ES2237285B2 - Procedimiento para la diagnosis genetica de todas las especies del genero merluccius en la cadena alimentaria. - Google Patents
Procedimiento para la diagnosis genetica de todas las especies del genero merluccius en la cadena alimentaria.Info
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Abstract
Procedimiento para la diagnosis genética de todas las especies del género Merluccius en la cadena alimentaria. El procedimiento se caracteriza por 1) amplificar un fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 de los genes ribosómicos, para determinar la presencia de merluza en una muestra, 2) por amplificar un fragmento de 602-659 pb de los genes ribosómicos que incluye al espaciador ITS1 y digerirlo con una batería de endonucleasas de restricción y 3) por el análisis de los patrones combinados de fragmentos obtenidos que permite diferenciar inequívocamente las 12 especies de merluza entre sí y del bacalao, en todo tipo de productos y subproductos frescos, congelados y precocinados. De aplicación en los sectores alimentario, importador, sanitario y de control de calidad.
Description
Procedimiento para la diagnosis genética de todas
las especies del género Merluccius en la cadena
alimentaria.
La invención tiene aplicación en el control de
calidad y origen de materia prima, control de fraude al consumidor,
control de fraude en importaciones, etiquetado de productos y
subproductos, genética forense de pesquerías, conflictos pesqueros
en aguas internacionales, y gestión de pesquerías.
La merluza es una especie de gran impacto
económico en los mercados europeos. En 1998, las importaciones
españolas de merluza europea ascendieron a 28.986 t con un valor de
mercado de más de 70 millones de euros. Las excelentes cualidades
alimentarias y organolépticas de este pescado junto con la
diversificación de sus productos comerciales, ha creado una demanda
de mercado que las empresas transformadoras palian mediante la
importación y comercialización de otras especies del mismo género
(Merluccius spp.). La entrada de nuevas especies en los
mercados europeos ha puesto de manifiesto la necesidad de control
sobre la calidad y el etiquetado de los productos. El control de
origen y autenticidad de especies es más urgente: 1) cuanto mayor es
la diversidad de especies susceptibles de ser comercializadas bajo
el mismo nombre y 2) tras la manipulación del pescado previa a la
venta, mediante procesos como fileteado, eviscerado y descabezado,
que dificultan sobremanera la identificación de los especimenes. La
diversificación de los productos disponibles en el mercado ha
favorecido el aumento de la reglamentación, tanto a nivel estatal
como europeo, en materia de etiquetado y control de autenticidad de
origen de especies.
En el Real Decreto 1380/2002, de 20 de diciembre
(BOE Nº 3, página 183, 3/1/03) de identificación de los productos
de la pesca, de la acuicultura y del marisqueo, congelados y
ultra-congelados, se tiene en cuenta el Título III
de la Ley 3/2001 de 26 de marzo de Pesca Marítima del Estado sobre
comercialización de productos pesqueros, el reglamento (CE) número
104/2000 del Consejo, de 17 de diciembre de 1999 por el que se
establece la Organización Común de Mercados (OCM), el Real Decreto
1334/1999 (31 julio) por el que se aprueba la Norma general de
etiquetado y el Real Decreto 1109/1991 (12 julio) por el que se
aprueba la Norma general relativa a los alimentos
ultra-congelados destinados a la alimentación
humana. De tal modo que en los mercados españoles se admiten las
siguientes denominaciones comerciales para productos y subproductos
que contengan merluza (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
La substitución de unas especies por otras de
menor valor comercial, como por ejemplo Merluccius
senegalensis por merluza europea del pincho, Merluccius
merluccius, o la identificación errónea en productos
precocinados, suponen prácticas de indudable beneficio económico.
Dado que las características organolépticas diferenciales de las
especies influyen tanto en la aceptación de un determinado producto
por parte de los consumidores, como en el precio que aquellos
adquieren el mercado, es necesaria una herramienta que permita
identificar inequívocamente la especie que se encuentra en el
interior de los envases y comprobar su correcto etiquetado.
Para los expertos es posible identificar la
especie por caracteres morfológicos cuando el pescado está intacto,
ya sea fresco o congelado (Inada 1981). Una vez fileteado o
eviscerado, la mayoría de los caracteres morfológicos han
desaparecido o sufrido modificaciones irreversibles y la
identificación es prácticamente imposible. Mackie y Jones en 1978,
utilizaron proteínas para identificar 5 especies del género
Merluccius, sin embargo en productos sometidos a
procesamientos térmicos como los precocinados (normalmente
rebozados), es muy difícil reproducir los patrones
electroforéticos, debido a la rápida degradación de las
proteínas.
Los ácidos nucleicos constituyen la mejor
alternativa a las proteínas ya que sufren un menor deterioro tras
los tratamientos térmicos. Para la identificación de especies se
puede utilizar tanto ADN mitocondrial (ADNmt) como ADN nuclear. Se
utiliza preferentemente 1) el ADNmt que está en mayor número de
copias que el nuclear, no presenta secuencias no codificantes
(intrones) y es de menor tamaño que el nuclear y 2) las familias
génicas repetidas de ADN nuclear, como la de los genes ribosómicos
(rDNA), que presentan baja variación dentro de especie (Arnheim y
col. 1980), se encuentran en múltiples copias en el genoma, y están
muy conservadas en la escala evolutiva.
Aunque potencialmente existen distintos métodos
de identificación de especies con ADN, se han utilizado
fundamentalmente tres metodologías: a) las basadas en la
amplificación por PCR de un fragmento de ADN específico de especie,
por ejemplo, en dípteros (Rutledge y col., 1999), o en gádidos
(Taylor y col, 2002), b) las que utilizan los polimorfismos de
tamaño de los amplicones de PCR, por ejemplo en halibut y lenguado
(Céspedes y col, 1999), y c) las que utilizan la técnica de
PCR-RFLPs, es decir, la digestión de un fragmento de
ADN amplificado por PCR, con una batería de enzimas de restricción,
por ejemplo en peces planos (Céspedes y col., 1998).
Piñeiro y col (2001) identifican 5 especies de
merluza utilizando la técnica de electroforesis bidimensional.
Quinteiro y col (2001) empleando la técnica de
PCR-RFLPs identifican 11 de las 12 especies del
género Merluccius spp. Estos autores amplifican por PCR la
región control del ADN mitocondrial y la digieren con 4 enzimas de
restricción, de modo que por comparación de los patrones de bandas
obtenidos pueden diferenciar 11 especies. Sin embargo, este
procedimiento carece de una primera fase de diagnóstico de
presencia-ausencia de merluza en una muestra y no
consigue identificar todas las especies mundiales de merluza. Esta
falta de identificación total de las especies, puede conducir a
diagnósticos falsos o inexactos que invalidan dicho método. Además,
está ampliamente demostrado a lo largo de la escala evolutiva que
la región control del ADN mitocondrial (D-loop) es
altamente variable dentro de especie, y que esta variabilidad
intra-específica genera patrones de fragmentos
difíciles de interpretar, al tiempo que incrementa el número de
identificaciones erróneas. Por todo lo antedicho, es imprescindible
disponer de un procedimiento para la identificación y
diferenciación genética de todas las especies de merluza
Merluccius spp.: M. merluccius, M.
senegalensis, M. polli, M. capensis, M.
paradoxus, M. productus, M. gayi, M.
australis, M. hubbsi, M. albidus, M.
angustimanus y M. bilinearis en productos comerciales,
que resuelva los inconvenientes previamente mencionados.
Arnheim N., Krystsl M.,
Schmickel R., Wilson G., Ryder O., y
Zimmer E. (1980) Molecular evidence for genetic
exchanges among ribosomal genes on homologous chromosomes in man
and apes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 77
(12) 7323-7327.
Céspedes A., García T.,
Carrera E., González I., Sanz B.,
Hernández P. E. and Martín R. 1998.
Identification of flatfish species using polymerase chain reaction
(PCR) amplification and restriction analysis of the cytochrome
b gene. Journal of Food Science. Vol 63 (2):
206-209.
Céspedes A., García T.,
Carrera E., González I., Fernández A.,
Hernández P. and Martín R. 1999.
