ES2250143T3 - Prolongacion de la duracion de vida de aptameros de oligodesoxinucleotidos anticoagulantes en sangre. - Google Patents
Prolongacion de la duracion de vida de aptameros de oligodesoxinucleotidos anticoagulantes en sangre.Info
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Abstract
Una composición que comprende: (a) Un DNA aptámero que se une a la trombina; y (b) estreptavidina que se compleja con dicho aptámero en el extremo 3¿ o en ambos extremos, 5¿ y 3¿.
Description
Prolongación de la duración de vida de aptámeros
de oligodesoxinucleótidos anticoagulantes en sangre.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden polinucleótidos que se unen específicamente a
trombina y a métodos para prolongar la vida mitad de tales
polinucleótidos in vivo. Las composiciones son complejos,
bien sea covalentes o no covalentes, del polinucleótido y
estreptavidina. Los complejos incluyen el extremo 3' o los dos
extremos del polinucleótido.
Los aptámeros son secuencias de ácidos nucleicos
que se unen específicamente a proteínas diana y otras biomoléculas
(16, 30). Los aptámeros son de interés para aplicaciones en
formación de imágenes, terapia y radioterapia, y son una forma única
para usar ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a complejos de
DNA aptámeros con estreptavidina. La complejación del aptámero con
estreptavidina aumenta considerablemente la vida mitad del aptámero
in vivo. Los complejos pueden ser no covalentes o covalentes.
Los complejos no covalentes pueden formarse por unión covalente de
un ligando al ácido nucleico y después complejando el ligando con su
proteína de unión específica.
El aptámero se une específicamente a la trombina.
Tales aptámeros pueden ser marcados para la detección fuera del
cuerpo y pueden usarse después en métodos para formar imágenes de
coágulos de sangre (trombos) in vivo. Un problema con tales
métodos es que la vida mitad de los aptámeros en el suero es
típicamente muy corta. Complejando el aptámero con estreptavidina la
vida mitad del aptámero en el suero aumenta considerablemente. Así
pues, la presente invención proporciona métodos in vitro para
formar imágenes de trombos.
Figura 1: Representación esquemática de complejos
entre trombina (IIa) y aptámero (1A), aptámero
3'-biotinilado (1B), y aptámero
3'-biotina-estreptavidina (1C). El
diagrama sugiere por qué los nucleótidos de los aptámeros
modificados pueden disminuir la afinidad, mientras que el
3'-bioconjugado es aceptable.
Figura 2: Radiocromatograma de HPLC del producto
[^{123}I]ODN 2c (180 \muCi) después de purificación del
producto radioyodado a través de una columna de Sephadex^{TM} G25
en fosfato sódico (pH 7,0, 0,05 M). La HPLC de fase inversa empleó
CH_{3}CN en TEAB, 1 mL/min.
Figura 3: El % de la dosis de ^{125}I en la
sangre total de ratón se muestra después de la inyección de ODN 1b,
ODN 1c y ODN 1d (1 \muCi de cada uno). La sangre del ratón no fue
corregida para el contenido de DNA.
Figura 4. El % de la dosis de ^{125}I en la
sangre total de ratón se muestra después de la inyección de ODN 2b,
ODN 2c y ODN 2d (1 \muCi de cada uno). La sangre del ratón no fue
corregida para el contenido de DNA.
Figura 5: El % de la dosis de
[^{123}I]DNA en la sangre total de conejo se muestra
después de la inyección de 200 \muCi de ODN 1b, ODN 1c y ODN 1d
(200 \muCi de cada uno).
Figura 6: El % de la dosis de
[^{123}I]DNA en la sangre total de conejo se muestra
después de la inyección de 200 \muCi de ODN 2b, ODN 2c y ODN 2d
(200 \muCi de cada uno).
Figura 7: Radiocromatograma de HPLC de los
metabolitos IVDU, IVU y yoduro recuperados de la sangre de conejo 10
minutos después de la inyección de [^{123}I] ODN 1b (3,5 \muCi).
Se dan los detalles preparativos y de HPLC en la leyenda de la Tabla
5. Se muestra el rastreo del monitor de ^{123}I. IVDU y IVU fueron
identificados mediante co-migración con
patrones.
Figura 8: Unión in situ de aptámero a
coágulos de fibrinógeno. La Figura 8A muestra la unión de ODN 1b; la
Figura 8b muestra la unión de ODN 2b.
Los polinucleótidos aptámeros son típicamente DNA
fosfodiéster estándar de cadena sencilla (ssDNA). También pueden
incorporarse análogos próximos de DNA en el aptámero, como se
describe más adelante.
La invención se refiere a DNA aptámeros que se
unen a trombina.
A continuación se describe un procedimiento de
descubrimiento de aptámero típico.
1) Se sintetiza un polinucleótido que comprende
una secuencia aleatorizada entre "brazos" que tienen secuencia
constante. Los brazos pueden incluir sitios de restricción para la
clonación conveniente y pueden también actuar como sitios de cebado
para cebadores de PCR. La síntesis puede realizarse fácilmente en
instrumentos comerciales.
2) La proteína diana (trombina) se trata con el
polinucleótido aleatorizado. La proteína diana puede estar en
solución y después los complejos pueden ser inmovilizados y
separados de los ácidos nucleicos no unidos mediante el uso de una
columna de afinidad de anticuerpos. Alternativamente, la proteína
diana podría ser inmovilizada antes del tratamiento con el
polinucleótido aleatorizado.
3) Los complejos de proteína diana y
polinucleótido se separan del material no complejado y después los
polinucleótidos unidos se separan de la proteína diana. Entonces
puede caracterizarse el ácido nucleico unido, pero es más normal
amplificarlo, p. ej. mediante PCR, y se repiten las etapas de unión,
separación y amplificación. En muchos casos, el uso de condiciones
que favorecen de forma creciente la separación del ácido nucleico de
la proteína diana, por ejemplo concentración de sal más elevada, en
el tampón de unión usado en la etapa 2) en iteraciones
subsiguientes, tiene por resultado la identificación de
polinucleótidos que tienen una afinidad por la proteína diana cada
vez
más alta.
más alta.
4) Los ácidos nucleicos que muestran elevada
afinidad por las proteínas diana se aíslan y se caracterizan. Esto
se realiza típicamente clonando los ácidos nucleicos usando sitios
de restricción incorporados en los brazos, y después secuenciando el
ácido nucleico clonado.
La afinidad de los aptámeros por sus proteínas
diana está típicamente en el margen nanomolar, pero puede ser tan
pequeña como la zona picomolar. Esto es, K_{d} es típicamente de 1
pM a 500 nM, más típicamente de 1 pM a 100 nM. Los aptámeros que
tienen una afinidad de K_{d} en el intervalo de 1 pM a 10 nM son
también útiles.
Los polinucleótidos aptámeros pueden ser
sintetizados en un sintetizador de ácidos nucleicos disponible
comercialmente, por métodos conocidos en la técnica. El producto
puede ser purificado por métodos de selección de tamaños o por
métodos cromatográficos.
