ES2222782A1 - Metodo para la obtencion de un modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabolica de los seres humanos. - Google Patents
Metodo para la obtencion de un modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabolica de los seres humanos.Info
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Abstract
Método para la obtención de un modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabólica de los seres humanos. El método se basa en el empleo de vectores de expresión que codifican por los mRNA sentido y anti-sentido de las enzimas de las Fases I y II de biotransformación de fármacos que mayor variabilidad presentan en el ser humano para transformar células que expresan actividad reductasa. Dichos vectores pueden modular (aumentar o disminuir) la expresión individualizada de una enzima, sin influir en las demás. Dicho modelo celular singular es capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabólica de los seres humanos. De aplicación en el estudio del desarrollo de nuevos fármacos, en particular, en el estudio del metabolismo, potencial hepatotoxicidad idiosincrásica, interacciones medicamentosas, etc. de nuevos fármacos.
Description
Método para la obtención de un modelo celular
singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia
metabólica de los seres humanos.
La invención se relaciona con la obtención de un
modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la
idiosincrasia metabólica de los seres humanos mediante el empleo de
vectores de expresión que codifican por los mRNA sentido y
anti-sentido de las enzimas de las Fases I y II de
biotransformación de fármacos que mayor variabilidad presentan en
el ser humano.
Como es conocido, el metabolismo de fármacos
constituye la primera causa de la variabilidad en la respuesta
clínica en humanos. Los fármacos, además de ejercer una acción
farmacológica sobre un determinado tejido diana, sufren
modificaciones químicas en su tránsito a través del organismo
(absorción, distribución y excreción). Este proceso se denomina
metabolismo o biotransformación de fármacos, y puede tener lugar en
todos aquellos órganos o tejidos con los que el fármaco llega a
estar en contacto. El proceso está catalizado por un grupo de
enzimas denominadas genéricamente enzimas de metabolización o
biotransformación de fármacos, presentes principalmente en las
fracciones microsomal y/o citosólica de las células, y en menor
medida, en el espacio extracelular y que incluyen diversas
oxigenasas, oxidasas, hidrolasas y enzimas de conjugación
(Garattini 1994). El hígado es, en ese contexto, el órgano que más
peso específico tiene y las monooxigenasas dependientes del
citocromo P450 (CYP450) junto con las
flavín-monooxigenasas, citocromo C reductasa,
UDP-glucoronil transferasa y la glutation
transferasa, las enzimas más directamente implicadas (Watkins
1990). Intestino, pulmones, piel y riñón siguen en importancia en
cuanto a su capacidad de metabolismo de xenobióticos (Krishna 1994).
Estos procesos de biotransformación también pueden llevarse a cabo
por los microorganismos saprofiticos que colonizan el tracto
intestinal.
El fenómeno de la biotransformación es clave en
el contexto de la biodisponibilidad, variabilidad de la respuesta
farmacológica y toxicidad de un fármaco, y comprenderlo es crucial
para un mejor uso y desarrollo de nuevos medicamentos. En efecto,
la biotransformación es la etapa más variable y la que más influye
en los niveles plasmáticos del fármaco tras su administración a
varios individuos. La velocidad con la que un fármaco es
biotransformado y el número y abundancia de los diversos
metabolitos formados (perfil metabólico) puede variar
considerablemente entre individuos, y ello explica que para unos,
una determinada dosis de fármaco sea terapéuticamente eficaz por
generar niveles plasmáticos adecuados, y para otros sea ineficaz
porque una metabolización más rápida no permita alcanzar la
concentración plasmática terapéutica. La situación tiene mayor
trascendencia en aquellos individuos que por carecer de alguno de
las enzimas implicadas en el metabolismo del fármaco, se alcanzan
niveles plasmáticos mucho más elevados de lo esperado tras una dosis
que es bien tolerada por el resto de la población (Meyer 1997).
Es un hecho constatado muchas veces que existe
una significativa variabilidad en el metabolismo de fármacos y
xenobióticos entre los individuos/grupos de población humanos
(Shimada et al 1994). Dos razones contribuyen básicamente a la
existencia de esas diferencias: la inducibilidad de los enzimas de
biotransformación por xenobióticos, y la existencia de
polimorfismos genéticos.
En efecto, una de las características de las
enzimas de biotransformación es el hecho de ser inducibles por
xenobióticos, con lo que la exposición a dichos compuestos se
traduce en una mayor expresión de dichas enzimas. Agentes tales como
fármacos, contaminantes ambientales, aditivos alimentarios, tabaco
o alcohol actúan como inductores enzimáticos (Pelkonen et al 1998).
Una definición "clásica" de inducción implica síntesis de
novo de la enzima como resultado del aumento de la
transcripción del correspondiente gen, en respuesta a un estímulo
apropiado. Sin embargo, en los estudios sobre el metabolismo de
xenobióticos este término se utiliza frecuentemente en un sentido
más amplio para describir un aumento en la cantidad y/o actividad
de la enzima como resultado de la acción de agentes químicos,
independientemente del mecanismo por el que se haya producido (por
ejemplo, aumento de la transcripción, estabilización del mRNA,
aumento de la traducción o estabilización del enzima) (Lin and Lu
1998). El fenómeno de inducción no es exclusivo del CYP y afecta
también a enzimas de conjugación. No obstante, los procesos de
inducción más estudiados han sido aquellos que afectan al CYP y los
inductores se clasifican en función de las isoenzimas del CYP sobre
las que son capaces de actuar (Pelkonen et al 1998, Lin and Lu
1998).
Sin embargo, no todas estas diferencias en la
actividad de biotransformación se pueden atribuir a la acción de
inductores. Se ha podido constatar que factores genéticos,
concretamente polimorfismos genéticos, están también implicados en
esa variabilidad (Smith et al 1998). Isoenzimas del CYP (CYP 1A1/2,
2A6, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1) y enzimas de conjugación
(N-acetiltransferasa y glutation
S-transferasa) se expresan de forma polimórfica
(Blum 1991, Miller et al 1997).
\newpage
El polimorfismo genético del P450, junto con la
variabilidad fenotípica, es la causa más frecuente en las
diferencias interindividuales en la metabolización de fármacos.
Tiene su origen en la existencia de cambios genéticos como
consecuencia de mutaciones, dele iones y/o amplificaciones.
Típicamente se presentan dos tipos de situaciones (Meyer y Zanger
1997): (i) sujetos con genes defectivos (mutado, incompleto,
inexistente, etc.) que como consecuencia de ello metabolizan pero el
fármaco (metabolizadores lentos); y (ii) individuos con genes
funcionales duplicados o amplificados que como consecuencia de ello
tienen una mayor capacidad de metabolización (metabolizadores
ultrarrápidos).
Los polimorfismos mejor estudiados son los de la
debrisoquina/esparteína hidroxilasa (CYP2D6) (Skoda 1988; Kimura et
al. 1989; Heim y Meyer 1992), y el de la
S-mefenitoína hidrosilasa (CYP2C19) (Wrighton et al.
1993; De Morais 1994; Goldstein et al 1994) que afectan a más del
7% y del 5% de la población caucásica respectivamente, y que pueden
dar lugar a alteraciones significativas en la metabolización de más
de 30 fármacos de uso común.
El metabolismo de fármacos por los enzimas
hepáticos hay que entenderlo como un conjunto de reacciones en las
que distintas enzimas compiten por un mismo substrato: el fármaco.