Identification of Sole (Solea solea) and Greenland Halibut
(Reinhaardtius hippoglossoides) by PCR Amplification of the
5S rDNA Gene. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
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Inada 1981. Studies on Merluciid
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Mackie I.M. and Jones B.W.
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water-soluble (sarcoplasmic) proteins of fish
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(Merluccius spp.). Comparative Biochemistry and
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Piñeiro C., Vázquez J.,
Marina A.I., Barros-Velázquez J., and
Gallardo J.M. 2001. Characterization and partial
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comercial hake species by mass spectrometry following
two-dimensional electrophoresis.
Electrophoresis 22: 1545-1552.
Quinteiro J., Vidal R.,
Izquierdo M., Sotelo C.G., Chapeta M.j.,
Pérez-Martín R. I., Rehbein H.,
Hold G.L., Russel V.J., Pryde S.E., Rosa
C., Samtos A.T. and Rey-Méndez M.
2001. Identificaton of hake speceis (Merluccius genus)
using sequencing and PCR-RFLP analysis of
mitochondrial DNA control region sequences. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 49:
5108-5114.
Rutledge C.R., Wesson D.M. and
Meek C.L. 1999. Polymerase chain reaction assay to
identify all immature stages of two species of the Anopheles
quadrimaculatus sibling species complex (Diptera: Culicidae).
Journal of the American Mosquito Control Association,
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Taylor M.I., Fox C., Rico I.
and Rico C. 2002. Species-specific
TaqMan probes for simultaneous identification of (Gadus
morhua L.), haddock (Melanogrammus aeglefinus L.) and
whiting (Merlangius merlangus L.). Molecular Ecology
Notes 2: 599-601.
El objetivo de esta invención es la detección de
la presencia de merluza en una muestra de alimentos o productos
frescos, congelados y/o precocinados, en sus diversos formatos
comerciales y en caso positivo, la posterior identificación
genética inequívoca de la especie concreta de merluza, i. e.
Merluccius merluccius, Merluccius senegalensis, Merluccius
polli, Merluccius capensis, Meriuccius paradoxus, Merluccius
productos, Merluccius gayi, Merluccius australis, Merluccius
hubbsí, Merluccius albidus, Merluccius angustimanus y Meriuccius
bilinearis. La invención se basa en la amplificación de un
fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 de los genes ribosómicos,
para comprobar la presencia de merluza o bacalao en una muestra. En
caso positivo, se amplifica posteriormente un fragmento de
602-659 pb de los genes ribosómicos que incluye al
ITS1 y se estudian las diferencias en la secuencia nucleotídica del
ITS1 entre las 12 especies de merluza. Basándose en estas
diferencias ínter-específicas, se aplica de modo
secuencial una batería de 4 endonucleasas de restricción que
generan patrones de bandas característicos de cada una de las
especies comercializadas bajo la denominación "merluza". La
novedad de la técnica que se presenta radica en que se proporciona
al usuario la secuencia de 2 cebadores de ADN que permiten
determinar la presencia o ausencia en la muestra de alguna de las
doce especies de merluza o de bacalao. Los cebadores seleccionados
fueron probados en Gadus morhua (bacalao), Macruronus
novazelandiae y Macruronus magellanicus (denominadas
comercialmente merluzas de cola), salmónidos y peces planos,
amplificando únicamente en merluzas y bacalao, por ello se han
determinado también los patrones de digestión enzimática para esta
especie, con las cuatro enzimas seleccionadas. En caso de que el
test anterior sea positivo y por tanto haya merluza o bacalao en la
muestra, se proporciona al usuario la secuencia de 2 cebadores de
ADN que permiten amplificar un fragmento de mayor tamaño
(602-659 pb). Sobre este fragmento se ha
seleccionado un conjunto de dianas de corte de endonucleasas
específicas que permiten, tras el estudio del patrón de bandas de
los fragmentos que generan, diferenciar inequívocamente todas las
especies de merluza y el bacalao. La técnica presentada tiene bajo
coste, es sencilla y requiere poco tiempo de ejecución. Presenta
evidentes ventajas frente a técnicas de análisis de proteínas que
son alteradas en los procesos a los que se someten los productos.
Con respecto a la técnica propuesta por Quinteiro y col. (2001) el
presente procedimiento presenta varias ventajas, a saber: a) el uso
de cebadores específicos para merluza que permite un primer
diagnóstico de presencia-ausencia de merluza en los
productos, b) no es necesario digerir con todas las enzimas para
identificar las especies, pues con una sola enzima de restricción
se distinguen 4 especies de merluza y el bacalao, con dos enzimas
de restricción se distinguen 9 especies, con 3 enzimas se
distinguen 10 especies y con las 4 enzimas se distinguen las 12
especies mundiales de merluza c) con este procedimiento es posible
diferenciar todas las especies mundiales del género
Merluccius (12 especies) descritas en la literatura hasta la
fecha y d) los cebadores utilizados se han confeccionado de modo
que solamente funcionan sobre ADN de merluza y bacalao, pero en
ningún otro grupo de peces ensayado (por ej. salmónidos, peces
planos y Macruronus magellanicus o merluza de cola).
Se trata de un procedimiento para la detección de
presencia-ausencia de merluza en una muestra de
productos frescos, congelados, ultra-congelados y/o
procesados y etiquetados como merluza, y en caso positivo, para la
identificación de la especie concreta de merluza, i. e.
Merluccius merluccius, Merluccius senegalensis, Merluccius
polli, Merluccius capensis, Merluccius paradoxus, Merluccius
productus, Merluccius gayi, Merluccius australis, Merluccius
hubbsi, Merluccius albidus, Merluccius angustimanus y
Merluccius bilinearis. El procedimiento se caracteriza por
la amplificación de un fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 de
los genes ribosómicos, para comprobar la presencia de merluza o
bacalao en una muestra y, en caso positivo, la amplificación
posterior de un fragmento de 602-659 pb de los
genes ribosómicos que incluye el ITS1, por la aplicación secuencial
de una batería de endonucleasas de restricción sobre el fragmento
amplificado de 602-659 pb, y por el análisis de los
fragmentos obtenidos característicos de cada especie y que permite
diferenciar las especies de merluza entre si y del bacalao. La
metodología se describe en la Figura 1 y sigue los pasos que se
detallan a continuación:
- 1.-
- Extracción y purificación del ADN.
- 2.-
- Comprobación de la cantidad y calidad del ADN.
- 3.-
- Determinación de la presencia de ADN de merluza en una muestra mediante amplificación por PCR de un fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 de los genes ribosómicos.
- 4.-
- Comprobación de la correcta amplificación.
- 5.-
- Amplificación por PCR de un fragmento de 602-659 pb de los genes ribosómicos.
- 6.-
- Comprobación de la correcta amplificación.
- 7.-
- Digestión de alícuotas del fragmento amplificado con endonucleasas de restricción que reconocen y cortan específicamente en determinadas secuencias diana.
- 8.-
- Estudio de los fragmentos de ADN obtenidos tras la digestión enzimática y determinación de la especie de merluza por comparación con los patrones característicos de cada especie.
A continuación se describe detalladamente cada
una de las etapas mencionadas:
Al objeto de evitar contaminaciones con ADN no
procedente de la muestra, es necesario esterilizar los reactivos y
materiales que se vayan a utilizar en la extracción y amplificación
del ADN. En la bibliografía se pueden encontrar distintos métodos
para extraer ADN (Sambrook y col., 1989). La mayoría de ellos
requieren fenolización de la muestra, aunque los hay menos
contaminantes como los que utilizan agentes quelantes como la
resina Chelex (Estoup y col., 1996). En productos precocinados y/o
rebozados es necesaria una etapa previa de desengrasado.
El ADN extraído debe estar en cantidad y calidad
suficientes para los análisis. El principal problema para
conseguirlo es la degradación que ha sufrido el ADN de los
productos durante su elaboración. No obstante el ADN extraído de
esos productos alcanza una longitud suficiente para amplificar el
fragmento de 602-659 pb de los genes ribosómicos
que incluye al ITS1, que servirá para la diagnosis de especie.
