ES2222095A1 - Virus adn recombinantes que comprenden un adn complementario de un replicon de un virus arn y sus aplicaciones. - Google Patents
Virus adn recombinantes que comprenden un adn complementario de un replicon de un virus arn y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Virus ADN recombinantes que comprenden un ADN complementario de un replicón de un virus ARN y sus aplicaciones. El genoma del virus ADN recombinante comprende la totalidad o parte del genoma de un virus ADN y una secuencia de ADNc de un replicón derivado de un virus ARN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína exógena o un fragmento de la misma, y, opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales de dicho virus ARN o proteínas encapsidadoras de dicho replicón. Dichos virus ADN recombinantes son útiles para producir partículas virales quiméricas de ciclo único conteniendo un replicón derivado de un virus ARN, para producir proteínas exógenas de interés, o fragmentos de las mismas, así como en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en la formulación de vacunas.
Description
Virus ADN recombinantes que comprenden un ADN
complementario de un replicón de un virus ARN y sus
aplicaciones.
La invención se relaciona, en general, con virus
ADN recombinantes cuyo genoma comprende una secuencia de ADN
complementario de un replicón derivado de un virus ARN que contiene
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína exógena, o un
fragmento de la misma, y, opcionalmente, dicho virus ADN
recombinante comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos
que codifica proteínas estructurales o encapsidadoras de dicho virus
ARN. Dichos virus ADN recombinantes son útiles para producir
partículas virales quiméricas de ciclo único conteniendo un
replicón derivado de un virus ARN, para producir proteínas exógenas
de interés, o fragmentos de las mismas, así como en aplicaciones
terapéuticas.
Los avances en la tecnología del ADN recombinante
han conducido al progreso en el desarrollo de transferencia de
genes entre organismos. Actualmente se están dedicando numerosos
esfuerzos para intentar producir productos químicos, farmacéuticos y
biológicos de interés económico y comercial mediante el empleo de
técnicas de transferencia de genes.
La inmunización utilizando vectores virales
recombinantes constituye una poderosa herramienta para el
desarrollo de vacunas. Se basa en la inoculación de vectores de
expresión que contienen secuencias de nucleótidos que codifican la
proteína inmunogénica (la proteína exógena de interés). No
obstante, las dosis habitualmente utilizadas en numerosos estudios
de vacunación con poxvirus u otros vectores virales son muy altas,
lo que plantea la cuestión de su viabilidad a nivel masivo.
Adicionalmente se han desarrollado replicones, o
moléculas de ARN [aisladas] autoreplicativas, derivadas de virus ARN
de banda simple con polaridad positiva, como alternativa al ADN
para la inmunización genética. Estos replicones pueden expresar,
además, una proteína exógena de interés. Sin embargo, esta
alternativa presenta numerosos problemas debido al elevado coste de
producción, la baja eficiencia de los métodos para la introducción
del replicón en las células, la reducida vida media intracelular
del ARN y a su degradación por las RNAsas. Para evitar estos
problemas, se han desarrollado sistemas que permiten empaquetar los
replicones, generando partículas virales recombinantes, que actúan
como vehículo para la introducción de los replicones en las células.
Sin embargo, la producción de dichas partículas es dificultosa y
cara, y las dosis utilizadas en numerosos estudios de vacunación con
alfavirus también son muy altas, lo que plantea la cuestión de su
viabilidad a nivel masivo.
Los métodos habituales de generación de
replicones empaquetados se basan en la transcripción in
vitro del replicón y su posterior electroporación. Recientemente
se han desarrollado otros métodos basados en el empleo de líneas
celulares empaquetadoras que permiten empaquetar replicones. La
solicitud de patente WO 02/077221 describe células empaquetadoras
que producen alfavirus. No obstante, estos métodos de generación de
replicones empaquetados son caros y difícilmente escalables a
escala industrial.
Por otra parte, el empleo de vectores vacunales
presenta, en ocasiones, problemas de seguridad intrínsecos, por
ejemplo, en individuos inmunodeprimidos. Este problema puede
solucionarse mediante el empleo de vectores virales de ciclo único;
no obstante, esta solución presenta el inconveniente de que, al no
amplificarse el virus vacunal, la cantidad de antígeno se vería
limitada.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar
sistemas alternativos de expresión de productos exógenos de
interés, incluyendo productos con actividad terapéutica, que
solucionen la totalidad o parte de los inconvenientes previamente
mencionados.
La invención se ilustra mediante la construcción
de un virus vaccinia recombinante que comprende un replicón del
virus Semliki Forest que expresa una proteína reportera. El virus
Semliki Forest (SFV) pertenece a la familia de los alfavirus y es un
virus ARN envuelto de banda simple y de polaridad positiva
(Schlesinger and Garoff 1987). La molécula de ARN está
capeada y poliadenilada y tiene un tamaño aproximado de 11 a 12
kpb (Strauss and Strauss 1994).
La identificación de elementos que actúan en cis
requeridos para la replicación del ARN y para el empaquetamiento
hace posible diseñar vectores de expresión basados en alfavirus que
pueden expresar cualquier gen de interés en el citoplasma de
cualquier célula permisiva para la replicación del virus (Berglund,
Sjoberg et al. 1993), (Liljestrom and Garoff 1991). Los vectores
derivados de estos virus son ampliamente utilizados para estudios de
expresión de genes in vitro y están empezando a ser
empleados para el desarrollo de vacunas y aplicaciones en terapia
génica (Schlesinger and Dubensky 1999). Los alfavirus ofrecen
varias ventajas como son su amplio rango de huésped (incluyendo
células de mamíferos, insectos y aves), altos niveles de expresión
de proteína y un genoma pequeño que es fácilmente manipulable.
Después de la entrada del virus en la célula, el
ARN genómico sirve como ARN mensajero para la traducción de las
proteínas virales no estructurales requeridas para la iniciación de
la amplificación del ARN viral. La replicación del ARN viral
comienza con la síntesis de una banda intermediaria de polaridad
negativa que es usada como molde para la síntesis de ARN genómico y
para la transcripción, desde un promotor interno, de ARN subgenómico
de banda positiva. Este ARN subgenómico es el ARN mensajero para la
traducción de las proteínas estructurales. La síntesis del ARN de
polaridad positiva, negativa o subgenómico está regulada
temporalmente por procesamiento proteolítico de los componentes no
estructurales de la poliproteína replicasa, por una proteasa
codificada por el virus en la región C terminal de la proteína no
estructural nsP2 (Lemm, Rumenapf et al. 1994).
Los sistemas de expresión basados en alfavirus se
han desarrollado por sustitución de los genes que codifican para
las proteínas estructurales por el gen que va a ser expresado. Este
sistema ha sido descrito para los virus Sindbis (Bredenbeek, Frolov
et al. 1993) y Semliki Forest (Berglund, Sjoberg et al. 1993),
(Liljestrom and Garoff 1991). El ARN transcrito in vitro
desde la construcción resultante puede ser introducido en las
células por electroporación (Liljestrom and Garoff 1991) o por un
tratamiento con lipofectina (Xiong, Levis et al. 1989). Este ARN es
autorreplicante porque codifica para la replicasa viral, y
adicionalmente produce altos niveles de ARN subgenómico que
codifica para la proteína que va a ser expresada (Bredenbeek and
Rice 1992).
En el sistema de expresión basado en SFV la
producción de partículas recombinantes está basada en la
cotransfección en células de dos moléculas de ARN independientes. La
primera de ellas es el replicón, el cual contiene el gen de la
replicasa, el promotor subgenómico seguido de un gen heterólogo que
se desea expresar y las regiones de los extremos 5' y 3' del genoma
requeridos para la replicación del ARN (Niesters and Strauss 1990),
(Kuhn, Hong et al. 1990). La segunda molécula es el ARN Helper que
también conserva las señales de replicación en 5' y 3' y un
promotor subgenómico seguido de los genes que codifican para las
proteínas estructurales (Liljestrom and Garoff 1991) (Liljestrom
1994). Ambos ARNs pueden ser sintetizados in vitro desde
plásmidos que contienen esas secuencias bajo el promotor SP6 o
pueden ser expresados dentro de la célula por transcripción a partir
de un promotor eucariota (DiCiommo and Bremner 1998). La idea de
tener la función del Helper codificada por una molécula
independiente es conseguir, a través de complementación en trans, un
empaquetamiento selectivo del ARN recombinante dentro de las
partículas de SFV. Esto proviene del hecho de que el vector Helper
carece de la señal de empaquetamiento en su secuencia. La señal de
empaquetamiento, presente en el replicón, es reconocida por la
proteína de la cápside durante el ensamblaje del virus y de ahí que
la transfección con el replicón el RNA Helper sólo produzca
partículas virales que porten el replicón, con lo que sólo el
producto del gen exógeno podrá ser expresado en células
posteriormente infectadas con partículas así producidas (Liljestrom
and Garoff 1991).
Se ha desarrollado un virus ADN recombinante que
comprende la totalidad o parte del genoma de un virus ADN y una
secuencia de ADN complementario (ADNc) de un replicón derivado de
un virus ARN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína exógena o un fragmento de la misma, y, opcionalmente,
una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas con actividad
encapsidante para dicho ARN. El virus ADN recombinante actúa como
lanzadera del replicón del virus ARN que contiene la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína exógena o fragmento de la
misma. Tanto la replicación del replicón dentro de la célula
infectada como la producción de partículas conteniendo el replicón
empaquetado pueden actuar incrementando la cantidad de proteína
exógena o fragmento de la misma producida.
El virus ADN recombinante desarrollado en esta
invención puede ser utilizado en investigación básica o aplicada,
por ejemplo, para obtener productos de interés, como vector vacunal
o en terapia génica, así como para producir partículas virales
quiméricas defectivas de ciclo único.
Un virus ADN recombinante como el proporcionado
por esta invención presenta, entre otras, numerosas ventajas, tanto
en cuanto a su facilidad de escalado en la producción masiva de
replicones empaquetados como a su empleo en la elaboración de
vacunas recombinantes puesto que permite amplificar en mayor medida
la cantidad de antígeno y utilizar cantidades menores de vector
viral. Adicionalmente, la expresión del antígeno en dos contextos
diferentes (células infectadas por el virus ADN y células
infectadas con las partículas de ciclo único) puede tener
implicaciones en cuanto a la respuesta inmune contra el
antígeno.
Por tanto, en un aspecto la invención se
relaciona con un virus ADN recombinante que comprende la totalidad
o parte del genoma de un virus ADN y una secuencia de ADNc de un
replicón derivado de un virus ARN que contiene una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína exógena o un fragmento de la
misma, y, opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica
proteínas estructurales o encapsidadoras de dicho virus ARN.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
procedimiento para la producción de partículas virales quiméricas
defectivas de ciclo único derivadas de un virus ARN que comprende
infectar una célula competente con dichos virus ADN
recombinantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende dichos virus ADN
recombinantes y un vehículo farmacéuticamente aceptables.
\newpage
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para producir una proteína, o un fragmento de la misma, de
interés, que comprende infectar una célula competente con dicho
virus ADN recombinante y, si se desea, aislar el dicha proteína de
interés o fragmento de la misma.
La Figura 1 muestra esquemáticamente la
construcción del plásmido pRedTS-0. A partir del
plásmido pGPTK, que contiene en su secuencia los flancos de
recombinación para el gen de la timidina quinasa (TK) del virus
vaccinia (VV) se clonó parte del extremo 5' y 3' del genoma de SFV,
que sirven posteriormente corno flancos de recombinación para el
replicón completo. En un paso siguiente se clonó el gen marcador
dsRed bajo el control de un promotor viral. TKL: flanco de
recombinación izquierdo del gen TK del VV. TKR: flanco de
recombinación derecho del gen TK del VV. dsRed: proteína roja
fluorescente. ns-1: parte de la secuencia del gen no
estructural 1 de SFV. f: extremo 3' del replicón de SFV.