De la afinidad del fármaco por cada enzima (K_{M}), y de las
características cinéticas de la reacción por ella catalizada
(V_{MAX}) dependerá la importancia de esa reacción en el contexto
global de la metabolización del fármaco. Por tanto, pueden darse dos
situaciones extremas: a) que el compuesto sea substrato de varios
enzimas, pero originando básicamente un mismo metabolito, o b) que
varias enzimas estén implicadas en su metabolismo resultando en la
formación de diversos metabolitos.
En el primero de los casos, una expresión
distinta de las enzimas implicadas en el metabolismo de un fármaco
se traduce en diferencias en su velocidad de metabolización y, con
ello, en su farmacocinética. Este fenómeno puede tener como
consecuencia tanto una metabolización deficiente de fármacos, con la
consiguiente acumulación del compuesto en el organismo, niveles
plasmáticos anormalmente elevados, como, en el otro extremo, una
metabolización tan acelerada que impida alcanzar niveles
terapéuticos adecuados y el efecto farmacológico deseado.
En el segundo caso, el perfil metabólico del
fármaco sería claramente distinto, es decir, la cantidad y
proporción relativa de los metabolitos formados sería diferente.
Esto puede traducirse en una menor eficacia farmacológica si el
metabolito, y no el compuesto administrado, es el
farmacológicamente activo, o bien, en la producción en cantidad
anormal de un metabolito más tóxico, responsable de efectos
adversos.
La variabilidad geno-fenotípica
del CYP, además de ser responsable directa de las diferencias
farmacocinéticas (biodisponibilidad, vida media, velocidad y grado
de metabolización, perfil metabólico) e indirectamente de las
farmacodinámicas (ineficacia terapéutica/respuesta exagerada,
efectos no deseados) (Miller et al 1997, Smith et al 1998), está en
la raíz de la toxicidad idiosincrásica (Pain 1995). Con frecuencia,
en el transcurso de su metabolismo, el fármaco puede dar origen a
otro metabolito más tóxico para la célula, o ser convertido en una
especie química más reactiva capaz de interaccionar con otras
biomoléculas (bioactivación). Este tipo de reacciones, minoritario
en gran parte de la población, puede tener un peso específico
considerable en aquellos otros individuos con niveles singulares de
expresión de los distintos CYP (Meyer 1992).
Disponer de sistemas in vitro capaces de
reproducir fielmente el metabolismo in vivo de los fármacos
es uno de los objetivos perseguidos por distintos grupos de
investigación. El grupo de investigación de los inventores ha
desarrollado el cultivo de hepatocitos humanos y su utilización en
estudios de fármaco-toxicología (Bort et al 1996,
Castell et al. 1997, Gómez-Lechón et al 1997). Sin
embargo, en estos modelos solo es posible influir sobre la
expresión de los enzimas de biotransformáción de una manera
limitada. Por ejemplo, mediante el uso de inductores enzimáticos es
posible aumentar los niveles de expresión de los CYPs (Donato et
al. 1995, Guillén et al. 1998, Li 1997). Pero, aun utilizando
inductores específicos tales como metil colantreno, fenobarbital o
rifampicina no es posible modificar de manera selectiva uno de
ellos sin influir sobre los otros.
Otra posible alternativa es la utilización de
líneas celulares manipuladas genéticamente para sobreexpresar uno
de los CYPs humanos (Bort et al. 1999a). Mientras estas líneas son
un instrumento útil para determinar si una enzima particular está
implicada en la formación de un determinado compuesto, no son una
alternativa para averiguar en qué medida diferencias en la
expresión de una de las enzimas de biotransformación influyen en el
perfil metabólico y velocidad de metabolización del fármaco por los
hepatocitos.
El modelo ideal sería aquel que permitiese
modular de manera sencilla la expresión individualizada de una
enzima sin influir en los otros. En el caso de la inducción,
existen distintas estrategias experimentales que podrían ser
aplicables, basadas en la utilización de vectores de expresión con
un promotor activable por un determinado compuesto exógeno de una
forma concentración-dependiente. De esta manera, en
función de la concentración del activador, se produce una mayor o
menor expresión del gen heterólogo clonado "en fase" a
continuación del promotor. Entre los diferentes sistemas empleados
cabe destacar:
\newpage
a) el sistema basado en el operón Tn10a
(Tet-on y Tet-off) (Gossen et
al 1992, 1995; Resnitzky et al 1994) que requiere una doble
transfección estable de las células. Existen dos variantes:
Tet-on y Tet-off. En
el sistema "Tet-on" se transfecta
inicialmente las células con el vector
"pTet-on" (resistencia a G418) que permite
expresar de forma constitutiva la proteína híbrida tTA, proteína que
es incapaz de unirse al promotor TRE-CMV si antes
no se ha unido a la tetraciclina. La segunda transfección estable
se hace con el vector pTRE (resistencia a higromicina) que contiene
un cassette de expresión con el promotor TRE-CMV. El
gen ectópico se clona en este vector. En ausencia de tetraciclina
no hay expresión del gen ectópico. Al añadir tetraciclina, y de una
forma dosis-dependiente, ésta se une a la proteína
tTA, permitiendo su unión al promotor TRE-CMV y en
consecuencia la expresión de la proteína. Por su parte, el sistema
"Tet-off" consiste en una primera
transfección estable con pTet-off (resistencia a
G418), que permite expresar de forma constitutiva la proteína
híbrida tTA. Dicha proteína es capaz de unirse al promotor
TRE-CMV induciendo la expresión de la proteína que
se encuentra "en fase". Cuando se une a tetraciclina, pierde
dicha capacidad. La segunda transfección estable se hace con el
vector pTRE, que contiene un cassette de expresión con el promotor
TRE-CMV, y en donde se clona el gen ectópico. En
ausencia de tetraciclina se consigue una expresión constitutiva y
elevada del gen ectópico. Al añadir tetraciclina, y de una forma
dosis-dependiente, se une a la proteína tTA,
impidiendo su unión al promotor y, en consecuencia, la expresión se
detiene;
b) el sistema GRE-ecdysone (No et
al 1996): este sistema también requiere una doble transfección
estable de las células. En la primera se utiliza el vector pVgRXR
(resistencia a zeocina) que expresa de forma constitutiva la
proteína híbrida VgRXR. Dicha proteína es incapaz de unirse al
promotor regulado por glucocorticoides 5xE/GRE P_{HSP} si antes
no se ha unido a la ecdisona. Mediante una segunda transfección con
pIND (resistencia a G418) se introduce el gen ectópico en un
cassette de expresión con el promotor 5xE/GRE P_{HSP}. En
ausencia de ecdisona no hay expresión del gen ectópico. Al añadir
ecdisona, y de una forma dosis-dependiente, esta se
une a la proteína VgRXR, permitiendo su unión al promotor 5xE/GRE
P_{HSP} y en consecuencia la expresión de la proteína; y
c) sistemas basados en el promotor de la
metalotioneína (Stuart et al. 1984). El promotor de la
metalotioneína presenta capacidad para regular la expresión del gen
situado "en fase" en función de las dosis de Zn^{2+} y otros
metales pesados. En ausencia de Zn^{2+} no hay expresión del gen
ectópico. Al añadir Zn^{2+} aumenta la expresión del gen, de forma
dosis-dependiente.
Los problemas asociados con el uso de estos
vectores de expresión son varios. En primer lugar, no son
estrictamente dosis dependiente y, con frecuencia, se comportan
como "todo-o-nada", o bien no
son totalmente bloqueables. Además en el caso de Tet
on/Tet off y Ecdisona se requieren dos
transfecciones estables, lo cual, dado lo extraordinariamente
refractarios que son los hepatocitos a las transfecciones, hace muy
improbable el que se alcancen resultados con éxito. El resultado de
ello es que, actualmente, se carece de modelos celulares eficaces
capaces de reproducir in vitro la variabilidad humana en el
metabolismo de los fármacos.
