ES2223858T3 - Procedimiento para unir un antigeno a una molecula que tiene una elevada afinidad de union a dicho antigeno. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para unir un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno, caracterizado porque la unión se lleva a cabo en un medio que tiene un contenido de agua de menos de 25% en peso de la composición total.

Description

Procedimiento para unir un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión a dicho antígeno.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere en general al campo de la bioquímica. Más en particular, se refiere a un procedimiento para unir un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno, como un anticuerpo. Especialmente se refiere a un procedimiento para unir un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión, en el que la unión se lleva a cabo en un medio que tiene un contenido de agua de menos de 25% en peso de la composición total.

Antecedentes y técnica anterior

Los antígenos son moléculas o estructuras moleculares que pueden ser reconocidos por moléculas que se unen a ellos y que tienen una elevada afinidad por ellos. La mayoría de los procedimientos bioquímicos, incluido el reconocimiento de antígenos por anticuerpos, se producen en la naturaleza en medios esencialmente acuosos. También en la industria, la aplicación de anticuerpos para reconocer sus respectivas dianas se realiza tradicionalmente en presencia de un entorno acuoso líquido. Por ejemplo, el documento WO-A-98/56885 (Unilever) describe en los ejemplos que las manchas en una tela pueden ser blanqueadas en un entorno acuoso por medio de una enzima de glucosa oxidasa, acoplada a un anticuerpo surgido contra los compuestos presentes en las manchas.

El documento WO-A-98/00500 (Unilever) describe una composición de lavandería que comprende un agente ventajoso unido a un adyuvante de depósito de péptido o proteína, que tiene una elevada afinidad por la tela. La composición se reivindica que deposita eficazmente el agente ventajoso en la tela durante el ciclo de lavado.

Según el documento DE-A-19621224 (Henkel) la transferencia de colorantes textiles desde una prenda a otra durante un procedimiento de lavado o aclarado puede ser inhibida añadiendo anticuerpos contra el colorante textil al líquido de lavado o aclarado.

El documento WO-A-98/07820 (P&G) describe, entre otras cosas, composiciones de tratamiento del aclarado que contienen anticuerpos dirigidos a celulasa y componentes activos suavizantes estándar (como DEQA).

El documento anterior no previamente publicado WO-A-01/46514 (Unilever) describe un método para suministrar un agente ventajoso a una zona seleccionada de una tela para ejercer una actividad predeterminada, que comprende tratar previamente dicha zona con una molécula de unión multi-específica, en que dicha molécula de unión tiene una elevada afinidad de unión por dicha zona a través de una especifidad y es capaz de unirse a dicho agente ventajoso a través de otra especifidad, y seguidamente se pone en contacto dicha zona previamente tratada con dicho agente ventajoso para ejercer dicha actividad predeterminada a dicha zona. Se describe también un dispositivo para ser usado en el método anteriormente mencionado, en la forma de un dispositivo de suministro capaz de depositar una molécula de unión multi-específica a una zona seleccionada de una tela, en que dicha molécula de unión tiene una elevada afinidad de unión a través de una especifidad a dicha zona, y es capaz de unirse a un agente ventajoso a través de otra especifidad, a través de una cera semi-sólida o un bastoncillo de jabón, una barrita de bola rodante, una pulverización, aerosol, cepillo impregnado, gel o espuma.

Por lo tanto, hasta ahora, la reacción de unión entre un antígeno y la molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno se ha llevado a cabo siempre en medios acuosos o esencialmente acuosos. Se ha encontrado ahora sorprendentemente que la unión de un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno es inhibida hasta un grado mucho menos de lo esperado en concentraciones bajas de agua, por ejemplo, en un medio que tenga un contenido de agua de menos de 25% en peso de la composición total. Esto hace posible formular productos que hasta ahora eran considerados ineficaces e insatisfactorios.

Definición de la invención

Según la invención, se proporciona un procedimiento para unir un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno, caracterizado porque la unión se lleva a cabo en un medio que tiene un contenido de agua de menos de 25% en peso de la composición total.

Descripción detallada de la invención 1. El antígeno

La invención se refiere a un procedimiento en el que un antígeno es unido a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno, en el que la unión se lleva a cabo en un medio que tiene un contenido de agua de menos de 25% en peso de la composición total. Preferentemente, el contenido de agua es de menos de 15%, más preferentemente menos de 10% en peso de la composición total. El límite inferior del contenido de agua, por razones prácticas, es de más de aproximadamente 1%, habitualmente 5% o 10% en peso de la composición total. El suministro de anticuerpos a los antígenos en un entorno de bajo contenido de agua se puede llevar a cabo en un entorno líquido pero que carezca de agua (por ejemplo, glicerol sustituido) o en un formato completamente seco (por ejemplo, en polvo o en forma de partículas) o en condiciones de limpieza en seco de lavandería (lavado con disolventes o CO_{2} líquido).

El antígeno puede ser cualquier estructura molecular que sea capaz de ser reconocida por una correspondiente molécula de anticuerpo, fragmento de proteína o derivado de los mismos.

2.1 La molécula que tiene una elevada afinidad de unión

En el procedimiento según la invención, el antígeno se une por medio de un reactivo que tiene una elevada afinidad de unión por el antígeno. Un ejemplo específico de este reactivo es, por ejemplo, un anticuerpo.

