ES2249452T3 - Expresion de un gen heterologo en plantas. - Google Patents
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Abstract
Un casete de expresión preferida en semillas que tiene los elementos génicos reguladores que comprende: el promotor de la arcelina que comprende la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 1, el líder de arcelina 5I mostrado en la ID SEC Nº 2, el péptido señal de almacenamiento de albúmina 2S2 mostrado en la ID SEC Nº 4, un gen heterólogo de interés, y el extremo 3¿ de arcelina 5I que comprende la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 3, en el que dicho gen heterólogo de interés se coloca entre dicha secuencia líder y dicha secuencia 3¿ de arcelina 5I.
Description
Expresión de un gen heterólogo en plantas.
La presente invención se refiere a la expresión
de un gen heterólogo en plantas. Más específicamente, la invención
se refiere a la expresión elevada de proteínas heterólogas en
semillas, incorporando el gen entre secuencias específicas de la
semilla. Preferiblemente, dicha proteína heteróloga es un fragmento
variable de anticuerpo de cadena única (scFv).
La capacidad para clonar y producir una amplia
gama de proteínas a partir de diversas fuentes resultó posible con
la llegada de la tecnología recombinante. La selección de
hospedadores de expresión para la producción comercial de proteínas
heterólogas se basa en los aspectos económicos de la técnica de
producción, tales como el coste de la fermentación, el coste de la
purificación y la capacidad del hospedador para efectuar las
modificaciones postraduccionales necesarias para la actividad
biológica completa de la proteína recombinante.
Aunque en muchos casos las células hospedadoras
elegidas son células procariotas, tales como Escherichia
coli o células eucariotas simples tales como la levadura
Saccharomyces cerevisiae, estos sistemas no son suficientes
en todos los casos y pueden encontrarse problemas tanto en el
rendimiento como en la actividad de la proteína producida. El
problema de la actividad biológica puede resolverse mediante
sistemas alternativos tales como células vegetales, células de
mamífero y células de insecto, pero se resienten de un alto coste
de fermentación y un bajo rendimiento.
Las plantas transgénicas pueden producir varios
tipos de polipéptidos heterólogos, incluyendo anticuerpos (ac) y
fragmentos de anticuerpo (Whitelam y col., 1993; Goddijn y Pen,
1995; Hemming, 1995). Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo
son interesantes desde un punto de vista industrial: pueden
producirse contra prácticamente cada tipo de molécula orgánica y se
unen a este antígeno de forma muy específica. Sin embargo, el
principal inconveniente es el coste de producción. Las plantas y las
células vegetales son una alternativa interesante para la
producción de estas moléculas y de otros polipéptidos que son
difíciles de producir en otras células procarióticas o
eucarióticas.
El documento US5804694 describe la producción
comercial de la \beta-glucuronidasa en plantas
colocando el gen de la \beta-glucuronidasa detrás
de un promotor de ubiquitina. Con esta construcción, el 0,1% de la
proteína total extraída es \beta-glucuronidasa.
Puede mejorarse la acumulación, especialmente para ac y fragmentos
de ac, dirigiendo la proteína heteróloga al retículo endoplásmico.
El uso del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor da
lugar a un nivel de expresión de Fv de anticuerpos de cadena única
(scFv) de hasta el 4-6,8% de la proteína soluble
total en hojas (Fiedler y col., 1997).
Gran número de esfuerzos se han centrado en las
semillas para la producción de proteínas en plantas. De hecho, las
semillas, especialmente de legumbres y cereales, contienen grandes
cantidades de proteínas; éstas son principalmente proteínas de
almacenamiento, que pueden constituir hasta el 7-15%
del peso en seco de los cereales y hasta el 20-40%
de las legumbres. Además, las proteínas de almacenamiento son
limitadas en número y algunas de ellas pueden ser responsables de
hasta el 20% del contenido total de proteína de la semilla (Vitale
y Bollini, 1995), lo que puede tener importantes ventajas para el
procedimiento de purificación. A este respecto, se consideró que los
promotores que codifican las proteínas de almacenamiento son
herramientas ideales para obtener niveles elevados de expresión de
proteínas en semilla (Fiedler y col., 1997).
El documento US5504200 describe el uso del
promotor de la faseolina para la expresión de genes heterólogos en
plantas y células vegetales. El documento WO9113993 describe la
expresión de genes animales o del gen de la proteína de
almacenamiento 2S del coco de brasil, usando un promotor
seleccionado entre el grupo compuesto por el promotor de la
faseolina, la subunidad \alpha' del promotor de la
\beta-conglicinina y el promotor de la
\beta-zeina El gen se une a una señal
poli-A seleccionada del grupo compuesto por la
señal poli-A de la faseolina y la señal
poli-A animal.
Sin embargo, ninguno de estos sistemas conduce a
una expresión elevada de proteína heteróloga. El documento
WO9729200 describe un nivel de expresión específico de semillas del
1,9% de proteína heteróloga en la proteína soluble total, usando el
promotor específico de la legumina B4. Las mejoras adicionales de
los casetes de expresión llevan a una expresión del
3-4% de anticuerpos scFv en semillas maduras de
tabaco (Fiedler y col., 1997).
Recientemente, se aisló y clonó el gen de la
arcelina 5I (arc5I) de Phaseolus vulgaris. Este gen
es responsable de la producción de la proteína de almacenamiento de
semillas Arcelina 5a (ARC5a) que se acumula en plantas de tipo
silvestre hasta el 24-32% del contenido de proteína
total de la semilla (Goossens y col. 1994; Goossens y col., 1995).