La Figura 2 muestra esquemáticamente la
construcción de los plásmidos pRedTS 1-3. Mediante
PCR recombinante se introdujeron mutaciones en el promotor natural
de la TK. Las 3 versiones del promotor se clonaron en el plásmido
pRedTS-0 por digestión con Sph-I y
Xho-I y se generaron tres plásmidos (pRedTS 1, 2 y
3) de mayor a menor intensidad en la expresión, respectivamente.
Estos plásmidos se utilizaron para generar los virus WRedTS y
WH-RedTS que a su vez se emplearon, por
transfección del plásmido pSFVrsGFP, para formar los virus vaccinia
recombinantes que expresan el replicón a partir de diferentes
promotores (W-SFR-0
W-SFR-1,
W-SFR-2,
W-SFR-3,
WH-SFR-O,
WH-SFR-1,
WH-SFR-2 y
WH-SFR-3).
La Figura 3 muestra esquemáticamente la
construcción del plásmido pRednsTK. A partir del plásmido pRedTS,
insertando y eliminado genes, se creó el plásmido pRednsTK que porta
en su secuencia los genes de las proteínas no estructurales de SFV y
el gen marcador dsRed. TK_{L}: flanco de recombinación izquierdo
del gen TK de VV. TK_{R}: flanco de recombinación derecho del gen
TK de VV. dsRed: proteína roja fluorescente. nsPl-4:
genes no estructurales de SFV.
La Figura 4 muestra esquemáticamente la
construcción del plásmido pMix f. A partir del plásmido pRednsTK,
eliminando los genes de las proteínas estructurales y el gen
marcador dsRed y clonando la rsGFP y la parte final de las nsP4 se
creó el plásmido pMix. Este plásmido se utilizó para clonar los tres
fragmentos de 340, 170 y 70 nucleótidos del extremo 3' del replicón
de SFV, incluyendo o no la secuencia Poli-A del cDNA
de SFV generando así distintas versiones derivadas del plásmido
pMixf(pMix-f-340,
pMix-f-34OAn,
pMix-f-170,
pMix-f-170An,
pMix-f-70 y
pMix-f-70An). ns4: parte del gen de
la nsP4. rsGFP: proteína verde fluorescente. f extremo 3' del
replicón de SFV. TK_{R}: flanco de recombinación derecho de TK de
VV.
La Figura 5 muestra esquemáticamente el diseño
del vector combinado virus vacciniavirus Semliki Forest
(VV-SFV). En el contexto de la infección con el
virus vaccinia recombinante se transcriben y traducen las proteínas
estructurales (STR) y el replicón de SFV (nsP1-4 y
el gen de interés). La transcripción del replicón a partir de un
promotor temprano del virus vaccinia da lugar a la banda positiva
del replicón (+) que se traduce dando lugar a la replicasa. El ciclo
replicativo del replicón se completa a través de intermediarios de
banda negativa (-). Además, se produce un mensajero subgenómico que
media la expresión de la proteína exógena (\bullet). El replicón
completo (banda positiva) junto con las proteínas estructurales
(STR) expresadas a partir de un promotor fuerte de vaccinia forman
las partículas de SFV de ciclo único que infectarán las células
adyacentes y expresarán la proteína clonada en el replicón.
La Figura 6 muestra esquemáticamente la
construcción de virus recombinantes para el estudio del promotor
del virus vaccinia para la expresión del replicón SFV. Los virus
W-RedTS y WH-RedTS se aislaron a
partir de virus vaccinia WR y V-Helper,
respectivamente, mediante inserción con los plásmidos pRedTS 0, 1,
2 y 3. El virus V-Helper es un virus vaccinia
recombinante que expresa las proteínas estructurales de SFV clonadas
en el locus F13L, bajo el control de un promotor sintético
temprano/tardío, y su aislamiento está descrito en la tesis
doctoral de Maria del Mar Lorenzo Gilsanz, Universidad Autónoma de
Madrid, Facultad de Ciencias, 2001. Posteriormente, se aislaron los
virus indicados en la parte inferior de la figura por inserción con
el plásmido pSFVrsGFP. F13L: gen que codifica la proteína p37. TK:
gen de la Timidina quinasa. STR: genes de las proteínas
estructurales. TK_{L}: flanco de recombinación izquierdo de la
TK. ns-1: Extremo 5' del replicón. dsRed: gen
marcador. f: extremo 3' del replicón. TK_{R}: flanco de
recombinación derecho de TK. nsP 1-4: genes de las
proteínas no estructurales. rsGFP: gen de la proteína verde
fluorescente.
La Figura 7 muestra esquemáticamente la
construcción de virus recombinantes para el estudio de la secuencia
necesaria en el extremo 3' del replicón. Los virus
W-RednsTK y WH-RednsTK se aislaron
a partir de virus vaccinia WR y V-Helper,
respectivamente, mediante inserción con el plásmido pRednsTK.
Posteriormente, se aislaron los virus indicados en la parte
inferior por inserción con las diferentes versiones de los plásmidos
pMixf. F13L: gen que codifica la proteína p37. TK: gen de la
timidina quinasa. STR: genes de las proteínas estructurales de SFV.
TK_{L}: flanco de recombinación izquierdo de TK.
ns-1: Extremo 5' del replicón. dsRed: gen marcador.
f: extremo 3' del replicón. TK_{R}: flanco de recombinación
derecho de TK. nsPl-4: genes de las proteínas no
estructurales. rsGFP: gen marcador.
La Figura 8 es un conjunto de fotografías que
muestran la morfología de placa de los virus W-SFR
70An y WH-SFR 70An. Se infectaron células
BSC-1, sembradas en placas de 6 pocillos, con
diluciones de orden 10 del stock de los virus
W-SFR-70An y WH-SFR
70An. A las 48 h.p.i. se tiñeron con cristal violeta.
La Figura 9 muestra las imágenes obtenidas por
microscopia electrónica del virus recombinante
WH-SFR 70An. Las flechas blancas muestran virus
vaccinia y las flechas negras señalan SFPs (SFP, partícula viral
similar a SFV que lleva empaquetado un replicón, también denominada
en esta descripción partícula quimérica defectiva o de ciclo único).
En el panel A (aumento 60K) se señala un virus vaccinia
extracelular envuelto (EEV) con SFPs a su alrededor. En los paneles
B (30K), C (60K), D (60K) y F (30K) aparecen SFPs en la membrana
celular. En el panel E (30K) se muestra una célula con virus
vaccinia intracelular y SFPs en el exterior de la célula. Barra A,
C y D 100 nm. Barra B y F 200 nm. Barra E 500 nm.
La Figura 10 muestra las imágenes obtenidas por
microscopía electrónica de W-SFR 70An y WR. Los
paneles A y B muestran células infectadas con el virus recombinante
W-SFR 70. Las flechas señalan los virus vaccinia. A
(aumento 30K)-Virus vaccinia asociado a célula
(CEV). B (25K)-Aparecen virus vaccinia intracelular
envuelto (IEV). Los paneles C y D son células infectadas con el
virus vaccinia WR control. C (40K)-Virus vaccinia
asociado a célula (CEV). D (25K)-Virus intracelular
envuelto (IEV). Nótese en todos los casos, la ausencia de
estructuras del tipo SFPs. Barra 200 nm.
La Figura 11 es un diagrama de barras que muestra
la producción de SFPs en distintas líneas celulares. Las líneas
celulares sujetas a estudio fueron infectadas con el virus
recombinante WH-SFR 70An a m.d.i. de 5 ufp/célula.
A las 24 h.p.i. se recogieron los sobrenadantes de las infecciones,
se clarificaron y se filtraron a través de un filtro de 0,1 \mum.
Con el medio filtrado se infectaron células BHK sembradas en placas
de 6 pocillos y a las 24 h.p.i. se contaron células que expresaban
GFP.
La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra
la producción de virus vaccinia extracelular y asociado a células a
partir del virus WH-SFR 70An en distintas líneas
celulares. Se infectaron las líneas celulares escogidas a alta
m.d.i. con el virus WH-SFR 70An. A las 24 h.p.i. se
recogieron y clarificaron los sobrenadantes de las infecciones,
separando sobrenadante (virus extracelular) y células (virus
intracelular y asociado a célula). Se realizó un plaqueo en células
BSC-1 para titular la producción viral. A las 48
h.p.i. se tiñó con cristal violeta. Barras claras: Virus
extracelular. Barras oscuras: Virus asociado a célula.
La Figura 13 es un gráfico que muestra la
cinética de producción de partículas (SFPs) en presencia de
inhibidores del virus vaccinia. Se infectaron células Hela a alta
m.d.i. con el virus recombinante WH-SFR 70An y tras
la adsorción se añadió AraC (100 \mug/ml), Rifampicina (100
\mug/ml) o IMCBH (10 \mug/ml). Se tomaron muestras cada 12
horas, se clarificaron, filtraron y guardaron a 4°C hasta que se
recogió el último punto de la cinética. Para determinar el título de
SFPs se infectaron células BHK con diluciones de orden 10 del
sobrenadante filtrado y a las 24 h.p.i. se contaron células GFP(+)
en el microscopio de fluorescencia.
La Figura 14 incluye dos gráficas que muestran la
producción de virus extracelular y asociado a células del virus
WH-SFR 70An. Se infectaron células Hela a m.d.i. de
5 ufp/célula con el virus WH-SFR 70An, tras 1 hora
de adsorción se añadió AraC (100 p.g/ml), Rifampicina (100 pg/ml) o
IMCBH (10 \mug/ml). A las 24 h.p.i. se recogieron las infecciones
y se tituló la producción de virus extracelular y asociado a
células. Se representa la producción de virus extracelular (VE) y
virus asociado a célula (VI) respecto a un control sin
inhibidor.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
virus ADN recombinante, en adelante virus ADN recombinante de la
invención, que comprende la totalidad o parte del genoma de un
virus ADN y una secuencia de ADN complementario (ADNc) de un
replicón derivado de un virus ARN que contiene una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína exógena o un fragmento de la
misma. En una realización particular, el virus ADN recombinante de
la invención comprende la totalidad del genoma de un virus ADN. En
otra realización particular, el virus ADN recombinante de la
invención comprende una parte del genoma de un virus ADN;
ventajosamente, en este caso, la parte del genoma del virus ADN
incluirá, los elementos necesarios para la replicación del virus
ADN o, al menos, los elementos necesarios para iniciar la infección
y la transcripción del replicón. En otra realización particular, el
virus ADN recombinante de la invención comprende una parte del
genoma de un virus ADN y genes exógenos adicionales que puedan
actuar como adyuvantes o inmunomoduladores. A modo ilustrativo,
podrían utilizarse virus deficientes en funciones no esenciales o
incluso virus ADN de ciclo único (abortivos) afectando a alguna
función esencial para aumentar la seguridad del sistema.
El término "replicón" tal como se utiliza en
esta descripción incluye, aunque no se limita a, moléculas de ARN
de banda simple y polaridad positiva,
auto-replicativas. Por tanto, un replicón es un
elemento genético que codifica su propia replicasa y contiene los
elementos necesarios para su replicación. El replicón, una vez
introducido en una célula, se traduce y, posteriormente, se
replica. En la presente invención, el replicón incluye, además, una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína exógena o un
fragmento de la misma. El promotor subgenómico contenido en el
replicón regula la transcripción de la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína exógena o fragmento de la misma, tal como se
muestra esquemáticamente en la Figura 5.