Hablando de forma general, el grado de unión de una molécula A a otra molécula B puede ser expresado de forma general mediante la constante de equilibrio químico K_{d} que resulta de la siguiente reacción:

[A] + [B] \Leftrightarrow [AB]

La constante de equilibrio químico K_{d} está proporcionada por tanto por:

K_{d} = \frac{[A] \times [B]}{[AB]}

El hecho de si la unión de una molécula a la tela es específica o no lo es puede ser estimado a partir de la diferencia entre la unión (valor de K_{d}) de la molécula a un tipo de tela frente a la unión a otro tipo de material de tela. Para aplicaciones en lavandería, dicho material será una tela como algodón o poliéster. Sin embargo, habitualmente será más conveniente medir valores de K_{d} y diferencias en valores de K_{d} de otros materiales como una placa de microtitulación de poliestireno o una superficie especializada en un biosensor analítico. La diferencia entre las dos constantes de unión debe ser como mínimo 10, preferentemente más de 100 y más preferentemente, más de 1000. Normalmente, el reactivo se debe unir a la tela con una K_{d} menor que 10^{-4} M, preferentemente menos de 10^{-6} M y podría ser 10^{-10} M o incluso menos. Unas afinidades de unión superiores (K_{d} de menos de 10^{-5} M) y/o una diferencia mayor entre la unión de un tipo de tela y otro tipo de tela (o de fondo) aumentaría el depósito de agente ventajoso. También, la eficacia en peso del reactivo en la composición de aclarado total aumentaría y se requerirían cantidades más pequeñas del reactivo.

Se pueden concebir diversas clases de reactivo o moléculas que suministren la capacidad de unión específica a telas, a las que se desearía suministrar el agente ventajoso. En lo que sigue se proporcionará un cierto número de ejemplos de estas moléculas que tienen estas capacidades, sin pretender ser exhaustivos.

2.2.1 Anticuerpos

Los anticuerpos son proteínas de unión específica. Su función en la naturaleza es de una protección frente a enfermedades mediante el reconocimiento (y unión) de estructuras extrañas, como virus o bacterias, pero no las propias células. Además, son bien conocidos en la técnica métodos para generar anticuerpos que sean específicos para casi cualquier proteína, molécula orgánica o superficie celular, que sea probable encontrar. Esta especifidad de unión ha sido explotada en la industria de la Biotecnología, principalmente para diagnósticos médicos. Por ejemplo, muchos estuches de ensayo de embarazo para realizar en el hogar comprenden un anticuerpo que se une específicamente a la hormona marcadora del embarazo, gonadotropina coriónica humana (hCG), pero no a otras hormonas presentes en la orina.

Más recientemente, ha sido descrito el uso de anticuerpos en productos de lavandería (Henkel, Procter and Gamble, Unilever). En particular, la empresa Unilever ha descrito el uso de anticuerpos específicos para manchas para dirigir a diana enzimas blanqueadoras exclusivamente a manchas pero no a colorantes, consiguiendo así una supresión eficaz de las manchas sin deteriorar la tela circundante.

Los anticuerpos son ejemplos bien conocidos de moléculas que son capaces de unirse específicamente a compuestos frente a los cuales han surgido. Los anticuerpos pueden ser suministrados a partir de diversas fuentes. A partir de ratones, pueden ser obtenidos anticuerpos monoclonales que poseen afinidades de unión muy elevadas. A partir de estos anticuerpos, pueden ser preparados fragmentos Fab, Fv o ScFv, que tienen retenidas sus propiedades de unión. Estos anticuerpos o fragmentos pueden ser producidos a través de la tecnología de ADN recombinante mediante fermentación microbiana. Hospedantes de producción bien conocidos para anticuerpos y sus fragmentos son levadura, mohos o bacterias.

Una clase de anticuerpos de interés particular está formada por los anticuerpos de cadenas pesadas como los que se encuentran en los camélidos, como el camello o la llama. Los dominios de unión de estos anticuerpos consisten en un único fragmento de polipéptido, a saber, la región variable del polipéptido de cadena pesada (HC-V). Por el contrario, en los anticuerpos clásicos (murino, humano, etc.), el dominio de unión consiste en dos cadenas de polipéptidos (las regiones variables de la cadena pesada (V_{h}) y la cadena ligera (V_{1})). Los procedimientos para obtener inmunoglobulinas de cadena pesada a partir de camélidos o sus fragmentos (funcionalizados) han sido descritos en los documentos WO-A-94/04678 (Casterman and Hamers) y WO-A-94/25591 (Unilever y Free University of Brussels).

Alternativamente, los dominios de unión pueden ser obtenidos a partir de los fragmentos V_{h} de los anticuerpos clásicos mediante un procedimiento denominado "camelización". Mediante el mismo, el fragmento V_{h} clásico es transformado, mediante la sustitución de un cierto número de aminoácidos, en un fragmento de tipo HC-V, con lo que son retenidas sus propiedades de unión. Este procedimiento ha sido descrito por Riechmann y col. en un cierto número de publicaciones (J. Mol. Biol. (1996) 259, 957-969; Protein. Eng. (1996) 9, 531-537, Bio/Technology (1995) 13, 475-479). También, los fragmentos HC-V pueden ser producidos a través de una tecnología de ADN recombinante en un cierto número de hospedantes microbianos (bacterias, levaduras, mohos) como se describe en el documento WO-A-94/29457 (Unilever).

