ES2218529T3 - Uso de la hormona del crecimiento para la produccion de un medicamento para el tratamiento de lesiones isquemicas en el cerebro y demencia. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE HORMONAS DE CRECIMIENTO (GH) O DE ANALOGOS DE LAS MISMAS PARA LA PRODUCCION DE UN MEDICAMENTO QUE PROPORCIONE UNA MAYOR CONCENTRACION DE GH, FACTOR DE CRECIMIENTO I TIPO INSULINA (IGF-I), IGFBP-3 E INMUNORREACTIVIDAD A LA {BE}-ENDORFINA EN EL LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO.

Description

Uso de la hormona del crecimiento para la producción de un medicamento para el tratamiento de lesiones isquémicas en el cerebro y demencia.

El invento se refiere al uso de la hormona del crecimiento (GH; del inglés, growth hormone) o compuestos análogos de la misma, para la producción de un medicamento que proporciona una concentración aumentada de GH, factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I; del inglés, insuline-like growth factor I), proteína 3 ligante de factores de crecimiento de tipo insulina (IGFBP-3; del inglés, insuline-like growth factor binding protein 3) e inmunorreactividad de \beta-endorfina (\beta-EP; del inglés, \beta-endorphin) en el líquido cefalorraquídeo.

Introducción

Pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento no sustituida se quejan a menudo de fatiga general, falta de concentración e incapacidades relativas a la memoria. La fatiga reduce su capacidad laboral global, con consecuencias negativas para la profesión y las actividades diarias de los pacientes. Durante los últimos años, métodos para evaluar la calidad de vida de un modo validado han descrito la calidad y la magnitud del problema psicosocial asociado con la deficiencia de hormona del crecimiento en adultos (1).

Se ha mostrado recientemente que el tratamiento de pacientes que tienen deficiencia de hormona del crecimiento con hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH) afecta al bienestar psicológico de los pacientes (1,2) en sólo algunas semanas. No se conocen los mecanismos fisiológicos que hay detrás de esta mejora, pero podría ser debida a un efecto directo de la GH sobre células del cerebro o ser secundaria a la producción de sustancias de bajo peso molecular que atraviesan la barrera hematoencefálica. El efecto podría ser también el resultado de una alteración de la composición corporal que se produjera como resultado del tratamiento con GH. Es interesante que se hayan hallado receptores de GH en muchas zonas del cerebro, tales como, por ejemplo, el plexo coroideo, el hipocampo, el hipotálamo y la hipófisis (3,4). Se ha sugerido que la presencia de receptores de GH en el plexo coroideo está implicada en un mecanismo para el transporte de la hormona al otro lado de la barrera hematoencefálica (4). Se ha hallado GH en bajas concentraciones en el líquido cefalorraquídeo (CSF; del inglés, cerebrospinal fluid) de seres humanos (5), pero no se sabe si la rhGH atraviesa la barrera de sangre-CSF. Una inyección intraperitoneal de GH de rata, marcada con ^{125}I, da lugar a una acumulación de radiactividad en varias zonas cerebrales, lo que sugiere que la GH atraviesa la barrera hematoencefálica en la rata (6). Además, se ha aislado factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) del cerebro humano (6a) y hay una amplia distribución de receptores de IGF-I por todo el cerebro (6b).

La distribución de IGF-I en ratas después de una lesión hipóxica-isquémica en el cerebro y los efectos de la misma en cuanto a reducir \beta-endorfinas neuronales, que se producen principalmente en la hipófisis y el hipotálamo, se han asociado con una mejoría del humor después del ejercicio (7). Se ha sugerido también que la depresión está asociada con una hipoactividad del sistema opioide endógeno, mientras que la manía refleja una hiperactividad del sistema (8). En trastornos afectivos también se han hallado cambios en las concentraciones de monoaminas (9), y el tratamiento de ratas hipofisectomizadas y normales con GH influye en las concentraciones cerebrales de monoaminas (10).

Para caracterizar los cambios bioquímicos de pacientes con deficiencia de hormona del crecimiento en respuesta a rhGH, se han estudiado ahora los efectos del tratamiento con rhGH, durante un mes, sobre las concentraciones de GH, IGF-I, IGFBP-3, péptidos opioides, neuropéptidos y metabolitos de monoaminas en el líquido cefalorraquídeo.

El invento se refiere al uso de la hormona del crecimiento o compuestos análogos de la misma, para la producción de un medicamento que proporcione una concentración aumentada de hormona del crecimiento en el líquido cefalorraquídeo. Se refiere también al uso de la hormona del crecimiento o compuestos análogos de la misma, para la producción de un medicamento que proporcione una concentración aumentada de IGF-I, IGFBP-3 e inmunorreactividad de \beta-endorfina en el líquido cefalorraquídeo.

Se ha observado que la hormona del crecimiento administrada atraviesa la barrera de sangre-líquido cefalorraquídeo y, de ese modo, proporciona una concentración aumentada de hormona del crecimiento en el líquido cefalorraquídeo.

El tratamiento dura preferiblemente al menos un mes, y la cantidad de GH es preferiblemente 0,1-3 U/kg/semana.

El medicamento es para el tratamiento de lesiones isquémicas en el cerebro y la demencia.

El medicamento comprende preferiblemente hormona del crecimiento recombinante, tal como Genotropin®. Por "compuesto análogo" se quiere significar un péptido que tiene esencialmente la misma cadena peptídica que la hormona del crecimiento y proporciona el mismo efecto fisiológico deseado que la hormona del crecimiento.

Sujetos y métodos Diseño del estudio

Fue un estudio doble ciego, controlado con placebo, en el que se usaba rhGH (Genotropin®, Kabi Pharmacia, Estocolmo, Suecia) en 20 pacientes con una demostrada deficiencia de hormona del crecimiento. Los pacientes fueron estudiados durante un periodo de un mes. Se explicó la naturaleza del estudio a los pacientes y se obtuvo su consentimiento informado escrito. Kabi Pharmacia proporcionó los códigos de aleatorización, los cuales fueron destruidos sólo después de que se hubo completado el estudio del último paciente. El protocolo de estudio fue aprobado por la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Göteborg y el Consejo Sueco de Salud (Estocolmo).