Los replicones pueden ser construidos
delecionando la totalidad o parte de las secuencias de nucleótidos
que codifican la cápsida del virus ARN y manteniendo todas las
secuencias de nucleótidos codificantes y no codificantes necesarias
para la replicación. La retención de las secuencias de replicación
genómica permite la expresión de los productos de los genes virales
y exógenos en células apropiadas. Información adicional sobre la
construcción de replicones puede encontrarse, por ejemplo, en WO
02/095023.
En general, la secuencia de ADNc del replicón del
virus ARN utilizada en la generación del virus ADN recombinante de
la invención comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la
replicasa de dicho virus ARN, la secuencia de nucleótidos de un
promotor subgenómico seguida de la secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína exógena o un fragmento de la misma, las
regiones del genoma de dicho virus ARN necesarias para la
replicación del ARN y las señales de encapsidación del ARN. En una
realización particular, dicha secuencia de ADNc comprende, en
dirección 5' a 3', (i) una secuencia 5' requerida para la
amplificación mediada por la ARN polimerasa del virus (replicasa),
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la replicasa de
dicho virus ARN, (iii) unos medios para expresar una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína exógena, (iv) una secuencia
de nucleótidos que codifica una proteína exógena o un fragmento de
la misma, y (v) una secuencia 3' requerida para la amplificación
mediada por la ARN polimerasa del virus (replicasa), en donde dicha
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína exógena
reemplaza uno o más genes que codifican proteínas estructurales de
dicho virus ARN.
La secuencia de ADNc del replicón derivado del
virus ARN que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína exógena o un fragmento de la misma se encuentra bajo el
control de un promotor de transcripción del virus ADN utilizado en
la generación del virus ADN recombinante de la invención.
Prácticamente cualquier promotor de dicho virus puede ser
utilizado. En una realización particular, el virus ADN es el virus
vaccinia y el promotor de transcripción utilizado para controlar la
transcripción de dicha secuencia de ADNc del replicón derivado del
virus ARN es un promotor temprano del virus vaccinia.
La proteína exógena, o fragmento de la misma, a
la que se hace referencia en el virus ADN recombinante de la
invención puede ser cualquier proteína, o fragmento de la misma, de
interés, por ejemplo, en investigación básica o aplicada, en sanidad
humana o animal, etc., que no está presente de forma nativa en el
virus ARN ni en el virus ADN utilizados en la generación del virus
ADN recombinante de la invención. A modo ilustrativo, dicha proteína
exógena se elige entre una proteína biológicamente activa, una
proteína reportera, una proteína citotóxica, una proteína de un
patógeno, una proteína con actividad inmunomoduladora, una proteína
de un tumor, etc. Por ejemplo, la proteína exógena podría ser la
glicoproteína gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
causante del SIDA, o la glicoproteína E2 del virus de la Peste
Porcina Clásica, el antígeno de superficie del virus de la Hepatitis
B (HBV), la timidina quinasa del virus Herpes Simplex, que permite
matar selectivamente en la zona de expresión utilizando un fármaco,
etc. En una realización particular, dicha proteína exógena es una
proteína reportera tal como la proteína verde fluorescente (GFP).
Ejemplos ilustrativos de fragmentos de proteínas exógena incluyen
antígenos o epítopos de proteínas exógenas, que pueden ser
utilizados para inmunizar humanos o animales.
En una realización preferida, el virus ADN
recombinante proporcionado por esta invención comprende, además,
una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas
estructurales del virus ARN utilizado en la generación del virus ADN
recombinante de la invención o bien proteínas encapsidadoras de
dicho ARN. Tal como se utiliza en esta descripción, el término
"proteínas encapsidadoras" incluye a cualquier proteína con
actividad encapsidante que conduzca a la transmisión del replicón a
células adicionales, es decir, cualquier proteína que encapside (o
empaquete) y transmita el replicón. De este modo, en las células
infectadas por el virus ADN recombinante de la invención se produce
tanto el replicón como las proteínas estructurales o
encapsidadoras, lo que conduce a la producción de partículas virales
quiméricas defectivas de ciclo único que empaquetan el replicón,
que pueden salir al exterior celular e infectar otras células. La
secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales o
encapsidadoras de dicho virus ARN se localiza en un locus del genoma
del virus ADN diferente al locus en el que se encuentra la
secuencia de ADNc de un replicón derivado del virus ARN que
contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
exógena o un fragmento de la misma. En caso de que dicho virus ARN
tenga más de una proteína estructural, las secuencias codificantes
de dichas proteínas estructurales pueden estar en posiciones
adyacentes entre sí o separadas, controladas conjuntamente bajo un
mismo promotor o mediante promotores independientes. En caso de que
solo algunas de las proteínas estructurales o encapsidadoras sean
necesarias para la encapsidación y transmisión del replicón,
solamente se incluirían los genes correspondientes, en posiciones
adyacentes entre sí o separadas, controladas conjuntamente bajo un
mismo promotor o mediante promotores independientes.
En una realización particular, el virus ADN
recombinante proporcionado por esta invención comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales
del virus ARN utilizado en la generación del virus ADN recombinante
de la invención. En otra realización particular, el virus ADN
recombinante proporcionado por esta invención comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica proteínas encapsidadoras del
virus ARN utilizado en la generación del virus ADN recombinante de
la invención.
La secuencia de nucleótidos que codifica las
proteínas estructurales o encapsidadoras del virus ARN utilizado en
la generación del virus ADN recombinante de la invención se
encuentra bajo el control de un promotor de transcripción del virus
ADN utilizado en la construcción del virus ADN recombinante de la
invención. Prácticamente cualquier promotor de dicho virus puede
ser utilizado. En una realización particular, el virus ADN es el
virus vaccinia y el promotor de transcripción utilizado para
controlar la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos que
codifica las proteínas estructurales del virus ARN es un promotor
temprano/tardío del virus vaccinia. El promotor que regula la
transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica las
proteínas estructurales del virus ARN puede ser un promotor como el
que regula la transcripción de la secuencia de ADNc del replicón
derivado del virus ARN que contiene la secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína exógena o un fragmento de la misma o,
alternativamente, puede ser un promotor diferente. En una
realización particular, el virus ADN es el virus vaccinia, el
promotor utilizado para controlar la transcripción de la secuencia
de ADNc del replicón derivado del virus ARN es un promotor temprano
del virus vaccinia y el promotor de transcripción utilizado para
controlar la transcripción de la secuencia de nucleótidos que
codifica las proteínas estructurales del virus ARN es un promotor
temprano/tardío del virus vaccinia.
Prácticamente cualquier virus ADN puede ser
utilizado en la generación del virus ADN recombinante de la
invención; no obstante, en una realización particular, dicho virus
ADN es un virus ADN de doble banda, por ejemplo, un poxvirus. En
una realización particular, dicho virus ADN es un virus vaccinia
(VV), un virus ADN de gran tamaño (190 kb aproximadamente).
Alternativamente, otros virus ADN, tales como herpesvirus o
adenovirus, podrían ser usados.
El virus ARN utilizado en la generación del virus
ADN recombinante de la invención puede ser, prácticamente,
cualquier virus con genoma ARN; no obstante, en una realización
particular, dicho virus ARN se selecciona del grupo formado por los
virus ARN de cadena simple con polaridad positiva, los virus ARN de
cadena simple con polaridad negativa, los virus ARN con genoma
segmentado, los virus ARN de cadena doble y los retrovirus (no
obstante, en este último caso la situación es más complicada ya que
los retrovirus tienen la particularidad de que el RNA no es
autorreplicativo puesto que se genera por transcripción cuando está
integrado en el ADN celular). En una realización particular, dicho
virus ARN es un alfavirus, tal como el virus Semliki Forest
(SFV).
El virus ADN recombinante de la invención puede
ser obtenido mediante un procedimiento que comprende (i) la
obtención del ADNc derivado de un virus ARN; (ii) la construcción
de un replicón a partir de dicho ADNc; (iii) la inserción en dicho
replicón de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
exógena o un fragmento de la misma; (iv) la inserción de dicho ADNc
en un locus del genoma del virus ADN; y, en su caso, (v) la
obtención de la secuencias de nucleótidos que codifican las
proteínas estructurales o encapsidadoras del virus ARN, y (vi) la
inserción de dichas secuencias de nucleótidos codificantes de las
proteínas estructurales o encapsidadoras del virus ARN en otro
locus del genoma del virus ADN. Las técnicas utilizadas son
técnicas convencionales de Ingenieria Genética conocidas por los
técnicos en la materia (Sambrook et al., 1989).
En una realización particular (véase el Ejemplo
que acompaña a esta descripción) se describe la construcción de un
virus ADN recombinante VV-SFV que comprende el
genoma del virus vaccinia (VV) en el que se han insertado en
diferentes loci: (i) una secuencia de ADNc de un replicón derivado
del virus Semliki Forest (SFV) que contiene una secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína reportera GFP y (ii) una
secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales
de la partícula de SFV. El objetivo de esa realización particular
fue combinar dos tipos de vectores, uno basado en ADN (VV) y un
segundo basado en ARN (SFV), para generar un vector que actúe como
lanzadera del segundo (SFV). Los vectores de expresión basados en
alfavirus se han generado mediante la sustitución de los genes que
codifican para las proteínas estructurales del virus por un gen
heterólogo, manteniendo el control transcripcional el promotor
altamente activo del ARN subgenómico (Berglund et al., 1993),
(Liljestrom & Garoff, 1991). El ARN del replicón puede ser
transcrito in vitro y usado directamente por transfección o
empaquetado en partículas infecciosas por cotransfección en cultivo
celular con una molécula de ARN Helper defectivo, que proporciona,
en trans, las proteínas estructurales del virión (Liljestrom
& Garoff, 1991; Bredenbeek et al., 1993). Para conseguir la
transcripción del replicón SFV, se ha construido un virus vaccinia
recombinante que porta en su genoma un replicón completo insertado
en el locus de la timidina quinasa (TK) bajo el control del promotor
natural temprano de la TK. Adicionalmente, se generó un virus
vaccinia recombinante que además expresaba los genes de las
proteínas estructurales de SFV en el locus del gen F13L bajo un
promotor viral temprano/tardío. En el desarrollo del vector
combinado VV-SFV, se han estudiado diferentes
aspectos importantes para la viabilidad del sistema. En primer
lugar, experimentos previos habían demostrado la compatibilidad de
las infecciones de VV y el SFV. Adicionalmente se han estudiado los
requerimientos con respecto al promotor para la transcripción del
replicón, y los requerimientos con respecto al extremo 3' del
replicón (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción).