Los métodos para producir proteínas de fusión que comprendan una enzima y un anticuerpo o que comprendan una enzima y un fragmento de anticuerpo son ya conocidos en la técnica. Una aproximación es descrita por Neuberger y Rabbits (documento EP-A-194.276). Un método para producir una proteína de fusión que comprende una enzima y un fragmento de anticuerpo que era derivado de un anticuerpo originario de Camelidae es descrito en el documento WO-A-94/25591. Un método para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos es descrito por Hollinger y col. (1993) PNAS 90, 6444-6448.

Una característica particularmente atractiva del comportamiento de unión de los anticuerpos es su capacidad descrita para unirse a una "familia" de moléculas estructuralmente relacionadas. Por ejemplo, en Gani y col. (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 48, 277-282) se describe un anticuerpo que se hizo surgir frente a progesterona pero que se une también a esteroides estructuralmente relacionados, pregnanodiona, pregnanolona y 6-hidroxi-progesterona. Por lo tanto, usando la misma aproximación, se podrían aislar anticuerpos que se unan a una "familia" completa de cromóforos de manchas (como los polifenoles, porfirinas o carotenoides que se describen con posterioridad). Se podría usar un anticuerpo de acción amplia como éstos para tratar a diversas manchas diferentes cuando es acoplado a una enzima blanqueadora.

2.1.2. Péptidos

Los péptidos habitualmente tienen afinidades de unión por las sustancias de interés inferiores a los anticuerpos. No obstante, las propiedades de unión de péptidos cuidadosamente seleccionados o diseñados pueden ser suficientes para suministrar la selectividad deseada en un procedimiento de oxidación. Un péptido que sea capaz de unirse selectivamente a una tela a la que se quiera suministrar un agente ventajoso puede ser obtenido, por ejemplo, a partir de una proteína que se conozca que se une a esa tela específica. Un ejemplo de este péptido sería una región de unión extraída de un anticuerpo surgido contra esa tela. Un péptido adecuado podría ser análogo al centro activo de una proteína análoga a un dominio de unión no catalítico de una proteína, por ejemplo, un receptor.

Alternativamente, los péptidos que se unen a estas sustancias pueden ser obtenidos usando bibliotecas combinatoriales de péptidos. Esta biblioteca puede contener hasta 10^{10} péptidos, de los que puede ser aislado el péptido con las propiedades de unión deseadas (R. A. Houghten, Trends in Genetics, Vol. 9, no &, 235-239). Otras diversas realizaciones han sido descritas para este procedimiento (J. Scott y col., Science (1990) 249, 386-390; Fodor y col., Science (1991) 251,767-773; K. Lam y col., Nature (1991) 354, 82-84; R. A. Houghten y col., Nature (1991) 354, 84-86).

Los péptidos adecuados pueden ser producidos mediante síntesis orgánica usando, por ejemplo, el procedimiento de Merrifield (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154). Alternativamente, los péptidos pueden ser producidos mediante una tecnología de ADN recombinante en hospedantes microbianos (levadura, mohos, bacterias) (K. N. Faber y col. (1996) Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 72-79).

2.1.3. Peptidomímicos

Con el fin de mejorar la estabilidad y/o propiedades de unión de un péptido, la molécula puede ser modificada mediante la incorporación de aminoácidos no naturales y/o enlaces químicos no naturales entre los aminoácidos. Estas moléculas se denominan peptidomímicos (H. U. Saragovi y col. (1991) Bio/Technology 10, 773-778; S. Chen y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5872-5876). La producción de estos compuestos está restringida a la síntesis química.

2.1.4. Otras moléculas orgánicas

Se puede concebir fácilmente que se puedan encontrar otras estructuras moleculares, que no necesitan estar relacionadas con las proteínas, péptidos o sus derivados, que se unan selectivamente a las telas a las que se desee suministrar un agente ventajoso. Por ejemplo, ciertas moléculas polímeras de ARN que se ha mostrado que se unen a pequeñas moléculas de colorantes sintéticos (A. Ellington y col. (1990) Nature 346, 818-822). Estos compuestos de unión pueden ser obtenidos mediante la aproximación combinatorial descrita para los péptidos (L. B. McGown y col. (1995), Analytical Chemistry, 663A-668A).

Esta aproximación puede ser aplicada también para compuestos puramente orgánicos que no sean polímeros. Han sido descritos procedimientos combinatoriales para la síntesis y selección de las propiedades de unión deseadas para estos compuestos (Weber y col. (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34,2280-2282; G. Lowe (1995), Chemical Society Reviews 24, 309-317; L. A. Thompson y col. (1996) Chem. Rev. 96, 550-600). Una vez que los compuestos de unión adecuados han sido identificados, pueden ser producidos a una escala mayor por medio de síntesis orgánica.