A partir del ADN extraído y purificado, se
intenta amplificar por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) un
fragmento de 193 pb, localizado en el espaciador ITS1 de los genes
ribosómicos del ADN nuclear. Para ello se utilizan dos cebadores,
denominados respectivamente RP1 y RP2, que amplifican únicamente en
las 12 especies de merluza y en el bacalao y que corresponden a las
siguientes secuencias de nucleótidos (véase apartado denominado
lista de secuencias):
RP1: SEC ID NO 1 (18 nucleótidos)
RP2: SEC ID NO 2 (19 nucleótidos)
El diseño de los cebadores RP1 y RP2 se realizó
alineando las secuencias del espaciador ITS1 de los genes
ribosómicos, obtenidas para cada una de las especies de merluza, y
seleccionándolos en las regiones nucleotídicas conservadas entre
especies. Los cebadores sintéticos pueden obtenerse mediante
síntesis realizada por casas comerciales, por ejemplo
Sigma-Genosys. La reacción de amplificación por PCR
se realiza en un termociclador y con un programa de ciclos de
temperatura como el que sigue:
Un ciclo inicial de desnaturalización a 95ºC
durante 5 minutos, 30 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 65ºC durante
1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, seguidos de un ciclo final de
elongación a 72ºC durante 15 minutos.
Es necesario comprobar de visu la
amplificación del fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 de los
genes ribosómicos. El método más sencillo es mediante
electroforesis en geles de agarosa (Figura 2). La tinción se realiza
con Bromuro de Etidio y los fragmentos amplificados se visualizan
en un transiluminador ultravioleta. Es indispensable comigrar la
muestra con un marcador de pesos moleculares de fragmentos
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el tamaño de los
fragmentos amplificados y comprobar que la amplificación es
correcta. Si se ha producido la amplificación del fragmento de 193
bp entonces podemos asegurar que hay ADN nuclear de merluza o
bacalao en la muestra.
La amplificación del fragmento de
602-659 pb de los genes ribosómicos que contiene el
ITS1 se realiza con dos cebadores, denominados respectivamente PP1 y
PP2, y que corresponden a las siguientes secuencias de nucleótidos
(véase apartado denominado lista de secuencias):
PP1: SEC ID Nº: 3 (30 nucleótidos)
PP2: SEC ID Nº: 4 (20 nucleótidos)
Los cebadores, PP1 y PP2, se seleccionaron
respectivamente en los extremos 3' y 5' de los genes ribosómicos
18S y 5,8S, de Xenopus laevis.
El programa de amplificación en el termociclador
es como sigue: un ciclo inicial de desnaturalización a 95ºC durante
10 minutos, 40 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1
minuto y 72ºC durante 2 minutos, seguidos de un ciclo final de
elongación a 72ºC durante 15 minutos.
Es necesario comprobar visualmente la
amplificación del fragmento de 602-659 pb de los
genes ribosómicos que contiene el ITS1. El método más sencillo es
mediante electroforesis en gel de agarosa. La tinción se realiza con
Bromuro de Etidio y los fragmentos amplificados se visualizan en un
transiluminador ultravioleta. Es indispensable comigrar la muestra
con un marcador de pesos moleculares de fragmentos comprendidos
entre 100 y 1000 pb para estimar el tamaño de los fragmentos
amplificados y comprobar que la amplificación es la correcta (Figura
3).
\hbox{!/GGAG(N) _{6} !} El fragmento amplificado contiene los extremos de
los genes ribosómicos adyacentes y el espaciador ITS1 completo,
sobre la secuencia de este último se efectuó la selección de las
dianas de restricción.
El fragmento de 602-659 pb de los
genes ribosómicos que contiene el ITS1 de las 12 especies de
merluza presenta una serie de nucleótidos característicos de cada
especie (Figuras 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15, y 16).
Estas diferencias nucleotídicas permiten seleccionar una batería de
cuatro endonucleasas de restricción, que, aplicadas de modo
secuencial, permiten identificar a todas las especies de
merluza.
Los patrones de fragmentos generados tras la
digestión con Afa I distinguen las especies Merluccius
polli, Merluccius hubbsi, Merluccius paradoxus y Merluccius
bilinearis de las demás (Figura 17) y el bacalao Gadus
morhua. Esta enzima reconoce la secuencia GT!AC/CA!TG presente
en todas las especies.
La enzima de restricción Afa I en
Merluccius polli produce dos cortes en las posiciones 413 y
440 generando tres fragmentos de 466, 166 y 27 pb; en Merluccius
hubbsi tiene tres dianas en 201, 359 y 424 generando cuatro
fragmentos respectivamente de 254, 158, 125 y 65 pb; en
Merluccius albidus corta en una única posición, 364 y genera
dos fragmentos de 417 y 193 pb; en Merluccius paradoxus
corta en la posición 387 generando dos fragmentos de 440 y 190 pb y
en Merluccius bilinearis corta en las posiciones 23, 146 y
360 del ITS1 generando cuatro fragmentos de 214, 194, 123 y 76 pb.
Con esta enzima también se distingue el bacalao (Gadus
morhua), que presenta tres fragmentos de 360, 173 y 72 pb. El
resto de especies de merluza se agrupan por similitud de los
patrones resultantes tras la digestión con Afa I, de modo
que presentan patrón similar Merluccius merlucccius, Merluccius
senegalensis, Merluccius albidus, y Merluccius capensis;
y por otra parte Merluccius productus, Merluccius gayi,
Merluccius australis y Merluccius angustimanus.
Una vez diferenciadas las 4 primeras especies, la
enzima Bbe I distinguirá Merluccius merluccius y
Merluccius albidus de Merluccius senegalensis y
Merluccius capensis; y Meriuccius australis de
Merluccius productus, Merluccius gayi y Merluccius
angustimanus (Figura 18). Esta enzima reconoce la secuencia
GGCGC!C/C!CGCGG que está presente en distintas posiciones del ITS1
de las especies. En Merluccius merluccius corta en las
posiciones, 212 y 484, generando tres fragmentos de 272, 265 y 92
pb; en Merluccius albidus no presenta diana de restricción
por lo que se observa el fragmento de 610 pb; en Merluccius
senegalensis corta en las posiciones 202 y 476 y genera tres
fragmentos de 274, 255 y 89 pb; en Merluccius capensis tiene
una diana en 473 y genera dos fragmentos de 526 y 88 pb; en
Merluccius australis corta en las posiciones 181 y 460 y
genera tres fragmentos de 279, 234, y 97 pb; en Merluccius
productus corta en las posiciones 173 y 454, generando tres
fragmentos de 281, 226 y 96 pb; en Merluccius gayi corta en
las posiciones 173 y 456 y genera tres fragmentos de 283, 226 y 95
pb y en Merluccius angustimanus corta en las posiciones 173 y
453 generando tres fragmentos de 280, 226 y 96 pb.
La enzima Mlu NI distingue Merluccius
productus de Merluccius gayi y Merluccius
angustimanus (Figura 19). Esta enzima reconoce la secuencia
TGG!CCA/ACC!GGT. En Merluccius productus no existe la diana
de restricción para esta enzima de modo que se observa un fragmento
de 603 pb; en Merluccius gayi y Merluccius
angustimanus corta en la posición 335 y genera dos fragmentos,
uno común de 388 pb y otro de 216 y 214 pb respectivamente.
Con la enzima Mnl I se distingue
Merluccius gayi de Merluccius angustimanus. Esta
enzima reconoce la secuencia
CCTC(N)_{7}!/GGAG(N)_{6}! (Figura
20). Ambas especies de distinguen por la presencia en Merluccius
angustimanus de un fragmento de 160 pb que no está presente en
Merluccius gayi.
La digestión del espaciador de los genes
ribosómicos se realiza a 37ºC, con las enzimas Afa I,
Bbe I, Mlu NI y Mnl I, en 4 viales
independientes y utilizando el tampón adecuado para cada una de
ellas. Normalmente la incubación se realiza durante 5 horas, si
bien, cuanto más tiempo se digiera más claros serán los patrones de
bandas.
