ES2253028B1

ES2253028B1 - "EMPLOYMENT OF THE GEN SLUG, ITS TRANSCRIPTION OR EXPRESSION PRODUCTS, AND / OR INHIBITING OR STIMULATING COMPOUNDS OF THE SLUG EXPRESSION TO CONFER RADIORESISTENCE OR CELLULAR RADIOPROTECTION.

Info

Publication number: ES2253028B1
Application number: ES200301296A
Authority: ES
Inventors: Isidro Sanchez-Garcia; Manuel Sanchez-Martin
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Salamanca
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Salamanca
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: ES2253028A1

Abstract

La expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular. Por tanto, se puede conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug reprimiendo su expresión o bien se puede conferir radioprotección a células normales activando la expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, produciéndose de este modo un incremento en la eficacia de la radioterapia al reducir, o eliminar, el riesgo de un posible fracaso. De aplicación en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, en la elaboración de composiciones farmacéuticas que aumentan la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o composiciones farmacéuticas que confieren radioprotección o radioresistencia a células normales.The expression of the Slug gene is related to cellular resistance to irradiation since its absence produces an increase in cellular radiosensitivity. Therefore, radiosensitivity can be conferred to tumor cells expressing Slug by repressing its expression or radioprotection can be conferred to normal cells by activating the expression of the Slug gene, its transcription or expression products, thereby producing an increase in the efficacy of the Radiation therapy by reducing, or eliminating, the risk of a possible failure. For application in the treatment of cancer, for example, in the preparation of pharmaceutical compositions that increase the radiosensitivity of tumor cells expressing Slug or pharmaceutical compositions that confer radioprotection or radiosistance to normal cells.

Description

Empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, y/o compuestos inhibidores o estimuladores de la expresión de Slug para conferir radiosensibilización o radioprotección celular.Use of the Slug gene, its transcription or expression products, and / or compounds that inhibit or stimulate Slug expression to confer cellular radiosensitization or radioprotection.

Field of the Invention

Esta invención se relaciona, en general, con composiciones y métodos para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales o la radioresistencia de células normales basados en la represión o expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, y/o en el empleo de compuestos capaces de interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína en células tumorales o de compuestos capaces de aumentar la expresión del producto del gen Slug en células normales.This invention relates, in general, to compositions and methods for increasing the radiosensitivity of tumor cells or the radioresistance of normal cells based on repression or expression of the Slug gene, its transcription or expression products, and / or the use of compounds. capable of interfering with the Slug function at the level of nucleic acid or protein in tumor cells or compounds capable of increasing the expression of the Slug gene product in normal cells.

Background of the invention

Una de las alternativas terapéuticas para el tratamiento del cáncer consiste en someter al paciente a radioterapia. No obstante, el empleo de radioterapia en el tratamiento de tumores presenta una utilidad limitada debido, entre otras causas, a la existencia de tumores que no responden a radioterapia, y, por otra parte, a la ausencia de dianas específicas. Las bases genéticas relacionadas con la resistencia a la radioterapia en algunas células tumorales todavía no se conoce muy bien. Sin embargo, para mejorar la especificidad se han desarrollado metodologías que emplean radioterapia dirigida en donde los radioisótopos se conjugan a unos agentes selectivos capaces de localizar los tumores. Lamentablemente, el número de dichos agentes selectivos es muy reducido para el elevado número de tipos de tumores existentes.One of the therapeutic alternatives for Cancer treatment involves subjecting the patient to radiotherapy. However, the use of radiotherapy in the Tumor treatment has limited utility due, among other causes, to the existence of tumors that do not respond to radiotherapy, and, on the other hand, the absence of targets specific. The genetic basis related to resistance to radiotherapy in some tumor cells is not yet known very good. However, to improve specificity they have developed methodologies that employ targeted radiation therapy in where radioisotopes are conjugated to selective agents able to locate tumors. Unfortunately, the number of said selective agents is very small for the high number of types of existing tumors.

También se han desarrollado metodologías para el tratamiento de enfermedades neoplásicas que pretenden mejorar la especificidad del tratamiento utilizando un tipo de compuestos conocidos como "radiosensibilizadores", es decir, compuestos que aumentan la sensibilidad de las células tratadas a la irradiación (radiación \gamma). Entre dichos compuestos radiosensibilizadores se encuentra el 5-fluorouracilo que tiene la capacidad de incrementar la sensibilidad celular a la radiación. No obstante, debido a a naturaleza inespecífica de estos y otros compuestos radiosensibilizadores, la radiosensibilidad de las células normales también se ve incrementada. Por tanto, es necesario identificar nuevas dianas que permitan desarrollar compuestos radiosensibilizadores con especificidad mejorada capaces de aumentar de forma preferencial la radiosensibilidad de las células tumorales.Methodologies have also been developed for the treatment of neoplastic diseases that aim to improve the treatment specificity using a type of compounds known as "radiosensitizers", that is, compounds that increase the sensitivity of treated cells to the irradiation (γ radiation). Among those compounds radiosensitizers is the 5-fluorouracil that has the ability to Increase cellular sensitivity to radiation. However, due to the non-specific nature of these and other compounds radiosensitizers, the radiosensitivity of normal cells It is also increased. Therefore, it is necessary to identify new targets that allow developing compounds radiosensitizers with improved specificity capable of increasing preferentially the radiosensitivity of the cells Tumor

Ahora se ha encontrado que la expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular.It has now been found that the expression of the Slug gene is related to cellular resistance to irradiation since its absence produces an increase in cellular radiosensitivity.

El gen Slug es un gen presente en los vertebrados que codifica para la proteína Slug, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc", implicado en las transiciones epiteliales- mesenquimales [Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)]. Además, Slug es el responsable de las funciones del factor de células madre (SCF) y su receptor c-kit.The Slug gene is a gene present in vertebrates that codes for the Slug protein, a "zinc fingers" type transcription factor, involved in epithelial-mesenchymal transitions [Nieto et al ., Science 264: 835-849 (1994 )]. In addition, Slug is responsible for the functions of the stem cell factor (SCF) and its c-kit receptor.

El SCF es el producto del locus steel (S1) de ratón y es el ligando del receptor de tipo tirosina quinasa c-kit que está codificado por el locus white spotting (W) de ratón. El ligando c-kit parece tener actividades únicas y no redundantes sobre las células progenitoras primitivas. En este sentido, existe una amplia evidencia de que el SCF, en ausencia de otras citoquinas, promueve selectivamente la viabilidad más que la proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas murinas primitivas. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares que proporcionan especificidad biológica a la vía de transducción de señales de SCF/c-kit en la formación y migración de las células c-kit^{+}. Recientemente, se ha podido demostrar que los ratones Slug mutantes tienen características fenotípicas similares a las de los ratones S1 y W mutantes (consistentes en deficiencia pigmentaria, defectos gonadales y alteración de la hematopoyesis) y se ha identificado al factor de transcripción Slug como una diana molecular que contribuye a la especificidad biológica de la vía de transducción de señales del SCF/c-kit. Los genes Kit y Slug modulan de forma coordinada el desarrollo y supervivencia de líneas de melanocitos y de líneas hematopoyéticas en ratones kit deficientes y Slug deficientes.The SCF is the product of the mouse steel locus (S1) and is the ligand of the c-kit tyrosine kinase receptor that is encoded by the mouse white spotting (W) locus. The c-kit ligand appears to have unique and non-redundant activities on primitive progenitor cells. In this sense, there is ample evidence that the SCF, in the absence of other cytokines, selectively promotes viability rather than the proliferation of primitive murine hematopoietic progenitor cells. However, the molecular mechanisms that provide biological specificity to the SCF / c-kit signal transduction pathway in the formation and migration of c-kit + cells are unknown. Recently, it has been possible to demonstrate that mutant Slug mice have phenotypic characteristics similar to those of mutant S1 and W mice (consisting of pigmentary deficiency, gonadal defects and hematopoiesis alteration) and the Slug transcription factor has been identified as a target molecular that contributes to the biological specificity of the signal transduction pathway of the SCF / c-kit. The Kit and Slug genes coordinate in a coordinated way the development and survival of melanocyte lines and hematopoietic lines in deficient kit mice and deficient Slug.

Las propiedades biológicas del SCF han demostrado que la acción del SCF se produce en poblaciones celulares muy primitivas. En este sentido, se requiere la producción endógena del SCF para sobrevivir a la irradiación letal [Zsebo KH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 89:9464-9468; Neta R et al., Blood, 1993; 81:324-327]. La supervivencia tras la radiación con una dosis letal (LD_{100/30}, dosis de radiación letal para el 100% de los ratones en 30 días) está basada en la recuperación de la función alterada del sistema hematopoyético, ya que el trasplante de células de médula ósea normales en animales y humanos irradiados con dosis letales tiene como resultado la supervivencia a largo plazo y proporciona una prueba de que el sistema hematopoyético es crucial para la defensa frente a las complicaciones letales inducidas por la radiación. La DL_{100} para los animales mutantes Si es de 200 a 300 rads, mientras que la DLloo de sus homólogos congénicos está comprendida entre 720 y 900 rads [Harrison DE et al., Br. J. Haematol 1972; 22:155-168; Kaczmarek L et al., Int. J. Radiot. Biol. 1988; 53:703-708], lo que demuestra que la ausencia de SCF aumenta la radiosensibilidad.The biological properties of SCF have shown that the action of SCF occurs in very primitive cell populations. In this sense, endogenous SCF production is required to survive lethal irradiation [Zsebo KH et al ., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1993; 89: 9464-9468; Neta R et al ., Blood, 1993; 81: 324-327]. Survival after radiation with a lethal dose (LD 100/30, lethal radiation dose for 100% of mice in 30 days) is based on the recovery of the altered function of the hematopoietic system, since the transplantation of Normal bone marrow cells in animals and humans irradiated with lethal doses results in long-term survival and provides proof that the hematopoietic system is crucial for defense against lethal radiation-induced complications. The DL 100 for mutant animals Si is 200 to 300 rads, while the DLloo of its congenital counterparts is between 720 and 900 rads [Harrison DE et al ., Br. J. Haematol 1972; 22: 155-168; Kaczmarek L et al ., Int. J. Radiot. Biol. 1988; 53: 703-708], which shows that the absence of SCF increases radiosensitivity.

Por otra parte, se ha descrito el empleo del gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión, en la detección y/o tratamiento de células cancerigenas [WO 02/059361]. También se ha descrito el empleo del gen Slug y de su producto de expresión en la movilización de células madre hematopoyéticas para transplante o terapia génica, en la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas, y/o en el tratamiento de problemas de esterilidad masculina [PCT02/ES02/00520].On the other hand, the use of the Slug gene, or its transcription or expression products, in the detection and / or treatment of cancer cells has been described [WO 02/059361]. The use of the Slug gene and its expression product has also been described in the mobilization of hematopoietic stem cells for transplantation or gene therapy, in the ex vivo expansion of hematopoietic stem cells, and / or in the treatment of male sterility problems [ PCT02 / ES02 / 00520].

Compendium of the invention

La invención se enfrenta, en general, con la búsqueda de medios para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento del cáncer por radioterapia.The invention generally faces the search for means to improve the therapeutic efficacy of Radiation therapy cancer treatment.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han descubierto, sorprendentemente, que la expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular. Los resultados de este descubrimiento pueden ser utilizados para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug o radioprotección a células normales que expresan, o no, Slug, mediante la represión o expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, así como para identificar compuestos capaces de anular o minimizar la expresión de Slug en células tumorales que expresan el gen Slug, lo que aumenta la radiosensibilidad de las mismas, o bien para identificar compuestos que aumenten la expresión de Slug en células normales o sanas, que expresen o no Slug, lo que aumenta la resistencia de dichas células normales a la irradiación (radioresistencia o radioprotección). En cualquiera de los casos se produce un incremento en la eficacia del tratamiento del cáncer mediante radioterapia al reducir, o eliminar, el riesgo de un posible fracaso de la radio-
terapia.The solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have surprisingly discovered that the expression of the Slug gene is related to cellular resistance to irradiation since its absence produces an increase in cellular radiosensitivity. The results of this discovery can be used to confer radiosensitivity to tumor cells that express Slug or radioprotection to normal cells that express, or not, Slug, by repression or expression of the Slug gene, its transcription or expression products, as well as to identify compounds capable of canceling or minimizing Slug expression in tumor cells that express the Slug gene, which increases their radiosensitivity, or to identify compounds that increase Slug expression in normal or healthy cells, which express or not Slug , which increases the resistance of said normal cells to irradiation (radiosistance or radioprotection). In either case, there is an increase in the effectiveness of cancer treatment by radiotherapy by reducing, or eliminating, the risk of a possible failure of the radio-
therapy.

