ES2224414T3

ES2224414T3 - Proteinas ikk-alfa, acidos nucleicos y metodos.

Info

Publication number: ES2224414T3
Application number: ES98933094T
Authority: ES
Inventors: Mike Rothe; Zhaodan Cao; Catherine Regnier
Original assignee: Tularik Inc
Current assignee: Tularik Inc
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: US6235492B1; US6479266B1; EP1005539B1; ATE277171T1; EP1005539A1; JP3549899B2; CA2294566A1; JP2001510346A; US6235513B1; AU8283698A; US20060019365A1; US20030077683A1; EP1005539A4; DE69826493D1; JP2003265192A; US6235512B1; US7045613B2; AU726294B2; WO1999001541A1; DE69826493T2

Abstract

Un polipéptido de IKK-a aislado que comprende la SEQ ID NO:4, que fosforila IKBa en las serinas 32 y 36. Un ácido nucleico o recombinante que comprende una cadena de SEQ ID NO:3. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido y una célula que comprende un ácido nucleico. Un método para fabricar un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho mé- todo las etapas de: introducir un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 en una célula o extracto celular hospedante, incubar dicha célula o extracto hospedante bajo las condiciones necesarias para que dicho ácido nucleico sea expresado como un tránscrito y dicho tránscrito sea expresado como un producto de traducción que comprende dicho polipéptido, y aislar dicho producto de traducción.

Description

Proteínas IKK-\alpha, ácidos nucleicos y métodos.

Campo de la invención

El campo de esta invención son las proteínas involucradas en la activación del factor de transcripción.

Antecedentes

Las citoquinas disparan cambios en la expresión génica modificando la actividad de los factores de transcripción latentes (Hill y Treisman, 1995). El factor nuclear \kappaB (NF-\kappaB) es un ejemplo destacado de cuánto un estímulo externo es convertido en un factor de transcripción activo (Verna y col., 1995). El sistema NF-\kappaB está compuesto de homo y heterodímeros de miembros de la familia Rel de factores de transcripción relacionados que controlan la expresión de numerosos genes de respuesta inmune e inflamatoria así como de genes virales importantes (Lenardo y Baltimore, 1989, Baeuerle y Henkel, 1994). La actividad de los factores de transcripción NF-\kappaB está regulada por su localización subcelular (Verma y col., 1995). En la mayoría de los tipos de célula, el NF-\kappaB está presente como un heterodímero que comprende una subunidad de 50 kDa y una subunidad de 65 kDa. Este heterodímero es aislado en el citoplasma en asociación con I\kappaB\alpha, un miembro de la familia I\kappaB de proteínas inhibidoras (Finco y Baldwin, 1995; Thanos y Maniatis, 1995; Verma y col., 1995). El I\kappaB\alpha enmascara la señal de localización nuclear del NF-\kappaB y con ello evita la translocalización nuclear del NF-\kappaB. La conversión de NF-\kappaB en un factor de transcripción activo que se translocaliza en el núcleo y que se une a secuencias de ADN afines requiere la fosforilación y la posterior degradación dependiente de ubiquitina del I\kappaB\alpha en los 26 proteosomas. La fosforilación de I\kappaB\alpha inducida por señal se produce en las serinas 32 y 36. La mutación de una o de ambas serinas da lugar a I\kappaB\alpha resistente a la ubiquitinación y a la degradación proteolítica (Chen y col., 1995).

El factor de necrosis tumoral de citoquinas pleiotrópicas (TNF) y la interleucina-1 (IL-1) están entre los inductores fisiológicos de la fosforilación de I\kappaB y de la posterior activación de NF-\kappaB (Osborn y col., 1989; Beg y col., 1993). Aunque el TNF y la IL-1 inician cascadas de señalización que conducen a la activación del NF-\kappaB a través de distintas familias de receptores de superficie celular (Smith y col., 1994; Dinarello, 1996), ambas rutas utilizan miembros de la familia de factor asociado a receptor TNF (TRAF, del inglés "TNF receptor-associated factor") de las proteínas adaptor como transductores de señales (Rothe y col., 1995; Hsu y col., 1996; Cao y col., 1996b). Originalmente, se descubrió que las proteínas TRAF se asocian directamente a los dominios citoplasmáticos de varios miembros de la familia de receptores TNF, incluyendo el receptor TNF de 75 kDa (TNFR2), el CD40, el CD30, y el receptor linfotoxina-\beta (Rothe y col., 1994; Hu y col., 1994; Cheng y col., 1995; Mosialos y col., 1995; Song y Donner, 1995; Sato y col., 1995; Lee y col., 1996; Gedrich y col., 1996; Ansieau y col., 1996). Además, las proteínas TRAF son reclutadas indirectamente al receptor TNF de 55 kDa (TNFR1) mediante la proteína adaptor TRADD (Hsu y col., 1996). La activación de NF-\kappaB mediante TNF requiere TRAF2 (Rothe y col., 1995; Hsu y col., 1996). El TRAF5 también ha sido relacionado con la activación de NF-\kappaB a través de miembros de la familia de receptores TNF (Nakano y col., 1996). Por el contrario, el TRAF6 participa en la activación de NF-\kappaB mediante IL-1 (Cao y col., 1996b). En el tratamiento con IL-1, el TRAF6 se asocia con IRAK, una quinasa serina-treonina que se une al complejo receptor IL-1 (Cao y col., 1996a).

