ES2223463T3

ES2223463T3 - Metodos y kits para secuenciar polipeptidos.

Info

Publication number: ES2223463T3
Application number: ES00906904T
Authority: ES
Inventors: Thomas Woods Keough; Robert Scott Youngquist
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2020-01-12
Also published as: IL144129A; CN1340162A; DE60013093D1; NO20013563D0; JP2002535659A; WO2000043792A2; AU2848700A; DK1145012T3; CN1149398C; AU757356B2; EP1145012A2; NO20013563L; ATE274190T1; CA2359163A1; DE60013093T2; IL144129A0; CA2359163C; EP1145012B1; WO2000043792A3

Abstract

Se refiere a un método para determinar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido caracterizado porque comprende: (a) derivatizar el N¿terminal del polipéptido o los N¿terminales de uno o más péptidos del polipéptido con uno o más restos ácidos que tienen pKas menor que 2 cuando se acoplan con el polipéptido o péptidos, para proporcionar uno a más analitos derivatizados; (b) analizar uno o más analitos derivatizados mediante el uso de una técnica de espectrometría de masas para proporcionar un patrón de fragmentación; y (c) interpretar el patrón de fragmentación.

Description

Métodos y kits para secuenciar polipéptidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y kits que hacen posible la secuenciación de polipéptidos mediante el uso de técnicas de espectrometría de masas. Los métodos y kits son especialmente útiles para identificar polipéptidos de alto peso molecular para uso en, por ejemplo, campos de biología, farmacia, aseo personal, y limpieza de tejidos.

Antecedentes de la invención

Recientemente, se desarrollaron la espectrometría de masas de desorción - ionización por láser asistido por matriz (MALDI) y la ionización por electrospray para aplicaciones de secuenciación de péptidos y polipéptidos de alta sensibilidad. Por ejemplo véase, Spengler et al., "Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laser-desorption Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 6, pp. 105 - 108 (1992); Spengler et al., "Fundamental Aspects of Postsource Decay in Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry". Journal of Physical Chemistry, Vol. 96, pp. 9678 - 9684 (1992); Kaufmann et al., "Mass Spectrometric Sequencing of Linear Peptides by Production Analysis in a Reflectron Time-of-flight Mass Spectrometer Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 7, pp. 902 - 910 (1993); Kaufmann et al., "Sequencing of Peptides in a Time-of-flight Mass Spectrometer: Evaluation of Postsource Decay Following Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)", International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, Vol. 131, pp. 355 - 385 (1994). Kaufmann et al., "Post-source Decay and Delayed Extraction in Matrix-assisted Laser Desorption/lonization Reflectron Time-of-Flight Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 10, pp. 1199 - 1208 (1996); y Spengler, "Post-source Decay Analysis in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biomolecules", Journal of Mass Spectrometry, Vol. 32, pp. 1019 - 1036 (1997); Carr et al., "Integration of Mass Spectrometry in Analytical Biotechnology", Analytical Chemistry, Vol. 63, pp. 2802 - 2824, (1991); Yates III et al., "Mining Genomes With MS", Analytical Chemistry, Vol. 68, pp. 534A - 540A, (1996); Morris et al., "High Sensitivity Collisionally Activated Decomposition Tandem Mass Spectrometry on a Novel Quadrupole/Orthagonal Acceleration Time-of-Flight Mass Spectrometer", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 10, 889 - 896, (1996).

La espectrometría de MALDI ofrece varias ventajas en el campo de la espectrometría de masas. Por ejemplo, la espectrometría de MALDI brinda mayor sensibilidad que el equipo convencional de triple cuadrupolo de electrospray. Cuando se usa en combinación con analizadores de masa de tiempo de vuelo, también se puede aplicar la espectrometría de MALDI a péptidos de masa más alta que pueden ser analizados con equipo de triple cuadrupolo. Por otro lado, la ionización por electrospray, se conecta fácilmente con poderosas técnicas de separación, como la cromatografía líquida (CL) y varias formas de electroforesis capilar (EC). Es posible realizar análisis altamente automatizados cuando se usan la CL y la EC como dispositivos de introducción y purificación de la muestra.

Sin embargo, los métodos actuales de espectrometría de masas de MALDI y, en menor medida, de ionización por electrospray, no ofrecen patrones de fragmentación de espectrometría de masas en tándem predecibles de manera adecuada. Por ejemplo, habitualmente se observan series de iones múltiples (incluyendo iones a, iones b, e iones y), lo cual da como resultado espectros de MALDI de desintegración post-fuente que son demasiado complejos para interpretar y secuenciar eficazmente. Se forman series de iones múltiples (iones b e y), además de fragmentos internos e iones cargados de forma simple y múltiple a partir de iones precursores cargados de forma múltiple generados por ionización por electrospray, y los espectros de masas en tándem que se obtienen como resultado son a menudo difíciles de interpretar de novo. En consecuencia, los problemas con la fragmentación han restringido la capacidad de secuenciar polipéptidos rápidamente usando espectrometría de masas. Como resultado, la espectrometría de masas y en especial la espectrometría de masas de MALDI, tiene valor limitado en esta área.

Varios grupos de investigación han intentado mejorar la utilidad de la espectrometría de masas en el campo de la secuenciación de polipéptidos mediante el uso de técnicas de derivatización química. Dichas técnicas han sido usadas para promover y dirigir la fragmentación en los espectros MSMS de péptidos con el objetivo de aumentar la sensibilidad y disminuir la complejidad de los espectros resultantes. La mayoría de estas técnicas conocidas ofrecen productos derivados catiónicos. Por ejemplo, véase, Kidwell et al., "Sequencing of Peptides by Secondary Ion Mass Spectrometry", Journal of the American Chemical Society, Vol. 106, pp. 2219 - 2220 (1984) (derivatización con análisis de grupo amonio cuaternario, mediante el uso del método de ionización SIMS estático (antes del desarrollo de la espectrometría de MALDI e ionización por electrospray)). La aplicación de dichas técnicas que usan la espectrometría de MALDI e ionización por electrospray con activación colisional de baja energía no han demostrado ser eficaces en general.

Más recientemente, los investigadores han usado otras técnicas de derivatización en un esfuerzo por ampliar la secuenciación péptido / polipéptido mediante el uso de métodos de espectrometría de masas. Por ejemplo, se ha demostrado que la oxidación de residuos de cisteína presentes en péptidos trípticos (péptidos producidos mediante la digestión con tripsina) puede mejorar la fragmentación mediante el uso de espectrometría de masas en tándem de electrospray. Por ejemplo, véase, Gaskell et al., "Role of the Site of Protonation in the Low-Energy Decompositions of Gas-Phase Peptide Ions", Journal of the American Society of Mass Spectrometry, Vol. 7, pp. 522 - 531 (1996) y Gaskell et al., "Influence of Cysteine to Cysteic Acid Oxidation on the Collision-Activated Decomposition of Protonated Peptides: Evidence for Intraionic Interactions", Journal of the American Society of Mass Spectrometry, Vol. 3, pp. 337 - 344 (1992). En particular, se promovió la fragmentación de iones y. Sin embargo, esta técnica presenta varias limitaciones. Por ejemplo, la técnica no fue extendida a los métodos de la espectrometría de MALDI. La técnica también está restringida al análisis de aquellos polipéptidos que contienen residuos de cisteína que se producen en la secuencia a analizar. Efectivamente, rara vez se produce cisteína en polipéptidos de formación natural, lo cual presenta una restricción seria en la utilidad de esta técnica.

En consecuencia, existe una necesidad por proporcionar un método de espectrometría de masas para secuenciación de polipéptidos que sea simple, eficaz, y ampliamente aplicable a polipéptidos de tipo salvaje y variantes. Los inventores de la presente invención brindan un método para la secuenciación de polipéptidos de alta sensibilidad usando técnicas de espectrometría de masas. Los inventores de la presente invención han descubierto que los polipéptidos y péptidos derivatizados de esta manera con grupos ácidos relativamente fuertes proporcionarán fragmentación de iones y de forma casi exclusiva, lo cual da como resultado espectros que son fácilmente interpretados de novo. La presente invención también tiene que ver con kits que se usan para posibilitar de forma conveniente la realización del método de la presente invención.