Por tanto, un aspecto de esta invención se
relaciona con un método para la obtención de un modelo celular
singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia
metabólica de los seres humanos. Dicho método se basa en el empleo
de vectores de expresión que codifican por los mRNA sentido y
anti-sentido de las enzimas de las Fases I y II de
biotransformación de fármacos. Preferentemente, dichos vectores de
expresión contienen secuencias de DNA ectópicas que codifican por
los mRNA sentido y anti-sentido de las enzimas de
las Fases I y II de biotransformación de fármacos que mayor
variabilidad presentan en el ser humano.
Mediante el método proporcionado por esta
invención es posible modular o modificar (aumentar o disminuir) de
manera simple la expresión individualizada de una enzima sin
influir en las demás enzimas. Un modelo celular singular como el
proporcionado por esta invención puede utilizarse en estudios de
desarrollo de fármacos, en particular, en el estudio del
metabolismo, potencial hepatotoxicidad idiosincrásica,
interacciones medicamentosas, etc. de fármacos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
kit que comprende uno o más vectores de expresión que codifican por
los mRNA sentido y anti-sentido de las enzimas de
las Fases I y II de biotransformación de fármacos. Dicho kit puede
ser utilizado para la puesta en práctica del método para la
obtención de un modelo celular singular capaz de reproducir in
vitro la idiosincrasia metabólica de los seres humanos
proporcionado por esta invención.
La Figura 1 ilustra el bloqueo de la expresión de
HNF4 por RNA "antisentido" y represión del CYP2E1.
La Figura 2 es un diagrama de barras que ilustra
el incremento de mRNA en células HepG2I infectadas con distintos
clones del adenovirus recombinante identificado como
Ad-2E1.
La Figura 3 es una gráfica que ilustra el aumento
de actividad en células HepG2I infectadas con distintas
concentraciones del adenovirus recombinante identificado como
Ad-3A4 e incubadas con testosterona.
En un aspecto, la invención proporciona un método
para obtener un modelo celular singular capaz de reproducir in
vitro la idiosincrasia metabólica de los seres humanos, en el
que dicho modelo comprende un conjunto de vectores de expresión que
confieren a las células transformadas un perfil fenotípico de
enzimas de biotransformación de fármacos diseñado a voluntad, para
reproducir la idiosincrasia metabólica de los seres humanos, que
comprende:
- a)
- la transformación de células que expresan actividad reductasa con un conjunto de vectores de expresión que comprenden secuencias de DNA ectópicas que codifican por las enzimas de biotransformación de fármacos seleccionadas entre las enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I y las enzimas de biotransformación de fármacos de Fase II,
- en donde cada vector de expresión comprende una secuencia de DNA ectópica que codifica por una enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II, diferente, seleccionada entre:
- (i)
- una secuencia de DNA que se transcribe en el mRNA sentido de una enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II ("vector sentido"); y
- (ii)
- una secuencia de DNA que se transcribe en el mRNA anti-sentido de una enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II ("vector anti-sentido");
- en donde la expresión de dichas secuencias de DNA ectópicas en las células transformadas con dichos vectores de expresión confiere a las células transformadas unos perfiles fenotípicos determinados de enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II,
- para obtener, con dichos vectores de expresión, células que expresan de forma transitoria dichas secuencias de DNA ectópicas y presentan un perfil fenotípico de enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II diferente, y
- b)
- construir un modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabólica de los seres humanos a partir de dichas células transformadas con dicho conjunto de vectores de expresión, tanto vectores sentido como vectores anti-sentido, de manera que la resultante sea la expresión de cualquier perfil fenotípico de enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II deseado.
Según el método proporcionado por la invención se
transforman células que expresan actividad reductasa con un
conjunto de vectores de expresión. La existencia de dicha actividad
reductasa, CYP-reductasa, en las células a
transformar es esencial ya que si no la hay, o es insuficiente, se
expresará la proteína CYP contenida en el vector de expresión pero
ésta, aun siendo activa, no podrá funcionar en las reacciones de
oxidación de fármacos.
La actividad NADPH-citocromo P450
reductasa puede medirse fácilmente en las células mediante un
ensayo que comprende, por ejemplo, cultivar las células en placas
de 3,5 cm y utilizarlas cuando alcanzan un 80% de confluencia. Las
células se despegan de las placas con ayuda de una espátula en 1 ml
de tampón fosfato 20 mM (PBS, pH 7,4), se sonican durante
10-20 segundos y el homogeneizado obtenido se
centrifuga a 9000g durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante
(fracción S-9) se utiliza para la valoración de la
actividad enzimática. Para ello se toma una alícuota de 50 \mug de
proteína de la fracción S-9, se incuba en 1 ml de
tampón fosfato potásico 0,1 M (pH 7,2) conteniendo EDTA 0,1 \muM,
cianuro potásico 50 \muM, citocromo c 0,05 \muM y NADPH 0,1
\muM. La velocidad de reducción del citocromo c es determinada en
un espectrofotómetro a 550 nm. La actividad enzimática se calcula
usando el coeficiente de extinción molar de 20 x 10^{3} M x
cm^{-1}, y los resultados se expresan como nmol de citocromo c
reducido por minuto y por mg de proteína celular.
Prácticamente cualquier célula que exprese
actividad reductasa puede ser utilizada para la puesta en práctica
del método de la invención, por ejemplo, una célula humana o
animal, incluyendo células tumorales. Preferentemente, dicha célula
es una célula humana seleccionada entre células de origen hepático,
epitelial, endotelial y gastrointestinal tipo
CaCO-2. En una realización particular, dicha célula
humana es un hepatocito o una célula HepG2I. En otra realización
particular, dicha célula que expresa actividad reductasa es una
célula humana o animal, incluyendo las células tumorales, que,
careciendo de las enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I
o de Fase II, fuera infectada con una combinación de uno o más de
los vectores de expresión de la invención, conteniendo cada uno de
ellos en una concentración determinada para, de este modo, generar
una célula con capacidad metabólica similar a la de, por ejemplo, un
hepatocito, con un fenotipo normal o singular.
Los vectores de expresión utilizados para
transformar dichas células que expresan actividad reductasa, en
adelante, vectores de expresión de la invención, comprenden las
secuencias de DNA ectópicas que codifican por las enzimas de
biotransformación de fármacos seleccionadas entre las enzimas de
biotransformación de fármacos de Fase I y las enzimas de
biotransformación de fármacos de Fase II previamente definidas.
Ejemplos ilustrativos de enzimas de biotransformación de fármacos
de Fase I y de Fase II incluyen diversas oxigenasas, oxidasas,
hidrolasas y enzimas de conjugación, entre las que las
monooxigenasas dependientes de CYP450, las
flavín-monooxigenasas, las
sulfo-transferasas, la citocromo C reductasa, la
UDP-glucoronil transferasa, la epóxido hidrolasa y
la glutation transferasa son enzimas muy implicadas en la
biotransformación de fármacos.
En general, cada vector de expresión de la
invención comprende una secuencia de DNA ectópica que codifica por
una enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II,
diferente, seleccionada entre las secuencias (i) (sentido) y (ii)
(anti-sentido) previamente definidas.
