ES2246135A1 - Particulas de microgel polimerico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa. - Google Patents
Particulas de microgel polimerico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa.Info
- Publication number
- ES2246135A1 ES2246135A1 ES200400816A ES200400816A ES2246135A1 ES 2246135 A1 ES2246135 A1 ES 2246135A1 ES 200400816 A ES200400816 A ES 200400816A ES 200400816 A ES200400816 A ES 200400816A ES 2246135 A1 ES2246135 A1 ES 2246135A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- microgel particles
- enzyme
- glucose
- immobilized
- polymeric microgel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 31
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 title claims abstract description 12
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 title abstract description 7
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 title abstract description 7
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 title abstract 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 23
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 14
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 8
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 7
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 claims 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 11
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
Abstract
Partículas de microgel polimérico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa. La presente invención se refiere al diseño de un biosensor para la determinación de glucosa basado en un procedimiento para la inmovilización de la enzima glucosa oxidasa en microgeles poliméricos que consigue mantener la actividad enzimática constante durante largos períodos de tiempo. Comprende el diseño de un biosensor amperométrico de glucosa formado por un electrodo de platino sobre cuya superficie se inmoviliza la capa enzimática que consta de glucosa oxidasa atrapada dentro de microgeles de poli (ácido acrílico/acrilamida), que consiste en las siguientes etapas: - Preparación de la emulsión concentrada acuosa/oleosa con el enzima, monómeros, agente entrecruzante, agente iniciador y tensioactivo. - Polimerización de la emulsión concentrada a temperatura controlada. - Recuperación del producto mediante la separación de fases por centrifugación. - Conservación de las partículas de microgel, refrigeradas a 4ºC. - Preparación del biosensor. Como transductor se utiliza un electrodo de disco de platino. Sobre su superficie se incorporan las micropartículas con glucosa oxidasa en su interior y se fijan mediante una membrana de diálisis. La medida de glucosa se realiza en una celda amperométrica de tres electrodos: como electrodo de trabajo el biosensor, como electrodo de referencia uno de plata cloruro de plata y como electrodo auxiliar uno de platino. La medida se realiza a +0,6 V vs. AgCl/Ag. La corriente obtenida está directamente relacionada con la concentración de glucosa en la muestra.
Description
Partículas de microgel polimérico con glucosa
oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa.
La presente invención se refiere al diseño de un
biosensor para la determinación de glucosa basado en un
procedimiento para la inmovilización de la enzima glucosa oxidasa
en microgeles poliméricos que consigue mantener la actividad
enzimática constante durante largos periodos de tiempo.
Son numerosas las referencias bibliográficas que
describen biosensores amperométricos con sustancias biológicas,
especialmente enzimas, inmovilizadas en el interior de hidrogeles
(Caras, S.D. et al. Anal. Chem. 1985,
57:1920-1923; Birch, M.E. et al. Anal.
Chem. 1990, 62:1123-1130; Shul'ga, A.A. et
al. Sensor. Actuat. B 1992, 10:41-46;
Inoue, T. et al. Polyms. Gels Networks 1997,
5:561-575; Coche-Guerente, L.
Anal. Chem. 2001, 73:3206-3218; Jiménez, C.
et al. Anal.Chim.Acta 1997,
351:169-176).
En muchos casos se prefieren hidrogeles
conductores por facilitar la transferencia electrónica entre el
enzima y el transductor (Schuhmann, W., Rev. Mol. Biotech.
2002, 82:425-441; Brahim, S. et al.
Biosens. Bioelectron. 2002, 17:53-59; Brahim,
S. et al. Biosens. Bioelectron. 2002,
17:973-981; Gaspar, S. et al. Electrochim.
Acta 2000, 46(2-3):
255-264; Larsson, N. et al. Electrochim.
Acta 1998, 43(23):3541-3554).
Muchos de estos sistemas de inmovilización no
sólo han sido empleados en el desarrollo de biosensores, también
han tenido gran repercusión en la fabricación de biorreactores
(Santano, E. et al. 2002, Enzyme Microb. Tech. 2002,
30:639-646), en la industria alimentaria (Bryjak,
J., Biochem. Eng. J. 2003, 16:347-355), como
vehículos para vacunas (Suckow, M.A. et al. J. Control.
Release 2002, 85:227-235). En los biosensores
amperométricos modernos se observa una tendencia a inmovilizar el
material biológico en el interior de sistemas micelares (Peña, N.
et al. Anal. Chem. 2001, 73:1190-1195;
Val, I. et al. J. Mol. Catal. B 1998,
4:137-147; Kriwet, B. et al. J. Control.