En una realización preferida, el virus ADN
recombinante de la invención comprende, además, una secuencia de
nucleótidos que codifica las proteínas estructurales del virus ARN
utilizado en la construcción del virus ADN recombinante de la
invención o bien proteínas encapsidadoras de dicho virus ARN. En
esta realización, cuando el virus ADN recombinante de la invención
infecta células competentes, en dichas células se produce tanto el
replicón y la proteína exógena como las proteínas estructurales o
encapsidadoras del virus ARN. Como consecuencia de ello, dichas
proteínas estructurales o encapsidadoras empaquetan el replicón
(que contiene, además, la secuencia codificante de la proteína
exógena o fragmento de la misma) produciendo unas partículas
virales quiméricas defectivas de ciclo único que pueden salir al
exterior celular e infectar otras células. Dichas partículas virales
derivan, por tanto, del virus ARN y son quiméricas porque
contienen una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
exógena o un fragmento de la misma, defectivas porque la
secuencia de nucleótidos exógena reemplaza la totalidad o parte de
las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la
cápsida del virus ARN, y de ciclo único ya que solo pueden
infectar células una única vez porque el replicón empaquetado
carece de las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas
de la cápsida del virus ARN puesto que contiene únicamente las
secuencias de nucleótidos necesarias para la replicación así como
la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína exógena o un
fragmento de la misma.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para la producción de partículas
virales quiméricas defectivas de ciclo único, derivadas de un virus
ARN, que comprende infectar células competentes con virus ADN
recombinantes de la invención que comprenden, además de la
totalidad o parte del genoma de un virus ADN y una secuencia de
ADNc de un replicón derivado de un virus ARN que contiene una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína exógena o un
fragmento de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica las
proteínas estructurales o encapsidadoras de dicho virus ARN. Tras la
infección de las células competentes (es decir, células
susceptibles de ser infectadas por el virus ADN recombinante de la
invención), se produce tanto el replicón como las proteínas
estructurales o encapsidadoras, lo que lleva a la producción de
partículas virales quiméricas defectivas de ciclo único que
empaquetan el replicón, que pueden salir al exterior celular y son
capaces de infectar nuevas células. Si se desea, dichas partículas
virales quiméricas defectivas de ciclo único producidas se retiran
del sobrenadante por métodos convencionales. En una realización
particular se describe la producción de partículas virales
quiméricas defectivas de SFV a partir de un virus ADN recombinante
VV-SFV (véase el Ejemplo que acompaña a esta
descripción).
El virus ADN recombinante de la invención
presenta numerosos usos potenciales. En una realización particular,
dicho virus ADN recombinante de la invención puede utilizarse como
sistema para generar replicones empaquetados. Esta aproximación
tiene como ventaja respecto a los métodos clásicos de obtención de
replicones empaquetados el hecho de que no seria necesaria la
transcripción in vitro y electroporación del ARN, por lo que
el procedimiento puede ser fácilmente escalable. Adicionalmente, la
baja o nula formación de virus ARN viables constituye una ventaja
sustancial.
En otra realización particular, dicho virus ADN
recombinante de la invención puede utilizarse para expresar
proteínas exógenas o fragmentos de las mismas en sistemas celulares
competentes, animales o plantas, mediante su infección con dicho
virus ADN recombinante de la invención. Prácticamente cualquier
proteína exógena, o fragmento de la misma, de interés puede ser
expresada. En una realización concreta, la proteína exógena o
fragmento de la misma puede ser una proteína, o un fragmento de la
misma, con actividad terapéutica, por ejemplo, antitumoral que
ejerce su actividad sobre una célula maligna infectada con dicho
virus, o sobre una célula próxima, funcionando éste como una forma
de terapia génica antitumoral. Por tanto, en este caso, el virus
ADN recombinante de la invención junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable puede constituir una composición
farmacéutica. Ejemplos ilustrativos no limitativos de vehículos
farmacéuticamente aceptables incluyen agua, aceites, incluyendo
aceites minerales y vegetales, soluciones salinas, soluciones
alcohólicas, etc.
En otra realización particular, dicho virus ADN
recombinante de la invención puede utilizarse para inducir una
respuesta inmune en un animal, tal como un mamífero, incluido el
hombre, frente a la proteína exógena o fragmento de la misma. En
este caso, el virus ADN recombinante de la invención junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable puede constituir una vacuna
recombinante. Ejemplos ilustrativos no limitativos de vehículos
farmacéuticamente aceptables incluyen agua, aceites, incluyendo
aceites minerales y vegetales, soluciones salinas, soluciones
alcohólicas, adyuvantes inmunológicos etc. En un caso particular, el
replicón puede expresar determinantes antigénicos de cualquier
patógeno, incluyendo bacterias, hongos, virus o parásitos.
Alternativamente, el replicón puede expresar antígenos tumorales o
bien epítopos derivados de antígenos. Asimismo, el replicón puede
expresar cualquier proteína, o fragmento de la misma,
biológicamente activa, por ejemplo, una proteína inmunomoduladora,
tal como una citoquina, que puede modular la respuesta inmune en el
animal.
De acuerdo con esta aplicación de los virus ADN
recombinantes de la invención, es posible inmunizar animales contra
enfermedades mediante su uso directo como vacunas recombinantes.
Los virus ADN recombinantes de la invención son más efectivos que
los vectores singulares por separado, ya que pueden provocar una
amplificación en la expresión del antígeno, así como su
presentación al sistema inmune en dos contextos celulares diferentes
(células infectadas con el virus ADN recombinante y células
infectadas con la partícula viral quimérica defectiva de ciclo
único). Como es conocido, en la inmunización con el virus vaccinia
la respuesta del huésped está dirigida frente a las proteínas del
virus más el antígeno que se desea expresar. En ocasiones, primero
se vacuna con ADN para provocar una respuesta primaria frente a la
proteína de interés, y después con el virus recombinante para
generar una respuesta secundaria frente a dicha proteína que se
utiliza como antígeno. Con el procedimiento de expresión de
partículas de virus ARN quiméricas defectivas producidas a partir
de virus ADN recombinantes de la invención se singulariza la
respuesta inmune del huésped frente a una sola proteína, ya que la
proteína exógena es la única que se expresa masivamente tanto en
células infectadas con el virus ADN recombinante de la invención
como en células infectadas por las partículas virales quiméricas
defectivas de ciclo único. El sistema del replicón forma partículas
que aumentan la expresión del antígeno, con lo que se disemina de
una manera más eficaz y rápida en el huésped, centralizando la
respuesta del huésped a una sola proteína. En una realización
particular, el virus ADN recombinante de la invención comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica proteínas encapsidadoras con
una especificidad deterinada que pueden dirigir las partículas
quiméricas defectivas de ciclo único a determinados tipos
celulares.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende virus ADN
recombinantes de la invención y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Dicha composición farmacéutica incluye las vacunas
recombinantes previamente mencionadas.
Las partículas virales quiméricas defectivas de
ciclo único proporcionadas por esta invención, constituyen un objeto
adicional de la presente invención, y pueden ser utilizadas para los
mismos fines que los virus ADN recombinantes de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para generar una respuesta inmune en un animal, tal como un
mamífero, incluido el hombre, que comprende administrar a dicho
animal una vacuna recombinante que comprende virus ADN recombinantes
de la invención en los que dicha proteína exógena, o fragmento de
la misma, es un inmunógeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para producir un proteína, o un fragmento de la misma, de
interés, que comprende infectar una célula competente con virus ADN
recombinantes de la invención. La proteína, o fragmento de la misma,
una vez producida puede ser recuperada, si se desea, bien de la
célula infectada o del medio (en caso de que fuera excretada), por
métodos convencionales.
El siguiente ejemplo ilustra la obtención de
vectores combinados de virus ADN (VV) y ARN (SFV) y no debe ser
considerado como limitativo del alcance de la misma. Como es
conocido, los vectores derivados de los alfavirus, por ejemplo,
Sindbis y Semliki Forest, son usados ampliamente para estudios
in vitro de expresión génica y están empezando a ser
utilizados para el desarrollo de vacunas y aplicaciones en terapia
génica. La familia de los alfavirus ofrece varias ventajas como son
su amplio rango de huésped (incluyendo células de mamíferos,
insectos y aves), altos niveles de expresión de proteína y un
genoma relativamente pequeño que es fácilmente manipulable.
Ejemplo
Se realizó este ejemplo con la finalidad de
conseguir vectores combinados de virus ADN (VV) y ARN (SFV). El
fundamento del diseño de estos vectores es la transcripción de un
ARN autorreplicativo (replicón) como un ARN mensajero del virus ADN
(VV). Debido a que el replicón se traduce en su replicasa, una vez
transcrito y traducido, el replicón es independiente de la
maquinaria de expresión genética del VV. Para la realización de este
ejemplo se han diseñado dos versiones de vectores combinados
diferentes:
- (1)
- Virus vaccinia recombinantes que expresan el replicón de SFV completo, incluyendo un gen exógeno; y
- (2)
- Virus vaccinia recombinantes que expresan el replicón de SFV completo, incluyendo un gen exógeno, y que adicionalmente expresan las proteínas necesarias para el empaquetamiento del replicón, su salida al medio extracelular y su introducción en una nueva célula (Figura 5).
Los virus recombinantes construidos para la
expresión del replicón de SFV se aislaron por
infección/transfección en células CV-1 (obtenidas de
la American Type Culture Collection, ATCC). Brevemente, células
sembradas en un pocillo de 9 cm^{2} al 80% de confluencia fueron
infectadas con virus vaccinia vRB12, un mutante de deleción del gen
F 13L en la cepa WR (Blasco y Moss, 1992) a una multiplicidad de
infección (m.d.i.) de 0,05 ufp/célula (unidades formadoras de placa
por célula). Tras 1 hora de adsorción en un volumen reducido de
medio al 2% de suero se transfectaron con Fugene (Sigma), como
método de transfección y 2 \mug de plásmido. A las 72 horas se
recogieron las células y se lisaron mediante tres ciclos de
congelación y descongelación. Se utilizaron diluciones de orden 10
del virus obtenido para infectar monocapas de células
BSC-1 (obtenidas de la ATCC). A las 48 horas
post-infección (h.p.i.), se aislaron placas de
tamaño igual al virus vaccinia, cepa WR (Western Reserve) y se
resuspendieron en medio EMEM 5% STF (medio de cultivo de células
(EMEM), suplementado con 5% de Suero de Ternera Fetal (STF), ambos
obtenidos de la casa Biowittaker). El proceso de aislamiento de
placa de lisis se repitió 3 veces más, tras lo cual se amplificó el
virus doble recombinante en células BSC-1.
El aislamiento de los virus intermediarios para
la generación del replicón se realizó por un plaqueo estándar de
virus vaccinia en células 143B TK^{-} (obtenidas de la ATCC) en
presencia de 25 \mug/ml de bromo deoxiuridina (BrdU) (Calbiochem)
y por el seguimiento del gen marcador dsRed en el microscopio de
fluorescencia. Los virus que expresan el replicón se aislaron por la
expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) por microscopía
de fluorescencia.
Utilizando como molde ADN de células infectadas
con el virus WR y la pareja de oligonucleótidos identificados como
SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2 se generó un producto de PCR que
introducía una mutación en el promotor natural de la timidina
quinasa del virus vaccinia. Este fragmento se clonó en los sitios
Sph-I y Xho-I del plásmido pGPTK
(plásmido generado en el laboratorio de los inventores) que tenía
los flancos de recombinación con el gen de la timidina quinasa
resultando el plásmido pGPTK*.
Se hicieron dos clonajes sucesivos para construir
un plásmido que tuviera los flancos de recombinación con los genes
de las proteínas no estructurales de SFV. Se amplificó el fragmento
f (extremo 3' del replicón de SFV) con la pareja de oligonucleótidos
identificados como SEQ. ID. N°: 3 y SEQ. ID. N°: 4, y se clonó en
el plásmido pGPTK* linearizado con la enzima BamHl. El plásmido
resultante, pGPTKf, se utilizó para clonar parte del gen nsP l
(extremo 5' del replicón de SFV) amplificado por PCR con los
oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 5 y SEQ. ID. N°:
6. El fragmento amplificado se clonó en el sitio
Xho-I del plásmido pGPTK*fy se generó el plásmido
pGPTS.
