ES2224189T3

ES2224189T3 - Uso de acidos nucleicos obtenidos a partir de la secuencia de retrovirus porcino.

Info

Publication number: ES2224189T3
Application number: ES96944298T
Authority: ES
Inventors: Jay A. Fishman
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-12-14
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2016-12-13
Also published as: ATE268387T1; JP2007014340A; AU730656B2; EP0870058A4; JP2000501942A; CA2237545A1; EP0870058A1; EP1452540A2; US6190861B1; DE69632643T2; AU1414097A; EP1452540A3; WO1997021836A1; DE69632643D1; EP0870058B1

Abstract

SE DESCRIBE UN ACIDO NUCLEICO PURIFICADO QUE PUEDE HIBRIDARSE DE FORMA ESPECIFICA CON LA SECUENCIA DE RETROVIRUS PORCINOS.

Description

Uso de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la secuencia de retrovirus porcino.

Secuencia molecular de retrovirus porcino y métodos de uso.

Campo de la invención

La invención se refiere a secuencias de retrovirus porcinos, a péptidos codificados por secuencias de retrovirus porcinos y a métodos de uso de los ácidos nucleicos y péptidos de retrovirus porcinos.

Antecedentes de la invención

Los avances en el trasplante de órganos sólidos y la escasez crónica de donantes de órganos adecuados han hecho que el xenotrasplante sea una alternativa atractiva al uso de aloinjertos humanos. Sin embargo, un problema que surge con el uso de estos métodos es la posibilidad de introducir un nuevo grupo de enfermedades infecciosas de los donantes animales en la población humana.

El término aplicado a la adquisición por los seres humanos de agentes infecciosos que llevan otras especies es zoonosis. El trasplante de infecciones de especies no humanas en seres humanos se denomina de la mejor manera "zoonosis directa" o "xenosis".

Los primates no humanos y los cerdos se han considerado las fuentes potenciales principales de órganos para xenotrasplante (Niekrasz et al.. (1992) Transplant Proc 24:625; Starzl et al.. (1993) Lancet 341:65; Murphy et al.. (1970) Trans Proc 4:546; Brede and Murphy (1972) Primates Med 7:18; Cooper et al.. En Xenotransplantation: The Transplantation of Organs and Tissues between Species, eds. Cooper et al.. (1991) p. 457; RY Calne (1970) Transplant Proc 2:550; H. Auchincloss, Jr. (1988) Transplantation 46:1, y Chiche et al.. (1993) Transplantation 6: 1418). Las enfermedades infecciosas para primates y cerdos son similares a las de los donantes humanos. La prevención de la infección depende de la capacidad de predecir, reconocer y prevenir infecciones comunes en el receptor del trasplante inmunocomprometido (Rubin et al.. (1993) Antimicrob Agents Chemother 37:619). Debido al transporte potencial por primates no humanos de patógenos adoptados fácilmente por los seres humanos, los problemas éticos, y el coste de mantenimiento de grandes colonias de primates, otras especies han recibido consideración como donantes de órganos (Brede y Murphy (1972) Primates Med 7:18; Van Der Riet et al.. (1987) Transplant Proc 19:4069; Katler en Xenotransplantation: The Transplantation of Organs and Tissues between Species, eds. Cooper et al.. (1991) p. 457; Metzger et al.. (1981) J Immunol 127:769; McClure et al.. (1987) Nature 330:487; Letvin et al.. (1987) J Infect Dis 156:406; Castro et al.. (1991) Virology 184:219; Benveniste and Todaro (1987) Proc Natl Acad Sci USA 70:3316; y Teich, en RNA Tumor viruses, eds. Weiss et al.. (1985) p. 25). La importancia económica de los cerdos y la experiencia en estudios de trasplante en el modelo de cerdo miniatura han permitido definir algunos de los patógenos potenciales asociados con estos animales (Niekrasz et al.. (1992) Transplant Proc 24:625; Cooper et al.. en Xenotransplantation: The Transplantation of Organs and Tissues between Species, eds. Cooper et al.. (1991) p. 457; y Leman et al.. (1992) Diseases of Swine, 7ª ed. Ames, Iowa: Iowa State University). Los cerdos miniatura han recibido consideración como donantes de órganos debido a varias características de la especie. La estructura y función de los órganos principales de los cerdos son comparables a la estructura y función de los órganos principales del ser humano. El cerdo alcanza pesos corporales y tamaños de órganos adecuados para la provisión de órganos para uso humano. Por último, los veterinarios y criadores comerciales han desarrollado estrategias para la creación de cerdos sin patógenos específicos (SPF) con la capacidad de eliminar patógenos conocidos de colonias de cría (Alexander et al.. (1980) Proc 6th Int Congr Pig Vet Soc, Copenhagen; Betts (1961) Vet Rec 73:1349; Betts et al.. (1960) Vet Rec 72:461; Caldwell et al.. (1959) J Am Vet Med Assoc 135:504; y Yong (1964) Adv Vet Sci 9:61).

Existe una preocupación sobre la transferencia de retrovirus porcinos por xenotrasplante (Smith (1993) N Engl J Med 328:141). Muchas de las propiedades únicas de los retrovirus se deben a la síntesis de una copia de ADN complementaria a partir de la plantilla de ARN (por transcriptasa inversa) y a la integración de este ADN en el genoma del hospedador. La copia retroviral integrada (que se denomina copia endógena o "provirus") puede transmitirse a través de la línea germinal.

En FEBS LETTERS, vol. 183, 1985, páginas 124 a 128, Suzuka et al.. informan sobre algunas características de un retrovirus porcino procedente de una línea celular derivada de linfomas malignos porcinos.

La entrada AAQ91980 en la base de datos EMBL de Gerard y Kotewicz se refiere a la secuencia para un ADN procedente del virus de la leucemia murina de Moloney que codifica una nueva transcriptasa inversa. Se dice que tiene actividad de ADN polimerasa pero ninguna actividad RNasa H, y es útil para la síntesis de ADNc.

La entrada X51929 de la base de datos EMBL de Moehring et al. se refiere a la secuencia de RD-144 exógeno y el elemento proviral endógeno relacionado ECE1 de gato doméstico que difieren en sus genes ENV.

Sumario de la invención

En general, la siguiente descripción de la invención se refiere a un ácido nucleico, descrito como un segundo ácido nucleico, que se define como un ácido nucleico que hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h).

La invención también proporciona un método para investigar en una célula o tejido la presencia o expresión de un retrovirus de cerdo o de cerdo miniatura que comprende poner en contacto un ácido nucleico diana del tejido con un segundo ácido nucleico, como se ha definido, en condiciones en las que pueda producirse hibridación, siendo indicativa la hibridación de la presencia o expresión de una secuencia retroviral o retrovirus endógeno de cerdo o de cerdo miniatura en el tejido.

También se proporciona un método para investigar en un genoma de cerdo o de cerdo miniatura la presencia de un retrovirus porcino, que comprende poner en contacto el ADN genómico del cerdo miniatura con un segundo ácido nucleico, como se ha definido, en condiciones en las que las secuencias puedan hibridar, siendo indicativa la hibridación de la presencia de la secuencia retroviral porcina endógena en el genoma del cerdo miniatura.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para evaluar el riesgo potencial asociado con el trasplante de un injerto desde un cerdo o cerdo miniatura donante a un animal receptor, que comprende poner en contacto un ácido nucleico diana del donante, receptor o el injerto, con un segundo ácido nucleico, como se ha definido, en condiciones en las que puedan hibridar las secuencias, siendo indicativa la hibridación de un riesgo asociado con el trasplante.

También se proporciona un método para proporcionar un cerdo o cerdo miniatura sin una inserción de retrovirus activable en un sitio preseleccionado, que comprende: realizar un cruce entre un primer cerdo miniatura que tiene una inserción retroviral en el sitio preseleccionado y un segundo cerdo miniatura que no tiene una inserción retroviral en un sitio preseleccionado, y recuperar una descendencia de cerdos miniatura que no tenga la inserción, donde la presencia o ausencia de la inserción retroviral se determina poniendo en contacto el genoma de un cerdo miniatura con un segundo ácido nucleico como se ha definido.

También forma parte de esta invención un método para localizar el origen de una infección retroviral porcina y, comprende poner en contacto un ácido nucleico diana del injerto u órgano con un segundo ácido nucleico, como se ha definido, poner en contacto un segundo ácido nucleico diana del receptor con un tercer ácido nucleico, donde el tercer ácido nucleico es como se ha definido en relación con el segundo ácido nucleico, donde la hibridación con el ácido nucleico del injerto se correlaciona con la infección retroviral porcina en el injerto; y la hibridación con el ácido nucleico del receptor se correlaciona con la infección retroviral porcina en el receptor.

Otra parte de esta invención es un método para investigar en un ser humano la presencia o expresión de un retrovirus porcino endógeno que comprende: poner en contacto un ácido nucleico diana derivado del ser humano con un segundo ácido nucleico, como se ha definido, en condiciones en las que puedan hibridar las secuencias, siendo indicativa la hibridación de la presencia de las secuencias retrovirales o retrovirus porcinos endógenos en el ser humano.

La invención también comprende un método para determinar el número de copias, el tamaño o la terminación de un retrovirus porcino, que comprende: poner en contacto un ácido nucleico diana del donante, receptor o un injerto, con un segundo ácido nucleico, como se ha definido.

En realizaciones preferidas, la secuencia de nucleótidos del segundo ácido nucleico comprende al menos 20, 25, 30, 50, 100 ó 1000 nucleótidos consecutivos.

En otras realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad de secuencia de al menos un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con la secuencia con la que hibrida o su complementaria.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico es distinto del genoma retroviral entero de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, por ejemplo, tiene al menos 1 nucleótido más o menos, o difiere en la secuencia en al menos una posición, por ejemplo, el ácido nucleico es un fragmento de la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o incluye una secuencia adicional a la de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otras realizaciones: la secuencia del segundo ácido nucleico difiere de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria en 1, 2, 3, 4 ó 5 pares de bases; la secuencia del segundo ácido nucleico difiere de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria en al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 pares de bases pero en menos de 6, 7, 8, 9 ó 10 pares de bases.

En otras realizaciones preferidas: el segundo ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 ó 8060 nucleótidos; el segundo ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 ó 8060 nucleótidos.