Cualquier secuencia de DNA ectópica que codifica
por una enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase
II puede ser utilizada en la construcción de los vectores de
expresión de la invención. No obstante, en una realización
particular, dicha secuencia de DNA ectópica que codifica por una
enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II se
selecciona del grupo formado por las secuencias de DNA que se
transcriben en el mRNA sentido o en el mRNA antisentido de
isoenzimas de CYP450, tales como, CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6, CYP
2B6, CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C18, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP
3A4, CYP 3A5 o GST(A1), y secuencias de DNA que se
transcriben en el mRNA sentido o en el mRNA antisentido de enzimas
tales como oxigenasas, oxidasas, hidrolasas y enzimas de
conjugación, implicadas en la biotransformación de fármacos, por
ejemplo, secuencias de DNA que se transcriben en el mRNA sentido o
en el mRNA antisentido de flavín-monooxigenasas,
sulfo-transferasas, citocromo C reductasa,
UDP-glucoronil transferasa, epóxido hidrolasa o
glutation transferasa. La expresión de dichas secuencias de DNA
ectópicas en las células transformadas con los vectores de expresión
de la invención confiere a dichas células unos perfiles fenotípicos
determinados de enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I
o de Fase II.
En una realización particular, dicha secuencia de
DNA ectópica que codifica por una enzima de biotransformación de
fármacos de Fase I o de Fase II es una secuencia de DNA que se
transcribe en el mRNA sentido de una enzima de biotransformación de
fármacos de Fase I o de Fase II.
En otra realización particular, dicha secuencia
de DNA ectópica que codifica por una enzima de biotransformación de
fármacos de Fase I o de Fase II es una secuencia de DNA que se
transcribe en el mRNA antisentido de una enzima de biotransformación
de fármacos de Fase I o de Fase II.
La estrategia de regulación de la expresión de
genes mediante tecnología "antisentido" consiste básicamente
en introducir en el interior de una célula una molécula de RNA o un
oligodeoxinucleótido cuya secuencia es complementaria a la de un
mRNA nativo que se desea bloquear. La unión específica y selectiva
de ambas moléculas impide la traducción del mensajero y la síntesis
de la correspondiente proteína (Melton 1985, Stein and Cheng 1993,
Branch 1998). El resultado final es la inactívación dirigida de la
expresión de un gen seleccionado. El éxito de esta estrategia
depende de varios factores técnicamente difíciles de conseguir,
tales como disponer de un sistema eficiente para introducir la
molécula "antisentido" en el interior celular, que dicha
molécula interaccione específicamente con el mRNA diana y no con
otros mRNAs, y que sea resistente a los sistemas de degradación
celular. Los 2 procedimientos actualmente más utilizados comprenden
el empleo de un vector de expresión que incluye un cDNA clonado en
posición inversa (Melton 1995); este vector una vez transfectado al
interior celular expresa un RNA o fragmento de RNA no codificante
(sin sentido) que se asociará por apareamiento específico de bases a
su mRNA complementario nativo, o bien de oligos fosfotiolados que
son oligodeoxinucleótidos modificados para hacerlos resistentes a
la degradación intracelular (Stein and Cheng 1993). Su entrada al
interior celular se resuelve por endocitosis o picnocitosis. La
unión específica al mRNA diana es más dificil de predecir, de modo
que el oligo idóneo para bloquear un mRNA determinado solo puede
determinarse empíricamente [el éxito de esta metodología ha venido
extraordinariamente limitado por la muy baja eficiencia de los
procedimientos habituales de transfección (10%)].
En una realización particular del método
proporcionado por la presente invención, se han construido unos
adenovirus recombinantes que pueden ser utilizados como portadores
de un cDNA clonado con orientación invertida como fuente de mRNA
antisentido dentro de la célula. Dado que la eficiencia de
transfección muy elevada, en tomo al 100%, la molécula
"antisentido" se expresa de manera muy eficaz en la casi
totalidad de las células diana. La simplicidad del proceso de
infección en hepatocitos, que por otra parte son muy refractarios a
las técnicas de transfección clásicas, hace de este modelo un
modelo de elección. La viabilidad de la estrategia propuesta viene
avalada por recientes resultados obtenidos por los inventores en los
han desarrollado un adenovirus que codifica la expresión del mRNA
anti-sentido del factor de transcripción hepático
HNF4. La transfección de hepatocitos humanos con ese adenovirus
anti-sentido se traduce en la total desaparición del
factor de transcripción HNF4 a las 72 horas, según se demuestra por
el análisis por "western-blot". La proteína con
mayor homología al HNF4 es otro factor de transcripción de la misma
familia denominado RXR. Esta proteína no sufre cambios, demostrando
de ese modo que el bloqueo por "anti-sentido"
resulta totalmente específico. La inactivación dirigida de ese
factor de transcripción resultó en la pérdida de expresión de
ciertos CYPs, en concreto el CYP2E1.
Prácticamente cualquier sistema de transferencia
de DNA exógeno a una célula puede ser utilizado en la construcción
de los vectores de expresión de la invención. En una realización
particular, el vector de expresión de la invención se selecciona
entre un vector viral, un liposoma o un vehículo micelar, tal como
un liposoma o vehículo micelar útil para terapia génica. En
general, cualquier virus o vector viral capaz de infectar a las
células utilizadas para la puesta en práctica del método
proporcionado por esta invención puede ser utilizado para la
construcción del vector de expresión de la invención.
Ventajosamente, se elegirán vectores de expresión capaces de
expresar transgenes, de manera altamente eficiente y rápida en las
células transformadas. En una realización particular, dicho virus
es un adenovirus, natural o recombinante, o una variante del mismo,
tal como un adenovirus del subgrupo C, tipo 5.
El adenovirus es un virus no oncogénico del
género Mastadenoviridae, cuya información genética está
constituida por una doble cadena lineal de DNA de 36 kilobases (kb)
dividida en 100 mu (unidades de mapa; 1 mu=360 pb). Información
sobre su ciclo replicativo ha sido proporcionada por Greber 1993,
Ginsberg 1984 y Grand 1987.
Los adenovirus infectan con notable facilidad
muchos tipos celulares, incluidos los hepatocitos, por lo que
constituyen una herramienta útil para la transfección de genes
exógenos a células de mamífero. En particular, el adenovirus es un
excelente vector de expresión que cuenta con la ventaja adicional
de poseer una eficiencia muy alta para la transfección de
hepatocitos (igual o superior al 95%). Además, el grado de
expresión es proporcional a la carga viral infectiva y, finalmente,
la expresión del transgén no influye en la expresión de los otros
genes hepáticos (Castell et al. 1998).
La introducción de genes ectópicos en el DNA de
un adenovirus viene limitado por dos hechos: (i) el virus no puede
encapsular más de 38 kb (Jones 1978 y Ghosh Choudhury 1987) y (ii)
su gran tamaño dificulta la clonación por ser poco frecuentes los
puntos de restricción únicos. Para solventar dichos problemas se han
desarrollado diversas estrategias, siendo la más utilizada la
desarrollada por McGrory et al. 1988 o recombinación homóloga.