Los polinucleótidos aptámeros tienen típicamente
una longitud de 10 a 200 nucleótidos, más típicamente de 10 a 100
nucleótidos, aún más típicamente de 10 a 50 nucleótidos, y todavía
más típicamente de 10 a 25 nucleótidos. Un margen de longitud
preferido es de 25 a 50 nucleótidos.
Las secuencias del aptámero pueden elegirse como
una secuencia deseada, o pueden hacerse poblaciones de secuencias
aleatorias o parcialmente aleatorias, y después elegirse por la
unión específica a una trombina in vitro. Puede usarse
cualquiera de los ensayos de unión de ácido nucleico - proteína
típicos conocidos en la técnica, p. ej. la transferencia
"Southwestern" usando oligonucleótidos marcados o bien proteína
marcada como sonda. Véase también la patente de EE.UU. nº 5.445.935
para un ensayo de polarización de fluorescencia de interacción de
proteína - ácido nucleico.
Un problema importante es utilizar aptámeros
in vivo. In vivo, los aptámeros comparten con el DNA
natural un tiempo de vida en sangre muy corto, estimado en 1 a 2
minutos. Este corto tiempo de vida se atribuye algunas veces a la
nucleasa del suero (10). La nucleasa del suero tiene por resultado
fragmentos truncados de DNA aptámero, carente de afinidad por la
proteína diana.
Se ha demostrado que hay dos aptámeros que tienen
propiedades de unión de trombina. El aptámero d(GGT
TGGTGTGGTTGG) (ODN 1a) está dirigido contra el exositio 1 de la trombina, el sitio de unión con el fibrinógeno (5). El aptámero d(AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT) (ODN 2a) está dirigido contra el exositio 2, el sitio de unión de la heparina (29). Tanto ODN 1b como ODN 2b se unen realmente a la trombina libre. La radioyodación de estannil oligodesoxirribonucleótios ha proporcionado [^{123}I, ^{125}I] aptámeros de alta actividad específica para esta investigación (14).
TGGTGTGGTTGG) (ODN 1a) está dirigido contra el exositio 1 de la trombina, el sitio de unión con el fibrinógeno (5). El aptámero d(AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT) (ODN 2a) está dirigido contra el exositio 2, el sitio de unión de la heparina (29). Tanto ODN 1b como ODN 2b se unen realmente a la trombina libre. La radioyodación de estannil oligodesoxirribonucleótios ha proporcionado [^{123}I, ^{125}I] aptámeros de alta actividad específica para esta investigación (14).
Observaciones in vivo con aptámero ODN 1a
sugirieron que el aptámero se pierde desde la sangre directamente a
la extracción del órgano (18, 27). El tiempo de vida de ODN 1a en
suero o sangre parecía más largo in vitro que en la
circulación general. Se encontraron pocos productos de degradación
en la sangre en circulación. La introducción de un aparato
bypass corazón-pulmón en un perro aumentó la
vida mitad de ODN 1a a aproximadamente 10 minutos (11). La hipótesis
de extracción predice que el DNA aptámero puede permanecer intacto
en la sangre hasta la extracción, disponible para la formación de
imagen del trombo. El rápido aclaramiento por extracción dejaría
tiempo insuficiente para marcar el trombo, mientras que la nucleasa
de la sangre podría hacer cualquier marcaje de vida corta. La
presente invención se dirige a estos dos obstáculos para prolongar
el tiempo de vida en la
sangre.
sangre.
Para que un aptámero conserve la afinidad por su
proteína diana, deben usarse los mismos análogos de nucleótidos que
se usan en el experimento de selección, para sintetizar el aptámero
para usos prácticos. Se prefiere usar nucleótidos de DNA natural.
Debe evitarse la introducción de análogos de nucleótidos que anulen
los contactos entre el aptámero y la proteína diana, con el
resultado de una disminución de la afinidad.
\newpage
Dado que la principal nucleasa del suero es una
3'-exonucleasa, puede proporcionarse protección por
casquetes en los extremos 3' en DNA de cadena sencilla (ssDNA:
single stranded DNA) (1, 28). Los ejemplos de
trabajo que siguen demuestran que tales casquetes en los extremos
hacen aumentar la vida mitad de aptámeros en la sangre circulante
in vivo.
La presente invención se dirige también al
problema de la extracción del aptámero por el órgano. Muchas
proteínas son totalmente estables en la sangre en circulación. El
aclaramiento de las proteínas del suero por el riñón está bien
modelado. Los ejemplos de trabajo que siguen muestran también que la
extracción del órgano puede ser impedida usando un bioconjugado del
aptámero con una proteína del suero. El bioconjugado debe permitir
que la secuencia del aptámero núcleo adopte su configuración nativa
con alta afinidad hacia la proteína diana, mientras que el resto de
proteína confiere un tiempo de vida en la sangre más prolongado
(Figura 1).
De acuerdo con la presente invención, la
estreptavidina (SA) es la proteína preferida para prolongar la vida
mitad de un aptámero usado para formación de imagen del trombo y
anticoagulación (3, 25). La estreptavidina tiene una vida mitad
natural de 2,5 horas en la circulación de ratas y conejos. El
homólogo avidina es aclarado rápidamente de la circulación. Un DNA
clonado que codifica estreptavidina y que es útil para preparar
tales proteínas modificadas, se describe en la referencia 31. Se
describen estreptavidinas variantes, por ejemplo, en la
referencia
32.
32.
La SA puede ser complejada con el aptámero
derivatizando el polinucleótido en su extremo 3' (preferentemente
para su uso en sangre) o en ambos extremos, con biotina. Los métodos
para esta reacción son conocidos en la técnica. También pueden
usarse otros ligandos si se desea. El uso de un ligando y
estreptavidina para complejar el aptámero proporciona la
especificidad del sitio de la complejación.
Se considera que los nucleótidos apropiados para
la síntesis de aptámeros y su uso, y los reactivos para la unión
covalente de estreptavidina a los ácidos nucleicos y su uso, son
conocidos en la técnica.
El complejo de aptámero y estreptavidina de la
presente invención puede ser marcado y usado como agente para
diagnóstico in vitro de manera más o menos igual que
cualquier agente de unión de proteínas específico, p. ej. un
anticuerpo monoclonal. Así, un complejo de aptámero y estreptavidina
de la presente invención puede ser usado para detectar y cuantificar
la cantidad de su proteína diana que hay en una muestra, p. ej. una
muestra de sangre, para proporcionar un diagnóstico de un estado
patológico que guarda relación con la cantidad de la proteína que
hay en la muestra.