La quinasa inductora de NF- \kappaB (NIK, del inglés " NF-\kappaB-inducing kinase") es un miembro de la familia quinasa quinasa quinasa MAP (MAP3K) que fue identificado como una proteína que interactúa con TRAF2 (Malinin y col., 1997). La NIK activa el NF-\kappaB cuando es sobreexpresada, y los mutantes inactivos a quinasa de NIK que comprenden su dominio del extremo C que interactúa con TRAF2 (NIK_{(624-947)}) o que carecen de dos residuos de lisina cruciales en su dominio de quinasa (NIK_{(KK429-430AA)}) se comportan como inhibidores negativos dominantes que suprimen la activación de NF-\kappaB inducida por TNF, IL-1, y TRAF2 (Malinin y col., 1997). Recientemente, se descubrió que la NIK se asocia con miembros adicionales de la familia TRAF, que incluyen el TRAF5 y el TRAF6. Los mutantes catalíticamente inactivos de la NIK también inhibieron la activación de NF-\kappaB inducido por TRAF5 y por TRAF6, proporcionando de este modo un concepto unificante para la NIK como mediador común en las cascadas de señalización de NF-\kappaB activadas por TNF y IL-1 por debajo de los TRAFs.

Se han descubierto dos quinasas I\kappaB de 36 y de 40 kDa que fosforilan las posiciones de los 40 residuos C-terminales del I\kappaB\alpha (Bennett y col., 1996). También se ha descrito una quinasa I\kappaB específica para los residuos Ser 293 y Thr 291 del dominio ácido en el extremo C del I\kappaB\alpha (Kuno y col., 1995). Se ha demostrado que la Ser 32 y la Ser 36 de I\kappaB\alpha son fosforilados en respuesta al TNFalpha y a la IL-1 (Mercurio y col., 1996).

Aquí, describimos una nueva quinasa humana I\kappaB Quinasa, IKK-\alpha, como una proteína que interactúa con NIK. La IKK-\alpha tiene una similitud de secuencia con la traducción conceptual de un marco de lectura abierto identificado previamente (SEQ ID NO:5), el cual se postula que codifica una quinasa serina-treonina de función desconocida ("Conserved Helix-loop-helix Ubiquitous Kinase" o CHUK, Conelly y Marcu, 1995; Mock y col., 1995). Se ha demostrado que los mutantes catalíticamente inactivos de la IKK-\alpha suprimen la activación de NF-\kappaB inducida por estimulaciones de TNF y de IL-1 así como por TRAF y sobreexpresión de NIK; se demuestra que la IKK-\alpha expresada transitoriamente se asocia con el complejo I\kappaB\alpha endógeno; y se demuestra que la IKK-\alpha fosforila I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36.

Sumario de la invención

La invención proporciona métodos y composiciones relacionadas con polipéptidos de IKK-\alpha aislados y con
los ácidos nucleicos relacionados. Los polipéptidos de IKK-\alpha pueden regular la activación de NF\kappaB y por lo tanto proporcionan reguladores importantes de la función celular. Los polipéptidos pueden ser producidos recombinantemente a partir de células hospedantes transformadas procedentes del polipéptido IKK-\alpha sujeto que codifica los ácidos nucleicos o pueden ser purificados a partir de células de mamífero. La invención proporciona métodos de escrutinio de un agente que modula la interacción de un polipéptido IKK-\alpha con un objetivo de unión. La descripción es útil en diagnosis (por ejemplo, escrutinios de hibridación genética de tránscritos IKK-\alpha), en terapia (por ejemplo, inhibidores de quinasa IKK-1 para inhibir la transducción de señal de TNF) y en la industria biofarmacéutica (por ejemplo, como inmunógenos, reactivos para aislar otros reguladores transcripcionales, reactivos para el escrutinio de agentes farmacológicos de cabeza en librerías químicas, etc.).

En particular, la presente invención proporciona:

-: Un polipéptido IKK-\alpha aislado que comprende la SEQ ID NO:4, que fosforila I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36;

-: Un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una cadena de la SEQ ID NO:3;

-: Un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención;

-: Una célula que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención;

-: Un método para fabricar un polipéptido aislado de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas de: introducir un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula hospedante o en extracto celular, incubar dicha célula hospedante o dicho extracto en las condiciones en las que dicho ácido nucleico es expresado como un tránscrito y dicho tránscrito es expresado como un producto de traducción que comprende dicho polipéptido, y aislar dicho producto de traducción; y

-: Un método para realizar el escrutinio de un agente que modula la interacción de un polipéptido IKK-\alpha con un objetivo de unión, comprendiendo dicho método las etapas de: incubar una mezcla que comprende:

: un polipéptido aislado de acuerdo con la invención,

: un objetivo de unión de dicho polipéptido, y

: un agente candidato;

: en las condiciones mediante las cuales, pero para la presencia de dicho agente, dicho polipéptido se une específicamente a dicho objetivo de unión en un afinidad de referencia; detectar la afinidad de unión de dicho polipéptido a dicho objetivo de unión para determinar una afinidad por el agente, en el que una diferencia entre la afinidad por el agente y la afinidad de referencia indica que dicho agente modula la unión de dicho polipéptido a dicho objetivo de unión.