La expresión del gen en Arabidopsis thaliana y Phaseolus
acutifolius indicaba que la proteína de almacenamiento de
semillas ARC5a puede expresarse hasta el 15%, respectivamente el 25%
de la proteína soluble total (Goossens y col., 1999), cuando se
usaban las propias señales promotoras y de expresión. Sin embargo,
no se mostraban evidencias de que el promotor pudiera dar una
expresión eficaz con otras proteínas. De forma sorprendente,
encontramos que el uso del promotor de arcelina 5I o del promotor
de faseolina, en combinación con la secuencia líder de arcelina 5I o
el líder omega del virus del mosaico del tabaco (TMV) y la
secuencia 3' de arcelina 5I, podía dar lugar a un nivel de
expresión de proteína heteróloga de hasta el 12% de la proteína
total de la semilla, que es mucho más alta que las conocidas en la
técnica anterior.
\newpage
Un primer aspecto de la presente invención es
proporcionar un casete de expresión preferida en semillas que tiene
elementos reguladores del gen que comprenden
- el promotor de la arcelina que comprende la
secuencia mostrada en la ID SEC Nº 1
- el líder de arcelina 5I mostrado en la ID SEC
Nº 2
- el péptido señal de almacenamiento de albúmina
2S2 mostrado en la ID SEC Nº 4.
- el extremo 3' de arcelina 5I que comprende la
secuencia mostrada en la ID SEC Nº 3, en el que
dicho gen heterólogo de interés se sitúa entre
dicha secuencia líder y dicha secuencia 3' de arcelina 5I.
Preferiblemente, dicho gen de interés se fusiona
con la secuencia que codifica el péptido señal de almacenamiento de
albúmina 2S2. En una realización preferida, el gen de interés es un
gen que codifica un anticuerpo scFv.
Otro aspecto de la invención es proporcionar un
procedimiento para obtener la expresión preferida en semillas de una
proteína heteróloga usando el casete de expresión preferida de
semillas de la invención, a un nivel de al menos el 10%,
preferiblemente a un nivel de al menos el 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o
40% de la proteína total soluble de la semilla, a condición de que
dicha proteína heteróloga no sea una proteína de almacenamiento de
semilla sin modificar tal como Arcelina 5a. Preferiblemente, dicha
proteína heteróloga no es una Arcelina, Faseolina o Zeina sin
modificar. Otra realización preferida es un procedimiento según la
invención, por el cual dicha proteína heteróloga es un scFv.
Aún otro aspecto de la invención es una célula
vegetal, transformada con un casete de expresión según la invención
o una planta transgénica que comprende un casete de expresión de
acuerdo con la invención. De hecho, el casete de expresión puede
incorporarse y transformarse en una célula vegetal o en una planta,
usando procedimientos conocidos por el experto en la materia.
Dichos procedimientos incluyen, pero no de forma limitante, la
transformación mediada por ADN-T de
Agrobacterium, bombardeo de partículas, electroporación y
captación directa de ADN.
Las definiciones siguientes se exponen para
ilustrar y definir el significado y el alcance de los diversos
términos usados para describir la presente invención.
Expresión preferida en semillas significa
que la expresión preferiblemente tiene lugar en la semilla, pero no
excluye la expresión en otros órganos de la planta.
Gen de interés como se usa aquí significa
la secuencia codificadora de un gen del cual se quiere obtener la
expresión preferida en semillas.
Líder como se usa aquí significa la
secuencia sin traducir del extremo 5'.
Péptido señal indica la función inicial
del péptido en la proteína de almacenamiento de albúmina 2S2 pero
no implica necesariamente que el péptido tenga la misma función y
sea procesado de la misma forma cuando se fusiona con el gen de
interés.
Proteína heteróloga se refiere a cualquier
proteína que puede expresarse en semillas pero que no es una
proteína de almacenamiento de semilla sin modificar. Por el
contrario, las proteínas de almacenamiento de semillas modificadas
(mutantes específicos, proteínas de fusión, proteínas de
almacenamiento de semillas mejoradas...) son parte de la presente
invención y, de ese modo, se incluyen en dicha definición.
Figura 1: Visión general de los vectores de
ADN-T para la evaluación de producción de scFv en
semillas de Arabidopsis thaliana.
LB y RB = límite izquierdo y límite derecho del
ADN-T.
pVS1 = inserción plasmídica de Pseudomonas
aeruginosa para la estabilidad y replicación del vector en
Agrobacterium tumefaciens.
pBR = origen de replicación en Escherichia
coli.
NptII = marcador de selección neomicina
fosfotransferasa II bajo el control del promotor nos y de las
señales de terminación 3' ocs y de poliadenilación.
SmISpR = gen de resistencia bacteriana a
espectinomicina y estreptomicina.
Figura 2: Construcción de pBluescript
(2S2-G4).
Figura 3: Construcción de patag5
(3'-arc5I).
Figura 4: Construcción de pSP72
(Parc5I/ARC5a^{cs}).
Figura 5: Amplificación de fragmentos de ADN para
la construcción del vector.
Figura 6: Construcción de
pParc5I-G4. Este vector, de acuerdo con el Tratado
de Budapest, se ha depositado en las Belgian Coordinated
Collections of Microorganisms - BCCM^{TM} Laboratorium voor
Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie (LMPB),
Universidad de Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000
Gent, Bélgica por la Dra. Ann Depicker, Molenstraat 61, 9820
Merelbeke, Bélgica (dirección de trabajo: K.L. Ledeganckstraat 35,
9000 Gent, Bélgica) y tiene el número de acceso: LMBP 4128.
Figura 7: Construcción de
pParc5I-\Omega-G4.
Figura 8: Construcción de
pP35S-G4.
Figura 9: Construcción de
pP\beta-phas-G4.
Figura 10: Resultados de la cuantificación de
scFv-G4 en los extractos de semillas por
inmunotransferencia cuantitativa. Se cargaron 500 ng de proteína de
extractos de semillas A, P y \Omega y 2,5 \mug de proteína de
extractos 35S y Col O en un gel SDS-PAGE al 10%. Las
proteínas G4 se detectaron con anticuerpos monoclonales
anti-c-myc y anti-ratón
conjugados con fosfatasa alcalina. ColO = control negativo.