Tratamiento

La dosificación de rhGH fue 0,25 U/kg/semana, administrada subcutáneamente por el paciente antes de acostarse. La dosis diaria máxima fue 4 U. Los viales de placebo contenían el mismo vehículo que los viales de rhGH y eran indistinguibles de estos. Los viales de rhGH contenían 16 U (5,92 mg). Entre las inyecciones, los viales abiertos se conservaron en una nevera (temperatura entre 5 y 12ºC) y se protegieron de la luz durante un máximo de 7 días.

Protocolo del estudio

Los pacientes fueron estudiados como pacientes internos consecutivos en el Pabellón de Endocrinología durante un día antes del tratamiento con placebo o de la terapia activa, y, más tarde, 1 mes después del inicio del tratamiento con placebo o rhGH. Los pacientes fueron dejados en ayunas y fueron mandados a la cama a media noche antes de la punción lumbar que se llevó a cabo de 8,00 a 9,00 del día siguiente. Por la mañana sólo recibieron medicación de reposición hormonal. Con el paciente en una posición recostada lateral, se realizó una punción en el espacio intervertebral L_{3}-L_{4} o L_{4}-L_{5} usando una aguja de calibre 22. Los primeros 12 ml de CSF recogidos fueron mezclados a fondo. De esta porción, se congelaron partes alícuotas de 1 ml después de una centrifugación. El CSF restante fue utilizado para recuento celular, citología, cuantificación de albúmina e IgG y enfoque isoeléctrico. Los ml 13º y 14º del CSF recogido se congelaron inmediatamente a la cabecera de la cama para el posterior análisis del ácido gamma-aminobutírico (GABA; del inglés, gamma-aminobutyric acid). Los ml 15º a 25º de CSF fueron recogidos en porciones de 2 ml, mezclados con inhibidores de proteasas y congelados a la cabecera de la cama para el posterior análisis de endorfinas, neuropéptidos, hGH e IGF-I. Se recogió suero simultánemente a la recogida del CSF y se congeló en partes alícuotas. Todas las muestras fueron conservadas a -80ºC hasta ser analizadas.

Pacientes

Se pidió a veinte pacientes de 30-65 años, que habían sido previamente investigados como pacientes internos en el Servicio de Endocrinología a causa de una insuficiencia hipofisaria de inicio en la adultez después de una hipoglicemia provocada por insulina, todos los cuales tenían una concentración sérica de GH inferior a 5 mU/l, que participaran en el estudio. Todos los pacientes habían sido tratados con una adecuada terapia de reposición con glucocorticoides (acetato de cortisona, 25-50 mg/día), hormonas tiroideas (L-T4, 0,1-0,15 mg/día) y hormonas sexuales. Ninguno de los pacientes había sido previamente tratado con GH. En la Tabla 1 se muestran las características de los 20 pacientes de los grupos de estudio.

Métodos analíticos

Las células del CSF fueron contadas en una cámara Fuchs-Rosenthal. Las preparaciones citológicas se llevaron a cabo en una citocentrífuga y fueron teñidas con disolución de May-Grünwald-Giemsa.

Se midieron la albúmina y la IgG en CSF y suero usando una técnica nefelométrica que incluía una serie de patrones (Behring Nephelometer Analyser). La imprecisión fue < 5% (coeficiente de variación total) para 43,6 g/l y 234 mg/l de albúmina y 13,7 g/l y 34,7 mg/l de IgG. La relación de albúmina (albúmina en CSF/albúmina en suero x 1.000) fue utilizada para evaluar la barrera de sangre-CSF. El índice de IgG fue calculado como una medida cuantitativa de síntesis local de IgG (11). El enfoque isoeléctrico fue llevado a cabo en geles de poliacrilamida, teñidos con tinción de plata (12). La producción intratecal de IgG fue verificada mediante una técnica de inmunotransferencia usando un antisuero contra la cadena gamma de IgG humana. La síntesis local de IgG fue definida como dos o más bandas de IgG enriquecidas en CSF.

La beta-2-microglobulina fue determinada en CSF y suero utilizando un ensayo de inmunosorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay) (13) (A 972 y P 174 de Dakopatts a/s, Copenhague, Dinamarca). El coeficiente de variación total fue < 5% para 2,07 mg/l y 1,04 mg/l en suero y CSF, respectiva-
mente.

Péptidos opioides

Se recogieron muestras de CSF directamente en tubos de polipropileno preenfriados (Cryotubes, Nunc, Dinamarca) que contenían tampón de fosfato con albúmina sérica bovina al 0,1%, K_{3}-EDTA 0,34 M e inhibidores de peptidasas (concentraciones finales: 20 micromoles/l de bestatina, 0,1 micromoles/l de tiorfano, 1 micromol/l de captoprilo, 1.000 UI de calicreína/ml y 2 micromoles/l de PMSF).

Se llevaron a cabo radioinmunoensayos (RIA) para encefalinas usando un anticuerpo de conejo anti-[Leu^{5}] y [Met^{5}]-encefalina (RA-08-099, Cambridge Research Biochemicals, Diagnostika, Falkenberg, Suecia) que tenía 100% de reactividad cruzada con Leu-encefalina, 50% de reactividad cruzada con Met-encefalina, 2% de reactividad cruzada con \beta-endorfina y < 1% de reactividad cruzada con Met-encefalina-sulfóxido, dinorfina A, péptido intestinal vasoactivo (VIP; del inglés, vasoactive intestinal peptide), neuropéptido Y (NPY), factor liberador de corticotropina (CRF; del inglés, corticotropin releasing factor) y somatostatina 14 (SS 14). El patrón de Leu-encefalina (nº 8601) era de Peninsula Laboratories, Inc (Merseyside, Reino Unido), y se usó [^{125}I]-Leu-encefalina (Du Pont, NEN Division, Alemania) como radioindicador. El nivel más bajo de cuantificación fue ajustado a 1,0 picomoles/l para la inmunorreactividad de encefalinas.