Como gen marcador para la selección de los virus
recombinantes resultantes de la transfección de este plásmido se
utilizó la proteína roja fluorescente (dsRed). El gen marcador
dsRed se obtuvo por digestión del plásmido pRBdsRed2 (plásmido
generado en el laboratorio de los inventores) con las enzimas
Xho-I y BamHI y se clonó en el pGPTS previamente
digerido con las mismas enzimas eliminando así el cassette
GFP-Pac e insertando el gen dsRed. El plásmido
creado fue denominado pRedTS-0 (Figura 1).
La introducción de mutaciones en el promotor de
la timidina quinasa se realizó mediante amplificación por PCR de
los fragmentos TK_{L} y ns-1 que solapan en la
zona del promotor. Con los oligonucleótidos identificados como SEQ.
ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8 y SEQ. ID. N°: 9 (cada uno de ellos
introduce una mutación en el promotor que varía la intensidad de la
expresión) y SEQ. ID. N°: 10, se generaron los fragmentos
ns-1 1, ns-1 2 y
ns-1 3 que portan las mutaciones en el promotor y
el flanco de recombinación ns-1. Con los
oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°:
11, SEQ. ID. N°: 12 y SEQ. ID. N°: 13 (introducen las mismas
mutaciones en el promotor pero en la hebra complementaria) se
amplifican los fragmentos TK_{L} 1, TK_{L} 2 y TK_{L} 3.
Estos productos de PCR que solapan en la zona del promotor se
utilizaron como molde para hacer PCR recombinante y amplificar así
los fragmentos que portan las tres versiones del promotor. Los
fragmentos con las tres versiones del promotor se digirieron con
Sph-I y Xho-I y se clonaron en el
plásmido pRedTS digerido con las mismas enzimas. Se obtuvieron tres
plásmidos: pRedTS 1, pRedTS 2 y pRedTS 3 (Figura 2). Estos plásmidos
se transfectaron en células infectadas con los virus WR y
V-Helper y se generaron los virus
W-RedTS 0, W-RedTS 1,
W-RedTS 2 y W-RedTS 3 y
WH-RedTS 0, WH-RedTS 1,
WH-RedTS 2 y WH-RedTS 3. Estos
virus recombinantes son intermediarios para la formación del virus
vaccinia que expresa el replicón de SFV. A partir, del plásmido
pSFVrsGFP, al que se introdujo una mutación en la secuencia de los
genes de las proteínas no estructurales para eliminar una señal de
terminación de la transcripción de vaccinia, y que tiene clonada la
rsGFP en el replicón, se transfectó en células infectadas con los
virus intermediarios. Los virus resultantes W-SFR 0,
W-SFR 1, W-SFR 2 y
W-SFR 3 y WH-SFR 0,
WH-SFR 1, WH-SFR 2 y
WH-SFR 3 se aislaron por la expresión de GFP.
Se diseñaron una serie de clonajes para la
construcción del plásmido pRednsTK que mediante
infección/transfec-
ción en células infectadas con los virus WR y V-Helper generarían los virus recombinantes intermediarios necesarios para el aislamiento del virus vaccinia que expresa el replicón de SFV. Con esta estrategia se pretendía estudiar el requerimiento en 3' del replicón.
ción en células infectadas con los virus WR y V-Helper generarían los virus recombinantes intermediarios necesarios para el aislamiento del virus vaccinia que expresa el replicón de SFV. Con esta estrategia se pretendía estudiar el requerimiento en 3' del replicón.
Partiendo del plásmido pRedTS 1 y por digestión
con BamHI y Nsi-I se eliminó el flanco derecho de la
TK y el fragmento f y se insertó de nuevo el flanco derecho obtenido
por digestión con las mismas enzimas. A este plásmido se le llamó
pRedTK y se le insertó por digestión con BsiWI y BamHI los genes de
las proteínas no estructurales de SFV extraídas del
pSFV-1 (Liljestrom and Garoff 1991) por digestión
con las mismas endonucleasas de restricción y se eliminó el
fragmento ns-1 y el marcador dsRed que se clonó en
un paso posterior. Por PCR, con la pareja de oligonucleótidos
identificados como SEQ. ID. N°: 14 y SEQ. ID. N°: 15, se amplificó
el promotor de vaccinia y el gen de la dsRed con las dianas BamHI y
BgIII en sus extremos y se clonó en el plásmido pnsTK digerido con
BamHI. Este plásmido, pRednsTK, se transfectó en células infectadas
con los virus WR y V-Helper para generar los virus
recombinantes W-RednsTK y WH-RednsTK
(Figura 3). Estos virus recombinantes fueron creados como
intermediarios para la formación del virus vaccinia que expresa el
replicón. El plásmido pRednsTK ha sido depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjasot, Valencia, el 2 de julio
de 2003, correspondiéndole el número de acceso CECT 5824.
Finalmente a partir del pnsRedTK y por digestión
con Sph-I y HindlIl se eliminó la secuencia de los
genes de las proteínas no estructurales de SFV, el promotor de
vaccinia, el marcador dsRed y el flanco izquierdo de la TK y se
clonó la parte final del gen nsP4 y el gen marcador rsGFP
amplificados por PCR a partir del pSFV-rsGFP con los
oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 16 y SEQ. M. N°:
17. El plásmido creado, pMix, tenía los sitios de restricción Xmal
y Stu-I para insertar la secuencia en 3' del
replicón de SFV. Se amplificaron seis fragmentos por PCR: F340,
F340 poli A, F 170, F170 poli A, F70 y F70 poli A (nombrados según
el tamaño y la presencia o no del poli A en la secuencia).
| Pareja de oligonucleótidos | Producto amplificado |
| SEQ. ID. N°: 18 - SEQ. ID. N°: 19 | F de340 nt |
| SEQ. ID. N°: 20 - SEQ. ID. N°: 19 | F de170 nt |
| SEQ. ID. N°: 21 - SEQ. ID. N°: 19 | F de70 nt |
| SEQ. ID. N°: 18 - SEQ. ID. N°: 22 | F de340 nt + poliA |
| SEQ. ID. N°: 20 - SEQ. ID. N°: 22 | F de170 nt + poliA |
| SEQ. ID. N°: 21 - SEQ. ID. N°: 22 | F de70 nt + poliA |
Estos seis fragmentos amplificados por PCR tenían
en sus extremos las dianas de restricción XmaI y
Stu-I diseñados para su posterior inserción en el
plásmido pMix (Figura 4). Los plásmidos generados se transfectaron
en células infectadas con los virus W-Red nsTK y
WH-Red nsTK creando así el virus vaccinia que
expresa el replicón. El plásmido pMix-f70An ha sido
depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT),
Burjasot, Valencia, el 2 de julio de 2003, correspondiéndole el
número de acceso CECT 5825.Asimismo, el plásmido
pRB-Helper, que contiene la secuencia codificante de
las proteínas estructurales de SFV, ha sido depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjasot, Valencia, el 2
de julio de 2003, correspondiéndole el número de acceso CECT
5823.
Dado que las características de los mensajeros
tempranos son más adecuadas para la transcripción de ARNs de mayor
tamaño (Davison and Moss 1989a, Davison and Moss 1989b) se decidió
situar el ADNc del replicón (SFV) bajo el control del promotor de la
timidina quinasa (TK) viral (VV) que es exclusivamente temprano
(Weir and Moss 1987).
Con objeto de ensayar distintas posibilidades en
cuanto a la eficiencia de transcripción, se decidió probar
diferentes promotores TK mutantes con distinta eficiencia (Davison
and Moss 1989a, Davison and Moss 1989b). La secuencia óptima del
promotor y las mutaciones que se introdujeron se describen en la
Tabla 2.
En negrilla y cursiva se marca el nucleótido
mutado de la secuencia del promotor de la TK. Se especifica la
expresión relativa descrita para los diferentes promotores mutados
(Davison and Moss 1989a, Davison and Moss 1989b). Las secuencias
subrayadas corresponden al replicón. La posición de iniciación de
la transcripción se sitúa justo antes del primer nucleótido del
replicón (G) [véase la flecha]
La construcción de los virus vaccinia
recombinantes con promotores mutados y el replicón de SFV, se llevó
a cabo mediante un proceso en dos pasos. En primer lugar, se insertó
en el locus de la TK un marcador visualizable (dsRed) junto con la
secuencia de los extremos 5' y 3' del replicón. Posteriormente se
completó la secuencia del replicón por sustitución del gen dsRed e
incorporación de los genes de las proteínas no estructurales y el
gen exógeno. Este proceso se llevó a cabo tanto a partir del virus
vaccinia WR, como a partir del virus V-Helper
(Lorenzo, Tesis Doctoral, 2001), que contiene los genes de las
proteínas estructurales de SFV. Los virus derivados de WR se
denominaron W-RedTS (virus vaccinia intermediario) y
W-SFRy los derivados de V-Helper se
nombraron WH-RedTS (virus intermediario) y
WH-SFR (Figura 6).
Durante el proceso de aislamiento de los ocho
virus recombinantes, se siguió la expresión de GFP y la estabilidad
del virus recombinante, que es una indicador de la viabilidad o no
viabilidad del recombinante doble. Los resultados se muestran en la
Tabla 3.
| Virus | Secuencia promotor | Recombinante | Expresión |
| estable | GFP | ||
| W-SFR 0 | SEQ. ID. N°: 27 | SI | + |
| W-SFR 1 | SEQ. ID. N°: 28 | SI | + |
| W-SFR 2 | SEQ. ID. N°: 29 | SI | + |
| W-SFR 3 | SEQ. ID. N°: 30 | SI | + |
| WH-SFR 0 | SEQ. ID. N°: 31 | NO | NA |
| WH-SFR 1 | SEQ. ID. N°: 32 | SI | + |
| WH-SFR 2 | SEQ. ID. N°: 33 | NO | NA |
| WH-SFR 3 | SEQ. ID. N°: 34 | NO | NA |
A la izquierda de la tabla se indica el nombre de
los virus con la secuencia mutada del promotor de la TK. La columna
"Recombinante estable" hace referencia a si fue posible el
aislamiento del virus doble recombinante. La expresión de GFP se
visualizó en el microscopio de fluorescencia observando placas de
virus. +: Indica expresión de GFP. NA: No aplicable.
Los resultados sugieren que, mientras en los
virus W-SFR la eficiencia del promotor no afecta a
la viabilidad del virus, sí lo hace en los virus
WH-SFR, lo que apunta a un papel de las proteínas
estructurales de SFV en la replicación y/o expresión génica del
replicón.
Para comprobar si los virus aislados eran
eficientes en la formación de pseudopartículas de SFV (SFPs), se
determinó la presencia de replicones empaquetados en el sobrenadante
de cultivos infectados por dichos virus (Tabla 4). Para ello, se
infectaron células BHK-21 (obtenidas de la ATCC)
con los virus recombinantes W-SFR o
WH-SFR. En paralelo, se realizaron coinfecciones de
dichos recombinantes con el virus V-Helper, que
proporciona "en trans" las proteínas necesarias para el
empaquetamiento del replicón a los virus W-SFR que
no expresan las proteínas estructurales. Se recogieron los
sobrenadantes de las infecciones a las 48 h.p.i. y se filtraron a
través de un filtro de 0,1 \mum para eliminar los virus vaccinia.