La molécula tiene una elevada afinidad de unión por el antígeno. Si la molécula esa una proteína o un péptido, puede ser que una parte de su cadena polipéptida sea responsable de la afinidad de unión a la tela, y parte del reactivo comprende una parte enzimática capaz de proporcionar algún tipo de ventaja. En la primera situación, la enzima puede ser una proteína de fusión que comprenda dos dominios, que pueden ser acoplados por medio de un conector. Alternativamente, la molécula que tiene la elevada afinidad de unión puede estar covalentemente acoplada a un agente ventajoso por medio de un agente de acoplamiento bivalente como glutaraldehído. Un examen completo de las químicas apropiadas para acoplar dos biomoléculas se proporciona en la publicación "Bioconjugate techniques" de Greg T. Hermanson, Academic Press Inc (1986). Alternativamente, si la molécula que tiene la elevada afinidad de unión es un péptido o una proteína, puede ser acoplada también a la enzima mediante la construcción de una proteína de fusión. En esta construcción normalmente habría un conector péptido entre el reactivo de unión y la enzima. Un ejemplo de una fusión de una enzima y un reactivo de unión se describe por Ducancel y col. Bio/technology 11, 601-605.

Una realización adicional sería que la molécula con la afinidad de unión elevada fuera una molécula bioespecífica. Esta molécula podría cumplir el requisito de acumular un agente ventajoso en la tela suministrando dicha molécula conjuntamente con el agente ventajoso como un complejo no covalente previamente formado o bien suministrando las dos separadamente y permitiendo que se auto-ensamblen en el líquido de lavado o aclarado o en la tela.

En una realización preferida, el procedimiento de la invención se lleva a cabo usando micro-partículas sensibilizadas con un antígeno o combinaciones de anticuerpo/antígeno configuradas de forma que las micro-partículas tengan un contenido de un agente ventajoso y el anticuerpo tenga una elevada afinidad o especifidad por una sustancia (o "molécula marcadora") normalmente encontrada en algunas zonas de las telas pero no en otras. Ejemplos de estas moléculas marcadoras incluyen colorantes deteriorados en el blanqueo y microbios que se conoce que están asociados con los malos olores. El anticuerpo dirige el agente ventajoso a diana hasta su sitio de acción previsto y se une allí al mismo. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para microbios pueden dirigir a diana partículas que contengan fragancias hasta las zonas de malos olores. Por tanto, se consigue un uso más eficaz de ingredientes caros. Alternativamente, los anticuerpos específicos por colorantes deteriorados en el blanqueo pueden dirigir a diana partículas coloreadas hasta zonas decoloradas, reponiendo así el color perdido en el ciclo de lavado principal.

Previamente, estas micro-partículas habían sido sensibilizadas con un anticuerpo y usadas para generar un punto final coloreado en dispositivos de diagnóstico médico, cuando eran aplicadas manualmente en una tira de ensayo. Según la presente invención, partículas análogas están siendo específicamente unidas a algunas muestras de algodón pero no a otras, dependiendo de que las moléculas marcadoras estén presentes en las muestras. La unión de las partículas es conducida no por la aplicación manual, sino agitando una fase líquida global (por ejemplo, un líquido de aclarado) que contiene dichas partículas y las muestras. La agitación aumenta el número de colisiones entre la tela y las partículas y, por tanto, aumenta la unión específica: las partículas sensibilizadas con anticuerpo específico dan lugar a colisiones productivas y la unión es permanente; las partículas sensibilizadas con anticuerpo no específico dan lugar a colisiones no productivas y no se unen permanentemente. Esta agitación podría ser fácilmente conseguida durante el ciclo de aclarado en una máquina lavadora automática.

Otra ventaja de la presente invención es que es posible dirigir a diana algunas moléculas ventajosas hasta zonas particulares de la tela durante el aclarado. Por ejemplo, los colorantes pueden ser dirigidos a diana hasta zonas blanqueadas de colores para reponer el colorante perdido en el lavado principal o la fragancia puede ser dirigida a diana hasta zonas en las que es más necesaria (es decir, las zonas en las que están presentes los microbios asociados con los malos olores, como las zonas "bajo el brazo"). Sin embargo, no habían sido previamente descritos métodos para dirigir a diana moléculas pequeñas (como las de un colorante o fragancia) hasta zonas particulares de la tela. Los inventores han abordado este problema introduciendo moléculas pequeñas (como un colorante) en una micro-partícula y sensibilizando seguidamente las partículas con un anticuerpo. La ventaja de esto es que un único acontecimiento de unión de anticuerpo puede depositar muchas moléculas de colorante en la zona o tejido diana. Aunque las partículas sensibilizadas con anticuerpo han sido previamente descritas (como partes componentes de dispositivos de diagnóstico médico), fueron usadas en una forma fundamentalmente diferente: en el dispositivo médico, las partículas son manualmente aplicadas a la superficie diana (normalmente un papel de nitrocelulosa) y seguidamente son eluidas con una solución. Si está presente el anticuerpo específico, las partículas permanecen adheridas. En otro caso no es así. Por el contrario, las partículas sensibilizadas con anticuerpo no habían sido previamente usadas para dirigir a diana un compuesto químico pequeño (como un colorante o una fragancia) desde una fase líquida global hasta un sitio diana particular en una superficie. Además, si hay una interacción análoga entre las partículas y la superficie diana (es decir, si las muestras son manualmente colocadas en el líquido global y permanecen estásticas) se observa poca o ninguna unión. Sin embargo, los inventores han sido capaces de conseguir sorprendentemente una unión específica a muestras de algodón agitando una fase líquida global (de líquido de aclarado o agua corriente) que contiene dichas partículas y las muestras.

