ES2252971T3

ES2252971T3 - Metodo para determinar el pronostico de individuos infectados por el vih.

Info

Publication number: ES2252971T3
Application number: ES99945084T
Authority: ES
Inventors: Daniel Zagury; Jean-Francois Zagury
Original assignee: Neovacs SA
Current assignee: Neovacs SA
Priority date: 1998-08-21
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2019-08-20
Also published as: DE69928275D1; ATE309394T1; WO2000011225A9; EP1123419A1; WO2000011225A1; EP1123419B1; EP1123419A4; DE69928275T2; CY1106067T1; DK1123419T3

Abstract

Un método in vitro para determinar la prog nosis de un individuo infectado por VIH, que comprende: - la medida del nivel de únicamente dos marcadores séri cos, concretamente anticuerpos anti-tat y proteína p24, en el suero de un individuo infectado por VIH; - la comparación del nivel medido de anticuerpos anti- tat y de proteína p24 con los niveles indicativos de progresión o no progresión de la enfermedad; y - la determinación de la prognosis del individuo infec tado por VIH, en el que niveles elevados de anticuer pos anti-tat y niveles bajos de proteína p24 son in dicativos de no progresión de la enfermedad, y niveles bajos de anticuerpos anti-tat y niveles ele vados de proteína p24 son indicativos de progresión de la enfermedad.

Description

Método para determinar el pronóstico de individuos infectados por el VIH.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a análisis de diagnóstico y pronóstico para determinar la progresión de una enfermedad. Más particularmente, se refiere a un análisis de pronóstico para determinar el estado de progresión de pacientes infectados con VIH.

Descripción de la técnica relacionada

Después de la activación inmune, las células CD4^{+} infectadas con VIH-1 sintetizan proteínas víricas y liberan viriones (Zagury y col., 1986). En las células infectadas, la proteína tat reguladora de la transactivación-transcripción, que no se encuentra en la partícula vírica pero está codificada por el genoma del VIH-1, intensifica la transcripción del ARNm vírico a través de la interacción con la secuencia de ARN que actúa en cis denominada TAR (Cullen, 1991). En contraste con su efecto intensificador sobre la replicación vírica, tat deteriora la maquinaria fisiológica normal de las células T infectadas, contribuyendo de este modo a su muerte prematura (Zagury y col., 1986). Las alteraciones celulares inducidas por tat pueden ser también ejercidas en células T no infectadas, ya que esta proteína liberada por las células infectadas de manera aguda al compartimento extracelular (Ensoli y col., 1993), puede dirigirse hacia células no infectadas por un mecanismo que implica interacción con integrinas (Hynes, 1992) o con otros receptores de la membrana celular (Weeks y col., 1993). Las células inmunes, que llevan una gran densidad de receptores de integrinas, particularmente después de la activación (Hynes, 1987), pueden ser disreguladas por tat extracelular, según se ha demostrado in vitro (Zagury y col., 1996). El pretratamiento de PBMCs activadas con tat induce inmunosupresión de células T (Viscidi y col., 1995; Chirmule y col., 1995) y apoptosis (Li y col., 1995; Westendorp y col., 1995; Katsikis y col., 1997). La tat extracelular actúa no solamente sobre células T sino también sobre las células procesadoras de antígeno (APCs), por ejemplo monocitos, macrófagos y células dendríticas (Zagury y col., 1998). El efecto inmunosupresor inducido por tat es promulgado además por la secreción incrementada de la citoquina inmunosupresora IFN\alpha por las APCs (Zagury y col., 1998). Los presentes inventores demostraron que cultivos de PBMC activadas con PHA tratados con VIH-1, pero no cultivos sin tratar, generan células T supresoras CD8^{+}. En este modelo experimental in vitro, se confirmó el potente papel de tat y de IFN\alpha en la inmunosupresión inducida por VIH-1, ya que anticuerpos específicos anti-tat y anti-IFN\alpha, pero no anticuerpos control, impedían la producción de células T supresoras CD8^{+} (Zagury y col., 1998).

Actualmente, el indicador o marcador del pronóstico es la carga vírica. Sin embargo, el trabajo de los presentes inventores muestra que no es un buen indicador del pronóstico de la progresión futura de la enfermedad en una etapa temprana de la enfermedad cuando la carga vírica permanece baja, sino que es sencillamente un indicador de la etapa de la enfermedad (sujeto asintomático frente a enfermo). Aunque hay disponible comercialmente un ensayo para determinar la proteína vírica p24, este ensayo es utilizado solamente para determinar si un individuo está infectado, y no como un indicador/marcador del pronóstico de la progresión de la enfermedad.

La cita de cualquier documento en la presente no indica la admisión de que tal documento sea técnica anterior pertinente, o sea considerado material para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier afirmación referente al contenido o a una fecha de cualquier documento está basada en la información disponible para los solicitantes en el momento del registro y no constituye una admisión de la corrección de tal afirma-
ción.

Resumen de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que los parámetros inmunes anticuerpo anti-tat y niveles de proteína p24 en individuos infectados con VIH, son los mejores indicadores de la evolución de la enfermedad, al menos en una etapa no avanzada de la enfermedad. Utilizando el anticuerpo anti-tat y la proteína p24 como los dos únicos marcadores del pronóstico, la presente invención proporciona un método in vitro para determinar la prognosis de un individuo infectado con VIH mediante la medida del nivel sérico de los marcadores del pronóstico y la comparación de los mismos con los niveles séricos de los marcadores del pronóstico que son indicativos de la progresión o no progresión de la enfermedad o la comparación de los mismos con una medida del pasado realizada anteriormente en el mismo individuo.

Se proporciona además un método in vitro para evaluar la respuesta inmune de un individuo no infectado como resultado de la inmunización con una vacuna de tat mediante la medida del nivel de anticuerpos anti-tat y de la proteína p24 después de la inmunización.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación de los títulos de IFN\alpha en sueros de pacientes de No Progresión/Progresión lenta (NP), que son pacientes asintomáticos, y en sueros de pacientes de Progresión Rápida (FP), que son pacientes enfermos. En el eje de abscisas, los títulos de IFN\alpha están expresados como U.I. (<4, 4-30 y >30), y en el eje de ordenadas, los porcentajes de pacientes NP (\Box) y FP (\blacksquare).

Las Figuras 2A y 2B muestran una representación gráfica de la distribución de la DO de p24 para subpoblaciones de NP y de pacientes de No Progresión con Progresión de la enfermedad (NP-P) (Fig. 2A) y una representación en forma de diagrama de cajas de la distribución (Fig. 2B). Las cajas oscuras de los diagramas de cajas representan un 75% de la distribución, los segmentos hacia arriba y hacia abajo representan los límites superior e inferior de los umbrales de los valores atípicos, por encima y por debajo de los cuales están los valores atípicos y los extremos.

Las Figuras 3A y 3B muestran una representación gráfica de la distribución del Ab anti-tat para las subpoblaciones NP y NP-P (Fig. 3A) y una representación en forma de diagrama de cajas de la distribución (Fig. 3B). Las cajas oscuras de los diagramas de cajas representan el 75% de la distribución, los segmentos hacia arriba y hacia abajo representan los límites superior e inferior de los umbrales de los valores atípicos, por encima y por debajo de los cuales están los valores atípicos y los extremos.

Las Figuras 4A-4F muestran diagramas dispersión de los niveles de Ab anti-tat (D.O.) frente a: el nivel de antígeno p24 (pg/ml) (p <0,001) (Fig. 4A); el log_{10} de la carga vírica (copias de ARN/ml) (p=No Significativo o NS) (Fig. 4B); recuento de células CD4 (células/mm^{3}) (p=NS) (Fig. 4C); el nivel de Ab anti-p24 (D.O.) (p=NS) (Fig. 4D); el nivel de Ab anti-nef (D.O.) (p=NS) (Fig. 4E); el nivel de Ab anti-TT (D.O.) (p=NS) (Fig. 4F) en sueros de casos NP que permanecían estables (X) o que progresaron (\ding{115}) durante el periodo de seguimiento de 21 meses. Las líneas discontinuas corresponden a la mediana. Los valores entre paréntesis representan los valores de p, esto es los valores de significación obtenidos de los análisis de correlación de Pearson.

Las Figuras 5A y 5B muestran la cinética de la producción de anticuerpos (Ab) anti-Tat (Fig. 5A), medida mediante ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), y un histograma de los títulos de anticuerpos anti-Tat en los sueros recogidos de 4 a 6 meses después de la primera inyección (Fig. 5B). En la Fig. 5A, los sueros fueron utilizados a una dilución 1:500 y los niveles de anticuerpo fueron expresados como valores de densidad óptica (D.O.). Los sueros procedentes de sujetos del estudio no inmunizados no presentaban niveles detectables de anticuerpos hacia Tat. A, B, C, D y E representan sujetos del estudio inmunizados. En la Fig. 5B, los anticuerpos hacia Tat fueron analizados en los sueros a diluciones 1:1.000 a 1:64.000 y medidos mediante ELISA. Los títulos están expresados como la mayor dilución que daba una reacción positiva de más de tres veces los niveles previos a la inmunización. Los sueros procedentes de individuos no inmunizados (controles: F y G) no mostraban títulos detectables de anticuerpos.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de investigar si marcadores séricos particulares en individuos infectados con VIH, tales como anticuerpos contra especificidades del VIH-1 o el marcador vírico p24, son predictivos de la progresión de la enfermedad, se recogió suero de 104 individuos infectados con VIH-1 en los que no había progresado la enfermedad (elegidos como individuos que han estado infectados más de ocho años con recuentos de células CD4 siempre alrededor de 500 por mm^{3} y sin signos clínicos de enfermedad) en el momento de su inscripción en el estudio y en el seguimiento de uno a dos años más tarde. En el seguimiento, 26 de los individuos infectados con VIH-1 mostraron signos de progresión de la enfermedad (una disminución de células CD4 de más del 30% o la presencia de síntomas clínicos). En este estudio, los presentes inventores descubrieron que, de los marcadores séricos analizados (anticuerpos hacia antígenos del VIH incluyendo las proteínas env, gag, nef y tat, así como antigenemia p24, viremia, recuento de células CD4 y título de IFN\alpha), los anticuerpos anti-tat y la antigenemia p24 eran los mejores marcadores predictivos en el suero, estando los anticuerpos anti-tat correlacionados inversamente con la antigenemia p24, que es ya conocida como un marcador de la replicación vírica. Éstos fueron los únicos dos marcadores séricos que correlacionaban significativamente los dos subgrupos, individuos infectados con un nivel de marcadores séricos por encima de la mediana y sujetos con un nivel de marcadores séricos por debajo de la medida, con la progresión y no progresión de la enfermedad.