En otras realizaciones preferidas: el segundo ácido nucleico puede hibridar específicamente con una región traducible de un genoma retroviral de cerdo miniatura, el genoma retroviral de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, por ejemplo, una región del gen gag, pol o env; el segundo ácido nucleico puede hibridar específicamente con una región no traducida de un genoma retroviral de cerdo miniatura de la SEC D Nº: 3 o su secuencia complementaria; el segundo ácido nucleico puede hibridar específicamente con una región no conservada de un genoma retroviral de cerdo miniatura de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; el segundo ácido nucleico puede hibridar específicamente con las regiones muy conservadas de un genoma retroviral de cerdo miniatura de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En realizaciones preferidas, el cebador se selecciona entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº: 4-74.

En realizaciones preferidas, la hibridación del segundo ácido nucleico como sonda a secuencias retrovirales puede detectarse por métodos convencionales, por ejemplo, por sondas radiomarcadas o por sondas que llevan marcadores no radiactivos tales como enzimas o sitios de unión a anticuerpos. Por ejemplo, una sonda puede conjugarse con una enzima tal como peroxidasa de rábano picante, donde la actividad enzimática de la enzima conjugada se usa como señal de hibridación. Como alternativa, la sonda puede acoplarse a un epítopo reconocido por un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo conjugado con una enzima u otro marcador.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye ARN; o incluye ADN.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico aislado a partir de un cerdo miniatura; ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo miniatura; ADN, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc procedente de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo miniatura, por ejemplo, un riñón; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo miniatura donante de órganos potencial; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo miniatura que se ha trasplantado en un receptor de órganos, por ejemplo, un receptor xenogénico, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico aislado a partir de un cerdo; ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo; ADN, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo, por ejemplo, un riñón; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo donante de órganos potencial; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo que se ha trasplantado en un receptor de órganos, por ejemplo, un receptor xenogénico, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano.

En una realización preferida: el segundo ácido nucleico es una secuencia retroviral porcina, sonda o cebador de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o un fragmento de la secuencia o de la secuencia complementaria con una longitud de al menos 15, 20 ó 30 pares de bases.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otras realizaciones preferidas: el segundo ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el segundo ácido nucleico es un genoma retroviral de longitud completa.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico es: un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para investigar en una célula o un tejido, por ejemplo, un trasplante de células o tejidos, por ejemplo, un xenoinjerto, la presencia o expresión de una secuencia retroviral o retrovirus de cerdo o de cerdo miniatura, por ejemplo, un retrovirus de cerdo miniatura endógeno. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana procedente del tejido con una segunda secuencia seleccionada entre el grupo de: una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, en condiciones en las que pueda tener lugar la hibridación, siendo la hibridación indicativa de la presencia o expresión de una secuencia retroviral o retrovirus endógeno de cerdo miniatura en el tejido o de un retrovirus endógeno de cerdo en el tejido.

En realizaciones preferidas, el método incluye además amplificar el ácido nucleico diana con cebadores que hibridan específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En realizaciones preferidas, el tejido o trasplante celular se selecciona entre el grupo compuesto por: corazón, pulmón, hígado, médula ósea, riñón, células cerebrales, tejido neural, páncreas o células pancreáticas, timo o tejido intestinal.

En otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana es: ADN; ARN; o ADNc.

En otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana se coge de: una muestra de tejido, o una muestra de sangre, por ejemplo, una muestra de biopsia de tejido, por ejemplo, una muestra de tejido adecuada para hibridación in situ o inmunohistoquímica.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico aislado a partir de un cerdo; ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo; ADN, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo, por ejemplo, un riñón; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc preparado a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo donante de órganos potencial; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo que se ha trasplantado en un receptor de órganos, por ejemplo, un cerdo receptor o un receptor xenogénico, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano.

En una realización preferida, el ácido nucleico diana es ARN o un ácido nucleico amplificado a partir de ARN en el tejido, y la hibridación se correlaciona con la expresión de una secuencia retroviral o retrovirus endógeno de cerdo miniatura o un retrovirus endógeno de cerdo.

En una realización preferida, el ácido nucleico diana es ADN, o un ácido nucleico amplificado a partir de ADN en el tejido, y la hibridación se correlaciona con la presencia de un retrovirus endógeno de cerdo miniatura o un retrovirus endógeno de cerdo.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para investigar en un célula o tejido porcino, la presencia de un retrovirus activable porcino, por ejemplo, un provirus activable porcino. El método incluye:

estimular una célula o tejido porcino con un tratamiento que pueda activar un retrovirus;

poner en contacto un ácido nucleico diana de la célula o tejido porcino con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3; siendo indicativa la hibridación de la presencia de un provirus porcino activable en la célula o tejido porcino.

En realizaciones preferidas, el tratamiento es: contacto con un fármaco, por ejemplo, un esteroide o un agente citotóxico, infección o contacto con un virus, o la inducción de estrés, por ejemplo, estrés nutricional o estrés inmunológico, por ejemplo, contacto con una célula T, por ejemplo, una célula T reactiva.

En otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana se coge de: una muestra de tejido, o una muestra de sangre, por ejemplo, un muestra de biopsia de tejido, por ejemplo, una muestra de tejido adecuada para hibridación in situ o inmunohistoquímica.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico aislado a partir de un cerdo; ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo; ADN, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo, por ejemplo, un riñón; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc preparado a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo donante de órganos potencial; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo que se ha trasplantado en un receptor de órganos, por ejemplo, un receptor xenogénico, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 1 o su secuencia complementaria, con la SEC ID Nº: 2 o su secuencia complementaria, o con la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para investigar en un genoma de cerdo miniatura o un genoma de cerdo la presencia de un retrovirus o secuencia retroviral porcina, por ejemplo, un retrovirus porcino endógeno. El método incluye:

poner en contacto un ADN genómico de cerdo miniatura (o de cerdo) con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3; o mutantes naturales del mismo; en condiciones en las que puedan hibridar las secuencias, siendo indicativa la hibridación de la presencia de una secuencia retroviral o de retrovirus porcino endógeno en el genoma del cerdo miniatura (o del cerdo).

En realizaciones preferidas, el método incluye además amplificar todo o una parte del genoma de cerdo miniatura (o de cerdo) con cebadores que hibridan específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En una realización preferida: el segundo ácido nucleico es una secuencia retroviral porcina, sonda o cebador, por ejemplo, como se describe en este documento; el segundo ácido nucleico es una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o un fragmento de la secuencia o de la secuencia complementaria con una longitud de al menos 15, 20 ó 30 pares de bases.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para investigar en un cerdo miniatura modificado genéticamente o un cerdo modificado genéticamente la presencia o expresión de una secuencia retroviral o retrovirus de cerdo miniatura o de cerdo, por ejemplo, un retrovirus endógeno de cerdo miniatura. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana del cerdo o cerdo miniatura modificado genéticamente con una segunda secuencia elegida entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; en condiciones en las que pueda producirse la hibridación, siendo indicativa la hibridación de la presencia o expresión de un retrovirus o secuencia retroviral de cerdo miniatura endógena o de un retrovirus o secuencia retroviral de cerdo en el cerdo o cerdo miniatura modificado genéticamente.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 1 o su secuencia complementaria, de la SEC ID Nº: 2 o su secuencia complementaria, o de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para evaluar el riesgo potencial asociado con el trasplante de un injerto desde un cerdo o cerdo miniatura donante en un mamífero receptor, por ejemplo, un cerdo o cerdo miniatura, un primate no humano, o un ser humano. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana del donante, receptor o el injerto, con una segunda secuencia elegida entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; en condiciones en las que las secuencias puedan hibridar, siendo indicativa la hibridación del riesgo asociado con el trasplante.

En una realización preferida: el segundo ácido nucleico es una secuencia retroviral porcina, sonda o cebador, por ejemplo, como se describe en este documento; de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o un fragmento de la secuencia o la secuencia complementaria con una longitud de al menos 15, 20 ó 30 pares de bases.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para determinar si un retrovirus o secuencia retroviral endógena de cerdo o cerdo miniatura incluye una mutación que modula su expresión, por ejemplo, tiene como resultado una expresión errónea. El método incluye:

determinar la estructura del genoma retroviral endógeno, y

comparar la estructura del genoma retroviral endógeno con la secuencia retroviral de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, siendo una diferencia predictiva de una mutación.

En realizaciones preferidas, el método incluye secuenciar el genoma endógeno y compararlo con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En realizaciones preferidas, el método incluye usar cebadores para amplificar, por ejemplo, por PCR, LCR (reacción en cadena de la ligasa) u otros métodos de amplificación, una región del genoma retroviral endógeno, y comparar la estructura del producto de amplificación con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria para determinar si hay diferencias en secuencia entre el genoma retroviral y la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria. El método también incluye determinar si existen uno o más sitios de restricción en el genoma retroviral endógeno, y determinar si los sitios existen en la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En realizaciones preferidas, la mutación es un defecto grueso, por ejemplo, una inserción, inversión, translocación o deleción, de todo o parte del genoma retroviral.

En realizaciones preferidas, la detección de la mutación puede incluir: (i) proporcionar una sonda de PCR marcada amplificada a partir de ADN (por ejemplo, la SEC ID Nº: 3) que contenga una secuencia de nucleótidos retroviral porcina que hibride con una secuencia con sentido o antisentido del genoma retroviral porcino (por ejemplo, SEC ID Nº: 3) o mutantes naturales de la misma; (ii) exponer la sonda/cebador a un ácido nucleico del tejido (por ejemplo, ADN genómico) digerido con una endonucleasa de restricción; y (iii) detectar por hibridación in situ de la sonda/cebador con el ácido nucleico, la presencia o ausencia de lesión genética. Como alternativa, pueden usarse análisis directos de PCR usando cebadores específicos para genes retrovirales porcinos (por ejemplo, genes que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 3), para detectar la presencia o ausencia de la lesión genética en el genoma retroviral porcino comparando los productos amplificados.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para proporcionar un cerdo miniatura o cerdo sin una inserción de secuencia retroviral o retrovirus endógeno, por ejemplo, un retrovirus activable, en un sitio preseleccionado. El método incluye:

realizar un cruce entre un primer cerdo miniatura (o cerdo) que tiene una inserción retroviral en el sitio preseleccionado y un segundo cerdo miniatura (cerdo) que no tiene una inserción retroviral en un sitio preseleccionado, por ejemplo, el mismo sitio, y recuperar una descendencia de cerdos miniatura (o cerdos) que no tengan la inserción, donde la presencia o ausencia de la inserción retroviral se determina poniendo en contacto el genoma de un cerdo miniatura (o cerdo) con una secuencia que puede hibridar específicamente con una secuencia retroviral porcina; una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se hibrida con otro ácido nucleico, por ejemplo, ADN, procedente del genoma del primer animal o de uno de sus antepasados.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se hibrida con otro ácido nucleico, por ejemplo, ADN procedente del genoma del segundo animal o de uno de sus antepasados.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se hibrida con otro ácido nucleico, por ejemplo, ADN procedente del genoma de un animal de la descendencia o de uno de sus antepasados.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otras realizaciones preferidas: el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; y el segundo ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos.