Resumen de la invención

La presente invención tiene que ver con métodos de espectrometría de masas y kits que son especialmente útiles para la secuenciación de polipéptidos. Los métodos comprenden la determinación de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, en los siguientes pasos:

(a) derivatizar el N-terminal del polipéptido o los N-terminales de uno o más péptidos del polipéptido con uno o más restos ácidos que tienen pKas menor que aproximadamente 2 cuando se acoplan con el polipéptido o péptidos, para proporcionar uno a más analitos derivatizados;

(b) analizar uno o más analitos derivatizados mediante el uso de la técnica de espectrometría de masas para proporcionar un patrón de fragmentación; e

(c) interpretar el patrón de fragmentación.

Los kits de la presente invención comprenden uno o más agentes reactivos de resto ácido que dan restos ácidos que tienen pKas menor que aproximadamente 2 cuando se acoplan con un polipéptido; y medios para derivatizar el N-terminal del polipéptido o los N-terminales de uno o más péptidos del polipéptido con uno o más agentes reactivos de resto ácido. Los kits de la presente invención son especialmente útiles en relación con la realización de los métodos.

Descripción detallada de la invención

Los métodos y kits de la presente invención son útiles para la secuenciación de polipéptidos incluyendo, por ejemplo, los polipéptidos de tipo salvaje, variantes y/o sintéticos. Los métodos y kits son especialmente útiles para identificar polipéptidos de alto peso molecular para uso en, por ejemplo, campos de biología, farmacia, aseo personal, y limpieza de tejidos.

Los métodos y kits de la presente invención tienen una amplia utilidad. Las aplicaciones incluyen, aunque no se restringen a: facilitación de estudios biológicos que requieren una determinación rápida de secuencias de péptidos o polipéptidos; identificación de modificaciones post-traduccionales en proteínas y para la identificación de modificaciones de aminoácidos en proteínas de tipo variante tales como aquellas usadas en, por ejemplo, productos de limpieza y lavado comercial de ropa; ayuda al diseño de detectores de oligonucleótidos para la clonación de genes; rápida caracterización de productos formados en estudios de evolución dirigida; química combinatoria e identificación de biblioteca de péptidos; y proteómica.

El método de la presente invención comprende la adición de uno o más grupos ácidos relativamente fuertes al N-terminal del polipéptido o uno o más péptidos formados por escisión del polipéptido antes del análisis por espectrometría de masas. Sin pretender estar restringidos por la teoría, se cree que los productos derivados cargados de forma negativa que se obtienen facilitan la fragmentación iniciada en el sitio de carga de baja energía. Esto resulta particularmente eficaz en el caso que los C-términales (términos carboxilo) del polipéptido o sus péptidos sean básicos o hidrófobos, preferentemente residuos básicos. Nuevamente, sin estar restringidos por la teoría, se cree que en el caso que un residuo básico sea protonado durante el análisis por espectrometría de masas, el grupo ácido relativamente fuerte será desprotonado, lo cual contraresta la carga positiva en el residuo básico. Un protón adicional para ionizar el producto derivado se encontrará esencialmente "libre" para ionizar aleatoriamente los grupos amida del eje central de los polipéptidos / péptidos ya que el residuo más básico ya se encuentra protonado. Además, sin estar restringidos por la teoría, se cree que en el caso que un segundo grupo ácido relativamente fuerte sea incorporado en los
polipéptidos / péptidos, ambos grupos ácidos serán desprotonados, ofreciendo dos protones esencialmente "libres" para ionización aleatoria de los grupos amida de eje central de los polipéptidos / péptidos.

El uso del método de la presente invención ofrece aumentos importantes en la eficacia de la fragmentación. Además, se observan relaciones de señal a ruido de ión fragmento aumentado para los péptidos derivatizados en relación con los péptidos no derivatizados que tienen las mismas secuencias. La espectrometría de PSD MALDI simple y los espectros de masas en tándem por electrospray que se obtienen como resultado pueden ser interpretados periódicamente de novo.

Todos los porcentajes, relaciones, y proporciones usados en el presente documento son en peso a menos que se especifique lo contrario.

Tal como se usan en el presente documento, se usarán abreviaturas para describir aminoácidos. Dichas abreviaturas se describen en la Tabla I más abajo. Adicionalmente, en la Tabla I se describen los promedios de masas de residuos aminoácidos que resultan útiles para la práctica de la presente invención.

TABLA I

1

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el término "ionización por desorción" se refiere a la transición de un analito de la fase sólida a la fase gaseosa como iones.

Tal como se usa en el presente documento, el término "desorción" se refiere a la partida de un analito de la superficie y / o a la entrada del analito en la fase gaseosa.

Tal como se usa en el presente documento, "ionización" se refiere al proceso de creación o retención en un analito de una carga eléctrica igual a más o menos uno o más unidades de electrón.

Tal como se usa en el presente documento, el término "MALDI" se refiere a desorción - ionización por láser asistido por matriz.

Tal como se usa en el presente documento, el término "matriz" en referencia a "MALDI" se refiere a sustancias químicas pequeñas, acídicas, que absorben luz que pueden estar mezcladas en solución con el polipéptido de interés, o sus péptidos, de interés de manera tal que, con el secado en la etapa de muestra, los analitos incrustados en la matriz cristalina pueden ser desorbidos e ionizados con éxito desde la fase sólida en la fase gaseosa o de vapor que sigue a la irradiación láser. Alternativamente, pueden cargarse soluciones de polipéptidos, o sus péptidos, en las matrices adecuadas, las cuales son secadas previamente en la etapa de muestra. Los ejemplos no restrictivos de matrices adecuadas comprenden ácido nicotínico, ácido sinapínico, ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido a-ciano-4-hidroxicinámico, y ácido a-ciano-4-hidroxicinámico mezclado con nitrocelulosa.

Tal como se usa en el presente documento, el término "ionización por electrospray" se refiere al proceso de producción de iones a partir de solución mediante la pulverización electrostática de la solución de un electrodo capilar a alto voltaje con respectro a un contra electrodo conectado a tierra. La definición pretende incluir tanto la ionización por electrospray como la ionización por electrospray asistida de forma neumática, también llamada ionspray. Tal como se usa en el presente documento, el término "ionización por electrospray" aplica para todos los caudales líquidos y pretende incluir experimentos de microspray y nanospray. Además, la definición pretende aplicar para los análisis de péptidos infundidos directamente en la fuente iónica sin separación, y para el análisis de péptidos o mezclas de péptidos que son separadas antes de la ionización por electrospray. Los métodos de separación en-línea adecuados incluyen, pero no se restringen a, CLAR, CLAR capilar y electroforesis capilar. Los experimentos de ionización por electrospray pueden ser llevados a cabo con una variedad de analizadores de masa, que incluyen, pero no se restringen a, triple cuadrupolos, trampas de iones, analizadores de tiempo de vuelo de aceleración ortogonal e instrumentos de Resonancia Ión-Ciclotrón por Transformada de Fourier.

Tal como se usa en el presente documento, el término "polipéptidos" se refiere a una molécula que tiene dos o más residuos aminoácidos. El método de la presente invención es adecuado para la identificación secuencial de polipéptidos de masa alta.

Tal como se usa en el presente documento, el término "de tipo salvaje" se refiere a un polipéptido producido por organismos que no han sufrido mutaciones.

Tal como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia aminoácida la cual es diferente a la del polipéptido de tipo salvaje.

Métodos de la presente invención

El método de la presente invención es útil para determinar la secuencia aminoácida de un polipéptido. Con el uso de la frase "determinar la secuencia aminoácida", la presente invención no pretende restringirse a determinar la secuencia completa de un polipéptido determinado. Más bien, con esta frase se pretende significar en el presente documento, que se determina una parte, varias partes, y / o la secuencia completa.

Los métodos de la presente invención comprenden la adición de uno o más grupos ácidos relativamente fuertes al N-terminal del polipéptido o uno o más de sus péptidos para producir uno o más analitos derivatizados para el análisis por espectrometría de masas. Los polipéptidos / péptidos son entonces analizados mediante una técnica de espectrometría de masas para proporcionar un patrón de fragmentación. El patrón de fragmentación que se obtiene como resultado es interpretado de tal modo como secuenciación del polipéptido.