Descripción detallada de la invención

La secuencia de nucleótidos de un cADN natural que codifica un polipéptido IKK-\alpha humano se muestra como SEQ ID NO:3, y la traducción conceptual completa se muestra como SEQ ID NO:4.

TABLA 1 Ejemplos de polipéptidos IKK-\alpha que tienen especificidad de unión de IKK-\alpha

hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 1-30)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 686-699)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 22-31)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 312-345)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 599-608)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 419-444)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 601-681)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 495-503)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 604-679)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 565-590)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 670-687)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 610-627)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 679-687)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 627-638)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 680-690)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 715-740)
hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 684-695)	hIKK-\alpha\Delta1 (SEQ ID NO:4, residuos 737-745)

Los polipéptidos IKK-\alpha sujetos presentan actividad de quinasa específica de IKK-\alpha. Los polipéptidos IKK-\alpha son capaces de fosforilar tanto la serina 32 como la serina 36 de I\kappaB (Verma, I. M., y col. (1995)). Tal como se usan aquí, Ser32 y Ser36 de I\kappaB se refieren de forma colectiva a los dos residuos de serina que son parte de la secuencia de consenso DSGL/IXSM/L (por ejemplo, ser 32 y 36 en I\kappaB\beta, y ser 157 y 161, ó 18 y 22, dependiendo del uso de metioninas, en I\kappaB\varepsilon, respectivamente).

La actividad de quinasa específica de IKK-\alpha puede ser determinada mediante los cómodos ensayos in vitro, basados en células, o in vivo: por ejemplo, ensayos de unión in vitro, ensayos de cultivo celular, en animales (por ejemplo, terapia génica, transgénicos, etc.), etc. Los ensayos de unión abarcan cualquier ensayo en el que se evalúe la interacción molecular de un polipéptido de IKK-\alpha con un objetivo de unión. El objetivo de unión puede ser un objetivo de unión intracelular natural tal como un sustrato de IKK-\alpha, una proteína reguladora de IKK-\alpha u otro regulador que module directamente la actividad de IKK-\alpha o su localización; u objetivos de unión no naturales tales como una proteína inmune específica tal como un anticuerpo, o un agente específico de IKK-\alpha tal como los identificados en los ensayos de escrutinio descritos más adelante. La especificidad de unión de IKK-\alpha puede ser evaluada mediante la actividad de quinasa o mediante las constantes de equilibrio de unión (normalmente de al menos aproximadamente 10^{7} M^{-1}, preferiblemente de al menos aproximadamente 10^{8} M^{-1}, más preferiblemente de al menos aproximadamente 10^{9} M^{-1}), mediante la capacidad del polipéptido sujeto para función como mutante negativo en células que expresan IKK-\alpha, para provocar anticuerpos específicos de IKK-\alpha en un hospedante heterólogo (por ejemplo, un roedor o un conejo), etc. En cualquier caso, la especificidad de unión de IKK-\alpha de los polipéptidos de IKK-\alpha sujetos distingue necesariamente las secuencias CHUK murinas y humanas de Conelly y Marcu (1995) así como la IKK-\beta (SEQ ID NO:2).

Los polipéptidos de IKK-\alpha reivindicados están aislados o son puros: un polipéptido "aislado" no va acompañado de al menos algo del material con el que está asociado en su estado natural, constituyendo preferiblemente al menos aproximadamente 0,5%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 5% en peso del polipéptido total en una muestra dad y un polipéptido puro constituye al menos aproximadamente el 90%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 99% en peso del polipéptido total en una muestra dada. En una realización particular, los polipéptidos de IKK-\alpha son aislados a partir de complejo de MKP-1 precipitable, aislado a partir de complejo IKK, y/o aislados a partir de IKK-\beta. Los polipéptidos de IKK-\alpha y los dominios de polipéptido pueden ser sintetizados, producidos mediante tecnología recombinante, o purificados a partir de células de mamífero, preferiblemente de humano. Se dispone de una amplia variedad de métodos moleculares y bioquímicos para la síntesis bioquímica, para la expresión molecular y para la purificación de las composiciones sujeto, véase, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, y col., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, y col., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), o que, en caso contrario, son conocidos en la técnica.

Los agentes de unión específicos de los polipéptidos IKK, preferiblemente los polipéptidos IKK-\alpha reivindicados, incluyen sustratos, agonistas, antagonistas, objetivos de unión intracelulares naturales, etc., métodos para identificar y fabricar dichos agentes, y su uso en diagnosis, terapia y desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, los agentes de unión específicos son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnosis y terapéuticas, especialmente cuando la enfermedad o la prognosis de enfermedad están asociadas con una utilización incorrecta de una ruta que incluye las proteínas sujeto, por ejemplo, la activación de NF-\kappaB. Los agentes de unión específica de IKK nuevos incluyen receptores específicos de IKK, tales como receptores de polipéptido recombinado somáticamente como los anticuerpos específicos o los receptores de antígeno de célula T (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) y otros agentes de unión intracelulares naturales identificados con ensayos tales como los escrutinios de uno, dos y tres híbridos, agentes de unión intracelulares no naturales identificados en escrutinios de librerías químicas tales como las descritas más adelante, etc. Agentes de interés particular modulan la función IKK, por ejemplo, la activación transcripcional dependiente de IKK. Por ejemplo, una amplia variedad de inhibidores de la actividad de quinasa de IKK I\kappaB incluyen clases conocidas de inhibidores de serina/treonina quinasa (por ejemplo, PKC) tales como los inhibidores competitivos de ATP e inhibidores de unión de sustrato, de antibióticos, de péptidos derivados de IKK, etc., ver las Tablas II y III. La especificidad y la actividad de IKK son fácilmente cuantificadas en ensayos de quinasa de elevada capacidad de producción usando paneles de proteína quinasas (ver las referencias citadas y los Ejemplos).