Los ejemplos de trabajo ejemplifican el uso de
los complejos para formación de imágenes para diagnóstico. En las
aplicaciones de formación de imágenes, los complejos se marcan de
forma que puedan ser detectados fuera del cuerpo. Los marcadores
típicos son radioisótopos, normalmente radiosiótopos con vida mitad
corta. Pueden usarse los radioisótopos habituales para formación de
imágenes, tales como
^{123}I,^{124}I,^{125}I,^{131}I,^{99m}Tc,^{186}Re,^{188}Re,^{64}Cu,^{67}Cu,^{212}Bi,^{213}Bi,^{67}Ga,
^{90}Y,^{111}In, ^{18}F,^{3}H, ^{14}C,^{35}S ó ^{32}P.
Pueden también usarse potenciadores de formación de imágenes de
resonancia magnética nuclear (NMR), tales como el
gadolinio-153, para marcar el complejo para su
detección mediante NMR. Los métodos y reactivos para la realización
del marcaje, bien sea en el polinucleótido o en el resto proteico,
se consideran conocidos en la técnica.
In vivo, el complejo de aptámero y
proteína de la presente invención puede ser usado como agente para
formación de imágenes. Los ejemplos de trabajo ilustran el uso de
complejos de la presente invención como agentes para formar imágenes
de trombos in vivo.
Para el uso en la circulación, los complejos de
la presente invención se formulan para administración intravenosa.
La formulación de las proteínas y ácidos nucleicos, y de complejos
de los mismos para uso i.v. se considera conocida en la técnica. La
dosis del complejo que se administra dependerá evidentemente de la
utilidad que se pretenda en particular.
En un marco terapéutico o diagnóstico, se
considera que la dosis administrada puede ser determinada por
métodos estándar en la técnica. Para la formación de imágenes para
diagnóstico, una dosis típica sería 1 a 10, preferentemente 2 a 5
mCi de compuesto ^{123}I suspendido en 1 ml de suero salino
fisiológico. La actividad específica es preferentemente de 100 a
20.000 Ci/mmol, preferentemente de 5000 a 20.000 Ci/mmol del ácido
nucleico
aptámero.
aptámero.
La invención se ilustra mediante los ejemplos
siguientes. Los ejemplos muestran simplemente realizaciones de la
invención seleccionadas, y no son limitantes de la presente
invención. El alcance de la invención se define por las
reivindicaciones que siguen.
Oligodesoxinucleótidos (ODNs): Los ODNs
fueron preparados usando química de fosforamidita estándar, por el
laboratorio del Servicio de Ácidos Nucleicos y Proteínas de la
Universidad de Columbia Británica, Vancouver B.C. Se prepararon
estannil ODNs y ODNs radioyodados mediante el procedimiento de los
autores publicado (14) (Tabla 1). El 3'-biotina ODN
se preparó usando biotina TEG CPG (Glen Research P/N:
10-1963). Se obtuvieron [^{123}I]NaI y
[^{125}I]NaI en NaOH 0,1N de Nordion International. Se
prepararon ODNs con una actividad específica de
1.000-2.000 Ci/mmol (^{125}I) o >10.000
Ci/mmole (^{123}I). Los ONDs radiactivos se prepararon como sales
sódicas usando columnas de exclusión de tamaños comerciales,
siguiendo las instrucciones del suministrador
(Centri-Spin-10^{TM}, Princeton
Separations (^{125}I); NAP-5, Pharmacia
(^{123}I)). En la Fig. 2 se da un radiocromatograma de [^{123}I]
ODN 2c. Los bioconjugados de ODNs con estreptavidina se obtuvieron
incubando el 3'-biotina ODN en solución salina
tamponada con fosfato con un exceso de cuatro veces de
estreptavidina (Boehringer-Mannheim) durante cuatro
horas a temperatura ambiente. El bioconjugado se purificó usando un
filtro Centricon-30^{TM} (Millipore) siguiendo las
instrucciones del proveedor.
Determinación de la afinidad del aptámero por
la trombina: Se derivatizó \alpha-trombina
humana (Enzyme Research) con
D-Phe-pro-Ala-CH_{2}Cl
PPACK marcado con fluoresceína (Haematologic Technologies)
bloqueando el sitio activo (6). La solución de trombina (Tris 20 mM,
NaCl 150 mM, pH 7,4) se valoró con aptámero. La intensidad de la
fluorescencia se controló usando un espectrofotómetro de
luminiscencia (LS50b (Perkin Elmer); 492 nm/522 nm) y se ajustó
mediante análisis de regresión no lineal a la ecuación 10 de la
referencia (7), para estimar kD. La fluorescencia intrínseca se
midió usando el ajuste 280 nm/340 nm. La estreptavidina vehículo dio
lugar a un fondo de luz dispersada con los ONDs 1f y 2f, de forma
que se realizaron medidas por duplicado.
Análisis farmacocinético y
radiobiodistribución: Se investigaron seis composiciones de ODN
en biodistribución en animales (Tabla 1). Los procedimientos con
animales fueron aprobados por el UBC Commitee on Animal Care (comité
para la atención a los animales), que sigue las recomendaciones del
Canadian Council for Animal Care. Ratón: se llevaron a cabo estudios
de biodistribución usando ratones machos CDI/UBC
(20-25 g). Se inyectó a los ratones en la vena de la
cola 37 KBq (1 \muCi; 0,7 pmoles) de [^{125}I] ODN en 0,1 mL de
tampón de fosfato potásico, y fueron sacrificados a intervalos dados
después de la inyección. Se determinó la actividad de la sangre,
hígado, riñones, bazo, estómago, pulmones, corazón, músculos y
cerebro, y los resultados se expresaron como % de la dosis inyectada
por órgano (Tabla 3A-3F, órganos; Figuras 3 y 4,
sangre). Conejo: se usaron para los experimentos conejos de Nueva
Zelanda blancos hembras (apr. 3,5 kg). Los conejos fueron
anestesiados mediante la inyección i.m. de hidrocloruro de cetamina
(42 mg/kg), Acepromazina (1,0 mg/kg) y Xylazina (4,2 mg/kg). Se
inyectó a los conejos en la vena marginal de la oreja 0,5 mCi de
[^{123}I] OND (100 pmoles), y se estimó la biodistribución a
partir de escaneos escintilográficos. Cada biodistribución se basa
en datos procedentes de un sólo conejo (Tabla
4A-4F). Para estudios en la sangre (Figuras 5 y 6)
los conejos fueron heparinizados (100 U/kg) y se inyectaron
aproximadamente 200 \muCi de [^{123}I] ODN (40 pmoles) a través
de la vena de la oreja; se tomaron muestras de sangre completa de
una arteria de la oreja opuesta, y se dispensaron en tubos pesados
previamente, que contenían anticoagulante EDTA. Se tomó un volumen
de sangre del conejo para que fuesen 54 mL/kg, 1,050 g/mL (21, 23).
Después de los procedimientos quirúrgicos invasivos, los conejos
fueron sacrificados mediante inyección intravenosa de
Euthanyl^{TM}.