Los niveles séricos de anticuerpos anti-tat y de proteína p24 son utilizados como marcadores de pronóstico en métodos de pronóstico de acuerdo con la presente invención. Por el término "prognosis" se quiere indicar que el estado de progresión del individuo infectado con VIH en la infección temprana puede ser pronosticado. De este modo, como los niveles séricos de anticuerpos anti-tat se correlacionan inversamente con la progresión de la enfermedad, a niveles séricos elevados de anticuerpos anti-tat, el individuo infectado con VIH está en un estado de no progresión. El nivel sérico de anticuerpos anti-tat determina el estado de progresión de un individuo infectado con VIH. Mientras que los niveles de anticuerpos anti-tat estén todavía elevados, el individuo es un paciente de no progresión. Una vez que comienza a disminuir el nivel de anticuerpos anti-tat, la prognosis es entonces que el individuo infectado está entrando en un estado progresivo.

Además, aparte de medir el nivel sérico de anticuerpos anti-tat como marcador/indicador del pronóstico, el nivel sérico de p24, que es ya un marcador conocido de la replicación vírica, puede ser también utilizado como marcador del pronóstico en la presente invención, ya que ha sido descubierto por los presentes inventores que está altamente correlacionado con la progresión de la enfermedad. Ensayos para determinar p24 con el fin de diagnosticar la infección por VIH-1 (pero no el estado de progresión del individuo) están disponibles comercialmente.

La presente invención está dirigida a un método in vitro para determinar la prognosis de un individuo infectado por VIH mediante la medida del nivel sérico de la combinación de anticuerpos anti-tat y proteína p24 como marcadores de pronóstico, y la comparación del nivel medido con los niveles de los marcadores de pronóstico indicativos de la progresión o no progresión de la enfermedad.

El nivel de cualquiera de los marcadores séricos anteriormente discutidos puede ser medido mediante cualquiera de una variedad de técnicas de ensayo y no está limitado al ELISA utilizado en el Ejemplo de la presente, según será apreciado por los expertos en la técnica. Por ejemplo, estas técnicas podrían incluir la utilización de transferencias, esferas, placas, inmunoprecipitaciones, anticuerpos monoclonales o policlonales contra la proteína tat o fragmentos, la proteína tat o péptidos de tat, medidas competitivas o ensayos directos, marcadores enzimáticos o radiactivos, etc.

La correlación de los niveles séricos elevados de anticuerpos anti-tat con la no progresión de la enfermedad entre individuos infectados con VIH y de los niveles bajos con una progresión de la enfermedad, sugiere firmemente que la elevación del nivel sérico de anticuerpos anti-tat mediante inmunización activa podría controlar la replicación vírica.

Mediante inmunización activa con una vacuna de tat, el nivel de anticuerpos anti-tat es restaurado hasta un nivel indicativo de no progresión de la enfermedad. Este mismo individuo es monitorizado a lo largo del tiempo con el fin de confirmar que el nivel sérico de anticuerpos anti-tat está en un nivel predictivo de la no progresión de la enfermedad y que este nivel se mantiene a lo largo del tiempo. Si se observa una disminución del nivel sérico de anticuerpos anti-tat o un incremento de la proteína tat en el suero, puede contemplarse una intervención adicional, tal como una inmunización adicional con una vacuna de tat.

Aunque la vacuna de tat preferida es la vacuna del toxoide tat descrita en WO 96/27389, la vacuna de tat utilizada de acuerdo con la presente invención no está limitada a tal vacuna del toxoide tat. Como apreciarán los expertos en la técnica, puede utilizarse de acuerdo con la presente invención cualquier vacuna de tat que consiga la finalidad deseada de estimular una respuesta inmune y elevar el título de anticuerpos anti-tat y lo cual está dentro de la experiencia en la técnica.

La presente invención está dirigida además a un método in vitro para evaluar la respuesta inmune de un individuo no infectado como resultado de la inmunización con una vacuna de tat. Este método compara el nivel de anticuerpos anti-tat antes y después de la inmunización para determinar la respuesta inmune humoral del individuo a la proteína tat.

Habiendo descrito ahora la invención de manera general, la misma será comprendida más fácilmente mediante referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan a manera de ilustración y no están destinados a ser limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos Pacientes

Se reclutaron dos grupos de caucásicos franceses genéticamente homogéneos en varios centros hospitalarios de Paris y provincias circundantes en el contexto del programa GRIV (Hendel y col., 1996; Rappaport y col., 1997). El primer grupo estaba compuesto por pacientes de No Progresión/Progresión lenta (NP) y constaba de 182 individuos reclutados sobre la base de los criterios siguientes: seropositividad durante más de 8 años (media y mediana 12 años ambas); clínicamente asintomáticos en ausencia de terapia antirretroviral; recuento de células CD4 nunca inferior a 500/mm^{3}. Estos sujetos representaban aproximadamente el 1% de los individuos seropositivos que acudían a los centros hospitalarios. En este grupo de NPs asintomáticos, 104 individuos tenían su seguimiento disponible durante un periodo de 1-2 años (media y mediana 20 y 21 meses) después de su inscripción inicial: síntomas clínicos (Etapa B o C de CDC según está definido por la clasificación de 1993) y los parámetros de laboratorio incluían el recuento de células CD4. Veintiseis de estos 104 NPs mostraron signos de progresión durante 1 a 2 años de seguimiento y fueron denominados pacientes de No Progresión en los que Progresó la enfermedad (NP-P), mientras que los 78 restantes fueron denominados pacientes de No Progresión en los que No Progresó la enfermedad (NP-NP).

El segundo grupo estaba compuesto por 67 pacientes de Progresión Rápida (FP) definidos según sigue: seropositividad < 3 años, tratados con fármacos anti-VIH-1, clínicamente asintomáticos o no y recuento de células CD4 inferior a 300/mm^{3}. La población de FP representaba el 5% aproximadamente de los individuos seropositivos reclutados en las clínicas.

Después de su inclusión en el estudio GRIV, las células y el suero fueron enviados durante la noche al laboratorio de los presentes inventores y se almacenaron congelados. El presente trabajo fue realizado sobre este banco de sueros recogidos en el momento de su inscripción en el estudio.

Ensayos Serológicos

Los sueros procedentes de los pacientes NP y FP, recogidos en el momento de su incorporación al estudio, y de controles sanos seronegativos, fueron investigados para determinar los parámetros serológicos siguientes:

(1) El título de anticuerpos hacia la proteína p24 y los péptidos gag del VIH-1, hacia la proteína tat y péptidos tat, hacia la proteína nef, hacia la proteína gp160 y hacia péptidos de gp120 y hacia el toxoide tetánico (TT) fue determinado mediante un ELISA estándar, y los resultados fueron expresados como la DO del suero de ensayo restando la DO media de los sueros control. Las proteínas gag, env, tat y nef fueron preparadas mediante ingeniería recombinante. Los péptidos analizados fueron sintetizados químicamente (Neosystem, Strasbourg, Francia).

(2) La carga vírica en el suero fue determinada utilizando el Kit Virionquant (Paris, Francia) que proporciona los resultados como el número de copias eq/mm^{3}. Brevemente, el ARN vírico es extraído del suero y utilizado para RT-PCR con múltiples pares de cebadores del VIH-1. El producto ADN amplificado es detectado posteriormente y cuantificado utilizando un sistema de ELISA. Las DOs son comparadas con las obtenidas para un estándar, VirionStandard™, cubriendo 4 logs de copias eq/ml (de 10^{2} a 10^{5}) y tratadas en paralelo. El análisis estadístico fue realizado sobre los valores log.

(3) La antigenemia p24 fue medida mediante el kit "HIV-1 p24 Core Profile ELISA Kit" (NEN-Dupont, # de Catálogo NEK060B) con los resultados expresados en pg/ml.

(4) Niveles de IFN\alpha: se utilizó el ensayo biológico que emplea VSV y células MDBK para determinar los niveles de IFN\alpha en suero, y los títulos comparados con el estándar NIH (2,5 x 10^{6} UI/mg de proteína) fueron expresados en U.I.