Release 1998, 56:149-158), de micro y
nanopartículas (Rodriguez, M. C. et al. Anal. Chim.
Acta 2002, 549:43-5; Mecerreyes, D. et
al. Adv. Mater. 2001, 13:204-208; Chen,
X-Y. et al. Biochem. Bioph. Res. Co.
1998, 245:352-355) y más recientemente de microgeles
(Val, I, Otero,C., 1998; Loxley, A. Vincent B., Colloid. Polym.
Sci. 1997, 275:1108-1114), debido, en todos los
casos, a las ventajas que la gran superficie especifica aporta a la
aplicación práctica. Muchos de estos sistemas se preparan a partir
de polímeros gelificados (Coppi, G. et al. Intern. J.
Pharm. 2002, 242:263-266), método que facilita
la preparación de los geles. No obstante, este sistema de
gelificación produce sistemas coloidales que se alteran y degradan
con facilidad.
La presente invención incorpora los microgeles
de poliacrilamida/poli(ácido acrílico) como sistemas de
inmovilización de enzimas y su aplicación al diseño de biosensores
amperométricos por presentar además de las ventajas inherentes a
los hidrogeles, entre las que destacan el control del tamaño de
poro, otras de gran interés como son la fácil manipulación de este
material biológico, su gran estabilidad, inusual hasta el momento y
la eliminación de interferencias producidas por sustancias de
carácter amónico y habitualmente presentes en medios biológicos.
El método de inmovilización de enzimas en
microgeles, que se propone en esta invención, destaca frente a los
anteriores métodos de inmovilización por su extraordinaria
estabilidad. Estos microgeles, transcurridos tres meses, presentan
la misma actividad enzimática y, como consecuencia, originan la
misma respuesta analítica en el biosensor amperométrico. Los
biosensores más estables hasta ahora descritos, como el propuesto
por Wang (Wang, S.G. et al. Electrochem. Comm. 2003,
5:800-803), transcurrido un mes presentaron un
96,3% de su actividad inicial y tras tres meses de su preparación
la actividad enzimática descendió al 91,2% de la inicial.
La incorporación de ácido acrílico, como
monómero, junto con lo acrilamida incorpora una carga negativa a
los microgeles resultantes que eliminan las interferencias causas
por sustancias de carácter amónico presentes en medios biológicos
(Rubio Retama, J. et al. Biomaterials 2003,
24:2965-2973).
Las nuevas e importantes aportaciones del método
que se presenta sobre lo ya conocido son la mayor selectividad, la
mencionada estabilidad y la sencilla preparación y manipulación de
las micropartículas con el enzima en su interior, característica muy
útil para diseñar biosensores de fácil comercialización.
Partículas de microgel polimérico con glucosa
oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de inmovilización de enzima glucosa oxidasa sobre
microgeles poliméricos y su uso como material biológico de un
biosensor que permite medir glucosa discriminándola del ácido úrico
y del ácido ascórbico.
El biosensor se prepara con partículas de
microgel compuestas por poli(ácido acrílico) y poliacrilamida en
proporción 1:1 en peso y
NN'-metilen-bisacrilamida como
agente reticulante. La inclusión de la enzima en el interior de los
microgeles se realiza mediante polimerización desde una emulsión
concentrada acuosa/oleosa.
La fase continua oleosa está formada por una
mezcla de dodecano y Span80. Para obtener la fase dispersa se
utiliza una disolución tampón de fosfato de sodio de concentración
0,05 M en la cual se disuelven los monómeros de acrilamida, ácido
acrílico y agente entrecruzante
NN'-metilen-bisacrilamida. Se añade
persulfato de amonio como agente iniciador, con el fin de eliminar
el oxígeno disuelto se somete la mezcla a burbujeo con nitrógeno.
Finalmente se incorpora la enzima en cantidades comprendidas entre
10 y 100 mg\cdot mL^{-1}. La emulsión concentrada se forma
inyectando la fase acuosa gota a gota sobre la fase oleosa.
Una vez conseguida la emulsión concentrada, de
aspecto lechoso, para que comience la polimerización se añade al
sistema
NNN'-trimetil-etilen-diamina
que actúa como acelerador de la reacción. Se controla la
temperatura de polimerización para asegurarse de que no se
sobrepasa la temperatura de desnaturalización de la enzima. El
sistema se mantiene en agitación hasta completar la
polimerización.
Las partículas de gel se extraen precipitándolas
con una disolución tampón fosfato y centrifugando posteriormente.
Finalmente, las partículas se liofilizan y se conservan en cámara
frigorífica.