En bacalao, Gadus morhua, la enzima de
restricción Afa I corta en las posiciones 19 y 379 generando
tres fragmentos de 360, 173 y 72 pb, La enzima de restricción
Bbe I corta en la posición 464 y genera dos fragmentos de 517
y 88 pb; y la enzima de restricción Mlu NI no presenta
dianas de restricción en la secuencia del bacalao, de modo que se
observa una banda de 605 pb (Figura 21).
Para obtener los patrones característicos de cada
especie debe visualizarse el resultado de la digestión. Las muestras
se identificarán basándose en la restricción con Afa I de
modo que tres fragmentos de 466, 166 y 27 pb son indicativos de la
presencia de Merluccius polli; cuatro fragmentos de 254, 158,
125 y 65 pb indican la presencia de Merluccius hubbsi. Si hay
Merluccius paradoxus en una muestra observaremos dos
fragmentos de 440 y 190 pb. Si se trata de Merluccius
bilinearis observaremos cuatro fragmentos de 214, 194, 123 y 76
pb, y en caso de que haya bacalao se observarán tres fragmentos de
360, 173 y 72 pb respectivamente.
Posteriormente con la enzima de restricción
Bbe I, un fragmento de 610 pb es indicativo de Merluccius
albidus; tres fragmentos de 272, 265 y 92 pb indican la
presencia de Merluccius merluccius. Si hay Merluccius
senegalensis observaremos tres fragmentos de 274, 255 y 89 pb;
dos fragmentos de 526 y 88 pb son indicativos de Merluccius
capensis; si hay Merluccius australis obtendremos tres
fragmentos de 279, 234, y 97 pb; si hay Merluccius productus
o Merluccius gayi o Merluccius angustimanus veremos
respectivamente tres fragmentos de 281, 226 y 96 pb; 283, 226 y 95
pb y 280, 226 y 96 pb.
Tras la digestión con la enzima Mlu NI se
distinguirá un fragmento de 603 pb de Merluccius productus,
que no presenta la diana de restricción para esta enzima.
Merluccius gayi y Merluccius angustimanus presentan
dos fragmentos cada una, uno común de 388 pb y otro de 216 y 214 pb
respectivamente.
Finalmente con Mnl I se distinguirán
Merluccius gayi de Merluccius angustimanus por la
presencia en Merluccius angustimanus de un fragmento de 160
pb que no existe en Merluccius gayi.
En resumen, la invención proporciona un
procedimiento para la identificación genética y la diferenciación
de las especies Merluccius merluccius, Merluccius
senegalensis, Merluccius polli, Merluccius capensis, Merluccius
paradoxus, Merluccius productus, Merluccius gayi, Merluccius
australis, Merluccius hubbsi, Merluccius albidus, Merluccius
angustimanus, Merluccius bilinearis y Gadus morhua en una
muestra problema a ensayar, que comprende las etapas de:
- a)
- Obtención de una muestra a ensayar,
- b)
- Extracción y purificación del ADN de la muestra,
- c)
- Amplificación por PCR de una secuencia de 193 pb del espaciador ITS1 de los genes ribosómicos con los cebadores RP1 y RP2 que corresponden a la SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2, respectivamente,
- d)
- Comprobación de la amplificación para saber si hay merluza y/o bacalao en la muestra,
- e)
- Si ha habido amplificación, se amplifica por PCR el espaciador ITS1 de los genes ribosómicos y sus dos flancos, con los cebadores PP1 y PP2 que corresponden a las secuencias SEC ID NO 3 y SEC ID NO 4, respectivamente,
- f)
- Comprobación de la correcta amplificación del fragmento,
- g)
- Digestión de los amplicones de PCR con enzimas de restricción que reconozcan dianas específicas,
- h)
- Análisis de los productos de digestión obtenidos frente a los patrones de restricción característicos de las especies a identificar de modo que:
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia GT!AC/CA!TG tres fragmentos de 466, 166 y 27 pb son indicativos de la presencia de Merluccius poli; cuatro fragmentos de 254, 158, 125 y 65 pb indican la presencia de Merluccius hubbsi; dos fragmentos de 440 y 190 pb son indicativos de la presencia de Merluccius paradoxus, si hay Merluccius bilinearis observaremos cuatro fragmentos de 214, 194, 123 y 76 pb y si se trata de Gadus morhua observaremos 3 fragmentos de 360, 173 y 72 pb.
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia GGCGC!C/C!CGCGG, un fragmento de 610 pb es indicativo de Merluccius albidus; tres fragmentos de 272, 265 y 92 pb indican la presencia de Merluccius merluccius; si hay Meduccius senegalensis observaremos tres fragmentos de 274, 255 y 89 pb; dos fragmentos de 526 y 88 pb son indicativos de Merluccius capensis; si hay Merluccius australis obtendremos tres fragmentos de 279, 234, y 97 pb; si hay Merluccius productus o Merluccius gayi o Merluccius angustimanus veremos tres fragmentos respectivamente de 281, 226 y 96 pb; o 283, 226 y 95 pb y 280, 226 y 96 pb.
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia TGG!CCA/ACC!GGT, se distinguirá Merluccius productus por un fragmento de 603 pb, de Merluccius gayi y Merluccius angustimanus que presentan dos fragmentos, uno común de 388 pb y otro de 216 y 214 pb respectivamente.
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia CCTC(N)_{7}!/GGAG(N)_{6}!, se distinguirán Merluccius gayi de Merluccius angustimanus por un fragmento de 160 pb presente solamente en Merluccius angustimanus.
El procedimiento proporcionado por esta invención
puede aplicarse a cualquier tipo de producto fresco, congelado,
refrigerado, precocinado, etc.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser
limitativos de su alcance.
Se plantea el problema de identificar el origen
geográfico y la especie de merluza de una partida de colas de
merluza importadas de otro país para consumo humano. La información
previa sobre la muestra es que se trata de una partida de colas de
merluza argentina. Se trata de determinar inequívocamente la
especie.
La extracción de ADN se realizó con una
disolución de Chelex al 10% en agua pura calentada a 55ºC. Se cortó
con un bisturí un trozo de tejido de 4 colas de la muestra. Los
trozos de tejido se introdujeron independientemente en tubos de
ensayo de 1,5 mL y se añadieron 300 \muL de la disolución de
Chelex al 10% (caliente y en agitación) y 5 \muL de
proteinasa-K. Se agitó la mezcla fuertemente con un
agitador y se incubó a 55ºC durante 1 hora y después a 100ºC durante
15 minutos. Tras la incubación se centrifugó a 12.000 g durante 3
minutos, de modo que los restos de tejido precipitaron unidos a la
resina y el ADN permaneció en el sobrenadante.
Para comprobar la cantidad y la calidad del ADN
extraído se tomó una alícuota del ADN y se hizo migrar por
electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% en tampón TBE 1X.
Para amplificar se utilizaron disoluciones (10
\muM) de los dos cebadores, denominados MP1 y MP2 (SEC ID NO 1 y
SEC ID NO 2, respectivamente). La reacción se llevó a cabo con el
kit puRe Taq Ready-to-go PCR
Beads (Amersham Biosciences, ref.
27-9557-01), en tubos de 0,2 mL. Se
añadieron: 5 \muL de ADN extraído con Chelex, 20 pmol de cada
cebador y 16 \muL de H_{2}O para ajustar el volumen final de la
reacción a 25 \muL.
Se empleó la técnica de electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en tampón TBE 1X con 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio a 10 mg/mL. Se visualizaron 15 \muL del producto de la
amplificación mediante iluminación del gel con una lámpara UV. Se
empleó un patrón de pesos moleculares con fragmentos de ADN
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el peso molecular de
los fragmentos amplificados. En todas las muestras se visualizó el
fragmento de 193 pb (Figura 22A).
Para amplificar se utilizaron disoluciones (10
\muM) de los dos cebadores, denominados PP1 y PP2 (SEC ID NO 3 y
SEC ID NO 4, respectivamente). La reacción se llevó a cabo con el
kit puRe Taq Ready-to-go PCR
Beads (Amersham Biosciences, ref.