Se contempla un método para evaluar un tratamiento, por ejemplo, un tratamiento inmunosupresor con respecto a la capacidad de activar un retrovirus, por ejemplo, un retrovirus porcino endógeno. El método incluye:

administrar un tratamiento a un sujeto, por ejemplo, un cerdo miniatura (o cerdo), que tiene un retrovirus porcino endógeno; y

detectar la expresión del retrovirus porcino con una secuencia de ácido nucleico purificada que hibrida específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

El tratamiento inmunosupresor puede incluir radiación, quimioterapia o tratamiento con fármacos.

El tratamiento es uno que puede inducir tolerancia inmunológica; el tratamiento es uno que puede introducir nuevo material genético, por ejemplo, introducir nuevo material genético en un genoma de cerdo miniatura (o un genoma de cerdo) o en el genoma de un hospedador que recibe un injerto de cerdo o cerdo miniatura, por ejemplo, el tratamiento es uno que introduce un nuevo material genético a través de la transferencia mediada por retrovirus.

El ácido nucleico purificado es una secuencia retroviral porcina, sonda o cebador, por ejemplo, como se describe en este documento; el ácido nucleico purificado es la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o un fragmento de dicha secuencia o su secuencia complementaria con una longitud de al menos 15, 20 ó 30 pares de bases.

El ácido nucleico purificado tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

El ácido nucleico purificado tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; y el segundo ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el ácido nucleico purificado es un genoma retroviral de longitud completa.

El segundo ácido nucleico es: un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para localizar el origen de una infección retroviral porcina. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana del injerto con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; poner en contacto un ácido nucleico diana del receptor con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; correlacionándose la hibridación con el ácido nucleico del injerto con la infección retroviral porcina en el injerto; y correlacionándose la hibridación con el ácido nucleico del receptor con la infección retroviral porcina en el receptor.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN.

En una realización preferida: el segundo ácido nucleico es una secuencia retroviral porcina, sonda o cebador, por ejemplo, como se describe en este documento, el segundo ácido nucleico es una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o un fragmento de la secuencia o de la secuencia complementaria con una longitud de al menos 15, 20 ó 30 pares de bases.

En realizaciones preferidas, el receptor es un animal, por ejemplo, un cerdo miniatura, un cerdo, un primate no humano o un ser humano.

En realizaciones preferidas, el injerto se selecciona entre el grupo compuesto por: corazón, pulmón, hígado, médula ósea o riñón.

En otras realizaciones preferidas: el segundo ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el segundo ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el segundo ácido nucleico es un genoma retroviral de longitud completa.

Se contempla un método para investigar en una célula, por ejemplo, una célula que tiene un trastorno, por ejemplo, un trastorno proliferativo, por ejemplo, una célula tumoral, por ejemplo, una célula cancerosa, por ejemplo, un linfoma o carcinoma hepatocelular, que se desarrolla en el receptor de un injerto, por ejemplo, un xenoinjerto, la presencia o expresión de un retrovirus o secuencia retroviral porcina. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana procedente de una célula tumoral con una segunda secuencia elegida entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3; o mutantes naturales del mismo; en condiciones en las que puedan hibridar la muestra y la secuencia de ácido nucleico, siendo indicativa la hibridación de la presencia de una secuencia retroviral o retrovirus porcino endógeno en la célula tumoral.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana de una célula tumoral incluye: ADN genómico, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 1 o su secuencia complementaria, de la SEC ID Nº: 2 o su secuencia complementaria o de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para investigar en un ser humano la presencia o expresión de una secuencia retroviral o retrovirus porcino endógeno, que comprende:

poner en contacto un ácido nucleico diana derivado del ser humano con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3; o mutantes naturales del mismo; en condiciones en las que puedan hibridar las secuencias, siendo indicativa la hibridación de la presencia de una secuencia retroviral o retrovirus porcino endógeno en el ser humano.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana derivado de un ser humano es una muestra de ADN, ARN, ADNc, un ácido nucleico de una muestra de sangre o una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra de biopsia de tejido.

En realizaciones preferidas, el ser humano es un cerdo miniatura o un receptor de xenoinjerto de cerdo, o una persona que ha entrado en contacto con un cerdo miniatura o con un receptor de un xenoinjerto de cerdo.

En realizaciones preferidas: el receptor se ensaya con respecto a la presencia de secuencias retrovirales porcinas antes de la implantación del tejido de cerdo o de cerdo miniatura.

Se contempla un método para investigar mutaciones virales que modulan, por ejemplo, aumentan o reducen la susceptibilidad de un retrovirus porcino a un agente antiviral, por ejemplo, un antibiótico antiviral. El método incluye:

administrar un tratamiento, por ejemplo, un agente antiviral, por ejemplo, un antibiótico antiviral;

aislar una supuesta cepa mutante retroviral porcina;

determinar una estructura de la supuesta cepa retroviral mutante; y

comparar la estructura con la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

desarrollar el retrovirus porcino en presencia de un tratamiento, por ejemplo, un agente antiviral, por ejemplo, un antibiótico antiviral; y

determinar la cantidad de ADN retroviral porcino sintetizado por hibridación del ADN retroviral porcino con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo.

El método incluye además amplificar el ácido nucleico retroviral porcino con cebadores que hibridan específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, por ejemplo, por ensayo de ADN cuantitativo por reacción en cadena de la polimerasa (PDQ).

El segundo ácido nucleico es una secuencia retroviral porcina, sonda, o cebador, por ejemplo, como se describe en este documento; la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

El segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

El segundo ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el segundo ácido nucleico es un genoma retroviral de longitud completa.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para investigar en un producto derivado de cerdo la presencia o expresión de un retrovirus o secuencia retroviral de cerdo o de cerdo miniatura, por ejemplo, un retrovirus endógeno de cerdo miniatura. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana del producto derivado de cerdo con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; en condiciones en las que pueda tener lugar la hibridación, siendo la hibridación indicativa de la presencia o expresión de una secuencia retroviral o retrovirus endógeno de cerdo o de cerdo miniatura en el producto derivado de cerdo.

En realizaciones preferidas, el producto es: un producto proteico, por ejemplo, insulina; un producto alimentario; o un trasplante celular, por ejemplo, una célula de cerdo o de cerdo miniatura que se va a trasplantar en un hospedador, por ejemplo, una célula de cerdo o de cerdo miniatura que se modifica por ingeniería genética para expresar un producto deseado.

En realizaciones preferidas, el segundo ácido nucleico tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con una secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, con la SEC ID Nº: 2 o su secuencia complementaria.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para determinar el número de copias, el tamaño o la finalización de un retrovirus o secuencia retroviral porcina, por ejemplo, en el genoma de un donante, receptor o un injerto. El método incluye:

poner en contacto un ácido nucleico diana del donante, receptor o un injerto con una segunda secuencia seleccionada entre una secuencia que puede hibridar específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína gag; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 585-2156 (por ejemplo, de los nucleótidos 585-2156) de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína pol; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido que codifica una proteína env; un ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos consecutivos de secuencia con sentido o antisentido de los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3, o mutantes naturales del mismo.

En realizaciones preferidas, el método también incluye amplificar el ácido nucleico retroviral porcino con cebadores que hibridan específicamente con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, por ejemplo, por ensayo de ADN cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (PDQ) o PCR anidada.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico aislado a partir de un cerdo miniatura; ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo miniatura; ADN, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc procedente de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo miniatura, por ejemplo, un riñón; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo miniatura que se ha trasplantado en un receptor de órganos, por ejemplo, un receptor xenogénico, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico diana incluye: ADN genómico aislado a partir de un cerdo; ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un cerdo; ADN, ARN o ADNc, por ejemplo, ADNc obtenido a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo, por ejemplo, un riñón; ARN, ADN o ADNc, por ejemplo, ADNc preparado a partir de una plantilla de ARN, aislado a partir de un órgano de cerdo que se ha trasplantado en un receptor de órganos, por ejemplo, un receptor xenogénico, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano.

En realizaciones preferidas, el tejido se selecciona entre el grupo compuesto por: corazón, pulmón, hígado, médula ósea, riñón, células cerebrales, tejido neural, páncreas o células pancreáticas, timo o tejido intestinal.

Una "preparación purificada" o una "preparación sustancialmente pura" de un polipéptido como se usa en este documento significa un polipéptido que carece de una o más proteínas distintas, lípidos y ácidos nucleicos con los que existe de forma natural. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de sustancias que se usan para purificarlo, por ejemplo, anticuerpos o matrices de gel, tales como poliacrilamida. Preferiblemente, el polipéptido constituye al menos un 10, 20, 50, 70, 80 ó 95% en peso seco de la preparación purificada. Preferiblemente, la preparación contiene: suficientes polipéptidos para permitir la secuenciación de la proteína; al menos 1, 10 ó 100 \mug del polipéptido; al menos 1, 10 ó 100 mg del polipéptido.

Hibridan específicamente, como se usa en este documento, significa que un ácido nucleico hibrida con una secuencia diana con un grado sustancialmente mayor que con otras secuencias en una mezcla de reacción. Por sustancialmente mayor significa una diferencia suficiente para determinar si la secuencia diana está presente en la mezcla.

Un "tratamiento", como se usa en este documento, incluye cualquier tratamiento terapéutico, por ejemplo, la administración de un agente terapéutico o sustancia, por ejemplo, un fármaco o irradiación.