Las enzimas así inmovilizadas mantienen su
actividad constante durante largos períodos de tiempo, permitiendo
su uso como material biológico para la preparación de
biosensores.
Para facilitar la comprensión de las
características de la invención y formando parte de esta memoria
descriptiva se acompañan una serie de figuras que representan lo
siguiente:
La Figura 1 muestra una micrografía de las
partículas de microgel con la enzima glucosa oxidasa inmovilizada
en su interior.
La Figura 2 muestra el esquema de un biosensor de
glucosa con partículas de microgel con glucosa oxidasa como
material biológico, donde 1 es el contacto eléctrico, 2 el soporte
de teflón, 3 el electrodo de platino, 4 la membrana de diálisis y 5
las micropartículas con GOx.
En la Figura 3 se representa la respuesta del
biosensor amperométrico, preparado con micropartículas de
poli(ácido acrílico)/poliacrilamida, frente a la concentración de
glucosa.
La Figura 4 muestra la respuesta del biosensor
con micropartículas de poliacrilamida (A) y del biosensor con
micropartículas de ácido acrílico y poliacrilamica (B) frente a la
glucosa y a posibles interferentes como el ácido úrico y ascórbico.
Se observa como en el segundo caso los interferentes no generan
señal.
En la figura 5 se representa la respuesta del
biosensor a la glucosa a lo largo de un periodo de tres meses tras
su preparación.
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos a su
alcance.
En este ejemplo se describe la inmovilización de
la enzima, que se lleva a cabo por polimerización desde una
emulsión concentrada acuosa/oleosa.
La fase acuosa se obtiene empleando una
disolución tampón, pH 7,2 de fosfato de sodio 0,05 M en la cual se
disuelven los monómeros de acrilamida 1,75 M, ácido acrílico 1,75 M
y agente entrecruzante
NN'-metilen-bisacrilamida 3,25%; se
añade persulfato de amonio 11 mM, como agente iniciador. La mezcla
se somete a burbujeo de nitrógeno y se incorpora, como enzima, 50
mg\cdotmL^{-1} de glucosa oxidasa.
Para obtener la emulsión concentrada se inyecta
la fase acuosa gota a gota sobre la fase oleosa, formada por una
mezcla de Dodecano y Span80. La emulsión resultante contiene un
13,89% de fase oleosa y un 86,11% de fase acuosa.
En la tabla se muestra la composición de las
fases oleosa y acuosa de la emulsión concentrada utilizada para
inmovilizar la enzima en el interior de los microgeles.
Se añade a la emulsión concentrada anterior
NNN'-trimetil-etilen-diamina,
que actúa como catalizador, y se mantiene el sistema en agitación
durante 60 minutos (tiempo suficiente para completar la
polimerización) a una temperatura inferior a la de
desnaturalización de la enzima.
Las micropartículas del gel obtenido se extraen
mediante precipitación con una disolución tampón fosfato 0,05M, pH
7,2, y centrifugando a 500 r.p.m.
Las micropartículas se liofilizan y se conservan
en cámara frigorífica a 4°C.
Las micropartículas así obtenidas están
compuestas por poli(ácido acrílico) y poliacrilamida en proporción
1:1 en peso con
NN'-metilen-bisacrilamida como
agente reticulante en cuyo interior se ha inmovilizado la enzima
glucosa oxidasa. La forma de las partículas es esférica y sus
dimensiones varían entre 0,5 \mum y 12 \mum (Figura 1).
El biosensor consta de un transductor (electrodo
de disco de platino) y material biológico (partículas de microgel
compuestas por poli(ácido acrílico) y poliacrilamida con glucosa
oxidasa en su interior, obtenidas según el ejemplo 1, fijadas a la
superficie del electrodo mediante una membrana de diálisis. El
esquema del biosensor se muestra en la Figura 2.
En la Figura 3 se muestra la respuesta del
biosensor en función de la concentración de glucosa. Se observa que
dicha respuesta se ajusta a un comportamiento
Michaelis-Menten, indicando que la matriz
polimérica protege a la enzima sin influir en su cinética y
actividad enzimática.
Por otro lado, la composición 1:1
poliacrilamida/poli(ácido acrílico) confiere a las micropartículas
del gel carga negativa. Esta carga negativa impide la aproximación a
la superficie del electrodo de especies con carga negativa neta,
como el ácido ascórbico y ácido úrico que, al potencial de lectura
(+0,6 V), darían una señal de corriente no deseada. En la Figura 4
se muestra cómo la carga negativa que confiere el poli(ácido
acrílico) al microgel elimina las interferencias que originaban el
ácido ascórbico y ácido úrico cuando se utilizan partículas de
microgel sin carga.