Para aplicaciones en detergentes de lavandería, pueden ser concebidas diversas clases de telas naturales o artificiales, en particular algodón. Estos compuestos macromoleculares tienen la ventaja de que pueden tener una naturaleza inmunogénica, es decir, es más fácil hacer surgir anticuerpos contra ellos. Además, son más accesibles en la superficie de la tela que, por ejemplo, las sustancias coloreadas en manchas, que generalmente tienen un bajo peso molecular.

Una realización importante de la invención es usar un reactivo de unión (como se describió anteriormente) que se une a varios tipos diferentes de telas. Esto tendría la ventaja de hacer posible que un único agente ventajoso se depositara en diversos tipos diferentes de tela.

3. Aplicaciones

La invención se puede llevar a cabo en diversos sistemas. En primer lugar, los anticuerpos pueden ser suministrados en un sistema de pulverización. Los sistemas de pulverización normales son:

3.1. Sistemas de bombeo

Estos usan una fuerza mecánica habitualmente aplicada apretando una palanca (por ejemplo, las pulverizaciones usadas para mojar instalaciones).

3.2. Aerosoles antitranspirantes

Estos están constituidos por suspensiones del compuesto activo sólido (una sal de aluminio) en aceites de silicona:

10% de sal de aluminio

13% de ciclometicona

1% de Bentona 38 (Hectorita de cuaternium 18)

1% de fragancia

75% de propelente (denominado CAP 40 que es una mezcla de 22% de propano, 24% de isobutano y 54% de n-butano)

77,1 g de propelente en un bote de aerosol de 150 ml.

3.3. Aerosol de desodorante

Estos pueden variar considerablemente de un país a otro, pero de forma aproximada:

7,5 g de etanol

1 g de miristato de isopropilo (ayuda a reducir la formación de manchas tras la aplicación)

1,5 g de fragancia

35 g de propelente CAP 40,

en un bote de 150 ml

3.4. Pulverización para el cabello

Estos usan dimetil-éter o CAP 40 como propelente.

Las pulverizaciones para el cabello son soluciones de polímero en etanol/agua.

Una cantidad de 0-5% es una mezcla completa de polímeros y el resto es etanol/agua con un contenido de agua de aproximadamente 0-45% del mismo.

Los anticuerpos suministrados en un formato de pulverización pueden ser posteriormente usados para aplicaciones de lavandería, cuidado personal (desodorantes, antitranspirantes, perfumes, productos para el cabello) o aplicaciones de higiene (limpieza de superficies duras).

3.5. El suministro de anticuerpos en un bastoncillo de gel o formato de bola rodante

Podrían ser usadas aplicaciones de bastoncillos o bolas rodantes (similares a las usadas en los desodorantes) para aplicar un anticuerpo o antígeno y constituirían también un entorno de bajo contenido de agua.

3.6. El suministro de anticuerpos en una almohadilla absorbente

Los componentes activos pueden ser suministrados a partir de una almohadilla absorbente o retenidos en la misma. En este caso, la unión se produce en presencia de bajos niveles de agua.

3.7. El suministro de anticuerpos en un procedimiento de limpieza en seco

Los anticuerpos pueden ser usados también en un procedimiento de limpieza en seco, por ejemplo, en el reconocimiento de manchas específicas.

Nuevamente, los anticuerpos suministrados de esta manera pueden ser usados en lavandería, cuidado personal (desodorantes, antitranspirantes, perfumes, productos para el cabello) o aplicaciones de higiene (limpieza de superficies duras). El término "anticuerpos" incluye múltiples especifidades en una única molécula de proteína, por ejemplo, bicéfalas/tricéfalas.

Las composiciones de la invención pueden ser usadas en una composición detergente que sea específicamente adecuada para lavar entornos con un bajo contenido de agua, y esto constituye un segundo aspecto de la invención. Cuando se formula un producto que contiene anticuerpos, es importante asegurarse de que los demás ingredientes del producto sean compatibles con la actividad del anticuerpo. El documento WO-A-98/07820 (P&G) describe, entre otras cosas, composiciones de tratamiento en el aclarado que contienen anticuerpos dirigidos a celulasa y componentes activos suavizantes estándar como DEQA. Dicha invención preferentemente no contiene ningún suavizante o niveles bajos de componente activo suavizante (por ejemplo, HEQ). Si está presente HEQ, el producto del aclarado contiene tripolifosfato de sodio (STP) para estabilizar la actividad del anticuerpo.