Figura 11: Cuantificación de
scFv-G4 en extractos de semillas de transformantes
por inmersión floral por inmunotransferencia cuantitativa. Se
muestran los resultados de 10 variedades de semillas T2 segregadas
transformadas con pParc5I-G4 (transferencia
superior) y 4 variedades de semillas T2 segregadas transformadas con
pP\beta-phas-G4 (transferencia
inferior). Cargamos 1 microgramo de proteínas de semillas de A1, A7,
F28, F31, F38 y F39, 1,5 microgramos de A3, A5, A8, A15, A22 y A42 y
2 microgramos de A14 y A16 en un gel SDS-PAGE al
10%. Las proteínas G4 se detectaron con anticuerpos monoclonales
anti-c-myc y anti-ratón
conjugados con fosfatasa alcalina. M = marcadores de peso
molecular.
Figura 12: Gel SDS-PAGE teñido
con azul de Coomassie que muestra las proteínas separadas de
semillas de Arabidopsis de transgénicos F28 (carriles 3 y 7),
F31 (carriles 4 y 8), F38 (carriles 5 y 9), F39 (carriles 6 y 10),
transformados con pP\beta-phas-G4
y de una planta de control no transformada (carril 2). Los carriles
3, 4, 5 y 6 contienen 30 microgramos de proteína y los carriles 7,
8, 9 y 10 contienen 20 microgramos de proteína. La flecha indica la
banda de la proteína scFv recombinante. El carril 1 contiene el
marcador de peso molecular. En base a las bandas de proteína teñidas
con Coomassie en carriles separados, el software ImageMaster VDS
midió los siguientes contenidos de G4 para cada carril: 9,9% para
F28 (11,3% por inmunotransferencia), 15,4% para F31 (20,0% por
inmunotransferencia), 16,0% para F38 (19,0% por inmunotransferencia)
y 9,6% para F39 (12,0% por inmunotransferencia).
Figura 13: Representación esquemática del ensayo
de ELISA usado para analizar la actividad de unión al antígeno de
las proteínas scFv extraídas ex planta y extraídas de E.
coli. (1) Recubrimiento de pocillo de microvaloración con
anticuerpo monoclonal 9E10 unido a la etiqueta
c-myc del scFv; (2) incubación conjunta de
varias cantidades de scFv de semillas o de E. coli con un
exceso del antígeno
dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) de
Petunia hybrida; detección de la DFR unida con (3) antisuero
policlonal de ratón contra DFR y (4) suero policlonal
anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina
(FA).
Figura 14: Resultados del análisis por ELISA de
la actividad de unión al antígeno de proteínas scFv extraídas de
semillas y de E. coli. El ensayo de ELISA (figura 12) se
realizó con diferentes concentraciones de G4 (eje X) en presencia o
ausencia (controles) del antígeno DFR. El eje Y representa la señal
del ELISA (\DeltaUF/min).
Figura 15: Construcción de patag6
(3'-arc5I).
Figura 16: Construcción de
pParc5I-G4bis.
Figura 17: Cuantificación de
scFv-G4 en semillas diferentes (3/2, 3/3, 3/4 y 3/5)
de una única planta de Phaseolus acutifolius transgénica.
Cargamos 3 (carriles a) o 4 (carriles b) microgramos de proteínas de
semillas de cada extracto de semillas en un gel
SDS-PAGE al 10%. Las proteínas G4 se detectaron con
anticuerpos monoclonales anti-c-myc y
anti-ratón conjugados con fosfatasa alcalina. M =
marcador de peso molecular.
Se construyeron cuatro vectores de
ADN-T para evaluar y comparar la producción de scFv
bajo el control de las señales de expresión de arc5I
(vectores pParc5I y
pParc5I-\Omega-G4), el promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor (vector
pP35S-G4) y el promotor del gen de la faseolina
\beta de Phaseolus vulgaris (vector
pP\beta-phas-G4)(figura 1). Una
primera etapa en el procedimiento de clonación consistió en la
construcción de tres vectores piloto: pBluescript
(2S2-G4) (figura 2), patag5
(3'-arc5I)(figura 3) y pSP72
(Parc5I/ARC5a^{cs})(figura 4).
La secuencia codificadora del fragmento G4 de
scFv, fusionada en su extremo 3' con la secuencia codificadora de
la etiqueta c-myc (Evan y col., 1985) y la señal KDEL de
retención de RE (Denecke y col., 1992), se cortó a partir del vector
pG4ER de ADN-T (De Jaeger y col., 1999) por los
sitios de restricción NcoI y XbaI. Además, se creó un
oligonucleótido que codifica la secuencia señal de almacenamiento de
proteínas de semillas 2S2 de Arabidopsis thaliana (Krebbers
y col., 1988). Este oligonucleótido estaba flanqueado en su extremo
3' por el extremo "cohesivo" del sitio de restricción
NcoI y estaba flanqueado en su extremo 5' por un extremo
"cohesivo" que complementa el sitio de restricción XbaI
pero lo destruye tras el ligamiento, seguido de los sitios de
restricción EcoRI, BglII y HindIII. El
fragmento G4 y el oligonucleótido se clonaron conjuntamente en el
vector pBluescriptKS (Stratagene, La Jolla, CA), tras cortar con
HindIII y XbaI. Se analizó la secuencia de la
inserción y se seleccionó un clon que contenía una inserción
correcta para etapas de clonación adicionales. De este modo,
obtuvimos el vector piloto pBluescript (2S2-G4),
que contenía la secuencia codificadora de G4, precedida de una
serie de sitios de restricción únicos que podrían usarse para la
inserción de los diferentes promotores en combinación con una
secuencia líder de
ARNm.
ARNm.