Brevemente, el procedimiento consiste, en esencia, en el empleo de
dos plásmidos, pJM17 y pACCMV, que contienen un fragmento homólogo
de la secuencia incompleta del adenovirus. En virtud de esta
homología se produce la recombinación de ambos plásmidos dando
origen a un virus defectivo (no replicativo) en cuyo genoma se
encuentra el gen que se desea expresar. El pJM17, desarrollado por
McGrory et al. 1988, es un plásmido de gran tamaño (40,3 kb) que
contiene el genoma circularizado completo del adenovirus tipo 5
d1309 (Jones 1978) en cuyo sitio Xbal en 3,7 mu se ha insertado el
plásmido pBRX (ori, amp_{r} y tet_{r}). Aunque el pJM17
contiene toda la información necesaria para generar virus
infectivos, su tamaño excede el límite de encapsulamiento por lo
que no puede generar nuevos viriones. Para que el adenovirus
generado tras la recombinación pueda multiplicarse, la
co-transfección se lleva a cabo en la línea celular
embrionaria humana de origen renal 293 (ATCC CRL 1573) que expresa
la región E1A del adenovirus tipo 5 (Graham 1977). De esta forma,
el aporte de la proteína E1A, factor de transcripción que actúa en
trans, por parte de la célula huésped, permite la
multiplicación del virus recombinante en su interior. Hay que
destacar que para su replicación en la línea 293, el virus
recombinante necesita además ciertas subregiones de E1 en
cis. Estas son la subregión comprendida entre 0 y 1,3 mu y
la comprendida entre 9,7 mu y el final de E1. Entre 0 y 0,28 mu se
encuentra el ITR (internal terminal repeats) con el origen
de replicación, entre 0,54 y 0,83 las señales de empaquetamiento
(Hearing 1987) y por último, a partir de 9,7 mu, un segmento que
rodea el gen de la proteína IX. De ahí que estas regiones se
mantengan en el pACCMV, en el que se han eliminado solamente 3 kb
de la región E1 para dar cabida al módulo de expresión, sin impedir
la normal replicación del virus en 293.
En el Ejemplo 1 se describe la obtención de
adenovirus recombinantes que contienen secuencias de DNA ectópicas
que se transcriben en el mRNA sentido o en el mRNA antisentido de
isoenzimas de CYP450, tales como, CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6, CYP
2B6, CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C18, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP
3A4, CYP 3A5 o GST(A1). Estos adenovirus recombinantes pueden
utilizarse para transformar (infectar o transfectar) células que
expresan actividad reductasa, por ejemplo, células de origen
hepático tales como HepG2I.
Una característica del método proporcionado por
esta invención radica en la versatilidad del mismo para generar
modelos celulares singulares con unos fenotipos determinados sin
más que variando la concentración de uso de los vectores de
expresión de la invención utilizados para transformar dichas
células. De hecho, pueden obtenerse modelos que permitan comparar
el metabolismo de un fármaco en un hígado que tenga 10 3A4 y 1 2D6
respecto a otro que tenga 1 3A4 y 10 2D6, por ejemplo, sin más que
variar los tipos y cantidades de vectores de expresión de la
invención a utilizar para transformar las células. Ensayos
realizados por los inventores han puesto de manifiesto que la
respuesta de dicho modelo es virtualmente lineal, es decir, a más
cantidad de vector de expresión de la invención, más actividad
expresada, hasta un determinado límite (cuando aparecen efectos
citopáticos en las células). Diversos ensayos han puesto de
manifiesto que, dependiendo del vector de expresión de la invención
utilizado, hasta alrededor de 300 UFC (unidades formadoras de
colonia) no hay alteraciones significativas en ninguna otra de las
funciones de las células (hepatocitos humanos) transformadas con
dichos vectores.
La transformación de las células con el vector de
expresión de la invención puede realizarse por cualquier método
convencional de transferencia de DNA exógeno a una célula, por
ejemplo, por infección o transfección, dependiendo, entre otras
razones, del vector de expresión de la invención utilizado. En una
realización particular, los vectores de expresión de la invención
utilizados son adenovirus recombinantes y las células pueden
transformarse por infección, para lo cual las células deben estar al
70% de confluencia. Brevemente, se aspira el medio de cultivo que
mantiene las células y éstas se lavan con medio base o buffer
salino; se harán dos lavados de 2 ó 3 ml cada uno. La cantidad de
virus a utilizar es variable. Dependerá de la cantidad de actividad
que se desee que expresen las células y de la susceptibilidad de las
mismas. Se realiza la dilución del adenovirus en el medio de
cultivo hasta que la concentración alcanza el rango de 1 a 50 MOI
(multiplicidad de infección). El volumen de medio utilizado para el
mantenimiento de las células depende del tamaño de la placa, el
volumen final de infección se reducirá ¼ del volumen habitual. El
tiempo de incubación está entre 1 hora y 30 minutos, y 2 horas a
37ºC. La actividad del transgén en las células infectadas se puede
detectar a partir de las 24 h, siendo en un máximo de 48 horas,
dependiendo de la célula utilizada. La cantidad máxima de virus
totales que una célula determinada admite es limitada. Para conocer
este dato se añaden cantidades de virus crecientes hasta que se
observen efectos citotóxicos aparentes (morfología, función
celular). De esa manera se ha podido establecer el número máximo de
partículas virales que una determinada célula tolera.
Los vectores de expresión de la invención pueden
ser utilizados para transformar de forma transitoria dichas células
que expresen actividad reductasa. Dicha transformación transitoria
sería diseñada a priori para obtener el balance de expresión
de enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I y II deseado,
con el fin de imitar la variabilidad individual (idiosincrasia
metabólica) particularmente acentuada en el sistema CYP de los
seres humanos. El uso combinado de cantidades variables de vectores
de expresión de la invención diferentes (por ejemplo, unos podrían
expresar unos enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I o
II y otros que expresen sus mRNA anti-sentido)
permite la modulación necesaria, y se establece a priori,
teniendo como límite la carga viral que cada sistema celular
tolera.
La invención constituye, por tanto, la primera
aproximación basada en el empleo de vectores de expresión, tanto
sentido como anti-sentido, de manera controlada,
para modular (aumentar o disminuir) cada uno de los enzimas de
biotransformación de fármacos de Fase I y II en células que
expresen actividad reductasa transformadas con dichos vectores,
para que dichas células reproduzcan a voluntad un determinado
fenotipo y conseguir un modelo in vitro de cualquier perfil
fenotípico humano imaginable, de forma sencilla, sin más que añadir
una cantidad controlada de vector de expresión a dichas
células.
Una buena parte de los problemas que se plantean
durante el uso de los medicamentos (efectos indeseados inesperados,
falta o exceso de actividad terapéutica para una misma dosis del
compuesto, etc.) son debidos en gran medida al hecho de que los
seres humanos no metabolizan los fármacos de la misma manera. Así,
una misma dosis puede alcanzar niveles plasmáticos diferentes en
distintos individuos, y/o metabolizarse dando origen a un perfil de
metabolitos diferente en los distintos seres humanos. Con
frecuencia surgen situaciones en las que debido a la mayor o menor
presencia de un determinado enzima de biotransformación, los
metabolitos hepáticos producidos (o la proporción relativa de
ellos) puede ser notablemente diferente. En ocasiones, niveles
bajos de enzimas cuya acción se traduce en producir
metabolito(s) poco tóxico(s), está poco expresada en
un determinado individuo, por lo que el metabolismo del fármaco en
él sigue vías alternativas que sí pueden dar origen a metabolitos
mucho más tóxicos y que son minoritarias en el resto de los
individuos. En otros casos puede ser la existencia anormalmente
elevada de una determinada enzima, minoritaria en los demás
individuos, que conlleva la producción de un metabolito más tóxico.
Estas diferencias (idiosincrasia metabólica) son un factor de riesgo
sobreañadido a la dificil aventura de conseguir que una nueva
molécula llegue a término como nuevo medicamento. La razón es
simple: compuestos que no han demostrado efectos adversos en los
primeros ensayos clínicos, al extender su uso a una mayor población,
y con ello dar posible entrada a individuos con singularidades
metabólicas, pueden aparecer fenómenos de toxicidad idiosincrásica
capaces de llevar al fracaso económico dicho desarrollo.
La presente invención permite manipular a
voluntad los niveles de los distintos enzimas de biotransformación
de fármacos de una célula humana, tal como ocurre en los seres
humanos, para estudiar en ella si dicha singularidad pudiera tener o
no relevancia de cara a un uso clínico generalizado de dicho nuevo
compuesto.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de vectores de expresión (sentido o
anti-sentido) de enzimas de biotransformación de
fármacos de Fase I o II en la manipulación de células, por ejemplo,
humanas y animales, incluyendo células tumorales, para reproducir
en ellas la variabilidad metabólica que se da en los seres humanos.