Análisis Estadístico

Los análisis estadísticos fueron realizados utilizando SPSS para Windows, versión 7.5. Las distribuciones de frecuencias acumulativas en cada parámetro biológico permitía para todos los casos la dicotomización de todas las variables continuas, en la preparación para los análisis de Chi-cuadrado. Se llevaron a cabo análisis de la T de Student en cada parámetro biológico con el fin de comparar las medias y las desviaciones estándar de los valores para los grupos NP-NP y NP-P. Se calcularon los coeficientes de las Correlaciones de Pearson para examinar las relaciones lineales, uno a uno, para cada par de parámetros biológicos. Se llevaron a cabo análisis de regresión lineal univariados para examinar la contribución independiente de cada covariado al estado de progresión (Tabla 5). Se realizaron análisis de regresión multivariados con el fin de examinar el comportamiento relativo de cada covariado en presencia de todos los covariados para predecir la progresión.

Resultados

Las Tablas 1 y 6 presentan datos que comparan los grupos NP y FP. Las Tablas 2 a 5 presentan comparaciones estadísticas de sujetos NP de los que había datos de seguimiento disponibles (104 individuos): 78 de estos casos de NP fueron considerados clínicamente estables (subgrupo NP-NP); y 26 presentaron signos de progresión hacia SIDA durante el seguimiento (subgrupo NP-P). Criterios tales como sexo, edad, además de otras especificidades de anticuerpos hacia VIH-1, incluyendo los péptidos gp160 y gp120 (bucle V3 y región de unión a CD4), no están informados en la presente porque no presentan ninguna información significativa.

Características biológicas correlacionadas en los grupos NP y FP

Además de los diferentes rasgos genéticos de predisposición (Li y col., 1995; Westendorp, y col., 1995), las poblaciones NP y FP de la cohorte de GRIV presentaban diferencias cuantitativas en parámetros serológicos (Tabla 1). En particular, el nivel medio de anticuerpos anti-p24 era significativamente mayor en el suero de los individuos NP (p<0,0001) con relación a los niveles en el suero de los pacientes FP. Los títulos medios de IFN\alpha eran significativamente más elevados (p<0,0001) en el suero de los paciente FP que en el de NP. La Figura 1 muestra los individuos con niveles anormales de IFN\alpha sérico. Además, los niveles de antígeno p24 en suero eran significativamente mayores (p=0,004) y los de anticuerpos hacia tat menores (p=0,03) en el grupo FP que en el grupo NP, pero en menor grado que anti-p24 e IFN\alpha. En contraste, las medias de los demás parámetros analizados, incluyendo los niveles de anticuerpos hacia nef y hacia TT, no eran significativamente diferentes en los dos grupos de pacientes (Tabla 1).

TABLA 1 Comparaciones con el Test T de las Medias de los Parámetros Biológicos en la Cohorte de GRIV

Parámetro	Media en NP	Media en FP	Valor de p
Biológico	(D.S.)	(D.S.)	(generado en el
	N = 182	N = 67	Test t de Student)
Anticuerpos hacia p24 (D.O.)	1,70 (0,72)	0,56 (0,45)	p < 0,0001
Título de IFN\alpha (UI)	6,9 (13,6)	22,6 (22,2)	p < 0,0001
ag p24 (pg/ml)	21,22 (16,4)	29,55 (28,6)	p = 0,0046

TABLA 1 (continuación)

Parámetro	Media en NP	Media en FP	Valor de p
Biológico	(D.S.)	(D.S.)	(generado en el
	N = 182	N = 67	Test t de Student)
Anticuerpos hacia tat (D.O.)	0,39 (0,25)	0,32 (0,17)	p = 0,032
Anticuerpos hacia nef (D.O.)	0,22 (0,25)	0,20 (0,26)	p = NS
Anticuerpos hacia TT (D.O.)	0,71 (0,45)	0,82 (0,46)	p = NS
NS = no significativo

Características Biológicas Asociadas con la Progresión de la Infección por VIH-1 en la Población NP

Entre los 104 pacientes NP para los que había un seguimiento disponible desde su inclusión en el estudio, 26 presentaron posteriormente una disminución del recuento de células CD4^{+} por debajo del nivel inicial de más de un 30% o, alternativamente, presentaron signos de enfermedad clínica correspondiente a la Etapa B o C de CDC según está definido por la clasificación de 1993. Fueron denominados pacientes de No Progresión con Progresión de la enfermedad (NP-P), mientras que los 78 individuos estables restantes fueron denominados pacientes de No Progresión Sin Progresión de la enfermedad (NP-NP).

Se llevaron a cabo análisis de recapitulación de cada parámetro clínico y biológico con el fin de explorar su distribución y dispersión. Una vez que se encontró que los rangos de los valores estaban de algún modo distribuidos normalmente y se determinaron las medias y medianas, cada parámetro fue dividido en "Alto" y "Bajo" (o por encima y debajo de sus medianas respectivas). Se construyeron tablas de dos por dos utilizando el procedimiento de análisis de Chi-cuadrado para analizar las proporciones observadas frente a las proporciones esperadas en los grupos NP y NP-P (Tabla 2).

TABLA 2 Análisis de Chi-cuadrado de los Parámetros Biológicos Frente al Estado de Progresión

Parámetro	División de	N de Casos	X^{2}	valor de p
Biológico	la Mediana
		NP-NP N = 78	NP-P N = 26
Anti-TT	Bajo (0-0,71)	38	13	0	0,545
	Alto (0,72+)	40	13
Anti-tat	Bajo (0-0,30)	33	19	7,38	0,006
	Alto (0,31+)	45	7
Anti-nef	Bajo (0-0,14)	37	15	0,82	0,365
	Alto (0,15+)	41	11
Anti-p24	Bajo (0-2,1)	38	13	1,03	0,590
	Alto (2,2+)	38	13
ag p24	Bajo (0-19)	44	8	5,12	0,20
	Alto (20+)	34	18
Carga Vírica	Bajo (0-3,9)	41	10	2,01	0,141
	Alto (4,0+)	36	16
CD4	Bajo (0-710)	34	17	3,10	0,78
	Alto (711+)	41	9
\begin{minipage}[t]{158mm} NP-NP son pacientes de No Progresión estables mientras que NP-P son pacientes de No Progresión con Progresión de la enfermedad durante el seguimiento. Los grupos "Alto" y "Bajo" fueron determinados mediante dicotomización de todos los casos mediante la división de la mediana para cada parámetro biológico.\end{minipage}

Entre los parámetros biológicos analizados, el más discriminativo de estabilidad frente a progresión era el nivel de anticuerpos anti-tat (p=0,006), seguido por la antigenemia p24 (p=0,020). Los recuentos de células CD4 (p=0,078) y la carga vírica (p=0,141) no fueron tan impresionantes en su capacidad para discriminar entre estas categorías de progresión. Según se muestra en el subgrupo de NP que presenta mayores recuentos de células CD4^{+}, había menos casos con signos de progresión que en los casos con recuentos menores de células CD4 (18% frente al 33%), pero esta relación no fue validada estadísticamente. Aunque la carga vírica era baja en la mayoría de los pacientes NP (< 10^{4} copias/ml), los que progresaron más tarde hacia SIDA tenían niveles relativamente mayores de ARN vírico en suero (31% frente al 19%), pero esta disparidad no alcanzaba significación estadística. No se encontró diferencia entre los dos grupos con otras especificidades de anticuerpos, incluyendo p24, nef y TT.

Según se observa en la Tabla 3, se llevaron a cabo análisis de correlación de Pearson en todos los 104 pacientes NP con el fin de examinar las relaciones uno a uno de cada par de parámetros biológicos continuos, y fueron seguidos por análisis para determinar cada categoría de progresión de la enfermedad. Anti-tat y p24 (medidos ambos en D.O.) estaban altamente e inversamente correlacionados (r=-0,641, p=0,000). Y lo que es más interesante, los niveles de anti-TT estaban correlacionados moderadamente con los niveles de anti-tat (r=0,341, p=0,000). Se realizaron también correlaciones de Pearson dentro de cada categoría de progresión de la enfermedad, teniendo como resultado más o menos las mismas asociaciones; sin embargo, no se encontró correlación significativa entre la carga vírica y anti-p24, ni entre la carga vírica y anti-TT en el grupo NP-P.

TABLA 3 Correlaciones de Pearson de los Parámetros Biológicos para Todos los Casos, y Posteriormente por el Estatus de Progresión de la Enfermedad

Par de Correlación	Todos los Casos	Estatus=NP	Estatus=NP-P
	n=104	n=78	n=26
	r (valor de p)	r (valor de p)	r (valor de p)
Anti-tat	Anti-TT	0,341 (0,000)	0,310 (0,006)	0,443 (0,024)
Anti-tat	p24	-0,641 (0,000)	-0,602 (0,000)	-0,732 (0,000)
p24	Anti-p24	-0,238 (0,016)	-0,226 (0,050)	-0,352 (NS)
p24	Anti-TT	-0,335 (0,001)	-0,253 (0,025)	-0,623 (0,001)
VL	Anti-tat	-0,176 (NS)	-0,202 (NS)	0,291 (NS)
VL	Anti-p24	-0,204 (0,040)	-0,272 (0,018)	0,008 (NS)
VL	Anti-TT	-0,217 (0,028)	-0,229 (0,045)	-0,052 (NS)

En los pacientes NP-P, para los que los niveles de antigenemia p24 eran mayores que en el grupo NP (Tabla 2), los niveles de anticuerpos hacia tat estaban inversamente correlacionados con la antigenemia p24 (r=-0,732, p<0,001) (Tabla 3). Además, la mayoría de los pacientes NP-P que estaban en etapas avanzadas de la infección presentaban manifestaciones clínicas relacionadas con el SIDA, a pesar de la terapia antirretroviral. De los pocos individuos asintomáticos restantes (20%), la mayoría pertenecía al subgrupo NP-P con un título elevado de anticuerpos hacia tat (D.O. >0,31).