Los inhibidores preferidos incluyen compuestos naturales tales como la estaurosporina (Amura S., y col., J Antibiot. (Tokio), julio de 1995; 48 (7): 535-48), producida por un organismo marino, y compuestos sintéticos tales como el PD 153035, que también inhibe potentemente a la proteína quinasa de receptor EGF (Fry D. W. y col., Science, 19 de agosto de 1994; 265 (5175): 1093-5). Los miembros de la familia de tirfostina de inhibidores sintéticos de proteína quinasa también son útiles; incluyen compuestos que son competidores de ATP puros, compuestos que son competidores de sustrato puros, y compuestos que son competidores mixtos: compiten tanto con el ATP como con el sustrato (Levitzki A. y Gazit A., Science, 24 de marzo de 1995; 267 (5205): 1782-8). Inhibidores adicionales de IKK incluyen competidores de sustrato basados en péptidos fabricados endógenamente por la célula de mamífero, por ejemplo, PKI (inhibidor de proteína quinasa, del inglés "protein kinase inhibitor", Seasholtz A. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 28 de febrero de 1995; 92 (5): 1734-8), o proteínas que inhiben las quinasas cdc (Correa-Bordes J. y Nurse P., Cell, 15 de diciembre de 1995; 83 (6): 1001-9). Inhibidores adicionales de quinasa basados en péptidos pequeños, competitivos con sustratos e inhibidores alostéricos (mecanismos de inhibición independientes de la competencia con ATP o con sustrato) son fácilmente generados mediante los métodos establecidos (Hvalby O., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 24 de mayo de 1994; 91 (11): 4761-5; Barja P., y col., Cell Immunol., enero de 1994; 153(1): 28-38; Villar-Palasi C, Biochim. Biophys. Acta, 30 de diciembre de 1994; 1224(3): 384-8; Liu W. Z., y col., Biochemistry, 23 de agosto de 1994; 33 (33): 10120-6).

TABLA II Inhibidores de Quinasa IKK de Molécula Pequeña Seleccionados

HA-100^{1}	Iso-H7^{12}	A-3^{18}
Queleritrina^{2}	PKC 19-31	HA1004^{19,20}
Estaurosporina^{3,4,5}	H-7^{13,3,14}	K-252a^{16,5}
Calfostina C^{6,7,8,9}	H-89^{15}	KT5823^{16}
K-252b^{10}	KT5720^{16}	ML-9^{21}
PKC 19-36^{11}	cAMP-depPKinhib^{17}	KT5926^{22}

Referencias

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TABLA III Inhibidores de quinasa IKK de Peptidilo seleccionados

	hI\kappaB\alpha, residuos 24-39, 32Ala	hIKK-\alpha, \Delta5-203
	hI\kappaB\alpha, residuos 29-47, 36Ala	hIKK-\alpha, \Delta1-178
	hI\kappaB\beta, residuos 26-46, 32/36Ala	hIKK-\alpha, \Delta368-756
	hI\kappaB\beta, residuos 25-38, 32Ala	hIKK-\alpha, \Delta460-748
	hI\kappaB\beta, residuos 30-41, 36Ala	hIKK-\alpha, \Delta1-289
	hI\kappaB\beta, residuos 26-46, 32/36Ala	hIKK-\alpha, \Delta12-219
	hI\kappaB\varepsilon, residuos 24-40, 32Ala	hIKK-\alpha, \Delta3o7-745
	hI\kappaB\varepsilon, residuos 31-50, 36Ala	hIKK-\alpha, \Delta319-644
	hI\kappaB\varepsilon, residuos 27-44, 32/36Ala

Los inhibidores preferidos son activos oralmente en hospedantes mamíferos. Para usos de diagnosis, los inhibidores u otros agentes de unión de IKK son marcados frecuentemente, por ejemplo con moléculas fluorescentes, radioactivas, quimioluminiscentes, o con otras moléculas fácilmente detectables, ya sea directamente conjugadas con el agente de unión, o conjugadas a una sonda específica para el agente de unión.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de IKK-\alpha descritos son usadas para traducir hacia atrás los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de IKK-\alpha optimizados para los sistemas de expresión seleccionados (Holler y col. (1993) Gene 136, 323-328; Martin y col. (1995) Gene 154, 150-166) o son usadas para generar prímeros de oligonucleótidos degenerados y sondas para su uso en el aislamiento de secuencias naturales de ácido nucleico que codifica IKK-\alpha (software "GCG", Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI). Los ácidos nucleicos que codifican IKK-\alpha usando en los vectores de expresión de IKK-\alpha e incorporados en células hospedantes recombinantes, por ejemplo para la expresión y el escrutinio, en animales transgénicos, por ejemplo para estudios funcionales tales como la eficacia de fármacos candidatos para enfermedades asociadas a la función celular modulada por IKK-\alpha, etc.