27-9557-01), en tubos de 0,2 mL. Se
añadieron: 5 \muL de ADN extraído con Chelex, 20 \muMol de cada
cebador, 0,5 \muL de Cl_{2}Mg a 25mM y 15,5 \muL de H_{2}O
para ajustar el volumen final de la reacción a 25 \muL.
Se empleó la técnica de electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en tampón TBE 1X con 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio a 10 mg/mL. Se visualizaron 5 \muL del producto de la
amplificación mediante iluminación del gel con una lámpara UV. Se
empleó un patrón de pesos moleculares con fragmentos de ADN
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el peso molecular de
los fragmentos amplificados. En los 4 casos se visualizó un
fragmento de 602-659 pb (Figura 22B).
Con el fin de evitar artefactos que dificulten la
interpretación de los patrones de digestión, el producto de la PCR
se purificó con el kit GFX PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences, ref.
27-9602-01).
Se digirió una alícuota del fragmento purificado
de las cuatro muestras con la enzima de restricción Afa I.
Las digestiones se realizaron en tubos de ensayo de 1,5 mL, se
añadieron de 5 \muL del fragmento purificado, 2 \muL del tampón
adecuado para cada enzima, 5 U de enzima y se completó el volumen
hasta 20 \muL con agua pura. Las reacciones de digestión se
incubaron durante una noche a 37ºC.
La visualización del patrón de digestión se
realizó en un gel de agarosa al 3% compuesto por una mezcla de
agarosas (2 : 1, NuSieve: Seakem LE) y 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio (10 mg/mL).
En cada pocillo se cargó toda la reacción de
digestión con 3 \muL de tampón de carga y en la primera calle se
hizo migrar un marcador de pesos moleculares denominado pGEM
(Promega, catálogo G1741). La migración se realizó a 70 V durante
una hora y tras ella se visualizaron los fragmentos obtenidos en una
lámpara ultravioleta (Figura 23).
Los individuos se identificaron inequívocamente
como Merluccius hubbsi (denominada en la etiqueta como
merluza argentina) puesto que se observó el patrón de 4 bandas
característico de esta especie para la enzima Afa I.
Los organismos oficiales encargados del control
de importaciones habrían verificado que no existe fraude en esta
partida comercial, y que los aranceles rendidos por los
importadores son los adecuados.
Se plantea el problema de determinar si hay o no
merluza en una lata de conserva etiquetada como "pimientos del
piquillo rellenos de merluza y gambas".
Al tratarse de un producto precocinado se
procedió a desengrasar la muestra previamente a la extracción. Para
ello se introdujeron 200 mg del relleno de los 4 pimientos
presentes en la muestra, en 4 tubos de 15 mL. Se añadió una mezcla
de cloroformo: etanol: agua (1 : 2 : 0,8) y se mantuvieron a
temperatura ambiente durante dos horas. Transcurrido este tiempo,
el contenido del tubo de 15 mL se filtró en papel de filtro y se
recogió el residuo sólido. La extracción de ADN se realizó con una
disolución de Chelex al 10% en agua pura calentada a 55ºC.
Aproximadamente 50 mg de tejido de cada relleno
se introdujeron independientemente en tubos de ensayo de 1,5 mL y
se añadieron 300 \muL de la disolución de Chelex al 10% (caliente
y en agitación) y 5 \muL de proteinasa-K. Se
agitó la mezcla fuertemente con un agitador y se incubó a 55ºC
durante 1 hora y después a 100ºC durante 15 minutos. Tras la
incubación se centrifugó a 12.000 g durante 3 minutos, de modo que
los restos de tejido precipitaron unidos a la resina y el ADN
permaneció en el sobrenadante.
Para comprobar la cantidad y la calidad del ADN
extraído se tomó una alícuota del ADN y se hizo migrar por
electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% en tampón TBE 1X.
Para amplificar se utilizaron disoluciones (10
\muM) de los dos cebadores, denominados MP1 y MP2 (SEC ID NO 1 y
SEC ID NO 2, respectivamente). La reacción se llevó a cabo con el
kit puRe Taq Ready-to-go PCR
Beads (Amersham Biosciences, ref.
27-9557-01), en tubos de 0,2 mL. Se
añadieron: 5 \muL de ADN extraído con Chelex, 20 pmol de cada
cebador y 16 \muL de H_{2}O para ajustar el volumen final de la
reacción a 25 \muL.
Se empleó la técnica de electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en tampón TBE 1X con 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio a 10 mg/mL. Se visualizaron 15 \muL del producto de la
amplificación mediante iluminación del gel con una lámpara UV. Se
empleó un patrón de pesos moleculares con fragmentos de ADN
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el peso molecular de
los fragmentos amplificados. Se observó en todos los casos un
fragmento amplificado de 193 pb, lo que indicó la presencia de
merluza o bacalao en las 4 muestras de pimientos rellenos.
Para amplificar se utilizaron disoluciones (10
\muM) de los dos cebadores, denominados PP1 y PP2 (SEC ID NO 3 y
SEC ID NO 4, respectivamente). La reacción se llevó a cabo con el
kit puRe Taq Ready-to-go PCR
Beads (Amersham Biosciences, ref.
27-9557-01), en tubos de 0,2 mL. Se
añadieron: 5 \muL de ADN extraído con Chelex, 20 pmol de cada
cebador, 0,5 \muL de Cl_{2}Mg a 25mM y 15,5 \muL de H_{2}O
para ajustar el volumen final de la reacción a 25 \muL.
Se empleó la técnica de electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en tampón TBE 1 X con 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio a 10 mg/mL. Se visualizaron 5 \muL del producto de la
amplificación mediante iluminación del gel con una lámpara UV. Se
empleó un patrón de pesos moleculares con fragmentos de ADN
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el peso molecular de
los fragmentos amplificados. En todos los casos se visualizó un
fragmento de 602-659 pb.
Con el fin de evitar artefactos que dificulten la
interpretación de los patrones de digestión, el producto de la PCR
se purificó con el kit GFX PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences, ref.
27-9602-01).
Una alícuota de cada fragmento purificado de las
4 muestras se digirió con la enzima de restricción Afa I. La
digestión se realizó en tubos de ensayo de 1,5 mL, se añadieron 5
\muL del fragmento purificado, 2 \muL del tampón adecuado para
cada enzima, 5 U de enzima y se completó el volumen hasta 20 \muL
con agua pura. Las reacciones de digestión se incubaron durante una
noche a 37ºC.
La visualización del patrón de digestión se
realizó en un gel de agarosa al 3% compuesto por una mezcla de
agarosas (2 : 1, NuSieve: Seakem LE) y 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio (10 mg/mL).
En cada pocillo se cargó toda la reacción de
digestión con 3 \muL de tampón de carga y en la primera calle se
hizo migrar un marcador de pesos moleculares denominado pGEM
(Promega, catálogo G1741). La migración se realizó a 70 V durante
una hora y tras ella se visualizaron los fragmentos obtenidos en una
lámpara ultravioleta (Figura 24).
Existe merluza en las muestras puesto que el ADN
presenta el patrón típico de Merluccius merluccius, Merluccius
senegalensis o Merluccius capensis.
Las autoridades competentes habrían verificado el
correcto etiquetado del producto y confirmado que efectivamente
existía merluza en el relleno de los pimientos del piquillo.
Se trata de comprobar que un producto precocinado
etiquetado como merluza europea del pincho en salsa verde es
efectivamente merluza y se trata de la especie Merluccius
merluccius.
Al tratarse de un producto precocinado se
procedió a desengrasar la muestra previamente a la extracción. Para
ello se introdujeron 300 mg de dos trozos de tejido del producto en
dos tubos de 15 mL. Se troceó el tejido con unas tijeras y se
añadió una mezcla de cloroformo: etanol: agua (1 : 2 : 0,8). Se
mantuvieron a temperatura ambiente durante dos horas y transcurrido
este tiempo, el contenido del tubo de 15 mL se filtró. La
extracción de ADN se realizó con una disolución de Chelex al 10% en
agua pura calentada a 55ºC.