Se llevaron a cabo posteriormente análisis univariados y multivariados de los factores biológicos y su valor para predecir el estatus de progresión. Cuando se examinó cada covariado como indicador univariado de la progresión de la enfermedad (Tabla 4), anti-tat, p24 y la carga vírica predecían significativamente el estatus de progresión. Sin embargo, ninguna de estas relaciones independientes refleja la multiplicidad de factores que actúan en consonancia para producir la progresión de la enfermedad.

TABLA 4 Análisis Univariado de Covariados como Indicadores de la Progresión de la Enfermedad

Covariado Independiente	\beta	Valor de p
Anti-nef	-0,101	0,309
Anti-p24	0,049	0,625
Anti-tat	-0,208	0,035
Anti-TT	-0,092	0,351
p24	0,225	0,022
VL	0,216	0,028

Un abordaje quizá más práctico de esta exploración de interacciones entre los parámetros biológicos es el abordaje multivariado. Se llevaron a cabo cuatro métodos de regresión múltiple gradual con el fin de examinar la influencia de cada covariado sobre la progresión de la enfermedad en presencia de todos los demás (Tabla 5).

TABLA 5 Eliminación Retrógrada de Covariados de un Modelo de Regresión Múltiple para Predecir la Progresión de la Enfermedad

Modelo	Coeficientes	Coeficientes	T	Sig.
	No Estandarizados	de \beta
		Estandarizados
	\beta	Error Estándar
1	(Constante)	0,495	0,590		0,840	0,403
	Anti-nef	-0,187	0,309	-0,061	-0,607	0,545
	Anti-p24	0,186	0,116	0,155	1,605	0,112
	Anti-tat	-0,212	0,707	-0,039	-0,300	0,765
	Anti-TT	7,305E-02	0,205	0,038	0,357	0,722
	p24	1,320E-02	0,008	0,229	1,711	0,090
	VL	0,149	0,073	0,211	2,042	0,044
2	(Constante)	0,387	0,463		0,835	0,406
	Anti-nef	-0,200	0,304	-0,065	-0,659	0,512
	Anti-p24	0,190	0,115	0,169	1,652	0,102
	Anti-TT	6,738E-02	0,203	0,035	0,332	0,740
	p24	1,461E-02	0,006	0,253	2,399	0,018
	VL	0,151	0,072	0,214	2,093	0,039
3	(Constante)	0,474	0,381		1,243	0,217
	Anti-nef	-0,205	0,303	-0,067	-0,678	0,499
	Anti-p24	0,186	0,114	0,166	1,637	0,105
	p24	1,395E-02	0,006	0,242	2,432	0,017
	VL	0,145	0,070	0,207	2,077	0,040
4	(Constante)	0,406	0,367		1,106	0,272
	Anti-p24	0,179	0,113	0,159	1,582	0,117
	p24	1,416E-02	0,006	0,246	2,483	0,015
	VL	0,154	0,069	0,218	2,228	0,028
5	(Constante)	0,804	0,268		2,996	0,003
	p24	1,203E-02	0,006	0,209	2,153	0,034
	VL	0,133	0,069	0,189	1,948	0,054
a. Variable Dependiente: ESTATUS

El método de introducción de covariados más informativo es el modelo de eliminación retrógrada que elimina covariados con el fin de incrementar el valor predictivo sobre el estatus de la progresión. Todos los covariados continuos fueron introducidos en la ecuación para predecir el estatus de la progresión (1 = NP Estables, 2= NP con Progresión de la enfermedad). Curiosamente, el primer covariado a eliminar del modelo fue anti-tat, seguido por anti-TT, anti-nef, posteriormente anti-p24, dejando la carga vírica (\beta=0,133, p=0,054) y p24 (\beta=0,012, p=0,034) como los indicadores más importantes del estatus de la progresión de la enfermedad.

Cada covariado fue dividido en dos grupos (alto o bajo) por la mediana respectiva de la distribución. Estos covariados dicotomizados fueron introducidos posteriormente en una regresión multivariada para medir sus contribuciones independientes a la predicción del estatus de la enfermedad; se observó una inversión sorprendente de eliminaciones de covariados, lo cual indica que p24 (que se esperaría que fuera el indicador más importante del estatus de la enfermedad) fue eliminado primero, indicando que tenía el menor efecto predictivo sobre la progresión de la enfermedad, seguido por anti-nef, anti-TT, anti-p24, carga vírica, dejando al anti-tat como el indicador más destacado de la progresión de la enfermedad (\beta=-0,465, p=0,007). La discordancia de resultados de un método a otro lleva a considerar seriamente las implicaciones de tomar decisiones analíticas acerca de la toma de decisiones de agrupamiento importantes para parámetros biológicos continuos (esto es, la dicotomización de los covariados antes de introducirlos en un sistema complejo).

Las Figuras 2A-2B y las Figuras 3A-3B ilustran las medias y la dispersión globales de los valores de p24 y de anti-tat medidos por la densidad óptica para los grupos NP-NP y NP-P.

Relaciones Entre los Niveles de Anticuerpos hacia tat y Otros Parámetros

En los 182 NP inscritos en la cohorte, los niveles de anticuerpos hacia tat fueron comparados con los demás parámetros biológicos para investigar los mecanismos que dan lugar a la potente correlación entre los niveles elevados de anticuerpos hacia tat y la estabilidad clínica. Las Figuras 4A-4F muestran que en el subgrupo de NP con niveles elevados de anticuerpos hacia tat (D.O. >0,31; esto es, por encima de la mediana), presentaban signos de progresión menos sujetos que en el subgrupo con niveles bajos de anticuerpos hacia tat (D.O. <0,31; esto es, por debajo de la mediana). Estas diferencias son altamente significativas (Tabla 6).

TABLA 6 Comparación Mediante el Test T entre Respondedores con Niveles de Anti-tat Altos y Bajos para los Parámetros Biológicos en Sujetos NP y FP

Media (DS)
	NP	FP
	tat	tat	P	tat	tat	P
	alto^{*}	bajo		alto^{*}	bajo
ag p24 (pg/ml)	8,03 (7,4)	35 (10,9)	<0,001	7,03 (29,2)	9,97 (23,8)	<0,001
Anticuerpos hacia	1,77 (0,7)	1,64 (0,73)	NS	0,43 (0,38)	0,66 (0,64)	NS
p24 (D.O.)
Células CD4/ml	793 (295)	819 (333)	NS	365 (276)	326 (223)	NS
Log_{10} Carga Vírica	3,36 (1,19)	3,52 (1,18)	NS	ND	ND	--
(copias de ARN eq./ml)
ND = No Determinado
NS = No Significativo
\begin{minipage}[t]{155mm} Para cada parámetro, los pacientes fueron distribuidos en dos grupos basados en los niveles de anticuerpos hacia tat que eran altos (por encima de la mediana) y bajos (por debajo de la mediana).\end{minipage}

En la Tabla 6, los subgrupos de NP con niveles altos y bajos de anticuerpos hacia tat fueron comparados con el test T para los parámetros clínicos y de laboratorio (recuentos de células CD4^{+}, antígeno p24, anticuerpos hacia p24 y carga vírica). Los anticuerpos hacia p24, la carga vírica y CD4 no discriminaban significativamente entre NPs con niveles bajos y altos de anticuerpos hacia tat, mientras que la antigenemia p24 sí lo hacía. Se encontró el mismo resultando comparando FPs con niveles bajos y altos de anticuerpos hacia tat.

\newpage

Discusión

El proyecto GRIV fue iniciado para investigar parámetros genéticos e inmunológicos que determinan los dispares cursos de la progresión de la enfermedad en varios individuos infectados con VIH-1, variando desde 2 hasta más de 17 años. Para llevar a cabo el estudio, se seleccionaron dos grupos de sujetos seropositivos genéticamente bien definidos, un grupo estaba compuesto por sujetos asintomáticos sanos infectados durante 8 años (NP), y el otro grupo estaba compuesto por pacientes en etapas avanzadas aunque infectados más recientemente (<3 años) (FP) reclutados en diferentes centros hospitalarios de Francia. Los criterios de selección utilizados para incluir sujetos en cada uno de estos dos grupos extremos de pacientes, fueron de tal manera que los NP representaban alrededor de un 1% y los FP un 3% aproximadamente de los pacientes seropositivos totales que estaban siendo seguidos en los centros.

En el presente estudio, se evaluaron parámetros séricos inmunológicos y virológicos para determinar aquellos parámetros que contribuían a establecer el curso de la progresión de la enfermedad por VIH-1, progresión rápida frente a no progresión/progresión lenta. Además, entre el grupo de NP, se investigaron los factores celulares y séricos sanguíneos asociados con la progresión de la enfermedad por VIH-1 en aquellos individuos que eran inicialmente asintomáticos en el momento de su inclusión en el estudio.

El estatus NP, en oposición al FP, estaba correlacionado principalmente con los anticuerpos hacia p24 e inversamente correlacionado con los títulos de IFN\alpha circulante. Entre los pacientes de No Progresión/Progresión Lenta (NP), la progresión posterior hacia SIDA, determinada por síntomas clínicos y/o biológicos, estaba asociada principalmente con niveles bajos de anticuerpos hacia tat y niveles elevados de antígeno p24. Y lo que es más interesante, niveles elevados de anticuerpos hacia un péptido de tat (AA1-15), pero no hacia otras regiones de la proteína, estaban también correlacionados con la estabilidad (no mostrado).