Dichos vectores permiten modificar a total voluntad la expresión de
una enzima determinada sin afectar las otras. De esta manera es
posible manipular células haciendo que expresen la cantidad de cada
una de las enzimas que se deseen (puesto que los vectores virales
pueden utilizarse solos o en combinación) y así simular la
variabilidad que se da en los seres humanos. Mediante la presente
invención es posible estudiar y anticipar la trascendencia que
podría tener para un ser humano diferentes niveles de expresión de
enzimas de biotransformación de fármacos al administrar un nuevo
fármaco, todo ello antes de su uso en seres humanos, constituyéndose
de este modo en una modelo experimental, celular, singular, que
permita simular, o reproducir in vitro, la variabilidad que
existe en el ser humano. Asimismo, la invención permite predecir
las consecuencias que la distinta expresión de los enzimas de
biotransformación de fármacos pudiera tener sobre el metabolismo,
farmacocinética y potencial hepatotoxicidad de un fármaco en
desarrollo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
kit que comprende uno o más vectores de expresión que codifican por
los mRNA sentido y anti-sentido de las enzimas de
las Fases I y II de biotransformación de fármacos. Dicho kit puede
ser utilizado para la puesta en práctica del método para la
obtención de un modelo celular singular capaz de reproducir in
vitro la idiosincrasia metabólica de los seres humanos
proporcionado por esta invención.
La estrategia utilizada para la clonación de los
enzimas de biotransformación CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6, CYP 2B6,
CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C18, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP 3A4,
CYP 3A5 o GST(A1) humanos fue la de llevar a cabo una
RT-PCR de alta fidelidad sobre una librería de cDNAs
hepáticos humanos utilizando para ello unos oligonucleótidos
cebadores que flanquean las secuencias codificadoras de dichos
enzimas.
La mezcla de reacción de la transcriptasa reversa
(RT) consistió en 20 \mul de 1x tampón de transcriptasa reversa,
DTT 10mM, dNTPs 500 \muM, 3 \muM cebador oligo d(T), 14,
60 U de Rnase OUT y 250 U de Rtase H. A esta mezcla se añadió 1
\mug de RNA total. La reacción se llevó a cabo durante 60 minutos
a 42ºC, seguidos de un calentamiento de 5 minutos a 95ºC y un
rápido enfriamiento en hielo. El cDNA se almacenó a -20ºC hasta su
uso.
Para cada CYP se diseñaron dos pares de
oligonucleótidos cebadores que flanquean su secuencia codificante.
Cada cebador contiene una secuencia adicional en el extremo 5'
correspondiente a un sitio de restricción de una enzima determinada,
lugares por donde serán clonados en el vector pACCMV [véase la
Tabla 1].
\newpage
Con el cDNA recién sintetizado se realiza un PCR
convencional. La reacción de PCR se realizó en un termociclador con
la siguiente mezcla de reacción: 3 \mul de cDNA (1/10 RT), 3
\mu de buffer (10x), 50 \muM de dNTPs, 1 U total de High
Fidelity (Roche), 6 \muM de oligonucleótidos cebadores y agua
hasta un volumen final de 30 \mu. El programa empleado en el
termociclador consistió en:
A) Desnaturalización inicial: 3 minutos a
95ºC
B) 4 ciclos de:
- a.- desnaturalización de ciclos: 40 s a 95ºC
- b.- anillamiento: 45 s a 58ºC (varía según los cebadores)
- c.- elongación final: 5 minutos a 74ºC
C) 30 ciclos (más específicos) de:
- a.- desnaturalización de ciclos: 40 s a 95ºC
- b.- anillamiento: 45 s a 62ºC (varía según los cebadores)
- c.- seguido de una elongación final de 5 minutos a 74ºC.
El producto amplificado por PCR se purificó por
cromatografia en columna (High pure PCR product purification kit) y
se eluyó con tampón TE. Posteriormente los productos de PCR se
analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se
visualizaron con bromuro de etidio para confirmar los tamaños de los
cDNAs amplificados.
Previo a la clonación se incubó el DNA con
enzimas de restricción en el tampón recomendado por el fabricante.
Una mezcla estándar de incubación debe contener: 2 unidades de
enzima/\mug de ADN, tampón 10x y agua destilada. Ocasionalmente,
en algunos enzimas, se requieren 100 \mug/ml de BSA o se incuban
a 25ºC.
La subclonación de fragmentos de cDNA (inserto)
en un vector pACCMV (vector), se realizó mediante ligación de
extremos cohesivos usando el mismo enzima de restricción. Con esta
estrategia se obtienen clones con orientación sentido y
antisentido. Incluye, además de la ligación en sí misma, pasos
previos de desfosforilación de los extremos del vector, para evitar
así su recircularización, para lo cual, se añadió al tubo anterior
2 \mul de CIP (20-30 U/\mul; Gibco BRL cat nº
18009019) y se incubó durante 20 minutos a 37ºC. A continuación, se
añadieron 2 \mul más de CIP y se inclubó durante 20 minutos a
56ºC. Para inactivar la enzima y detener la reacción se incubó
durante 10 minutos a 75ºC.
Antes de la ligación se debe repurificar tanto el
vector como el inserto para eliminar los restos de nucleótidos,
enzimas y tampones que podrían dificultar la ligación. Para ello se
emplea el kit Geneaclean (Bio 101 cat nº 1001-200)
para purificar bandas de un gel de TAE-agarosa (1%
agarosa en Tris-acetato 40 mM y EDTA 2 mM).
Una vez purificadas ambas bandas, se preparó la
siguiente mezcla de reacción para la ligación:
| 2,0 | \mul de vector (0,75 \mug/\mul) |
| 4,0 | \mul de inserto (1 \mug/\mul) |
| 1,0 | \mul de T4 Ligasa (1U/\mul) (Gibco BRL cat nº 15224-017) |
| 1,5 | \mul de tampón 10x |
| 6,5 | \mul de agua |
| \overline{15,0} | \mul totales |
Paralelamente se preparó una mezcla control sin
inserto. Tras 2 horas a temperatura ambiente se transformaron
bacterias competentes con las mezclas de ligación.
La ligación de extremos cohesivos se llevó a cabo
mediante la siguiente mezcla de reacción:
\newpage
| 1,0 | \mul de vector (0,5 \mug/\mul) |
| 4,0 | \mul de inserto (1 \mug/\mul) |
| 1,0 | \mul de T4 Ligasa (1U/\mul) (Gibco BRL cat nº 15224-017) |
| 1,5 | \mul de tampón 10x |
| 10,0 | \mul de agua |
Paralelamente se preparó una mezcla control sin
inserto. Tras 2 horas a temperatura ambiente se transformaron
bacterias competentes con las mezclas de ligación.
Se utilizaron bacterias previamente tratadas con
soluciones frías de CaCl_{2}, y sometidas durante un tiempo muy
corto a 42ºC para hacerlas competentes y receptivas al DNA del
plásmido. Para ello, se añadió 0,1-1 \mug de cDNA
(ligación) a 100 \mul de bacterias competentes, se dejó la mezcla
en hielo durante 30 minutos y se incubó en 1 ml de medio S.O.C.
(Gibco BRL cat nº 15544-0189). A continuación, 100
\mul se transfirieron a una placa de medio LB-agar
con ampicilina (100 \mug/ml) y se dejó toda la noche a 37ºC.