Una "preparación purificada de ácido nucleico" es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo a una o a las dos secuencias codificantes con las que está inmediatamente contiguo (es decir, una en el extremo 5' y la otra en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del que procede el ácido nucleico; y/o que carece sustancialmente de una secuencia de ácido nucleico o proteína con la que existe en el organismo del que procede el ácido nucleico. La expresión incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, por ejemplo, en un plásmido de replicación autónoma o virus, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias de ADN. Un ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica más secuencias. Un genoma retroviral purificado es un ácido nucleico que carece sustancialmente de un ácido nucleico o proteína viral de un hospedador.

"homólogo", como se usa en este documento, se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptido o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por el mismo aminoácido o subunidad monomérica base, por ejemplo, si una posición en cada dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de emparejamientos o posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias se emparejan o son homólogas, entonces las dos secuencias tienen una homología del 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten una homología del 50%. En general, se realiza una comparación cuando dos secuencias se alinean para dar una homología máxima. La expresión identidad de secuencia tiene sustancialmente el mismo significado.

Las expresiones "provirus" o "retrovirus endógeno", como se usan en este documento, se refieren a una forma integrada del retrovirus.

Los términos "péptidos", "proteínas" y "polipéptidos" se usan indistintamente en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión "elemento transgénico" significa una secuencia de ácido nucleico, que es parcial o totalmente heteróloga, es decir, extraña, al animal o célula en el que se introduce pero que está diseñada para insertarse, o se inserta, en el genoma del animal de tal manera que altera el genoma de la célula en la que se inserta. La expresión incluye elementos que producen un cambio en la secuencia, o en la capacidad de activarse, de una secuencia retroviral endógena. Los ejemplos de elementos transgénicos incluyen los que producen cambios, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, G por A), inserciones o deleciones de una secuencia retroviral endógena (o regiones flanqueantes) que tienen como resultado la inhibición de la activación o la expresión errónea de un producto retroviral.

Como se usa en este documento, la expresión "célula transgénica" se refiere a una célula que contiene un elemento transgénico.

Como se usa en este documento, un "animal transgénico" es cualquier animal en el que uno o más, y preferiblemente esencialmente todas las células del animal incluyen un elemento transgénico. El elemento transgénico puede introducirse en la célula, directa o indirectamente por introducción en un precursor de la célula, por medio de una manipulación genética deliberada, tal como por microinyección. Esta molécula puede integrarse dentro de un cromosoma o puede ser un ADN de replicación extracromosómica.

Como se describe en este documento, un aspecto de la invención emplea un ácido nucleico puro (o recombinante) que incluye un genoma retroviral de cerdo miniatura (o de cerdo) o un fragmento del mismo, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido gag-pol o env, y/o equivalentes de tales ácidos nucleicos. La expresión "ácido nucleico", como se usa en este documento, puede incluir fragmentos y equivalentes. El término "equivalente" se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos funcionalmente equivalentes o polipéptidos funcionalmente equivalentes que, por ejemplo, retienen la capacidad de reaccionar con un anticuerpo específico para un polipéptido gag-pol o env. Las secuencias de nucleótidos equivalentes incluirán secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas, y por lo tanto, incluirán secuencias que difieren de la secuencia de nucleótidos de gag, pol o env mostrada en este documento debido a la degeneración del código genético.

"Expresión errónea", como se usa en este documento, se refiere a un patrón de tipo no silvestre de expresión génica, por ejemplo, la expresión de un retrovirus porcino, por ejemplo, la expresión del gen Tsukuba-1, por ejemplo, la expresión del gen gag, pol o env. Incluye: la expresión en niveles de tipo no silvestre, es decir, un exceso o defecto de expresión; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del tiempo o fase en la que se expresa el gen, por ejemplo, un aumento o reducción de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un periodo o fase del desarrollo predeterminado; un modelo de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de reducción de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un tipo celular o tipo de tejido predeterminado; un modelo de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de ayuste, tamaño, secuencia de aminoácidos, modificación post-traduccional, estabilidad o actividad biológica de los polipéptidos de retrovirus porcino expresado, por ejemplo, Tsukuba-1; un modelo de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del efecto de un estímulo ambiental o extracelular sobre la expresión de los genes de retrovirus porcino, por ejemplo, Tsukuba-1, por ejemplo, un patrón de mayor o menor expresión (en comparación con el tipo silvestre) en presencia de un aumento o disminución en la resistencia del estímulo.

Pueden usarse métodos de la invención con cerdo o cerdo miniatura.

El retrovirus endógeno es una fuente potencial de infección no siempre susceptible a las prácticas de cría convencionales. Muchos provirus son defectuosos e incapaces de replicarse. Los provirus, si están intactos, pueden activarse por ciertos estímulos y después iniciar la replicación viral usando mecanismos celulares del hospedador. La infección retroviral a menudo no perjudicará a la célula hospedadora. Sin embargo, la replicación de virus puede tener como resultado viremia, transformación maligna (por ejemplo, a través de la inserción de oncogenes retrovirales), degeneración u otros efectos de inserción (por ejemplo, inactivación génica). Los efectos de tal infección pueden no surgir durante muchos años. El espectro de comportamiento de infección lentiviral activa en seres humanos está bien descrita con respecto al VIH. Estos incluyen SIDA, infecciones poco habituales y tumores, virus recombinantes y otros
virus, y variaciones antigénicas que pueden prevenir la generación de inmunidad protectora por el hospedador infectado.

La selección de animales permitirá la eliminación de donantes con replicación activa de virus conocidos. Los provirus inactivos pueden detectarse con sondas genéticas y retirarse o inactivarse. Estas nuevas estrategias permitirán la identificación y eliminación de patógenos humanos potenciales derivados de cerdo de una manera no posible en la población de donantes de órganos humanos exogámicos y, de esta manera, será importante para el desarrollo de xenotrasplantes humanos.

Las secuencias retrovirales porcinas usadas en la invención también son útiles como sondas de diagnóstico para detectar la activación de retrovirus porcinos endógenos después del trasplante y xenotrasplante de órganos derivados de cerdos o cerdos miniatura. Las secuencias retrovirales porcinas de la invención también proporcionan herramientas de diagnóstico necesarias para evaluar el riesgo asociado con el trasplante de órganos de cerdos o cerdos miniatura en receptores humanos. Estas secuencias también son útiles para la evaluación longitudinal de la activación retroviral en el receptor humano de órganos derivados de cerdo miniatura.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. de Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al.. Patente de Estados Unidos Nº: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vector For Mammalian Cells (J. H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Sprinc Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al.. eds), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no deben considerarse limitantes.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1 es la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) del ADNc de Tsukuba-1.

La Figura 2 es la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 2) de un genoma retroviral defectuoso aislado a partir del retrovirus de la línea celular PK-15.

La Figura 3 es la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 3) de un retrovirus encontrado en un cerdo miniatura.

Descripción detallada Retrovirus de Cerdo Miniatura

El trasplante puede aumentar la probabilidad de activación retroviral, si están presentes provirus intactos e infecciosos. Muchos fenómenos asociados con el trasplante, por ejemplo, la supresión inmune, rechazo de injertos, enfermedad de injerto frente a hospedador, coinfección viral, terapias citotóxicas, radioterapia o tratamiento con fármacos, pueden promover la activación de la expresión retroviral.

Se cree que muchas especies llevan secuencias retrovirales en su ADN genómico. El número de elementos retrovirales intactos (completos) que podrían activarse a menudo es desconocido. Una vez activados, los virus porcinos requerirían el receptor apropiado en tejidos humanos para propagarse más allá del órgano trasplantado. La mayoría de los provirus endógenos intactos (normalmente los tipos B y C), una vez activados, no son patógenos. Sin embargo, la coinfección con otros virus, la recombinación con otros virus endógenos o la modificación del comportamiento viral en el medio humano extraño puede alterar la patogenia, la especificidad de órgano o la replicación de los retrovirus u otros agentes infecciosos.

La falta de datos de secuencia sobre virus de cerdo ha dificultado los esfuerzos para evaluar el número de secuencias porcinas, o secuencias retrovirales porcinas, que se han incorporado en el genoma humano o la frecuencia de incorporación.

El inventor, al demostrar que el retrovirus Tsukuba-1 se encuentra en cerdos miniatura, y al proporcionar la secuencia entera del genoma retroviral porcino (Tsukuba-1), ha permitido evaluar el riesgo de retrovirus endógenos en la práctica clínica general y, más importante, en xenotrasplantes.

Las secuencias retrovirales porcinas de la invención pueden usarse para determinar el nivel (por ejemplo, el número de copias) de secuencias de provirus porcinos intactos (es decir, potencialmente replicantes) en una cepa de donantes de trasplantes de xenoinjertos. Por ejemplo, el número de copias de las secuencias retrovirales de cerdo miniatura puede determinarse por el método de Cuantificación de ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PDQ), descrito en este documento, o por otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Esta técnica de cuantificación permitirá la selección de donantes animales, por ejemplo, donantes de cerdos miniatura, sin una secuencia retroviral porcina intacta o con un bajo número de copias de elementos virales.

Las secuencias retrovirales porcinas de la invención pueden usarse para determinar si se han producido mutaciones, por ejemplo, inversiones, translocaciones, inserciones o deleciones en la secuencia retroviral porcina endógena. Los genomas virales mutados pueden ser deficientes en la expresión. Por ejemplo, pueden identificarse lesiones genéticas exponiendo una sonda/cebador derivado de una secuencia de retrovirus porcino a un ácido nucleico del tejido (por ejemplo, ADN genómico) digerido con endonucleasas de restricción o por hibridación in situ de la sonda/cebador derivado de la secuencia retroviral porcina con el ácido nucleico derivado del donante, por ejemplo, un tejido de cerdo miniatura. Como alternativa, puede usarse un análisis de PCR directa, usando cebadores específicos para genes retrovirales porcinos (por ejemplo, genes que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 3) para detectar la presencia o ausencia de la lesión genética en el genoma retroviral porcino.

Las secuencias retrovirales de cerdos miniatura usadas en la invención también pueden usarse para detectar recombinantes virales dentro del genoma, o en la circulación, células, o tejidos trasplantados, entre el retrovirus porcino y otros virus humanos endógenos o patógenos oportunistas (por ejemplo, citomegalovirus) del receptor del trasplante inmunocomprometido. Por ejemplo, pueden detectarse piezas del genoma viral por PCR o por hibridación, por ejemplo, hibridación de transferencia de Southern o Northern, usando secuencias derivadas de la SEC ID Nº: 3 como cebadores para amplificación o sondas para hibridación.