Ensayo de ^{123}I unido a DNA: El
[^{123}I]DNA de la sangre completa en el conejo se estimó
multiplicando el ^{123}I de la sangre total (en unidades de % de
dosis por órgano en sangre) por el DNA de la fracción (determinado
por ensayo) dando el resultado como [^{123}I] %DNA dosis/órgano
en sangre. Después de la centrifugación de la sangre, el plasma (25
\muL) se ensayó mediante una columna de sílice (Sep
Pak\mu^{TM}, Waters) con elución por metanol/acetona (1/1; 2,5
mL) (15) (Figuras 5 y 6). Se demostró que el ensayo en sílice Sep
Pak\mu^{TM} retenía nucleósido monofosfato y todos los ODNs, al
tiempo que liberaba el nucleósido y el yodo libre. Se adoptaron la
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y la cromatografía en
columna de sílice porque la precipitación con ácido tricloroacético
(TCA) y etanol eran ineficaces con oligonucleótidos cortos (menores
que 20-meros) derivados de los aptámeros (20).
Metabolitos del plasma (26): Se inyectó a
un conejo de Nueva Zelanda hembra (2,4 kg) [^{123}I]ODN 1b
(3,5 mCi) en la vena marginal de la oreja; se obtuvo el plasma de
las muestras de sangre (0,5 mL) y se trató con un volumen igual de
metanol enfriado con hielo (5 min). El líquido sobrenadante se
evaporó, se resuspendió en metanol acuoso (20% vol/vol) y se filtró
(0,45 \mum). La mezcla se analizó usando una columna C18 (Waters:
8NVC184 \mu) con un gradiente lineal de metanol (27% a 62%, 18
min) en KH_{2}PO_{4} (0,01M) (2 mL/min) (12, 26). Los picos de
^{123}I correspondían al patrón
5-(2-yodovinil)-2'-desoxiuridina
(IVDU) (Prof. L. I. Wiebe) y al patrón
[^{125}I]5-(2-yodovinil)uracilo
(IVU), (preparado a partir de BrVU (Sigma) (13)). Se supuso que el
hueco representaba yoduro libre (Figura 7; Tabla 5).
Digestión de ODNs por nucleasa de la
sangre: Se suspendió [^{125}I] ODN (0,02 \muCi,
aproximadamente 10 fmoles) en 40 \mul de sangre recién extraída de
un conejo o un ratón. La sangre se incubó a la temperatura de cuerpo
simulada, durante una serie de tiempos (5, 10, 20, 40, 80 y 160
min). Se obtuvo el plasma por centrifugación. El plasma (2,5 \mul)
se diluyó en formamida (10 \mul) o si no en urea (10 \mul; urea
(7 M), glicerol (10%) e incubado 5 min a 95ºC y después 5 min a 0ºC)
y se aplicó a un gel del tipo de secuenciación de poliacrilamida
[20% de poliacrilamida (bisacrilamida/acrilamida (1/19)), urea (8
M)) para electroforesis (PAGE). Se llevó a cabo la autorradiografía
con película Kodak Biomax^{TM} MS e intensificador de imagen
Biomax^{TM} MS (Tablas 6 y 7).
Los conjugados con 3'-biotina y
3'-estreptavidina de los aptámeros deben conservar
la afinidad para la trombina (Figs. 1A-1C). La
afinidad (kD) de los aptámeros bioconjugados (Tabla 1) por la
fluoresceína PPA-trombina se midió mediante
valoración fluorométrica, usando una longitud de onda incidente de
492 nm y una longitud de onda de emisión de 522 nm (Tabla 2). La
fluorescencia tiene lugar con un rendimiento cuántico característico
más alto en el complejo (aptámero y fluoresceína
PPA-trombina) que con la enzima libre. Las medidas
de fluorescencia durante la valoración permitieron la estimación de
la trombina unida frente a la no unida, en función de la molaridad
del aptámero, y de aquí el cálculo de kD. El valor de Ki para la
inhibición de la coagulación por ODN 1f se estimó en aproximadamente
100 nM. El kD de ODN 2f en la hidrólisis de Chromozymthrombin fue
10,2 nM.
Los conjugados de
3'-estreptavidina solos (no conjugados con DNA no
modificado ni con 3'-biotina) mostraron un tiempo de
vida prolongado en la sangre, in vivo. La evaluación
biológica se llevó a cabo con seis análogos de aptámeros, ODNs 1b,
c, d y 2b, c, d (dos series de bioconjugados; Tabla 1). Para cada
análogo los autores estimaron las biodistribuciones en el ratón y en
el conejo, con un detallado estudio de la sangre del conejo. Ensayos
de nucleasa de la sangre in vitro suplementaron los estudios
de la sangre in vivo.
El primer ejemplo, [^{125}I] aptámero ODN 1b,
fue preparado a partir del precursor de estannilo. Se determinó la
biodistribución en el ratón. Se inyectaron partes alícuotas de
aptámero (1 \muCi) a través de la vena de la cola. Los ratones
fueron sacrificados y se midió el ^{125}I en órganos y tejidos
seleccionados. Los resultados para los tiempos 0-15
minutos están listados en la Tabla 3A. El ^{125}I aumentó
rápidamente en varios órganos, de forma notable en el tejido
muscular, el hígado y el riñón. El ^{125}I unido al órgano comenzó
a descender dentro del período de observación. Los pulmones
acumularon poco ^{125}I. El % de la dosis de ^{125}I de la
sangre por órgano cayó rápidamente hasta los 2,5 minutos (la "fase
temprana") y a una velocidad acusadamente más baja desde los 2,5
minutos a los 15 minutos (la "fase tardía") (Figuras 3 y
4).
La biodistribución en el conejo se estimó a
partir de imágenes escintilográficas (Tabla 4A). Después de la
inyección de [^{123}I]ODN 1b (0,5 mCi) las imágenes fueron
analizadas durante 30 minutos o más. El corazón, el hígado y los
riñones eran llamativos. La absorción por el hígado alcanzó un
máximo y después disminuyó. La absorción por el riñón alcanzó un
máximo rápidamente; un retardo de 10 minutos precedió a la aparición
de ^{123}I en la vejiga. Se encontró en la vejiga un
30-40% del ^{123}I inyectado a los
30-60 minutos después de la inyección. Los pulmones
acumularon escasa actividad. La vesícula biliar no apareció en las
imágenes del conejo. Se inyectó a dos conejos anestesiados, de la
forma habitual, ODN 1b (50 \muCi). Se lavaron muestras de bilis de
la vesícula biliar en intervalos de 5 minutos. Se recuperó menos del
0,1% de la dosis inyectada de la vesícula biliar durante los
primeros 40 minutos.
La sangre de conejo se analizó por separado a
partir de la imagen, después de la inyección de [^{123}I] ODN 1b
(200 \muCi). Se recuperó sangre en intervalos de 30 segundos. Se
observó que la actividad de ^{123}I (% de la dosis por órgano)
aumentó inicialmente desde el 50% a los 20 segundos hasta un máximo
del 66% a los 30-40 segundos. El % de la dosis de
^{123}I por órgano decreció después rápidamente, aproximándose al
24% a los 5 minutos. Desde aproximadamente el minuto 10 en adelante,
la actividad de ^{123}I disminuyó más lentamente, alcanzando el
17,8% a los 30 minutos. El patrón de eliminación de ^{123}I de
nuevo sugirió una fase "temprana" y una fase "tardía".