La elevada correlación inversa encontrada entre los anticuerpos anti-tat y la antigenemia p24 en todos los sujetos, proporciona un estatus único a la proteína tat en comparación con las demás proteínas del VIH-1 investigadas en este estudio, a saber gp120, nef y p24. Como la progresión de la enfermedad en individuos asintomáticos infectados con VIH-1 (sujetos NP en el momento del reclutamiento) parece estar altamente asociada (p=0,006) con un título bajo de anticuerpos anti-tat (D.O. <0,31), los anticuerpos anti-tat son un marcador crítico del inicio de la disfunción inmune (progresión de la enfermedad) antes que la antigenemia p24, que refleja la actividad de replicación vírica.

Los anticuerpos hacia tat reconocen la proteína tat en el medio extracelular pero no dentro de las células infectadas por VIH-1. Por tanto, el efecto anti-tat de estos anticuerpos específicos impide que esta proteína vírica se dirija a células no infectadas, incluyendo células inmunes (Viscidi y col., 1989; Chirmule y col., 1995). En este contexto, los anticuerpos hacia tat podrían contribuir a impedir localmente la inmunosupresión celular inducida por tat en aquellos focos linfoides con infección aguda y tat extracelular, como hacen in vitro en PBMC activadas infectadas con VIH-1 (Zagury y col., 1998a). Los anticuerpos anti-tat pueden neutralizar la capacidad de tat para inhibir la respuesta inmune a antígenos de memoria, para preparar a las células T no infectadas para la apoptosis inducida por activación y, además, para preparar a células no infectadas para la infección por VIH-1 (Li y col., 1995). De este modo, los anticuerpos anti-tat pueden controlar la replicación del VIH-1 in vivo indirectamente mediante la prevención de la inmunosupresión y la muerte programada de células inmunes activadas mediadas por tat.

Se ha demostrado previamente que la respuesta de CTL es inicialmente eficaz para controlar la infección por VIH-1 y que la pérdida de esta respuesta está asociada con la progresión de la infección por VIH-1 hacia SIDA (Borrow y col., 1997; Goulder y col., 1997). La función de las células CD8 en la mediación del control de la infección por VIH-1 puede ser a través de citolisis directa de las células infectadas por VIH-1 y/o por la liberación de factores solubles (esto es, quimioquinas C-C) dentro del contexto de la respuesta inmune celular. Se ha demostrado que células CD8^{+} procedentes de individuos multiexpuestos, pero no infectados, confieren una inmunidad protectora a ratones hu-PBL-SCID desafiados con una infección por VIH-1 (Zhang y col., 1996).

La pérdida de reacción inmune celular inducida por tat, particularmente la ausencia de CTLs efectores, parece estar acompañada por una disminución de quimioquinas C-C anti-VIH-1 (Zagury y col., 1998a). Como consecuencia, sigue a continuación la pérdida del control de la replicación del virus en los pacientes infectados (Borrow y col., 1997; Goulder y col., 1997; Zagury, 1997). Los anticuerpos hacia tat circulantes pueden ejercer una función protectora mediante el bloqueo del efecto supresor inducido por tat sobre la respuesta inmune celular a las células infectadas, así como a otros patógenos oportunistas, teniendo como resultado el control de la replicación vírica y el mantenimiento de las funciones inmunes. El control de la replicación vírica por anticuerpos hacia tat es altamente sugerente por la correlación inversa (p<0,001) encontrada en la cohorte de GRIV entre los anticuerpos hacia tat y la antigenemia p24 (Tabla 3 y Fig. 4A).

Estos estudios que muestran que los anticuerpos hacia tat se correlacionan con la no progresión y resultados in vitro previos que demuestran la función de la tat extracelular en la supresión de la respuesta de células T hacia el antígeno, incluyendo la producción de quimioquinas C-C (Zagury y col., 1998a) y la activación de CTL (Zagury y col., 1997), en la estimulación de la apoptosis de células T inducida por la activación y en la preparación de células no infectadas para la replicación del virus (Li y col., 1997), llevaron a los presentes inventores a establecer una nueva estrategia basada en la inmunización activa con anti-tat (Gringeri y col., presentado). El presente estudio proporciona un fundamento potente para incluir el inmunógeno tat como un componente de una vacuna integral contra el SIDA con el fin de permitir respuestas inmunes celulares mantenidas ante los efectos inmunopatológicos de la infección por VIH-1. Para este fin, se desarrolló una estrategia para la preparación de tat, concretamente el Toxoide tat (Gringeri y col., presentado). Esta estrategia permitirá la aplicación con éxito de estrategias de vacunas convencionales utilizando antígenos inductores de CTL anti-VIH-1 (Picard y col., 1992; Achow y col., 1990; Nixon y col., 1991). La inmunización con tat puede ser una estrategia eficaz para solventar la inmunosupresión inducida por tat y la diseminación del virus. En ausencia de estos efectos, el sistema inmune puede ser capaz de responder con éxito en respuesta a la infección por VIH-1. Por tanto, el procedimiento del Toxoide tat puede ser un componente esencial de estrategias de vacunas terapéuticas así como preventivas contra el SIDA.

Ejemplo 2 Materiales y métodos Sujetos

Catorce pacientes infectados con VIH-1 pero asintomáticos fueron voluntarios para participar en este estudio piloto abierto de fase I y firmaron el consentimiento informado aprobado por el Comité Ético Local.

De los 14 pacientes asintomáticos anti-VIH positivos enrolados en el estudio, 11 eran hombres con hemofilia de 19 a 39 años de edad (mediana, 31 años). Los 3 pacientes restantes eran mujeres de 20 a 36 años de edad (mediana, 33 años) que habían sido infectadas por contactos heterosexuales. La duración de la infección por VIH-1 variaba de 4 a 15 años (mediana, 12 años). Ocho de los 14 pacientes no habían recibido nunca tratamiento antirretroviral, mientras que los 6 restantes habían estado bajo tratamiento antirretroviral durante al menos 1 año. Entre estos 6 pacientes, 4 habían sido tratados con tres fármacos, incluyendo inhibidores de proteinasas, durante al menos 6 meses. Además, 6 de los 14 pacientes reclutados habían sido inmunizados previamente con anti-IFN\alpha, de los cuales 3 estaban recibiendo tratamiento antirretroviral.

Los recuentos de células CD4^{+} variaban de 219 a 453 células/mm^{3} (media \pm DS, 293 \pm 70 células/mm^{3}) en el momento del reclutamiento. Otros parámetros inmunológicos y virológicos están mostrados en la Tabla 8. Los 11 hemofílicos estaban todos también infectados con el virus de la hepatitis C (VHC).

Inmunización Inmunógeno

El toxoide TAT fue preparado mediante inactivación química de la proteína TAT del VIH-1 recombinante purificada por solubilización en guanidina 6 M y tampón conteniendo HCl, seguido por cromatografía en agarosa níquel (NTA, Quiagen, Hilden, Alemania). La proteína fue expresada en Escherichia coli como una proteína de fusión en pRSETA (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) y contenía seis residuos de histidina (esto es, un sitio de unión de níquel). Los vectores de expresión del ADNc de TAT del VIH-1 derivaban de VIH-1-MB, pCV1. La proteína TAT purificada, pero no el toxoide TAT, presentaba una potente actividad biológica según se midió por el ensayo de CAT en células HeLa. La actividad de la TAT nativa era inhibida por Ab anti-TAT murinos.

El toxoide TAT del VIH-1 fue producido por Bio Sidus (Buenos Aires, Argentina) bajo condiciones de Buenas Prácticas de Laboratorio.

Preparaciones Inmunizantes de Tat del VIH-1

Preparación de estimulación: 100 \mug de toxoide TAT del VIH-1 en una emulsión agua-en-aceite (adyuvante incompleto de Freund HFA con aceite mineral Seppic, ISA051).

Preparación de refuerzo: 50 \mug de toxoide TAT del VIH-1 en una emulsión agua-en-aceite (HFA, Sepicc, ISA051).

Programa de Inmunización

Los sujetos seropositivos para VIH-1 fueron inyectados intramuscularmente con la preparación de estimulación de Tat del VIH-1 y reforzados cada 1 a 2 semanas (inmunización A) o cada 4 semanas (inmunización B), hasta que se detectó un aumento de dos veces o mayor del nivel de Abs anti-Tat preinmunización, determinado en densidad óptica (D.O.), mediante el ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA) en los sueros recogidos de 7 a 14 días después de cada inyección. Posteriormente, la inmunización anti-Tat fue mantenida mediante refuerzo con Tat cada 3 a 4 meses según los niveles de Ab anti-TAT. El Programa A incluía 8 pacientes y el Programa B incluía 6 pacientes.

Evaluación de la Tolerancia

La seguridad y la tolerancia fueron determinadas mediante examen clínico, los síntomas de los pacientes y evaluación en el laboratorio (bioquímica y recuento completo de células sanguíneas). Los efectos colaterales locales y sistémicos fueron registrados 7 días después de cada inyección.

Evaluación de la Seguridad

Se buscaron cuidadosamente signos y síntomas relacionados con la progresión del SIDA durante el periodo de seguimiento mediante examen clínico. Se observó cualquier cambio del tratamiento antirretroviral.

