ES2246134B1 - Sensor molecular fluorescente aplicable a la determinacion cuantitativa de la actividad del enzima fosfatasa alcalina. - Google Patents
Sensor molecular fluorescente aplicable a la determinacion cuantitativa de la actividad del enzima fosfatasa alcalina.Info
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Abstract
El nuevo sensor molecular fluorescente desarrollado se aplica a la determinación cuantitativa de la actividad de fosfatasa alcalina en medios bioquímicos. Su interés técnico reside en el cambio de fluorescencia producido en presencia de enzima que da lugar a una variación en el máximo de emisión de alrededor de 100 nm. La absorbancia de esta sonda molecular se sitúa en una zona espectral muy ancha (250-450 nm), lo que permite utilizar cualquier tipo de irradiación para detectar la presencia de enzima con este sensor. El cambio producido es observable incluso a simple vista, con un cambio de color en presencia de concentraciones de enzima nanomolares. El sensor propuesto puede ser utilizado en Bioquímica, Biofísica y Biotecnología con la posibilidad de determinar la actividad endógena del enzima en células y tejidos. Dada la elevada sensibilidad del nuevo sensor podrán realizarse estudios en Inmunohistoquímica, Citología y Biomedicina.
Description
Sensor molecular fluorescente aplicable a la
determinación cuantitativa de la actividad del enzima fosfatasa
alcalina.
Analítica en Bioquímica, Biofisica,
Biotecnología, Inmunohistoquímica, Biomedicina, etc.
La patente de invención, objeto de la presente
memoria, se refiere al desarrollo de un nuevo sensor molecular
aplicable a la determinación cuantitativa del enzima fosfatasa
alcalina. A continuación se da cuenta de los antecedentes existentes
sobre el empleo de sensores con fines similares.
La Biotecnología moderna ha logrado sus mayores
éxitos en el área de la salud humana a través de la aplicación de
microorganismos, enzimas y sensores enzimáticos en diagnosis,
terapias, transplantes de tejidos y células, etc. Muchos de estos
métodos son aplicables también en el área de Biotecnología de
alimentos, porque permiten detectar la presencia de patógenos
contaminantes, enzimas, células o anticuerpos, garantizando así la
seguridad de las materias primas y de los productos terminados. En
ambas áreas el uso de enzimas ha ido creciendo sin parar en los
últimos 25 años.
Las células utilizan una gran variedad de
ésteres de fosfato y polifosfato como sustratos de enzimas,
segundos mensajeros, componentes estructurales de membranas y para
almacenar energía. Además, las reacciones de fosforilación y
defosforilación están envueltas en la regulación del reconocimiento
biológico molecular y afectan de manera importante a la
proliferación celular y al reconocimiento
proteína-proteína, dan lugar a importantes cambios
conformacionales y alteran la dinámica de biopolímeros. Estos
procesos están catalizados por varias fosfatasas y kinasas. Un
modelo químico de éstas y otras enzimas en el reconocimiento
molecular debe obtener buenos resultados en aplicaciones
potenciales en la distribución de drogas en lugares específicos.
El enzima fosfatasa alcalina es una
fosfomonoesterasa localizada en células procariotas y eucariotas
capaz de catalizar la hidrólisis y la trans fosforilación de una
gran variedad de monoésteres de fostato. La reacción enzimática
transcurre a través de un intermediario de fosfato de serina
covalente para producir fósforo inorgánico y el correspondiente
alcohol orgánico, su actividad se puede determinar en función de la
cantidad de alcohol generada. La importancia biológica de este
enzima reside en que las variaciones de su actividad en suero
humano dan información sobre gran variedad de estados de enfermedad
(N. Sträter, W. N. Lipscomb, T. Klabunde, and B. Krebs, Angew.
Chem. Int Ed. Engl., 35, 2024-2055
(1996)). Se utiliza para evaluar problemas o alteraciones
del hígado y es muy sensible, sobre todo, en problemas de
obstrucción de las vías biliares El enzima ha sido utilizado
también en Biología Molecular (marcaje de DNA) y se ha estudiado
también la transferencia de energía fotoinducida desde los residuos
de triptófano fosforescentes presentes en la proteína al terbio
ligado (B. D. Schlyer, D. G. Steel, A. Gafni, J. Biol. Chem.