Las diferencias entre la sangre de la fase
temprana y la de la fase tardía fueron examinadas después de la
inyección de ODN 1b a conejos. En ambas fases, la actividad de
^{123}I se localizó en el plasma sanguíneo después de la inyección
de ODN. La cromatografía del plasma reveló que el ^{123}I del
plasma de la fase temprana se unía a SiO_{2}, lo que sugiere que
el ^{123}I estaba incorporado al DNA. El ^{123}I del plasma de
la fase tardía unió aproximadamente un 3% al SiO_{2}, lo que
sugiere que los metabolitos por debajo del nivel de nucleósido
monofosfato predominaban en la sangre de la fase tardía (Figuras 5 y
6). Se estimó el [^{123}I]DNA total de la sangre
multiplicando el ^{123}I total de la sangre (en unidades de % de
la dosis por órgano en la sangre) por el DNA de la fracción
(determinado por cromatografía en SiO_{2}) dando el resultado en
las unidades siguientes: [^{123}I]%DNA dosis/órgano en la sangre.
En el caso de ODN 1b, los metabolitos en el plasma de conejo fueron
identificados y caracterizados mediante HPLC de fase inversa (Figura
2; Tabla 5). Los principales picos de ^{123}I coincidieron con
5-(2-yodovinil)-2'-desoxiuridina
(IVDU), 5-(2-yodovinil)-uracilo
(IVC) y probablemente yoduro libre (es decir el hueco de HPLC). El
IVDU era el metabolito más abundante a los 5 minutos, mientras que
el yoduro predominó en los tiempos más tardíos.
La rápida eliminación del ODN 1b de la sangre es
evidentemente un problema serio. Los autores han intentado reducir
este problema con los bioconjugados con 3'-biotina
(ODN 1c) y 3'-estreptavidina (ODN 1d). Bioconjugados
similares del aptámero del exositio 2 (ODNs 2b, c, d) fueron
evaluados para determinar si los resultados eran específicos de la
secuencia. Se extendió un análisis comparativo a los ODNs 1c, d y
2b, c, d (Tablas 3A-F, y 4A-F).
Sangre: Los aptámeros modificados se
comportaron de manera característica en la sangre (Figuras
3-6), dependiendo de la modificación 3', y no
dependiendo mucho de la secuencia de DNA. Se midió inicialmente la
farmacocinética de radioyodo de la sangre total en el ratón y el
conejo. Resultados de ratón repetidos demostraron la validez
estadística (es decir, desviación estándar (SD) aceptable). Los
resultados con ratón y conejo se parecían entre ellos. Las
concentraciones en sangre eran inicialmente altas, pero cayeron a
medida que se eliminaba el radiotrazador. Los autores han expuesto
el fenómeno de la "fase temprana" y de la "fase tardía" en
la sangre. El nivel inicial de radioyodo en la sangre (% de la dosis
por órgano) era significativamente más elevado para los aptámeros de
3'-biotina (ODNs 1c y 2c) que para los aptámeros no
modificados. El % de la dosis en sangre de la "fase tardía" por
órgano de aptámeros de 3'-biotina se superpone a los
niveles para aptámeros no modificados. Los aptámeros modificados con
3'-SA mostraron radioyodo en sangre elevado
inicialmente y también más tarde (en comparación con los no
modificados y 3'-biotina).
El DNA se ensayó directamente en plasma de conejo
(Figuras 5 y 6). La farmacocinética mostró un tiempo de vida del
aptámero en la sangre prolongado, aunque los datos sugieren una
cinética multicomponente. El tiempo de vida medio se calculó por
integración numérica. Para ODN 1d el tiempo de vida medio se estimó
en 7,9 minutos basándose en los datos de 0 minutos a 30 minutos,
15,2 minutos (datos de 0 minutos a 90 minutos) y 18,6 minutos (datos
de 0 minutos a 120 minutos). Para ODN 2d el tiempo de vida medio fue
8,7 (datos de 0 minutos a 30 minutos), 23 minutos (datos de 0
minutos a 90 minutos) y 31 minutos (datos de 0 minutos a 120
minutos). Sería interesante una mayor clarificación de la naturaleza
del componente de vida larga.
Para suplementar los datos de distribución en la
sangre, los autores de la presente invención han desarrollado un
ensayo de degradación de nucleasa in vivo simulada para
[^{125}I]ODNs. En un trabajo anterior (datos no
presentados), los autores encontraron que el ODN 1b y el ODN 2b eran
ambos estables hasta 160 minutos a 39ºC en plasma de conejo
precongelado. Los autores de la presente invención han desarrollado
un ensayo de nucleasa en sangre recién extraída (heparinizada) de
ratones o conejos. A 20-23ºC no se observó digestión
de ODN 1b ni ODN 2b durante 160 minutos. A la temperatura corporal
simulada, se observó una considerable digestión. Las
autorradiografías indicaron principalmente las bandas de ODNs
intactos. Se observaron tenues escalas de ODNs truncados delante de
ODN 1b y ODN 2b intactos. Se informó de las escalas anteriormente
in vivo con ODN 1a monitorizado por HPLC o fluorescencia
estimulada por láser (18, 24, 27). No se observaron escalas con ODNs
1c, d ni 2c, d.
Así pues, se incubaron [^{125}I]ODNs
in vitro en sangre de ratón (36ºC) o sangre de conejo (39ºC)
recién extraídas (Tablas 6 y 7). El DNA se recuperó del plasma y se
examinó mediante PAGE desnaturalizante y autorradiografía. La vida
mitad de ODNs 1b y 2b se estimó en aproximadamente 10 minutos en
sangre de ratón o aproximadamente 5 minutos en sangre de conejo. La
vida mitad de ODN 1c biotinilado fue aproximadamente 160 minutos en
la sangre de ratón o en la sangre de conejo, mientras que la vida
mitad de 2c fue aproximadamente 80 minutos en la sangre de ratón y
aproximadamente 40 minutos en la sangre de conejo. La vida mitad de
los bioconjugados 1d y 2d con estreptavidina parecía ser 160 minutos
o mayor en la sangre de ratón o en la de conejo.
Hígado: La absorción por el hígado mostró
el más elevado % de la dosis por órgano con casi todos los ODNs,
tanto en el ratón como en el conejo, aunque la absorción en los
riñones y músculo era comparable. El máximo se alcanzó rápidamente,
en uno o dos minutos; la máxima absorción de análogos de
estreptavidina se retrasó a aproximadamente 5 minutos en el ratón.
La actividad en el hígado disminuyó rápidamente a partir del máximo.