Se llevaron a cabo ensayos RIA para dinorfina A utilizando un anticuerpo (RAS 8730) de conejo anti-dinorfina A (1-17), dinorfina A no marcada (nº 8730) y [^{125}I]-dinorfina A de Peninsula Laboratories, Inc. Este anticuerpo reacciona al 100% con dinorfina A 1-17, 42% con dinorfina A 1-13, 30% con dinorfina A 1-10 NH_{2}, 4% con dinorfina 1-10 y 0,02% con dinorfina A 1-9, y tiene < 1% de reactividad cruzada con Met- y Leu-encefalinas, \beta-endorfina, VIP, NPY, CRF y SS 14. El nivel más bajo de cuantificación fue ajustado a 7,8 picomoles/l.

Para ensayos RIA para \beta-endorfina, se usó el anticuerpo N 1621 de conejo anti-\beta-endorfina (Amersham, Aylesbury, Reino Unido). Este anticuerpo tiene 1-2% de reactividad cruzada con \beta-lipotropina y < 1% de reactividad cruzada con \beta-endorfina, Met- y Leu-encefalinas, VIP, NPY, CRF y SS 14. El patrón no radiactivo (nº 8616) fue adquirido a Peninsula Laboratories, Inc., y la 3-[^{125}I]-yodotirosil-\beta-endorfina era de Amersham. El nivel más bajo de cuantificación fue ajustado a 4,0 picomoles/l.

Se llevó a cabo un ensayo RIA para VIP utilizando el anticuerpo RA-08-115 y el patrón no radiactivo PP-05-2283 A (Cambridge Research Biochemicals), y el indicador radiactivo IM.158 de Amersham. La especificidad del anticuerpo era 100% para VIP nativo y 70% para VIP 1-28, y tenía < 1% de reactividad cruzada con Met- y Leu-encefalinas, \beta-endorfina, NPY, CRF y SS 14. El nivel más bajo de cuantificación fue ajustado a 2,0 picomoles/l.

Se llevó a cabo un ensayo RIA para somatostatina 14 con el anticuerpo RAS 8001 (Peninsula Laboratories, Inc.), el patrón no radiactivo PP-05-2254A (Cambridge Research Biochemicals) y el radioindicador yodado nativo IM.161 de Amersham. La especificidad del anticuerpo era 100% para somatostatina 14, 100% para somatostatina 28 y 100% para somatostatina 25 y, de acuerdo con los ensayos de los inventores, 69% para Met-encefalina, 16% para Leu-encefalina, 14% para dinorfina A, 8% para \beta-endorfina, 16% para VIP, 20% para CRF y < 1% para NPY. El nivel más bajo de cuantificación fue ajustado a 8,2 picomoles/l.

Para el ensayo RIA para CRF, se usaron el anticuerpo RA-08-082 y el patrón no radiactivo PP-05-1004 (Cambridge Research Biochemicals), y el radioindicador yodado IM.189 de Amersham. La reactividad del anticuerpo era 100% para CRF humano, y el anticuerpo tenía < 1% de reactividad cruzada con Met- y Leu-encefalinas, \beta-endorfina, VIP, NPY y SS 14. Las muestras de CSF fueron primero sometidas a una operación de fraccionamiento por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography) (14), y el nivel más bajo de cuantificación fue ajustado a 8,2 picomoles/l.

Todos los patrones y las muestras fueron conservadas en tubos de polipropileno, y todas las incubaciones con antisueros se realizaron a 4ºC durante la noche (o durante más tiempo) usando un tampón de fosfato sódico 0,1 M con cloruro sódico 50 mM y un pH de 7,4, que contenía albúmina sérica bovina (Sigma, St. Louis, EE.UU.) al 0,1%, azida sódica al 0,1% y Triton X-100 al 0,1% (volumen/volumen). Para precipitación a temperatura ambiental se usó un anticuerpo policlonal anti-conejo, de oveja (Suspensión para Decantación nº 3, Pharmacia, Suecia). Todas las muestras se analizaron por duplicado.

El coeficiente de variación de los ensayos RIA, asociado a las series, fue calculado a partir de un testigo de CSF al que se habían añadido los respectivos péptidos, y se halló que era 9% para el ensayo de Met- y Leu-encefalinas (para 5 picomoles/l, n = 4), 3,4% para el ensayo de dinorfina A (para 50 picomoles/l, n = 4), 4,9% para el ensayo de \beta-endorfina (para 40 picomoles/l, n = 4), 10,6% para el ensayo de VIP (para 50 picomoles/l, n = 10), 2,5% para el ensayo de somatostatina 14 (para 110 picomoles/l, n = 4) y 3,3% para CRF (para 100 picomoles/l, n = 4). El CV total del ensayo de CRF (incluyendo la HPLC) fue 13,8% (para 44 picomoles/l, n = 18).

Ácido gamma-aminobutírico

El CSF (400 \mul) fue ultrafiltrado en microcolumnas UFC3LC00 (celulosa de baja fijación Ultrafree-MC, Millipore, Göteborg, Suecia) y los aminoácidos fueron derivatizados con el reactivo FMOC y fueron separados mediante un sistema de HPLC en fase inversa [HP 1090, Hewlett Packard Company, Palo Alto, California, EE.UU., provisto de un fluorímetro Perkin-Elmer LS-4 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Connecticut, EE.UU.) y un sistema de datos HP 1000 para cromatografía] esencialmente de acuerdo con Einarsson et al. (15). La columna era una columna HICHROM S5 C8 (Hichrom Limited, Theale, Reino Unido) de 200 x 4,5 mm. El gradiente estaba compuesto de un tampón de ácido cítrico 20 mM, un tampón de citrato sódico 20 mM y tetrahidrofurano y fue desarrollado durante 35 min con un pH creciente y una polaridad menguante a 1,0 ml/min. El nivel más bajo de detección fue ajustado a 30 nanomoles/l con una recuperación de 100%, y el coeficiente de variación asociado a las series, calculado a partir de un testigo de CSF, fue 3% (para 340 nanomoles/l, n = 15).