Se creó un oligonucleótido para insertar algunos
sitios de restricción únicos en el vector de ADN-T
patag4 (Goossens y col., 1999). El oligonucleótido contenía los
siguientes sitios de restricción desde su extremo 5' a su extremo
3': el extremo 5' "cohesivo" de EcoRI, los sitios de
restricción XbaI, XhoI y BglII y un extremo 3'
"cohesivo" que complementa a XbaI pero que lo destruye
tras el ligamiento. El oligonucleótido se ligó en patag4, tras
cortar con EcoRI y XbaI. Esto da lugar al vector
patag5. Se analizó la secuencia del oligonucleótido insertado y se
seleccionó un clon con la inserción correcta para etapas de
clonación adicionales. Usando XbaI y EcoRI, cortamos
las señales 3' de expresión de
arc5I(3'-arc5I) a partir del vector
pBluescript(arc5I) (Goossens y col., 1995), que contenía la
secuencia genómica del gen arc5I. El fragmento 3' de
arc5I se ligó en patag5, tras cortar con XbaI y
EcoRI. Esto dio lugar al vector de ADN-T
patag5(3'-arc5I).
El promotor arc5I y la secuencia codificadora de
la proteína ARC5a (ARC5a^{cs}) se cortaron de
pBluescript(arc5I). Este fragmento se ligó en el vector de
clonación pSP72 (Promega, Madison, WI) tras cortar con EcoRI
y XbaI. Esto dio lugar al vector pSP72
(Parc5I/ARC5a^{cs}), que contenía el promotor arc5I
precedido de los sitios de restricción EcoRI y
BglII.
Además de estos tres vectores piloto, se
amplificaron mediante PCR cuatro fragmentos de ADN. Estos fragmentos
se denominaron PCR1, PCR2, PCR3 y PCR4 (figura 5). Los fragmentos
PCR1 y PCR2 se amplificaron a partir de los extremos 3' del
promotor 5' de arc5I (Parc5I) en pBluescript (arc5I). PCR1
contenía el extremo 3' del Parc5I seguido de la secuencia
"líder" de arc5I y el extremo 5' de la secuencia señal 2S2.
PCR2 contenía el mismo extremo 3' de Parc5I, pero seguido de la
secuencia "líder" \Omega y el extremo 5' de la secuencia
señal 2S2. Ambos fragmentos estaban flanqueados por los sitios de
restricción SacI y HindIII. PCR3 se obtuvo
amplificando el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
del vector pGEJAE1 (De Jaeger y col., 1999). En el extremo 3' del
promotor 35S, incorporamos el "líder" de arc5I, seguido del
extremo 5' de la secuencia señal 2S2. PCR3 está flanqueado por los
sitios de restricción BglII y HindIII. PCR4 contenía
el promotor del gen de la faseolina \beta de Phaseolus
vulgaris, amplificado a partir del vector pBluescript
(P\beta-phas) (van der Geest y col., 1994). En el
extremo 3' de PCR4, incorporamos el "líder" de arc5I
seguido del extremo 5' de la secuencia señal 2S2. Este fragmento
estaba flanqueado por los sitios de restricción XhoI y
HindIII. Los vectores pilotos y los cuatro fragmentos de PCR
se usaron para clonar los cuatro vectores de ADN-T
de la figura 1.
Primero se cortó el extremo 5' del promotor de
arc5I a partir del vector pSP72 (Parc5I/ARC5a^{cs}) usando
las enzimas BglII y SacI. Este fragmento promotor,
junto con el fragmento PCR1, se ligó en el vector pBluescript
(2S2-G4), tras la digestión de restricción con
BglII y HindIII. Esto dio lugar al vector pBluescript
(Parc5I- "líder" arc5I-2S2-G4).
Se analizó la secuencia del fragmento PCR1 insertado y se seleccionó
un clon con inserción correcta para etapas de clonación
adicionales. Finalmente, el promotor arc5I con el
"líder" arc5I y la secuencia que codifica G4, se cortó
de la construcción anterior por los sitios de restricción
BglII y XbaI y se ligó en el vector
patag5(3'-arc5I), tras la digestión con
BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de
ADN-T pParc5I-G4. Este plásmido
transformado en E. coli MC1061 se depositó en el BCCM con el
número de depósito LMBP 4128. El plásmido contiene el promotor
arc5I completo y el extremo 3' de arc5I completo,
como se usa en los casetes de expresión que comprenden el promotor
arc5I y el extremo 3' de arc5I.
Primero se cortó el extremo 5' del promotor
arc5I a partir del vector pSP72 (Parc5I/ARC5a^{cs}) por
digestión de restricción con BglII y SacI. Este
fragmento promotor, junto con el fragmento PCR2, se ligó en el
vector pBluescript (2S2-G4), tras la digestión de
restricción con BglII y HindIII. Esto dio lugar al
vector pBluescript (Parc5I-"líder"
\Omega-2S2-G4). Se analizó la
secuencia del fragmento PCR2 insertado y se seleccionó un clon con
inserción correcta para etapas de clonación adicionales. Finalmente,
se cortó el promotor arc5I con el "líder" \Omega y la
secuencia que codifica G4 a partir de la construcción anterior en
los sitios de restricción BglII y XbaI y se ligó en el
vector patag5 (3'-arc5I), tras la digestión con
BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de
ADN-T
pParc5I-\Omega-G4.
El fragmento PCR3 se ligó en el vector
pBluescript (2S2-G4), tras la digestión de
restricción con BglII y HindIII. Esto dio lugar al
vector pBluescript (P35S-"líder"
arc5I-2S2-G4). Se analizó la
secuencia del fragmento PCR3 insertado y se seleccionó un clon con
la inserción correcta para etapas de clonación adicionales.
Finalmente, con el promotor 35S con el "líder" de arc5I
y la secuencia codificadora de G4 se cortó de la construcción
anterior en los sitios de BglII y XBaI y se ligaron al
vector patag5 (3' arc5I), tras la digestión con BglII y
XbaI. Esto dio lugar al vector de ADN-T
pP35S-G4.