Aproximadamente 50 mg de cada tejido se
introdujeron independientemente en 2 tubos eppendorf de 1,5 mL y se
añadieron 300 \muL de la disolución de Chelex al 10% (caliente y
en agitación) y 5 \muL de proteinasa-K. Se agitó
la mezcla fuertemente con un agitador y se incubó a 55ºC durante 1
hora y después a 100ºC durante 15 minutos. Tras la incubación se
centrifugó a 12.000 g durante 3 minutos, de modo que los restos de
tejido precipitaron unidos a la resina y el ADN permaneció en el
sobrenadante.
Para comprobar la cantidad y la calidad del ADN
extraído se tomó una alícuota del sobrenadante y se hizo migrar por
electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% en TBE 1X.
Para amplificar se utilizaron disoluciones (10
\muM) de los dos cebadores, denominados MP1 y MP2 (SEC ID NO 1 y
SEC ID NO 2, respectivamente). La reacción se llevó a cabo con el
kit puRe Taq Ready-to-go PCR
Beads (Amersham Biosciences, ref.
27-9557-01), en tubos de 0,2 mL. Se
añadieron: 5 \muL de ADN extraído con Chelex, 20 pmol de cada
cebador y 16 \muL de H_{2}O para ajustar el volumen final de la
reacción a 25 \muL.
Se empleó la técnica de electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en tampón TBE 1X con 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio a 10 mg/mL. Se visualizaron 15 \muL del producto de la
amplificación mediante iluminación del gel con una lámpara UV. Se
empleó un patrón de pesos moleculares con fragmentos de ADN
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el peso molecular de
los fragmentos amplificados. En ambos casos se visualizó un
fragmento de 193 pb lo que indicó la presencia de merluza o bacalao
en las muestras.
Para amplificar se utilizaron disoluciones (10
\muM) de los dos cebadores, denominados PP1 y PP2 (SEC ID NO 3 y
SEC ID NO 4, respectivamente). La reacción se llevó a cabo con el
kit puRe Taq Ready-to-go PCR
Beads (Amersham Biosciences, ref.
27-9557-01), en tubos de 0,2 mL. Se
añadieron: 5 \muL de ADN extraído con Chelex, 20 pmol de cada
cebador, 0,5 \muL de Cl_{2}Mg a 25mM y 15,5 \muL de H_{2}O
para ajustar el volumen final de la reacción a 25 \muL.
Se empleó la técnica de electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en tampón TBE 1X con 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio a 10 mg/mL. Se visualizaron 5 \muL del producto de la
amplificación mediante iluminación del gel con una lámpara UV. Se
empleó un patrón de pesos moleculares con fragmentos de ADN
comprendidos entre 100 y 1000 pb para estimar el peso molecular de
los fragmentos amplificados. En ambos casos se visualizó un
fragmento de 602-659 pb.
Con el fin de evitar artefactos que dificulten la
interpretación de los patrones de digestión, el producto de la PCR
se purificó con el kit GFX PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences, ref.
27-9602-01).
Tres alícuotas del fragmento purificado se
digirieron por separado con cada una de las enzimas de restricción
Afa I, Bbe I y Mlu NI. Las digestiones se
realizaron en tubos de ensayo de 1,5 mL, se añadieron de 5 \muL
del fragmento purificado, 2 \muL del tampón adecuado para cada
enzima, 5 U de enzima y se completó el volumen hasta 20 \muL con
agua pura. Las reacciones de digestión se incubaron durante una
noche a 37ºC.
La visualización del patrón de digestión se
realizó en un gel de agarosa al 3% compuesto por una mezcla de
agarosas (2 : 1, NuSieve: Seakem LE) y 1,3 \muL de Bromuro de
Etidio (10 mg/mL).
En cada pocillo se cargó toda la reacción de
digestión con 3 \muL de tampón de carga, y en la primera calle se
migró un marcador de pesos moleculares denominado pGEM (Promega,
catálogo G1741). La migración se realizó a 70 V durante una hora y
tras ella se visualizaron los fragmentos obtenidos en una lámpara
ultravioleta (Figura 25).
Los patrones obtenidos no se correspondieron con
los esperados para la especie Merluccius merluccius.
Las autoridades de control alimentario podrían
afirmar inequívocamente que existe fraude en el etiquetado de este
producto y determinar la sanción a imponer a la empresa responsable
del envasado, etiquetado o distribución. Incluso, dados los
patrones obtenidos se podría determinar la especie real envasada,
que es merluza austral, Merluccius australis.
La figura 1 muestra el esquema general del
protocolo a seguir para determinar la presencia o ausencia de
merluza en una muestra y en caso positivo identificar la especie
concreta. La primera calle de la izquierda representa los fragmentos
del marcador de peso molecular p-GEM (Promega,
referencia de catálogo G1741) y las siguientes calles contienen (de
izquierda a derecha) los patrones de digestión enzimática del
espaciador ITS1 amplificado en el DNA de: ME = M. merluccius,
SE = M. senegalensis, PO = M. polli, CA = M.
capensis, PA = M. paradoxus, PR = M. productus,
GA = M. gayi, AU = M. australis, HU= M. hubbsi,
AL = M. albidus, AN = M. angustimanus, BI= M.
bilinearis y GM = Gadus morhua. Las especies
identificadas se muestran en un recuadro.
La figura 2 muestra la fotografía de un gel de
agarosa 2% que verifica la amplificación de un fragmento de 193 bp
en todas las especies de merluza (Merluccius spp) y en el
bacalao (Gadus morhua) con los cebadores RP1 y RP2. La
primera calle de la izquierda son los fragmentos del marcador de
peso molecular p-GEM (Promega, referencia de
catálogo G1741) y las siguientes calles contienen (de izquierda a
derecha) el fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 amplificado en
el DNA de: ME = M. merluccius, SE = M. senegalensis,
PO = M. polli, CA = M. capensis,
\hbox{PA
=} M. paradoxus, PR = M. productus, GA = M.
gayi, AU = M. australis, HU= M. hubbsi, AL = M.
albidus, AN = M. angustimanus, BI= M. bilinearis y
GM = Gadus morhua.
La figura 3 muestra la fotografía de un gel de
agarosa 2% en la que se pone de manifiesto la amplificación de un
fragmento de 602-659 pb de los genes ribosómicos
que contiene al espaciador ITS1 y a sus 2 fragmentos flanqueantes
de los genes ribosómicos 18S y 5,8S, de todas las especies de
merluza. La primera calle es el marcador de peso molecular
(p-GEM, Promega, referencia de catálogo G1741) y
las siguientes calles (de izquierda a derecha) contienen el
fragmento de 602-659 pb amplificado sobre DNA de: ME
= M. merluccius, SE = M. senegalensis, PO = M.
polli, CA = M. capensis, PA = M. paradoxus, PR =
M. productus, GA = M. gayi, AU = M. australis,
HU= M. hubbsi, AL = M. albidus, AN = M.
angustimanus y BI = M. bilinearis.
La figura 4 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 556 pb amplificado en DNA de la especie Meriuccius
merluccius. Se indican las posiciones de reconocimiento de las
enzimas de restricción: Afa I (GT!AC/CA!TG), Bbe I
(GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI (TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de
dicho espaciador se muestra también en la SEC ID NO 5 (Lista de
Secuencias). Las regiones subrayadas corresponden a los cebadores
utilizados para amplificar por PCR el fragmento de 193 pb en
merluzas y en bacalao.
La figura 5 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 543 pb amplificado en la especie Merluccius
senegalensis. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra
también en la SEC ID NO 6 (Lista de Secuencias). Las secuencias
subrayadas corresponden a los cebadores utilizados para amplificar
por PCR el fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 6 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 586 pb amplificado en la especie Merluccius polli. Se
indican las posiciones de las dianas de reconocimiento de las
enzimas de restricción: Afa I (GT!AC/CA!TG), Bbe I
(GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI (TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de
dicho espaciador se muestra en la SEC ID NO 7 (Lista de
Secuencias). Las secuencias subrayadas corresponden a los cebadores
utilizados para amplificar por PCR el fragmento de 193 pb en
merluzas y en bacalao.