Las sondas de hibridación de ácido nucleico y los prímeros de replicación/amplificación que presentan una secuencia específica de cADN de IKK-\alpha comprenden al menos 12, preferiblemente al menos 24, más preferiblemente al menos 36 y aún más preferiblemente al menos 96 bases contiguas de una cadena de SEQ ID NO:3, particularmente de SEQ ID NO:2, nucleótidos 1-1913, y, preferiblemente, que incluyen al menos una de las bases 1-92, 1811, 1812, 1992, 1995, 2034, 2035, 2039, 2040, 2050, 2055 y 2060, y suficiente para hibridarse específicamente con un segundo ácido nucleico que comprende la cadena complementaria de SEQ ID NO:3 en presencia de un tercer ácido nucleico que comprende (SEQ ID NO:5). Demostrar la hibridación específica generalmente requiere condiciones restrictivas, por ejemplo, hibridar en una disolución tampón que comprende un 30% de formamida en disolución tampón 5 x SSPE (NaCl 0,18 M, NaPO_{4} 0,01M, pH 7,7, EDTA 0,001 M) a una temperatura de 42ºC y permaneciendo unido cuando es sometido a lavado a 42ºC con 0,2 x SSPE; preferiblemente hibridando en una disolución tampón que comprende un 50% de formamida en una disolución tampón 5 x SSPE a una temperatura de 42ºC y permaneciendo unido cuando es sometido a lavado a 42ºC con disolución tampón 0,2 x SSPE a 42ºC. Los ácidos nucleicos de IKK-\alpha también pueden ser distinguidos usando algoritmos de alineamiento, tales como BLASTX (Altschul y col. (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410).

Los ácidos nucleicos sujetos son de secuencias sintéticas/no naturales y/o están aislados, es decir, no acompañados de al menos algo del material al que están asociados en su estado natural, constituyendo preferiblemente al menos aproximadamente 0,5%, preferiblemente al menos aproximadamente 5% en peso del total de ácidos nucleicos presentes en una fracción dada, y normalmente son recombinantes, lo que significa que comprenden una secuencia no natural o una secuencia natural unida a un nucleótido(s) diferente al que está unida en un cromosoma natural. Los ácidos nucleicos recombinantes que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 contienen dicha secuencia en un extremo, flanqueada inmediatamente por (es decir, están contiguos a) una secuencia diferente a la que están unidos en un cromosoma natural, o flaqueada por una región nativa inferior a 10 kb, preferiblemente inferior a 2 kb, que está en un extremo o que está inmediatamente flanqueada por una secuencia diferente a la que está unida en un cromosoma natural. Aunque los ácidos nucleicos son normalmente ARN o ADN, a menudo es ventajoso usar ácidos nucleicos que comprenden otras bases o análogos de nucleótidos para proporcionar una estabilidad modificada, etc.

Los ácidos nucleicos sujetos encuentran una amplia variedad de aplicaciones que incluyen el uso como tránscritos traducibles, sondas de hibridación, prímeros PCR, ácidos nucleicos de diagnosis, etc.; el uso en la detección de la presencia de genes de IKK-\alpha y de tránscritos de gen y en la detección o amplificación de ácidos nucleicos que codifican homólogos de IKK-\alpha adicionales y análogos estructurales. En diagnosis, las sondas de hibridación de IKK-\alpha encuentran un uso en la identificación alelos de IKK-\alpha naturales y mutantes en muestras clínicas y de laboratorio. Los alelos mutantes son usados para generar sondas de oligonucleótidos específicas para alelos (ASO, del inglés "allele-specific oligonucleotide") para diagnosis clínica de elevada producción. En terapia, los ácidos nucleicos de IKK-\alpha terapéuticos son usados para modular la expresión celular, la concentración intracelular o la disponibilidad de IKK-\alpha activo.

La invención proporciona métodos eficientes para identificar agentes, compuestos o compuestos de cabeza para agentes activos al nivel de una función celular de IKK modulable. Generalmente, estos métodos de escrutinio incluyen ensayar compuestos que modulan la interacción IKK con un objetivo de unión de IKK natural, en particular, la fosforilación de IKK de sustratos derivados de I\kappaB, particularmente sustratos I\kappaB y NIK. Se proporciona una amplia variedad de ensayos de agentes de unión, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína marcada in vitro, inmunoensayos, ensayos basados en las células, etc. Los métodos son adaptables al escrutinio automatizado de alta capacidad, eficiente económicamente, de librerías químicas en busca de compuestos de cabeza. Los reactivos identificados encuentran uso en la industria farmacéutica para ensayos con animales y humanos; por ejemplo, los reactivos pueden ser derivados y reescrutados en ensayos in vitro e in vivo para optimizar la actividad y minimizar la toxicidad para su desarrollo farmacéutico.