270, 22890 (1995); S. Ghosh, A. Misra, A. Ozarowski, A. H.
Maki, J. Phys. Chem. 107, 11520-11526,
(2003)).
Sería por tanto deseable la valoración de la
actividad de fosfatasa alcalina en medios químicos y biológicos.
Uno de los métodos de mayor interés para la valoración de la
actividad enzimática se basa en el uso de sensores químicos. Estos
compuestos responden a la presencia de las especies a analizar de
distintas maneras pero los más convincentes y sensibles, son los
basados en el cambio de propiedades ópticas (absorbancia,
fluorescencia, fosforescencia, difracción, etc.) (ver, por ejemplo,
las siguientes citas: J. Janta, Principles of Chemical
Sensors (Plenum, New York, 1989)); Molecular
Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,
Eds. R. P. Haugland y M. T. Z. Spence, ninth edition (2003);
Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent
precipitates; US patent number 5,316,906; John H. Holtz y Sanford
A. Asher, Nature, 389, 829-832
(1997).
Por todo ello, se utilizará la fluorescencia
como herramienta analítica para el estudio de las características
físico-químicas de medios biológicos. Uno de los
principales problemas que se presentan a la hora de analizar los
datos de fluorescencia obtenidos es discernir entre la emisión de
la sonda molecular libre en el medio y la emisión de la sonda
incluida en el entorno biológico a estudiar, que es precisamente la
que porta la información sobre las características estructurales de
dicho entorno. Este problema se puede resolver si la sonda
molecular en el interior del medio biológico (células, tejidos
celulares, etc.) adopta una estructura diferente que en el exterior.
En el caso de los enzimas que hidrolizan de modo eficaz y
específico grupos fosfato en material biológico del interior
celular, la emisión de la sonda situada en el mismo lugar que el
fosfato deberá ser diferente de la emisión de la misma sonda, pero
en el exterior celular.
Nos centraremos, por tanto, en el desarrollo de
un nuevo sensor molecular que permita valorar sin dificultad la
actividad de fosfatasa alcalina en medios bioquímicos a partir del
cambio producido en sus propiedades ópticas en presencia del
enzima.
\newpage
El sensor molecular fluorescente desarrollado es
el fosfato de 7-hidroxiquinoleína (FQ). Esta
molécula es aplicable a la determinación cuantitativa de la
actividad enzimática de fosfatasa alcalina y otros enzimas con
similar actividad hidrolítica en medios bioquímicos.
Su interés reside en los apreciables cambios que
experimenta su fluorescencia en presencia de trazas del enzima, con
variaciones de la posición del máximo de emisión típicamente desde
430 nm hasta aproximadamente 520 nm. Además, la sonda absorbe luz
en una zona espectral muy ancha, que puede ir desde 250 nm hasta 450
nm, e incluso hasta mayores longitudes de onda, dependiendo de los
sustituyentes, lo que permite emplear en el análisis fuentes de
irradiación muy diversas. La hidrólisis enzimática puede ser
estudiada también a través de espectroscopia de absorción, porque
el producto obtenido tras la hidrólisis tiene un espectro muy
diferente del de partida apareciendo una banda de absorción con un
máximo a 400 nm. De hecho, este cambio se puede incluso observar a
simple vista, con el cambio de color de la disolución de incolora a
amarillo-verdosa tras la adición concentraciones
nanomolares del
enzima.
enzima.
El nuevo sensor molecular (FQ) es un sustrato de
fosfatasa alcalina y presenta una serie de propiedades que suponen
importantes ventajas con respecto a otros utilizados a tal fin. La
intensidad de la fluorescencia puede ser medida de una forma
simple, limpia y segura con medidas normalmente no destructivas, con
lo que se puede calcular con facilidad, previo calibrado, la
concentración de fosfatasa presente en el medio.
La presente patente de invención se ilustra
adicionalmente mediante los siguientes 4 ejemplos, los cuales no
pretenden ser limitativos de su alcance.