El estudio cuantitativo de la estabilidad de los
microgeles descritos en el ejemplo 1 se realizó empleando el
biosensor amperométrico del ejemplo 2. La respuesta del biosensor a
una misma concentración de glucosa, permanece constante durante al
menos 120 días, constatándose que las micropartículas liofilizadas
mantienen su morfología y su actividad enzimática al menos tres
meses después de su preparación, según muestra la Figura 5.
Claims (14)
1. Partículas de microgel polimérico con enzima
inmovilizada en su interior, caracterizadas porque contienen
poliacrilamida y poli(ácido acrílico) en proporción 1:1, agente
entrecruzante
NN'-metilen-bisacrilamida al 3,25% y
en cuyo interior se ha inmovilizado la enzima glucosa oxidasa.
2. Partículas de microgel polimérico con enzima
inmovilizada en su interior, según reivindicación 1,
caracterizadas por poseer forma esférica y tamaños entre 0,5
\mum y 12 \mum.
3. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior descritas en las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas: (1) preparación de una emulsión concentrada
acuosa/oleosa que contiene la enzima glucosa oxidasa, (2)
polimerización de la emulsión concentrada, (3) recuperación del
producto y (4) conservación de las partículas de microgel.
4. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicación 3, caracterizado porque la fase oleosa está
formado por una mezcla de dodecano (75%v/v) y Span80 (25% v/v).
5. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicación 3, caracterizado porque la fase acuosa
contiene acrilamida 1,75 M, ácido acrílico 1,75 M,
NN'-metilen-bisacrilamida 3,25%,
disolución tampón fosfato 0,05M, pH 7,2 y enzima glucosa oxidasa en
cantidades comprendidas entre 10 y 100
mg-mL^{-1}.
6. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicaciones 3, 4 y 5, caracterizado porque la
preparación de la emulsión concentrada acuosa/oleosa se realiza
inyectando la fase acuosa gota a gota sobre la fase oleosa.
7. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicación 3, 4, 5 y 6, caracterizado porque utiliza una
emulsión concentrada acuosa/oleosa que contiene un 13,89% de fase
oleosa y un 86,11% de fase acuosa.
8. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicación 3, caracterizado porque la polimerización se
realiza utilizando como catalizador
NNN'-trimetil-etilen-diamina
(1,25% v/v) y controlando al temperatura para evitar la
desnaturalización de la enzima.
9. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicación 3, caracterizado porque la recuperación del
producto se realiza mediante la separación de fases por
centrifugación.
10. Método de obtención de partículas de microgel
polimérico con enzima inmovilizada en su interior, según
reivindicación 3, caracterizado porque las partículas se
liofilizan antes de conservarse en cámara frigorífica.
11. Uso de las partículas de microgel polimérico
con enzima inmovilizada en su interior descritas en las
reivindicaciones 1 y 2, como biosensor de glucosa.
12. Uso de partículas de microgel polimérico con
enzima inmovilizada en su interior, según reivindicación 11, donde
el biosensor consta de un electrodo de disco de platino como
transductor.
13. Uso de partículas de microgel polimérico con
enzima inmovilizada en su interior, según reivindicaciones 11 y 12,
donde el biosensor discrimina la señal de glucosa de la del ácido
úrico por poseer las partículas carga superficial negativa.