La destrucción del sistema hematopoyético inducida por irradiación es la principal causa de muerte según los hallazgos en los que se observa que la transferencia de células de médula ósea normales evita la muerte debida a la irradiación letal. Anteriormente se había relacionado la vía de transducción de señales del SCF/c-kit con la recuperación hematopoyética que evita la muerte debida a la irradiación de una dosis letal, aunque se desconocían los mecanismos moleculares que median este efecto biológico. Dado que mutaciones en los genes SCF, c-Kit y Slug tienen un fenotipo similar en ratones, los inventores han examinado si Slug podría complementar la radiosensibilidad de ratones kit-deficientes. Ahora se ha comprobado (véase el Ejemplo) que Slug actúa como un agente radioprotector ya que su ausencia tiene como consecuencia un aumento de la radiosensibilidad. Este efecto no puede recuperarse activando la vía de señalización de SCF/c-kit en ratones Slug deficientes irradiados con dosis letales, ya que los ratones tratados con SCF no mostraron estimulación de la recuperación hematopoyética que condujese a la supervivencia de los ratones Slug deficientes. Se ha encontrado que se podía complementar el fallo hematopoyético en ratones c-kit deficientes irradiados con dosis letales transduciéndoles con una proteína TAT-Slugh. Estos resultados ponen de manifiesto que el factor de transcripción Slug es absolutamente necesario para la supervivencia a la irradiación a dosis letales y que Slug es la diana molecular que media en la radioprotección celular a través de la vía de transducción de señales SCF/c-kit. Estos resultados indican que Slug es un componente molecular que confiere radiorresistencia a las células cancerígenas.The destruction of the hematopoietic system induced by irradiation is the main cause of death according to the findings in which it is observed that the transfer of normal bone marrow cells prevents death due to lethal irradiation. Previously, the signal transduction pathway of SCF / c-kit had been related to hematopoietic recovery that prevents death due to irradiation of a lethal dose, although the molecular mechanisms that mediate this biological effect were unknown. Since mutations in the SCF, c-Kit and Slug genes have a similar phenotype in mice, the inventors have examined whether Slug could complement the radiosensitivity of kit-deficient mice. It has now been proven (see Example) that Slug acts as a radioprotective agent since its absence results in an increase in radiosensitivity. This effect cannot be recovered by activating the SCF / c-kit signaling pathway in deficient Slug mice irradiated with lethal doses, since SCF treated mice showed no stimulation of hematopoietic recovery leading to the survival of deficient Slug mice. It has been found that hematopoietic failure could be complemented in deficient c-kit mice irradiated with lethal doses by transducing them with a TAT-Slugh protein. These results show that the Slug transcription factor is absolutely necessary for survival at lethal dose irradiation and that Slug is the molecular target that mediates cellular radioprotection through the SCF / c-kit signal transduction pathway. . These results indicate that Slug is a molecular component that confers radiation resistance to cancer cells.

Por consiguiente, la invención se relaciona, por una parte, con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug. La reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede conseguirse mediante el empleo de "inhibidores de Slug", es decir, compuestos que reducen, inhiben o reprimen la expresión de Slug. Este aumento en la radiosensibilidad de dichas células tumorales permite utilizar dosis de irradiación más bajas. Por consiguiente, el gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, pueden utilizarse en la búsqueda de inhibidores de Slug. Dichos compuestos, al reducir, anular o reprimir la expresión de Slug, aumentan la radiosensibilidad de las células tumorales que expresan Slug, lo que permite utilizar dosis de irradiación más bajas, y, podrían ser utilizados, por tanto, en el tratamiento del cáncer.Accordingly, the invention relates, on the one hand, to the reduction, inhibition or repression of the Slug gene, its transcription or translation products, to confer radiosensitivity to tumor cells expressing Slug. The reduction, inhibition or repression of the Slug gene, its transcription or translation products, can be achieved through the use of "Slug inhibitors", that is, compounds that reduce, inhibit or repress the expression of Slug. This increase in the radiosensitivity of these tumor cells allows lower irradiation doses to be used. Therefore, the Slug gene, its transcription or translation products, can be used in the search for Slug inhibitors. Such compounds, by reducing, canceling or suppressing Slug expression, increase the radiosensitivity of tumor cells expressing Slug, which allows for lower irradiation doses to be used, and, therefore, could be used in the treatment of cancer.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug.Thus, in one aspect, the invention relates to the reduction, inhibition or repression of the Slug gene, its transcription or translation products, to confer radiosensitivity to tumor cells expressing Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de inhibidores de Slug para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug.In another aspect, the invention relates to the use of Slug inhibitors to confer radiosensitivity to tumor cells expressing Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un inhibidor de Slug, por ejemplo, un compuesto con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o proteína. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.In another aspect, the invention relates to a composition comprising a Slug inhibitor, for example, a compound capable of interfering with the Slug function at the level of nucleic acid or protein. In a particular embodiment, said Composition is a pharmaceutical composition.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho inhibidor de Slug en la elaboración de una composición para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer, en particular, de células tumorales que expresan Slug. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.In another aspect, the invention relates to the use of said Slug inhibitor in the elaboration of a composition to increase the radiosensitivity of tumor cells that express Slug or in the elaboration of a composition for the cancer treatment, in particular, of tumor cells that express Slug. In a particular embodiment, said composition is A pharmaceutical composition

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación ("screening") de un compuesto capaz de reducir, anular o reprimir la expresión del gen Slug.In another aspect, the invention relates to a method for the identification ("screening") of a compound capable of reducing, canceling or repressing the expression of the Slug gene.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción o traducción de dicho gen y/o sobre sus productos de transcripción o expresión, y seleccionar los compuestos que tienen la capacidad de interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o proteína.In another aspect, the invention relates to a method for the identification of a potentially useful compound for the treatment of cancer which comprises testing said compound in a cellular system that expresses the Slug gene, evaluating the effect of said compound on transcription or translation. of said gene and / or its transcription or expression products, and select the compounds that have the ability to interfere with the Slug function at the nucleic acid or protein level.

Por otra parte, la invención también se relaciona con la expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radioprotección o radioresistencia a células normales o sanas. La expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede ser aumentada, lo que incrementaria la radioprotección o radioresistencia celular, mediante el empleo de "estimuladores de Slug", es decir, compuestos que aumentan o activan la expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión. Este aumento en la radioresistencia de dichas células normales permite reducir la toxicidad sobre dichas células asociada con la radioterapia. Por consiguiente, el gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede utilizarse en la búsqueda de estimuladores de Slug. Dichos compuestos actúan como radioprotectores de las células normales ya que aumentan su radioresistencia, lo que reduce la toxicidad asociada con la radioterapia, y pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.On the other hand, the invention also relates to the expression of the Slug gene, its transcription or translation products, to confer radioprotection or radiosistance to normal or healthy cells. The expression of the Slug gene, its transcription or translation products, can be increased, which would increase radioprotection or cellular radiosistance, through the use of "Slug stimulators", that is, compounds that increase or activate the expression of the Slug gene, its transcription or expression products. This increase in the radioresistance of said normal cells allows to reduce the toxicity on said cells associated with radiotherapy. Therefore, the Slug gene, its transcription or translation products, can be used in the search for Slug stimulators. Such compounds act as radioprotectors of normal cells as they increase their radioresistance, which reduces the toxicity associated with radiotherapy, and can be used in the treatment of cancer.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, y/o estimuladores de Slug en la elaboración de una composición que confiere radioprotección o radioresistencia a células normales.Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of the Slug gene, its transcription or translation products, and / or Slug stimulators in the elaboration of a composition that confers radioprotection or radiosistance to normal cells.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende el gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, y/o un estimulador de Slug. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.In another aspect, the invention relates to a composition comprising the Slug gene, its transcription or translation products, and / or a Slug stimulator. In a particular embodiment, said composition is a pharmaceutical composition.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, o dicho estimulador de Slug en células normales en la elaboración de una composición para proteger dichas células normales frente a la irradiación, o en la elaboración de una composición para aumentar la radioresistencia de células normales o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.In another aspect, the invention relates to the use of the Slug gene, its transcription or expression products, or said Slug stimulator in normal cells in the elaboration of a composition to protect said normal cells against irradiation, or in the elaboration of a composition to increase the radioresistance of normal cells or in the preparation of a composition for the treatment of cancer. In a particular embodiment, said composition is a pharmaceutical composition.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de aumentar o activar la expresión del gen Slug, en particular, en células normales que expresan dicho gen.In another aspect, the invention relates to a method for the identification of a compound capable of increasing or activating the expression of the Slug gene, in particular, in normal cells expressing said gene.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cancer que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la expresión de dicho gen y seleccionar los compuestos con capacidad para aumentar la expresión de Slug.In another aspect, the invention relates to a method for the identification of a potentially useful compound for the treatment of cancer which comprises testing said compound in a cellular system that expresses the Slug gene, evaluating the effect of said compound on the expression of said gene and select compounds with capacity to increase Slug expression.

Brief description of the figures

La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto de irradiación en la supervivencia de ratones Slug -/-. Se irradiaron ratones Slug -/- y +/- con varias dosis para determinar una dosis letal de irradiación. La supervivencia de ratones Slug +/- y tipo salvaje no se ve influenciada por la irradiación a bajas dosis. La dosis de irradiación se administró en forma de dosis divididas de igual intensidad con intervalos de 4 horas. En ordenadas se representa el porcentaje de supervivencia mientras que en abscisas se representan los días post-irradiación.Figure 1 is a graph showing the effect of irradiation in the survival of Slug - / - mice. Be irradiated Slug - / - and +/- mice with several doses to determine a lethal dose of irradiation. The survival of Slug mice +/- and wild type is not influenced by low irradiation dose. The irradiation dose was administered as a dose. divided of equal intensity with intervals of 4 hours. In ordered the survival percentage is represented while in abscissa the days are represented post irradiation.

La Figura 2 muestra los niveles de proteína p53 en células de médula ósea tras la administración de radiación \gamma. La proteína p53 fue detectada mediante un análisis Western blot en células de médula ósea de ratones Slug +/+ y Slug -/-. La actina se utilizó como control de carga. Los números que aparecen en la parte superior (0, 1, 2, 4, 6, y 12) indican los periodos de tiempo (horas).Figure 2 shows p53 protein levels in bone marrow cells after radiation administration γ. The p53 protein was detected by Western analysis. Bone marrow cell blotting of Slug + / + and Slug - / - mice. The Actin was used as loading control. The numbers that appear at the top (0, 1, 2, 4, 6, and 12) indicate the periods of time (hours)

La Figura 3 es una gráfica que muestra las poblaciones celulares de la médula ósea de ratones irradiados con una DL_{100/30} y tratados con SCF. Se inyectó SCF por vía intravenosa (i.v.) 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación. Las poblaciones celulares de la médula ósea de ratones tipo salvaje fueron similares a las de los ratones Slug +/- irradiados con una DL_{100/30} y tratados con SCF. Los datos presentados son la media ± EEM para cuatro ratones en cada punto temporal.Figure 3 is a graph showing the bone marrow cell populations of mice irradiated with a DL_ {100/30} and treated with SCF. SCF was injected via Intravenous (IV) 20 h and 2 h before irradiation and 4 h after of the last dose of irradiation. The cell populations of the Bone marrow of wild-type mice were similar to those of Slug +/- mice irradiated with a DL 100/30 and treated with SCF The data presented are the mean ± SEM for four mice in Each time point.