La figura 7 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 541 pb amplificado en la especie Merluccius
capensis. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra
también en la SEC ID NO 8 (Lista de Secuencias). Las secuencias
subrayadas corresponden a los cebadores utilizados para amplificar
por PCR el fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 8 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 557 pb amplificado en la especie Merluccius
paradoxus. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra en
la SEC ID NO 9 (Lista de Secuencias). Las secuencias subrayadas
corresponden a los cebadores utilizados para amplificar por PCR el
fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 9 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 530 pb amplificado en la especie Merluccius
productus. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra
también en la SEC ID NO 10 (Lista de Secuencias). Las secuencias
subrayadas corresponden a los cebadores utilizados para amplificar
por PCR el fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 10 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 531 pb amplificado en la especie Merluccius gayi. Se
indican las posiciones de las dianas de reconocimiento de las
enzimas de restricción: Afa I (GT!AC/CA!TG), Bbe I
(GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI (TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de
dicho espaciador se muestra en la SEC ID NO 11 (Lista de
Secuencias). Las secuencias subrayadas corresponden a los cebadores
utilizados para amplificar por PCR el fragmento de 193 pb en
merluzas y en bacalao.
La figura 11 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 537 pb amplificado en la especie Merluccius
australis. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra
también en la SEC ID NO 12 (Lista de Secuencias). Las secuencias
subrayadas corresponden a los cebadores utilizados para amplificar
por PCR el fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 12 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 529 pb amplificado en la especie Merluccius hubbsi.
Se indican las posiciones de las dianas de reconocimiento de las
enzimas de restricción: Afa I (GT!AC/CA!TG), Bbe I
(GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI (TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de
dicho espaciador se muestra también en la SEC ID NO 13 (Lista de
Secuencias). Las secuencias subrayadas corresponden a los cebadores
utilizados para amplificar por PCR el fragmento de 193 pb en
merluzas y en bacalao.
La figura 13 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 537 pb amplificado en la especie Merluccius albidus.
Se indican las posiciones de las dianas de reconocimiento de las
enzimas de restricción: Afa I (GT!AC/CA!TG), Bbe I
(GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI (TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de
dicho espaciador se muestra también en la SEC ID NO 14 (Lista de
Secuencias). Las secuencias subrayadas corresponden a los cebadores
utilizados para amplificar por PCR el fragmento de 193 pb en
merluzas y en bacalao.
La figura 14 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 529 pb amplificado en la especie Meriuccius
angustimanus. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra
también en la SEC ID NO 15 (Lista de Secuencias). Las secuencias
subrayadas corresponden a los cebadores utilizados para amplificar
por PCR el fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 15 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 538 pb amplificado en la especie Meriuccius
bilinearis. Se indican las posiciones de las dianas de
reconocimiento de las enzimas de restricción: Afa I
(GT!AC/CA!TG), Bbe I (GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI
(TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de dicho espaciador se muestra
también en la SEC ID NO 16 (Lista de Secuencias). Las secuencias
subrayadas corresponden a los cebadores utilizados para amplificar
por PCR el fragmento de 193 pb en merluzas y en bacalao.
La figura 16 muestra la secuencia del espaciador
ITS1 de 532 pb amplificado en el bacalao Gadus morhua. Se
indican las posiciones de las dianas de reconocimiento de las
enzimas de restricción: Afa I (GT!AC/CA!TG), Bbe I
(GGCGC!C/C!CGCGG) y Mlu NI (TGG!CCA/ACC!GGT). La secuencia de
dicho espaciador se muestra también en la SEC ID NO 17 (Lista de
Secuencias). Las secuencias subrayadas corresponden a los cebadores
utilizados para amplificar por PCR el fragmento de 193 pb en
merluzas y en bacalao.
La figura 17 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% con los patrones de fragmentos obtenidos tras la
digestión con Afa I del fragmento de 602-659
de los genes ribosómicos que contiene al espaciador ITS1, de cada
una de las 12 especies de merluza. La primera calle es el marcador
de peso molecular (p-GEM, Promega, referencia de
catálogo G1741) y las siguientes calles son (de izquierda a
derecha): ME = M. meriuccius, SE = M. senegalensis,
\hbox{PO =} M. polli, CA = M. capensis, PA
= M. paradoxus, PR = M. productus, GA = M.
gayi, AU = M. australis, HU = M. hubbsi, AL =
M. albidus, AN = M. angustimanus y BI = M.
bilinearis. Los tamaños de los fragmentos se indican en pares de
bases.
La figura 18 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% con los patrones de fragmentos obtenidos tras la
digestión con Bbe I del fragmento de 602-659
de los genes ribosómicos que contiene al espaciador ITS1 de cada
una de las 12 especies de merluza. La primera calle es el marcador
de peso molecular (p-GEM, Promega, referencia de
catálogo G1741) y las siguientes calles son (de izquierda a
derecha): ME = M. merluccius, SE = M. senegalensis,
\hbox{PO =} M. polli, CA = M. capensis, PA
= M. paradoxus, PR = M. productus, GA = M.
gayi, AU = M. australis, HU = M. hubbsi, AL =
M. albidus, AN = M. angustimanus y BI = M.
billnearis. Los tamaños de los fragmentos se indican en pares de
bases. Las bandas superiores no deben ser tenidas en cuenta para la
identificación pues son debidas al ruido de fondo de la variación
intraindividual del espaciador ITS1, que en ningún caso interfiere
con los patrones diagnóstico descritos.
La figura 19 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% con los patrones de fragmentos obtenidos tras la
digestión con Mlu NI del fragmento de 602-659
pb de los genes ribosómicos que contiene al espaciador ITS1, de
cada una de las 12 especies de merluza. La primera calle es el
marcador de peso molecular (p-GEM, Promega,
referencia de catálogo G1741) y las siguientes calles son (de
izquierda a derecha): ME = M. merluccius, SE = M.
senegalensis, PO = M. polli, CA = M. capensis, PA
= M. paradoxus, PR = M. productus, GA = M.
gayi, AU = M. australis, HU = M. hubbsi, AL =
M. albidus, AN = M. angustimanus y BI = M.
bilinearis. Los tamaños de los fragmentos se indican en pares de
bases.
La figura 20 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% con los patrones de fragmentos obtenidos tras la
digestión con Mnl I del fragmento de 602-659
pb de los genes ribosómicos que contiene al espaciador ITS1, de
Merluccius gayi y Merluccius angustimanus. La primera
calle es el marcador de peso molecular (p-GEM,
Promega, referencia de catálogo G1741) y las siguientes calles son
(de izquierda a derecha): GA = M. gayi y AN = M.
angustimanus. Los tamaños de los fragmentos se indican en pares
de bases.
La figura 21 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% con los fragmentos obtenidos tras la digestión con
Afa I, Bbe I y Mlu NI del fragmento de 605 pb
de los genes ribosómicos que contiene el ITS1 del bacalao (Gadus
morhua). La primera calle de la izquierda es el marcador de
peso molecular p-GEM (Promega, referencia de
catálogo G1741). Los tamaños de los fragmentos se indican en pares
de bases.
La figura 22 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 2% en la que se observa la amplificación A) con los
cebadores RP1 y RP2, de un fragmento de 193 pb del espaciador
ribosómico ITS1 que indica la presencia de merluza o bacalao en 4
muestras problema, y B) con los cebadores PP1 y PP2, de un fragmento
de 602-659 pb de los genes ribosómicos en las
mismas muestras que A. Los números corresponden a las 4 muestras
etiquetadas como colas de merluza. La primera calle de la izquierda
es el marcador de peso molecular (p-GEM, Promega,
referencia de catálogo G1741). Los tamaños de los fragmentos se
indican en pares de bases.
La figura 23 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% en la que se observan los patrones de bandas obtenidos
tras la digestión con Afa I del fragmento de
602-659 pb de los genes ribosómicos que contiene al
espaciador ITS1 en las muestras problema del Ejemplo 1. Los números
corresponden a 4 muestras etiquetadas como colas de merluza. La
primera calle de la izquierda es el marcador de peso molecular
(p-GEM, Promega, referencia de catálogo G1741). Los
tamaños de los fragmentos se indican en pares de bases.