Los inventores de la presente invención han descubierto que la acidez del/de los grupo/s de derivatización (resto ácido) tiene un efecto profundo sobre los espectros de masas que se obtienen como resultado. Sorprendentemente, esos restos ácidos que tienen pKa menor que aproximadamente 2 cuando se acoplan con un polipéptido o sus péptidos producirán patrones de fragmentación que son interpretados fácilmente para proporcionar la información de secuencia deseada. El experto con experiencia normal es competente para medir los valores de pKa tal como se describe en la presente memoria usando métodos estándar conocidos en la técnica. Los ejemplos no restrictivos de dichos métodos incluyen, por ejemplo, métodos de valoración y electroquímicos. El método preferido de medición de valores pKa es por medio de valoración.

El método de la presente invención puede ser llevado a cabo de la siguiente manera:

Derivatización de polipéptido y/o péptidos del polipéptido

Una característica importante de la presente invención es la derivatización de un polipéptido o péptidos de un polipéptido de interés con uno o más ácidos relativamente fuertes, es decir, restos ácidos que tengan pKas menor que aproximadamente 2, preferentemente menor que aproximadamente 0, y más preferentemente menor que -2, cuando se acoplan con un polipéptido o péptidos del polipéptido. Con "péptidos de un polipéptido" se quiere significar en el presente documento que el polipéptido es digerido o de algún modo escindido (llamado colectivamente en el presente documento "digestión" o similar) en dos o más péptidos. Los péptidos que se obtienen como resultado son derivatizados de acuerdo con el método de la presente invención. Con "cuando se acoplan" se quiere significar en el presente documento que los pKas de los restos ácidos se definen como medidos después de ser unidos covalentemente con un polipéptido o péptido en el presente documento.

El polipéptido o sus péptidos pueden ser producidos mediante cualquier método. Por ejemplo, si fuera necesario, el polipéptidos de interés es aislado para el análisis. Se pueden usar varios procedimientos para el aislamiento incluyendo, por ejemplo, electroforesis en gel uni-dimensional y bi-dimensional. Como otro ejemplo, los polipéptidos pueden ser sintetizados mediante métodos de química combinatoria bien conocidos en la técnica.

La digestión puede producirse mediante una cantidad de métodos, incluyendo en gel o en una membrana, preferentemente en gel. Por ejemplo, véase, Shevchenko et al., "Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels", Analytical Chemistry, Vol. 68, pp. 850 - 858 (1996). Sin Embargo, es posible digerir al polipéptido ya sea de forma enzimática o química, preferentemente de forma enzimática. Se prefiere principalmente usar un procedimiento de digestión que produzca un residuo básico o hidrófobo, como opción de mayor preferencia básico, en o cerca del -término de los péptidos que se obtienen como resultado. Con "en" se quiere significar en el presente documento que el residuo básico o hidrófobo es el residuo del C-terminal del péptido. Con "cerca" se quiere significar en el presente documento que el residuo básico o hidrófobo está preferentemente dentro de los aproximadamente 40 residuos aminoácidos del C-terminal del péptido, más preferentemente dentro de los aproximadamente 30 residuos, aún más preferentemente aproximadamente 20 residuos, y como la opción de mayor preferencia dentro de los 10 residuos aminoácidos del C-terminal del péptido.

Mientras que se pueden usar muchos métodos para este procedimiento, se prefiere digerir de forma enzimática al polipéptido mediante el uso de, por ejemplo, tripsina, endoproteinasa Lys C, endoproteinasa Arg C, o quimotripsina, preferentemente, tripsina, endoproteinasa Lys C, o endoproteinasa Arg C, y como la opción de mayor preferencia tripsina. Se prefieren la tripsina, endoproteinasa Lys C, y endoproteinasa Arg C porque los péptidos que se obtienen como resultado del polipéptido terminarán generalmente en el C-terminal con un residuo de arginina o lisina (residuos básicos), con la excepción, por supuesto, del C-terminal original del polipéptido. También son adecuadas otras enzimas, especialmente si se producen residuos básicos en o cerca del C-terminal de los péptidos que se obtienen como resultado. También se prefiere la quimotripsina para la digestión, ya que generalmente escinde en residuos aminoácidos hidrófobos. También es útil la digestión química. Por ejemplo, es útil la digestión con bromuro de cianógeno.

El método de la presente invención puede ser adaptado de acuerdo con lo descrito en Patterson et al., Patente U.S. Nº 5.821.063, cedida a PerSeptive Biosystems, Inc., emitida el 13 de Octubre de 1998, especialmente con respectro a las técnicas de digestión en ella descritas. Por ejemplo, se puede usar y derivatizar una pluralidad de muestras que tengan distintas relaciones de agente a polipéptido de acuerdo con la presente invención.

Sin embargo, la digestión no es necesaria en todos los casos, en especial (aunque, ciertamente, no de forma restringida) cuando se secuencian polipéptidos pequeños. Tal como se usa en el presente documento, polipéptidos "pequeños" incluyen aquellos que tienen preferentemente menos que aproximadamente cincuenta residuos aminoácidos, más preferentemente menos que aproximadamente cuarenta residuos, aún más preferentemente menos que aproximadamente treinta residuos, aún más preferentemente menos que aproximadamente veinte residuos, y como la opción de mayor preferencia menos que aproximadamente diez residuos aminoácidos.

Por ejemplo, se pueden caracterizar polipéptidos que son sintetizados mediante métodos bien conocidos, incluyendo el método de química combinatoria (un "polipéptido sintético"). En este caso, se prefiere principalmente sintetizar un polipéptido que tenga residuo básico o hidrófobo, preferentemente básico (como opción de mayor preferencia arginina o lisina), en o cerca del C-terminal del polipéptido que se obtiene como resultado.

El polipéptido (si el polipéptido es lo suficientemente "pequeño" tal como se definió más arriba en el presente documento) o los péptidos del polipéptido son derivatizados con uno o más restos ácidos que tienen pKas menor que aproximadamente 2, preferentemente menor que aproximadamente 0 y como opción de mayor preferencia menor que -2 (cuando se acoplan con el polipéptido o péptidos) para dar un analito derivatizado. Los restos ácidos del analito derivatizado son preparados mediante acoplamiento con un agente reactivo de resto ácido. El agente reactivo de resto ácido no está restringido, siempre que se obtenga como resultado un resto ácido en el polipéptido o sus péptidos que tenga el pKa descrito en el presente documento. Los ejemplos no restrictivos de agentes reactivos de resto ácido que pueden usarse para acoplamiento incluyen, por ejemplo, ditiobis(sulfosuccinimidilopropionato), anhídrido S-acetilomercaptosuccínico, 2-iminotiolano (el cual también puede ser llamado agente reactivo de Traut), anhídrido ditiodiglicólico, anhídrido tetrafluorosuccínico, anhídrido hexafluoroglutárico, anhídrido sulfosuccínico, anhídrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico, cloruro de clorosulfoniloacetilo, y 1,3-propano sultona. El uso de agentes reactivos tales como anhídrido S-acetilomercaptosuccínico, 2-iminotiolano, y anhídrido ditiodiglicólico requiere de oxidación después de la derivatización con el péptido para producir el resto ácido. Los agentes reactivos de resto ácido que no requieren de la etapa de oxidación incluyen, por ejemplo, anhídrido tetrafluorosuccínico, anhídrido hexafluoroglutárico, anhídrido sulfosuccínico, anhídrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico y cloruro de clorosulfoniloacetilo. Estos agentes reactivos son a menudo preferidos debido a síntesis más eficiente y / o falta de complicación de la oxidación de residuos inestables en el polipéptido o sus péptidos. El acoplamiento de un agente reactivo de resto ácido al N-terminal de un péptido que contiene cisteína, seguido por oxidación del grupo sulfhidrilo de la cisteína a un ácido cisteico es un método de producir péptidos que contienen dos restos ácidos (ácidos sulfónicos).

Los restos ácidos son como opción de mayor preferencia un ácido sulfónico. Entre éstos, los restos ácidos más preferidos incluyen resto 2-sulfoacetilo, resto 3-sulfopropionilo, y resto 2-sulfobenzoilo.