La Figura 4 muestra la transducción de TAT-Slugh en ratones. La Figura 4A es un diagrama de la proteína de fusión TAT-Slugh. La Figura 4B muestra los resultados de la inmunofluorescencia de células Ba/F3 no transducidas (panel de la izquierda) y de células Ba/F3 transducidas con la proteína TAT-Slugh. La proteína TAT-Slugh fue detectada con el anticuerpo monoclonal 12CA5 que detecta el epítopo HA. La Figura 4C muestra los resultados de un análisis por inmunoblot de células Ba/F3 a los 60 minutos de ser transducidas con diferentes cantidades de la proteína TAT-Slugh. La Figura 4D muestra los resultados de un análisis por inmunoblot de células Ba/F3 transducidas con 50 µg de la proteína TAT-Slugh a diferentes periodos de tiempo. La Figura 4E muestra los resultados de un análisis por inmunoblot de células de médula ósea aisladas de ratones Slug -/- a los 120 minutos de la inyección por vía intraperitoneal (i.p.) de diferentes cantidades de la proteína de fusión TAT- Slugh. La Figura 4F es una gráfica que muestra el efecto de la irradiación sobre la supervivencia de ratones kit deficientes transducidos con la proteína de fusión TAT-Slugh. Los ratones fueron irradiados con 350 rads administrados en dosis divididas. Se inyectó SCF por vía i.v. 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación y las proteínas TAT fueron inyectadas por vía i.p. en una dosis única de 250 µg inmediatamente después de la irradiación.Figure 4 shows the transduction of TAT-Slugh in mice. Figure 4A is a diagram of the TAT-Slugh fusion protein. Figure 4B shows the results of the immunofluorescence of Ba / F3 cells non-transduced (left panel) and Ba / F3 cells transduced with the TAT-Slugh protein. The protein TAT-Slugh was detected with the antibody 12CA5 monoclonal that detects the HA epitope. Figure 4C shows the results of an immunoblot analysis of Ba / F3 cells at 60 minutes of being transduced with different amounts of the TAT-Slugh protein. Figure 4D shows the results of an immunoblot analysis of Ba / F3 cells transduced with 50 µg of the TAT-Slugh protein at Different periods of time. Figure 4E shows the results of an immunoblot analysis of bone marrow cells isolated from Slug - / - mice 120 minutes after injection intraperitoneal (i.p.) of different amounts of protein TAT-Slugh fusion. Figure 4F is a graph showing the effect of irradiation on survival of deficient kit mice transduced with the TAT-Slugh fusion protein. The mice were irradiated with 350 rads administered in doses. divided. SCF was injected via i.v. 20 h and 2 h before irradiation and 4 h after the last dose of irradiation and TAT proteins were injected via i.p. in a single dose of 250 µg immediately after irradiation.

La Figura 5 muestra el rescate de la aplasia inducida por irradiación letal en ratones kit mutantes por la proteína de fusión TAT-Slugh. La Figura 5A muestra el efecto de la supervivencia de células de médula ósea W/W^{v} tras la irradiación. La muerte celular está acompañada de pérdida de nucleosoma tras la irradiación. El ADN de bajo peso molecular se aisló 6 horas después de la irradiación con 350 rads de ratones control. Calle 1: ratones control; Calle 2: ratones W/W^{v} tratados con SCF mediante inyección por vía i.v. 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación; Calle 3: ratones W/W^{v} a los que se les inyectó por vía i.p. una dosis única de 250 µg de la proteína TAT-Slugh inmediatamente después de la irradiación; Calle 4: ratones W/W^{v} a los que se les inyectó por vía i.p. una dosis única de 250 µg de la proteína TAT control inmediatamente después de la irradiación. El ADN se marcó en los extremos, se resolvió por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizó por autorradiografia. La Figura 5B muestra los resultados de un análisis hematológico de sangre periférica de ratones irradiados con 350 rads y tratados con la proteína de fusión TAT-Slugh o con la proteína TAT. Se obtuvieron resultados similares después de estudiar 5 ratones por grupo. En ordenadas se representa el número de leucocitos, plaquetas y eritrocitos o la concentración de hemoglobina, y en abscisas el tiempo post-irradiación (días).Figure 5 shows the rescue of aplasia lethal irradiation induced in kit mice mutant by TAT-Slugh fusion protein. Figure 5A shows the survival effect of bone marrow cells W / W v after irradiation. Cell death is accompanied by loss. of nucleosome after irradiation. The low molecular weight DNA is isolated 6 hours after irradiation with 350 rads of mice control. Lane 1: control mice; Lane 2: W / W v mice treated with SCF by injection via i.v. 20 h and 2 h before irradiation and 4 h after the last irradiation dose; Lane 3: W / W v mice that were injected via i.p. a single dose of 250 µg of the TAT-Slugh protein immediately after irradiation; Street 4: mice W / W v those who were injected via i.p. a single dose of 250 µg of the control TAT protein immediately after irradiation. The DNA was marked at the ends, resolved by 2% agarose gel electrophoresis and visualized by autoradiography. Figure 5B shows the results of an analysis Hematological peripheral blood of mice irradiated with 350 rads and treated with the TAT-Slugh fusion protein or with the TAT protein. Similar results were obtained after Study 5 mice per group. In ordinates the number is represented of leukocytes, platelets and erythrocytes or the concentration of hemoglobin, and in time abscissa post-irradiation (days).

Detailed description of the invention

La invención se relaciona, en general, con el descubrimiento de que la expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular. Por tanto, la represión o expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, puede ser utilizada para conferir radiosensibilidad o radioprotección celular, por lo que dicho gen, sus productos de transcripción y/o expresión, constituyen una diana muy atractiva para el tratamiento del cáncer.The invention relates, in general, to the discovery that the expression of the Slug gene is related to cellular resistance to irradiation since its absence produces an increase in cellular radiosensitivity. Therefore, repression or expression of the Slug gene, its transcription or expression products, can be used to confer cellular radiosensitivity or radioprotection, whereby said gene, its transcription and / or expression products, constitute a very attractive target for cancer treatment

1. Increased cell radiosensitivity tumor

Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el factor Slug actúa como agente radioprotector de células tumorales que lo expresan (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción) por lo que dicho factor podría ser una de las causas del fracaso, total o parcial, de una terapia antitumoral basada en la irradiación de células tumorales que expresan el producto del gen Slug. Consecuentemente, un aumento en la sensibilidad de dichas células tumorales que expresan el factor Slug a la irradiación (radiosensibilidad) permitiria reducir el fracaso en la terapia antitumoral por irradiación.Tests carried out by the inventors have shown that the Slug factor acts as a radioprotective agent for tumor cells that express it (see the Example that accompanies this description) so that this factor could be one of the causes of failure, total or partial , of an antitumor therapy based on the irradiation of tumor cells that express the product of the Slug gene. Consequently, an increase in the sensitivity of said tumor cells that express the Slug factor to irradiation (radiosensitivity) would reduce the failure in the antitumor therapy by irradiation.

Por consiguiente, la invención se relaciona, por una parte, con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug. La reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede conseguirse mediante el empleo de inhibidores de Slug. El gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, pueden utilizarse en la búsqueda de inhibidores de Slug, los cuales pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.Accordingly, the invention relates, on the one hand, to the reduction, inhibition or repression of the Slug gene, its transcription or translation products, to confer radiosensitivity to tumor cells expressing Slug. The reduction, inhibition or repression of the Slug gene, its transcription or translation products, can be achieved through the use of Slug inhibitors. The Slug gene, its transcription or translation products, can be used in the search for Slug inhibitors, which can be used in the treatment of cancer.

De forma más concreta, en un aspecto, la invención se relaciona con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug.More specifically, in one aspect, the invention relates to the reduction, inhibition or repression of the Slug gene, its transcription or translation products, to confer radiosensitivity to tumor cells expressing Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de inhibidores de Slug para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "inhibidor de Slug" incluye a cualquier compuesto que reduce, anula o reprime la expresión del gen Slug, por ejemplo, un compuesto con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico (ADNg, ADNc, ARN) o proteína (Slug). En general, la interferencia con la función del gen Slug se puede hacer a nivel del ADN impidiendo su expresión, inactivando el ARNm que se genera mediante oligonucléotidos antisentido o ribozimas, inactivando la proteína mediante el empleo de anticuerpos o compitiendo el efecto de dicha proteína con dominantes negativos [Choo Y et al. J. Mol. Biol., 1997, 273:525-532; Cobaleda C and Sánchez-García I. Blood, 2000, 95:731-737] y/o, en general, mediante el empleo de cualquier compuesto que reprima la expresión del gen Slug. A modo ilustrativo, dicho inhibidor de Slug puede ser una proteína, un péptido, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un fragmento de
anticuerpo.In another aspect, the invention relates to the use of Slug inhibitors to confer radiosensitivity to tumor cells expressing Slug. As used in this description, the term "Slug inhibitor" includes any compound that reduces, cancels or represses the expression of the Slug gene, for example, a compound capable of interfering with the Slug function at the nucleic acid level ( CDNA, cDNA, RNA) or protein (Slug). In general, interference with the function of the Slug gene can be done at the DNA level preventing its expression, inactivating the mRNA that is generated by antisense oligonucleotides or ribozymes, inactivating the protein through the use of antibodies or by competing the effect of said protein with dominant negatives [Choo Y et al . J. Mol. Biol., 1997, 273: 525-532; Cobaleda C and Sánchez-García I. Blood, 2000, 95: 731-737] and / or, in general, by using any compound that suppresses the expression of the Slug gene. By way of illustration, said Slug inhibitor can be a protein, a peptide, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, an antibody or a fragment of
antibody.

En una realización particular, dicho inhibidor de Slug es un oligonucleótido antisentido, es decir, un compuesto que, cuando se administra a una célula que expresa el gen Slug, por ejemplo, una célula tumoral que expresa la proteína Slug, es capaz de, por ejemplo, reducir, anular, o reprimir la expresión del gen Slug, reduciendo de este modo los niveles de factor Slug o anulándolos completamente. Dicho oligonucleótido antisentido podría unirse específicamente, por ejemplo, al ARNm del gen Slug evitando de ese modo su traducción en la proteína Slug. Información sobre ADNg, ADNc o ARNm de Slug, en particular, de Slugh (humano) puede encontrarse en WO 02/059361 así como en las referencias bibliográficas contenidas en dicho documento. Dicho oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos y una longitud adecuados para su hibridación con la secuencia de nucleótidos del gen Slug o de su producto de transcripción, bajo condiciones de alta astringencia. A modo ilustrativo, dicho oligonucleótido antisentido comprende, al menos 8, nucleótidos consecutivos, preferentemente, al menos, 12, 16 ó 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen Slug o capaces de hibridar con la secuencia de nucleótidos del gen Slug bajo condiciones de alta astringencia, tales como, por ejemplo, SSPE 5x y SDS al 0,5%, a 65ºC o condiciones equivalentes. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido que pueden utilizarse para evitar la expresión de Slug pueden encontrarse en WO 02/059361.In a particular embodiment, said Slug inhibitor is an antisense oligonucleotide, that is, a compound that, when administered to a cell expressing the Slug gene, for example, a tumor cell expressing the Slug protein, is capable of, by For example, reducing, canceling, or repressing the expression of the Slug gene, thereby reducing the levels of Slug factor or completely canceling them. Said antisense oligonucleotide could specifically bind, for example, to the mRNA of the Slug gene thereby preventing its translation into the Slug protein. Information about Slug cDNA, cDNA or mRNA, in particular, of Slugh (human) can be found in WO 02/059361 as well as in the bibliographic references contained in said document. Said antisense oligonucleotide comprises a nucleotide sequence and a length suitable for hybridization with the nucleotide sequence of the Slug gene or its transcription product, under conditions of high astringency. By way of illustration, said antisense oligonucleotide comprises at least 8 consecutive nucleotides, preferably at least 12, 16 or 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of the Slug gene or capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the Slug gene under conditions high astringency, such as, for example, 5x SSPE and 0.5% SDS, at 65 ° C or equivalent conditions. Examples of antisense oligonucleotides that can be used to prevent Slug expression can be found in WO 02/059361.

En otra realización particular dicho inhibidor de Slug es un anticuerpo anti-Slug, tal como un anticuerpo que reconoce a la proteína Slug intacta o un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un portador. Los anticuerpos anti-Slug pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse mediante la tecnología del hibridoma [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]. Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')2, etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales, que reconocen a la proteína Slug o un fragmento antigénico de la misma.In another particular embodiment said Slug inhibitor is an anti-Slug antibody, such as an antibody that recognizes the intact Slug protein or an antigenic fragment thereof, optionally conjugated to a carrier. Anti-Slug antibodies can be polyclonal or, preferably, monoclonal, which can be obtained by hybridoma technology [Kohler et al ., Nature 256: 495 (1975)]. Alternatively, antibody fragments can be used, for example Fab, F (ab ') 2, etc., which can be obtained by conventional methods, which recognize the Slug protein or an antigenic fragment thereof.