Los recuentos de células CD4^{+} (PACS con anticuerpos monoclonales de Ortho Diagnostics, Raritan, NJ, EE.UU.), la viremia VIH-1 plasmática (PCR de ARN, kit de ELISA de Viroquant, Paris, Francia) y la antigenemia p24 del VIH-1 (ELISA, NEN-Du Pont, Nemours, Francia) fueron los principales parámetros seguidos para la evaluación de la seguridad. El kit de ELISA de Viroquant para determinar ARN del VIH-1 tiene un umbral de sensibilidad de 10 copias eq/ml. El kit de ELISA para determinar la antigenemia p24 tiene un umbral de sensibilidad de 4,4 pg/ml. Además, se monitorizaron con precisión análisis de la función hepática en los pacientes positivos para VHC.

Evaluación de la Inmunogenicidad

La inmunogenicidad del toxoide TAT fue evaluada analizando Abs anti-TAT del VIH-1 mediante ELISA de 7 a 14 días después de cada inyección. Los Abs séricos anti-Tat fueron detectados mediante un ensayo ELISA estándar utilizando placas Costar de 96 pocillos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). La proteína Tat recombinante fue fijada sobre la placa a 50 ng/pocillo. Los sueros a una dilución 1:500 fueron analizados según el procedimiento estándar de ELISA, y los resultados fueron expresados como valores de la DO. Los niveles de Ab hacia Tat circulantes variaban entre los pacientes infectados. En contraste, en todos los pacientes infectados pero no inmunizados (>100 sujetos analizados), muestras de suero consecutivas recogidas en un periodo de 1 año y analizadas en el mismo experimento bajo la misma condición de ELISA no presentaban variabilidad en sus niveles de Ab hacia Tat menor de \pm 1,5 veces. Ésta es la razón por la cual los respondedores fueron definidos como aquellos pacientes que mostraban un incremento de los niveles de Ab anti-TAT del VIH-1 de dos veces o más con respecto a los valores preinmunización. La inmunidad mediada por células (CMI) y la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) hacia la proteína TAT del VIH-1 fueron evaluadas aleatoriamente por la respuesta linfoproliferativa y ensayos cutáneos, respectivamente. La CMI fue analizada por la proliferación de células T medida por incorporación de ^{3}H-timidina; células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) frescas de los pacientes fueron cultivadas durante 6 días en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo redondeado en presencia (muestras de ensayo) o ausencia (muestras control) de 10 \mug/ml de toxoide Tat. Dieciocho horas antes de la finalización del cultivo, se añadieron a cada pocillo 0,5 \muCi de timidina. Las células fueron recogidas posteriormente y se midió la incorporación de timidina en el ADN celular en un contador \beta, y se expresó como cuentas por minuto (cpm) por mililitro. Los resultados están expresados como la proporción de las cpm de las muestras de ensayo respecto a las cpm de las muestras control, y una proporción de >2 fue considerada como positiva (Picard y col., 1992). Se llevó a cabo la administración de una inyección intradérmica del toxoide Tat (10 mg) en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para el ensayo cutáneo de la DTH. Los ensayos cutáneos positivos correspondían a una pápula de >1 cm de diámetro medida a las 48 horas.

Seis sujetos seropositivos para VIH-1 no inmunizados y seis sujetos seronegativos de la misma edad, género y con los mismos recuentos de células CD^{+} (esto último solamente en los pacientes seropositivos para VIH) fueron utilizados como controles para estos ensayos.

Resultados Seguridad y Tolerancia

Siete de los 14 pacientes que participaron en el estudio informaron de fiebre leve (hasta 38ºC) que duró de 12 a 48 horas después de la primera inyección (preparación de estimulación). Nueve de los 14 pacientes se quejaron de dolor e inflamación en el lugar de la primera inyección (preparación de estimulación) que requirieron fármacos antiinflamatorios. El dolor y la inflamación se resolvieron de 2 a 7 días después de la inyección en todos los casos. No se informó de efectos colaterales en las inyecciones sucesivas.

La evaluación clínica no mostró signos de progresión de la enfermedad por VIH-1 ni de enfermedades concomitantes relacionadas o no relacionadas con la infección por VIH-1. El tratamiento antirretroviral no tuvo que ser cambiado durante la inmunización y el seguimiento en ninguno de los pacientes.

Los recuentos absolutos de células CD4^{+} incrementaron significativamente después de la inmunización, con una diferencia de medias con respecto a los valores preinmunización de 60 células/mm^{3} (intervalo de confianza del 95%, 34-85 células/mm^{3}; Test t de Student para muestras pareadas, t=4,99; P=0,0002), mientras que el porcentaje de células CD4^{+} no cambió significativamente (Tabla 7).

Hasta la última visita de seguimiento, la viremia VIH-1 plasmática no cambió significativamente después de la inmunización con respecto a los niveles preinmunización, aunque se observó una tendencia a disminuir (diferencia de medias respecto a los valores preinmunización, -0,63 copias de ARN eq x 10 ml; intervalo de confianza del 95%, -1,341 a +0,067 copias de ARN eq x 10^{4} ml; Test t de Student para muestras pareadas, t=1,95; P=0,0725); los niveles basales y de seguimiento están mostrados en la Tabla 7.

La antigenemia p24 del VIH-1 no cambió significativamente después de la inmunización con respecto a los niveles preinmunización (Test t de Student para muestras pareadas, t=1,76, P=0,10), aunque 4 de 14 pacientes mostraron una disminución (Tabla 7). Los análisis de la función hepática así como otros parámetros bioquímicos o hematológicos no presentaron ninguna diferencia respecto a los valores preinmunización.

TABLA 7 Recuentos Absolutos de Células CD4^{+}, Viremia VIH-1 Plasmática y Antigenemia en 14 Pacientes Seropositivos para VIH-1 Inmunizados con la Preparación de TAT del VIH-1 Recombinante Inactivada

	Recuento de Células	Viremia VIH-1	Ag del VIH (pg/ml)
	CD4^{+}/mm^{3} (%)	Plasmática^{\alpha}
Código	Seguimiento	Pre-	Al final	Pre-	Al final	Pre-	Al final
	(meses)	inmunización	del	inmunización	del	inmunización	del
			seguimiento		seguimiento		seguimiento
1	8	284 (28,4%)	345 (34,5%)	5,75	5,71	11	4
2	8	453 (16,8%)	534 (18,4%)	2,06	2,15	32	3
3	12	227 (28,4%)	345 (34,5%)	0,35	<0,001	17	4
4	3	287 (22,1%)	252 (21,0%)	0,49	0,70	3	3
5	5	282 (28,2%)	319 (22,8%)	3,34	0,91	4	4
6	9	224 (11,8%)	294 (12,8%)	5,23	3,90	3	3
7	3	313 (24,1%)	443 (23,3%)	5,39	5,55	4	4
8	4	275 (30,6%)	314 (31,4%)	4,12	3,18	5	4
9	6	274 (8,3%)	386 (9,9%)	5,08	5,74	4	5
10	8	295 (22,7%)	372 (26,6%)	4,02	3,9	5	4
11	4	219 (16,9%)	235 (23,5%)	4,01	<1	8	3
12	12	272 (20,9%)	340 (30,9%)	4,74	2,30	ND	4
13	9	435 (33,5%)	478 (28,1%)	4,30	4,07	3	4
14	3	257 (13,5%)	274 (13,7%)	2,05	2,90	3	3
\alpha: la viremia VIH plasmática es medida en 10.000 copias
equivalentes/ml (ver métodos)
ND - no disponible

Inmunogenicidad

Ocho pacientes fueron asignados a un programa de inducción de tipo A de forma voluntaria, y los 6 pacientes restantes siguieron el esquema de inmunización B. Todos los pacientes respondieron a la inmunización con TAT con un incremento de Abs hacia TAT que variaba de dos veces a ocho veces (Tabla 8), incluyendo los pacientes que fueron tratados con fármacos antirretrovirales, inmunizados contra IFN\alpha o ambos. Los pacientes recibieron de 1 a 8 inyecciones para inducir y mantener una respuesta de Ab durante un periodo de seguimiento de 3 a 12 meses (mediana, 8,5 meses). Se consiguió una respuesta de Ab, definida como un aumento de dos veces o más del nivel de Ab anti-TAT del VIH-1 con respecto a los niveles preinmunización, con 1 a 5 inyecciones (mediana, 3 inyecciones) ambas en pacientes con inducción de tipo A (inyección cada 1-2 semanas) o de tipo B (inyecciones cada 4 semanas).

Cuatro de 8 pacientes analizados mostraron una respuesta de DTH positiva a la inyección intradérmica de proteína TAT recombinante inactivada con persistencia de la induración cutánea (pápula) de hasta 72 horas (Tabla 8).