También se prefiere el uso de productos derivados del ácido disulfónico. El uso preferido de productos derivados del ácido disulfónico da como resultado ambos grupos de ácidos sulfónicos cerca del N-terminal del péptido. Por ejemplo, el acoplamiento de un agente reactivo de resto ácido al N-terminal de un péptido que contiene cisteína, seguido por oxidación del grupo sulfhidrilo de la cisteína a un ácido cisteico es una forma de producir péptidos que contienen dos restos ácidos (ácidos sulfónicos).

El experto con experiencia normal podrá llevar a cabo los procedimientos de acoplamiento relativamente simples necesarios en la presente invención. Sin embargo, para mayor conveniencia, se ilustran a continuación los ejemplos no restrictivos de derivatización de polipéptidos, o péptidos del polipéptido de interés:

Ejemplo 1

3

Se prepara anhídrido cíclico de ácido 2-Sulfobenzoico (comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) en una concentración de 0,1 M en tetrahidrofurano seco antes de ser usado. Se diluye el polipéptido ASHLGLAR (1 nmol, comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis MO) (SEQ ID Nº: 1) en 20 \muL de trimetilamina 0,05 M. Se añade una solución (2 \muL) de anhídrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico y la mezcla de reacción se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción continúa durante aproximadamente 2 minutos a temperatura ambiente antes de la dilución del analito derivatizado que se obtiene como resultado y el análisis de espectro de masas. La concentración del agente reactivo de resto ácido disminuye en un factor de hasta 100 cuando se derivatizan cantidades más pequeñas.

Ejemplo 2

4

Se mezcla ASHLGLAR (1 nmol, comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis MO) (SEQ ID Nº: 1) con 2 \muL de ácido sulfoacético 0,02 M, el cual es formado mediante la mezcla de 2 \muL de cloruro de clorosulfoniloacetilo limpio (comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) con 500 \muL de agua. La mezcla se seca y luego se reconstituye en 20 \muL de tetrahidrofurano:diisopropiloetilo amina (4:1 v:v). Se añade cloruro de clorosulfoniloacetilo 0,1 M (2 \muL, comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) en tetrahidrofurano seco y la mezcla se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción de derivatización continúa durante aproximadamente dos minutos a temperatura ambiente. El analito derivatizado se seca, reconstituye en 20 \muL de agua y se diluye más antes del análisis de espectro de masas.

El cloruro de clorosulfoniloacetilo es también un agente reactivo útil para la derivatización de asilados de gel 2D, aunque un procedimiento sintético modificado brinda rendimientos de producto más consistentes. En el Ejemplo 14 se discute el procedimiento modificado.

Ejemplo 3

5

Se prepara anhídrido S-acetilomercaptosuccínico (comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) en una concentración de 0,1 M en tetrahidrofurano seco antes de ser usado. Se diluye ASHLGLAR (1 nmol, comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis MO) (SEQ ID Nº: 1) en 20 \muL de trimetilamina 0,05 M. Se añade una solución (5 \muL) de anhídrido S-acetilomercaptosuccínico y la mezcla de reacción se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción continúa durante aproximadamente dos minutos a temperatura ambiente y entonces se oxida con 10 \muL ácido fórmico (88%):H202 (30%) preparado en una relación de 19:1 (v:v). La oxidación continúa durante 16 horas a temperatura ambiente, la muestra se seca antes de la dilución y el análisis de espectro de masas.

La concentración del agente reactivo de resto ácido disminuye en un factor de hasta 100 cuando se derivatizan cantidades más pequeñas.

Ejemplo 4

6

Se añade 2-iminotiolano (agente reactivo de Traut, comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) (3 \muL, 0,1 M en agua des-ionizada) a ASHLGLAR (1 nmol, comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis MO) (SEQ ID Nº: 1) en trimetilamina 0,1 M (20 \muL). La reacción continúa durante 5 minutos a temperatura ambiente. El producto se oxida con 3 \muL de ácido fórmico (88%):H202 (30%) preparado en una relación de 19:1 (v:v). La oxidación continúa durante 5 minutos a temperatura ambiente, y el analito derivatizado se seca antes del análisis de espectro de masas.

Ejemplo 5

7

Se oxida el polipéptido CDPGYIGSR (comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (SEQ ID Nº: 2) mediante la mezcla de 1 a 5 nM de polipéptido (en 5 - 20 \muL de agua) con 10 \muL de ácido fórmico (88%):H202 (30%) preparado en una relación de 19:1 (v:v). La oxidación continúa durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el analito derivatizado se seca antes del análisis de espectro de masas.

Ejemplo 6

8

Se recoge ditiobis(sulfosuccinimidilopropionato) (DTSSP) (comercialmente disponible en Pierce Chemical Co., Crockford, IL) en una solución salina regulada por fosfato a 50 nM / 20 \muL y se ajusta el pH a 7,7 con 1 N NaOH. Se añade la solución (20 \muL) a 1 \muL del péptido HLGLAR (a 1 nM / \muL) (SEQ ID Nº: 3) y se deja reaccionar durante 30 minutos. Se extingue la reacción con tris-hidroximetilo-aminometano (0,1 M, 20 \muL). La muestra se desaliniza y oxida con 10 \muL de ácido fórmico (88%):H202 (30%) preparado en una relación de 19:1 (v:v). La oxidación continúa durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el analito derivatizado se seca antes del análisis de espectro de
masas.

Ejemplo 7

9

Se disuelve ácido ditiodiglicólico (0,93 g 5,1 mmol, comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (alternativamente, se puede usar un polímero del mismo de su anhídrido (cíclico o acíclico)) en diclorometano (20 mL) y se coloca en atmósfera inerte. Se añade dicilohexilocarbodiimida (1,05 g, 5,1 mmol) en una parte. Después de aproximadamente 96 horas, se remueve el precipitado mediante filtración y se concentra el filtrado al vacío. El material que se obtiene como resultado es recogido en dietiléter y filtrado. Una vez más, se concentra el filtrado al vacío para dar anhídrido ditiodiglicólico.

Se prepara anhídrido ditiodiglicólico (se muestra la forma cíclica en este ejemplo) en una concentración de 0,1 M en tetrahidrofurano seco antes de ser usado. Se diluye ASHLGLAR (1 nmol) (SEQ ID Nº: 1) en 20 \muL de trimetilamina 0,05 M. Se añade la solución (5 \muL) de anhídrido ditiodiglicólico y la mezcla de reacción se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción continúa durante aproximadamente dos minutos a temperatura ambiente. El producto que se obtiene como resultado se oxida con 2 \muL de ácido fórmico (88%):H202 (30%) preparado en una relación de 19:1 (v:v). La oxidación continúa durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el analito derivatizado se seca antes del análisis de espectro de masas. La concentración del agente reactivo de resto ácido disminuye en un factor de hasta 100 cuando se derivatizan cantidades más pequeñas.

Ejemplo 8

10

Se prepara anhídrido 3-sulfopropiónico en una concentración de 0,1 M en tetrahidrofurano seco antes de ser usado. Se diluye ASHLGLAR (1 nmol) (SEQ ID Nº: 1) en 20 \muL de tetrahidrofurano:diisopropiletilamina 4:1 (v:v). Se añade la solución (2 \muL) de anhídrido 3-sulfopropiónico y la mezcla de reacción se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción continúa durante aproximadamente dos minutos a temperatura ambiente antes de la dilución y los análisis de espectro de masas. La concentración del agente reactivo de resto ácido disminuye en un factor de hasta 100 cuando se derivatizan cantidades más pequeñas.

Ejemplo 9

11

Se prepara anhídrido tetrafluorosuccínico en una concentración de 0,1 M en tetrahidrofurano seco antes de ser usado. Se diluye ASHLGLAR (1 nmol) (SEQ ID Nº: 1) en 20 \muL de trimetilamina 0,05 M. Se añade una solución (2 \muL) de anhídrido tetrafluorosuccínico y la mezcla de reacción se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción continúa durante aproximadamente dos minutos a temperatura ambiente antes de la dilución y el análisis de espectro de masas. La concentración del agente reactivo de acoplamiento disminuye en un factor de aproximadamente 100 cuando se derivatizan cantidades más pequeñas.