En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende, al menos, un inhibidor de Slug, en una cantidad terapéuticamente eficaz, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica puede contener uno o más inhibidores de Slug, es decir, uno o más compuestos capaces de reducir, anular o reprimir la expresión del gen Slug por lo que es útil para sensibilizar células tumorales que expresan Slug frente a la irradiación, por ejemplo, frente a la radiación ionizante, tal como la radiación \gamma, de manera que, al no expresar dicha proteína Slug, o expresarla a niveles muy bajos, se aumenta la radiosensibilidad de dichas células tumorales que expresan Slug, con lo que se pueden utilizar dosis letales de irradiación más bajas, lo que contribuye a reducir la toxicidad asociada con la radioterapia sobre las células normales o sanas.In a particular embodiment, said composition is a pharmaceutical composition comprising at least one Slug inhibitor, in a therapeutically effective amount, and a pharmaceutically acceptable excipient. Said pharmaceutical composition may contain one or more Slug inhibitors, that is, one or more compounds capable of reducing, canceling or suppressing the expression of the Slug gene so it is useful for sensitizing tumor cells that express Slug against irradiation, for example , against ionizing radiation, such as γ radiation, so that, by not expressing said Slug protein, or expressing it at very low levels, the radiosensitivity of said tumor cells expressing Slug is increased, so that they can be used lower lethal doses of irradiation, which helps reduce the toxicity associated with radiation therapy to normal or healthy cells.

Los excipientes que pueden utilizarse en la elaboración de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.The excipients that can be used in the preparation of the pharmaceutical composition provided by this invention will depend, among other things, on the way administration of said pharmaceutical composition. A review of the different forms of administration of active ingredients, of the excipients to be used and their manufacturing procedures It can be found in the Galician Pharmacy Treaty, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. of Editions, 1993.

En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada a su administración por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). En otra realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector, viral o no viral, y un inhibidor de Slug. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].In a particular embodiment, the composition Pharmaceutical provided by this invention is a composition intended for intravenous administration (i.v.) or intraperitoneal (i.p.). In another particular embodiment, the Pharmaceutical composition provided by this invention is a composition intended for use in gene therapy that It comprises a vector, viral or non-viral, and a Slug inhibitor. TO illustratively, said vectors may be viral vectors, by for example, based on retroviruses, adenoviruses, etc., or non-viral such as DNA-liposome complexes, DNA-polymer, DNA-polymer-liposome, etc. [see "Nonviral Vectors for Gene Therapy", edited by Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)].

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un inhibidor de Slug en células tumorales en la elaboración de una composición para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer, en particular, de células tumorales que expresan Slug. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica. Ejemplos ilustrativos de células tumorales que expresan Slug incluyen, entre otras, células de leucemias y de tumores sólidos, por ejemplo, leucemias mieloides agudas, células leucémicas con la translocación t(17;19), sarcomas, por ejemplo, células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR, células que expresan BCR-ABL, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores ginecológicos, carcinomas de mama, tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF), etc. Por tanto, dicho inhibidor de Slug podría ser utilizado en el tratamiento de dichos tumores y cánceres, por ejemplo, como coadyuvante en el tratamiento de dichos tumores y cánceres por radioterapia.In another aspect, the invention relates to the use of a Slug inhibitor in tumor cells in the development of a composition to increase the radiosensitivity of tumor cells that express Slug or in the development of a composition for the treatment of cancer, in particular of tumor cells expressing Slug. In a particular embodiment, said composition is a pharmaceutical composition. Examples Illustrative of tumor cells expressing Slug include, among others, leukemia and solid tumor cells, for example, acute myeloid leukemias, leukemic cells with translocation t (17; 19), sarcomas, for example, rhabdomyosarcoma cells that express the PAX3-FKHR translocation, cells that express BCR-ABL, cell lung cancer small, gynecological tumors, breast carcinomas, tumors colonic derived from interstitial cells of Cajal (a type of SCF dependent cells), etc. Therefore, said inhibitor of Slug could be used in the treatment of such tumors and cancers, for example, as an adjunct in the treatment of said Radiation therapy tumors and cancers.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación ("screening") de un compuesto capaz de reducir la transcripción y/o traducción del gen Slug que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción y/o traducción de dicho gen.In another aspect, the invention relates to a method for the identification ("screening") of a compound capable of reducing the transcription and / or translation of the Slug gene comprising testing said compound in a cellular system expressing the Slug gene and evaluating the effect of said compound on the transcription and / or translation of said gene.

La invención se relaciona, en otro aspecto, con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer, en particular de células tumorales que expresan Slug, que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción o traducción de dicho gen y/o sobre sus productos de transcripción o expresión, y seleccionar los compuestos con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína.The invention relates, in another aspect, to a method for the identification of a compound potentially useful for the treatment of cancer, in particular of tumor cells expressing Slug, which comprises testing said compound in a cellular system that expresses the Slug gene, evaluate the effect of said compound on the transcription or translation of said gene and / or on its transcription or expression products, and select the compounds capable of interfering with the Slug function at the nucleic acid or protein level.

Dicho sistema celular que expresa el gen Slug utilizado bien para identificar un compuesto capaz de reducir la transcripción y/o traducción del gen Slug o bien para identificar un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer, puede ser una célula, normal o tumoral, que expresa dicho gen Slug de forma nativa o bien una célula que no expresa dicho gen Slug de forma nativa pero que ha sido transformada con una construcción de ADN o con un vector que contiene la secuencia del gen Slug y lo expresa. En una realización particular, dicho sistema celular que expresa el gen Slug se selecciona entre una célula normal de mamífero y una célula tumoral de mamífero que expresan dicho gen Slug.Said cellular system that expresses the Slug gene used either to identify a compound capable of reducing the transcription and / or translation of the Slug gene or to identify a compound potentially useful for the treatment of cancer, may be a normal or tumor cell, which expresses said Slug gene natively or a cell that does not express said Slug gene natively but has been transformed with a DNA construct or with a vector containing the sequence of the Slug gene and expresses it. In a particular embodiment, said cellular system expressing the Slug gene is selected from a normal mammalian cell and a mammalian tumor cell expressing said Slug gene.

La evaluación del efecto del compuesto a ensayar sobre la transcripción o traducción del gen Slug y/o sobre sus productos de transcripción o expresión para, por ejemplo, seleccionar los compuestos con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína puede realizarse por métodos convencionales.The evaluation of the effect of the compound to be tested on the transcription or translation of the Slug gene and / or on its transcription or expression products to, for example, select the compounds capable of interfering with the Slug function at the nucleic acid or protein level It can be done by conventional methods.

En general, la expresión del gen Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug (ARNm), o bien determinando el número de copias de gen Slug producidas. En el sentido utilizado en esta descripción, "determinar el nivel de ARNm" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de ARNm que se puede traducir en la proteína Slug en las células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el nivel de ARNm de Slug en las células de una muestra de control. Asimismo, "determinar el número de copias de gen Slug producidas" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el número de copias producidas del gen Slug en células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el número de copias del gen Slug producidas en células de una muestra de control. La determinación del número de copias del gen Slug puede realizarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, visualizando fragmentos dobles extracromosómicos [extrachromosomal double minutes (dmin)] o regiones de tinción homogéneamente integradas [integrated homogeneously staining regions (hsrs)] (Gebhart et al., Breast Cancer Res. Treat. 8:125 (1986); Dutrillaux et al., Cancer Genet. Cytogenet. 49:203 (1990)), mediante técnicas de hibridación utilizando sondas apropiadas obtenidas por métodos convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen Slug, etc. Asimismo, el nivel de ARNm de Slug puede determinarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante análisis Northern blot (Harada et al., Cell 63:303-312 (1990)), mapeo con la nucleasa Si (Fujita et al., Cell 49:357-367 (1987)), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (patentes norteamericanas US 4.683.195, US 4.683.202, US 4.965.188), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) (Makino et al., Technique 2:295-301 (1990)), técnicas de hibridación, microarrays (Wooster R., Trends in Genetics 16:327-329 (2000)), etc.In general, the expression of the Slug gene can be evaluated by any appropriate conventional method, for example, by determining the level of mRNA corresponding to the Slug gene (mRNA), or by determining the number of copies of Slug gene produced. In the sense used in this description, "determining the level of mRNA" includes any method that qualitatively or quantitatively measures or estimates the level of mRNA that can be translated into the Slug protein in the cells of a test sample either directly or relatively compared to the level of Slug mRNA in the cells of a control sample. Likewise, "determining the number of copies of the Slug gene produced" includes any method that allows to measure or estimate qualitatively or quantitatively the number of copies produced of the Slug gene in cells of a test sample either directly or relatively compared to the number of copies of the Slug gene produced in cells of a control sample. The number of copies of the Slug gene can be determined by any appropriate conventional method, for example, by visualizing extrachromosomal double fragments [extrachromosomal double minutes (dmin)] or homogeneously integrated staining regions [integrated homogeneously staining regions (hsrs)] (Gebhart et al ., Breast Cancer Res. Treat. 8: 125 (1986); Dutrillaux et al ., Cancer Genet. Cytogenet. 49: 203 (1990)), by hybridization techniques using appropriate probes obtained by conventional methods in view of the nucleotide sequence of the Slug gene, etc. Likewise, the level of Slug mRNA can be determined by any appropriate conventional method, for example, by Northern blot analysis (Harada et al ., Cell 63: 303-312 (1990)), mapping with the Si nuclease (Fujita et al . , Cell 49: 357-367 (1987)), polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, US 4,683,202, US 4,965,188), back transcription in combination with the chain reaction of the Polymerase (RT-PCR) (Makino et al ., Technique 2: 295-301 (1990)), hybridization techniques, microarrays (Wooster R., Trends in Genetics 16: 327-329 (2000)), etc.

Por otra parte, la expresión de la proteína Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometria de flujo, proteómica, etc. A modo ilustrativo, la expresión de la proteína Slug puede ser estudiada mediante un ensayo Western blot o dot/slot (Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)), mediante inmunoensayos, tales como ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o RIA (radioinmunoensayo). Adicionalmente, la expresión de la proteína Slug puede ser detectada in vivo mediante técnicas de diagnóstico por imagen mediante el empleo de anticuerpos anti-Slug unidos a marcadores apropiados, por ejemplo, marcadores detectables por rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN), etc. Una revisión del diagnóstico por imagen de tumores puede encontrarse en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer (S.W. Burchiel & B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). Otros métodos para determinar la expresión de Slug incluyen la citometria de flujo (Ward M.S., Pathology 31:382-392 (1999), proteómica (Pandey M. & Mann M., Nature 405:837-846 (2000); Chambers et al., J. Pathol. 192:280-288 (2000), etc.On the other hand, the expression of the Slug protein can be evaluated by any appropriate conventional method, for example, by techniques based on the use of antibodies, techniques based on in vivo imaging diagnosis, flow cytometry, proteomics, etc. By way of illustration, Slug protein expression can be studied by a Western blot or dot / slot assay (Jalkanen et al ., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen et al ., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)), by immunoassays, such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) or RIA (radioimmunoassay). Additionally, the expression of the Slug protein can be detected in vivo by diagnostic imaging techniques by using anti-Slug antibodies bound to appropriate markers, for example, X-ray detectable markers, nuclear magnetic resonance (NMR), etc. A review of tumor imaging can be found in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer (SW Burchiel & BA Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). Other methods for determining Slug expression include flow cytometry (Ward MS, Pathology 31: 382-392 (1999), proteomics (Pandey M. & Mann M., Nature 405: 837-846 (2000); Chambers et al ., J. Pathol. 192: 280-288 (2000), etc.