Debido al tamaño del virus vaccinia (270 nm x 350 nm (Moss 1990b))
éste queda retenido en el filtro, mientras que las SFPs pasan a
través del filtro. La presencia de SFPs en el medio filtrado se
detectó infectando células BHK-21 y observando las
infecciones en el microscopio de fluorescencia a las 24 h.p.i.,
para ver células con expresión de GFP.
| Virus Recombinante | Expresión GFP | |
| - V-Helper | + V-Helper (SFPs/ml) | |
| W-SFR 0 | \leq 2 | 4 x 10^{5} |
| W-SFR 1 | \leq 2 | 6,4 x 10^{5} |
| W-SFR 2 | \leq 2 | \leq 2 |
| W-SFR 3 | \leq 2 | \leq 2 |
| WH-SFR 1 | 1,1 x 10^{6} | 9,6 x 10^{6} |
Células BHK-21 fueron infectadas
con los virus recombinantes o coinfectadas con los virus
recombinantes y el virus V-Helper. A las 48 h.p.i.
el sobrenadante de la infección se clarificó y filtró a través de
filtros de 0,1 \mum para eliminar las partículas virales de
vaccinia. Con 500 \mul y 50 \mul de los sobrenadantes se
infectaron células BHK-21 y se observaron a las 24
h.p.i. en el microscopio de fluorescencia para detectar expresión
de GFP. \leq 2 indica que no se detectó ninguna célula con
fluorescencia de GFP en el cultivo.
Los resultados obtenidos (Tablas 3 y 4) indican
que la versión más fuerte del promotor (versión 0) dio como
resultado la imposibilidad de aislar el recombinante
correspondiente. Por otro lado, las versiones más débiles
(versiones 2 y 3) resultaban en una baja expresión de GFP o en una
baja producción de partículas. Por tanto, basándose en la
viabilidad, expresión de GFP y capacidad de producción de
partículas, se escogió la versión del promotor número 1 como la más
adecuada para posteriores experimentos.
Para determinar cuál es el requerimiento mínimo
de la secuencia del extremo 3' del replicón de SFV en cuanto a la
expresión del gen exógeno y formación de SFPs, se construyeron una
serie de virus recombinantes conteniendo diferentes versiones del
replicón de SFV con variaciones en la secuencia del extremo 3' del
mismo.
En primer lugar, se crearon los virus vaccinia
recombinantes que contienen (en el locus de la TK) la secuencia de
los genes de las proteínas no estructurales de SFV bajo la versión 1
del promotor de la TK y el gen marcador dsRed. Se aislaron los
virus W-RednsTK y WH-RednsTK a
partir de los virus WR o V-Helper, respectivamente.
Estos virus son intermediarios para el aislamiento del virus
recombinante con el replicón completo.
El siguiente paso fue incorporar seis fragmentos
de distintos tamaños (340, 170 y 70 nucleótidos incluyendo o no la
secuencia del PoliA) correspondientes a la zona del extremo 3' del
replicón que servirían para estudiar el requerimiento mínimo del
extremo 3' del replicón. Estas 6 versiones se insertaron tanto en
el virus derivado de WR como en el derivado de
V-Helper. De esta manera se aislaron los virus
W-SFR 340, W-SFR 170 y
W-SFR 70 o WH-SFR 340,
WH-SFR 170 y WH-SFR 70 (Figura 7)
que contenían en su genoma el replicón con o sin la secuencia PoliA
derivada del ADNc del replicón.
Tras las
infecciones-transfecciones con los plásmidos
carentes de PoliA no se detectaron células con fluorescencia verde,
por lo que se dedujo que en dichas construcciones no había
expresión mediada por el replicón. Al plaquear la progenie de estos
cultivos infectados, la mayor parte de las placas de virus
mostraban fluorescencia roja correspondiente al virus parental
(Figura 7) y se detectó un pequeño porcentaje de placas dsRed (-)
que correspondía al virus recombinante. Estas placas no mostraban
ninguna fluorescencia verde. Por tanto, la presencia de secuencia
PoliA en el extremo 3' del replicón es necesaria para que se
produzca expresión del gen exógeno.
- Se muestra el esquema de las construcciones realizadas en virus vaccinia que contienen el replicón con distintos tamaños del extremo 3' del replicón y con o sin PoliA (An). La expresión de GFP se visualizó observando las placas de virus recombinantes en el microscopio de fluorescencia. +: Indica presencia de placas que expresan GFP. -: Indica que las placas correspondientes a los virus recombinantes fueron GFP (-).
Los virus que portaban la secuencia PoliA de SFV
y distintos tamaños de la secuencia del extremo 3' del replicón
crecían a títulos elevados, comparables a los del virus parental. La
versión con la secuencia de 70 nucleótidos en el extremo 3' fue la
más fácil de aislar tanto en el virus WH-SFR
(contiene los genes de las proteínas estructurales) como en
W-SFR. El aislamiento de los virus
W-SFR y WH-SFR con las otras dos
versiones, de 340 y 170 nucleótidos, precisó más rondas de
purificación para aislar los virus dobles recombinantes.
Estos resultados indican que 70 nucleótidos de
extremo 3' del replicón son suficientes y que la secuencia PoliA es
necesaria para la correcta expresión del gen exógeno mediada por el
replicón. En consecuencia, todos los resultados posteriores se
refieren a las versiones que contienen 70 nucleótidos el posición
3' y la secuencia poliA del replicón.
Con el fin de comprobar si las construcciones
W-SFR y WH-SFR, con las tres
versiones del extremo 3' del replicón, eran capaces de empaquetar
el replicón para formar partículas de ciclo único (SFPs) se
hicieron infecciones con los virus recombinantes o coinfecciones con
los virus recombinantes y el virus V-Helper en
células BHK y se comprobó la producción de SFPs en el sobrenadante
de los cultivos a las 24 horas.
| Virus Recombinante | Producción de SFPs (SFPs/ml) | |
| - V-Helper | + V-Helper | |
| W-SFR 340 | \leq 2 | 2,9 x 10^{5} |
| W-SFR 170 | \leq 2 | 3,05 x 10^{5} |
| W-SFR 70 | \leq 2 | 2,1 x 10^{5} |
| WH-SFR 340 | 1,3 x 10^{5} | 2,3 x 10^{5} |
| WH-SFR 70 | 3,7 x 10^{5} | 4 x 10^{5} |
Se infectaron células BHK-21 con
los virus recombinantes especificados a la izquierda de la Tabla 6
(incluyendo el poli A del replicón) o coinfectadas con los virus
recombinantes y el virus V-Helper. A las 48 h.p.i.
se recogió el medio de la infección, se clarificó y filtró a través
de filtros de 0,1 \mum. Con 500 \mul o 50 \mul del medio
filtrado se infectaron monocapas de células BHK-21.
A las 24 h.p.i. se observaron en el microscopio de fluorescencia y
se contó el número de células que expresan GFP.
Los resultados indican que la presencia del
replicón en ausencia de proteínas estructurales no produce
cantidades detectables de SFPs. Sin embargo, la coinfección de
recombinantes que transcriben el replicón con el virus
V-Helper produjo títulos elevados (\leq 10^{5})
de SFPs, indicando que las proteínas estructurales expresadas por
el V-Helper son capaces de empaquetar el replicón.
Asimismo, los virus recombinantes WH-SFR 34OAn y
WH-SFR 70An fueron capaces, sin coinfección, de
producir títulos similares de SFPs. Una vez que se comprobó que las
dos versiones del virus recombinante WH-SFR
funcionaban correctamente y producían títulos similares de SFPs, se
escogió los virus W-SFR 70 y WH-SFR
70 (con la versión de 70 nucleótidos y secuencia poliA) como los
más idóneos para su posterior caracterización.
Con objeto de comparar la morfología de placa de
los dos virus vaccinia recombinantes aislados,
W-SFR 70 y WH-SFR 70, se hizo un
plaqueo del stock de estos virus recombinantes en células
BSC-1 en medio líquido. Como se puede observar en la
Figura 8 la infección con el virus W-SFR 70 dio
lugar a placas normales de virus vaccinia. Por el contrario, el
virus recombinante WH-SFR 70 dio lugar a placas en
formas de cometa. Presumiblemente esto se debe a la producción de
partículas (SFPs) que se liberan al medio e infectan las células
adyacentes. De hecho, el fenotipo de placa en forma de corneta está
descrito para cepas del virus vaccinia que liberan grandes
cantidades de virus extracelular. Por el contrario, la morfología de
placa del virus W-SFR 70 es congruente con el hecho
de que no forma partículas.
Una observación inesperada en los plaqueos del
stock del virus WH-SFR 70 fue la presencia de una
pequeña proporción de placas redondas que no se correspondían con el
fenotipo de placa en forma de cometa. Al observar estas placas al
microscopio de fluorescencia, se comprobó que estas placas no
expresaban GFP. Virus aislados de estas placas y recrecidos
mantuvieron el fenotipo GFP (-) por lo que posiblemente son virus
mutantes que han perdido la capacidad de expresar GFP mediante el
replicón SFV.
Con el fin de comprobar la presencia y morfología
de partículas generadas a partir del virus vaccinia
WH-SFR 70, se examinaron por microsocopía
electrónica células Hela (obtenidas de la ATCC) infectadas con los
virus WR (virus vaccinia control), W-SFR 70 (virus
vaccinia recombinante que expresa el replicón) o
WH-SFR 70 (virus recombinante que forma
partículas).
En las tres muestras se distinguieron con
facilidad las diferentes formas morfogenéticas distintivas de la
infección con vaccinia, incluyendo virus inmaduros, virus
intracelulares maduros (IMVs), virus intracelulares envueltos
(IEVs) y virus envueltos asociados a células (CEVs) (Figuras 9 y
10).
En células infectadas con WH-SFR
70 resultaba aparente la presencia, en o cerca de la membrana
plasmática, de partículas redondeadas de un tamaño (48 +/- 4)
considerablemente inferior al del virus vaccinia (200+/- 20)
(Figura 9). Estas partículas, que en muchos casos aparecían
formando acúmulos, son indistinguibles en tamaño y aspecto a los
viriones maduros de SFV (Strauss and Strauss 1994). Asimismo, se
observaron frecuentemente imágenes típicas de gemación de dichas
partículas en la membrana plasmática. El tipo y forma de las
partículas fue idéntico en células tratadas con IMCBH
(N-isonicotinol-N-3-metil-clorobenzoilhidracina).
\newpage
Estos resultados junto con la detección de la
actividad del replicón en los sobrenadantes de los cultivos
infectados y el fenotipo de placa del virus WH-SFR
70 indican que el replicón está siendo empaquetado correctamente en
partículas morfológica y funcionalmente equivalentes al virus
SFV.
En el sistema de expresión basado en SFV se
utiliza habitualmente la línea celular BHK, en la que se obtienen
niveles altos de expresión y producción de partículas. Por otra
parte, el virus vaccinia se crece y titula habitualmente en células
humanas o de mono.
Con objeto de determinar la eficiencia en la
producción de SFPs a partir del virus WH-SFR 70 en
distintas líneas celulares y cuantificar la producción viral, se
realizó un estudio en las líneas celulares: BSC-1,
CV-1, Cos, Hela, LoVo, BHK, RK-13 y
Vero (obtenidas de la ATCC). Para comprobar la formación de virus
vaccinia y pseudopartículas de SFV, tras la infección de dichas
líneas celulares se valoró la producción de SFPs, virus vaccinia
extracelular y virus vaccinia asociado a células.
La producción de SFPs a partir del virus
WH-SFR 70 se cuantificó utilizando diluciones del
sobrenadante clarificado de la infección que se usaron para infectar
monocapas de células BHK.