Las secuencias retrovirales de cerdo miniatura de la invención, por ejemplo, cebadores de PCR, permiten la cuantificación de virus activados. Las secuencias usadas en la invención también permiten la localización histológica (por ejemplo, por hibridación in situ) de retrovirus activados. La localización permite que los médicos determinen si un injerto debe retirarse como fuente de infección retroviral potencial del hospedador humano o si la infección retroviral se localizó fuera del injerto. Las secuencias de la invención, por ejemplo, los cebadores de PCR, permiten la detección de virus de replicación activa, por ejemplo, usando técnicas de PCR transcritas de forma inversa conocidas en la técnica. Las técnicas convencionales para las mediciones de transcriptasa inversa a menudo son complicadas, específicas de especie, y son de baja sensibilidad y especificidad, y pueden desarrollarse resultados falsos positivos usando sondas de longitud completa para transferencia molecular de Southern y Northern. Las secuencias de la invención permiten ensayos sensibles y específicos para la activación de virus y esto permitirá realizar una amplia diversidad de ensayos, de los que algunos se explican más adelante.

La invención proporciona el ensayo y el desarrollo de donantes animales que tienen menores números de inserciones provirales intactas. También permite el ensayo de regímenes inmunosupresores con menos probabilidad de proporcionar las condiciones para la replicación activa de retrovirus. Las condiciones que probablemente activarán un retrovirus generalmente tendrán más probabilidad de activar otros virus, incluyendo retrovirus desconocidos y patógenos humanos conocidos que incluyen citomegalovirus, virus de la hepatitis B y C, y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (I y II). Dada la disponibilidad de terapias preventivas para estas infecciones, estas terapias podrían usarse profilácticamente en pacientes que se sabe que son susceptibles a la activación de retrovirus porcinos.

Las secuencias retrovirales de cerdo miniatura pueden usarse para medir la respuesta de la infección por retrovirus de cerdo miniatura en humanos a la terapia, por ejemplo, terapia inmunomoduladora o antiviral, por ejemplo, agentes antivirales, por ejemplo, antibióticos antivirales. Con el VIH, la susceptibilidad a antibióticos antivirales se determina por la secuencia genética del gen de la transcriptasa inversa (región RT pol) y otros genes. La capacidad para determinar la secuencia exacta de los genes retrovirales permitirá la detección de mutaciones que se producen durante la infección que entonces conferirían resistencia de este virus a agentes antivirales. Los cebadores, por ejemplo, para la región
RT-pol, de la invención pueden usarse para detectar y secuenciar aislados virales clínicos de pacientes que han desarrollado mutaciones por el método PDQ descrito en este documento. Los cebadores también pueden usarse para determinar si las células tumorales, por ejemplo, células cancerosas, por ejemplo, linfoma o carcinoma hepatocelular, que se desarrollan en receptores de xenoinjertos contienen elementos retrovirales porcinos.

Las secuencias retrovirales porcinas también pueden usarse para detectar otros retrovirus homólogos y determinar si éstos son iguales o diferentes en comparación con las secuencias retrovirales de Tsukuba-1. Por ejemplo, dentro de una especie, los genes de la polimerasa están muy conservados. Los ensayos de PCR destinados a la región gag-pol seguidos de análisis de la secuencia permiten esta detección de virus homólogos. Las regiones apropiadas del virus Tsukuba-1 pueden determinarse usando secuencias derivadas de la SEC ID Nº: 1 descrita en este documento, para identificar secuencias genómicas virales 5' y 3' adicionales. Como se describe en otros sitios de este documento, las secuencias de la SEC ID Nº: 1 se usaron para obtener la secuencia del inserto retroviral PK-15 (SEC ID Nº: 2) y de una inserción retroviral en un cerdo miniatura (SEC ID Nº: 3).

Las secuencias de retrovirus de cerdo miniatura pueden usarse para investigar en animales donantes y receptores de xenoinjertos después del transplante la infección y como una medida del nivel apropiado de supresión inmune, con respecto a la susceptibilidad a la infección. En médicos, personal médico, familia o individuos que entran en contacto con los receptores de injertos, y otros, puede investigarse la infección con virus derivados del receptor del xenoinjerto. Esto también puede investigarse en miembros de la población general. Tal selección puede usarse para amplios estudios epidemiológicos de la comunidad. Estos métodos pueden ayudar a cumplir los requisitos de la F.D.A. con respecto al aumento de la seguridad de los receptores y de la comunidad a la exposición a nuevos virus introducidos en la comunidad por trasplante de xenoinjertos.

Como se muestra en Suzuka et al.., 1986, FEBS 198:339, los retrovirus porcinos, tales como el genoma de Tsukuba-1, pueden existir como una molécula circular. Tras la clonación, la molécula circular generalmente se escinde para producir una molécula lineal. Como entenderá un especialista en la técnica, por supuesto, el punto de partida y el punto final de la molécula lineal resultante, y las subregiones relativas de la secuencia viral, variarán con el punto de escisión. Por ejemplo, en la referencia de Suzuka et al.. se demuestra que LTR es un fragmento interno. Esto se indica en este documento ya que el orden de gag, pol, env en la SEC ID Nº: 1 se muestra como env, gag, pol, mientras que en otras partes de este documento el orden de estas regiones se proporciona como el orden natural gag, pol, env.

Polímeros Derivados de la Secuencia del Genoma Retroviral Porcino (Tsukuba-1)

En este documento se han descrito varios cebadores diferentes útiles en los métodos. Un especialista en la técnica puede identificar cebadores adicionales a partir de la secuencia viral de la SEC ID Nº: 1 por medio del uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para intentar identificar cebadores potencialmente útiles, un especialista en la técnica buscaría secuencias (las secuencias deben tener una longitud comprendida entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos) que hibriden con la SEC ID Nº: 1 con alta temperatura de fusión; que tengan una distribución equilibrada de nucleótidos, por ejemplo, una distribución equilibrada de A, T, C y G; que tengan una C o G terminal; y que no autohibriden o se complementen internamente.

Uso de Cebadores Derivados de la Secuencia del Genoma Retroviral Porcino (Tsukuba-1) I. Ensayo de órganos o células antes del trasplante

En animales donantes potenciales puede investigarse la replicación retroviral activa antes de usarse en el trasplante. Esto permite evitar que los animales experimenten una replicación viral activa. El virus de replicación a menudo es infeccioso en el 100% de los receptores, mientras que el provirus latente sin replicación generalmente produce infección en el 5 al 25% de los receptores.

II. Ensayo de los receptores

Pueden obtenerse muestras seriadas, por ejemplo, de glóbulos blancos a partir de un receptor de injertos mensualmente, por ejemplo, durante el primer mes y cada tres meses posteriormente. Las biopsias de tejidos obtenidas para la evaluación de la función del injerto pueden usarse para evaluar la activación de secuencias retrovirales o de la expresión de secuencias retrovirales en tejidos de injerto. En las muestras puede investigarse la presencia de infección por retrovirus tanto específicamente para el virus homólogo, para recombinantes virales que contienen porciones del genoma viral y para otros retrovirus, usando, por ejemplo, cebadores de PCR para la región pol del virus, que es la región con más probabilidad de conservarse. Si se detecta el virus, puede usarse una PCR cuantitativa para determinar la estabilidad relativa de la producción viral. Las células aisladas de receptores de xenoinjertos pueden ensayarse por cocultivo con líneas celulares permisivas humanas y porcinas (por ejemplo, trompas de falopio de cerdo, macrófagos de cerdo, o testículos de cerdo) que se sabe que contienen virus endógenos. Los virus aislados se ensayarán con respecto a la homología con la cepa parental y con respecto a las mutaciones que podrían afectar a la susceptibilidad a agentes antivirales, por ejemplo, antibióticos antivirales.

III. Ensayo de personal quirúrgico y médico y de miembros de la familia de receptores de injertos.

Pueden depositarse (archivarse) muestras, por ejemplo, glóbulos blancos, del personal quirúrgico y médico y de miembros de la familia del receptor antes del trasplante y a intervalos de tres meses durante el primer año y al menos anualmente posteriormente. También pueden realizarse estudios epidemiológicos sobre estas muestras. Estas muestras pueden ensayarse si los receptores se vuelven virémicos o si se detectan manifestaciones clínicas inusuales en estos individuos.

IV. Ensayo de células tumorales

Pueden ensayarse células tumorales que se desarrollan a partir de un injerto, o un receptor de injertos, con respecto a la presencia de retrovirus activos y con respecto a provirus.

V. Ensayo de pacientes

En los pacientes puede re-ensayarse cualquier cambio significativo en el estado clínico o un aumento de la supresión inmune de un rechazo de injerto que puede estar asociado con un mayor riesgo de activación viral.

Secuenciación del genoma retroviral porcino (Tsukuba-1)

Se usó un clon (P\lambda8.8) que contenía el inserto del retrovirus porcino XhoI de 8060 pb (Tsukuba-1) para transfectar E. coli competentes y el ADN se aisló para la secuenciación. La estrategia usada para secuenciar el genoma del retrovirus porcino de 8060 pb incluía una combinación de procedimientos que se indican a continuación.

Se generaron fragmentos aleatorios (1-3 kb) del clon (P\lambda8.8) por sonicación. Los fragmentos se hicieron de extremos romos y se subclonaron en el sitio EcoRV del vector pBluescript SK. Se preparó ADN plasmídico usando un procedimiento de lisis alcalina modificado. Se realizó una secuenciación de ADN usando reacciones de terminación Didesoxi (ABI). Como marcadores se usaron tintes fluorescentes específicos de bases. Las reacciones de secuenciación se analizaron en geles de poliacrilamida al 4,75% en un secuenciador automático ABI 373A-S o 373S. El análisis de datos posteriores se realizó en un software Sequencer™ 3.0. Se sintetizaron los siguientes cebadores de secuenciación internos:

1

El clon (P\lambda8.8) que contenía el inserto de retrovirus porcino XhoI de 8060 pb (Tsukuba-1) se depositó con la ATCC el 27 de diciembre de 1995 (ATCC, Nº de Depósito 97396).