2. Increase in cell radiosistance normal

La invención también se relaciona, por otra parte, con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, y compuestos que estimulan o activan la expresión de Slug para conferir radioprotección o radioresistencia a células normales o sanas, las cuales pueden, o no, expresar Slug. Asimismo, la invención también se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, en la búsqueda de compuestos que aumentan o activan la expresión del gen Slug, los cuales actúan como radioprotectores de las células normales y pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.The invention also relates, on the other hand, to the use of the Slug gene, its transcription or translation products, and compounds that stimulate or activate Slug expression to confer radioprotection or radioresistance to normal or healthy cells, which may, or no, express Slug. Likewise, the invention also relates to the use of the Slug gene, its transcription or translation products, in the search for compounds that increase or activate the expression of the Slug gene, which act as radioprotectors of normal cells and can be used in Cancer treatment

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto seleccionado entre un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug y sus mezclas, en la elaboración de una composición farmacéutica que confiere radioprotección o radioresistencia a células normales. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "ácido nucleico que codifica para la proteína Slug" incluye al ADN genómico (ADNg), ADN copia o complementario (ADNc) o ARN mensajero (ARNm) que contienen la secuencia codificante de la proteína Slug. El término "proteína Slug" incluye a cualquier proteína Slug independientemente de su origen; preferentemente, dicha proteína Slug es una proteína Slug de origen murino o humano. Asimismo, el término "estimulador de Slug", tal como aquí se utiliza, se refiere a un compuesto que aumenta o activa la expresión del gen Slug, por ejemplo, en células normales que expresan dicho gen, así como a compuestos, composiciones o construcciones que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Slug para su expresión en células que no lo expresan de forma nativa. Dicho estimulador de Slug puede actuar estimulando bien la transcripción de dicho gen o bien la traducción de su mensajero. El término "célula normal o sana", se utilizan indistintamente en esta descripción para referirse a una célula que no tiene alterado su ciclo de vida por ninguna alteración patológica. Dichas células normales o sanas pueden expresar, o no, Slug. Ejemplos de células normales que expresan Slug incluyen entre otras, células madre hematopoyéticas, células precursoras neuronales, etc. [WO 02/059361].Therefore, in another aspect, the invention is relates to the use of a compound selected from an acid nucleic encoding the Slug protein, a Slug protein, a Slug stimulator and its mixtures, in the elaboration of a pharmaceutical composition that confers radioprotection or Radiosistance to normal cells. As used in this description, the expression "nucleic acid encoding the Slug protein "includes genomic DNA (gDNA), copy DNA or complementary (cDNA) or messenger RNA (mRNA) containing the coding sequence of the Slug protein. The term "protein Slug "includes any Slug protein regardless of its origin; preferably, said Slug protein is a Slug protein of murine or human origin. Also, the term "stimulator of Slug ", as used herein, refers to a compound that increases or activates the expression of the Slug gene, for example, in cells normal expressing said gene, as well as compounds, compositions or constructions containing the sequence of nucleotides encoding the Slug protein for expression in cells that do not express it natively. Said stimulator of Slug can act by stimulating well the transcription of said gene or Well the translation of your messenger. The term "normal cell or healthy ", are used interchangeably in this description to refer to a cell that has not altered its life cycle by No pathological alteration. Such normal or healthy cells They can express, or not, Slug. Examples of normal cells that Slug express include among others, hematopoietic stem cells, neuronal precursor cells, etc. [WO 02/059361].

En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug, o sus mezclas, en una cantidad terapéuticamente eficaz, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.In a particular embodiment, said composition it is a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid that encodes for the Slug protein, a Slug protein, a stimulator of Slug, or mixtures thereof, in a therapeutically effective amount, and a pharmaceutically acceptable excipient.

En una realización concreta, dicha composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug o sus mezclas. Dicho ácido nucleico que codifica para la proteína Slug así como dicha proteína Slug pueden obtenerse por técnicas convencionales de ingenieria genética [PCT/ES02/00520].In a specific embodiment, said composition pharmaceutical comprises a nucleic acid encoding the Slug protein, a Slug protein or mixtures thereof. Said acid nucleic encoding the Slug protein as well as said protein Slug can be obtained by conventional engineering techniques genetics [PCT / ES02 / 00520].

En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica comprende uno o más estimuladores de Slug, es decir, uno o más compuestos capaces de estimular la expresión del gen Slug en células normales por lo que es útil para proteger dichas células, por ejemplo, células hematopoyéticas normales, frente a la irradiación, por ejemplo, frente a la radiación ionizante, de manera que, al sobreexpresar dicha proteína Slug aumenta la resistencia de dichas células normales a la irradiación. Como consecuencia de ello, el fracaso de la radioterapia se reduce ya que disminuye la toxicidad asociada con la radioterapia sobre las células normales o bien se pueden administrar dosis mayores de radioterapia. Los compuestos que estimulan o activan la expresión de Slug (estimuladores de Slug) pueden obtenerse por técnicas convencionales que comprenden, por ejemplo, la preparación de construcciones de ADN que comprenden el gen Slug o ADNc de dicho gen Slug, y un gen delator que cuando se pone en contacto con el compuesto a ensayar permite determinar si dicho compuesto activa la expresión del gen Slug. A modo ilustrativo, dicho gen delator puede ser el gen que codifica para una proteína para la que se dispone de anticuerpos específicos, o una proteína con actividad enzimática, por ejemplo, fosfatasa alcalina, [i-glucoronidasa, GFP, etc., detectándose dicha actividad mediante la adición del sustrato o sistema de revelado correspondiente [PCT/ES02/00520].In another specific embodiment, said pharmaceutical composition comprises one or more Slug stimulators, that is, one or more compounds capable of stimulating the expression of the Slug gene in normal cells, so it is useful for protecting said cells, for example, normal hematopoietic cells. , against irradiation, for example, against ionizing radiation, so that, by overexpressing said Slug protein, the resistance of said normal cells to irradiation increases. As a consequence, the failure of radiotherapy is reduced as the toxicity associated with radiotherapy on normal cells decreases or higher doses of radiotherapy can be administered. Compounds that stimulate or activate Slug expression (Slug stimulators) can be obtained by conventional techniques comprising, for example, the preparation of DNA constructs comprising the Slug gene or cDNA of said Slug gene, and a reporter gene that when contacting the compound to be tested allows determining whether said compound activates the expression of the Slug gene. By way of illustration, said reporter gene may be the gene encoding a protein for which specific antibodies are available, or a protein with enzymatic activity, for example, alkaline phosphatase, [i-glucoronidase, GFP, etc., detecting said activity by adding the corresponding substrate or developing system [PCT / ES02 / 00520].

Los excipientes que pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, SA. de Ediciones, 1993.The excipients that may be present in the pharmaceutical composition of the invention will depend, among others things, of the form of administration of said composition Pharmaceutical A review of the different forms of administration of active ingredients, of the excipients to be used and their manufacturing procedures can be found in the Treaty of Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, SA. of Editions, 1993

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede prepararse en prácticamente cualquier forma de administración; no obstante, en una realización particular, dicha composición farmacéutica es una composición destinada a su administración por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). En otra realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector, viral o no viral, y un inhibidor de Slug.The pharmaceutical composition provided by This invention can be prepared in virtually any form of administration; however, in a particular embodiment, said pharmaceutical composition is a composition intended for its intravenous (i.v.) or intraperitoneal (i.p.) administration. In another particular embodiment, the pharmaceutical composition provided by this invention is a composition intended for its use in gene therapy comprising a vector, viral or not viral, and a Slug inhibitor.

En general, cuando la composición farmacéutica comprende el gen Slug o sus productos de transcripción o expresión, dicha composición farmacéutica comprenderá unos vectores o sistemas que ayudan al proceso de transferencia de un gen exógeno a una célula, facilitando la entrega y biodisponibilidad intracelular del mismo de tal modo que éste pueda funcionar correctamente. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].In general, when the pharmaceutical composition comprises the Slug gene or its transcription or expression products, said pharmaceutical composition will comprise vectors or systems that help the process of transferring an exogenous gene to a cell, facilitating intracellular delivery and bioavailability thereof. so that it can work properly. By way of illustration, said vectors may be viral vectors, for example, based on retroviruses, adenoviruses, etc., or non-viral such as DNA-liposome, DNA-polymer, DNA-polymer-liposome, etc. complexes. [see "Nonviral Vectors for Gene Therapy", edited by Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)].

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto seleccionado entre un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug y sus mezclas, en la elaboración de una composición para proteger células normales frente a la irradiación, o en la elaboración de una composición para aumentar la radioresistencia de células normales o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica. En general, dicha irradiación es una radiación ionizante, tal como una radiación \gamma, del tipo utilizado habitualmente en radioterapia. Por tanto, el ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, la proteína Slug y dicho estimulador de Slug pueden ser utilizados en el tratamiento de tumores y cánceres, por ejemplo, como coadyuvante en el tratamiento de dichos tumores y cánceres por radioterapia; ventajosamente, dicho ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, la proteína Slug y dicho estimulador de Slug pueden ser utilizados en el tratamiento de tumores y cánceres de tejidos cuyas células normales expresan Slug.In another aspect, the invention relates to the use of a compound selected from a nucleic acid that encodes for the Slug protein, a Slug protein, a stimulator of Slug and its mixtures, in the elaboration of a composition for protect normal cells against irradiation, or in the development of a composition to increase the radioresistance of normal cells or in making a composition for the cancer treatment In a particular embodiment, said Composition is a pharmaceutical composition. In general, said irradiation is an ionizing radiation, such as a radiation γ, of the type commonly used in radiotherapy. By therefore, the nucleic acid encoding the Slug protein, the Slug protein and said Slug stimulator can be used in the treatment of tumors and cancers, for example, as an adjuvant in the treatment of said tumors and cancers by radiotherapy; advantageously, said nucleic acid encoding the protein Slug, the Slug protein and said Slug stimulator can be used in the treatment of tumors and tissue cancers whose normal cells express Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de aumentar o activar la expresión del gen Slug en un sistema celular que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción y/o traducción de dicho gen.In another aspect, the invention relates to a method for the identification of a compound capable of increasing or activating the expression of the Slug gene in a cellular system comprising testing said compound in a cellular system expressing the Slug gene and evaluating the effect of said compound on the transcription and / or translation of said gene.

La invención se relaciona, en otro aspecto, con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la expresión de dicho gen, y seleccionar los compuestos con capacidad para aumentar la expresión del producto del gen Slug.The invention relates, in another aspect, to a method for the identification of a compound potentially useful for the treatment of cancer which comprises testing said compound in a cellular system expressing the Slug gene, evaluating the effect of said compound on the expression of said gene, and select the compounds capable of increasing the expression of the Slug gene product.

Dicho sistema celular que expresa el gen Slug utilizado bien para identificar un compuesto capaz de aumentar la expresión del gen Slug o bien para identificar un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer, puede ser una célula, normal o tumoral, que expresa dicho gen Slug de forma nativa o bien una célula que no expresa dicho gen Slug de forma nativa pero que ha sido transformada con una construcción de ADN o con un vector que contiene la secuencia del gen Slug y lo expresa. En una realización particular, dicho sistema celular que expresa el gen Slug es una célula normal de mamífero que expresa Slug [WO 02/059361].Said cellular system that expresses the Slug gene used either to identify a compound capable of increasing the expression of the Slug gene or to identify a compound potentially useful for the treatment of cancer, may be a normal or tumor cell that expresses said Slug gene natively or a cell that does not express said Slug gene natively but has been transformed with a DNA construct or with a vector containing the sequence of the Slug gene and expresses it. In a particular embodiment, said cellular system that expresses the Slug gene is a normal mammalian cell that expresses Slug [WO 02/059361].

El aumento en la expresión de Slug puede ser debido bien a un incremento en la transcripción del gen Slug, bien a un aumento en la traducción de su mensajero o bien a una combinación de ambos efectos, e incluye, por tanto, la amplificación del gen Slug como su sobreexpresión así como la expresión en sistemas celulares que no lo expresan de forma nativa. La expresión del gen Slug y de la proteína Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado tal como se ha mencionado previamente [véase lo relativo a la evaluación del efecto de los compuestos a ensayar sobre la transcripción o traducción del gen Slug y/o sobre sus productos de transcripción o expresión para seleccionar los compuestos con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína].The increase in Slug expression may be due either to an increase in the transcription of the Slug gene, either to an increase in the translation of its messenger or to a combination of both effects, and therefore includes the amplification of the gene Slug as its overexpression as well as expression in cellular systems that do not express it natively. The expression of the Slug gene and the Slug protein can be evaluated by any appropriate conventional method as previously mentioned [see regarding the evaluation of the effect of the compounds to be tested on the transcription or translation of the Slug gene and / or on its transcription or expression products to select compounds capable of interfering with the Slug function at the level of nucleic acid or protein].

3. Examples

La invención se ilustra a continuación mediante un ejemplo que pone de manifiesto que la función biológica de radioresistencia de la vía de transducción de señales del SFC/c-kit es mediada por el factor de transcripción Slug. Dado que las mutaciones en los genes SCF, c-kit y Slug tienen un fenotipo similar que afecta a la hematopoyesis y como la radiosensibilidad es una anomalía fenotípica característica observada en los mutantes S1 y W in vivo [Harrison DE et al., Br. J. Haematol 1972; 22:155-168; Kaczmarek L et al., Int. J. Radiot. Biol. 1988; 53:703- 708], se ha examinado si Slug podría complementar la radiosensibilidad de ratones kit deficientes. Se ha encontrado que la ausencia de Slug aumenta la radiosensibilidad y que este efecto no se puede recuperar tratando ratones Slug mutantes sometidos a dosis de radiación letales con estimulación SCF de la recuperación hematopoyética. Por el contrario, se puede complementar el fallo hematopoyético que sigue al daño en el ADN tras radiación \gamma en ratones c-kit deficientes transduciéndoles con una proteína TAT-Slugh. Por tanto, dicho ejemplo ilustra, entre otras cosas, que la adición de Slug a células radiosensibles aumenta la radioresistencia de dichas células.The invention is illustrated below by an example which shows that the biological function of radioresistance of the signal transduction pathway of the SFC / c-kit is mediated by the transcription factor Slug. Since mutations in the SCF, c-kit and Slug genes have a similar phenotype that affects hematopoiesis and since radiosensitivity is a characteristic phenotypic abnormality observed in mutants S1 and W in vivo [Harrison DE et al ., Br. J. Haematol 1972; 22: 155-168; Kaczmarek L et al ., Int. J. Radiot. Biol. 1988; 53: 703- 708], it has been examined whether Slug could complement the radiosensitivity of deficient kit mice. It has been found that the absence of Slug increases radiosensitivity and that this effect cannot be recovered by treating mutant Slug mice subjected to lethal radiation doses with SCF stimulation of hematopoietic recovery. On the contrary, the hematopoietic failure that follows DNA damage after γ radiation in deficient c-kit mice can be complemented by transducing them with a TAT-Slugh protein. Therefore, said example illustrates, among other things, that the addition of Slug to radiosensitive cells increases the radioresistance of said cells.