El fragmento PCR4 se ligó en el vector
pBluescript (2S2-G4), tras la digestión de
restricción con XhoI y HindIII. Esto dio lugar al
vector pBluescript (P\betaphas-"líder" de
arc5I-2S2-G4). Tras analizar la
secuencia de ADN del fragmento PCR4 insertado, encontramos en el
promotor de faseolina \beta algunos pares de bases que diferían
de la secuencia original (Bustos y col., 1991; número de acceso del
Genbank J01263). Sin embargo, el extremo 3' de la secuencia
promotora clonada, empezando desde el sitio NdeI, era
exactamente igual a la secuencia dada. Por tanto, se cortó este
fragmento, junto con la secuencia codificadora del scFv G4, a
partir del vector pBluescript (P\betaphas-"líder"
arc5I-2S2-G4) usando los sitios de
restricción NdeI y XbaI. Además, se cortó el extremo
5' del promotor de la faseolina \beta a partir de pBluescript
(P\beta-phas) por los sitios de restricción
XhoI y NdeI. Se ligaron ambos fragmentos de ADN en
patag5(3'-arc5I), tras la digestión de
restricción con XhoI y XbaI. Esto dio lugar al vector
final pP\beta-phas-G4. Una vez
más analizamos la secuencia del promotor de la faseolina \beta y
encontramos las mismas diferencias con la secuencia original. La
secuencia entre el sitio XhoI y el sitio NdeI, como
se usa en la construcción se describe en la ID
SEC Nº 5.
SEC Nº 5.
Los cuatro vectores de ADN-T se
purificaron a partir de Escherichia coli y se electroporaron
en Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif^{R} (pMP90). Tras la
purificación de la colonia, se purificaron los plásmidos a partir de
Agrobacterium y se analizaron. En la transformación de
Arabidopsis se usaron cepas de Agrobacterium.
Se transformó Arabidopsis thaliana
(genotipo O de Columbia) por transformación de raíces (Valvekens y
col., 1988) con las construcciones pParc5I-G4,
pParc5I-\Omega-G4,
pP35S-G4 y
pP\beta-phas-G4. Tras la selección
de los callos transformados en medio selectivo con kanamicina, se
transfirieron 150 callos a medio inductor de la germinación.
Finalmente, los brotes se transfirieron a medio inductor de
enraizamiento. Tras la formación de las raíces, las plantas se
transfirieron al semillero y se recogieron las semillas de los
siguientes números de plantas de Arabidopsis transgénicas: 36
para pParc5I-G4, 4 para pP35S-G4,
18 para pP\beta-phas-G4 y 13 para
pParc5I-\Omega-G4.
En paralelo, se usaron las mismas construcciones
para la transformación de Arabidopsis por "inmersión
floral" (Clough y Bent, 1998). Se seleccionaron plantas T1
transformadas en medio selectivo que contiene kanamicina, se
transfirieron al semillero y se recogieron las semillas.
Los extractos crudos de proteínas de semillas se
obtuvieron siguiendo una modificación del protocolo de extracción de
van der Klei y col. (1995) (Goossens y col., 1999). Las semillas
molidas se extrajeron dos veces con hexano para eliminar los
lípidos. El residuo se liofilizó y posteriormente se extrajo dos
veces con Tris/HCl 50 mM, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, Tween 20 al 0,1%,
pH 8 (Fiedler y col., 1997) durante 15 minutos a temperatura
ambiente con agitación continua. Para prevenir la degradación de
las proteínas, se añadió al tampón de extracción una mezcla de
inhibidores de proteasas (2xC\diametermplete^{TM}, Roche
Molecular Biochemicals, Alemania). Se retiró el sedimento por
centrifugación a 20.000 x g y se combinaron los sobrenadantes. La
cantidad de proteína total en los extractos crudos se determinó por
el procedimiento de Lowry usando el ensayo de la proteína DC
(BioRad, Hercules, EE.UU.) con BSA como patrón (Tabla 1). La
fiabilidad de la cuantificación de proteína en semillas de
Arabidopsis por este procedimiento se verificó según
describen Goossens y col., 1999.
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración de proteína total en extractos de semillas transgénicas (500 microlitros) a partir de 10 mg | ||||
| de semillas de Arabidopsis transgénicas. | ||||
| A 1 | A 105 | A 140 | A 143 | A 165A |
| 3.665 | 3.395 | 3.042 | 3.708 | 3.675 |
| \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul |
| P 3A | P 5 | P 15 | P 22A | P 102B |
| 2.852 | 4.028 | 3.623 | 3.151 | 3.339 |
| \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul |
| \Omega 7A | \Omega 33 | \Omega 65C | \Omega 98A | \Omega 130 |
| 3.873 | 3.527 | 3.184 | 3.754 | 3.517 |
| \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul |
| 35S 93 | 35S 101 | 35S 116 | 35S 131A | Col O |
| 3.945 | 3.837 | 3.879 | 3.906 | 3.215 |
| \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul | \mug/\mul |
| Col O = genotipo 0 de Columbia no transformada como control. | ||||
| A = línea de Arabidopsis transformada con pParc5I-G4 | ||||
| P = línea de Arabidopsis transformada con pP\beta-phas-G4 | ||||
| 35S = línea de Arabidopsis transformada con pP35S-G4 | ||||
| \Omega = línea de Arabidopsis transformada con pParc5I-\Omega-G4 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas se separaron en
SDS-PAGE y se determinaron los niveles de
acumulación de scFv-G4 por análisis por
Western-blot cuantitativo usando el anticuerpo
monoclonal anti-c-myc 9E10 (Evan y col.,
1995) seguido de IgG anti-ratón conjugada con
fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), según De Jaeger y
col., 1999 (figura 10). Se usaron como patrones diferentes
cantidades de proteínas scFv-G4 purificadas a
partir de Escherichia coli (De Jaeger y col., 1999). Las
construcciones pParc5I-G4,
pParc5I-\Omega-G4 y
pP\beta-phas-G4 dan niveles
elevados de acumulación de scFv-G4 en semillas de
Arabidopsis, en el intervalo del 10% de proteína total
soluble de la semilla. Estos son los niveles más elevados de
proteínas scFv producidas en plantas que se han documentado. Además,
se encontraron fácilmente líneas con estos elevados niveles a pesar
de que sólo se analizaron 5 líneas para cada construcción, lo cual
es un indicio de que los casetes de expresión no son muy sensibles
al silenciamiento.