Sin embargo, los presentes inventores consiguieron una unión y especifidad muy superiores en líquidos de aclarado (o agua corriente) omitiendo las composiciones suavizantes normales. Consiguieron también una unión mejorada en presencia de composiciones suavizantes añadiendo sales, especialmente sales multivalentes como STP. Es sorprendente también que los inventores encontraran que los anticuerpos eran activos en líquidos de aclarado (o agua corriente). Las descripciones previamente publicadas de la unión de anticuerpos específicos están normalmente en un tampón de resistencia fisiológica (NaCl 0,15 M) complementado a menudo con 0,15% de tensioactivo. En muchos modos, esto imita el entorno en que se unen los anticuerpos en la naturaleza, a saber, en el suero que es aproximadamente NaCl 0.15 M, pH 7, y en la albúmina de suero se cree que actúa de una forma análoga a un tensioactivo en cuanto reduce la oportunidad de reacciones de unión no específicas.

Hasta esa medida, la composición comprende uno o más agentes ventajosos y, opcionalmente, otros ingredientes detergentes convencionales. La invención en su segundo aspecto proporciona una composición de aclarado que comprende de 0,1-50% en peso, basado en la composición total, de uno o más tensioactivos. Este sistema tensioactivo puede comprender a su vez 0-95% en peso de uno o más tensioactivos aniónicos y 5-100% en peso de uno o más tensioactivos no iónicos. El sistema tensioactivo puede contener adicionalmente compuestos detergentes anfóteros o de iones híbridos, pero esto normalmente no es deseado debido a su coste relativamente elevado. Se ha encontrado que es ventajoso incluir también tensioactivos catiónicos en la composición. Ejemplos de tensioactivos catiónicos adecuados se proporcionan en los documentos WO-A-97/03160 y WO-A-98/17767 (Procter & Gamble).

En general, los tensioactivos no iónicos y aniónicos del sistema tensioactivo pueden ser escogidos entre los tensioactivos descritos en "Surface Active Agents" vol. 1, por Schwartz & Perry, Interscience 1949, vol. 2 por Schwartz, Perry & Berch, Interscience 1958, en la edición actual de "McCutcheon Emulsifiers and Detergents" publicado por la empresa Manufacturing Confectioners Company o en "Tenside-Taschenbuch", H. Stache, 2ª Ed., Carl Hauser Verlag, 1981.

Los compuestos detergentes no iónicos adecuados que pueden ser usados incluyen, en particular, los productos de reacción de compuestos que tienen un grupo hidrófobo y un átomo de hidrógeno reactivo, por ejemplo, alcoholes alifáticos, ácidos, amidas o alquil-fenoles con óxidos de alquileno, especialmente óxido de etileno solo o bien con óxido de propileno. Los compuestos detergentes no iónicos específicos son condensados de alquil C_{6}-C_{22}-fenol-óxido de etileno, generalmente con 5 a 25 EO, es decir, 5 a 25 unidades de óxido de etileno por molécula, y los productos de condensación de alcoholes alifáticos lineales o ramificados, primarios o secundarios, de C_{8}-C_{18} con óxido de etileno, generalmente 5 a 40 EO.

Los compuestos detergentes aniónicos adecuados que pueden ser usados son sales de metales alcalinos habitualmente solubles en agua de sulfatos y sulfonatos orgánicos que tienen radicales alquílicos que contienen de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono, en los que el término alquilo es usado para incluir la parte alquílica de los radicales acilo superiores. Ejemplos de compuestos detergentes aniónicos sintéticos adecuados son alquil-sulfatos de sodio y potasio, especialmente los obtenidos por sulfatación de alcoholes C_{8}-C_{18} superiores producidos, por ejemplo, a partir de aceite de sebo o de coco, alquil C_{9}-C_{20}-benceno-sulfonatos de sodio o potasio, particularmente (alquil secundario lineal C_{10}-C_{15})-benceno-sulfonatos de sodio; y alquil-gliceril-éter-sulfatos de sodio, especialmente los éteres de los alcoholes superiores derivados de aceite de sebo o coco y alcoholes sintéticos derivados del petróleo. Los compuestos detergentes aniónicos preferidos son alquil C_{11}-C_{15}-benceno-sulfonatos de sodio y alquil
C_{12}-C_{18}-sulfatos de sodio. Son también aplicables tensioactivos como los descritos en el documento EP-A-328.177 (Unilever), que muestran resistencia a la desalación, los tensioactivos de alquil-poliglicósidos descritos en el documento EP-A-070.074 y alquil-monoglicósidos.

Los sistemas tensioactivos preferidos son mezclas de materiales activos detergentes aniónicos, en particular los grupos y ejemplos de tensioactivos aniónicos y no iónicos indicados en el documento EP-A-346.995 (Unilever). Es especialmente preferido el sistema tensioactivo que es una mezcla de una sal de metal alcalino de un (alcohol primario C_{16}-C_{18})-sulfato junto con un etoxilato de alcohol primario C_{12}-C_{15} 3-7 EO.

El detergente no iónico está presente preferentemente en cantidades mayores que 10%, por ejemplo 25-90% en peso del sistema tensioactivo. Los detergentes aniónicos pueden estar presentes, por ejemplo, en cantidades en el intervalo de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% en peso del sistema tensioactivo.

La composición detergente del aclarado puede adoptar cualquier forma física adecuada como un polvo, una pastilla, un líquido acuoso o no acuoso, una pasta o un gel. El complejo del agente ventajoso y el reactivo que tiene una elevada afinidad según la invención será usado generalmente en forma de una dilución en agua de aproximadamente 0,05 a 2%.