I. Materials and methods Cell cultures

Las células Ba/F3 [Palacios y Steinmetz, Cell 41:727 (1985)] se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS). Cuando fue necesario, se añadió un 10% de medio acondicionado con WEHI-3B como fuente de EL-3 (interleucina-3). Alternativamente, dichas células Ba/F3 pueden obtenerse tal como se describe en PCT/ES02/00520.Ba / F3 cells [Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727 (1985)] remained in the middle of Eagle modified by Dulbecco (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). When necessary, 10% of conditioned medium was added with WEHI-3B as source of EL-3 (interleukin-3). Alternatively, said cells Ba / F3 can be obtained as described in PCT / ES02 / 00520.

Mice

Se han descrito ratones heterocigóticos y homocigóticos para la mutación Slugh^{\Delta 1} obtenidos por eliminación de las secuencias genómicas de la región codificante de la proteína Slugh completa (ratones mutantes Slugh^{\Delta 1}) (18). Los ratones kit mutantes (W/W^{v}) y sus parejas para la reproducción se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, Estados Unidos). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidados Animales. Los ratones fueron irradiados con varias dosis, usando una fuente de cesio, siendo el intervalo entre dosis de igual intensidad de 4 horas. A los ratones se les inyectó SCF (SIGMA) por vía intravenosa (i.v.) en la vena de la cola en una dosis de 100 \mug/kg o solución salina que contenía suero bovino fetal al 0,1% (excipiente para las diluciones de SCF) en diferentes intervalos de tiempo. Todos los animales tratados se mantuvieron en jaulas de microaislamiento recibiendo alimento esterilizado y agua estéril acidificada. Diariamente durante 30 días se registró el número de ratones supervivientes.Heterozygous mice have been described and homozygous for the Slugh? 1 mutation obtained by elimination of genomic sequences from the coding region of the complete Slugh protein (mutant mice Slugh? 1) (18). Mutant kit mice (W / W v) and their partners for Reproduction were obtained from Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, U.S). All procedures were approved by the Institutional Committee of Animal Care. The mice were irradiated with several doses, using a cesium source, the interval between doses of equal intensity of 4 hours. To the mice SCF (SIGMA) was injected intravenously (i.v.) into the vein of the glue in a dose of 100 µg / kg or saline solution containing 0.1% fetal bovine serum (excipient for SCF dilutions) at different time intervals. All treated animals are they kept in microinsulation cages receiving food sterilized and acidified sterile water. Daily for 30 days the number of surviving mice was recorded.

Bone Marrow Analysis

Se sembraron células de médula ósea (0,25-1,0 x 10^{5} células/placa) aisladas de ratones Slug normales y Slug mutantes en placas de cultivo semisólido sin FBS (Stem Cell Technologies). El crecimiento de las colonias se estimuló con las siguientes combinaciones de factores de crecimiento recombinantes:Bone marrow cells were seeded (0.25-1.0 x 10 5 cells / plate) isolated from Normal Slug and Slug mutant mice in culture plates semi-solid without FBS (Stem Cell Technologies). The growth of colonies were stimulated with the following combinations of factors of recombinant growth:

--: factor de células madre de rata (100 ng/ml; SIGMA), interleuquina-3 de ratón (10 ng/ml; SIGMA) y EPO humana (2 U/ml; ROCHE) para el crecimiento de la unidad formadora de brotes eritroides (BFU-E);factor of rat stem cells (100 ng / ml; SIGMA), mouse interleukin-3 (10 ng / ml; SIGMA) and EPO human (2 U / ml; ROCHE) for the growth of the forming unit of erythroid outbreaks (BFU-E);

--: el crecimiento de las colonias derivadas de la unidad formadora de colonias eritrocitarias (CFU-E) se estimuló sólo con EPO humana (2 U/ml); yhe growth of colonies derived from the forming unit of erythrocyte colonies (CFU-E) was stimulated only with human EPO (2 U / ml); Y

--: el crecimiento de las colonias mieloides (CFU-GM) se estimuló con GM-CSF murino recombinante (10 ng/mg; SIGMA) en presencia o en ausencia de SCF (100 ng/ml; SIGMA).he Myeloid colonies growth (CFU-GM) is stimulated with recombinant murine GM-CSF (10 ng / mg; SIGMA) in the presence or absence of SCF (100 ng / ml; SIGMA).

Los cultivos se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado que contenía CO_{2} al 5% en aire y se hizo el recuento durante 3 días (para las colonias derivadas de la CFU-E) o durante 7 días (para GM-CSF y las colonias derivadas de la BFU-E) tras la iniciación del cultivo. La frecuencia de las colonias se determinó en cultivos por triplicado.The cultures were incubated at 37 ° C in an incubator. humidified containing 5% CO2 in air and the count for 3 days (for colonies derived from the CFU-E) or for 7 days (for GM-CSF and colonies derived from the BFU-E) after crop initiation. The colony frequency was determined in cultures by triplicate.

Peripheral blood test

Se extrajeron muestras de sangre periférica en tubos que contenían EDTA por sangrado retro-orbital y se sometieron a un recuento completo de células sanguíneas para determinar la cifra de eritrocitos, leucocitos, el hematocrito y el número de plaquetas. Para los hemocultivos, la sangre se recogió en jeringas estériles de insulina de 1 ml recubiertas con 70 µl de una solución de citrato trisódico al 3,8% (usada como anticoagulante que no inhibe el crecimiento aeróbico). Se inoculó una alícuota (0,1 ml) de sangre en los tubos que contenían (i) caldo de soja tripticasa o (ii) medio de tioglicolato fluido y se incubaron a 35ºC durante 7 días, tiempo tras el cual se determinó la presencia de bacterias utilizando técnicas convencionales.Peripheral blood samples were taken in tubes containing EDTA for retro-orbital bleeding and underwent a complete blood cell count to determine the number of erythrocytes, leukocytes, hematocrit and number of platelets For blood cultures, blood was collected in 1 ml sterile insulin syringes coated with 70 µl of a 3.8% trisodium citrate solution (used as an anticoagulant that does not inhibit aerobic growth). An aliquot was inoculated (0.1 ml) of blood in the tubes containing (i) soy broth tripticase or (ii) fluid thioglycolate medium and incubated at 35 ° C for 7 days, after which the presence of Bacteria using conventional techniques.

Serum biochemical parameters

Se recogió el suero total sin añadir anticoagulantes y se calcularon los parámetros bioquímicos usando un analizador de parámetros bioquímicos automático (Beckman). Se analizaron en 10 animales por grupo y por día los valores del nitrógeno ureico en sangre, potasio, glucosa, albúmina, proteínas totales y creatinina.Total serum was collected without adding anticoagulants and biochemical parameters were calculated using an automatic biochemical parameter analyzer (Beckman). Be analyzed in 10 animals per group and per day the values of blood urea nitrogen, potassium, glucose, albumin, protein Totals and creatinine.

TAT-Slugh transduction in mice

A ratones mutantes Slug -/- y kit (W/W^{v}) (de 8 semanas de edad) se les inyectó por vía i.p. 250 µg de la proteína de fusión TAT-Slugh o de la proteína TAT en 500 Al de tampón fosfato salino (PBS). Los ratones tratados fueron irradiados y analizados tal como se ha descrito previamente.To mutant mice Slug - / - and kit (W / W v) (8 weeks old) were injected via i.p. 250 µg of the TAT-Slugh fusion protein or TAT protein in 500 Al phosphate buffered saline (PBS). The treated mice were irradiated and analyzed as previously described.

La fusión genética TAT-Slugh se generó insertando ADN que contenía el marco de lectura abierto (ORF) de Slug en el plásmido pTAT-HA (Nagahara et al., 1998) y posterior transferencia a bacterias BL21(DE3)LysS. Tanto la proteína TAT como la proteína de fusión TAT-Slugh fueron purificadas mediante un procedimiento ya descrito (Nagahara et al., 1998) por sonicación en urea 8 M seguido de pases a través de una columna Ni-NTA (Qiagen) y de una columna PD-10 (Amersham Pharmacia) en PBS para eliminar las sales, procediéndose seguidamente a congelar las proteínas purificadas en presencia de glicerol y almacenarlas a -80ºC.TAT-Slugh genetic fusion was generated by inserting DNA containing the Slug open reading frame (ORF) into plasmid pTAT-HA (Nagahara et al ., 1998) and subsequent transfer to BL21 (DE3) LysS bacteria. Both the TAT protein and the TAT-Slugh fusion protein were purified by a procedure already described (Nagahara et al ., 1998) by sonication in 8 M urea followed by passes through a Ni-NTA column (Qiagen) and a PD-10 column (Amersham Pharmacia) in PBS to remove salts, then frozen proteins purified in the presence of glycerol and stored at -80 ° C.

Cell marking

Las células Ba/F3 transducidas con la proteína de fusión TAT-Slugh fueron analizadas mediante marcaje por inmunofluorescencia tal como se describe a continuación. Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% (pip) durante 15 minutos, lavadas con PBS y permeabilizadas con metanol durante 2 minutos. Después de bloquear con FCS al 5% en PBVS durante 30 minutos se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5) para detectar las células transducidas. Las células fluorescentes fueron visualizadas mediante microscopía epifluorescente. Las imágenes se registraron mediante el empleo de un microscopio de barrido confocal.Ba / F3 cells transduced with protein TAT-Slugh fusion were analyzed by immunofluorescence labeling as described below. The cells were fixed in 4% paraformaldehyde (pip) during 15 minutes, washed with PBS and permeabilized with methanol for 2 minutes After blocking with 5% FCS in PBVS for 30 minutes the anti-HA monoclonal antibody was used (12CA5) to detect transduced cells. The cells fluorescents were visualized by microscopy epifluorescent The images were recorded using a confocal scanning microscope.

Immunoblot

Se recogieron células de médula ósea a partir de la cavidad medular de los fémures de los ratones. Los ensayos Western blot se realizaron utilizando extractos de 1x10^{7} células de méduloa ósea o de células Ba/F3 por calle. La proteína p53 de ratón fue detectada utilizando el anticuerpo FL-393 (Santa Cruz), la proteína de fusión TAT-Slugh fue detectada utilizando el anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5). El anticuerpo policlonal C-11 (Santa Cruz) fue utilizado para detectar actina.Bone marrow cells were collected from the medullary cavity of the femurs of mice. The essays Western blotting was performed using 1x107 extracts Bone medullary cells or Ba / F3 cells per street. The protein mouse p53 was detected using the antibody FL-393 (Santa Cruz), the fusion protein TAT-Slugh was detected using the antibody monoclonal anti-HA (12CA5). Polyclonal antibody C-11 (Santa Cruz) was used to detect actin

DNA analysis

Se aisló ADN de bajo peso molecular tal como se indica a continuación. Las células se recogieron en 1,5 ml de medio de cultivo, se microcentrifugaron durante 1 minuto a 1.500 rpm (400 x g) y los sedimentos se suspendieron en 300 \mul de tampón de proteinasa K. Después de un periodo de incubación de una noche a 55ºC, el ADN se precipitó con etanol, se suspendió en 200 \mul de tampón TE que contenía 50 µg/ml de RNasa A y se incubó a 37ºC durante 2 h. El ADN se extrajo con fenol y cloroformo y se precipitó con etanol. Alícuotas de ADN (2 µg) fueron marcadas en sus extremos con \alpha32-dCTP y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2%. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a Hybond-N (Amersham) y se autorradiografió durante 2 h a -70ºC.Low molecular weight DNA was isolated as Indicate below. The cells were collected in 1.5 ml of medium of culture, they were microcentrifuged for 1 minute at 1,500 rpm (400 x g) and the sediments were suspended in 300 µl of buffer Proteinase K. After an overnight incubation period at 55 ° C, the DNA was precipitated with ethanol, suspended in 200 µl of TE buffer containing 50 µg / ml RNase A and incubated at 37 ° C for 2 h. The DNA was extracted with phenol and chloroform and was precipitated with ethanol. Aliquots of DNA (2 µg) were marked on their ends with α32-dCTP and underwent electrophoresis in 2% agarose gels. After the electrophoresis, the gel was transferred to Hybond-N (Amersham) and autoradiographed for 2 h at -70 ° C.