Determinación del número de copias retrovirales porcinas (Tsukuba-1) en un cerdo miniatura

Se aisló ADN genómico total a partir de riñón de cerdo miniatura por los métodos conocidos en la técnica. El ADN genómico aislado se digirió con la enzima de restricción EcoRI o HindIII. Los productos de digestión de ADN se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa, se sometieron a transferencia de Southern y se hibridaron con la secuencia de Tsukuba-1 purificada de longitud completa (SEC ID Nº: 1) en condiciones de alta rigurosidad (0,1 X SSC, 65ºC). En las muestras digeridas de las dos formas (EcoRI o HindIII) al menos seis copas de los fragmentos de alto peso molecular del genoma de cerdo miniatura (más de 16 kb de tamaño) hibridaron con la SEC ID Nº: 1, lo que indica la presencia de secuencias retrovirales homólogas en el ADN porcino.

Ensayo de Susceptibilidad por Cuantificación del ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PDQ)

Puede usarse un ensayo de susceptibilidad de cuantificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (PDQ) para medir rápida y directamente la sensibilidad de nucleósidos de aislados de retrovirus porcino.

Puede usarse PCR para cuantificar la cantidad de ARN retroviral porcino sintetizado después de una infección in vitro de células mononucleares de sangre periférica. Las cantidades relativas de ARN retroviral porcino en lisados celulares de cultivos mantenidos a diferentes concentraciones de fármacos reflejan la inhibición por fármacos de la replicación de virus. Con el método PDQ, pueden realizarse tanto ensayos de titulación de infectividad como de susceptibilidad sobre sobrenadantes de cultivos de pituitaria de células mononucleares de sangre periférica.

Los experimentos PDQ pueden realizarse esencialmente como se describe por Eron et al.., PNAS USA 89: 3241-3245, 1992. En resumen, pueden usarse alícuotas (150 \mul) de diluciones en serie de muestras de virus para infectar 2 x 10^{6} PBMC del donante estimulados por PHA en 1,5 ml de medio de crecimiento por pocillo de una placa de 24 pocillos de fondo plano (Corning). Las muestras de células separadas pueden contarse, recogerse y lisarse a 48, 72 y 96 horas. Después puede realizarse la determinación del número de copias de retrovirus porcino y la PCR cuantitativa en duplicado en cada lisado.

Los resultados de un ensayo de titulación de infectividad de PDQ pueden usarse para determinar la dilución del virus y el periodo de tiempo de cultivo empleado en un ensayo de susceptibilidad PDQ posterior. Estos parámetros deben elegirse de manera que el rendimiento del producto de PCR específico de retrovirus porcino para la infección de control sin tratar esté en la curva patrón del número de copias de retrovirus porcino antes de que la curva se aproxime a su máximo asintótico o a la meseta. Los PBMC del donante estimulados pueden incubarse con el fármaco durante 4 horas antes de la infección. Los pocillos duplicados en una placa de 24 pocillos deben recibir inóculos de retrovirus porcinos idénticos para cada concentración de fármaco ensayada y para los controles infectados no tratados. En cada experimento, deben incluirse controles no infectados y controles de toxicidad de fármaco. Todos los cultivos pueden recogerse y las células lisarse para PCT después de 48 ó 72 horas. En cada experimento, pueden usarse aislados caracterizados previamente como patrones de ensayo.

Pueden lisarse sedimentos celulares en diversos volúmenes de tampón de lisis (KCl 50 mM/Tris\cdotHCl 10 mM, pH 8,3/MgCl_{2} 2,5 mM/Nonidet P-40 al 0,5%/Tween 20 al 0,5%/proteinasa K al 0,01%) para producir una concentración de 1,2 x 10^{4} células equivalentes/\mul. La uniformidad de las concentraciones de ADN del lisado celular debe confirmarse en experimentos representativos aumentando la fluorescencia de Hoechst 33258 (Mini-Fluorometer, Hoefer).

De acuerdo con las secuencias del gen pol, puede sintetizarse un par de cebadores conservado. Los cebadores después pueden usarse para amplificar un fragmento de 1580 pares de bases del gen pol de retrovirus porcino a partir de 1,2 x 10^{5} equivalentes celulares de lisado usando PCR (GeneAmp, Cetus) en condiciones convencionales. Deben repetirse las amplificaciones si el ADN del retrovirus porcino se puede amplificar a partir de controles de reactivos.

Los productos de amplificación del gen pol del retrovirus porcino pueden detectarse específicamente y cuantificarse como se ha descrito (Conway, B.C. (1990) en Techniques in HIV Research, (Aldovani & Walker, eds.) (Stockton, Nueva York) páginas 40-46). Pueden hibridarse productos de PCR desnaturalizados térmicamente en un pocillo de una placa de microtitulación recubierto con estreptavidina con sonda de captura biotinilada y sonda de detector marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) [ensayo de hibridación de sándwich con solución de oligonucleótidos unido a enzimas ((ELOSA), DuPont Medical Products, Bilerica, MA) durante 60 minutos a 37ºC. Después de un lavado extensivo para retirar todos los reactivos excepto los híbridos de sonda-ADN, debe añadirse a cada pocillo un cromógeno de HRP, tetrametilbencidina (TMBlue, Transgenic Sciences, Worcester, MA). El desarrollo de color catalizado por HRP debe detenerse después de 1 hora por la adición de ácido sulfúrico a 0,65 M. La absorbancia (OD) a 450 nm puede medirse en un lector de placas de microtitulación automático (SLT Labinstruments, Hillsborough, NC).

En cada PCR puede generarse una curva patrón de número de copias de ADN de retrovirus porcino por medio del uso de una serie de dilución de células que contienen un genoma proviral porcino por célula.

Preparación de un cerdo miniatura que tiene un knockout de la secuencia viral Tsukuba-1 usando vectores de dirección de ADN isogénico

El ADN isogénico, o el ADN que es sustancialmente idéntico en secuencia entre el vector de dirección y el ADN diana en los cromosomas, aumenta en gran medida la frecuencia de acontecimientos de recombinación homóloga y la eficacia de dirección a ciertos genes. Usando vectores de dirección a ADN isogénico, pueden conseguirse frecuencias del 80% o superiores en células madre embrionarias de ratón. Esto está en contraste con vectores de ADN no isogénicos que normalmente producen frecuencias de dirección de aproximadamente un 0,5% a un 5%, es decir, aproximadamente dos órdenes de magnitud menores que los vectores de ADN isogénicos. Las construcciones de ADN isogénico se integran predominantemente en cromosomas por recombinación homóloga en lugar de por integración aleatoria. Como consecuencia, puede realizarse una mutagénesis dirigida de secuencias virales, por ejemplo, genes virales, en sistemas biológicos incluyendo cigotos, que no se prestan al uso de protocolos de selección elaborados, dando como resultado la producción de animales, por ejemplo, cerdos miniatura, que carecen o que tienen un número reducido de secuencias virales activables. Para que sea factible la estrategia del ADN isogénico, deben construirse vectores de dirección a partir de una fuente de ADN que sea idéntica al ADN del organismo al que se dirige. Idealmente, la dirección al ADN isogénico se realiza en cepas endogámicas de animales, por ejemplo, cerdos miniatura endogámicos, en los que todos los loci genéticos son homocigotos. Cualquier animal de esta cepa puede servir como fuente para generar vectores de dirección isogénicos. Este protocolo para la dirección de genes isogénicos se expone en TeRiele et al.., PNAS 89: 5128-5132, 1992 y PCT/US92/07184, incorporados en este documento como referencia. Más adelante se describe brevemente un protocolo para producir cerdos miniatura con Tsukuba-1 desactivado (knockout).

Se diseña un vector de inserción como se describe por Hasty y Bradley (Gene Targeting Vectors for Mammalian Cells, en Gene Targeting: A Practical Approach, ed, Alexandra L. Joyner, IRL Press 1993). Los vectores de inserción requieren que sólo se produzca un suceso de cruce para la integración por recombinación homóloga en el locus nativo. La doble cadena se rompe, y los dos extremos del vector que se sabe que son muy recombinogénicos, se localizan en secuencias adyacentes en el cromosoma. Las frecuencias de dirección de tales construcciones estarán en el intervalo del 30 al 50%. Un inconveniente de los vectores de inserción, en general, se refiere a las duplicaciones de secuencia que se introducen y que potencialmente hacen que el locus sea inestable. Todas estas construcciones se realizan usando procedimientos de clonación convencionales.

Hasty y Bradley también han descrito extensamente vectores de reemplazo. Los vectores de reemplazo conceptualmente más sencillos que el vector de inserción, usan un fragmento esencialmente colineal de un tramo de secuencia genómica de Tsukuba-1. Preferiblemente, la secuencia de ADN a partir de la que se construye un vector de reemplazo isogénico incluye aproximadamente de 6 a 10 kb de ADN ininterrumpido. Dos cruces, uno en cada lado del marcador selectivo, hacen que el vector de dirección mutante se integre y reemplace el gen de tipo silvestre.

La microinyección del ADN del transgen isogénico en uno de los pronúcleos de un embrión porcino en fase de cigoto (embrión de una célula) se realiza por una modificación de un protocolo descrito anteriormente (Hammer et al. 1985, Nature 315, 680; Pursel et al.. 1989, Science 244, 1281). La edad y el peso de los cerdos donantes, por ejemplo, minicerdos específicos de haplotipo, son críticos para el éxito. Óptimamente, los animales tienen de 8 a 10 meses de edad y pesan de 70 a 85 lb. Esto aumenta la probabilidad de obtener un suministro adecuado de embriones de una célula para la microinyección de los transgenes. Para permitir un ritmo preciso de las recolecciones de embriones en esta fase a partir de varios donantes de embriones, las cerdas se sincronizan usando una preparación de progesterona sintética (Regumate). Se aplican implantes de hormonas a cerdas designadas 30 días antes de la fecha de recolección de los embriones. Veinte días después, diez días antes de la fecha de recogida, los implantes se retiran y los animales se tratan con más hormonas para inducir la superovulación y aumentar el número de embriones para microinyección. Tres días después de retirar el implante, los animales se tratan con 400 a 1000 IU de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) y con 750 IU de gonadotropina coriónica humana (hCG) de tres a cuatro días después. Estos animales se reproducen por inseminación artificial (AI) en dos días consecutivos después de la inyección de hCG.