De los resultados de la Figura 11 se deduce que
no hay grandes variaciones en la producción de SFPs en las líneas
celulares empleadas, a excepción de las células Vero en las que se
produjo un menor título de partículas. Entre las líneas ensayadas,
las celulas Hela fueron las que mayor eficiencia tuvieron en la
producción de SFPs, por lo que fue la escogida para los posteriores
ensayos de caracterización del virus WH-SFR 70.
Con el fin de caracterizar las propiedades
biológicas del virus WH-SFR 70, se determinó la
producción de virus vaccinia en distintas líneas celulares. Para
ello, se infectaron las líneas celulares antes descritas con el
virus recombinante WH-SFR 70 y a las 24 h.p.i. se
cuantificó la producción de virus extracelular y virus asociado a
células.
Como se observa en la Figura 12 la producción de
virus extracelular y virus asociado a células a partir del virus
WH-SFR 70 fue muy similar en las distintas líneas
celulares empleadas y fue comparable a la de otros virus
recombinantes. Entre las líneas celulares ensayadas, hubo un ligero
descenso en la producción viral en las células Vero.
Por lo tanto, en términos generales la producción
de virus vaccinia del virus recombinante WH-SFR 70
no se ve afectada por la línea celular en la que se realiza la
infección, siendo la producción similar a la obtenida con otros
virus recombinantes.
Uno de los parámetros que se estudió para
optimizar la expresión y producción de partículas a partir del
virus WH-SFR 70 es el tiempo
post-infección al que se debían recoger las células
infectadas para obtener el mayor título de partículas. Además, se
evaluó la utilización de drogas que afectan a la replicación o
morfogénesis del virus vaccinia (Tabla 7), que en principio no
deberían afectar al replicón o a su empaquetamiento, ya que son
drogas específicas de ADN (Ara C) o de la morfogénesis de vaccinia
(rifampicina o IMCBH).
| Droga | Efecto | Concentración |
| Empleada (\mug/ml) | ||
| Ara C | Inhibe replicación (síntesis de ADN) | 100 |
| Rifampicina | Inhibe formación de IMV y EEV | 100 |
| IMCBH | Inhibe formación de EEV | 10 |
Con objeto de determinar el tiempo
post-infección óptimo para la producción de
partículas de SFV a partir del virus WH-SFR 70 se
hizo una infección con el virus y se tomaron muestras cada 12 horas
hasta un máximo de 48 horas.
En el cultivo infectado sin inhibidor se observó
un incremento en el título de partículas hasta las 36 horas
post-infección donde alcanza la máxima producción.
El IMCBH y la Rifampicina no afectan ala formación de SFPs por el
virus WH-SFR 70 (Figura 13). La adición de Ara C,
en principio no debería afectar negativamente a la replicación del
replicón, ya que el Ara C es específico de ADN y no afecta a la
síntesis de ARN. Por tanto, el efecto observado se deriva
probablemente de una disminución de la cantidad de proteínas
estructurales necesarias para empaquetar el replicón.
En los cultivos tratados con Ara C se observa una
cierta producción de partículas en las primeras horas de la
infección, lo cual es congruente con la expresión exclusivamente
temprana de las proteínas estructurales de SFV en presencia de Ara
C.
A la vista de los resultados, el tiempo óptimo
post-infección para la formación de SFPs a partir
del virus WH-SFR 70 es de 24 a 36 h.p.i. La adición
de IMCBH incrementa ligeramente el título de partículas.
Se estudió la producción de virus vaccinia
extracelular y asociado a células a partir del virus recombinante
WH-SFR 70 en presencia de los inhibidores del virus
vaccinia Ara C, IMCBH (Payne and Kristenson 1979) y Rifampicina
(Moss, Rosenblum et al. 1969). Con este fin se infectaron células
Hela con el virus WH-SFR 70 y a las 24 h.p.i. se
cuantificó el virus extracelular en el sobrenadante de la infección
y el virus asociado a célula.
Como ya está descrito, el AraC y la Rifampicina
(Moss, Rosenblum et al. 1969) disminuyen la producción de virus
vaccinia extracelular e intracelular. La producción de virus
extracelular y asociado a célula del virus WH-SFR 70
fue comparable a la de otros virus recombinantes y se ajusta al
patrón esperado. El IMCBH inhibe la formación de virus extracelular
envuelto (Payne and Kristenson 1979), así el porcentaje de la
producción de virus extracelular del virus WH-SFR
70 se redujo hasta un 80% con respecto al control sin inhibidor
mientras la producción de IMV disminuyó solo un 20% en presencia de
la droga.
Se puede concluir que el comportamiento del virus
WH-SFR 70 en la producción viral en presencia de
inhibidores del virus vaccinia es comparable a la de otros virus
vaccinia recombinantes.
Teniendo en cuenta los resultados de la cinética
de producción de SFPs (Figura 13) y de virus vaccinia (Figura 14)
se concluye que las condiciones más adecuadas para la producción de
SFPs a partir del virus WH-SFR 70 son 36 h.p.i. y en
presencia de IMCBH para disminuir la cantidad de virus vaccinia en
el medio. En estas condiciones se consiguen reproduciblemente
títulos de de SFPs próximos a 10^{8} SFPs/ml.
Una cuestión importante acerca del uso de SFV
como vector de expresión es la posibilidad de formación de virus
Semliki Forest completo, debido a un proceso de recombinación de
ARN. En el sistema de expresión basado en SFV el virus puede
generarse por recombinación entre las moléculas transfectadas de
ARN recombinante (replicón) y el mensajero que contiene los genes
de las proteínas estructurales (Geigenmüller-Gnirke,
Weiss et al. 1991), (Weiss and Schlesinger 1991). En el modelo del
virus Sindbis también está descrito que ocurre recombinación entre
los transcritos defectivos y que se debe a un intercambio de moldes
durante al replicación del ARN (Weiss and Schlesinger 1991).
Está estimado que en el método basado en la
transfección de ARNs transcritos "in vitro", la
frecuencia de virus infectivos encontrados en un stock de partículas
empaquetadas es de 10^{-6} a 10^{-4} lo cual implica la
existencia de virus SFV infectivos en cualquier stock de partículas
preparadas por el método descrito. Aunque esto no es muy importante
para el resultado de un experimento de expresión, sí que constituye
un potencial riesgo en bioseguridad y limita sus aplicaciones
"in vivo".
Considerando el diferente diseño de nuestro
sistema de producción de partículas nos pareció interesante
comprobar si en el sistema de formación de SFPs a partir del virus
vaccinia WH-SFR 70 se forman virus Semliki Forest
viables. Con este fin se infectaron células BHK con el stock de
10^{7} partículas que expresan GFP. A las 48 h.p.i. la monocapa de
células infectadas se observó al microscopio de fluorescencia y se
detectaron células que expresaban GFP. El sobrenadante de esta
infección se recogió, clarificó y filtró con un filtro de 0,1 \mum
y se utilizó para infectar un nuevo cultivo de células BHK. En
paralelo, el sobrenadante se tituló en células BHK en medio
semisólido para poder distinguir las placas de SFV. En ninguno de
los dos casos se encontró evidencias de infección por virus
SFV.
Por tanto se puede concluir que la frecuencia de
generación de virus SFV viables en nuestro sistema es menor que en
el sistema basado en transfección de plásmidos.
El objetivo de este ejemplo ha sido combinar dos
tipos de vectores, uno basado en ADN (virus vaccinia) y un segundo
basado en ARN (virus Semliki Forest), para generar un vector que
actúe como lanzadera del segundo (SFV).
Los vectores de expresión basados en Alfavirus se
han generado mediante la sustitución de los genes que codifican
para las proteínas estructurales del virus por un gen heterólogo,
manteniendo el control transcripcional el promotor altamente activo
del ARN subgenómico (Berglund et al., 1993), (Liljestrom &
Garoff, 1991). El ARN del replicón puede ser transcrito in
vitro y usado directamente por transfección o empaquetado en
partículas infecciosas por cotransfección en cultivo celular con
una molécula de ARN Helper defectivo, que proporciona, en
trans, las proteínas estructurales del virión (Liljestrom
& Garoff, 1991), (Bredenbeek et al., 1993).
Para conseguir la transcripción del replicón SFV,
se ha construido un virus vaccinia recombinante que porta en su
genoma un replicón completo insertado en el locus de la timidina
quinasa (TK) bajo el control del promotor natural temprano de la TK.
Adicionalmente, se generó un vaccinia recombinante que además
expresaba los genes de las proteínas estructurales de SFV en el
locus del gen F13L bajo un promotor viral temprano/tardío. Este
trabajo es la primera comunicación de un sistema así diseñado. En
trabajos publicados hay aproximaciones diferentes. Por ejemplo, hay
descrito un trabajo con el virus vaccinia como vector híbrido para
producir partículas de un vector retroviral en células
empaquetadoras (Holzer & Falkner, 2003).
En el desarrollo del vector combinado
VV-SFV, se han estudiado diferentes aspectos
importantes para la viabilidad del sistema. En primer lugar,
experimentos previos habían demostrado la compatibilidad de las
infecciones de vaccinia y el virus Semliki Forest. En este trabajo
se ha estudiado, además, los requerimientos con respecto al promotor
para la transcripción del replicón, y los requerimientos con
respecto al extremo 3' del replicón.
El primer paso fue estudiar el promotor del virus
vaccinia bajo el cual se iba a expresar el replicón. La
construcción de los virus recombinantes que expresan el replicón con
cuatro versiones del promotor, de distinta fuerza en la expresión,
sirvió para estudiar la influencia del promotor en el aislamiento y
correcto funcionamiento de estos virus. Los resultados demuestran
que una transcripción muy activa del replicón del virus vaccinia
impedía el aislamiento de los virus recombinantes. Por otro lado,
las versiones del promotor con una expresión débil del replicón
resultaban en una muy baja expresión del gen exógeno. Con una
versión del promotor intermedia se logró aislar el virus vaccinia
recombinante y se comprobó que era eficiente en la expresión de la
proteína exógena y en la formación de partículas de SFV.
Otro aspecto importante en el aislamiento y
eficiencia de estos virus es el requerimiento de secuencia en el
extremo 3' del replicón. El replicón contiene en su secuencia el gen
de la replicasa, el promotor subgenómico seguido del gen heterólogo
que se desea expresar y las regiones de los extremos 5' y 3' del
genoma requeridos para la replicación del ARN (Niesters &
Strauss, 1990), (Kuhn et al., 1990). Las construcciones realizadas
con distintos tamaños de la secuencia del extremo 3' con y sin
PoliA revelaron la necesidad de secuencia PoliA en el extremo 3'
del replicón, independientemente de la cantidad de secuencia
adyacente incluida. Es de reseñar que la secuencia PoliA incluida
en las construcciones deriva del ADN complementario derivado de
SFV, y que en cualquier caso, los mensajeros tempranos de vaccinia
son poliadenilados en su extremo 3'. Por tanto, los resultados
sugieren la necesidad, no sólamente del requerimiento de secuencia
PoliA, sino más propiamente la necesidad de un PoliA posicionado
correctamente.
Con respecto a los requerimientos de secuencia en
3', los resultados indican que 70 nucleótidos son suficientes para
el funcionamiento del replicón. Por consiguiente, los virus
escogidos para su posterior caracterización fueron aquellos que
contienen la versión "1" del promotor, y el replicón con 70
nucleótidos de secuencia no traducida del 3' y una cola de
PoliA.