14. Uso de partículas de microgel polimérico con
enzima inmovilizada en su interior, según reivindicaciones 11 y 12,
donde el biosensor discrimina la señal de glucosa de la del ácido
ascórbico por poseer las partículas carga superficial negativa.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400816A ES2246135B1 (es) | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Particulas de microgel polimerico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400816A ES2246135B1 (es) | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Particulas de microgel polimerico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2246135A1 true ES2246135A1 (es) | 2006-02-01 |
| ES2246135B1 ES2246135B1 (es) | 2006-11-01 |
Family
ID=35875082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200400816A Expired - Fee Related ES2246135B1 (es) | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Particulas de microgel polimerico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2246135B1 (es) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110183692A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-30 | 苏州柏特瑞新材料有限公司 | 一种三维交联可溶的聚合物微凝胶及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU958950A1 (ru) * | 1981-02-05 | 1982-09-15 | 1-Й Ленинградский Медицинский Институт Им.Акад.И.П.Павлова | Способ изготовлени ферментного электрода |
| GB2215335A (en) * | 1988-03-04 | 1989-09-20 | Shell Int Research | Microgel immobilised enzymes |
-
2004
- 2004-04-02 ES ES200400816A patent/ES2246135B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU958950A1 (ru) * | 1981-02-05 | 1982-09-15 | 1-Й Ленинградский Медицинский Институт Им.Акад.И.П.Павлова | Способ изготовлени ферментного электрода |
| GB2215335A (en) * | 1988-03-04 | 1989-09-20 | Shell Int Research | Microgel immobilised enzymes |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| [en linea] [recuperado el 19.12.2005] Recuperado de: EPO WPI Database, DW 198331, n‘ acceso 1983-727063 [31] & SU 958950 A1 (LENGD PAVLOV MED INST-MED LAB TECHN RES DES) 25.09.1982, (resumen) * |
| RUBIO RETAMA, J. et al. Microstructural modifications induced by the entrapped glucose oxidase in cross-linked polyacrylamide microgels used as glucose sensors. Biomaterials, 24, (2003), paginas 2965-2973. * |
| RUBIO RETAMA, J. et al. Microstructural modifications induced by the entrapped glucose oxidase in cross-linked polyacrylamide microgels used as glucose sensors. Biomaterials, 24, (2003), páginas 2965-2973. * |
| WANG, S.G. et al. Multi-walled carbon nanotubes for the immobilization of enzyme in glucose biosensors. Electrochem. Comm., 5, (2003), paginas 800-803. * |
| WANG, S.G. et al. Multi-walled carbon nanotubes for the immobilization of enzyme in glucose biosensors. Electrochem. Comm., 5, (2003), páginas 800-803. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110183692A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-30 | 苏州柏特瑞新材料有限公司 | 一种三维交联可溶的聚合物微凝胶及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2246135B1 (es) | 2006-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Plamper et al. | Functional microgels and microgel systems | |
| Li et al. | Rational design and applications of conducting polymer hydrogels as electrochemical biosensors | |
| Nilsson et al. | The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes | |
| Liu et al. | Organic–inorganic nanoflowers: from design strategy to biomedical applications | |
| Park et al. | Recent progress in bio-sensing techniques with encapsulated enzymes | |
| Liu et al. | Affinity and enzyme-based biosensors: recent advances and emerging applications in cell analysis and point-of-care testing | |
| Chen et al. | Organically modified sol‐gel/chitosan composite based glucose biosensor | |
| Guiseppi‐Elie et al. | Enzyme microgels in packed‐bed bioreactors with downstream amperometric detection using microfabricated interdigitated microsensor electrode arrays | |
| Arica | Epoxy‐derived pHEMA membrane for use bioactive macromolecules immobilization: Covalently bound urease in a continuous model system | |
| Sung et al. | A glucose oxidase electrode based on polypyrrole with polyanion/PEG/enzyme conjugate dopant | |
| Gabrovska et al. | Immobilization of urease on nanostructured polymer membrane and preparation of urea amperometric biosensor | |
| CN104267192A (zh) | 检测凝血酶用生物电化学传感器其制备方法及应用 | |
| Fernández-Lucas et al. | Magnetic chitosan beads for covalent immobilization of nucleoside 2′-deoxyribosyltransferase: application in nucleoside analogues synthesis | |
| Das et al. | Enzyme entrapped inside the reversed micelle in the fabrication of a new urea sensor | |
| Stasyuk et al. | A new bi-enzyme potentiometric sensor for arginine analysis based on recombinant human arginase I and commercial urease | |
| Kundu et al. | Preparation and characterization of glucose oxidase nanoparticles and their application in dissolved oxygen metric determination of serum glucose | |
| Wang et al. | Stimuli‐Responsive Self‐Degradable DNA Hydrogels: Design, Synthesis, and Applications | |
| JPH0416156B2 (es) | ||
| Guo et al. | Flexible enzyme cascade sensing platform based on a G-quadruplex nanofiber biohydrogel for target colorimetric sensing | |
| ES2246135B1 (es) | Particulas de microgel polimerico con glucosa oxidasa inmovilizada y su uso como biosensor de glucosa. | |
| Vasileva et al. | Study on the behaviour of glucose oxidase immobilized on microfiltration polyamide membrane | |
| Kutorglo et al. | Carboxyethyl-functionalized 3D porous polypyrrole synthesized using a porogen-free method for covalent immobilization of urease | |
| Ramon-Marquez et al. | Evaluation of different functional groups for covalent immobilization of enzymes in the development of biosensors with oxygen optical transduction | |
| Quan et al. | A Nitrite Biosensor Based on Coimmobilization of Nitrite Reductase and Viologen‐Modified Polysiloxane on Glassy Carbon Electrode | |
| Nigam et al. | Dendrimers based Electrochemical Biosensors. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20060201 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2246135B1 Country of ref document: ES |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20240426 |