II. Results Radioprotective potential of Slug cells deficient in γ radiation response

Células de médula ósea Slug deficientes fueron analizadas funcionalmente in vivo tras haber inducido daño en el ADN por radiación \gamma. Inicialmente, se irradiaron ratones Slug +/+, +/- y -/- con varias dosis que oscilaban entre 100 y 1.200 rads (1 rad = 0,01 Gy) para determinar una dosis letal (DL) de irradiación para los ratones Slug usados en estos estudios. El 50% de los ratones Slug -/- sobrevivió durante 30 días tras recibir una dosis de irradiación de 275 rads (DL_{50/30}). De manera similar, la DL_{90/30} se obtuvo con 300 rads y la DL_{100/30} se obtuvo con 350 rads (Figura 1). Sin embargo, la DL100130 de sus homólogos congénicos (ratones Slug +/+) estaba comprendida entre 1.100 y 1.150 rads. Por tanto, los estudios posteriores se llevaron a cabo aplicando 350 rads para obtener una dosis letal de irradiación para los ratones Slug deficientes.Slug deficient bone marrow cells were functionally analyzed in vivo after having induced DNA damage by γ radiation. Initially, Slug + / +, +/- and - / - mice were irradiated with several doses ranging from 100 to 1,200 rads (1 rad = 0.01 Gy) to determine a lethal dose (DL) of irradiation for Slug mice used in these studies. 50% of Slug - / - mice survived for 30 days after receiving an irradiation dose of 275 rads (DL 50/30). Similarly, the DL 90/30 was obtained with 300 rads and the DL 100/30 was obtained with 350 rads (Figure 1). However, the DL100130 of its congenital counterparts (Slug + / + mice) was between 1,100 and 1,150 rads. Therefore, subsequent studies were carried out by applying 350 rads to obtain a lethal dose of irradiation for Slug deficient mice.

Como la pérdida de función heterocigótica de Slug produce anomalías fenotípicas, se ha determinado la dosis letal de irradiación para ratones Slug +/-. La DL_{100/30} de los ratones Slug +/- se obtuvo con 1.100 rads (Figura 1), siendo similar a la DL_{100/30} de sus homólogos congénicos Slug +/+. Estos resultados indican que una mutación con resultado de pérdida de función de Slug en un alelo no produce un aumento en la radiosensibilidad.As the loss of heterozygous function of Slug produces phenotypic abnormalities, the dose has been determined Lethal irradiation for Slug +/- mice. The DL_ {100/30} of the Slug +/- mice were obtained with 1,100 rads (Figure 1), being similar to the DL_ {100/30} of its congenital counterparts Slug + / +. These results indicate that a mutation resulting in loss Slug function in an allele does not produce an increase in radiosensitivity

Para determinar si la recuperación hematopoyética era crucial para recuperar las dosis de irradiación, se trasplantaron células de médula ósea procedentes de donantes singénicos normales a los ratones Slug -/- y a los ratones Slug +/- irradiados con 350 y 1.100 rads, respectivamente. A las 4 horas posteriores a la irradiación, la inyección por vía i.v. de células de médula ósea supuso la supervivencia del 100% de los ratones sometidos a ambas dosis de irradiación, en comparación con el 0% de supervivencia de los animales control que no recibieron el trasplante de médula ósea. Los datos de los parámetros bioquímicos séricos no mostraron diferencias significativas, lo que sugiere que no había insuficiencias orgánicas principales que pudieran ser las responsables de las diferencias en las supervivencias de ambos grupos. Los hemocultivos de sangre periférica detectaron la presencia de bacterias intestinales en 10 de los 10 ratones que no habían recibido el transplante de médula ósea, en comparación con ninguno de los 9 ratones a los que se les había efectuado un transplante de médula ósea.To determine if recovery Hematopoietic was crucial to recover irradiation doses, bone marrow cells from donors were transplanted syngeneic normal to Slug - / - mice and Slug +/- mice irradiated with 350 and 1,100 rads, respectively. At 4 o'clock after irradiation, injection via i.v. of cells of bone marrow meant the survival of 100% of the mice undergoing both doses of irradiation, compared to 0% of survival of control animals that did not receive the bone marrow transplant. The data of the biochemical parameters serum showed no significant differences, suggesting that there were no major organic insufficiencies that could be the responsible for the differences in the survival of both groups Peripheral blood cultures detected presence of intestinal bacteria in 10 of the 10 mice that do not they had received the bone marrow transplant, compared to none of the 9 mice that had had a bone marrow transplant.

Normal activation of p53 in Slug bone marrow cells deficient in response to DNA damage

Se ha encontrado que las células de médula ósea Slug deficientes son radiosensibles a danos en el ADN inducidos por radiación \gamma. La proteína p53 está implicada en la respuesta celular a la irradiación [Lee et al., Oncogene, 1994, 9:3731-3736]. La exposición a una radiación ionizante provoca un incremento en los niveles intracelulares de p53 [Kastan et al., Cancer Res., 1991, 51:6304-6312]. Por tanto, se estudió si el potencial radioprotector de Slug se basaba en una interferencia con la activación de p53. Tal como se muestra en la Figura 2, se midieron los niveles de p53 a diferentes tiempos en células de médula ósea procedentes de ratones Slug -/- y Slug +/+ después de haber inducido daño en el ADN por radiación \gamma. La activación de p53 en células control y en células Slug deficientes fue similar (Figura 2), lo que indica que la regulación de p53 en respuesta al daño causado en el ADN no se ve afectada en células Slug deficientes. Estos resultados están de acuerdo con datos previos [Inoue et al., Cancer Cell, 2002, 2:279-285] y sugieren que Slug no necesita p53 para su función radioprotectora.It has been found that Slug deficient bone marrow cells are radiosensitive to DNA damage induced by γ radiation. The p53 protein is involved in the cellular response to irradiation [Lee et al ., Oncogene, 1994, 9: 3731-3736]. Exposure to ionizing radiation causes an increase in intracellular levels of p53 [Kastan et al ., Cancer Res., 1991, 51: 6304-6312]. Therefore, it was studied whether Slug's radioprotective potential was based on interference with the activation of p53. As shown in Figure 2, p53 levels were measured at different times in bone marrow cells from Slug - / - and Slug + / + mice after having induced DNA damage by γ radiation. The activation of p53 in control cells and in deficient Slug cells was similar (Figure 2), which indicates that the regulation of p53 in response to DNA damage is not affected in deficient Slug cells. These results are in agreement with previous data [Inoue et al ., Cancer Cell, 2002, 2: 279-285] and suggest that Slug does not need p53 for its radioprotective function.

Role of SCF in the hematopoietic recovery of Slug mice poor irradiated with lethal doses

Se ha encontrado potencial radioprotector únicamente en células de médula ósea tipo salvaje mientras que células de médula ósea Slug deficientes no protegían de la irradiación letal. El potencial radioprotector en ratones está sujeto a la modulación por interacciones SCF/c-kit. El tratamiento de ratones irradiados con SCF tiene como consecuencia un aumento de la supervivencia, en comparación con los controles irradiados [Zsebo KH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 89:9464-9468; Neta R et al., Blood, 1993; 81:324-327]. Como la radioprotección por parte del SCF se hace evidente tras inyección por ambas vías de administración, tanto por vía i.p como por vía i.v., del rSCF en ratones (14), se utilizó la vía i.v. en estos experimentos. La combinación del pre y post-tratamiento con SCF (-20, -2, y + 4 h) dio como resultado un 100% de supervivencia de ratones Slug +/+ y +/- irradiados con 1.100 rads (Tabla 1). La Tabla 1 muestra el efecto del SCF sobre la supervivencia de los ratones irradiados con LD_{100/30}.Radioprotective potential has been found only in wild-type bone marrow cells while deficient Slug bone marrow cells did not protect against lethal irradiation. The radioprotective potential in mice is subject to modulation by SCF / c-kit interactions. Treatment of mice irradiated with SCF results in increased survival, compared to irradiated controls [Zsebo KH et al ., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1993; 89: 9464-9468; Neta R et al ., Blood, 1993; 81: 324-327]. Since radioprotection by the SCF becomes evident after injection by both routes of administration, both ip and iv, of rSCF in mice (14), the iv route was used in these experiments. The combination of pre and post-treatment with SCF (-20, -2, and + 4 h) resulted in a 100% survival of Slug + / + and +/- mice irradiated with 1,100 rads (Table 1). Table 1 shows the effect of SCF on the survival of mice irradiated with LD 100/30.

TABLE 1 Efecto del SCF sobre la supervivencia de ratones irradiados con LD_{100/30}Effect of SCF on mouse survival irradiated with LD 100/30

GenotipoGenotype TratamientoTreatment Muertos/TotalDead / Total Supervivencia (%)Survival (%) Slug -/-slug - / - ExcipienteExcipient 40/4040/40 00 Slug -/-Slug -/- SCFSCF 40/4040/40 00 Slug +/-slug +/- ExcipienteExcipient 40/4040/40 00 Slug +/-Slug +/- SCFSCF 0/400/40 100100 Slug +/+slug + / + ExcipienteExcipient 40/4040/40 00 Slug +/+Slug + / + SCFSCF 0/400/40 100100 \begin{minipage}[t]{153mm}El excipiente o el SCF fue inyectado por vía i.v. a las 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación. Los ratones Slug -/- fueron irradiados con 350 rads y los ratones Slug +/+ y +1- con 1.100 rads. Los resultados presentados corresponden a 40 ratones de cada grupo.\end{minipage} \ begin {minipage} [t] {153mm} The excipient or the SCF was injected via i.v. at 20 h and 2 h before irradiation and 4 h after the last dose of irradiation. Slug mice - / - were irradiated with 350 rads and Slug + / + and + 1- mice with 1,100 rads. The results presented correspond to 40 mice of each group. \ end {minipage}

Para determinar hasta qué punto el SCF podría proteger a los ratones Slug -/- frente a una irradiación que en otras circunstancias seria letal, los ratones Slug -/- se irradiaron con 350 rads y se les inyectó SCF o un excipiente. El día 30, ninguno de los animales Slug -/- había sobrevivido (supervivencia 0%). Por el contrario, ninguno de los animales Slug +/+ y +/- murieron después de la irradiación y los animales seguían vivos después de los 30 días del periodo de estudio. Las poblaciones celulares de la médula ósea, incluyendo CFU-GM, CFU-E y BFU-E, nunca experimentaron una recuperación en ratones Slug -/- tratados con SCF (Figura 3). El día 3 después de la irradiación, las poblaciones celulares de la médula ósea disminuyeron hasta aproximadamente un 4% de los niveles previos a la irradiación (Figura 3), mientras que los ratones Slug +1- tratados con SCF presentaban un drástico aumento de las poblaciones celulares hacia el día 8 y habían recuperado los niveles anteriores a la irradiación hacia el día 21 (Figura 3). Estos resultados eran concordantes con la hematología de la sangre periférica, que no mostraba diferencias significativas entre los ratones Slug -/- tratados con SCF y no tratados [Pérez-Losada et al., Blood, 2002, 100:1274-1286], no observándose el aumento esperado en la cifra de eritrocitos, leucocitos y plaquetas durante las 2-3 semanas post-irradiación.To determine the extent to which SCF could protect Slug - / - mice from irradiation that would be lethal in other circumstances, Slug - / - mice were irradiated with 350 rads and SCF or an excipient was injected. On day 30, none of the Slug - / - animals had survived (0% survival). On the contrary, none of the Slug + / + and +/- animals died after irradiation and the animals were still alive after 30 days of the study period. Bone marrow cell populations, including CFU-GM, CFU-E and BFU-E, never experienced a recovery in Slug - / - mice treated with SCF (Figure 3). On day 3 after irradiation, the bone marrow cell populations decreased to approximately 4% of pre-irradiation levels (Figure 3), while Slug + 1- mice treated with SCF had a drastic increase in cell populations by day 8 and had recovered levels prior to irradiation by day 21 (Figure 3). These results were consistent with the hematology of peripheral blood, which showed no significant differences between Slug - / - mice treated with SCF and untreated [Pérez-Losada et al ., Blood, 2002, 100: 1274-1286], no observing the expected increase in the number of erythrocytes, leukocytes and platelets during 2-3 weeks post-irradiation.