Los ensayos de unión in vitro emplean una mezcla de componentes que incluye un polipéptido IKK, que puede ser parte de un producto de fusión con otro péptido o polipéptido, por ejemplo, una etiqueta para la detección o para el anclaje, etc. Las mezclas de ensayo comprenden un objetivo de unión de IKK intracelular natural. En una realización particular, el objetivo de unión es un sustrato que comprende las serinas 32 y/o 36 de I\kappaB. Dichos sustratos comprenden un péptido I\kappaB\alpha, \beta o \varepsilon que incluye los residuos serina 32 y/o 36 y al menos 5, preferiblemente al menos 10, y más preferiblemente al menos 20 residuos naturales inmediatamente adyacentes en cada lado (por ejemplo, 36 péptidos, residuos 26-46, 22-42, ó 12-32 ó 151-171 para sustratos derivados de I\kappaB\alpha, \beta o \varepsilon, respectivamente). Aunque se pueden usar los objetivos de unión nativos de longitud completa, frecuentemente se prefiere usar porciones suyas (por ejemplo, péptidos) siempre que la porción proporcione afinidad de unión y avidez por el polipéptido de IKK sujeto, mensurable con facilidad en el ensayo. La mezcla de ensayo también comprende un agente farmacológico candidato. Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque típicamente son compuestos orgánicos; preferiblemente compuestos orgánicos pequeños, y son obtenidos a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen librerías de compuestos sintéticos o naturales. También se pueden incluir en la mezcla una variedad de otros reactivos. Estos incluyen reactivos como ATP o análogos de ATP (para ensayos de quinasa), sales, disoluciones tampón, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc.

La mezcla resultante es incubada en las condiciones mediante las cuales, excepto por la presencia del agente farmacológico candidato, el polipéptido de IKK se une específicamente al objetivo de unión celular, a una porción o análogo con una afinidad de unión de referencia. Los componentes de la mezcla pueden ser añadidos en cualquier orden que proporcione las uniones requeridas y las incubaciones pueden ser llevadas a cabo a cualquier temperatura que facilite la unión óptima. Asimismo, se selecciona los periodos de incubación para una unión óptima, pero también son minimizados para facilitar un escrutinio rápido de elevada capacidad.

Después de la incubación, la unión con el agente entre el polipéptido IKK y uno o más objetivos de unión es detectada por cualquier modo conveniente. Para los ensayos de quinasa IKK, la "unión" es detectada generalmente mediante un cambio en la fosforilación de un sustrato IKK-\alpha. En esta realización, la actividad de quinasa puede ser cuantificada por la transferencia del sustrato de un fosfato marcado, en la que la marca puede proporcionar una detección directa en la forma de radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc., o una detección indirecta tal como una etiqueta de epítopo, etc. Se pueden usar una variedad de métodos para detectar la etiqueta dependiendo de la naturaleza de la etiqueta y de la de otros componentes del ensayo, por ejemplo mediante densidad óptica o electrónica, emisiones radiantes, transferencias de energía no radiantes, o detectadas indirectamente con conjugados de anticuerpos, etc.

Una diferencia en la afinidad de unión del polipéptido de IKK con el objetivo en ausencia del agente en comparación con la afinidad de unión en presencia del agente indica que el agente modula la unión del polipéptido de IKK con el objetivo de unión de IKK. Análogamente, en el ensayo basado en células, descrito también más adelante, una diferencia en la activación transcripcional dependiente de IKK-\alpha en presencia y en ausencia de un agente indica que el agente modula la función de IKK. Una diferencia, tal como se usa aquí, es estadísticamente significativa y preferiblemente representa al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 90%, de diferencia.

La sección experimental y los ejemplos presentados a continuación se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Experimental Identificación de IKK-\alpha

Para investigar el mecanismo de la activación de NF-\kappaB mediada por NIK, identificamos proteínas que se asocian directamente con NIK mediante clonación de interacción de proteína de dos híbridos de levadura (Fields y Song, 1989). Se generó un vector de expresión que codifica NIK fusionada al dominio de unión de ADN del factor de transcripción de levadura GAL4. Este vector fue usado como señuelo en escrutinios de dos híbridos de una librería de cADN de célula B humana. A partir de aproximadamente seis millones de transformantes, se obtuvieron ocho clones positivos, determinado mediante activación genes de informe his y lacZ. De estos clones, tres codificaban un miembro de la familia TRAF, TRAF3 (Hu y col., 1994; Cheng y col., 1995; Mosialos y col., 1995; Sato y col., 1995) y uno codificó una proteína nueva que denominamos IKK-\alpha. Se aisló un clon de IKK-\alpha humana de longitud completa mediante escrutinio de una librería de cADN Jurkat con una sonda generada a partir del extremo 5' del clon de dos híbridos de IKK-\alpha. La IKK-\alpha comprende un dominio catalítico N-terminal de serina-treonina quinasa, un dominio de hélice-lazo-hélice C-terminal y una hélice \alpha antipática de leucina con forma de cremallera yuxtapuesta entre el dominio hélice-lazo-hélice y el dominio quinasa.