| Niveles de acumulación de scFv-G4 en semillas de Arabidopsis transgénicas. | |||||||
| pParc5I-G4 | pP\beta-phas-G4 | pParc5I-\Omega-G4 | pP35S-G4 | ||||
| Línea | Nivel de G4 | Línea | Nivel de G4 | Línea | Nivel de G4 | Línea | Nivel de G4 |
| (*) | (*) | (*) | (*) | ||||
| A 1 | < 4% | P 3A | 10% | \Omega 7A | 12% | 35S93 | <0,8% |
| A 105 | 10% | P 5 | 10% | \Omega 33 | < 4% | 35S | 3% |
| 101 | |||||||
| A 140 | 6% | P 15 | < 4% | \Omega 65C | 6% | 35S | <0,8% |
| 116 | |||||||
| A 143 | 8% | P 22A | 12% | \Omega 98A | < 4% | 35S | <0,8% |
| 131A | |||||||
| A 165A | 8% | P 102B | 12% | \Omega 130 | < 4% | ||
| (*) \begin{minipage}[t]{145mm} nivel de acumulación como % del contenido de proteína total soluble de semillas transgénicas\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Arabidopsis thaliana (genotipo O de
Columbia) se transformó por "inmersión floral)" (Clough y Bent,
1998) con los construcciones pParc5I-G4,
pParc5I-\Omega-G4,
pP35S-G4 y
pP\beta-phas-G4. Se seleccionaron
plantas T1 transformadas en medio selectivo que contenía
kanamicina, se transfirieron al semillero y se recogieron las
variedades de semillas segregadas T2.
La extracción de semillas y la cuantificación de
proteína se determinaron como se describe en el ejemplo 3.
Las proteínas se separaron en
SDS-PAGE y se determinaron los niveles de
acumulación de proteínas scFv-G4 por análisis por
Western-blot cuantitativo usando el anticuerpo
monoclonal anti-c-myc 9E10 (Evan y col.,
1995) seguido de IgG anti-ratón conjugada con
fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), según describen
De Jaeger y col., 1999 (figura 11). Se usaron como patrones
diferentes cantidades de proteínas scFv-G4KDEL
purificadas a partir de Escherichia coli. La mayoría de las
variedades de semillas se analizaron al menos dos veces. Las
construcciones pParc5I-G4 y
pP\beta-phas-G4 dieron niveles de
acumulación de scFv-G4 muy elevados en semillas de
Arabidopsis, en el intervalo de 5-10% y
10%-20% de proteína total soluble de la semilla, respectivamente
(tabla 3). El uso del líder no traducido de arc5I en
pParc5I-G4 o el líder del TMV(omega) en
pParc5I-\Omega-G4 daban niveles de
acumulación similares (tabla 3), mostrando que ambos líderes
permiten un inicio de la traducción eficaz en semillas. Además, la
variación intertransgénica es baja para las cuatro construcciones,
lo cual es una indicación de que los casetes de expresión no son
muy sensibles al silenciamiento. Los extractos de semillas de
cuatros líneas de plantas
pP\beta-phas-G4 con la acumulación
más elevada de G4 mayor se analizaron adicionalmente por
SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (figura
12). Pudo identificarse una banda de proteína scFv clara del tamaño
esperado, que estaba ausente en la línea control sin transformar.
Usando el software ImageMaster VDS (Pharmacia, Uppsala, Suecia) se
midió el porcentaje de scFv en la proteína total soluble de la
semilla en cada carril. Se obtuvieron niveles de acumulación de scFv
similares en los carriles que los obtenidos con el análisis por
inmunotransferencia
cuantitativa.
cuantitativa.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Niveles de acumulación de scFv-G4 en variedades de semillas segregadas T2 de Arabidopsis transgénicas. Se {}\hskip0,2cm analizaron 20 variedades de semillas independientes, los niveles de scFv se clasificaron de mayor a menor. \end{minipage} | |||
| pParc5I-G4 | Pp\beta-phas-G4 | pParc5I-\Omega-G4 | pP35S-G4 |
| (*) | (*) | (*) | (*) |
| 8,0 \pm 1,4 | 20,0 \pm 0,0 | 5,8 \pm 0,4 | 1,1 \pm 0,1 |
| 7,8 \pm 0,4 | 19,0 \pm 1,4 | 4,9 \pm 0,2 | 1,1 \pm 0,1 |
| 6,7 \pm 0,1 | 12,0 \pm 0,0 | 4,5 \pm 0,7 | 1,1 \pm 0,1 |
| 6,4 \pm 0,5 | 11,3 \pm 1,8 | 4,0 \pm 0,0 | 1,0 \pm 0,0 |
| 5,3 \pm 1,8 | 7,2 \pm 0,2 | 3,9 \pm 0,2 | 1,0 \pm 0,0 |
| 4,7 \pm 0,5 | 5,4 \pm 0,9 | 3,9 \pm 0,2 | 0,8 \pm 0,1 |
| 4,5 \pm 0,7 | 5,0 \pm 0,0 | 3,5 \pm 0,2 | 0,7 \pm 0,1 |
| 3,9 \pm 0,2 | 4,5 \pm 0,7 | 3,2 \pm 0,2 | 0,7 \pm 0,1 |
| 3,8 \pm 0,4 | 4,4 \pm 0,5 | 3,1 \pm 0,6 | 0,7 \pm 0,1 |
| 3,7 \pm 0,5 | 4,0 \pm 1,0 | 3,0 \pm 0,0 | 0,7 \pm 0,0 |
| 2,4 \pm 0,5 | 3,9 \pm 0,2 | 3,0 \pm 0,0 | 0,7 \pm 0,1 |