La composición del aclarado de acuerdo con la invención, que comprende el complejo del reactivo que tiene una elevada afinidad por la tela y el adyuvante ventajoso, puede adoptar cualquier forma adecuada, es decir, la forma de una composición granular, un líquido o una suspensión de la enzima, o con un material portador (por ejemplo, como en el documento EP-A-258.068 y los productos Savinase® y Lipolase® de la empresa Novo Nordisk). Una buena forma de añadir el complejo a un producto del aclarado líquido es en la forma de una suspensión que contiene de 0,005 a 50% en peso del complejo de un tensioactivo no iónico de alcohol etoxilado.

Las composiciones de la invención comprenden aproximadamente 0,001 a 10 mg, preferentemente de 0,01 a 10 mg de anticuerpo por litro de líquido de lavado en uso. Una composición concentrada antes de ser usada comprenderá aproximadamente 1 a 1000 mg/l, preferentemente de 10 a 100 mg por litro del producto detergente.

La invención se ilustrará a continuación adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Unión de anticuerpo monoclonal a antígeno en concentraciones bajas de agua

Una placa ELISA se revistió con 100 \mul por pocillo de gonadotropina coriónica humana (hCG, Sigma Chemical Co) diluida hasta 1000 mIU/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,1% (v/v) de Tween 20 y 0,02% de azida de sodio (PBSTA). Después de una incubación durante una noche a 4ºC los pocillos se lavaron 3 veces con 200 \mul por pocillo de PBSTA. La placa fue bloqueada incubando con 100 \mul por pocillo de PBSTA que contenía 10 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente los pocillos se lavaron otra vez 3 veces con 200 \mul por pocillo de PBSTA y la placa se incubó con diversas diluciones en serie de un anticuerpo monoclonal específico para hCG (MAb 3299) diluido en diversas concentraciones de glicerol diluido en PBSTA. El MAb 3299 se generó usando técnicas de anticuerpos monoclonales estándar, sin embargo, los anticuerpos monoclonales que reconocen hCG pueden ser obtenidos de proveedores comerciales. Después de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, la aplaca se lavó 3 veces con PBSTA y seguidamente se incubó con un conjugado de IgG anti-ratón-fosfatasa alcalina (dilución 1:1000 en PBSTA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se llevaron a cabo otros 3 lavados y las placas se incubaron con solución de sustrato (1 comprimido de fosfatasa 104 de Sigma en 5 ml de dietanolamina 1 M que contenía MgCl_{2} 1 mM a pH 8,5) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Un esquema que muestra las etapas del ensayo se expone en la Figura 1. La densidad óptica del producto se midió a 405 nm (véase la Figura 2; 10 \mug/ml de MAb 3299 preparados en A, 100% de glicerol; B, 70% de glicerol; C, 0% de glicerol).

Ejemplo 2 Unión de antígeno a anticuerpo monoclonal en concentraciones bajas de agua

Una placa ELISA se revistió con un anticuerpo monoclonal (MAb 3299, específico para hCG) a 100 \mul por pocillo diluido hasta 10 \mug/ml en PBSTA. A continuación de una incubación durante una noche a 4ºC, los pocillos se lavaron 3 veces con 200 \mul por pocillo de PBSTA. La placa fue bloqueada con 100 \mul de PBSTA que contenía 10 mg/ml de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente y seguidamente se lavó 3 veces con PBSTA. La placa se incubó seguidamente durante 1 hora a temperatura ambiente con hCG conjugada a fosfatasa alcalina (diluida en serie en diversas concentraciones de glicerol preparado en PBSTA). La placa se lavó nuevamente y se incubó con solución de sustrato (1 comprimido de fosfatasa 104 de Sigma en 5 ml de dietanolamina 1 M que contenía MgCl_{2} 1 mM a pH 8,5) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Un esquema que muestra las etapas del ensayo se expone en la Figura 3. La densidad óptica del producto se midió a 405 nm (véase la Figura 4).

Ejemplo 3 Unión de anticuerpo a antígeno en volúmenes bajos de agua usando un aplicador de pulverización Preparación de una superficie de antígeno

Se incubaron platos de Petri de 5 cm de diámetro (aproximadamente 20 cm^{2} de área superficial) cada uno con 5 ml de hCG (Sigma) diluidos hasta 1000 mIU/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Los platos de Petri se lavaron seguidamente 3 veces con 5 ml de PBSTA que contenía 10 mg/ml de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación de 3 lavados adicionales con PBSTA, los platos se taparon en seco. Se prepararon platos de Petri testigos siguiendo el mismo procedimiento descrito para la aplicación de hCG pero omitiendo la hCG en las diluciones.