Interacción de IKK-\alpha y NIK en células humanas

La interacción de IKK-\alpha con NIK fue confirmada en ensayos de coinmunoprecipitación de células de mamíferos. La IKK-\alpha humana que contiene un epítopo de Flag N-terminal fue coexpresada transitoriamente en células 293 de riñón embriónico humano con proteínas NIK marcadas con epítopo Myc o con proteínas TRAF marcadas con epítopo HA. Los lisatos de célula fueron inmunoprecipitados usando un anticuerpo monoclonal contra el epítopo Flag, y coprecipitando proteínas NIK o TRAF, fueron detectados mediante análisis inmunoblot con anticuerpos monoclonales anti-Myc o anti-HA. En este ensayo, la IKK-\alpha fue capaz de coprecipitar NIK, confirmando la interacción entre ambas proteínas, detectada mediante análisis de dos híbridos de levadura para la IKK-\alpha. También, una proteína de IKK-\alpha mutante de eliminación que carece de la mayoría del dominio de quinasa N-terminal (IKK-\alpha_{(307-745)}) fue capaz de asociarse con NIK, lo que indica que la mitad C-terminal de hélice \alpha de la IKK-\alpha media en la interacción con NIK. Al contrario que la NIK, la IKK-\alpha no se asoció ni con TRAF2 ni con TRAF3. Sin embargo, cuando la NIK fue coexpresada con IKK-\alpha y TRAF2, se detectó una fuerte coprecipitación de TRAF2 con IKK-\alpha, indicando la formación de un complejo ternario entre la IKK-\alpha, la NIK y el TRAF2.

Efecto de IKK-\alpha y de los mutantes de IKK-\alpha sobre la activación de NF-\kappaB

Para investigar un posible papel de la IKK-\alpha en la activación de NF-\kappaB, examinados la sobreexpresión transitoria de IKK-\alpha podría activar un gen de informe dependiente de NF-\kappaB. Se cotransfectó un constructo de informe de E-selectinluciferasa (Schindler y Baichwal, 1994) y un vector de expresión de IKK-\alpha en células HeLa. La expresión de IKK-\alpha activó el gen de informe de un modo dependiente de la dosis, con una inducción máxima de actividad de luciferasa de aproximadamente 6 a 7 veces la del vector de control. Se obtuvieron resultados similares en las células 293, en las que la sobreexpresión de IKK-\alpha indujo actividad de gen de informe aproximadamente 4 veces superior. El tratamiento de TNF no estimuló la débil actividad inductora de NF-\kappaB de IKK-\alpha sobreexpresada en los ensayos de genes de informe. Por tanto, la IKK-\alpha induce la activación de NF-\kappaB cuando es sobreexpresada.

A continuación determinamos el efecto de la sobreexpresión de IKK-\alpha_{(307-745)} de quinasa inactiva, que todavía se asocia con NIK, sobre la activación de NF-\kappaB inducido por señal en ensayos de gen de informe en células 293. La sobreexpresión de IKK-\alpha_{(307-745)} bloqueó la activación de gen de informe inducida por TNF y por IL-1 de forma similar a la sobreexpresión de NIK_{(624-947)}. También se descubrió que el IKK-\alpha_{(307-745)} inhibía la actividad de gen de informe dependiente de NF-\kappaB provocada por la sobreexpresión de TRAF2, TRAF6 y NIK. Considerados en conjunto, estos resultados demuestran que un mutante de IKK-\alpha catalíticamente inactivo es un inhibidor dominante negativo de la activación de NF-\kappaB inducida por TNF, por IL-1, por TRAF y por NIK. Esto indica que la IKK-\alpha funciona como un mediador común de la activación de NF-\kappaB por TNF e IL-1 por debajo de NIK.

Referencias entre paréntesis

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Ejemplos 1. Protocolo para el ensayo de fosforilación IKK-\alpha - I\kappaB\alpha A. Reactivos

-: Neutralite Avidin: 20 \mug/ml en PBS.

-: Quinasa: IKK-\alpha 10^{-8} - 10^{-5} M (SEQ ID NO:4) a 20 \mug/ml en PBS.

-: Sustrato: sustrato biotinilado 10^{-7} - 10^{-4} M (péptido de 21 residuos que consiste en los residuos 26-46 de I\kappaB\alpha humano) a 40 \mug/ml en PBS.

-: Disolución tampón de bloqueo: 5% BSA, 0,5% de Tween 20 en PBS; 1 hora a temperatura ambiente.

-: Disolución tampón de ensayo: KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 1 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,25 mM, 1% de glicerol, 0,5% de NP-40, BME 50 mM, 1 mg/ml de BSA, cóctel de inhibidores de proteasa.

-: Reserva 10x de [^{32}P]\gamma-ATP: ATP frío 2 x 10^{-5} M con 100 \muCi [^{32}P]\gamma-ATP. Colocar en el microfrigorífico de 4ºC durante el escrutinio.

-: Cóctel de inhibidor de proteasa (1000X): 10 mg de Inhibidor de Tripsina (BMB nº 109894), 10 mg de Aprotinina (BMB nº 236624), 25 mg de Benzamidina (Sigma nº B-6506), 25 mg de Leupeptina (BMB nº 1017128), 10 mg de APMSF (BMB nº 917575), y NaVo_{3} 2 mM (Sigma nº S-6508) en 10 ml de PBS.

B. Preparación de las placas de ensayo

-: Recubrir con 120 \mul de reserva N Avidin por pocillo a lo largo de la noche a 4ºC.

-: Lavar dos veces con 200 \mul de PBS.

-: Bloquear con 150 \mul de disolución tampón de bloqueo.

-: Lavar dos veces con 200 \mul de PBS.