Rescue of lethal irradiation-induced aplasia in mice mutant kit by TAT-Slugh

Slug es una diana molecular aguas abajo de la vía de señalización SCF/c-kit, por lo que se exploró si el factor Slug podría estar implicado en la defensa frente al fallo hematopoyético inducido por irradiación en ratones kit mutantes. Como no se disponía de mecanismos farmacológicos para activar Slug, se procedió a la transducción de Slug: TAT-Slugh (Figura 4A). Se generó una proteína de fusión TAT-Slugh en el extremo amino terminal (Nagahara et al., 1998). El análisis por inmunoblot y el análisis microscópico reveló que la proteína de fusión TAT-Slugh era transducida rápidamente en células cultivadas alcanzando concentraciones intracelulares máximas en menos de 20 minutos (Figuras 4B-4D).Slug is a molecular target downstream of the SCF / c-kit signaling path, so explored if the Slug factor could be involved in the defense against irradiation-induced hematopoietic failure in mice mutant kit As there were no pharmacological mechanisms available for Activate Slug, Slug transduction was carried out: TAT-Slugh (Figure 4A). A protein was generated from TAT-Slugh fusion at the amino terminal end (Nagahara et al., 1998). Immunoblot analysis and analysis microscopic revealed that fusion protein TAT-Slugh was rapidly transduced into cells cultured reaching maximum intracellular concentrations in less than 20 minutes (Figures 4B-4D).

A continuación, se inyectó por vía i.p. la proteína TAT-Slugh en ratones Slug -/- (Schwarze et al., Science, 1999, 285:1569-1572]. El análisis por inmunoblot de células de médula ósea aisladas 120 minutos después de la inyección i.p. puso de manifiesto la presencia de la proteína TAT-Slugh alcanzando concentraciones máximas tras la inyección de 250 µg de la proteína TAT-Slugh (Figura 4E). Para ensayar el efecto de la proteína TAT-Slugh en ratones Slug deficientes irradiados con una dosis letal, se administró una única dosis de 250 µg de proteína TAT-Slugh inmediatamente después de la irradiación letal. Los 10 ratones Slug deficientes sobrevivieron tras el tratamiento con la proteína TAT-Slugh mientras que no sobrevivió ninguno de los 10 ratones Slug deficientes tratados con la proteína TAT-control (Figura 4F). Estos resultados ponen de manifiesto que la administración de TAT-Slugh puede complementar completamente la recuperación de la aplasia inducida por irradiación de una dosis letal en ratones Slug deficientes.Next, the TAT-Slugh protein was injected ip into Slug - / - mice (Schwarze et al ., Science, 1999, 285: 1569-1572). Immunoblot analysis of bone marrow cells isolated 120 minutes after The ip injection showed the presence of the TAT-Slugh protein reaching maximum concentrations after the injection of 250 µg of the TAT-Slugh protein (Figure 4E). To test the effect of the TAT-Slugh protein in deficient Slug mice irradiated with one lethal dose, a single dose of 250 µg of TAT-Slugh protein was administered immediately after lethal irradiation The 10 deficient Slug mice survived after treatment with the TAT-Slugh protein while none of the 10 deficient Slug mice survived treated with the TAT-control protein (Figure 4F). These results show that the administration of TAT-Slugh can completely complement the recovery of irradi-induced aplasia ation of a lethal dose in deficient Slug mice.

Seguidamente, se ensayó el efecto de TAT-Slugh en ratones kit deficientes irradiados mediante la administración de una dosis única de 250 µg de la proteína TAT-Slugh inmediatamente después de la administración de la dosis letal de irradiación. Los 10 ratones kit deficientes sobrevivieron tras el tratamiento con la proteína TAT-Slugh mientras que no sobrevivió ninguno de los 10 ratones kit deficientes tratados con la proteína TAT-control (Figura 4F). La proteína TAT-Slugh protegió a las células de médula ósea kit deficientes de la apoptosis tras irradiación con la dosis letal (Figura 5A). Las poblaciones celulares de la médula ósea de ratones kit deficientes tratados con TAT-Slugh se recuperaron y casi volvieron a los niveles anteriores a los de la irradiación. Estos resultados fueron concordantes con la hematología de la sangre periférica (Figura 5B). Por tanto, TAT-Slugh parece proteger ratones kit mutantes de la irradiación a dosis letales, lo que indica que Slug media el potencial radioprotector de la vía de señalización SCF/c-kit.Next, the effect of TAT-Slugh in irradiated deficient kit mice by administering a single dose of 250 µg of the TAT-Slugh protein immediately after administration of the lethal dose of irradiation. The 10 kit mice poor survived after protein treatment TAT-Slugh while none of the survived 10 deficient kit mice treated with protein TAT-control (Figure 4F). The protein TAT-Slugh protected bone marrow cells kit Deficient apoptosis after irradiation with lethal dose (Figure 5A). The bone marrow cell populations of mice poor kit treated with TAT-Slugh se recovered and almost returned to the levels before those of the irradiation. These results were consistent with the peripheral blood hematology (Figure 5B). So, TAT-Slugh seems to protect mutant kit mice from irradiation at lethal doses, indicating that Slug mediates the radioprotective potential of the signaling pathway SCF / c-kit.

III. Discussion The radioprotective function of the signaling pathway of SCF / c-kit is mediated by the Slug factor

Los acontecimientos biológicos controlados por la vía de transducción de señales de SCF/c-kit están involucrados en la generación y migración de las células madre hematopoyéticas. Ahora se ha investigado si la supervivencia a la irradiación letal gobernada por la vía de señalización de SCF/c-kit está mediada por el factor de transcripción Slug. Según esto, como la ausencia de Slug altera el desarrollo de las células madre hematopoyéticas, al igual que las mutaciones en los locus W o S1, y como los genes Kit y Slug modulan de forma coordinada el desarrollo y supervivencia de melanocitos y líneas hematopoyéticas en ratones kit deficientes y Slug deficientes [Pérez-Losada et al., Blood, 2002, 100:1274-1286; Sánchez- Martín et al., Hum. Mol. Genet., 2002, 11:3231-3236], se procedió a analizar, en primer lugar, si la ausencia de Slug producía un aumento en la radiosensibilidad. Los datos aquí presentados demuestran claramente que los ratones mutados en el locus Slug son radiosensibles. Estos resultados confirman que Slug es absolutamente necesario para la supervivencia a la irradiación letal de los ratones no manipulados. Como los ratones Slug mutantes tienen una vía de transducción de las señales de SCF/c-kit normal, se ha demostrado también que la activación del c-kit por el SCF no puede recuperar específicamente este efecto en los ratones Slug mutantes. Por el contrario, se pudo complementar el fallo hematopoyético tras dañar el ADN por radiación -y en ratones c-kit deficientes transduciéndoles con la proteína TAT-Slugh, lo que demuestra que la estimulación por parte del SCF de la recuperación hematopoyética tras la irradiación letal está mediada por el factor Slug.Biological events controlled by the signal transduction pathway of SCF / c-kit are involved in the generation and migration of hematopoietic stem cells. It has now been investigated whether the survival to lethal irradiation governed by the SCF / c-kit signaling pathway is mediated by the transcription factor Slug. According to this, as the absence of Slug alters the development of hematopoietic stem cells, as well as mutations in the W or S1 locus, and how the Kit and Slug genes coordinate in a coordinated way the development and survival of melanocytes and hematopoietic lines in deficient kit mice and Slug deficient [Pérez-Losada et al ., Blood, 2002, 100: 1274-1286; Sánchez- Martín et al ., Hum. Mol. Genet., 2002, 11: 3231-3236], we proceeded to analyze, first, if the absence of Slug produced an increase in radiosensitivity. The data presented here clearly demonstrate that mice mutated in the Slug locus are radiosensitive. These results confirm that Slug is absolutely necessary for the lethal irradiation survival of unhandled mice. Since the mutant Slug mice have a normal SCF / c-kit signal transduction pathway, it has also been shown that the activation of the c-kit by the SCF cannot specifically recover this effect in the mutant Slug mice. On the contrary, hematopoietic failure could be complemented after damaging the DNA by radiation - and in deficient c-kit mice by transducing them with the TAT-Slugh protein, which demonstrates that the SCF stimulation of the hematopoietic recovery after lethal irradiation It is mediated by the Slug factor.

Estos hallazgos son congruentes con el modelo propuesto por los inventores y según el cual las células madre que llevan el receptor c-kit expresarian el factor Slug, promoviendo así la supervivencia de la célula, dependiendo de la señal externa requerida (SCF) y permitiendo a las células migrar fuera de su entorno normal. Si esto no se consigue en un periodo específico de tiempo, experimentarian apoptosis, ya que se verian privadas de las señales externas requeridas para mantener la expresión del factor Slug.These findings are congruent with the model. proposed by the inventors and according to which the stem cells that they carry the c-kit receptor would express the Slug factor, thus promoting cell survival, depending on the external signal required (SCF) and allowing cells to migrate out of its normal environment. If this is not achieved in a period specific of time, they would experience apoptosis, since they would look deprived of the external signals required to maintain the Slug factor expression.

Importance of Slug-dependent radio resistance in the cancer treatment

Los resultados obtenidos muestran que la radiorresistencia conferida a las células HSC por la vía de señalización de SCF/c-kit está mediada por el factor Slug. El receptor c-kit está involucrado tanto en leucemias como en tumores sólidos. Se han descrito mutaciones que tienen como consecuencia la activación constitutiva del c-kit en las leucemias mieloides agudas, en el cáncer de pulmón de células pequeñas, en tumores ginecológicos, en carcinomas de mama y en tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF). Por tanto, la activación constitutiva de c-kit podría conferir propiedades de radiorresistencia a las células tumorales. Además, los hallazgos más recientes han mostrado que el factor Slug también se expresa en células leucémicas con la translocación t(17;19), en células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR y en células que expresan BCR- ABL. Por lo tanto, el factor Slug podría ser un componente común que proporciona radiorresistencia a las células tumorales y, como tal, podría, por lo tanto, constituir una diana atractiva en el tratamiento del cáncer humano.The results obtained show that the radio resistance given to HSC cells via SCF / c-kit signaling is mediated by the factor Slug. The c-kit receiver is involved in both leukemias as in solid tumors. Mutations have been described that they have as a consequence the constitutive activation of c-kit in acute myeloid leukemias, in the small cell lung cancer, in gynecological tumors, in breast carcinomas and in cell-derived colonic tumors interstitials of Cajal (a type of SCF-dependent cells). Therefore, the constitutive activation of c-kit could confer radio resistance properties to cells Tumor In addition, the most recent findings have shown that the Slug factor is also expressed in leukemic cells with the t translocation (17; 19), in rhabdomyosarcoma cells that express the PAX3-FKHR translocation and in cells that express BCR-ABL. Therefore, the Slug factor could be a common component that provides radioresistance to cells tumor and, as such, could, therefore, constitute a target Attractive in the treatment of human cancer.

Claims

1. Use of a Slug inhibitor in the development of a pharmaceutical composition to increase the radiosensitivity of tumor cells expressing Slug or in the development of a pharmaceutical composition for the treatment of Cancer.

2. Use according to claim 1, wherein said Slug inhibitor is a compound capable of interfere with the Slug function at the nucleic acid level or protein.

3. Use according to claim 1 or 2, in wherein said Slug inhibitor is selected from a protein, a peptide, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, an antibody or an antibody fragment.

4. Use according to claim 1, wherein said cancer comprises tumor cells that express Slug.

5. Use according to claim 4, wherein said tumor cells expressing Slug comprise cells of leukemia or solid tumors.

6. Use according to claim 1 or 5, in the development of a pharmaceutical composition for the treatment of acute myeloid leukemias, leukemic cells with translocation t (17; 19), sarcomas, rhabdomyosarcoma cells that express PAX3-FKHR translocation, cells that express BCR-ABL, small cell lung cancer, gynecological tumors, breast carcinomas or colonic tumors interstitial cell derivatives of Cajal.

7. Use of a compound selected from a nucleic acid encoding the Slug protein, a protein Slug, a stimulator of Slug and its mixtures, in the elaboration of a pharmaceutical composition that confers radioprotection or radioresistance to normal cells or in the development of a Pharmaceutical composition for the treatment of cancer.

8. Use according to claim 7, wherein said nucleic acid encoding the Slug protein comprises CDNA, cDNA or mRNA containing the coding sequence of the Slug protein

9. Use according to claim 7, wherein said Slug stimulator comprises a compound capable of stimulating the expression of the Slug gene product in normal cells.