Las variaciones de los espectros de absorción y
fluorescencia que suceden durante la hidrólisis de FQ catalizada
por fosfatasa alcalina se muestran en las figuras 1 y 2. Las
medidas de fluorescencia y de absorbancia deberán realizarse
inmediatamente después de preparar la disolución de sustrato de
concentración conocida para evitar en la medida de lo posible la
hidrólisis de los sustratos de fosfato que se produce
espontáneamente en disolución acuosa.
Las disoluciones de FQ y sus derivados se
realizaron en un tampón de pH 8.3 (tampón de defosforilación 10x
para fosfatasa alcalina: 10 mM ZnCl_{2},1 mM ZnCl_{2}, 100 mM
Tris.Cl) donde el enzima fosfatasa alcalina posee una actividad
óptima. En los experimentos realizados se emplearon concentraciones
de sustrato del orden de 10^{-4} M. Mediante un criostato se
mantuvo constante la temperatura de las muestras a 37ºC debido a
que ésta es la temperatura a la cual el enzima posee el máximo de
actividad.
Los datos sobre el enzima utilizado se
especifican a continuación: Fosfatasa alcalina (Sigma Chemical CO)
procedente de la mucosa intestinal bovina en suspensión 3.2 M de
(NH_{4})_{2}SO_{4} a pH 7 y estabilizado con 1 mM
MgCl_{2} y 0.1 mM ZnCl_{2}. Una unidad hidrolizará 1.0
micromoles de p-nitrofenilfosfato por minuto a pH
9.8 y a 37ºC. A partir de aquí, realizamos una disolución tamponada
de enzima que contiene 25 microlitros del enzima madre en 4 ml de
tampón de pH 8.3. En los experimentos realizados utilizamos 10
microlitros de esta disolución tamponada en 3 ml de disolución, lo
cual corresponde a una concentración de fosfatasa alcalina de 2.2 x
10^{-9} M.
Los espectros de absorción de la sonda molecular
FQ, muestran un máximo alrededor de 330 nm. Tras la adición del
enzima en concentración nanomolar, se observa que el máximo decrece
en este punto, apareciendo una banda de absorción a 400 nm
correspondiente a la molécula hidrolizada, la cual aumenta
sensiblemente su intensidad a lo largo del tiempo (en la figura 1
se muestra el cambio producido en el espectro de absorción de la
molécula FQ una hora después de la adición de fosfatasa alcalina de
concentración 2.2 x 10^{-9} M).
La figura 2 muestra los espectros de emisión de
FQ excitando a 330 (A) y a 400 nm (B) y los cambios producidos tras
la adición del enzima. Si excitamos a 330 nm la molécula FQ muestra
una banda a 430 nm que disminuye perceptiblemente de intensidad al
añadir el enzima apareciendo una nueva banda alrededor de 520 nm que
aumentará progresivamente de intensidad a lo largo del tiempo, a
medida que sucede la reacción de hidrólisis. Los espectros se
realizaron con intervalos de tiempo de 1 minuto. La banda a 520 nm,
que se observa más claramente cuando excitamos la muestra a 400 nm,
corresponde a la molécula hidrolizada.
En la figura 3 se muestra la influencia de la
concentración del sustrato FQ sobre la reacción de hidrólisis
catalizada por fosfatasa alcalina manteniendo la concentración de
enzima constante a 2.2 x 10^{-9} M y variando la concentración del
sustrato FQ desde 0.9 hasta 6.5 x 10^{-4} M. Se representa la
intensidad de fluorescencia frente al tiempo excitando a 400 nm y
observando la emisión a 520 nm. Se puede apreciar que a medida que
aumenta la concentración de sustrato la reacción de hidrólisis de FQ
se produce en mayor medida.
El sustrato reacciona con la muestra de enzima y
la fluorescencia resultante del producto hidrolizado es medida en
un fluorímetro para la cuantificación de la actividad enzimática.
Así, la actividad de la fosfatasa alcalina puede ser determinada en
disolución mediante el uso de una determinada concentración de
sustrato. Existe una buena linearidad entre la fluorescencia
resultante de la hidrólisis del producto y la actividad de la
fosfatasa alcalina cuando se utilizan concentraciones de enzima
nanomolares. Esta linearidad es entonces utilizada como curva
standard para la determinación de la actividad enzimática (Figura
4).