Determinación de 3-metoxi-4-hidroxifeniletilenglicol (MHPG), ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) y ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético (ácido homovanílico, HVA) en CSF

Muestras de CSF fueron descongeladas y fueron diluidas 1:1 (volumen/volumen) en tampón de acetato sódico 50 mM, pH de 4,00, que contenía 250 mg/l de Na_{2}-EDTA, 250 mg/l de glutatión reducido y 500 nanomoles/l de ácido 4-hidroxi-3-metoxifenil-láctico (MHPLA) como patrón interno. Se inyectaron partes alícuotas de 80 \mul en un sistema de HPLC (Kontron Instruments, Zurich, Suiza) y se desarrollaron en una sola serie. La separación fue llevada a cabo en modo de fase inversa en una columna Ultrasphere ODS, 5 \mum de tamaño de partículas, 250 mm x 4,6 mm de diámetro interno (Beckman Instruments, San Ramon, California, EE.UU.), esencialmente de acuerdo con Ojala-Karlsson et al. (16). La fase móvil consistía en una mezcla de ácido acético 50 mM, ácido cítrico 45 mM, Na_{2}-EDTA 0,3 mM y metanol al 3,5% (volumen/volumen), con un pH de 5,20 \pm 0,02. Se usó un detector electroquímico Coulochem II (ESA Inc., Badford, Massachusetts, EE.UU.) con una célula de acondicionamiento (Modelo 5021) y una célula analítica de alta sensibilidad (Modelo 5011). Los potenciales de electrodo fueron optimizados para una sensibilidad y una selectividad óptimas, y una relación calculada de las señales de las células 1 y 2 confería selectividad al sistema analítico. La señal de la célula analítica 2 fue usada para la cuantificación utilizando una curva de calibración multipuntual con el método del patrón interno. El coeficiente de variación asociado a las series fue 4,2%, 8,9% y 4,2% para MHPG (25,5 nM), 5-HIAA (318,4 nM) y HVA (153,7 nM), respectivamente (A. Grzegorczyk et al., no publicado).

Los niveles de factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) en plasma fueron determinados con un sistema de RIA del Nichols Institute, Wijehen, Holanda. El IGF-I soluble fue separado de la proteína ligante usando una operación de precipitación con ácido-etanol y álcali.

Los niveles de IGF-I en CSF fueron medidos después de una extracción con una columna C 18 Sep-Pak, de acuerdo con el sistema de RIA.

Los niveles de proteína 3 ligante de factores de crecimiento de tipo insulina (IGFBP-3) en plasma fueron determinados con un sistema de RIA del Nichols Institute, Wijehen, Holanda. Los niveles de hGH en suero fueron determinados mediante un ensayo radioinmunométrico de Pharmacia, Uppsala, Suecia. El patrón de hGH del sistema fue calibrado frente al primer patrón internacional 80/505 de la OMS. Los niveles de hormona del crecimiento en 1 ml de orina y 500 \mul y 250 \mul de CSF (ml 15-25º) fueron medidos mediante un ensayo inmunométrico para hormona del crecimiento urinaria (BioMerieux, Francia). El método tenía un límite de detección de 1,3 \muU/l de GH, y el coeficiente de variación total del método fue < 8% (media de 8,8 \muU/l, n = 62), 5,6% (media de 45,8 \muU/l, n = 60) y 7,4% (media de 98,3 \muU/l, n = 59). El ensayo fue calibrado frente al primer patrón internacional de la OMS (80:505, 2,6 U/mg). La linealidad del método fue probada con un procedimiento de diluciones sucesivas para muestras tanto de orina como de CSF. Las curvas de dilución resultaron paralelas a la curva patrón, excluyéndose por ello una reactividad cruzada inespecífica. Todas las muestras se analizaron por duplicado.

Métodos estadísticos

Se proporcionan valores descriptivos como la media \pm error estándar de la media (SEM; del inglés, standard error of the mean). Las diferencias entre los grupos en la línea de base se analizaron con la prueba no paramétrica de Mann-Whitney así como por análisis de conglomerados y análisis de componentes principales (17). Las diferencias, entre los grupos de tratamiento, de los valores obtenidos en la línea de base y después de 1 mes se analizaron separadamente con la prueba de permutación de una muestra. La correlación entre dos variables fue calculada con la prueba de correlación por rangos de Spearman. Se citan valores p de pruebas de dos colas.

Resultados Diferencias entre los grupos de rhGH y placebo en la línea de base

Puesto que había una tendencia a diferencias entre los dos grupos para diversas variables, aunque no estadísticamente significativas, se llevó a cabo un análisis de conglomerados basándose en los datos de GH en suero, GH en CSF, GH urinaria, IGF-I en plasma, IGFBP-3 en plasma, \beta-endorfina en CSF, 5-HIAA en CSF, HVA en CSF, la edad, el índice de masa corporal y la duración de la deficiencia de hormona del crecimiento. No pudo mostrarse agrupamiento alguno salvo entre hombres y mujeres.

Además, se llevaron a cabo análisis de componentes principales basándose en todas las variables para todos los individuos en la línea de base. No hubo una clara separación entre los dos grupos aunque, con el número limitado de pacientes incluidos, se observó una tendencia hacia una distribución asimétrica.

Sólo hubo diferencias estadísticamente significativas (P < 0,05) entre los dos grupos en la línea de base para cuatro de las variables analizadas. En el grupo de rhGH, la concentración de 5-HIAA era mayor (159,8 frente a 99,3 nanomoles/l, P = 0,01), la concentración de albúmina sérica era mayor (39,8 frente a 36,3 g/l, P = 0,01), el índice de IgG era mayor (0,47 y 0,42, P = 0,02) y la concentración de dinorfina A era mayor (12,4 y 5,6 picomoles/l).

Se emplearon también análisis de componentes principales para evaluar el efecto del tratamiento, y se advirtió una clara separación entre los individuos que recibían placebo y los que recibían rhGH. En los párrafos siguientes se comentarán separadamente los cambios en las variables individuales.

Ocho pacientes tenían una lesión en la barrera hematoencefálica, como venía indicado por una relación de albúmina > 7,0 en la línea de base. Todos los pacientes tenían las cuentas celulares en CSF y el índice de IgG normales. Cuatro pacientes presentaban síntomas de producción intratecal de IgG en el enfoque isoeléctrico.

Efectos del tratamiento con rhGH

Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los cambios en diversas variables del CSF, después de un mes de tratamiento con rhGH, entre el grupo de rhGH y el de placebo: las concentraciones de GH (p < 0,001), IGF-I (p < 0,001), IGFBP-3 (p < 0,001), HVA (p = 0,02) e inmunorreactividad de \beta-endorfina (p < 0,001) en CSF.