El conjunto de resultados apoya la idea de que en
el sistema del vector combinado WH-SFR 70 se
producen pseudopartículas que contienen replicones funcionales
empaquetados, iguales a los generados por el sistema tradicional de
SFV. Esta afirmación se apoya en diferentes observaciones:
- i)
- la presencia, en sobrenadantes de células infectadas por WH-SFR 70, de partículas de pequeño tamaño (filtrables por filtros de 100 nm) que infectan y producen expresión del gen heterólogo en nuevas células;
- ii)
- el fenotipo de placa del virus WH-SFR 70, en forma de corneta, que es indicativo de la liberación de partículas infectivas al medio de cultivo; y
- iii)
- la observación de partículas de simetría icosaédrica, similares al virus SFV, en células infectadas por WH-SFR 70, cuando se observan al microscopio electrónico.
Todas estas observaciones no ocurren para el
virus W-SFR 70, lo que demuestra el requerimiento
de las proteínas estructurales de SFV para que se dé el
empaquetamiento de los replicones.
Una observación importante es la aparición, en
los stocks de virus W-SFR 70 y
WH-SFR 70, de mutantes que han perdido la expresión
mediada por el replicón. Esto puede estar derivado de una
inestabilidad intrínseca de la construcción, o bien de que la
replicación del replicón compita en cierta medida con la
replicación de vaccinia, perjudicando a éste. En este último caso
es probable que dichos mutantes, aunque se produzcan muy
infrecuentemente, crezcan con más rapidez y por tanto se
enriquezcan rápidamente al llevar a cabo el crecimiento de los
stocks de virus. Evidentemente esto constituye un problema práctico
importante para el uso del sistema, y deberá ser objeto de futuros
estudios.
Un aspecto crucial relativo a la utilidad y
seguridad del sistema de expresión basado en SFV es la posibilidad
de que alguna partícula de virus SFV salvaje pueda surgir por
recombinación entre las moléculas de ARN del replicón y el ARN
Helper. En el sistema original, basado en cotransfección de ARN,
está descrito que pueden ocurrir tales eventos de recombinación de
ARN, lo que resulta en la generación de una población de virus SFV
infectivo (Geigenmüller-Gnirke et al., 1991),
(Weiss & Schlesinger, 1991). Puesto que el sistema de expresión
proporcionado por esta invención es radicalmente diferente en cuanto
a diseño, se procedió a comprobar si generaban virus SFV infectivos
a partir del virus WH-SFR 70. Para ello se infectó
una monocapa de células con el stock de 10^{7} partículas de SFV y
después de dos rondas de amplificación no se detectó ningún virus
SFV viable. Este resultado sugiere que el sistema de
VV-SFV supone una mejora respecto a los sistemas de
cotransfección clásicos.
Las aplicaciones del vector combinado
VV-SFV pueden ser varias. En primer lugar, podría
utilizarse como sistema para generar replicones empaquetados. Esta
aproximación tiene como ventaja respecto al método clásico el hecho
de que no seria necesaria la transcripción in vitro y
electroporación del ARN, por lo que el procedimiento puede ser
fácilmente escalable. Adicionalmente, la baja o nula formación de
virus SFV viables es una ventaja sustancial.
Una segunda aplicación potencial, quizá más
interesante, es el uso de vectores combinados de este tipo en la
inmunización contra enfermedades, es decir, su uso directamente
como vacunas recombinantes. Los vectores combinados podrían ser más
efectivos que los vectores singulares por separado, ya que pueden
provocar una amplificación en la expresión del antígeno, así como
su presentación al sistema inmune en dos contextos celulares
diferentes.
En la inmunización con el virus vaccinia la
respuesta del huésped está dirigida frente a las proteínas del
virus más el antígeno que queremos expresar. En ocasiones, primero
se vacuna con ADN para provocar una respuesta primaria frente a las
proteínas del virus, y después con el virus recombinante para
generar una respuesta secundaria frente a la proteína que se utiliza
como antígeno. Con el procedimiento de expresión de partículas de
Alfavirus basado en el virus vaccinia se singulariza la respuesta
inmune del huésped frente a una sola proteína, ya que la proteína
heteróloga es la única que se expresa masivamente tanto en células
infectadas con el vaccinia recombinante como en células infectadas
por pseudopartículas de SFV. El sistema del replicón forma
partículas que aumentan la expresión del antígeno y se podría
esperar que se diseminase de una manera más eficaz y rápida en el
huésped, centralizando la respuesta del huésped a una sola
proteína.
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comprenden un ADN complementario de un replicón de un virus ARN y
sus aplicaciones
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<160> 34
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<170> Patentln version 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido TK_{LL}
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<400> 1
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\dddseqskipgcttttgcat gcaataaatg gatcacaa
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido TK_{LR\text{*}}
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\dddseqskipgacactcgag aattaattat ttttcact
\hfill28
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido SFV 11370 Bam
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<400> 3
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido SFV 11900 Bgl
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido SFV 700 Xho
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<400> 5
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\hfill25
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<210> 6
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido ns-1
Sal
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\hfill25
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<210> 7
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido pTK1f
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<400> 7
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\dddseqskipgaataaagtg aacaataatt aattctcgac
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido pTK2f
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<400> 8
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\dddseqskipgaataaagcg aacaataatt aattctcgac
\hfill30
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido pTK3f
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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\dddseqskipgaataaagtc aacaataatt aattctcgac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido SFV 700 Xho
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipcacctgctcg agggcccagt ttgtg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido pTK1R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgaattaatta ttgttcactt tattcgact
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido pTK2R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgaattaatta ttgttcgctt tattcgact
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido pTK3R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgaattaatta ttgttgactt tattcgact
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Red Bam 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgtcttaggat ccaactcgag aaaaat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Red Bgl 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptctccagatc tataaaaatt atttat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
ns-4f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipcggtcggcat gcaacgagat gtca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido SFVGFP Hind
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgggatgtaat aagcttaatt acccgg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido F 340 Xma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgcagaaaatc ccgggtggtc tggg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido F Stu R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptttggaaggc ctaaaaacca attgca
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido F 170 Xma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipctgtatcccg ggtaacaaag cgcaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido F 70 Xma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipggcaataccc gggagcttac ataag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido F Stu R poli A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgcgcgtaggc ctattcatta atgca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor mutado de la timidina
quinasa de virus vaccinia "0"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtgaaa aataattaat tctcgacaga tggcgga
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor mutado de la timidina
quinasa de virus vaccinia "1"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtgaac aataattaat tctcgacaga tggcgga
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<211>37
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor mutado de la timidina
quinasa de virus vaccinia "2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagcgaac aataattaat tctcgacaga tggcgga
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor mutado de la timidina
quinasa de virus vaccinia "3"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtcaac aataattaat tctcgacaga tggcgga
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus W-SFR
0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtgaaa aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus W-SFR
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtgaac aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus W-SFR
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagcgaac aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus W-SFR
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtcaac aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus WH-SFR
0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtgaaa aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus WH-SFR
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtgaac aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210>33
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus WH-SFR
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagcgaac aataa
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Promotor virus WH-SFR
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptaaagtcaac aataa
\hfill15
Claims (19)
1. Un virus ADN recombinante que comprende la
totalidad o parte del genoma de un virus ADN y una secuencia de ADN
complementario (ADNc) de un replicón derivado de un virus ARN que
contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
exógena o un fragmento de la misma.
2. Virus recombinante según la reivindicación 1,
que comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica
proteínas estructurales de dicho virus ARN o proteínas
encapsidadoras que empaqueten y transmitan el replicón.
3. Virus recombinante según la reivindicación 1 ó
2, en el que dicho virus ADN es un virus ADN de doble banda.
4. Virus recombinante según la reivindicación 3,
en el que dicho virus ADN se selecciona entre poxvirus, herpesvirus
y adenovirus.
5. Virus recombinante según la reivindicación 4,
en el que dicho virus ADN es un virus vaccinia.
6. Virus recombinante según la reivindicación 1 ó
2, en el que dicho virus ARN se selecciona del grupo formado por
los virus ARN se selecciona del grupo formada por rvirus ARN de
cadena simple con polaridad positiva, virus ARN de cadena simple con
polaridad negativa, virus ARN con genoma segmentado, virus ARN de
cadena doble y retrovirus.
7. Virus recombinante según la reivindicación 6,
en el que dicho virus ARN es un alfavirus.
8. Virus recombinante según la reivindicación 7,
en el que dicho alfavirus es el virus Semliki Forest (SFV).
9. Virus recombinante según la reivindicación 1,
en el que dicha secuencia de ADNc del replicón del virus ARN
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la replicasa de
dicho virus ARN, la secuencia de nucleótidos de un promotor
subgenómico seguida de la secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína exógenarf o un fragmento de la misma, las regiones del
genoma de dicho virus ARN necesarias para la replicación del ARN y
las señales de encapsidación del ARN.
10. Virus recombinante según la reivindicación 1,
en el que dicha secuencia de ADNc de un replicón derivado de un
virus ARN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína exógena se encuentra bajo el control de un promotor de
transcripción de dicho virus ADN.
11. Virus recombinante según la reivindicación
10, en el que dicho virus ADN es el virus vaccinia y dicho promotor
de transcripción es un promotor temprano del virus vaccinia.
12. Virus recombinante según la reivindicación 2,
en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas
estructurales de dicho virus ARN se encuentra bajo el control de un
promotor de transcripción de dicho virus ADN.
13. Virus recombinante según la reivindicación
12, en el que dicho virus ADN es el virus vaccinia y dicho promotor
de transcripción es un promotor temprano/tardío del virus
vaccinia.
14. Virus recombinante según la reivindicación 1,
en el que dicha proteína exógena, o fragmento de la misma, es una
proteína biológicamente activa, una proteína reportera, una
proteína citotóxica, una proteína de un patógeno, una proteína con
actividad inmunomoduladora, una proteína de un tumor, un antígeno o
un epítopo de un antígeno.
15. Virus recombinante según la reivindicación
14, en el que dicha proteína exógena, o fragmento de la misma, se
selecciona entre la glicoproteína gp 120 del virus de la
inmunodeficiencia humana (Val) causante del SIDA, la glicoproteína
E2 del virus de la Peste Porcina Clásica, el antígeno de superficie
del virus de la Hepatitis B (HBV) y la timidina quinasa del virus
Herpes Simple.
16. Un procedimiento para la producción de
partículas virales quiméricas defectivas de ciclo único conteniendo
un replicón de un virus ARN que comprende infectar células
competentes con virus ADN recombinantes según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 15.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, que
comprende, además, retirar las partículas virales producidas.
18. Una composición farmacéutica que comprende
virus ADN recombinantes según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
19. Un método para producir un proteína, o un
fragmento de la misma, de interés, que comprende infectar una
célula competente con virus ADN recombinantes según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 15, y, si se desea, recuperar dicha
proteína de interés o fragmento de la misma.
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| LUNDSTROM, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. TRENDS in Biotechnology. Marzo 2003, Vol. 21, N 3, paginas 117-122. * |
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| VAN RIJN, P.A.; VAN GENNIP, H.G.P.; MOORMANN, R.J.M. An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV). Vaccine, 1999, Vol. 17, paginas 433-440. * |
| VAN RIJN, P.A.; VAN GENNIP, H.G.P.; MOORMANN, R.J.M. An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV). Vaccine, 1999, Vol. 17, páginas 433-440. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1642982B1 (en) | 2013-05-22 |
| WO2005003363A1 (es) | 2005-01-13 |
| EP1642982A1 (en) | 2006-04-05 |
| ES2222095B1 (es) | 2005-11-16 |
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