TABLA 8

Inmunogenicidad del Toxoide TAT Anti-VIH-1 en Pacientes Seropositivos para VIH-1
Nivel de Anticuerpos anti-TAT (DO)

Código	Tipo de	Preinmunización	Pico	Respuesta	Respuesta
	Inmunización (A/B)			de DTH	de CMI
1	B	0,240	1,230	NA	NA
2	A	0,104	1,526	NA	Positiva
3	B	0,217	0,537	Negativa	Negativa
4	B	0,214	1,063	Positiva	NA
5	A	0,446	1,612	NA	NA
6	A	0,213	0,664	Negativa	Negativa
7	A	0,204	1,139	NA	NA

TABLA 8 (continuación)

Código	Tipo de	Preinmunización	Pico	Respuesta	Respuesta
	Inmunización (A/B)			de DTH	de CMI
8	B	0,104	1,045	Positiva	Positiva
9	A	0,422	0,812	Negativa	NA
10	B	0,125	1,492	NA	NA
11	A	0,252	0,682	Negativa	NA
12	A	0,410	2,219	Positiva	Positiva
13	A	0,162	0,508	Positiva	Positiva
14	B	0,120	2,012	NA	NA
\begin{minipage}[t]{150mm} DTH: hipersensibilidad de tipo retardado; CMI: inmunidad mediada por células; NA: no analizado; DO: densidad óptica.\end{minipage}

Cuatro de 6 pacientes mostraron un consistente incremento de la respuesta proliferativa al antígeno Tat en ensayos de CMI (Tabla 8) que era de dos veces a 10 veces en comparación con las células cultivadas sin antígenos. De 3 pacientes positivos (P3, P8 y P12), estaban disponibles PBMCs congeladas recogidas antes de la inmunización con Tat. La proliferación de células T de estas células después de la estimulación con el toxoide Tat, no produjo ninguna respuesta proliferativa positiva (datos no mostrados). Por tanto, la Tabla 8 muestra la utilización del ELISA anti-Tat para monitorizar a los pacientes y muestra que el título de anticuerpos anti-Tat de los pacientes ha incrementado después de la inmunización. Esto demuestra que la medida de anticuerpos anti-Tat es un buen análisis para el seguimiento de los pacientes y proporciona un pronóstico de la evolución de la enfermedad.

Ninguno de los sujetos control seropositivos para VIH-1 o seronegativos presentaba un incremento de los niveles de Ab anti-TAT ni respuesta de CMI a la proteína Tat. Ninguno de los controles mostró una respuesta positiva a la proteína Tat en el ensayo cutáneo de DTH.

Discusión

Este estudio piloto de fase I fue diseñado para demostrar la seguridad, la tolerancia y la inmunogenicidad de una preparación de toxoide TAT del VIH-1 en pacientes seropositivos para VIH-1 inmunocomprometidos, incluso en aquellos tratados simultáneamente con fármacos antirretrovirales, inmunizados contra IFN\alpha o ambos.

Este estudio mostró que la inmunización con TAT anti-VIH-1 en estos pacientes fue segura y bien tolerada. Los parámetros bioquímicos, hematológicos, inmunológicos y virológicos, así como la evaluación clínica, no sugirieron ningún efecto tóxico de la inmunización. Además, los recuentos absolutos de células CD4^{+} parecían incrementar después de la inmunización en la mayoría de los pacientes, y en algunos pacientes tuvo lugar una disminución de la viremia VIH-1 plasmática y de la antigenemia p24. Adicionalmente, ninguno de los pacientes inmunizados mostró un incremento de los parámetros virológicos durante el periodo de seguimiento, aunque muchos no recibieron fármacos antirretrovirales. Estos resultados son consistentes con la función protectora de los Abs anti-TAT (Lolli y col., 1995; Krone y col., 1988; y Reiss y col., 1991), los cuales que se correlacionan inversamente con la antigenemia p24 y está ilustrado en los pacientes de no progresión (Zagury y col., 1998).

Este estudio mostró que la preparación inmunizante de toxoide TAT del VIH-1 era altamente inmunogénica; todos los pacientes que estaban en grados diferentes de inmunodeficiencia relacionada con el VIH-1 respondieron y algunos lo hicieron después de solamente una inyección. La inmunización indujo CMI, una inmunidad positiva mediada por células, e incluso una respuesta de DTH en al menos algunos de los pacientes evaluados.

Debe hacerse hincapié en que esta inmunización activa dirigida a reducir los efectos patógenos de la toxina TAT (Viscidi y col., 1989; Chirmule y col., 1995 y Zagury y col., 1996), puede ser utilizada en combinación con tratamientos antirretrovirales, con inmunización anti-IFN\alpha, o con ambos. Será importante ampliar las observaciones derivadas de este estudio piloto de fase I en un grupo más grande de pacientes.

Como la TAT extracelular puede ser considerada una estrategia del VIH-1 para inducir inmunosupresión y apoptosis en células inmunes no infectadas (Viscidi y col., 1989; Chirmule y col., 1995 y Zagury y col., 1996), nosotros proponemos contrarrestar estos efectos nocivos mediante una inmunización anti-Tat. El toxoide Tat podría ser un componente de una vacuna integral para personas seronegativas (preventiva) o seropositivas (terapéutica). Tal preparación de vacuna conteniendo epítopos inductores de CTL del VIH-1 debería combatir la inmunosupresión celular (Zagury y col., 1998), la replicación vírica (Zagury y col., 1998) y la progresión natural hacia SIDA (Goulder y col., 1996; Borrow y col., 1997 y Zagury, 1997) si no la entrada del virus.

Ejemplo 3 Métodos y materiales

Se diseñó un ensayo con la vacuna de fase I abierto, controlado, para evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de una preparación de toxoide Tat (Gringeri y col., 1998) en 5 sujetos de estudio seronegativos, durante un periodo de seguimiento de 6 meses.

Reactivos Inmunizantes

El inmunógeno referido como toxoide Tat era una proteína Tat del VIH-1 recombinante inactivada químicamente (Le Buanee y col., 1998; Gringeri y col., 1998) que tenía como adyuvante Adyuvante Incompleto de Freund (IFA), que constaba del mineral de ISA 051 de Seppic (Paris, Francia). El toxoide TAT fue preparado mediante inactivación química de la proteína TAT del VIH-1 recombinante purificada mediante solubilización en guanidina 6 M y tampón conteniendo HCl, seguido por cromatografía en agarosa níquel (NTA, Qiagen, Hilden, Alemania). La proteína fue expresada en Escherichia coli como una proteína de fusión en pRSETA (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) que contenía seis residuos histidina (sitio de unión del níquel). Los vectores de expresión de ADNc de TAT del VIH-1 derivaban de pCV-1 de VIH-1. La proteína TAT purificada, pero no el toxoide TAT, presentaba una potente actividad biológica según se midió mediante el ensayo de CAT en células HeLa. La actividad de la TAT nativa era inhibida por anticuerpos anti-TAT murinos. La inactivación del toxoide Tat fue evaluada por la ausencia de reactividad analizada mediante un ensayo de CAT (Le Buanee y col.; Gringeri y col., 1998).

Protocolo de Inmunización

Se inyectó intramuscularmente el toxoide Tat (70 \mug) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,4 ml) emulsionado con IFA (0,4 ml), de 1 a 3 veces a intervalos de 1 mes, con el fin de determinar la inmunogenidad con diferentes esquemas de vacuna y la seguridad después de inyecciones múltiples.

Se separaron el suero y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de sangre recogida antes de la primera inyección (control) y 8 días después de cada inyección.

Sujetos de Estudio

Se reclutaron cinco voluntarios sanos (3 hombres, 2 mujeres) de entre 25 y 46 años de edad (A-B, Tabla 9). La negatividad de anticuerpos hacia VIH-1 fue analizada mediante ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), con un ensayo de Transferencia Western de confirmación. Los criterios de inclusión fueron ausencia de enfermedades activas o crónicas, edad entre 18 y 65 años, formalidad para adoptar medidas preventivas con el fin de impedir la infección por VIH-1, no exposición a riesgo de infección por VIH-1, en los 3 meses previos, sin signos activos ni síntomas de ninguna enfermedad aguda y firma del consentimiento informado. Dos sujetos de estudio más con las mismas características (1 hombre, 1 mujer) fueron reclutados como controles (F y G, Tabla 9).

Un sujeto recibió una única inyección de vacuna de toxoide TAT intramuscularmente. Estos sujetos de estudio fueron estimulados con dos inyecciones de la misma preparación y el sujeto de estudio restante recibió toxoide TAT tres veces.

Cualquier signo y síntoma fue investigado cuidadosamente mediante examen clínico y entrevistas durante los primeros 7 días después de cada inyección y posteriormente una vez al mes durante el periodo de seguimiento completo de 6 meses. Se llevaron a cabo recuentos de células sanguíneas completas, la determinación del fenotipo de las células T y ensayos de la función renal y hepática antes y después de la inmunización.

Inmunogenicidad

La respuesta humoral al toxoide Tat se basaba en la determinación mediante ELISA de los niveles de anticuerpos anti-Tat circulantes en los sueros recogidos entre 7 y 14 días después de cada inyección y posteriormente una vez al mes, utilizando Tat recombinante biológicamente activa como antígeno de detección.

Los anticuerpos anti-Tat séricos fueron detectados mediante un ensayo ELISA estándar utilizando placas Costar (Cambridge, MA, EE.UU.) (FB, 96 pocillos, 3590). La proteína recombinante Tat fue fijada en la placa a 50 ng/pocillo. Los sueros, a una dilución 1:500, fueron analizados de acuerdo con el procedimiento de ELISA estándar y los resultados fueron expresados como valores de la densidad óptica (DO). El protocolo del estudio definía como respondedores a aquellos sujetos del estudio que mostraban un incremento de los niveles de anticuerpos anti-TAT del VIH-1 de dos veces o más respecto a los valores preinmunización. Este nivel de corte está basado en la observación de pacientes infectados con VIH-1 pero no inmunizados (>100 sujetos de estudio analizados), los cuales no presentaban variabilidad en sus niveles de anticuerpos hacia Tat (menos de \pm 1,5 veces) en muestras de suero consecutivas recogidas durante un periodo de 1 año y analizadas en un mismo experimento (bajo las mismas medidas de ELISA). La titulación de anticuerpos anti-Tat fue realizada de 4 a 6 meses después de la primera inyección y expresada como la mayor dilución que producía una reacción positiva medible mediante ELISA.