Presión lumbar de CSF, concentraciones de albúmina y \beta_{2}-microglobulina en suero y CSF, relación de albúmina e índice de IgG

Durante el tratamiento con rhGH, la presión lumbar permaneció inalterada. La concentración media de albúmina sérica disminuyó de 39,8 \pm 0,7 a 34,8 \pm 1,0 g/l (p = 0,01) pero la concentración de albúmina en CSF permaneció inalterada. Por lo tanto, durante el tratamiento con rhGH, la relación de albúmina aumentó de 6,7 \pm 0,8 a 8,0 \pm 0,8 (p = 0,01) pero el índice de IgG permaneció inalterado. Durante el tratamiento con rhGH, la concentración de \beta_{2}-microglobulina sérica aumentó de 1,69 \pm 0,07 a 1,96 \pm 0,1 mg/l (p = 0,02) pero la concentración de \beta_{2}-microglobulina en CSF permaneció inalterada (Tabla 4).

Inmunorreactividades de \beta-endorfina, encefalinas y dinorfina A

En los pacientes que recibían rhGH, la concentración media de inmunorreactividades de \beta-endorfina en CSF aumentó de 24,4 \pm 1,8 a 29,9 \pm 2,1 picomoles/l (p = 0,002) (Figura 1a). Durante el tratamiento con rhGH, las inmunorreactividades de encefalinas permanecieron inalteradas (Tabla 3). En cuanto a la reactividad de dinorfina A, no se observó cambio alguno en los individuos durante el estudio (datos no mostrados).

MHPG, 5-HIAA y HVA

Las concentraciones de MHPG y 5-HIAA en CSF resultaron inalteradas durante el tratamiento con rhGH, mientras que la concentración de HVA disminuyó de 282,1 \pm 36,0 a 234,3 \pm 26,5 nanomoles/l (p = 0,02) (Tabla 3; Figura 2a).

VIP, CRF, somatostatina y GABA

La concentración de VIP en CSF disminuyó de 4,1 \pm 0,6 a 3,7 \pm 0,4 picomoles/l (p = 0,03). Las concentraciones de inmunorreactividades de CRF y somatostatina en CSF permanecieron inalteradas durante el tratamiento con rhGH, al igual que la concentración de GABA (Tabla 3).

Concentración de GH en suero y orina, concentraciones de IGF-I e IGFBP-3 en plasma y concentraciones de GH, IGF-I e IGFBP-3 en CSF

Durante el tratamiento con rhGH, las concentraciones plasmáticas de IGF-I e IGFBP-3 aumentaron de 90,4 \pm 17,9 a 342,3 \pm 41,2 \mug/l (p = 0,002) y de 1,71 \pm 0,24 a 2,98 \pm 0,22 mg/l (p = 0,002), respectivamente. La concentración de GH en suero ascendió de 0,05 \pm 0,03 a 3,92 \pm 0,92 mU/l (p = 0,002). Durante el tratamiento con rhGH, la concentración de GH en CSF aumentó al décuplo, de 13,3 \pm 4,4 a 149,3 \pm 22,2 \muU/l (p = 0,002) (Figura 3a) y la concentración de IGFBP-3 en CSF aumentó de 13,4 \pm 1,25 a 17,5 \pm 1,83 \mug/l (p = 0,002) (Tabla 2). La concentración de IGF-I en CSF aumentó de 0,67 \pm 0,04 a 0,99 \pm 0,10 \mug/l (p = 0,005) (Figura 4 y Tabla 2).

Relación entre el cambio de concentración de GH en CSF y los cambios de las concentraciones de opioides endógenos, neuropéptidos y metabolitos de monoaminas durante el tratamiento con rhGH

Hubo una relación positiva (Rs: 0,57, p < 0,05) entre el aumento de concentración de GH en CSF y el aumento de inmunorreactividad de \beta-endorfina. Hubo una relación negativa (Rs: 0,53, p < 0,05) entre el aumento de concentración de GH en CSF y la disminución de HVA. No hubo correlación entre el cambio de concentración de GH en CSF y los cambios de concentraciones de encefalina inmunorreactiva, dinorfina A, VIP, somatostatina o MHPG, 5-HIAA y GABA.

Relación entre el cambio de concentración de GH en CSF y los cambios de las concentraciones de IGF-I en CSF durante el tratamiento con rhGH

No hubo correlación entre el aumento de concentración de GH en CSF y el aumento de concentración de IGF-I en CSF.

Relación entre el cambio de concentración de IGF-I en CSF y los cambios de IGFBP-3 en CSF y las concentraciones plasmáticas

El aumento de concentración de IGF-I en CSF mostró una acusada correlación positiva con el aumento de IGFBP-3 en CSF (r = 0,81, p < 0,05). No hubo correlación entre el aumento de concentración de IGF-I en CSF y el aumento de IGF-I en plasma.

Relación entre el cambio de concentración de GH en CSF y los cambios de las concentraciones de IGFBP-3 en CSF y plasma y la concentración de IGF-I en plasma

El aumento de concentración de GH en CSF se correlacionó con el aumento de IGFBP-3 en CSF (Rs: 0,66, p < 0,01), IGFBP-3 en suero (Rs: 0,67, p < 0,01) e IGF-I en suero (Rs: 0,7, p < 0,01).