Anticuerpo de unión a una superficie de antígeno usando un aplicador de pulverización

Cada plato de Petri fue pulverizado usando un aplicador de pulverización (disponible en los centros de jardines para pulverizar plantas) con una solución que contenía anticuerpo monoclonal 3468 que reconocía hCG diluida hasta 10 \mug/ml en PBSTA. La pulverización suministró entre 48-65 \mul (media \pm S.D. = 58 \pm 8 \mul) de reactivo según se determinó lavando inmediatamente los platos de Petri antes y después de la aplicación del anticuerpo. La solución de anticuerpo se dejó secar durante una noche a 4ºC y los platos se lavaron seguidamente una vez más con PBSTA. Seguidamente, los platos se incubaron con conjugado de IgG anti-ratón-fosfatasa alcalina (Sigma, dilución 1:1000 en PBSTA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados con PBSTA los platos se incubaron con solución de sustrato (1 comprimido de fosfatasa 104 de Sigma en 5 ml de dietanolamina 1 M que contenía MgCl_{2} 1 mM a pH 8,5). Después de incubar durante 210 minutos, se tomó una parte alícuota de 100 \mul de cada plato y se colocó en una placa ELISA y se determinó la densidad óptica a 410 nm. La Figura 5 muestra la media \pm S.D. (n = 3) de los platos (A) revestidos con antígeno y los platos testigos (B).

Supresión de manchas de unión en seco 1.1. Preparación de látex revestido con anticuerpo

Se usó un método de adsorción pasivo para crear látex revestido con anticuerpo. Se mezclaron 100 \mul de látex Duke Blue o Duke Green Scientific con 900 \mul de tampón de borato (borato 0,01 M, 0,02% de timerosol, pH 8,5). Después de centrifugar 10 minutos a 13.000 rpm, el sedimento se volvió a poner en suspensión en 1 ml de tampón de borato. La solución se centrifugó nuevamente durante 10 minutos a 13.000 rpm y el sedimento se volvió a poner en suspensión en 1 ml de MAb 3299 o MAb 4155 diluido hasta 50 \mug/ml en tampón de borato. Después de incubar 2 horas a temperatura ambiente con agitación en un mezclador de extremo sobre extremo, se añadieron 200 \mul de albúmina de suero bovino (BSA) diluida hasta 10 mg/ml en borato. Después de 30 minutos adicionales de incubación con agitación en un mezclador de extremo sobre extremo, siguió una centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. El sedimento se volvió a poner en suspensión en 1 ml de tampón de borato y seguidamente se centrifugó nuevamente durante 10 minutos a 13.000 rpm. Después de una nueva suspensión final en 1 ml de tampón de borato, el látex revestido con anticuerpo se almacenó a 4ºC.

1.2. Preparación de ropa manchada con látex azul

Se sumergieron muestras de algodón blanco en látex Duke Blue Scientific (10% de sólidos de 400 nm) revestido con gonadotropina coriónica humana (hCG, Sigma Chemical Co.). Después de una incubación de dos horas a 37ºC, las muestras se retiraron y se dejaron secar a 37ºC durante una noche.

1.3. Supresión de manchas en glicerol

Dos muestras de algodón manchado de 2,54 x 2,54 cm se aclararon separadamente en 50 ml de glicerol. Después de 30 minutos de agitación se colocó 1 muestra aclarada en 50 ml de glicerol que contenía 200 \mul de látex Duke Green Scientific (1% de sólidos de 412 nm) revestido con anticuerpo monoclonal específico para hCG (Mab 3299). La segunda muestra se colocó en 50 ml de glicerol que contenía 200 \mul de látex Duke Green Scientific (1% de sólidos de 412 nm) revestido con anticuerpo monoclonal específico para glucurónido esterona 3 (E3G) (Mab 4155). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente con agitación, las muestras se retiraron. El glicerol restante se analizó usando citometría de flujo para detectar y cuantificar la presencia de látex azul (véase la Figura 1). La cantidad total de mancha retirada es la cantidad de látex azul presente en la solución de 50 ml de látex/glicerol/MAb 3299 más la cantidad de látex azul presente en los 50 ml de látex/glicerol/MAb 4155. Para comprar la resistencia de supresión de manchas de cada anticuerpo, se expresan los valores como un porcentaje de la cantidad total de mancha retirada. Los resultados se muestran en la Fig. 6.

Claims (12)

1. Procedimiento para unir un antígeno a una molécula que tiene una elevada afinidad de unión por dicho antígeno, caracterizado porque la unión se lleva a cabo en un medio que tiene un contenido de agua de menos de 25% en peso de la composición total.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el medio tiene un contenido de agua de menos de 15%, preferentemente menos de 10% en peso de la composición total.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el medio tiene un contenido de agua de menos de 5% en peso de la composición total.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo que tiene una elevada afinidad de unión por la tela es una proteína o un péptido.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo que tiene una elevada afinidad de unión es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un derivado de los mismos.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo que tiene una elevada afinidad de unión tiene una constante de equilibrio químico K_{d} para la tela de menos de 10^{-4} M, preferentemente menos de 10^{-6} M.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la constante de equilibrio químico K_{d} es menor que 10^{-7} M.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la tela es algodón, poliéster o poliéster/algodón, o lana o seda.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo que tiene una elevada afinidad de unión es dirigido a una parte específica de la tela.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, usando micropartículas sensibilizadas con anticuerpo y centrifugadas de forma que las micropartículas tengan un contenido del agente ventajoso.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo que tiene una elevada afinidad de unión por la tela es un anticuerpo multiespecífico o anticuerpo o una estructura análoga dispuesta de forma que al menos una especifidad es dirigida a la tela y las demás son dirigidas a uno o más agentes ventajosos.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el reactivo tiene una especifidad dirigida a la tela y una al agente ventajoso.