Las recolecciones de los embriones se realizan como se indica a continuación: tres días después de la inyección inicial de hCG, los animales se anestesian con una inyección intramuscular de Telazol (3 mg/lb), Rompum (2 mg/lb) y Atropina (1 mg/lb). Se realiza una laparotomía en la línea media y se exterioriza el tracto reproductor. La recolección de los cigotos se realiza introduciendo una cánula en la ampolla del oviducto y lavando el oviducto con 10 a 15 ml de solución salina tamponada con fosfato, precalentada a 39ºC. Después de la recogida, los animales donantes se preparan para recuperarse de la cirugía de acuerdo con las directrices de la USDA. Los animales usados dos veces para recoger los embriones se eutanizan de acuerdo con las directrices de la USDA.

La inyección del ADN transgénico en los pronúcleos de los cigotos se realiza como se resume más adelante: los cigotos se mantienen en medio HAM F-12 suplementado con suero de ternero fetal al 10% a 38ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Para la inyección, los cigotos se ponen en medio BMOC-2, se centrifugan a 13.000 g para repartir los lípidos embrionarios y visualizar los pronúcleos. Los embriones se ponen en una cámara de inyección (portaobjetos con depresión) que contiene el mismo medio recubierto con aceite de parafina. La microinyección se realiza en un microscopio invertido Nikon Diaphot equipado con dispositivos ópticos Nomarski y micromanipuladores Narishige. Usando lentes de 40 aumentos, los embriones se mantienen en su sitio con una pipeta de sujeción y se les inyecta con la ayuda de una aguja de vidrio rellena con la solución de ADN que contiene el elemento transgénico, por ejemplo, un gen viral mutante (2 \mul/ml). La inyección de aproximadamente 2 picolitros de la solución (4 femptogramos de ADN) que es equivalente a aproximadamente 500 copias del elemento transgénico, por ejemplo, un gen viral mutante, se controla por el hinchamiento del pronúcleo en aproximadamente un 50%. Los embriones inyectados se ponen en el incubador antes de la transferencia a los animales receptores.

Los animales receptores se preparan de manera similar a los animales donantes, pero sin inducir la ovulación. Antes de la transferencia de los embriones inyectados, las cerdas receptoras se anestesian, el abdomen se abre quirúrgicamente aplicando una incisión longitudinal y los ovarios se exteriorizan. El oviducto ipsilateral al ovario con el mayor número de cuerpos lúteos se lava abundantemente, y los embriones se comprueban para evaluar si los animales son reproductivamente sanos. Aproximadamente de 4 a 6 cigotos inyectados con el elemento transgénico, por ejemplo, un gen viral mutante, se transfieren al oviducto lavado abundantemente, la incisión abdominal se sutura y los animales se ponen en un área caliente para su recuperación. El estado de embarazo se controla por ultrasonidos empezando el día 25 o aproximadamente una semana después de la fecha esperada de implantación. Las receptoras preñadas se encierran por separado hasta que esté previsto el parto.

Los cerdos recién nacidos se analizan para comprobar la integración del elemento transgénico en el ADN cromosómico. Se extrae ADN genómico a partir de una punción en la oreja o una muestra de sangre y se realiza una investigación inicial usando PCR. Los animales que son potencialmente positivos para el elemento transgénico se confirman por medio de un análisis de Southern. Los animales fundadores transgénicos se someten a otro análisis con respecto al locus de integración del elemento transgénico usando análisis de Southern.

El aislamiento y secuenciación de un inserto retroviral de cerdo endógeno y de un inserto retroviral en células PK-15 porcinas Clonación de retrovirus endógenos PK15 y PAL I. Aislamiento de ARN poli A+

Se prepararon linfocitos de sangre periférica (PBL) a partir de minicerdos de haplotipo d/d usando protocolos convencionales conocidos en la técnica. Los PBL se cultivaron en presencia de fitohemaglutinina (PHA) al 1% durante aproximadamente 48 horas. Los PBL activados se recogieron y el ARN total se aisló usando kits disponibles en el mercado, tales como el kit PUREscript de Gentra (Minneapolis, Minnesota). El ARN poli A+ se aisló a partir del ARN total usando otro producto disponible en el mercado, Dynal Dynabeads (Lake Success, NY). El análisis de Northern del ARN usando una sonda retroviral de cerdo confirmó la presencia de un ARN genómico retroviral de longitud potencialmente completa. El ARN de células PK15 se aisló usando protocolos similares.

II. Construcción de las bibliotecas de ADNc

Usando Superscript Choice System (Life Technologies Ltd, Gibco, BRL, Gaithersburg, MD) para la síntesis de ADNc, se construyó una biblioteca de ADNc usando oligo dT para construir la primera cadena de ADNc. El uso de la transcriptasa inversa Superscript fue importante para obtener ADNc retrovirales (RV) de longitud completa, debido a la longitud del ARN RV. La biblioteca de ADNc estaba enriquecida en fragmentos grandes de ADNc por selección por tamaños de fragmentos >4 kb por electroforesis en gel. Los ADNc se clonaron en Lambda ZAP Express (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA), que es uno de los pocos vectores de ADNc disponibles en el mercado que aceptarían insertos en el intervalo de 1 a 12 kb.

III. Selección de las bibliotecas de ADNc

Se seleccionaron 0,75 - 1,2 x 10^{6} clones independientes usando sondas gag y pol o gag y env. Los clones dobles positivos se purificaron adicionalmente hasta que se obtuvieron aislados individuales (1 ó 2 vueltas más de selección).

IV. Caracterización de los clones

Se seleccionaron entre 18 y 30 clones dobles positivos para la evaluación. Se preparó ADN Lambda usando protocolos convencionales, tales como el kit de ADN Lambda (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Los clones se analizaron por PCR para comprobar (a) los genes RV y (b) determinar el tamaño del inserto y de las regiones LTR. También se realizaron digestiones de restricción para confirmar el tamaño del inserto e intentar clasificar los clones. Se secuenciaron los clones que contenían los insertos más grandes y que tenían datos de PCR consistentes y previstos.

Desarrollo de un ensayo basado en PCR para la detección de la presencia de un retrovirus endógeno en células, tejidos, órganos, minicerdos u hospedadores receptores (por ejemplo, primates, seres humanos)

Usando un programa de software informático disponible en el mercado (tal como RightPrimer, Oligo 4.0, MacVector o Geneworks), se pueden analizar secuencias descritas en este documento para la selección de pares de cebadores de PCR. Los criterios para la selección general de pares de cebadores incluyen:

a.: La Tm de cada cebador está comprendida entre 65 y 70ºC

b.: Las Tm de cada par difieren en no más de 3ºC

c.: El fragmento de PCR tiene un longitud comprendida entre 200 y 800 pb

d.: No hay repeticiones, bases autocomplementarias, sucesos de cebador-dímero, etc. para cada par.

A. Criterios adicionales para: Un ensayo de PCR específico de cerdo

a. Se seleccionan cebadores dentro de regiones específicas porcinas de la secuencia -- tal como dentro de gag, env o U3. Los cebadores específicos de cerdo se definen como secuencias que, en general, tienen una homología <70% con la región correspondiente en retrovirus de seres humanos, ratones y primates. Además, las últimas cinco bases en el extremo 3' del cebador deben ser únicas para la secuencia retroviral de cerdo.

b. Los cebadores no deben tener más de una o dos bases mal emparejadas basándose en las secuencias de minicerdo y retrovirales descritas en este documento. Estas bases mal emparejadas no deben estar dentro de las tres o cuatro últimas bases del extremo 3' del cebador.

B. Criterios adicionales para: Ensayo de PCR específico de minicerdo

a. Se seleccionan cebadores de tal manera que haya al menos uno o dos desacoplamientos entre las secuencias de minicerdo y de cerdo doméstico. Al menos uno de estos desacoplamientos debe localizarse dentro de las tres o cuatro últimas bases en el extremo 3' del cebador. Preferiblemente, estos desacoplamientos serían un cambio de una G o C en un minicerdo a una A o T en el cerdo doméstico,

Estrategia de RT-PCT

Hay varios kits de RT-PCR disponibles en el mercado para la amplificación rutinaria de fragmentos. Para confirmar la Tm y la especificidad deben ensayarse varios pares de cebadores. La localización de cebadores dentro de la secuencia depende en parte de la cuestión que se responde. La RT-PCR debe responder cuestiones acerca de la expresión y presencia de secuencias de RV. La PCR no necesariamente responderá la cuestión de si la secuencia retroviral es de longitud completa o codifica un retrovirus competente de replicación. Una señal positiva en estos ensayos sólo dice que está presente una secuencia RV. La indicación de la posibilidad de que estén presentes genomas virales de longitud completa puede obtenerse realizando PCR largas usando cebadores en U5 y U3. Se dispone de un kit comercial para la amplificación por RP-PCR (kit Takara RNA LA PCR). La confirmación de los genomas virales de longitud completa requiere estudios de infectividad y/o aislamiento de partículas virales.

El análisis de Northern complementaría los datos de RT-PCR. La detección de bandas en el tamaño previsto de genomas virales de longitud completa con sondas de hibridación de env, U3 o U5 proporcionaría mayores evidencias. La presencia de otras bandas pequeñas que hibridan indicaría la cantidad de fragmentos virales defectuosos presentes.

Ensayo Basado en Elisa para Detectar la Presencia de Proteínas, Polipéptidos o Péptidos Retrovirales Porcinos

Además del uso de ensayos basados en ácidos nucleicos, por ejemplo, basados en PCR, para detectar la presencia de secuencias retrovirales, los ensayos basados en ELISA pueden detectar la presencia de proteínas, polipéptidos y péptidos retrovirales porcinas.

Las etapas básicas para desarrollar un ELISA incluyen (a) la generación de péptidos, polipéptidos y proteínas específicas retrovirales porcinas; (b) la generación de anticuerpos específicos para las secuencias retrovirales porcinas; y (c) desarrollo del ensayo.

Usando las secuencias retrovirales descritas en este documento, pueden diseñarse péptidos antigénicos usando programas informáticos tales como MacVector o Geneworks para analizar las secuencias retrovirales. Como alternativa, es posible expresar las secuencias retrovirales porcinas en sistemas de expresión de genes y purificar los polipéptidos o proteínas expresadas. Después de la síntesis, los péptidos, polipéptidos o proteínas se usan para inmunizar ratones o conejos y para desarrollar sueros que contengan anticuerpos.