TABLA 1 Características de los 20 pacientes de los grupos de estudio

Característica	rhGH	Placebo
Edad media (años)	49,1	52,0
Intervalo	30-64	40-65
Sexo (M/F)	5/5	5/5
Duración conocida de hipopituitarismo (años)	9,4	14,2
Intervalo	2-21	2-34
Diagnóstico original
Prolactinoma, adenoma cromófobo, craneofaringioma	10	7
Quiste hipofisario	0	1
Síndrome de Sheehan		1
Hipopituitarismo idiopático		1
Tratamiento de reposición
Corticosteroide	5	7
Tiroxina	8	8
Esteroides gonadales	5	3
Desmopresina	1	3
Altura (cm)	172 \pm 3,1	173,7 \pm 4,3
Peso (kg)	79,6 \pm 5,7	81,4 \pm 4,4

TABLA 2 Mediciones de concentración de GH en el suero (S) y el líquido cefalorraquídeo (CSF), GH urinaria, factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) en plasma, y proteína 3 ligante de IGF (IGFBP-3) en plasma y en CSF, en pacientes con deficiencia de hormona del crecimiento tratados con rhGH o placebo durante 1 mes

	Línea de base	1 mes
Sustancia y grupo	media \pm SEM	media \pm SEM	Valor P
GH en S (mU/l)
rhGH	0,05 \pm 0,03	3,92 \pm 0,92	0,002
placebo	0,26 \pm 0,15	0,47 \pm 0,35
GH en CSF (\muU/l)
rhGH	13,3 \pm 4,4	149,3 \pm 22,2	0,002
placebo	9,2 \pm 4,9	8,3 \pm 4,2

TABLA 2 (continuación)

	Línea de base	1 mes
Sustancia y grupo	media \pm SEM	media \pm SEM	Valor P
GH urinaria (\muU/24 h)
rhGH	2,9 \pm 1,0	41,0 \pm 7,2	0,002
placebo	4,6 \pm 2,1	4,4 \pm 2,2
Conc. de IGF-I en plasma (\mug/l)
rhGH	90,4 \pm 17,9	342,3 \pm 41,2	0,002
placebo	88,9 \pm 19,1	88,8 \pm 19,3
Conc. de IGF-I en CSF (\mug/l)
rhGH	0,67 \pm 0,04	0,99 \pm 0,10	0,005
placebo	0,74 \pm 0,05	0,72 \pm 0,06
Conc. de IGFBP-3 en plasma (mg/l)
rhGH	1,71 \pm 0,24	2,98 \pm 0,22	0,002
placebo	1,63 \pm 0,26	1,64 \pm 0,25
Conc. de IGFBP-3 en CSF (\mug/l)
rhGH	13,4 \pm 1,25	17,5 \pm 1,83	0,002
placebo	12,1 \pm 1,24	11,8 \pm 1,19

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TABLA 3 Mediciones de opioides endógenos, neuropéptidos y metabolitos de monoaminas en el CSF, en pacientes con deficiencia de hormona del crecimiento tratados con rhGH o placebo durante 1 mes

	Línea de base	1 mes
Sustancia y grupo	media \pm SEM	media \pm SEM	Valor P
\beta-endorfina (picomoles/l)
rhGH	24,4 \pm 1,8	29,9 \pm 2,1	0,002
placebo	30,4 \pm 2,8	29,7 \pm 2,5
Encefalina (picomoles/l)
rhGH	6,6 \pm 0,5	7,0 \pm 0,5	NS
placebo	6,8 \pm 0,4	7,7 \pm 1,1
VIP (picomoles/l)
rhGH	4,1 \pm 0,6	3,7 \pm 0,4	0,03
placebo	3,3 \pm 0,4	3,3 \pm 0,3
MHPG (nanomoles/l)
rhGH	38,3 \pm 3,2	35,8 \pm 3,2	NS
placebo	32,1 \pm 2,1	28,2 \pm 2,2

TABLA 3 (continuación)

	Línea de base	1 mes
Sustancia y grupo	media \pm SEM	media \pm SEM	Valor P
5-HIAA (nanomoles/l)
rhGH	159,8 \pm 19,3	141,0 \pm 17,1	NS
placebo	99,3 \pm 14,0	95,5 \pm 12,5
HVA (nanomoles/l)
rhGH	282,1 \pm 36,0	234,3 \pm 26,5	0,02
placebo	175,8 \pm 37,1	180,7 \pm 38,6
GABA (nanomoles/l)
rhGH	244,1 \pm 34,1	240,0 \pm 26,7	NS
placebo	160,5 \pm 34,9	153,9 \pm 31,5

TABLA 4 Mediciones de presión lumbar, concentraciones de albúmina en suero y CSF, relación de albúmina, índice de IgG y concentraciones de \beta_{2}-microglobulina en suero y CSF, en pacientes con deficiencia de hormona del crecimiento tratados con rhGH o placebo durante 1 mes

	Línea de base	1 mes
Medición y grupo	media \pm SEM	media \pm SEM	Valor P
Presión lumbar de CSF (cm de H_{2}O)
rhGH	15,1 \pm 1,4	15,4 \pm 1,5	NS
placebo	16,6 \pm 1,5	16,8 \pm 1,2
Conc. de albúmina en S (g/l)
rhGH	39,8 \pm 0,7	34,8 \pm 1,0	0,01
placebo	36,3 \pm 0,9	37,3 \pm 1,0
Conc. de albúmina en CSF (mg/l)
rhGH	263,5 \pm 29,9	282,9 \pm 31,0	NS
placebo	218,7 \pm 27,3	230,3 \pm 28,3
Relación de albúmina
rhGH	6,7 \pm 0,8	8,0 \pm 0,8	0,01
placebo	6,0 \pm 0,7	6,1 \pm 0,7
Índice de IgG
rhGH	0,47 \pm 0,1	0,45 \pm 0,01	NS
placebo	0,42 \pm 0,02	0,42 \pm 0,01
\beta_{2}-microglobulina en S (mg/l)
rhGH	1,69 \pm 0,07	1,96 \pm 0,10	0,02
placebo	1,64 \pm 0,16	1,61 \pm 0,16

TABLA 4 (continuación)

	Línea de base	1 mes
Medición y grupo	media \pm SEM	media \pm SEM	Valor P
\beta_{2}-microglobulina en CSF (mg/l)
rhGH	1,30 \pm 0,09	1,34 \pm 0,09	NS
placebo	1,20 \pm 0,08	1,12 \pm 0,05

Discusión

Este informe, aunque limitado en cuanto al número de pacientes, describe sistemáticamente cambios en varios parámetros bioquímicos del CSF como resultado del tratamiento, con rhGH, de pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento. Los criterios de selección aleatoria, inicialmente elegidos para permitir la evaluación psicométrica del tratamiento, produjeron una distribución algo asimétrica de individuos en los grupos de rhGH y placebo. Sin embargo, las diferencias no fueron estadísticamente verificadas para ninguna de las variables que respondían significativamente al tratamiento con rhGH. De este modo, se ha mostrado por vez primera que el tratamiento, con rhGH, de pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento eleva significativamente las concentraciones de \beta-endorfinas inmunorreactivas, disminuye la concentración de ácido homovanílico y decuplica la concentración de GH en el CSF. Hubo también un aumento significativo de las concentraciones de IGF-I e IGFBP-3 en el CSF.