La absorción en el hígado de ratón no pareció distinguir las parejas
1b/2b y 1c/2c; sin embargo, la absorción de 2d excedió a la de 1d.
En el conejo, la absorción de ODN 2b, c, d excedió al
correspondiente ODN 1b, c, d. Con los datos de ratones los autores
tienen una buena certidumbre cuantitativa y estadística. Los máximos
del hígado de ratón mostraron dependencia de la secuencia. 1b >
1c > 1d o 2b = 2c > 2d. Los datos para el conejo diferían
ligeramente de esta regla. Los autores de la presente invención no
detectaron la vesícula biliar del conejo en las imágenes.
Riñón: El % de la dosis por órgano del
riñón era tan alto como un 15%. Se observaron amplios máximos para
los ODNs 1b y 2b a 1,0 - 1,5 minutos. Los máximos para los
bioconjugados se observaron a tiempos cada vez más tardíos, con los
máximos para los ODNs 1d y 2d a 5 minutos, y de menor magnitud. En
el riñón de ratón, la absorción de ODN 2b, c, d excedió al análogo
ODN 1b, c, d. Las imágenes del conejo muestran que la vejiga
contenía 30-40% de la dosis inyectada después de la
inyección de ODN 1b. Aunque la ruta riñón/vejiga cobró importancia
con el tiempo, la vejiga del conejo no se observó hasta
aproximadamente 10 minutos después de la inyección de 1b, c, d o 2b,
c, d. Esta observación sugiere que la absorción por el riñón puede
representar casi el total en la ruta riñón/vejiga a tiempos
tempranos.
Músculo: El músculo de ratón mostró un
bajo % de la dosis por gramo para todos los ODNs; el % de la dosis
por órgano tomó importancia (hasta el 27%). Los máximos fueron
alcanzados pronto por 1b o 2b (1 minuto), más tarde por 1c o 2c (5
minutos), y aún más tarde por 1d o 2d (10-15
minutos).
Pulmones: Los pulmones del ratón
alcanzaron su más alto % de la dosis por gramo de órganos sólidos
después de la inyección de los bioconjugados de estreptavidina y
biotina. La sangre de ratón mostró incluso un mayor % de la dosis
por gramo que el pulmón en estos casos. La actividad del pulmón
puede indicar absorción fisiológica, o puede reflejar contaminación
del tejido pulmonar con la sangre. En los conejos, los autores de la
presente invención no observaron imágenes del pulmón después de la
inyección de análogos de ODN bioconjugado con [123I] (es decir, 1b,
c, d o 2b, c, d).
Tiroides: Las tiroides no forman imagen
durante estudios escintilográficos de 30 minutos con conejos.
Las biodistribuciones que se han expuesto en el
presente texto están generalmente de acuerdo con la biodistribución
de ODN 1a tritiado en ratas (24) que se ha publicado. Las
diferencias pueden ser atribuidas a IVDU y bioconjugados en los ODNs
de la presente invención contrastadas con DNA natural en la ref.
(24), y diferencias en las especies.
El corto tiempo de vida en la sangre es un
obstáculo general para la aplicación de DNA fosfodiéster como
radiofármaco, y un problema particular con radiotrazadores de DNA
aptámero. La nucleasa del suero, y también la extracción por el
órgano, han sido propuestos como causas fundamentales de este
problema. Los bioconjugados con
3'-biotina-estreptavidina de los
aptámeros conservan la afinidad y muestran tiempos de vida en sangre
prolon-
gados.
gados.
Los estudios de biodistribución confirmaron que
los aptámeros fosfodiéster DNA no protegidos son de vida corta,
igual que otros ODNs, sea en circulación o en sangre extraída. Las
biodistribuciones reflejan probablemente la absorción de aptámeros
intactos en tiempos tempranos. Los aptámeros mostraron tiempos de
vida in vitro más bien largos mediante el ensayo PAGE in
vitro en sangre reciente. Las estimaciones fueron 5, 10, 40, 80
o >160 minutos, dependiendo del análogo (ODN 1b, c, d o 2b, c, d)
y de la especie animal. Estas estimaciones de los tiempos de vida
implican que muchos análogos podrían estar intactos in vivo
al cabo de 1, 5, 10 o 15 minutos después de la inyección in
vivo. Los tiempos de vida de la bibliografía para ODN 1a en
suero (in vitro) están en el intervalo de 15 a 30 minutos. La
estructura cuarteto de guanina puede estabilizar ambos ODNs 1 y 2 en
el suero en relación con los ODNs carentes de estructura secundaria.
La unión con la protrombina es un factor adicional que se cree que
prolonga el tiempo de vida in vitro de análogos de ODN 1 (11,
18, 27). Los niveles de DNA prolongados en la sangre en circulación
con bioconjugados aptámero estreptavidina apoyan también esta idea.
Las diferencias de biodistribución dependiente de la secuencia entre
los análogos ODN 1 y 2 sugieren también la absorción de DNA intacto.
Los tiempos de absorción máxima por el órgano (especialmente hígado,
músculo y riñones) parecen estar determinados por la disponibilidad
de DNA en la fase temprana; ciertos máximos del órgano pueden
aparecer en tiempos mas tardíos con los bioconjugados porque se
prolonga la disponibilidad del DNA.
El radioyodo total (ODN más metabolitos) se
aclaró de la sangre en circulación en dos etapas, tanto en el ratón
como en el conejo. El DNA aptámero marcado predominó durante la
etapa temprana. Durante la etapa tardía predominaron los metabolitos
(es decir, IVDU, IVU y yoduro). Para aptámeros ODNs 1b y 2b no
modificados, se considera que la vida mitad en circulación es de 1,0
a 1,5 minutos (11, 18, 24, 27). Este tiempo de vida aumentó
escasamente en los análogos 3'-biotinilados, incluso
aunque eran estables a la nucleasa en la sangre no circulante. Se
obtuvo un tiempo medio de vida en la sangre prolongado de 18,6
minutos o más, con los bioconjugados con
3'-estreptavidina.
3'-estreptavidina.
Se ha propuesto que el ODN 1a es aclarado por la
extracción por el órgano, especialmente la extracción por el pulmón
(11, 18, 27). La estabilización de los aptámeros mediante
estreptavidina (y no mediante biotina sóla) sugiere que los ODNs
podrían pasar a través de un filtro (análogo al glomérulo renal) a
otro compartimento durante el aclaramiento natural y la degradación.