Seguidamente se dejaron crecer las bacterias, a
partir de las cuales se amplificó y purificó el DNA plasmídico
mediante el procedimiento que se describe a continuación. Una
colonia aislada de bacterias transformadas se crece en
2-5 ml de medio LB con ampicilina. A continuación,
se centrifuga a 8000 rpm durante 1 minuto y el precipitado se
resuspende en tampón de lisis (glucosa 50 mM,
Tris-HCl 25 mM pH 8,0, EDTA y 4 mg/ml de lisozima).
La suspensión se deja durante 5 minutos en hielo y se centrifuga a
10000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se transfiere a un tubo
limpio, se añaden 500 \mul de isopropanol y se centrifuga a 15000
rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retira y el residuo se
lava con etanol 70% (v/v), se seca y se resuspende en un volumen
apropiado de TE pH 7,5 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Una vez verificado
con los enzimas de restricción la colonia adecuada, se transfiere el
resto del cultivo a un frasco con 250 ml y se crece toda la noche
para amplificar el plásmido.
Para la purificación de DNA plasmídico del
cultivo de bacterias (entre 250 y 500 ml) se emplearon kits
convencionales.
La co-transfección de los
plásmidos se lleva a cabo en la línea celular 293, donde el virus
recombinante generado por recombinación homóloga es capaz de
multiplicarse.
La co-transfección de los
plásmidos se realizó por el método del fosfato cálcico, utilizando
diversas proporciones. Para ello, se siembran varias placas de 6 cm
de diámetro a 50-60% de confluencia. Al día
siguiente se preparan tubos conteniendo los diferentes plásmidos y/o
carrier así como los controles y se añade el contenido de cada tubo
gota a gota sobre 500 \mul de HBS 2X (Hepes 50 mM, NaCl 140 mM,
KCl 5 mM, glucosa 10 mM y Na_{2}HPO_{4} 1,4 mM ajustando a pH
7,15) y se deja 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación,
se vierte suavemente sobre la monocapa celular evitando que se
desprenda, se deja 15 minutos a temperatura ambiente, se añaden 4 ml
de medio con suero, se incuba en estufa a 37ºC durante
4-6 horas, se retira el medio de las placas, se
añade 1 ml de medio sin suero ni antibióticos con un 15% de
glicerol, se esperan 90 segundos y se añaden 5 ml de PBS.
Seguidamente se lava dos veces con PBS para retirar por completo el
glicerol, se añaden 5 ml de medio y se guarda en estufa cambiando
el medio cada 3-4 días hasta que se observe la lisis
celular.
Una vez que tiene lugar el proceso de
recombinación, el virus se multiplica en las células 293, llegando
a producir en dichas células la lisis (entre 2 y 6 días).
Seguidamente se procede a efectuar la clonación del virus, para lo
cual, en placas cubiertas de agar semisólido, se preparan
diluciones seriadas 1/10-1/100 del virus a clonar
en DMEM, se añaden 0,5 ml de cada dilución a una placa de 6 cm de
diámetro de células 293 y se incuban las células en estufa a 37ºC
durante 1 hora, moviéndolas cada 15 minutos. A continuación, se
retira el medio y se cubre la monocapa con 6 ml de una mezcla de
agar 1,3% MEM 2x (1:1 v/v) previamente calentado a 45ºC y se incuba
en estufa a 37ºC. Al cabo de 7-9 días aparecen
visibles las calvas o zonas donde la monocapa de células 293 está
alterada. Se seleccionan dichas calvas y se amplifican en nuevas
placas de células 293.
Se preparó de un stock de virus puro por
centrifugación en gradiente de CsCl (método A) y, alternativamente,
usando polietilenglicol (método B), un método más sencillo que
rinde resultados similares.
Cuando las células 293 lisan, se retira el
sobrenadante y se recogen en PBS conteniendo MgCl_{2} 1 mM, y
0,1% de Nonidet p40.
\newpage
En este caso, las células ya han lisado y, por
tanto, no es posible retirar el medio. Se añade Nonidet p40 hasta
que quede al 0,1%. Posteriormente, se agita durante 10 minutos a
temperatura ambiente y se centrifuga a 20000g durante 10 minutos. El
sobrenadante se pasa a un tubo limpio y se añaden 0,5V de 20%
PEG-8000/NaCl 2,5M, y se incuba en agitación
durante 1 hora a 4ºC. A continuación, se centrifuga a 12000g
durante 10 minutos y se resuspende el precipitado en 1/100 a 1/50
del volumen de medio inicial en el siguiente tampón: NaCl 135 mM,
KCl 5 mM, MgCl_{2} 1 mM y Tris-HCl 10 mM pH 7,4.
Posteriormente, se dializó durante toda la noche a 4ºC con el mismo
tampón y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum para
esterilizar el stock. Finalmente se hicieron alícuotas y se
conservaron a -70ºC con 100 \mug/ml de BSA.
Siguiendo el procedimiento descrito previamente,
se generaron unos adenovirus recombinantes que contenían las
secuencias de DNA codificantes de las enzimas de biotransformación
CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6, CYP 2B6, CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C18, CYP
2C19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP 3A4, CYP 3A5 o GST(A1). Estos
adenovirus recombinantes (vectores de expresión de la invención)
fueron denominados. con el prefijo "Ad" (adenovirus) seguido
del nombre de la enzima, es decir, Ad-1A1,
Ad-1A2, Ad-2A6,
Ad-2B6, Ad-2C8,
Ad-2C9, Ad-2C18,
Ad-2C19, Ad-2D6,
Ad-2E1, Ad-3A4,
Ad-3A5 y Ad-GST(A1)
respectivamente.
Los adenovirus recombinantes obtenidos en el
Ejemplo 1 [Ad-1A1, Ad-1A2,
Ad-2A6, Ad-2B6,
Ad-2C8, Ad-2C9,
Ad-2C18, Ad-2C19,
Ad-2D6, Ad-2E1,
Ad-3A4, Ad-3A5 y
Ad-GST(A1)] se utilizaron para transformar
células HepG2I mediante infección.
Se aspiró el medio de cultivo que contenía un
cultivo de células HepG2I al 70% de confluencia. Las células se
lavaron dos veces con 2-3 ml de medio base o buffer
salino cada vez. La cantidad de virus utilizado fue ampliamente
variable con el fin de generar un modelo celular singular que
cubriera un amplio espectro de la variabilidad metabólica en
humanos. Los adenovirus se diluyeron en el medio de cultivo hasta
alcanzar una concentración comprendida entre 1 y 50 MOI. El volumen
de medio utilizado para el mantenimiento de las células depende del
tamaño de la placa, el volumen final de infección se reducirá ¼
del volumen habitual. El tiempo de incubación se mantuvo entre 1
hora y 30 minutos, y 2 horas a 37ºC. La actividad del transgén en
las células infectadas se puede detectar a partir de las 24 h,
siendo en un máximo de 48 horas, dependiendo de la célula
utilizada. La cantidad máxima de virus totales que una célula
determinada admite es limitada. Para conocer este dato se añaden
cantidades de virus crecientes hasta que se observen efectos
citotóxicos aparentes (morfología, función celular). De esa manera
se ha podido establecer el número máximo de partículas virales que
una determinada célula tolera.
Las Figuras 2 y 3 ilustran ejemplos particulares
de cómo es posible modificar a voluntad la expresión de unas
enzimas humanas relevantes en el metabolismo de fármacos. En
concreto, la Figura 2 muestra el incremento de mRNA en células
HepG2I infectadas con distintos clones del Ad- 2E1, mientras que la
Figura 3 muestra el aumento de actividad en células HepG2I
infectadas con distintas concentraciones del Ad-3A4
e incubadas con testosterona.