La identidad molecular de la inmunorreactividad de \beta-endorfina en CSF, no planteada en este estudio, será el sujeto de una investigación distinta en que se usa un fraccionamiento por HPLC como primera operación. El antisuero usado es específico para el extremo carboxílico del péptido \beta-endorfina y presenta una pequeñísima reactividad cruzada con la \beta-lipotropina intacta así como con las partes amino-terminales de la molécula de \beta-endorfina, tal como con Met-encefalina y \beta-endorfina. Sin embargo, el anticuerpo utilizado aún puede reconocer metabolitos o \beta-endorfinas parcialmente modificadas.

Los péptidos opioides estimulan la liberación de GH en el hombre (18) independientemente de la hormona liberadora de GH (19) y median en la liberación de GH estimulada por clonidina (20). Se ha mostrado también que la administración intraventricular de \beta-endorfinas activa la secreción de GH (21). Por vez primera, se ha mostrado ahora que la GH estimula la liberación de \beta-endorfinas. El mecanismo es confuso, pero puede ser un efecto directo de la GH sobre células productoras de \beta-endorfinas o ser secundario a la producción, en tejidos periféricos, de sustancias de bajo peso molecular que penetran en la barrera hematoencefálica.

El mecanismo existente tras el aumento de inmunorreactividad de \beta-endorfina en el CSF podría ser también debido a las concentraciones disminuidas de ácido homovanílico después del tratamiento con GH. En ratas, la dopamina inhibe la liberación de \beta-endorfina en la hipófisis neurointermedia, el hipotálamo y el septo, y el haloperidol, un antagonista de dopamina, aumenta las concentraciones plasmáticas de inmunorreactiovidad de \beta-endorfina (22). Durante el tratamiento con clorpromazina, hubo un aumento significativo en el nivel de la actividad opiácea total en el cerebro de ratas (23), lo que supuestamente refleja una biosíntesis aumentada del péptido.

La inmunorreactividad de \beta-endorfina en suero se volvió indetectable después de la hipofisectomía de pacientes con cáncer metastásico, pero, aunque disminuida, permaneció detectable en cantidades significativas en el CSF (24). Esto sugiere que una cantidad considerable de \beta-endorfina del CSF no es de origen hipofisario. En ese estudio, la reducción de la concentración de \beta-endorfina en el CSF muy bien podría estar relacionada con la deficiencia de GH causada por la hipofisectomía (24).

El observado aumento de inmunorreactividad de \beta-endorfina podría posiblemente explicar la mejoría del humor normalmente vista después del tratamiento con rhGH. El paciente que subjetivamente mejoró más presentaba el mayor aumento de inmunorreactividad de \beta-endorfina. Varios estudios han mostrado que una activación de receptores opiáceos ejerce un efecto antidepresivo (25). La terapia electroconvulsiva causa un aumento de corta duración de la inmunorreactividad de \beta-endorfina en plasma y puede contribuir a los efectos positivos de este tratamiento en la depresión endógena (26).

Simultáneamente al aumento de la inmunorreactividad de \beta-endorfina, hubo una caída en la concentración de ácido homovanílico. Se ha mostrado que la GH produce una rápida reducción de dopamina y noradrenalina en la protuberancia mediana de ratas (27). Se han observado cambios en aminas biogénicas del cerebro tan sólo 15 minutos después de una inyección de GH. Los cambios son dependientes de la región y casi siempre hay una disminución de los niveles de aminas biogénicas del cerebro (10).

El VIP actúa como un neurotransmisor y está presente en el CSF humano. Presenta una amplia distribución en el cerebro, incluyendo la corteza, el hipocampo, la amígdala, el hipotálamo y la hipófisis anterior (28). Una de sus funciones es actuar como un factor liberador de prolactina. Las células VIP hipofisarias resultan activadas por el hipotiroidismo y suprimidas por dosis suprafisiológicas de hormonas tiroideas (29). La GH aumenta la conversión de

T_{4} en T_{3} (2), por lo que la disminución de la concentración de VIP en el CSF podría ser posiblemente explicada por este mecanismo.

El hallazgo de que ocho pacientes tenían una lesión en la barrera de sangre-CSF y que cuatro pacientes tenían una discreta producción intratecal de IgG no es sorprendente ya que la mayoría de los pacientes habían recibido tratamiento quirúrgico de su tumor hipofisario y/o radiación. Durante el tratamiento con rhGH, dos pacientes presentaron una relación de albúmina aumentada, pero este aumento fue explicado por la caída en la concentración de albúmina sérica durante el tratamiento con rhGH, lo que, a su vez, es explicado por la expansión del volumen de fluido extracelular causada por las acciones antinatriuréticas de la GH (30). Aunque la GH ejerce potentes acciones antinatriuréticas, no hubo cambio alguno en la presión intracraneal durante el tratamiento con rhGH.

Se observó un aumento medio al décuplo en la concentración de GH en CSF después del tratamiento de un mes con rhGH. Esto sugiere que la rhGH atraviesa la barrera de sangre-CSF. Este aumento fue similar en pacientes con y sin lesión en la barrera de sangre-CSF. Este acusado aumento de GH en CSF contrasta con lo que se había comunicado sobre monos rhesus. En ese estudio, la infusión de grandes cantidades de GH humana sólo condujo a un pequeño cambio en los niveles de GH en CSF (31). Sin embargo, en ese estudio, las mediciones de GH en CSF fueron llevadas a cabo después de un solo periodo de infusión, lo que contrasta con el presente estudio en que los pacientes fueron tratados durante un mes. En segundo lugar, la sensibilidad del ensayo sobre hormona del crecimiento urinaria usado en el presente estudio era de aproximadamente 100 a 1.000 veces mayor que la del método de radioinmunoensayo usado por Belchetz et al. (31). En el presente estudio, el aumento medio de GH en CSF es de diez veces en comparación con la línea de base, pero la relación de GH en CSF/suero aún es sólo 5%.