C. Ensayo

-: Añadir 40 \mul de disolución tampón de ensayo por pocillo.

-: Añadir 40 \mul de sustrato biotinilado (2-200 pmoles/40 \mul en disolución tampón de ensayo)

-: Añadir 40 \mul de quinasa (0,1 - 10 pmoles/40 \mul en disolución tampón de ensayo).

-: Añadir 10 \mul de compuesto o de extracto.

-: Añadir 10 \mul de reserva de [^{32}P]\gamma-ATP 10x.

-: Agitar a 25ºC durante 15 minutos.

-: Incubar otros 45 minutos adicionales a 25ºC.

-: Detener la reacción lavando 4 veces con 200 \mul de PBS.

-: Añadir 150 \mul de cóctel de centelleo.

-: Contar en Topcount.

D. Controles para todos los ensayos (localizados en cada placa)

: a. Unión no específica.

: b. Inhibición de ATP frío al 80%.

2. Protocolo para el ensayo de unión IKK-\alpha - NIK de elevada capacidad de producción. A. Reactivos

-: Neutralite Avidin: 20 \mug/ml en PBS.

-: Disolución tampón de ensayo: KCl 100 mM, HEPES 20 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 1 mM, 1% de glicerol, 0,5% de NP-40, \beta-mercaptoetanol 50 mM, 1 mg/ml de BSA, cóctel de inhibidores de proteasa.

-: Reserva 10x de polipéptido ^{33}P IKK-\alpha: IKK-\alpha"frío" 10^{-8} - 10^{-6} M suplementado con 200.000-250.000 cpm de IKK-\alpha marcada (contador Beckman). Colocar en el microfrigorífico de 4ºC durante el escrutinio.

-: NIK: NIK 10^{-7} - 10^{-5} M biotinilado en PBS.

B. Preparación de las placas de ensayo:

-: Lavar dos veces con 200 \mul de PBS.

-: Bloquear con 150 \mul de disolución tampón de bloqueo.

-: Lavar dos veces con 200 \mul de PBS.

C. Ensayo

-: Añadir 40 \mul de disolución tampón de ensayo por pocillo.

-: Añadir 10 \mul de compuesto o de extracto.

-: Añadir 10 \mul de ^{33}P-IKK-\alpha (20-25.000 cpm/0,1-10 pmoles/pocillo = conc. Final de 10^{-9} - 10 ^{-7} M).

-: Agitar a 25ºC durante 15 minutos.

-: Incubar otros 45 minutos adicionales a 25ºC.

-: Añadir 40 \mul de NIK biotinilada (0,1 - 10 pmoles/40 \mul en disolución tampón de ensayo).

-: Incubar 1 hora a temperatura ambiente.

-: Detener la reacción lavando 4 veces con PBS 200 \muM.

-: Añadir cóctel de centelleo 150 \muM.

-: Contar en Topcount.

D. Controles para todos los ensayos (localizados en cada placa):

: a. Unión no específica.

: b. Soluble (NIK no biotinilada) al 80% de inhibición.

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<110> TULARIK, INC

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<120> PROTEÍNAS IKK-ALFA, ÁCIDOS NUCLEICOS Y MÉTODOS

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<130> N78562 DMG PJC

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<140> 98933094_9

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<141> 1998-07-01

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<150> US 08/890854

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<151> 1997-07-01

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<160> 5

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<170> PatentIn Ver.2.1

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<210> 1

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<211> 2268

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2268)

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<400> 1

1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 756

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

6

7

8

9

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<210> 3

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<211> 2238

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2238)

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<400> 3

10

11

12

13

14

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<210> 4

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<211> 745

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

15

16

17

18

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<210> 5

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<211> 2146

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

19

20

Claims

1. Un polipéptido de IKK-\alpha aislado que comprende la SEQ ID NO:4, que fosforila I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36.

2. Un ácido nucleico o recombinante que comprende una cadena de SEQ ID NO:3.

3. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Una célula que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un método para fabricar un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho método las etapas de: introducir un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 en una célula o extracto celular hospedante, incubar dicha célula o extracto hospedante bajo las condiciones necesarias para que dicho ácido nucleico sea expresado como un tránscrito y dicho tránscrito sea expresado como un producto de traducción que comprende dicho polipéptido, y aislar dicho producto de traducción.

6. Un método de escrutinio de un agente que modula la interacción de un polipéptido IKK-\alpha con un objetivo de unión, comprendiendo dicho método las etapas de:

: incubar una mezcla que comprende:

: un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1,

: un objetivo de unión de dicho polipéptido, y

: un agente candidato;

: bajo las condiciones necesarias para que, excepto por la presencia de dicho agente, dicho polipéptido se una específicamente a dicho objetivo de unión con una afinidad de referencia;

: detectar la afinidad de referencia de dicho polipéptido con dicho objetivo de unión para determinar una afinidad por el agente, en el que una diferencia entre la afinidad por el agente y la afinidad de referencia indica que dicho agente modula la unión de dicho polipéptido con dicho objetivo de unión.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho objetivo de unión es un sustrato intracelular natural y dicha afinidad de referencia y por el agente es detectada como fosforilación de dicho sustrato.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho sustrato comprende un dominio de polipéptido I\kappaB que comprende al menos uno de Ser 32 y Ser 36.