La determinación de la respuesta celular se basaba en la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) hacia la proteína TAT del VIH-1 y en la inmunidad mediada por células (CMI) in vitro por la proliferación de células T de PBMCs estimuladas por el toxoide Tat medida mediante el ensayo de incorporación de ^{3}H-timidina. PBMCs frescas procedentes de los sujetos del estudio fueron cultivadas durante 6 días en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos en presencia (muestras de ensayo) o ausencia (muestras control) de 10 \mug/ml de toxoide Tat. A las 18 horas antes de la finalización del cultivo, se añadieron a cada pocillo 0,5 \muCi de timidina. Las células fueron recogidas posteriormente y se midió la timidina incorporada al ADN celular en un contador \beta y se expresó como cuentas por minuto por mililitro (cpm/ml). Los resultados fueron expresados como el índice de proliferación (PI). PI = cpm de las muestras de ensayo: cpm de las muestras control. Un PI >1 era considerado positivo (Picard y col.,
1990).

Se llevó a cabo la administración de una inyección intradérmica de toxoide Tat (10 \mug) en 100 \mul de PBS para el ensayo cutáneo de DTH antes de la vacunación anti-Tat y después de la inmunización. Los resultados positivos del análisis cutáneo correspondían a una pápula de >0,5 cm de diámetro medida después de 48 a 72 horas.

Resultados Seguridad y Tolerancia

La administración de la preparación del toxoide Tat de una a tres veces no tuvo como resultado ninguna reacción local o sistémica adversa y fue bien tolerada por todos los sujetos. Incluso el sujeto del estudio que recibió tres inyecciones intramusculares de la emulsión agua-en-aceite no se quejó de dolor local ni de ninguna otra molestia. No se observó ningún cambio de los recuentos de células sanguíneas totales ni de los fenotipos de las células T, ni tampoco en los análisis de la función renal y hepática en ninguno de los pacientes.

Respuesta Humoral

Los 5 sujetos del estudio inmunizados presentaban niveles elevados de anticuerpos anti-Tat en sus sueros después de la primera, la segunda y/o la tercera inyección (Figs. 5A y 5B), con un incremento de los niveles de anticuerpos que variaba de tres veces a más de diez veces con respecto a los valores preinmunización. No se observaron niveles detectables de anticuerpos anti-Tat en el ELISA de los sujetos de estudio control (DO <0,250). De 4 a 6 meses después de las primeras inyecciones de inmunización, 5 de 5 sujetos del estudio inmunizados presentaban títulos elevados de anticuerpos anti-Tat que variaban de 1:1.000 a 1:64.000 (Fig. 5B, Tabla 9), mientras que no se encontraron títulos detectables en los controles (<1:250). Los sujetos que presentaban el mayor nivel de anticuerpos anti-Tat son los que tendrán mejor protección frente a la infección por VIH-1.

Respuesta Celular

Los 4 sujetos del estudio analizados mostraban una respuesta de DTH positiva hacia Tat, caracterizada por una pápula roja bien formada de 1 a 3 cm que aparecía 48 horas después de la inyección intradérmica del toxoide Tat y que persistía a las 72 horas (Tabla 9), mientras que no se observó reacción cutánea en los sujetos de estudio
control.

La inmunidad mediada por células, medida por la proliferación de células T de PBMCs después de la estimulación con el toxoide Tat, estaba también notablemente incrementada en los 5 individuos inmunizados pero no en los voluntarios no inmunizados (Tabla 9). El índice de proliferación variaba de 6 a 63 en los vacunados, mientras que era <1,5 en los controles.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9 Respuesta Inmune de los Sujetos de Estudio Seronegativos al Toxoide Tat

			Recuento de
			Células CD4 (%)^{a}
Sujetos	Edad	Género	T0	T1	Inyecciones de	DTH^{b}	Título de	CMI^{d}
	(años)				toxoide Tat		Ab anti-Tat^{c}
A	46	F	40,9	44,9	2	+	16.000	63
B	43	M	50,8	52,1	1	+	32.000	11
C	25	F	49,0	44,1	2	ND	1.000	6
D	29	M	37,0	31,9	3	+	8.000	32
E	35	M	ND	ND	2	+	16.000	10
F	30	M	48,5	43,6	0	-	<250	1,2
G	32	F	43,8	42,2	0	-	<250	1,0
^{a} T0, valores preinmunización; T1, valores 4 a 6 meses después de la primera inyección de inmunización.
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} El ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado fue realizado mediante inyección intradérmica del toxoide Tat (0,5 \mu g en 100 \mu l).\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm} Los títulos de Ab anti-Tat fueron analizados en muestras de suero recogidas 4-6 meses después de la primera inyección.\end{minipage}
^{d} \begin{minipage}[t]{155mm} La inmunidad mediada por células fue determinada por la proliferación de células T medida por incorporación de ^{3}H-timidina. Los resultados están expresados como el índice de proliferación (PI). PI = cpm (dxp): cpm (control).\end{minipage}
ND, no disponible; DTH, hipersensibilidad de tipo retardado;
CMI, inmunidad mediada por células; Ab, anticuerpo; cpm, cuentas por minuto.

Discusión

Este estudio abierto, controlado, fue diseñado para evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de una inmunización activa frente a la proteína Tat del VIH-1, utilizando un toxoide Tat recombinante inactivado en sujetos de estudio sanos seronegativos para VIH-1. Se utilizó como inmunógeno una Tat inactivada pero inmunogénica (esto es, el toxoide Tat) para evitar daños inducidos por la Tat nativa en varios tejidos, incluyendo el SNC (Shi y col., 1998) y el sistema inmune (Viscidi y col., 1989), en los cuales la introducción de la toxina Tat podría producir peligros, particularmente en aquellos sujetos del estudio con una predisposición autoinmune o en aquéllos cuyos sistemas inmunes estuvieran comprometidos por infecciones crónicas, infecciones parasitarias crónicas o como resultado de malnutrición. La inmunización con el toxoide Tat, en una emulsión agua-en-aceite, fue segura y bien tolerada por todos los sujetos de estudio seronegativos.

La inmunización anti-Tat indujo niveles elevados de anticuerpos anti-Tat circulantes en todos los sujetos del estudio inmunizados; esta respuesta de anticuerpos se consiguió incluso después de una inyección de inmunización y estaba acompañada por una respuesta celular, según se mostró por la proliferación de células T in vitro y por el ensayo cutáneo in vivo. Además, los individuos A, B y E, que fueron inmunizados por primera vez 1 año antes, continuaban manteniendo un título elevado de anticuerpos circulantes hacia la toxina Tat (16.000^{-1}, 8.000^{-1} y 16.000^{-1}, respectivamente). Es interesante que en el individuo D, que fue inmunizado al mismo tiempo con el toxoide Nef y la proteína p24, los títulos de anticuerpos circulantes y la respuesta celular dirigida contra estos antígenos del VIH-1 se incrementaron enormemente (datos no mostrados), así como los dirigidos contra Tat (Tabla 9).

En conclusión, la presencia de niveles elevados de anticuerpos anti-Tat circulantes antagonizaría a la toxina Tat liberada al compartimento extracelular por las células infectadas y por tanto prevendría la inmunosupresión inducida por Tat de las células T no infectadas. Por tanto, después de la exposición a VIH-1 de los individuos no infectados inmunizados con el toxoide Tat y otros antígenos del VIH-1 inductores de CMI, tales como los péptidos Env, Gag o Nef, la presencia de niveles elevados de anticuerpos circulantes contra Tat debería controlar el efecto inmunosupresor de la toxina Tat liberada durante la infección aguda y permitir el desarrollo de la respuesta celular inducida por antígenos estructurales del VIH-1. La liberación casi inmediata de un nivel elevado de quimioquinas \beta podría contribuir al incremento de la resistencia del huésped a la infección por VIH-1 (Zagury y col., 1998). Un ensayo de fase II/III será llevado a cabo para confirmar estas afirmaciones.

Referencias

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Claims

1. Un método in vitro para determinar la prognosis de un individuo infectado por VIH, que comprende:

-: la medida del nivel de únicamente dos marcadores séricos, concretamente anticuerpos anti-tat y proteína p24, en el suero de un individuo infectado por VIH;

-: la comparación del nivel medido de anticuerpos anti-tat y de proteína p24 con los niveles indicativos de progresión o no progresión de la enfermedad; y

-: la determinación de la prognosis del individuo infectado por VIH, en el que niveles elevados de anticuerpos anti-tat y niveles bajos de proteína p24 son indicativos de no progresión de la enfermedad, y niveles bajos de anticuerpos anti-tat y niveles elevados de proteína p24 son indicativos de progresión de la enfermedad.

2. Un método in vitro para evaluar la condición de un individuo infectado por VIH tratado con la vacuna de tat, que comprende:

-: la medida de los niveles de únicamente dos marcadores séricos, concretamente anticuerpos anti-tat y proteína p24, en un individuo infectado por VIH tratado a lo largo del tiempo; y

-: la determinación de si el nivel de proteína p24 ha aumentado suficientemente mientras que el nivel de anticuerpos anti-tat ha disminuido suficientemente para garantizar la administración posterior de una vacuna de tat al individuo infectado por VIH.