Se ha probado la estabilidad de la sonda frente
a la hidrólisis espontánea del grupo fosfato realizando los
espectros de absorción y de emisión después de transcurridas 1, 2 y
24 horas de la preparación de la muestra (figuras 5A y 5B). Los
resultados muestran que a penas se produce variación transcurridas
una o dos horas aunque al cabo de 24 horas la hidrólisis ya empieza
a ser apreciable.
Figura 1. Espectros de absorción
ultravioleta-visible de la molécula FQ en tampón de
pH 8.3 en ausencia de fosfatasa alcalina (línea continua) y una hora
después de la adición de una concentración de enzima de 2.2 x
10^{-9} M (línea discontinua). Las flechas muestran el sentido de
la variación del espectro de FQ tras la adición de fosfatasa
alcalina a la disolución.
Figura 2. Variación de los espectros de emisión
de FQ en tampón de pH 8.3 tras la adición de una concentración de
enzima 2.2 x 10^{-9} M excitando a 330 nm (A) y a 400 nm (B). Los
espectros se realizaron en intervalos de tiempo de 1 minuto. Las
flechas indican el sentido de variación de los espectros de emisión
de FQ con el tiempo tras la adición de enzima. T = 37ºC.
Figura 3. Representación de la variación de la
intensidad de fluorescencia frente al tiempo tras la adición de
fosfatasa alcalina 2.2 x 10^{-9} M a diferentes concentraciones
del sustrato FQ en tampón de pH 8.3. La longitud de onda de
excitación fue de 400 nm y la de observación de 520 nm. T =
37ºC.
Figura 4. Representación de la variación de la
intensidad de fluorescencia frente a las unidades de enzima
añadidas a una muestra de FQ en tampón de pH = 8.3 con una
concentración del orden de 10^{-4} M. Se midieron las variaciones
de intensidad de fluorescencia a los 5 minutos de la adición del
enzima. T = 37ºC.
Figura 5. Espectros de absorción
ultravioleta-visible (A) y de emisión (B) de una
muestra de FQ en tampón de pH = 8.3 transcurridas 0, 1, 2 y 24 horas
de la preparación de la muestra. Las flechas indican el sentido en
el que se produce la variación de intensidad de absorbancia o de
emisión con respecto al tiempo.
La síntesis de esta sonda molecular se consigue
con facilidad a través de la fosforilación del grupo hidroxilo en
la molécula de 7-hidroxiquinoleína, siguiendo
esencialmente condiciones ya descritas para obtener la molécula FQ
(Takaku, Chem. Pharm. Bull., 25, 2121 (1977)).
Los datos de FQ se dan a continuación:
Microanálisis para C_{9}H_{8}NO_{4}P (225):
C: 45.13, H: 4.04, N: 5.85, P: 12.93;
encontrado:
C: 45.06, H: 3.52, N: 6.17, P: 13.00.
Fluorescencia: Máximo a 430 nm.
UV/Vis: \lambda_{max} (\varepsilon)= 330
nm (765 M^{-1}cm^{-1}); 318 nm (2371 M^{-1}cm^{-1}).
Dada la elevada sensibilidad del nuevo sensor
podrán realizarse estudios en Inmunohistoquímica, Citología y
Biomedicina.
Claims (1)
1. Sensor molecular fluorescente aplicable a la
determinación cuantitativa de la actividad del enzima fosfatasa
alcalina en medios bioquímicos que se caracteriza por la
variación de sus propiedades ópticas en presencia del enzima y
comprende el monoéster de fosfato de la molécula
7-hidroxiquinoleína denominado fosfato de
7-hidroxiquinoleína (FQ).
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|---|---|---|---|
| ES200400814A ES2246134B1 (es) | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Sensor molecular fluorescente aplicable a la determinacion cuantitativa de la actividad del enzima fosfatasa alcalina. |
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| ES200400814A ES2246134B1 (es) | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Sensor molecular fluorescente aplicable a la determinacion cuantitativa de la actividad del enzima fosfatasa alcalina. |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| US5316906A (en) * | 1991-08-23 | 1994-05-31 | Molecular Probes, Inc. | Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates |
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- 2004-04-02 ES ES200400814A patent/ES2246134B1/es not_active Expired - Fee Related
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