Se encuentran elevadas concentraciones de ODNs 1d y 2d en pulmones
de ratón (pero no en pulmones de conejo). Los anteriores resultados
sugieren que para tiempos tempranos los riñones llevan solamente de
8 a 15% de la dosis inyectada, con poca cantidad en la vejiga. Los
datos indican que la mayoría del ODN (85 a 92%) es extraído por
otros órganos distintos del riñón; no se dispone de modelos de
extracción. La naturaleza multicomponente de la cinética del
aclaramiento sugiere que puede estar implicada más de una forma de
complejo de estreptavidina. Desde un punto de vista bioquímico, la
exonucleasa 3' del suero es bien conocida; el casquete del extremo
3' del ODN es suficiente para prolongar el tiempo de vida en el
suero (1, 28). Sin embargo los fosfodiéster ODNs con casquete en el
extremo 3' son de vida corta en la sangre circulante, lo que sugiere
que el problema de la estabilidad tiene más componentes. En un
ejemplo, un ODN metilfosfonato con un
5'-fosfodiéster simple probó ser estable en la
sangre no circulante, pero se recuperaron ODNs tuncados en la sangre
en circulación, o con extractos de órganos (4, 9). Esto sugirió un
paso de ODN de uno a otro lado entre la sangre y los órganos
sólidos. Los fósforotioato ODNs son principalmente resistentes a la
nucleasa del suero. Muestran unión no específica a las proteínas del
suero como característica secundaria (8). Invirtiendo este marco,
los autores han unido fosfodiéster ODNs a una proteína de suero
simulada, y se impidió el aclaramiento de los
ODNs.
ODNs.
Oligodesoxinucleótidos: Se llevó a cabo la
5'-biotinilación con una modificación de las
reacciones del estannil oligonucleótido (14). El
5'-Fmoc estannil ODN en el soporte sólido fue
tratado con
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU) (0,1 M en acetonitrilo, 2,5 minutos) para eliminar el Fmoc. El
soporte sólido se lavó con acetonitrilo, y después se hizo
reaccionar con biotina TEG fosforamidita (Glen Research P/N:
10-1955) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El producto fue oxidado usando ácido
3-cloroperoxibenzoico, como se ha descrito con
anterioridad (14). Se llevaron a cabo los procedimientos estándar de
segmentación con estannilo y desprotección (14), dando lugar a
estannil ODN di-biotinilado con el
5'-DMT aún en su lugar. El producto de ODN se
purificó mediante HPLC estándar (14) usando un gradiente de
acetonitrilo en TEA bicarbonato (0,15 M, pH 7,0) en la que se
recogió un sólo pico (t_{R} = 41 min), y se dividió en porciones
de 100 \mug. El ODN fue radioyodado usando ^{123}I y un
procedimiento Iodobead estándar (14). El producto radioyodado
(DMT-on) se resolvió mediante HPLC estándar a
t_{R} = 35 min; este pico se recogió y se evaporó a sequedad en la
centrífuga bajo vacío. La destritilación se realizó suspendiendo el
producto seco en solución acuosa de ácido acético (80%, 50 \muL)
durante 20 minutos a temperatura ambiente. El ácido acético se
eliminó bajo vacío y el ODN se evaporó por segunda vez en presencia
de TEA (10 \muL). El producto radioyodado se purificó directamente
con una columna NAP-5. El producto dio un único pico
de ^{123}I (t_{R} = 19 min) en
HPLC.
HPLC.
La estabilidad del aptámero en la sangre se
evaluó por el contenido de ^{123}I en DNA de la sangre de la misma
manera que en el Ejemplo 1.
La estabilidad del aptámero en la sangre mejoró
más (en comparación con el aptámero 3'-biotinilado)
cuando se conjugó con estreptavidina un aptámero doblemente
biotinilado (es decir en ambos extremos 3' y 5'). Esto conduciría a
un tipo de bioconjugado de oligonucleótido cíclico con un único
tetrámero de estreptavidina, o si no una unión de dos tetrámeros de
estreptavidina. Con el bioconjugado di-biotina
estreptavidina se encontró un vida mitad de aproximadamente 90
minutos en la sangre de conejo.
Se prepararon mezclas de reacción de TSTW (50
\mul) suplementado con fibrinógeno (0 a 10 \muM), CaCl_{2} (2
mM), [^{125}I]ODN (0,1 \muCi, 20 nM) y IIa (0,2 a 500
nM). La atroxina reemplazó al fibrinógeno en las reacciones testigo.
Después de la coagulación (1 h), las mezclas de reacción se
centrifugaron. Después se determinaron el aptámero libre y el unido.
Los resultados se muestran en las Figuras 8A y 8B.
Los artículos que siguen, de la bibliografía de
revistas y patentes, se han citado a lo largo de toda la memoria
decriptiva. Cada artículo se incorpora al presente texto como
referencia en su totalidad mediante tales citas bibliográficas.
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Tabla 1: Aptámeros de oligodesoxinucleótido
dirigidos contra los exositios 1 y 2 de la trombina humana usados en
este trabajo: a: X = Y = nada; b: X = IVDU, Y = nada; c: X = IVDU; Y
= biotina; d: X = IVDU, Y = biotina-estreptavidina;
e: X = nada, Y = biotina; f: X = nada, Y =
biotina-estreptavidina.
Tabla 2: Ensayo fluorométrico de la K_{d} de
unión de aptámeros bioconjugados a \alpha-trombina
humana con un sitio activo marcado con
fluoresceína-PPACK. La intensidad emitida (522 nm)
se registró antes y después de la adición de aptámero a una solución
de trombina (100 nM). La longitud de onda incidente fue 492 nm.
Tablas 3A-F: Los ratones
recibieron [^{125}I] ODN (1 \muCi) por la vena de la cola, y
fueron sacrificados y sometidos a disección a los tiempos dados. El
^{125}I fue ensayado en los tejidos y los órganos. Excepto en los
casos indicados, n = 3. La identidad del ODN se indica en cada
registro.
Tablas 4A-F: Conejos de Nueva
Zelanda hembra anestesiados recibieron [^{123}I] ODN (0,5 mCi) por
la vena de la oreja. Los conejos se dejaron en posición supina sobre
el detector y se obtuvieron imágenes basadas en marcos de cuentas de
diez segundos. La biodistribución se estimó a partir del análisis de
las cuentas en la región de interés, en comparación con las cuentas
totales.
Tabla 5: Se analizaron los metabolitos de la
sangre mediante HPLC después de la inyección de [^{123}I] ODN 1b
en un conejo de Nueva Zelanda hembra. Se obtuvo el plasma de las
muestras de sangre (0,5 mL) y se trató con un volumen igual de
metanol a 0ºC. El líquido sobrenadante se evaporó, se resuspendió y
se filtró, antes de HPLC (12, 26). La HPLC en fase inversa empleó un
gradiente de metanol (27% a 62% durante 18 minutos) en solución
acuosa de KH_{2}PO_{4} (0,01 M, 2 ml/min). Se identificaron IVDU
e IVU mediante migración con patrones. Se recogieron las muestras (1
mL) en frascos de material plástico para la medida cuantitativa en
un contador del tipo de pocillos.
Tabla 6: Se incubó [^{125}I] ODN en 40 \muL
de sangre recién extraída de un ratón, durante los tiempos
indicados, a 36ºC. Se diluyó el plasma (2,5 \muL) en formamida (10
\muL) o si no en urea (10 \muL; urea (7M), glicerol (10%)), y el
DNA se resolvió mediante PAGE. La autorradiografía fue puntuada en
relación con la presencia (+) o la ausencia (-) de aptámero de
longitud completa.