Habiendo obtenido los anticuerpos específicos retrovirales porcinos, el ELISA puede desarrollarse como se indica a continuación. Se recubren placas ELISA con un volumen de anticuerpo policlonal o monoclonal (anticuerpo de captura) que es reactivo con el analito a ensayar. Tales analitos incluyen retrovirus porcinos o proteínas retrovirales tales como env o p24. Las placas ELISA después se incuban a 4ºC durante una noche. Las placas recubiertas después se lavan y se bloquean con un volumen de reactivo de bloqueo para reducir o prevenir la hibridación no específica. Tales reactivos de bloqueo incluyen albúmina de suero bovino (BSA), suero bovino fetal (FBS), leche o gelatina. La temperatura para el proceso de bloqueo es 37ºC. Las placas pueden usarse inmediatamente o almacenarse congeladas a -20ºC hasta que se necesiten. Las placas después se lavan, se cargan con una dilución en serie del analito, se incuban a 37ºC y se lavan de nuevo. El analito unido se detecta usando un anticuerpo de detección. Los anticuerpos de detección incluyen anticuerpos policlonales o monoclonales unidos a enzima, fluoresceinados, conjugados con biotina o con otra señal, que son reactivos con el analito. Si se usan anticuerpos monoclonales, el anticuerpo de detección debe reconocer un epítopo que es diferente del anticuerpo de captura.

Otras Realizaciones

La invención incluye ácidos nucleicos, por ejemplo, ARN o ADN, que codifican un polipéptido de la invención. Esto incluye ácido nucleicos de doble cadena sí como que codifican cadenas antisentido individuales.

En la invención se incluyen: variaciones alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con el ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 (para las definiciones de alta y baja rigurosidad véase: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1 - 6.3.6.

La invención también se refiere a un ácido nucleico purificado que tiene una identidad u homología de secuencia de al menos el 60%, 70%, 72%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, aún más preferiblemente al menos el 95%, y aún más preferiblemente al menos el 98%, 99% o 100% con la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico es distinto del genoma retroviral entero de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, por ejemplo, tiene al menos 1 nucleótido más, o es al menos un nucleótido menor, o difiere en secuencia al menos en una posición. Por ejemplo, el ácido nucleico es un fragmento de la secuencia de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria, o incluye una secuencia adicional a la de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria.

En realizaciones preferidas: la secuencia del ácido nucleico difiere de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria en 1, 2, 3, 4 ó 5 pares de bases; la secuencia del ácido nucleico difiere de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 3 o su secuencia complementaria en al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 pares de bases pero menos de 6, 7, 8, 9 ó 10 pares de bases.

En otras realizaciones preferidas: el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos; el ácido nucleico tiene una longitud menor de 20, más preferiblemente menor de 25, 30, 50, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 u 8060 nucleótidos.

Equivalentes

Los especialistas en la técnica podrán reconocer o ser capaces de averiguar, sin usar nada más que la experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en este documento.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Jay A. Fishman

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIA MOLECULAR DE RETROVIRUS PORCINO Y MÉTODOS DE USO

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 74

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: LAHIVE & COCKFIELD, LLP

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(B): CALLE: 60 State Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO: Massachusetts

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F): CÓDIGO POSTAL: 02109-1875

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/572.645

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-DICIEMBRE-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Louis Myers

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.965

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: MGP-038CP

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (617) 227-7400

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (617) 227-5941

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8060 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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2

3

4

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7333 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

7

8

9

10

11

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

12

13

14

15

16

17

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCTAGAGA CATGTACTC

\hfill

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCTTCTAG CCATTCCTTC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGACTCG GTGGAAGGGC CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCCCTTCC ACCGAGTCTC GA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTGGATCC ATGCATCCCA CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTGGGATGC ATGGATCCAG GT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCCACCT CCCGATTCGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATCGGG AGGTGGCGCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCCTTAAG CTTCGCCTCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGCGAAG CTTAAGGGGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAGCACAA AGGGCAGGAG AGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTCCTGC CCTTTGTGCT TTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTTAGGAA CCTGGTGGCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCACCAGG TTCCTAAAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCCAGATA TCCTCCATGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATGGAGGA TATCTGGGGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGTTTCCA ATCAATCCCC AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGGGATTG ATTGGAAACT GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTATGTTTG CCCAGGACCA CCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTGGTCCT GGGCAAACAT AAA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGTGGC GCCGGCTTAA CGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTTAAGCC GGCGCCACCT CCC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCCAACCC AAGGACCAGG ACCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTCCTGGT CCTTGGGTTG GGGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGCACGAC TAAAATGGGG GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCCCATTT TAGTCGTGCT GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCCATCCC ACCAACACCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTGTTGGT GGGATGGGGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCCCCCAC CCCGAAACAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTTTCGGG GTGGGGGAGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCAAGAAA GCCAGGTCCC CGAA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGGGGACC TGGCTTTCTT GGCT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTCTGGT GGCGGGTCTC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGACCCGC CACCAGAGCC T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCAGGGAT GGGTTTGGCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCAAACCC ATCCCTGCGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCACCTGG ACCCGACTGC CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCAGTCGG GTCCAGGTGA GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTACGGGA CGGGCAGCGA TGGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCATCGCTG CCCGTCCCGT AAAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCTGGGGC GGCGGTGGTG GACGGG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGTCCACC ACCGCCGCCC CAGCCA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCAAAGCC CCAGAACCCA GACG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCTGGGTT CTGGGGCTTT GGGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGAACAGG CAGACATCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTTACAGA CAAGCTGTGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAACAAAGG CTGGGAAGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAGGAGACA GCCTGAACTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCATTGT CTGACCCTAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCAACACCT ATACCAGCTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTGAGGT ATAGCAGGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGGTGTAG GAACAGGAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTGTTGAA CCATCCCTCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAATGGAGA GATCCAGGTA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGCATCAC TCTCTTACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCCTGCTT GTGGAATACG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGAGAAGA AGTGGGGGAAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGTCGTA CACCACGCAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGACAGA AGAAGAAAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATAGTCAT TAGTCCCAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTGGTTTG CATCAAGACC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGCAAAGG CATACCTGCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGAGCCTC TGCTAAGAAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGCTGTTG ACAATCATC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATGAGGAGA GGGCTTGACT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAGACGTG CTAGGAGGT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTCTTGCT GTTTGCATC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGACACTCA GAACAGAGAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATCGTCTA ACCCACCTAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGTTTCTG GTCATACCTG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTACATCT CTCTAGGCA

\hfill

19

Claims

1. Un método para investigar en una célula o un tejido la presencia o expresión de un retrovirus de cerdo o de cerdo miniatura, que comprende:

poner en contacto un ácido nucleico diana de la célula o tejido con un segundo ácido nucleico, donde el segundo ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h);

en condiciones en las que puede producirse hibridación, siendo indicativa la hibridación de la presencia o expresión de un retrovirus o secuencia retroviral de cerdo o de cerdo miniatura en el tejido.

2. Un método para investigar en el genoma de un cerdo o de un cerdo miniatura la presencia de un retrovirus porcino, que comprende:

poner en contacto el ADN genómico del cerdo o del cerdo miniatura con un segundo ácido nucleico, donde el segundo ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº:3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h);

en condiciones en las que puede producirse hibridación, siendo indicativa la hibridación de la presencia de la secuencia retroviral porcina endógena en el genoma del cerdo miniatura.

3. Un método para evaluar el riesgo potencial asociado con el trasplante de un injerto desde un cerdo o cerdo miniatura donante a un animal receptor, que comprende:

poner en contacto un ácido nucleico diana del donante, receptor o el injerto, con un segundo ácido nucleico, donde el segundo ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h);

en condiciones en las que puedan hibridar las secuencias, siendo indicativa la hibridación de un riesgo asociado con el trasplante.

4. Un método para proporcionar un cerdo o cerdo miniatura sin una inserción de retrovirus activable en un sitio preseleccionado, que comprende:

realizar un cruce entre un primer cerdo miniatura que tiene una inserción retroviral en el sitio preseleccionado y un segundo cerdo miniatura que no tiene una inserción retroviral en un sitio preseleccionado, y recuperar una progenie de cerdos miniatura que no tenga la inserción, donde la presencia o ausencia de la inserción retroviral se determina poniendo en contacto el genoma de un cerdo miniatura con un segundo ácido nucleico que hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h).

5. Un método para localizar el origen de una infección retroviral porcina, que comprende:

poner en contacto un ácido nucleico diana de un injerto u órgano con un segundo ácido nucleico, donde el segundo ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h);

poner en contacto un ácido nucleico del receptor con un tercer ácido nucleico, donde el tercer ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h);

donde la hibridación con el ácido nucleico del injerto se correlaciona con la infección retroviral porcina en el injerto; y la hibridación con el ácido nucleico del receptor se correlaciona con la infección retroviral porcina en el receptor.

6. Un método para investigar en un ser humano la presencia o expresión de un retrovirus porcino endógeno, que comprende:

poner en contacto un ácido nucleico diana derivado del ser humano con un segundo ácido nucleico, donde el segundo ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h);

en condiciones en las que puedan hibridar las secuencias, siendo indicativa la hibridación de la presencia de las secuencias retrovirales o de retrovirus porcino endógenas en el ser humano.

7. Un método para determinar el número de copias, tamaño, o terminación de un retrovirus porcino, que comprende:

poner en contacto un ácido nucleico diana de un donante, receptor o un injerto, con un segundo ácido nucleico, donde el segundo ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos consecutivos seleccionada entre el grupo compuesto por:

(a) la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que codifica una proteína gag de la SEC ID Nº: 3;

(c) los nucleótidos 585-2156 de la SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia que codifica una proteína pol de la SEC ID Nº: 3;

(e) los nucleótidos 2307-5741 de la SEC ID Nº: 3;

(f) una secuencia que codifica una proteína env de la SEC ID Nº: 3;

(g) los nucleótidos 5620-7533 de la SEC ID Nº: 3;

(h) mutantes naturales de cualquiera de (a)-(g); y

(i) secuencias complementarias a una cualquiera de (a)-(h).

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicha secuencia de nucleótidos comprende al menos 20, 25, 30, 50, 100 o 1000 nucleótidos consecutivos.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho segundo ácido nucleico tiene una identidad de secuencia de al menos el 85%, 90%, 95%, 98% o 100% con la secuencia con la que hibrida o su secuencia complementaria.