Ejemplo 10

12

Se mezcla el polipéptido CDPGYIGSR (comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis MO) (SEQ ID Nº: 2) con 2 \muL de ácido sulfoacético 0,02 M, el cual es formado mediante la mezcla de 2 \muL de cloruro de clorosulfoniloacetilo limpio (comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) con 500 \muL de agua. La mezcla se seca y se reconstituye en 20 \muL de tetrahidrofurano:diisopropiloetilo amina (4:1 v:v). 0.1 Se añade M cloruro de clorosulfoniloacetilo (2 \muL) en tetrahidrofurano seco y la mezcla se agita por torbellino durante 30 segundos. La reacción de derivatización continúa durante aproximadamente 2 minutos a temperatura ambiente. El analito derivatizado se seca y se reconstituye en 10 \muL de agua. A esa solución se le añaden 10 \muL de ácido fórmico (88%):H202 (30%) preparado en una relación de 19:1 (v:v). La oxidación continúa durante 5 minutos a temperatura ambiente, y produce el péptido derivatizado que tiene dos grupos de ácido sulfónico cerca del N-terminal.

Análisis usando la técnica de espectrometría de masas

Tras la derivatización, se analiza el polipéptido o uno o más péptidos del polipéptido usando una técnica de espectrometría de masas. Mientras que la técnica utilizada no está limitada, las técnicas preferidas son las espectrometría de masas de desintegración post-fuente (PSD) desorción - ionización por láser asistido por matriz (MALDI) e ionización por electrospray en tándem. Por ejemplo, véase, Spengler et al., "Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laser-desorption Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 6, pp. 105 - 108 (1992); Spengler et al., "Fundamental Aspects of Postsource Decay in Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry", Journal of Physical Chemistry, Vol. 96, pp. 9678 - 9684 (1992); Kaufmann et al., "Mass Spectrometric Sequencing of Linear Peptides by Product-ion Analysis in a Reflectron Time-of-flight Mass Spectrometer Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 7, pp. 902 - 910 (1993); Kaufmann et al., "Sequencing of Peptides in a Time-of-fight-Mass Spectrometer: Evaluation of Postsource Decay Following Matrix-assisted Laser Desorption Ionization" (MALDI), International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, Vol. 131, pp. 355 - 385 (1994); Kaufmann et al., "Post-source Decay and Delayed Extraction in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-Reflectron Time-of-Flight Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 10, pp. 1199 - 1208 (1996); y Spengler, "Post-source Decay Analysis in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biomolecules", Journal of Mass Spectrometry, Vol. 32, pp. 1019 - 1036 (1997); Carr et al., "Integration of Mass Spectrometry in Analytical Biotechnology", Analytical Chemistry, Vol. 63, pp. 2802 - 2824, (1991); Yates III et al., "Mining Genomes With MS", Analytical Chemistry, Vol. 68, pp. 534A - 540A, (1996); Morris et al., "High Sensitivity Collisionally Activated Decomposition Tandem Mass Spectrometry on a Novel Quadrupole/Orthagonal Acceleration Time-of-Flight Mass Spectrometer", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 10, 889 - 896, (1996). Como opciones de mayor preferencia, las técnicas usadas son espectrometría de masas de modo de ión positivo de PSD MALDI y de ionización por electrospray en tándem. Para mayor conveniencia, los Ejemplos 11 y 12 más abajo ilustran las técnicas de espectrometría de masas que pueden usarse para analizar el polipéptido o sus péptidos.

Como ha sido sorprendentemente descubierto por los inventores de la presente invención, los péptidos o péptidos del polipéptido derivatizados adecuadamente ofrecen espectros MSMS caracterizados principalmente por iones y. Como bien se conoce en la técnica, los iones y indican fragmentos ionizados que contienen el C-terminal original del polipéptido o péptidos. Tal como se usa en el presente documento, el término "ión y" también incluye iones (y-NH3); a modo ilustrativo, la digestión incompleta de productos que contienen un segundo residuo básico (por ejemplo) producen a menudo abundantes iones (y-NH3). Preferentemente, los espectros producidos por este método están esencialmente libres de iones a e iones b. Los iones a e iones b se forman por escisiones a cada lado de los grupos carbonilo de eje central. Es importante destacar que la carga se retiene con el fragmento del N-terminal con iones a e iones b. Tal como se usa en el presente documento, el término "esencialmente libres de" con referencia a iones a y / o iones b significa que en comparación con la serie dominante de iones y, los iones a y los iones b tienen una abundancia relativa colectiva menor que aproximadamente el 20%, preferentemente menor que aproximadamente el 10%, y como opción de mayor preferencia menor que aproximadamente el 5%.

De acuerdo con the método of la presente invención, no es necesario analizar y / o identificar todos los productos de digestión para identificar a su polipéptido, especialmente si la secuencia del polipéptido se encuentra en una base de datos de secuencias.

Ejemplo 11 Técnica de secuenciación de la espectrometría de PSD MALDI

En este ejemplo, la técnica de espectrometría de masas es llevada a cabo en un Voyager DE-RP o Voyager DE-STR (PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA) (o un equivalente adecuado) equipado con un láser N2 (337 nm, ancho de pulso de 3 nseg , velocidad de repetición de 20Hz). Se adquieren los espectros de masas en el modo reflectrón con extracción demorada. La calibración de masa externa es llevada a cabo con un estándar de péptido de masa baja, y la exactitud de la medición de la masa es generalmente de \pm 0,3 Da. Se diluye el polipéptido or péptidos derivatizados a aproximadamente 10 pM/\muL en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). Entonces se diluyen las muestras cinco a diez veces más en ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (alphaCN) el cual se prepara mediante la disolución de 10 mg en 1 mL de acetonitrilo 50% acuoso que contiene TFA 0,1%. Por ejemplo, véase, Beavis et al., "a-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry", Organic Mass Spectrometry, Vol. 27, pp. 156 - 158 (1992). Se analizan los aislados de gel de las superficies de película delgada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico / nitrocelulosa (alphaCN/NC) preparado mediante el método de evaporación rápida. Por ejemplo, véase, Amott et al., "An Integrated Approach to Proteome Analysis: Identification of Proteins Associated with Cardiac Hypertrophy". Analytical Biochemistry, Vol. 258, pp. 1 - 18 (1998).

Se obtienen los espectros de masas en tándem de la espectrometría de PSD MALDI para el analito derivatizado despues del aislamiento del ión precursor adecuado usando la selección sincronizada de ión. Se pueden analizar los analitos derivatizados usando una cantidad de matrices de la espectrometría de MALDI que incluyen, pero no se restringen a alphaCN, alphaCN/NC y ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB). Se orientan nuevamente los iones fragmento en el detector final mediante el escalonamiento del voltaje aplicado al reflectrón. Las relaciones típicas de voltaje que pueden usarse son las siguientes: 1,0000 (segmento de ión precursor), 0,9126, 0,6049, 0,4125, 0,2738, 0,1975 y 0,1213 (segmentos fragmento). Se combinan los segmentos individuales (o se "cosen" tal como se dice generalmente en la técnica) mediante programas informáticos disponibles comercialmente en PerSeptive Biosystems, Framingham, MA (se selecciona "PSD" en la ventana de análisis). Se obtienen todos los segmentos de iones precursores a una potencia de láser baja (atenuador variable = 1450) para < 256 pulsos de láser para evitar la saturación del detector. Se aumenta la potencia láser (atenuador variable = 1650) para todos los segmentos restantes de las adquisiciones de la espectrometría de PSD MALDI. Habitualmente, se adquieren 256 pulsos de láser para cada segmento de ión fragmento. Se adquieren los datos a una velocidad de digitalización de 20 MHz.

