BUKs-db / db) at Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor Me., USA) They served as experimental animals.
Se escogieron machos con edades comprendidas entre las 8 y 10 semanas, para el estudio. Los animales se distribuyeron en jaulas (2 ratones/jaula), se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio a 22ºC y se alimentaron con pienso Purina® para roedores. Se usaron 6 animales seleccionados aleatoriamente, sin tener en cuenta su nivel de glucosa en sangre al inicio del tratamiento.Males with ages included were chosen between 8 and 10 weeks, for the study. The animals are distributed in cages (2 mice / cage), kept in standard laboratory conditions at 22 ° C and fed with I think Purina® for rodents. 6 selected animals were used randomly, regardless of your blood glucose level at the beginning of treatment.
Se les suministró, por espacio de 28 días, a
cuatro de los ratones, y ad libitum una disolución de la
mezcla hipoglucemiante de triterpenos y diterpenos como bebida, con
una concentración de 60 mg/ml. A dos ratones, identificados como
control, se les administro agua normal (embotellada, Fuente Alta)
como bebida, por el mismo periodo de
tiempo.Four of the mice were given, for 28 days, and ad libitum a solution of the hypoglycemic mixture of triterpenes and diterpenes as a drink, with a concentration of 60 mg / ml. Two mice, identified as control, were given normal water (bottled, High Source) as a drink, for the same period of
weather.
Se tomó cada 4 días una muestra de sangre de la cola, tras ayuno de una noche, sobre la que se determino la concentración de glucosa. Se determinó también el peso de los animales para ver su evolución en el tiempo. Las muestras de sangre fueron analizadas mediante el medidor de glucosa Glucocard G Meter® (Menarini Diagnostics) y sus correspondientes tiras reactivas Glucocard G Sensor® (Menarini Diagnostics).A blood sample was taken every 4 days from the tail, after one night's fast, upon which the glucose concentration The weight of the animals to see their evolution over time. Blood samples were analyzed using the Glucocard G Meter® glucose meter (Menarini Diagnostics) and their corresponding test strips Glucocard G Sensor® (Menarini Diagnostics).
Analizando los datos mediante la comparación de las gráficas se puede observar como existen datos significativos de la actividad hipoglucemiante de la mezcla de triterpenos y diterpenos objeto de esta patente.Analyzing the data by comparing the graphs can be seen as there are significant data of the hypoglycemic activity of the triterpene mixture and diterpenes object of this patent.
Como se puede observar en las Fig. 2-7, la administración continuada de una disolución de la mezcla hipoglucemiante de triterpenos y diterpenos a ratones obesos y diabéticos alterados genéticamente (C57BUKs-db/db) a una concentración de 60 mg/ml, produjo una significativa reducción de la glucemia y el control de ésta a lo largo del tiempo, en relación con los ratones control, tratados con agua ad libitum.As can be seen in Figs. 2-7, continued administration of a solution of the hypoglycemic mixture of triterpenes and diterpenes to genetically altered obese and diabetic mice (C57BUKs-db / db) at a concentration of 60 mg / ml, produced a significant reduction of glycemia and its control over time, in relation to control mice, treated with water ad libitum .
\newpage\ newpage
La presente invención no debe ser limitada en
alcance por las realizaciones específicas descritas en los ejemplos
los cuales pretenden ilustrar algunos aspectos de la invención y
cualquier realización que sea funcionalmente equivalente está
dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias
modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y
descritas aquí serán aparentes para el experto en la materia y
están recogidas en las presentes reivindi-
caciones.The present invention should not be limited in scope by the specific embodiments described in the examples which are intended to illustrate some aspects of the invention and any embodiment that is functionally equivalent is within the scope of this invention. In fact, several modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to the person skilled in the art and are included in the present claims.
cations
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