Tabla 7: Se incubó [^{125}I] ODN en 40 \muL
de sangre recién extraída de un conejo durante los tiempos
indicados, a 39ºC. Por lo demás, el procedimiento fue similar a la
Tabla 6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
- Los ratones recibieron [^{125}I] oligodesoxinucleótido (ODN) (1 \muCi) por la vena de la cola, y fueron sacrificados y sometidos a disección en los tiempos dados. Se ensayó el [^{125}I] en los tejidos y órganos para dar el % de la dosis inyectada por órgano. Excepto cuando se indica, n = 3. La identidad del ODN se indica en cada carta.
- Conejos de Nueva Zelanda hembra anestesiados recibieron [^{123}I] oligodesoxinucleótido (ODN ) (0,5 mCi) por la vena de la oreja. Los conejos se dejaron en posición supina sobre el detector y se obtuvieron imágenes basadas en marcos de cuentas de diez segundos. La biodistribución (% de la dosis inyectada por órgano) se estimó a partir del análisis de las cuentas en la región de interés, en comparación con las cuentas totales.
| 5 min | 15 min | 30 min | |
| IVDU | 46,7% | 23,4% | 11,6% |
| IVU | 13,2% | 7,5% | 5,0% |
| Yoduro | 32,8% | 63,3% | 78,3% |
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Tabla 5. Se analizaron los metabolitos de la
sangre mediante HPLC después de la inyección de [^{123}I] ODN 1b
en un conejo de Nueva Zelanda hembra. Se obtuvo el plasma de las
muestras de sangre (0,5 mL) y se trató con un volumen igual de
metanol a 0ºC. El líquido sobrenadante se evaporó, se resuspendió y
se filtró, antes de la HPLC (12, 26). La HPLC en fase inversa empleó
un gradiente de metanol (27% a 62% durante 18 minutos) en solución
acuosa de KH_{2}PO_{4} (0,01 M, 2 ml/min). Se identificaron
5-(2-yodovinil)-2'-desoxiuridina
(IVDU) y
[^{125}I]5-(2-yodovinil)uracilo
(IVU) mediante migración con patrones. Se recogieron las muestras (1
mL) en frascos de material plástico para la medida cuantitativa en
un contador del tipo de pocillos.
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| ODN | 5 min | 10 min | 20 min | 40 min | 80 min | 160 min |
| ODN-1b | + | + | (+) | - | - | - |
| ODN-1c | + | + | + | + | + | + |
| ODN-1d | + | + | + | + | + | + |
| ODN-2b | + | + | (+) | - | - | - |
| ODN-2 | + | + | + | + | + | - |
| ODN-2d | + | + | + | + | + | + |
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Tabla 6: Se incubó [^{125}I]
oligodesoxinucleótido (ODN) en 40 \muL de sangre recién extraída
de un ratón, durante los tiempos indicados, a 36ºC. Se diluyó el
plasma (2,5 \muL) en formamida (10 \muL) o en urea (10 \muL;
urea (7M), glicerol (10%)), y el DNA se resolvió mediante PAGE. La
autorradiografía fue puntuada en relación con la presencia (+) o la
ausencia (-) de aptámero de longitud completa.
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| ODN | 5 min | 10 min | 20 min | 40 min | 80 min | 160 min |
| ODN-1b | + | (+) | - | - | - | - |
| ODN-1c | + | + | + | + | + | + |
| ODN-1d | + | + | + | + | + | + |
| ODN-2b | + | (+) | - | - | - | - |
| ODN-2 | + | + | + | + | (+) | - |
| ODN-2d | + | + | + | + | + | + |
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Tabla 7: Se incubó [^{125}I] ODN en 40 \muL
de sangre recién extraída de un conejo durante los tiempos
indicados, a 39ºC. Por lo demás, el procedimiento fue similar al de
la leyenda de la Tabla 6.
| ODN | Tipo | k_{D} |
| ODN 1a | no modificado | 45 nM |
| ODN 1e | 3'-biotina | 55 nM |
| ODN 1f | 3'-estreptavidina | 41 nM, 99 nM |
| ODN 2a | no modificado | 26,5 nM |
| ODN 2e | 3'-biotina | 85 nM |
| ODN 2f | 3'-estreptavidina | 89 nM, 110 nM |
Tabla 2. Ensayo fluorométrico de las K_{D}s de
unión de aptámeros bioconjugados a \alpha trombina humana con un
sitio activo marcado con fluoresceína-PPACK. La
intensidad emitida (522 nm) se registró antes y después de la
adición de aptámero a una solución de trombina (100 nM). La longitud
de onda incidente fue 492 nm.
Claims (5)
1. Una composición que comprende:
(a) Un DNA aptámero que se une a la trombina;
y
(b) estreptavidina que se compleja con dicho
aptámero en el extremo 3' o en ambos extremos, 5' y 3'.
2. La composición según la reivindicación 1ª, en
la que dicho aptámero se derivatiza en el extremo 3' o en ambos
extremos, 5' y 3', con biotina, y dicho complejo está formado por
biotina y estreptavidina.
3. La composición según las reivindicaciones 1ª o
2ª, en la que dicha composición se marca además con un marcador
radiactivo.
4. La composición según la reivindicación 3ª, en
la que dicho marcador radiactivo es ^{123}I o ^{125}I.
5. El uso de un DNA aptámero que se une a
trombina y estreptavidina que se compleja con dicho aptámero en el
extremo 3' o en ambos extremos, 5' y 3', para la preparación de una
composición para diagnóstico para obtener imágenes de formación de
un trombo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13989699P | 1999-06-22 | 1999-06-22 | |
| US139896P | 1999-06-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2250143T3 true ES2250143T3 (es) | 2006-04-16 |
Family
ID=22488780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00940098T Expired - Lifetime ES2250143T3 (es) | 1999-06-22 | 2000-06-22 | Prolongacion de la duracion de vida de aptameros de oligodesoxinucleotidos anticoagulantes en sangre. |
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| JP (1) | JP2003502392A (es) |
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| AU (1) | AU5517400A (es) |
| CA (1) | CA2378051A1 (es) |
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| ES (1) | ES2250143T3 (es) |
| WO (1) | WO2000078364A2 (es) |
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| US6111095A (en) * | 1995-06-07 | 2000-08-29 | Merck & Co., Inc. | Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers |
-
2000
- 2000-06-22 ES ES00940098T patent/ES2250143T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 2000-06-22 AT AT00940098T patent/ATE304868T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-22 EP EP00940098A patent/EP1194174B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 DE DE60022753T patent/DE60022753T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 AU AU55174/00A patent/AU5517400A/en not_active Abandoned
- 2000-06-22 WO PCT/CA2000/000751 patent/WO2000078364A2/en active IP Right Grant
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