Ejemplo 12 Una técnica de secuenciación de espectrometría de masas en tándem por ionización por electrospray

En este ejemplo, se adquieren los espectros de masas usando un sistema de CL capilar (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) acoplado a un espectrómetro de masas de trampa de ión modelo LCQ (ThermoQuest, San José, CA) equipado con una fuente de microelectrospray (uES) casera. Se usa una columna de CL C18 de 0,5 x 150 mm (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) con un caudal de 5 \mul/min. Las fases móviles de la CL son agua y acetonitrilo, que contienen, cada una, TFA 0,02%. El gradiente habitual es de 15% de acetonitrilo durante 5 min., después 15-60% de acetonitrilo durante 40 min. Se alcanzan caudales de 0,5 \mul/min a la fuente uES y 4,5 \mul/min a un detector UV mediante la colocación de una T divisoria (1/16'', 0,25 mm de diámetro, Valco, Houston, TX) después de la columna de CL. Se inyectan las muestras de polipéptido o péptido derivatizado en la columna de CL con un tomador de muestras automático (ALCOTT, modelo-719, Norcross, GA). La fuente de uES se encuentra en un micrómetro X, Y, Z (New Focus, Inc., Santa Clara, CA) montado en el extremo frontal del instrumento. La aguja de microelectrospray es una aguja "PicoTip" (FS360-50-15-D) de New Objective (Cambridge, MA).

Se obtienen los espectros de masas en tándem por electrospray usando las siguientes condiciones en los instrumentos: voltaje de aguja rociadora de 1,5 kV, temperatura capilar calentada de 200ºC, y energía de colisión de 35 eV. Se usa un intervalo de masa de 300-2000 m/z en cada exploración de MS completa. Se obtienen los espectros de masas en tándem por electrospray usando la exploración que depende de los datos en el modo "juego triple" que consiste en tres micro exploraciones en secuencia: 1) una exploración de MS completa, 2) un acercamiento en iones seleccionados para determinar los estados de carga, y 3) exploraciones de MS/MS en iones adecuados seleccionados a partir de las exploraciones de acercamiento. Se repiten estos tres eventos de exploración durante la serie de CL.

Interpretación del patrón de fragmentación

Se interpreta el patrón de fragmentación producido por el análisis de espectro de masas para secuenciar al polipéptido. El experto con experiencia normal en el campo de la espectrometría de masas podrá interpretar manualmente el patrón de fragmentación de polipéptidos pequeños de novo sin la ayuda de programas informáticos disponibles comercialmente o bases de datos de secuencias. De igual modo, el experto también podrá secuenciar de novo los péptidos de los polipéptidos (productos de la digestión). Alternativamente, el experto puede usar ayudas conocidas para la interpretación que incluyen por ejemplo, programas informáticos disponibles comercialmente o bases de datos de secuencias.

Por ejemplo, se pueden determinar eficazmente y con exactitud las secuencias del polipéptido o sus péptidos con el patrón de fragmentación de ión y que se produce por medio de la presente invención. Se puede lograr la identificación de residuos aminoácidos individuales de novo midiendo la diferencias de masa entre los miembros adyacentes en la serie de ión y. Así, se logra la identificación mediante la comparación de las diferencias de masa medidas con las masas conocidas de residuos de aminoácidos (ver la Tabla I más arriba, en el presente documento). Por ejemplo, a la alanina le corresponde una diferencia de masa medida de 71,1 Da. La dirección de la lectura también se establece directamente a partir del espectro de masas. La dirección es del C-terminal al N-terminal si se mide de la masa baja a la masa alta. La dirección de la lectura es del N-terminal al C-terminal si se mide de la masa alta a la masa baja.

Las secuencias del polipéptido y sus péptidos, también pueden ser determinados eficazmente y con exactitud mediante el uso de programas informáticos que acepten datos de fragmentación de espectros de masas, ya sean masas de series de iones y no interpretadas o etiquetas de secuencia derivadas de las masas de iones y, como entradas para las búsquedas en bases de datos de secuencias. Dichos programas informáticos usados comúnmente por el experto avezado incluyen, pero no se restringen a, "Protein Prospector" (comercialmente disponible en la Universidad de California en San Francisco o http://prospector.ucsf.edu) y "Peptide Search" (comercialmente disponible en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania o http://www.mann.embl-heidelberg.de).

El patrón de fragmentación producido por la presente invención puede ser consultado en comparación con una cantidad de bases de datos de secuencias que incluyen, pero no se restringen a, la base de datos no redundante NCBI
(ncbi.nlm.nih.gov/blast/db.nr.z), SWISPROT (ncbi.nlm.gov/repository/SWISS-PROT/sprot33.dat.z), EMBL (FTP://
ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/peptidesearch/), OWL (ncbi.nlm.nih.gov/repository/owl/FASTA.z), dbEST (ncbi.nlm.nih.
gov/repository/dbEST/dbEST.weekly.fasta.mmddyy.z) y Genebank (ncbi.nlm.nih.gov/genebank/genpept.fsa.z). A menudo se puede recuperar la secuencia completa del polipéptido de interés de la base de datos de secuencias si se buscan los datos de fragmentación producidos por uno o más de los productos derivados del péptido en cuestión formado mediante el uso de los métodos de la presente invención.

Por supuesto, cuando se usa la técnica de búsqueda en base de datos, resulta más eficaz restringir las búquedas especificando que sólo los iones y o iones (y-NH3) son fragmentos permitidos ya que los iones y e (y-NH3) son las especies más prominentes que se observan en el patrón de fragmentación en el cual se utilizan los métodos de la presente invención. Otros tipos de iones fragmento tales como a, b, (b+H2O), (b-H2O), (b-NH3) e iones de escisión interna pueden ser descalificados ya que no son prominentes en los espectros de los péptidos derivatizados que usan el método de la presente invención. Los productos derivados formados con la presente invención ofrecen patrones de fragmentación simples que producen a menudo mayor especificidad en la búsqueda en base de datos que la que se puede obtener a partir de los espectros de los mismos péptidos sin derivatización.

Los métodos de la presente invención son ilustrados más en detalle en los ejemplos no restrictivos de más abajo. En estos ejemplos, el experto con experiencia normal podrá reconocer que las cantidades de las "proteínas candidatas" producidas pueden diferir de aquellas descritas en el presente documento ya que continuamente se añaden proteínas nuevas a las bases de datos.

Ejemplo 13

Se demuestra la espectrometría de masas en tándem de PSD MALDI de polipéptidos de masa alta con FVNQHLC (SO_{3}H) GSHLVEALYLVC (SO_{3}H) GERGFFYTPKA de cadena B de insulina oxidada (SEQ ID Nº: 4) (MMcalc = 3495,9 Da) (comercialmente disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La masa de este polipéptido excede con mucho el límite superior de la mayoría de los instrumentos convencionales de triple cuadrupolo. El espectro de masas en tándem del polipéptido nativo muestra una serie de iones relativamente intensa que consiste esencialmente de iones y. Todos los iones y entre y9 e y24 son observados fácilmente. Los fragmentos específicos a la secuencia que definen el N-terminal de la molécula, y25 a y29, se encuentran ausentes del espectro.

Se mejora el espectro de este polipéptido mediante derivatización usando el agente reactivo de resto ácido, anhídrido cíclico de ácido sulfobenzoico (comercialmente disponible en Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO). El polipéptido derivatizado muestra un incremento significativo de los iones y derivados de la región del N-terminal de la molécula (y25, y26, y27, y28, e y29). Se observa una serie completa de iones y desde y8 a y29 después de la derivatización. No se detectan iones b prominentes.

Ejemplo 14

Un polipéptido separado por electroforesis en gel bidimensional se digiere en gel con tripsina para producir péptidos del polipéptido. Los péptidos muestran varias señales MH+ intensas mediante la espectrometría de MALDI que incluyen iones a m/z 1060,8, 1090,8, 1271,0, 1299,0, 1312,0, 1344,0, 1399,1, 1450,1, 1460,1 y 1794,4. La búsqueda en base de datos mediante el programa informático Protein Prospector en comparación con los registros en la biblioteca de secuencias de proteína NCBI produce una lista de cuarenta y una proteínas candidatas que coinciden con cinco o más de las masas trípticas de entrada (parámetros de búsqueda: intervalo de MW 1.000 a 150.000, punto isoeléctrico de 3,0 a 10,0, Met oxidado permitido como reacción colateral y una tolerancia de masa conservadora de +/- 0,6 Da).