Queda por elucidar el mecanismo existente tras el aumento de GH en CSF. Más del 80% de las proteínas del CSF proceden del suero por ultrafiltración, lo que depende del tamaño molecular. Una explicación alternativa es un transporte mediado por receptores de GH en el plexo coroideo, como ha sido sugerido por Lai et al., 1.991 (4).

Los niveles de IGFBP-3 en CSF pueden proceder de la reserva plasmática (32), pero también pueden ser producidos localmente (33). El mecanismo del aumento de la \beta_{2}-microglobulina sérica en diferentes enfermedades no está totalmente entendido pero se ha postulado una liberación, regulada por citoquinas, desde células inmunes (34). Experimentos con animales han mostrado que la GH influye en la proliferación y diferenciación de linfocitos T (35). Se sugiere ahora un efecto ejercido por la GH sobre el sistema inmune como la causa más plausible del aumento de \beta_{2}-microglobulina sérica observado en este estudio.

En conclusión, se ha hallado que un mes de tratamiento, con rhGH, de pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento aumenta la concentración de inmunorreactividades de \beta-endorfina en el CSF y disminuye simultáneamente las concentraciones de ácido homovanílico y VIP. Estos cambios podrían explicar posiblemente la mejoría en el bienestar psicológico normalmente observada en pacientes con deficiencia de hormona del crecimiento poco después del inicio del tratamiento con rhGH. La concentración de GH en el CSF se decuplicó, lo que demuestra que la rhGH atraviesa la barrera de sangre-CSF.

Leyendas

Figura 1a. Efectos de la rhGH sobre la inmunorreactividad de \beta-endorfina (\beta-EP) en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 1b. Efectos del placebo sobre la inmunorreactividad de \beta-endorfina (\beta-EP) en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 2a. Efectos de la rhGH sobre la concentración de ácido homovanílico en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 2b. Efectos del placebo sobre la concentración de ácido homovanílico en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 3a. Efectos de la rhGH sobre la concentración de GH en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 3b. Efectos del placebo sobre la concentración de GH en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 4a. Efectos de la rhGH sobre la concentración de IGF-I en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

Figura 4b. Efectos del placebo sobre la concentración de IGF-I en el CSF, en 10 pacientes adultos con deficiencia de hormona del crecimiento.

De este modo, en el ensayo doble ciego controlado con placebo se han estudiado los efectos del tratamiento, durante un mes, con hormona del crecimiento humana recombinante sobre péptidos opioides endógenos, neuropéptidos, metabolitos de monoaminas, hormona del crecimiento y proteína 3 ligante de factores de crecimiento de tipo insulina (IGFBP-3) en el líquido cefalorraquídeo de 20 pacientes con deficiencia de hormona del crecimiento de inicio en la adultez. Todos los pacientes recibieron la apropiada reposición con hormonas tiroideas, suprarrenales y gonadales. La dosis de hormona del crecimiento humana recombinante fue 0,25 U/kg/semana.

En el líquido cefalorraquídeo, la concentración media de \beta-endorfina inmunorreactiva aumentó de 24,4 \pm 1,8 a 29,9 \pm 2,1 picomoles/l (p = 0,002) durante el tratamiento con hormona del crecimiento humana recombinante. La concentración de ácido homovanílico, metabolito de la dopamina, disminuyó de 282,1 \pm 36,0 a 234,3 \pm 26,5 nanomoles/l (p = 0,02). La concentración de péptido intestinal vasoactivo disminuyó de 4,1 \pm 0,6 a 3,7 \pm 0,4 picomoles/l (p = 0,03). La concentración de hormona del crecimiento en el líquido cefalorraquídeo aumentó de 13,3 \pm 4,4 a 149,3 \pm 22,2 \muU/l (p = 0,002) y la concentración de IGFBP-3 en el líquido cefalorraquídeo ascendió de 13,4 \pm 1,25 a 17,5 \pm 1,83 \mug/l (p = 0,002).

No hubo cambios significativos en las concentraciones de encefalinas, dinorfina A, 3-metoxi-4-hidroxifeniletilenglicol, un metabolito de la norepinefrina, ácido 5-hidroxiindolacético, un metabolito de la serotonina, ácido gamma-aminobutírico, somatostatina y factor liberador de corticotropina, en el líquido cefalorraquídeo.

Se concluye que el tratamiento con hormona del crecimiento humana recombinante aumenta la concentración de inmunorreactividades de \beta-endorfina en el líquido cefalorraquídeo y disminuye simultáneamente las concentraciones de ácido homovanílico y péptido intestinal vasoactivo. La concentración de hormona del crecimiento en el líquido cefalorraquídeo se decuplicó, lo que demuestra por vez primera en seres humanos que la hormona del crecimiento humana recombinante atraviesa la barrera de sangre-líquido cefalorraquídeo.

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Claims (7)

1. Uso de la hormona del crecimiento (GH) o compuestos análogos de la misma, compuestos análogos que son péptidos que tienen esencialmente la misma cadena peptídica que la hormona del crecimiento y que proporcionan el mismo efecto fisiológico deseado que la hormona del crecimiento, para la producción de un medicamento que proporcione una concentración aumentada de GH en el líquido cefalorraquídeo para el tratamiento de lesiones isquémicas en el cerebro.

2. Uso de la hormona del crecimiento (GH) o compuestos análogos de la misma, compuestos análogos que son péptidos que tienen esencialmente la misma cadena peptídica que la hormona del crecimiento y que proporcionan el mismo efecto fisiológico deseado que la hormona del crecimiento, para la producción de un medicamento que proporcione una concentración aumentada de GH en el líquido cefalorraquídeo para el tratamiento de la demencia.

3. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, que proporciona una concentración aumentada de IGF-I en el líquido cefalorraquídeo.

4. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, que proporciona una concentración aumentada de IGFBP-3 en el líquido cefalorraquídeo.

5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento es adaptado para un tratamiento que dura preferiblemente al menos un mes.

6. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento contiene GH para 0,1-3 U/kg/semana.

7. Un uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, en el que el medicamento comprende hormona del crecimiento humana recombinante.