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\dddseqskipcccgaattca ccatgctggc ctcagg
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<213> Artificial
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2A6
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\dddseqskipccgaattcca gacctgcacc ggcaca
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP 2B6
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2B6
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<400> 8
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C8
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C8
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C9
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<400> 11
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C9
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\hfill28
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<210> 13
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C18
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<212> DNA
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C18
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<210> 15
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C19
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<400> 15
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\dddseqskipatggatcctt ttgtggtcct t
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<211> 19
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<212> DNA
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<220>
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2C19
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\newpage
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<400> 16
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\dddseqskipagcagccaga ccatctgtg
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2D6
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<400> 17
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\dddseqskipctaagggaac gacactcatc ac
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<210> 18
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP2D6
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<400> 18
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\dddseqskipctcaccagga aagcaaagac ac
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<213> Artificial
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP3A5
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\dddseqskipgttgaagaat ccaagtggcg atggac
\hfill26
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<210> 20
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<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen CYP3A5
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipacagaatcct tgaagaccaa agtagaa
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<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 27
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<213> Artificial
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\vskip0.333000\baselineskip
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<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen GST(A1)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipccaggatcct gctatcatgg cagagaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 33
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.333000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación PCR del
gen GST(A1)
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptatggatccc aaaactttag aacattggta ttg
\hfill33
Claims (15)
1. Un método para obtener modelos celulares
singulares capaces de reproducir in vitro la idiosincrasia
metabólica de los seres humanos, en el que dicho modelo comprende
un conjunto de vectores de expresión que confieren a las células
transformadas la expresión variable y controlada de enzimas de
biotransformación de fármacos, para reproducir la idiosincrasia
metabólica de los seres humanos, que comprende:
a) la transformación de células que expresan
actividad reductasa con un conjunto de vectores de expresión cada
uno de los cuales comprende una secuencia de DNA ectópica diferente
que codifica para una enzima de biotransformación de fármacos de
fase I o una enzima de biotransformación de fármacos de fase II,
seleccionada entre:
i. una secuencia de DNA que se transcribe en el
mRNA sentido de una enzima de biotransformación de fármacos de fase
I o de Fase II ("vector sentido"); y
ii. una secuencia de DNA que se transcribe en el
mRNA anti-sentido de una enzima de
biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II ("vector
anti-sentido");
para obtener, con dichos vectores de expresión,
células que expresan de forma transitoria dichas secuencias de DNA
ectópicas y presentan un perfil fenotípico, variable a voluntad, de
enzimas de biotransformación de fármacos de fase I o de Fase II
diferente, y
a) Construir modelos celulares capaces de
reproducir in vitro la idiosincrasia metabólica de los seres
humanos a partir de dichas células transformadas con dicho conjunto
de vectores de expresión, tanto vectores sentido como vectores
anti-sentido, de manera que la resultante sea la
expresión de cualquier perfil fenotípico humano de enzimas de
biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II deseado.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha célula que exprese actividad reductasa es una célula humana o
animal, incluyendo células tumorales.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha célula que exprese actividad reductasa es una célula humana
seleccionada entre células de origen hepático, epitelial,
endotelial y gastrointestinal tipo CaCO-2.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dichos enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I y de Fase
II se seleccionan entre oxigenasas, oxidasas, hidrolasas y enzimas
de conjugación.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dichos enzimas de biotransformación de fármacos de Fase I y de Fase
II se seleccionan entre monooxigenasas dependientes de CYP450,
flavín-monooxigenasas,
sulfo-transferasas, citocromo C reductasa,
UDP-glucoronil transferasa, epóxido hidrolasa y
glutation transferasa.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de DNA ectópica que codifica por una enzima de
biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II se selecciona
del grupo formado por las secuencias de DNA que se transcriben en el
mRNA sentido o en el mRNA antisentido de isoenzimas de CYP450 y
secuencias de DNA que se transcriben en el mRNA sentido o en el
mRNA antisentido de oxigenasas, oxidasas, hidrolasas y enzimas de
conjugación implicadas en la biotransformación de fármacos.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de DNA ectópica que codifica por una enzima de
biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II se selecciona
del grupo formado por las secuencias de DNA que se transcriben en el
mRNA sentido o en el mRNA antisentido de CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6,
CYP 2B6, CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C18, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP
3A4, CYP 3A5, GST(A1), y secuencias de DNA que se
transcriben en el mRNA sentido o en el mRNA antisentido de
flavín-monooxigenasas,
sulfo-transferasas, citocromo C reductasa,
UDP-glucoronil transferasa, epóxido hidrolasa o
glutation transferasa.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de DNA ectópica que codifica por una enzima de
biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II es una
secuencia de DNA que se transcribe en el mRNA sentido de una enzima
de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de DNA ectópica que codifica por una enzima de
biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II es una
secuencia de DNA que se transcribe en el mRNA antisentido de una
enzima de biotransformación de fármacos de Fase I o de Fase II.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
dichos vectores de expresión que comprenden secuencias de DNA
ectópicas que codifican por las enzimas de biotransformación de
fármacos seleccionadas entre las enzimas de biotransformación de
fármacos de Fase I y las enzimas de biotransformación de fármacos de
Fase II, se seleccionan entre vectores virales, liposomas y
vehículos micelares.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dichos vectores de expresión son adenovirus, naturales o
recombinantes.
12. Método según la reivindicación 1, que
comprende el empleo combinado de cantidades variables de dichos
vectores de expresión que comprenden secuencias de DNA ectópicas
que codifican por las enzimas de biotransformación de fármacos
seleccionadas entre las enzimas de biotransformación de fármacos de
Fase I y las enzimas de biotransformación de fármacos de Fase
II.
13. Empleo de vectores de expresión sentido o
anti-sentido de enzimas de biotransformación de
fármacos de Fase I o II en la manipulación de células que expresan
actividad reductasa para reproducir en ellas la variabilidad
metabólica que se da en los seres humanos.
14. Un método para estudiar el metabolismo y/o la
farmacocinética y/o la potencial hepatotoxicidad idiosincrásica y/o
potenciales interacciones medicamentosas, de un fármaco, que
comprende poner en contacto dicho fármaco con un modelo celular
singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia
metabólica de los seres humanos obtenido según el método de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Un kit que comprende uno o más vectores de
expresión que codifican por los mRNA sentido y
anti-sentido de las enzimas de las Fases I y II de
biotransformación de fármacos.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ES200202109A ES2222782B1 (es) | 2002-09-13 | 2002-09-13 | Metodo para la obtencion de un modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabolica de los seres humanos. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200202109A ES2222782B1 (es) | 2002-09-13 | 2002-09-13 | Metodo para la obtencion de un modelo celular singular capaz de reproducir in vitro la idiosincrasia metabolica de los seres humanos. |
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|---|---|
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- 2002-09-13 ES ES200202109A patent/ES2222782B1/es not_active Expired - Fee Related
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| TZANAKAKIS, E.S.; WAXMAN, D.J.; HANSEN, L.K. et al. Long-term enhancement of cytochrome P450 2B1/2 expression in rat hepatocyte spheroids through adenovirus-mediated gene transfer. Cell Biology and Toxicology. Febrero 2002, Vol. 18, N‘ 1, paginas 13-27. * |
| TZANAKAKIS, E.S.; WAXMAN, D.J.; HANSEN, L.K. et al. Long-term enhancement of cytochrome P450 2B1/2 expression in rat hepatocyte spheroids through adenovirus-mediated gene transfer. Cell Biology and Toxicology. Febrero 2002, Vol. 18, Nº 1, páginas 13-27. \\ Y 9,12 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2222782B1 (es) | 2006-03-01 |
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