Los péptidos del polipéptido pueden ser derivatizados con uno cualquiera de varios de los agentes reactivos tratados en los ejemplos anteriores. Estos incluyen, pero no se restringen a, anhídrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico, anhídrido 3-sulfopropinoico o cloruro de clorosulfoniloacetilo. En este ejemplo, se usa cloruro de clorosulfoniloacetilo como el agente reactivo de resto ácido. El procedimiento de derivatización para péptidos de bajo nivel aislados de electroforesis en gel 2D es modificado para mejorar la reproducibilidad y producción de productos derivados. Habitualmente, el extracto de péptido del gel 2D se concentra hasta quedar casi seco (5 a 10 \muL) en concentrador de tipo "speed vac". Los concentrados se acidifican con 15 \muL de TFA 0,1% y se limpian usando mini columnas C18 disponibles comercialmente (ZipTip^{TM}, Millipore Corporation, Bedford, MA 01730). Se seca la muestra limpia en un concentrador de tipo "speed vac" y se reconstituye en 10 \muL de base (THF:DIEA 19:1 v/v). En este ejemplo, se añaden 2 \muL de una solución de cloruro de clorosulfoniloacetilo (2 \muL del líquido límpio en 1 mL de THF) y la reacción continúa durante 1 a 2 minutos a temperatura ambiente. Nuevamente se secan las muestras derivatizadas en un concentrador de tipo "speed vac" y se reconstituyen en 10 \muL de TFA 0,1% antes del análisis. En esta etapa, la muestra puede ser mezclada con matriz de MALDI y una parte puede ser cargada en la etapa de muestra para ser analizada, o puede limpiarse nuevamente usando una mini columna C18 disponible comercialmente (ZipTip^{TM}, Millipore Corporation). Entonces, la muestra limpia puede ser eluída directamente a partir del ZipTip en una etapa de muestra de la espectrometría de MALDI en un volumen de 1 - 2 \muL de acetonitrilo: TFA 0,1% (1:1 v/v) que contiene 10 mg/mL de matriz de MALDI. Este último procedimiento permite la carga de todos los productos derivados recuperados en la etapa de muestra de la espectrometría de MALDI para su análisis, mejorando así la sensibilidad global del método. Se lleva a cabo la espectrometría de masas en tándem de PSD MALDI en el péptido derivatizado que pesa aproximadamente 1572 Da. Se obtiene una etiqueta de secuencia que tiene iones y en m/z 574,5, 661,7, 875,9, 1003,8, 1103,9, 1204,6, 1304,1, y el ión (derivado de MH+) en m/z 1451,0. Se consulta el espectro en comparación con la base de datos de secuencia de proteínas, y la búsqueda devuelve seis proteínas candidatas (todas aspartato aminotransferasas mitocondriales) (parámetros de búsqueda: Intervalo de MW 1,000 a 150,000, tolerancia de masa de ión principal de +/- 0.6 Da, tolerancia de masa de ión fragmento de +/- 2.5 Da, Pri(mi)Frag(av), cantidad permitida de iones omitidos = 1). Se obtiene este nivel de especificidad porque la búsqueda en la base de datos se restringe a considerar iones y como los únicos fragmentos permitidos. Esta restricción en la búsqueda es posible porque los iones de escisión interna y el N-terminal no son prominentes en los espectros de masas en tándem de estos productos derivados (debido a la derivatización de acuerdo con la presente invención). Se obtiene una especificidad mucho menor (resultado de 239 proteínas candidatas) cuando se consulta este mismo espectro de masas en tándem en comparación con la biblioteca completa y se permiten todos los tipos de iones fragmento (a, b, (b + H20), (b - NH3), (b - H20), internos e y). Se identificó al péptido como FVTVQTISGTGALR (SEQ ID Nº: 5).

Se busca la confirmación de la identificación de la proteína mediante la espectrometría de PSD MALDI de los productos derivados que pesan aproximadamente 1916 Da. El espectro contiene 7 iones fragmento en m/z 724,6, 1154,2, 1299,3, 1439,0, 1551,9, 1665,5, y 1779,2, además del ión precursor protonado. Se consulta este espectro en comparación con la base de datos suponiendo que los fragmentos son iones y. La búsqueda no devuelve ni asparagina aminotransferasa mitocondrial ni ninguna otra proteína candidata. Si se investiga la base de datos permitiendo tanto iones y como (y-NH3) la búsqueda devuelve 16 proteínas candidatas, 10 de las cuales son asparagina aminotransferasas mitocondriales. Esta última búsqueda confirma la identificación de la proteína. Se requiere de la inclusión de los iones (y-NH3) como posibles fragmentos para esta búsqueda en particular ya que el péptido es un producto tríptico incompleto (ILIRPLYSNPPLNGAR) (SEQ ID Nº: 6) que contiene un segundo residuo de arginina. Tal como se establece más arriba en el presente documento, los productos de digestión incompleta derivatizados muestran a menudo iones fragmento (y-NH3) en los espectros de masas en tándem de PSD.

Ejemplo 15

Se analiza una digestión tríptica en gel de una proteína asilada de electroforesis en gel 2D mediante espectrometría de masas en tándem por electrospray de CL en una trampa de iones de tipo LCQ después de la derivatización de acuerdo con el Ejemplo 14 en el presente documento. Se adquieren todos los espectros sin atención, de un modo automatizado que depende de los datos mediante las micro exploraciones de secuencia de "juego triple". El espectro de masas en tándem de un péptido tríptico derivatizado (MH+ = 971,5) muestra varios iones de producto de tipo y que incluyen, m/z 401,1, 538,3, 651,3, 750,4. Se utilizan los iones y medidos como datos de entrada, junto con la masa MH+ del péptido tríptico no derivatizado (971,5 - 122 = 849,5), para búsquedas en base de datos. Las búsquedas en base de datos mediante el uso del programa informático "Protein Prospector" en comprarción con la biblioteca de secuencia de proteínas NCBI devuelve 3 proteínas candidatas (parámetros de búsqueda: Intervalo total de MW, tolerancia de ión principal de +/- 0,6 Da, tolerancia de ión fragmento de +/- 1,0 Da, iones monoisotópicos fragmento y principal, e iones permitidos no omitidos). Las tres proteínas candidatas devueltas por la búsqueda en base de datos fueron haptoglobinas. Se identificó al péptido como VVLHPER (SEQ ID Nº: 7).

Se busca la confirmación de la identificación de la proteína mediante la búsqueda en la base de datos mediante espectro de masas en tándem producido a partir de un segundo péptidos derivatizado (MH+ del producto derivado = 771,4 Da). El espectro mostró varios iones, incluyendo los iones de tipo y en m/z 322,1, 436,2 y 535,3. Mediante el uso de los mismos parámetros de búsqueda como los descritos más arriba, tres secuencias de péptidos coinciden con los datos de entrada del espectro de masas en tándem por electrospray. Una de las tres secuencias de péptidos corresponde a la de la haptoglobina. Se estableció la identificación de dicho péptido como NVNFR (SEQ ID Nº: 8). Este resultado confirma la identidad de la proteína.

Ejemplo 16

El método de la presente invención es fácilmente utilizado para identificar polipéptidos variantes. El espectro de masas de MALDI de una digestión triptica de una enzima aislada muestra muchas masas trípticas idénticas a aquellas de la proteasa comercial, Savinase® (comercialmente disponible en Novo Nordisk. Copenhagen, Denmark). Uno de los péptidos trípticos que se esperan, GVLVVAASGNSGAGSISYPAR (MH+ = 1933 Da) (SEQ ID NO: 9), se encuentra ausente del espectro, y se observa un ión desconocido en m/z 1963. Esto sugiere que el aislado es una variante de Savinase®. Once cambios distintos de aminoácidos simples pueden ser los responsables del cambio de masa de +30 Da observado (4 G - > S, 4 A - > T, y 3 V - > E). Se obtiene el espectro de masas en tándem de PSD MALDI después de la derivatización tal como se ilustra en el Ejemplo 2 en el presente documento. Se observa una serie completa de iones v para el péptido de 21 aminoácidos. El espectro verifica que la glicina en el residuo 14 sea convertida en serina. En este espectro se miden las masas de todos los iones. El espectro es interpretado automáticamente usando el programa de secuenciación de escala de péptidos que se incluye en el sistema de datos de la espectrometría de MALDI de PerSeptive Biosystems.