| 1,7 \pm 0,5 | 3,8 \pm 0,3 | 2,7 \pm 0,4 | 0,7 \pm 0,1 |
| 1,3 \pm 0,4 | 1,8 \pm 0,4 | 1,6 \pm 0,4 | 0,6 \pm 0,0 |
| 0,9 \pm 0,2 | 1,8 \pm 0,3 | 1,5 | 0,5 \pm 0,1 |
| 0,8 \pm 0,0 | 1,6 | 1,4 \pm 0,1 | 0,5 \pm 0,0 |
| 0,5 \pm 0,1 | 1,3 | 0,7 \pm 0,0 | 0,4 \pm 0,0 |
| 0,5 \pm 0,1 | 1,2 | 0,6 \pm 0,1 | 0,3 \pm 0,0 |
| 0,4 \pm 0,1 | 0,8 | 0,3 | 0,2 \pm 0,1 |
| <0,3 | <0,4 | 0,2 | 0,1 |
| <0,3 | n.d. | 0,1 | n.d. |
| (*) \begin{minipage}[t]{155mm} nivel de acumulación de scFv como % del contenido de proteína soluble en semillas transgénicas, con desviación típica. n.d. = no se detecta. \end{minipage} | |||
Para cada construcción, se analizaron
genéticamente 10 variedades de semillas T2 que contenían los niveles
de G4 más elevados por análisis de segregación. Se germinaron 72
semillas de cada variedad de semilla en medio selectivo, que
contenía kanamicina e identificamos por análisis estadístico líneas
vegetales que contenían un emplazamiento de ADN-T
único. Para las construcciones pParc5I-G4 y
pP\beta-phas-G4, se eligieron 4
líneas que contenía un emplazamiento de ADN-T único
para cultivar y seleccionar variedades de semillas homocigotas. Se
cultivaron 10 plantas T2 por línea, se recogieron semillas T3 y se
seleccionaron variedades de semillas T3 homocigotas cultivando las
plantas en medios selectivos que contenían kanamicina. No se
encontraron semillas homocigotas de una de las cuatro líneas que
contenían la construcción pParc5I-G4. La acumulación
de G4 se midió por inmunotransferencia cuantitativa en variedades
de semillas T3 segregadas y T3 homocigotas.
La mayoría de las variedades de semillas
homocigotas de pParc5I-G4 y todas las de
pP\beta-phas-G4 daban niveles de
G4 mayores que las correspondientes variedades T3 segregadas (tabla
4). Se obtuvieron variedades de semillas homocigotas tanto para la
construcción pParc5I-G4 como para la
pP\beta-phas-G4 que contenían G4
a más del 10% de la proteína total soluble de la semilla. La
variedad de semilla homocigota, transformada con
pP\beta-phas-G4, contenía niveles
de G4 extraordinariamente elevados, hasta el 36,5% de la PTS en
semillas. Este es el nivel de proteína heteróloga más alto jamás
documentado para plantas.
| Niveles de acumulación de scFv-G4 en variedades de semillas T3 segregadas y homocigotas de Arabidopsis | |||
| Línea vegetal | Variedades de semillas | Variedades de semillas | Variedades de semillas |
| T2 segregadas (*) | T3 segregadas (*) | T3 homocigotas (*) | |
| A1 | 8,0 \pm 1,4 | 8,2 \pm 1,0 | 4,4 \pm 0,8 |
| 6,7 \pm 0,7 | 12,5 \pm 1,9 | ||
| A15 | 4,7 \pm 0,5 | 5,6 \pm 1,0 | 6,4 \pm 1,4 |
| 4,7 \pm 0,0 | 7,7 \pm 1,4 | ||
| A16 | 4,5 \pm 0,7 | 3,8 \pm 0,7 | 6,0 \pm 1,0 |
| 5,1 \pm 1,4 | 3,5 \pm 0,4 | ||
| F3 | 4,5 \pm 0,7 | 5,8 | 18,0 |
| F24 | 5,0 \pm 0,0 | 7,0 \pm 1,4 | 13,5 \pm 2,1 |
| 4,9 \pm 0,2 | 15,0 \pm 1,4 | ||
| F28 | 11,3 \pm 1,8 | 13,0 \pm 1,4 | 21,0 \pm 4,2 |
| 10,5 \pm 0,7 | 18,5 \pm 0,7 | ||
| F38 | 19,0 \pm 1,4 | 17,5 \pm 0,7 | 36,5 \pm 3,4 |
| 17,5 \pm 3,5 | |||
| (*) \begin{minipage}[t]{155mm} Nivel de acumulación de scFv como % del contenido de proteína soluble total en semillas transgénicas, con desviación típica. n.d. = no se detecta. Se analizó para la mayoría de las líneas más de una variedad de T3 segregada y homocigota. A1, A15 y A16 son líneas vegetales transformadas con la construcción pParc5I-G4. Las líneas F3, F28 y F38 se transformaron con pP\beta-phas-G4. \end{minipage} |
Se midió la actividad de unión al antígeno de las
proteínas G4 extraídas de semillas y se comparó por ELISA con G4
extraída de E. coli. Usamos extracto de semillas de la
variedad de semilla "Phas" que contenía G4 al 36,5% (tabla 4).
Se incubaron diferentes cantidades de scFv con el antígeno
dihidroflavonol-4-reductasa en
exceso y se midió el antígeno unido por ELISA de tipo sándwich
(figura 13). Se establecieron curvas de señal de ELISA tanto para
la scFv bacteriana como para la vegetal y se compararon. Las curvas
se superponían entre sí (figura 14), lo que indicaba que la scFv
producida en planta tenía similar actividad de unión al antígeno que
la scFv bacteriana.