La figura 24 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% en la que se observan los patrones de bandas obtenidos
tras la digestión con Afa I, del fragmento de
602-659 pb de los genes ribosómicos que contiene al
ITS1 en las muestras problema del Ejemplo 2. Los números
corresponden a 4 muestras etiquetadas como pimientos del
"piquillo rellenos de merluza con gambas". La primera calle de
la izquierda es el marcador de peso molecular
(p-GEM, Promega, referencia de catálogo G1741). Los
tamaños de los fragmentos se indican en pares de bases.
La figura 25 muestra una fotografía de un gel de
agarosa 3% en la que se observan los patrones de bandas obtenidos
tras la digestión con Afa I (calles 1 y 5), Bbe I
(calles 2 y 6) y Mlu NI (calles 3 y 7), del fragmento de
602-659 de los genes ribosómicos que contiene el
ITS1, de las muestras problema del Ejemplo 3. La calle de la
izquierda es el marcador de peso molecular (p-GEM,
Promega, referencia de catálogo G1741), y las calles 4 y 8 son
controles negativos. Los tamaños de los fragmentos se indican en
pares de bases.
<110> Universidad de Vigo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la diagnosis
genética de todas las especies del género Merluccius en la
cadena alimentaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> mpmerITS1.doc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Merluccius spp
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgggaggata gcggttac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 19
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Merluccius spp
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipcagtttcggg gatagcata
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> DNA
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<213> Merluccius spp
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipaagtaaaagt cgtaacaagg tttccgtagg
\hfill30
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<210> 4
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Merluccius spp
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagccgagt gatccaccgc
\hfill20
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<210> 5
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<211> 556
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<212> DNA
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<213> Merluccius merluccius
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(556)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Merluccius senegalensis
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(543)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 586
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<212> DNA
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<213> Merluccius polli
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(586)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Merluccius capensis
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(541)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 557
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<212> DNA
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<213> Merluccius paradoxus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(557)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
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<211> 530
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Merluccius productus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(530)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Merluccius gayi
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(531)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 12
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<211> 537
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<212> DNA
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<213> Merluccius australis
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(537)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5.8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
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<211> 529
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<212> DNA
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<213> Merluccius hubbsi
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(529)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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<210> 14
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<211> 537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Merluccius albidus
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(537)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Merluccius angustimanus
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(529)
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<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
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<211> 538
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<212> DNA
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<213> Merluccius bilinearis
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(538)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gadus morhua
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(532)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer espaciador transcrito (ITS1:
Internal Transcribed Spacer) no traducido, de los genes ribosómicos
(rDNA) 28S y 5,8S (i.e. 28 S+ITS1+5,8S)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Un procedimiento para la identificación
genética de especies de merluza, M. merluccius, M. senegalensis,
M. polli, M. capensis, M. paradoxus, M. productus, M. gayi, M.
australis, M. hubbsi, M. albidus, M. angustimanus y M.
bilinearis en una muestra a ensayar, que comprende las etapas
de (Figura 1):
- a.
- Obtención de una muestra a ensayar.
- b.
- Extracción y purificación del ADN de la muestra.
- c.
- Comprobación de la cantidad y calidad del ADN extraído en gel de agarosa.
- d.
- Amplificación por PCR de un fragmento de 193 pb del espaciador ITS1 de los genes ribosómicos, con los cebadores RP1 y RP2 que corresponden a las SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2, respectivamente,
- e.
- Comprobación de la amplificación en gel de agarosa.
- f.
- Si ha habido amplificación, se amplifica por PCR un fragmento de 602-659 pb de los genes ribosómicos, con los cebadores PP1 y PP2 que corresponden a las SEC ID NO 3 y SEC ID NO 4, respectivamente, y se comprueba la correcta amplificación del fragmento.
- g.
- Digestión de los amplicones con enzimas de restricción que reconozcan las dianas GT!AC/CA!TG, GGCGC!C/C!CGCGG, TGG!CCA/ACC!GGT y GTCTC(N)_{1}!/CAGAG(N)_{5}!.
- h.
- Análisis de los productos de digestión obtenidos, frente a los patrones de restricción característicos de las especies a identificar de modo que:
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia GT!AC/CA!TG tres fragmentos de 466, 166 y 27 pb son indicativos de la presencia de Merluccius polli; cuatro fragmentos de 254, 158, 125 y 65 pb indican la presencia de Merluccius hubbsi; dos fragmentos de 440 y 190 pb son indicativos de la presencia de Merluccius paradoxus y si existe Merluccius bilinearis observaremos cuatro fragmentos de 214, 194, 123 y 76 pb (Figura 17).
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia GGCGC!C/C!CGCGG, un fragmento de 610 pb es indicativo de la presencia de Merluccius albidus; tres fragmentos de 272, 265 y 92 pb indican la presencia de Merluccius merluccius; si hay Merluccius senegalensis observaremos tres fragmentos de 274, 255 y 89 pb; dos fragmentos de 526 y 88 pb son indicativos de Merluccius capensis; si hay Merluccius australis obtendremos tres fragmentos de 279, 234, y 97 pb; si hay Merluccius productus o Merluccius gayi o Merluccius angustimanus veremos respectivamente tres fragmentos de 281, 226 y 96; 283, 226 y 95; y 280, 226 y 96 pb (Figura 18).
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia TGG!CCA/ACC!GGT se distinguirá un fragmento de 603 pb correspondiente a Merluccius productus, de Merluccius gayi y Merluccius angustimanus que presentan dos fragmentos, uno común de 388 pb y otro específico de 216 y 214 pb respectivamente (Figura 19).
- -
- con la enzima de restricción que reconoce la secuencia CCTC(N)_{7}!/GGAG(N)_{6}! se distinguirá Merluccius gayi de Merluccius angustimanus, por la presencia en Merluccius angustimanus de un fragmento de 160 pb que no está presente en Merluccius gayi (Figura 20).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la muestra a ensayar procede de un producto fresco, congelado o
procesado, etiquetado como Merluza, pescadilla, merluza austral o
merluza de Chile o merluza sureña, merluza americana o plateada,
merluza del Cabo, merluza del Perú o gayi, merluza argentina o
sudamericana, merluza europea, merluza del cabo o merluza de altura,
merluza negra o merluza del Pacífico.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
que la enzima que reconoce la diana de restricción GT!AC/CA!TG es
la enzima Afa I, la enzima que reconoce la diana de
restricción GGCGC!C/C!CGCGG es la enzima Bbe I, la enzima que
reconoce la diana de restricción TGG!CCA/ACC!GGT es la enzima
Mlu NI, y la enzima que reconoce la diana de restricción
CCTC(N)_{7}!/GGAG(N)_{6}! es la
enzima Mnl I.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el análisis de los productos de la digestión enzimática se
lleva a cabo mediante separación electroforética de los fragmentos
y la visualización de los mismos por tinción con Bromuro de
Etidio.
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| ES200300996A ES2237285B2 (es) | 2003-04-30 | 2003-04-30 | Procedimiento para la diagnosis genetica de todas las especies del genero merluccius en la cadena alimentaria. |
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| ES200300996A ES2237285B2 (es) | 2003-04-30 | 2003-04-30 | Procedimiento para la diagnosis genetica de todas las especies del genero merluccius en la cadena alimentaria. |
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| ES2237285A1 ES2237285A1 (es) | 2005-07-16 |
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| ES200300996A Expired - Fee Related ES2237285B2 (es) | 2003-04-30 | 2003-04-30 | Procedimiento para la diagnosis genetica de todas las especies del genero merluccius en la cadena alimentaria. |
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 2003-04-30 ES ES200300996A patent/ES2237285B2/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| ASENSIO L. et al. "Identification of Nile perch (Lates niloticus), grouper (Epinephelus guaza), and wreck fish (Polyprion americanus) fillets by PCR amplification of the 5S rDNA gene". J. AOAC Int., 2001 Mayo-Jun., 84 (3):777-81. * |
| MEYER R. et al. "Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food". J. AOAC Int., 1995 Nov.-Dic., 78 (6):1542-51. * |
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