Ejemplo 17

Se demuestra el uso de productos derivados del ácido disulfónico, con ambos grupos de ácido sulfónico cerca del N-terminal del péptido, mediante la comparación de los espectros de PSD MALDI producidos a partir de CDPGYIGSR (SEQ ID Nº: 2) derivatizado de acuerdo con el Ejemplo 5 en en presente documento. Se analiza el producto derivado formado por la oxidación con ácido perfórmico del grupo sulfhidrilo del residuo de cisteína (Ejemplo 5) usando la espectrometría de PSD MALDI a partir de una matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico. El espectro de PSD que se obtiene como resultado se encuentra dominado por el ión fragmento y7 que se formó por escisión de la unión inestable de la amida del ácido Asp-Pro. Los iones de tipo y de menor masa muestran una abundancia relativamente baja. Por ejemplo, la abundancia de los iones y3 e y4 en comparación con el ión y7 es de 8% y 5% solamente respectivamente (relación de altura de pico máximo). Sin pretender estar restringidos por la teoría, se cree que el protón de ionización "móvil" se ubica preferentemente en el átomo de nitrógeno de la amida del ácido Asp-Pro básico ya que el nitrógeno de la amida del ácido Pro es más básico que los otros grupos amida del eje central. Se piensa que esta ubicación de la carga produce la fragmentación preferida de la unión amida entre los ácidos Asp y Pro protonado. Este problema se minimiza mediante la adición de un segundo grupo de ácido sulfónico cerca del N-terminal del péptido de acuerdo con el Ejemplo 10. La adición del segundo grupo de ácido sulfónico requiere de la adición de un segundo protón "móvil" para producir el ión cargado de forma positiva que se usa para el análisis de la espectrometría de PSD MALDI. Una vez más, sin pretender estar restringidos por la teoría, se cree que este segundo protón se encuentra libre para ionizar otros grupos amida del eje central ya que el grupo de Pro relativamente básico ya se encuentra ionizado. La protonación de otros grupos amida de eje central conduce a un aumento de la fragmentación de aquellos grupos y a la mejoría de la abundancia relativa de los iones y correspondientes en el espectro de PSD MALDI. En el espectro de PSD del producto derivado formado de acuerdo con el Ejemplo 10, la abundancia de los iones y3 e y4 aumenta a aproximadamente 41% y 57% respectivamente (relación de altura de pico máximo) en comparación con la del ión y7.

Kits de la presente invención

Los kits que pueden ser usados para determinar las secuencias de aminoácidos de un polipéptido son una realización adicional de la presente invención. Los kits comprenden:

(a) uno o más agentes reactivos de resto ácido que den restos ácidos que tengan pKas menor que aproximadamente 2 cuando se acoplan con el polipéptido o uno o más péptidos del polipéptido; y

(b) medios para derivatizar el N-terminal del polipéptido o el N-terminal de uno o más péptidos del polipéptido con uno o más agentes reactivos de resto ácido.

Los kits de la presente invención pueden ser adaptados para una espectrometría de masas de forma similar a la del soporte de muestra descrito en, por ejemplo, La Patente U.S. Nº 5.827.659 de Patterson, cedida a PerSeptive Biosystems, Inc., emitida el 27 de Octubre de 1998.

Opcionalmente, los kits pueden comprender adicionalmente uno o más péptidos de verificación para analizar, por ejemplo, la exactitud de la técnica de espectrometría de masas. También se pueden incluir datos de espectros de masas como referencia.

Más arriba se describen los agentes reactivos de resto ácido que pueden ser incluidos en los kits.

Los medios especialmente preferidos para la derivatización incluyen aquellos que permiten la adecuada derivatización por parte del analizador o cualquier otra persona interesada en obtener el polipéptido o péptidos derivatizados. Un medio especialmente preferido para la derivatización comprende uno o más dispositivos de contención que contiene, por ejemplo, el agente reactivo de resto ácido y en última instancia el polipéptido / péptidos de interés.

Los dispositivos de contención adecuados incluyen, por ejemplo, ampollas, tubos, puntas de pipeta, placas, soportes de muestras, y placas de pocillos múltiples. Se ofrece una conveniencia opcional en el caso en que el agente reactivo de resto ácido se encuentre dentro del dispositivo de contención de modo tal que no sea necesario que el analizador lo añada. Por ejemplo, el agente reactivo de resto ácido puede encontrarse en el interior de una punta de pipeta y ser activado a medida que el polipéptido o péptidos son empujados hacia la punta con una solución reguladora adecuada. El dispositivo de contención es como opción de mayor preferencia, aunque no necesariamente, desechable.

El agente reactivo de resto ácido también puede estar unido al soporte sólido. Por ejemplo, el agente reactivo puede estar unido al soporte dentro de la punta de una pipeta. El polipéptido o péptidos de interés pueden ser recogidos en un sistema de solución reguladora adecuado y arrastrados repetidamente sobre el agente reactivo unido. Después de la reacción, se puede cargar una cantidad adecuada del polipéptido o péptidos derivatizados directamente en la etapa de muestra de la espectrometría de masas de MALDI, o puede ser inyectada en un dispositivo de espectrometría de masas de ionización por electrospray.

También se pueden incluir en los kits de la presente invención uno o más sistemas de solución reguladora que se usan para facilitar la derivatización. El sistema de solución reguladora adecuado para la inclusión depende del agente reactivo de resto ácido incluido. En los ejemplos de derivatización más arriba se describen ejemplos preferidos de sistemas de solución reguladora. Los sistemas de solución reguladora especialmente preferidos incluyen, aunque no se restringen a, soluciones amino terciarias (tanto acuosas como no acuosas (por ejemplo, soluciones en tetrahidrofurano)) y aminas terciarias limpias. Las aminas terciarias especialmente preferidas incluyen la trimetilamina, trietilamina, y diisopropiletilamina.

Los kits de la presente invención también pueden comprender una o más ayudas para la digestión tales como aquellas descritas más arriba en el presente documento. Las ayudas para la digestión pueden ser químicas o enzimáticas. Por ejemplo, como ayudas para la digestión pueden incluirse: tripsina, Lys C endoproteinasa, Arg C endoproteinasa y / o quimotripsina, preferentemente, tripsina, Lys C endoproteinasa y / o Arg C endoproteinasa, y como opción de mayor preferencia tripsina. En el presente documento, también se pueden incluir las ayudas químicas para la digestión, tales como bromuro de cianógeno.

Claims

1. Se refiere a un método para determinar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido caracterizado porque comprende:

(a) derivatizar el N-terminal del polipéptido o los N-terminales de uno o más péptidos del polipéptido con uno o más restos ácidos que tienen pKas menor que 2 cuando se acoplan con el polipéptido o péptidos, para proporcionar uno a más analitos derivatizados;

(b) analizar uno o más analitos derivatizados mediante el uso de una técnica de espectrometría de masas para proporcionar un patrón de fragmentación;

y

(c) interpretar el patrón de fragmentación.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la técnica de espectrometría de masas es espectrometría de masas de PSD MALDI o espectrometría de masas de ionización por electrospray en tándem.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la interpretación del patrón de fragmentación comprende el uso de un programa informático o base de datos disponible comercialmente.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido sintético.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los péptidos del polipéptido son producidos por digestión.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque la digestión es digestión enzimática.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el resto ácido es uno o más ácidos sulfónicos o un derivado del ácido disulfónico.

8. Un kit para usar en la determinación de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido caracterizado porque comprende:

(a) uno o más reactivos de resto ácido que proporcionen uno o más restos ácidos que tengan pKas menor que 2 cuando se acoplan con el polipéptido o uno o más péptidos del polipéptido; y

(b) medios para derivatizar el N-terminal del polipéptido o los N-terminales de uno o más péptidos del polipéptido con uno o más reactivos de resto ácido.

9. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque los medios para derivatizar comprenden uno o más dispositivos de contención.

10. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque comprende adicionalmente una o más ayudas para la digestión.