Phaseolus acutifolius TB1 se transformó
con pParc5I-G4bis (figura 16).
pParc5I-G4bis contiene el mismo
ADN-T que pParc5I-G4, excepto en que
éste contiene una construcción P35S-GUS adicional
para el análisis de la segregación de las plantas transgénicas.
Para la construcción de este vector de
ADN-T, primero hicimos la construcción piloto
patag6(3'-arc5I) (figura 15) según el
procedimiento de la etapa de clonación usado para
patag5(3'-arc5I) (figura 3). Se creó un
oligonucleótido para insertar algunos sitios de restricción únicos
en el vector de ADN-T patag3 (Goossens y col.,
1999). El oligonucleótido contenía los siguientes sitios de
restricción desde su extremo 5' a su extremo 3': el extremo 5'
"cohesivo" de EcoRI, los sitios de restricción
XbaI, XhoI y BglII y un extremo 3'
"cohesivo" que complementa a XbaI pero que lo destruye
tras el ligamiento. El oligonucleótido se ligó en patag3, tras
cortar con EcoRI y XbaI. Esto dio lugar al vector
patag6. Se analizó la secuencia del oligonucleótido insertado y se
seleccionó un clon con la inserción correcta para etapas de
clonación adicionales. A partir del vector pBluescript
(arc5I) (Goossens y col., 1995), que contenía la secuencia
genómica del gen arc5I, cortamos las señales de expresión 3'
de arc5I (3'-arc5I) usando XbaI y
EcoRI. El fragmento 3' de arc5I se ligó en patag6,
tras cortar con XbaI y EcoRI. Esto dio lugar al
vector patag6 (3'-arc5I). Esta construcción piloto
se usó para hacer pParc5I-G4bis (figura 16). La
secuencia "líder" de arc5I y la secuencia codificadora
de G4 se cortaron a partir del vector pBluescript
(Parc5I-"líder" de
arc5I-2S2-G4) (figura 6) por los
sitios de restricción BglII y XbaI y se ligaron en el
vector patag6 (3'-arc5I) tras la digestión con
BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de
ADN-T pParc5I-G4bis.
Se obtuvieron tres plantas transgénicas usando el
protocolo de Dillen y col. (1997). Como las tres plantas se
regeneraron a partir del mismo callo, se esperaba que fueran clones
del mismo suceso de transformación. Se recogieron semillas y se
hicieron extractos proteicos de estas semillas separadas en el
mismo tampón que para la extracción de semillas de
Arabidopsis y según describen Goossens y col. (1999). La
concentración de proteína total soluble se midió
espectrofotométricamente a 280 nm y se determinó la acumulación de
G4 por inmunotransferencia cuantitativa.
Se detectó G4 como una banda única de proteína
(figura 17) en, por término medio, 3 de 4 semillas de las tres
variedades de semillas segregadas. Por tanto, los más probable es
que estos transformantes contengan un único emplazamiento de
ADN-T. Todas las semillas que acumulaban G4
analizadas contenían G4 al 2-2,5% de la proteína
total soluble o 2-2,5 miligramos de scFv por gramo
de peso fresco de semillas. Hasta ahora, sólo una publicación
informaba de la producción de scFv en una especie de leguminosas.
Perrin y col. (2000) obtuvieron 9 microgramos de scFv por gramo de
peso fresco de semillas de guisantes con el promotor legA.
De este modo, la acumulación con la construcción con el promotor
arc5I es de 200 a 300 veces mayor que los niveles informados
con el promotor legA. Puesto que nosotros sólo obtuvimos una
línea vegetal transgénica, lo más probable es que puedan obtenerse
líneas vegetales con niveles de scFv incluso mayores. Goossens y
col. (1999) ya obtuvieron niveles 4 veces más elevados de proteína
ARC5I en variedades de semillas homocigotas comparadas con
variedades de semillas segregadas y esto bajo el control del mismo
promotor arc5I. Por tanto, tras obtener más líneas
transgénicas y seleccionar líneas homocigotas, esperamos alcanzar
niveles de scFv del 10% en Phaseolus acutifolius, usando
esta construcción con el promotor arc5I.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión de un gen heterólogo en
plantas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GAN/ARC/V064
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 00202278.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-29
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
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<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaseolus vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaseolus vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaatgcatg atc
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1280
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaseolus vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1415
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<212> ADN
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<213> Phaseolus vulgaris
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (7)
1. Un casete de expresión preferida en semillas
que tiene los elementos génicos reguladores que comprende:
- el promotor de la arcelina que comprende la
secuencia mostrada en la ID SEC Nº 1,
- el líder de arcelina 5I mostrado en la ID SEC
Nº 2,
- el péptido señal de almacenamiento de albúmina
2S2 mostrado en la ID SEC Nº 4,
- un gen heterólogo de interés, y
- el extremo 3' de arcelina 5I que comprende la
secuencia mostrada en la ID SEC Nº 3, en el que dicho gen heterólogo
de interés se coloca entre dicha secuencia líder y dicha secuencia
3' de arcelina 5I.
2. Un casete de expresión preferida en semillas
según la reivindicación 1, por medio del cual dicho gen de interés
se fusiona con la secuencia que codifica el péptido señal de
almacenamiento de albúmina 2S2.
3. Un casete de expresión preferida en semillas
según la reivindicación 1 ó 2, por medio del cual el gen heterólogo
de interés codifica un fragmento de Fv de cadena única.
4. Un procedimiento para obtener la expresión
preferida en semillas de una proteína heteróloga, usando un casete
de expresión según cualquiera de las reivindicaciones
1-3, a un nivel de al menos el 10% de la proteína
total soluble de la semilla, a condición de que dicha proteína
heteróloga no sea una proteína de almacenamiento de semillas sin
modificar.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4 en
el que dicho nivel es de al menos el 15% de la proteína total
soluble de la semilla.
6. Una célula vegetal transformada con un casete
de expresión según cualquiera de las reivindicaciones
1-3.
7. Una planta transgénica que comprende un casete
de expresión según cualquiera de las reivindicaciones
1-3.
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