EP4695761A1 - Procédé de détermination d'une fréquence de production d'une série de gouttes en mouvement dans un canal fluidique - Google Patents

Procédé de détermination d'une fréquence de production d'une série de gouttes en mouvement dans un canal fluidique

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Publication number
EP4695761A1
EP4695761A1 EP24715198.8A EP24715198A EP4695761A1 EP 4695761 A1 EP4695761 A1 EP 4695761A1 EP 24715198 A EP24715198 A EP 24715198A EP 4695761 A1 EP4695761 A1 EP 4695761A1
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EP
European Patent Office
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drops
image
derived
initial image
frequency
Prior art date
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Pending
Application number
EP24715198.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Mathias GIRAULT
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Hekat
Original Assignee
Hekat
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Filing date
Publication date
Application filed by Hekat filed Critical Hekat
Publication of EP4695761A1 publication Critical patent/EP4695761A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0004—Industrial image inspection
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/10—Segmentation; Edge detection
    • G06T7/12—Edge-based segmentation
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10004—Still image; Photographic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30108—Industrial image inspection

Definitions

  • the present invention relates generally to the technical field of fluidics.
  • the invention finds a particularly advantageous application in the realization of a control of the frequency of production of drops on a reference frequency.
  • the frequency of production of the drops depends on the pressure within the fluid channel in which the drops are produced, and this pressure within the channel takes a certain time to establish itself. The narrower the channel, the longer it takes. Thus, with a constant pressure and flow rate of injections of the fluids, the frequency of production of the drops varies over time.
  • optical methods for measuring higher production frequencies that can reach several tens of kilohertz. Some of these optical methods are based on fluorescent coding, which requires loading the drops with a fluorescent liquid, using a laser and a very sensitive detector (because the fluorescent signal is weak). To do without fluorescence, other methods are based on very high frequency imaging combined with serial drop counting. In both cases, these methods require expensive detectors.
  • the present invention provides a method for determining a production frequency of a series of drops moving in a fluid channel, the method comprising the following steps:
  • the frequency of production of the drops is determined by means of a rolling shutter image capture device, i.e. an inexpensive image capture device.
  • Rolling shutter image capture devices are in fact very inexpensive, in particular in comparison with global shutter devices used in the very high frequency imaging methods of the prior art.
  • the outline of a drop provides information on the movement of the drop in the channel thanks to the temporal information contained in the image. Indeed, since this single image is acquired line by line, i.e. sequentially, the The shape of the droplet contour in this image depends on the speed of the droplet. Thus, evaluating a deformation of the drops via their contour therefore makes it possible to determine their movement in the channel.
  • the invention makes it possible to determine the production frequency inexpensively.
  • the method of the present disclosure does not require fluorescent coding of the drop.
  • the deformation rate is expressed in pixels per unit of time and the distance between the two microdroplets is expressed in pixels.
  • the dimension of the ratio of the deformation rate to the distance i.e. the production frequency, is directly the inverse of a time. It is therefore not necessary to determine a speed of the droplet in meters per unit of time, which requires determining a large number of parameters of the optical system, in particular the magnification of the optical imaging system.
  • the method according to the invention does not require any calibration to determine the frequency of production of the drops since the “pixel” dimension is eliminated in the ratio of the deformation rate to the distance. This makes the invention very simple to implement.
  • each derived image being associated with an offset value, the lines of each derived image being successively translated, relative to their position on the initial image, by a number of pixels proportional to the offset value associated with said derived image; detect, on each derived image, a contour derived from said at least one of the two drops; determine the production frequency on the additional basis of the derived contours deduced from the derived images;
  • each line of each derived image is translated, relative to its position on the initial image, by one number of pixels equal to the offset value multiplied by an index of said line;
  • a deformation which is representative of a difference between a shape of said at least one of the two drops on the initial image and a circular shape, on the basis of a difference in position between a first end of said at least one of the two drops in a line of pixels which is acquired first during the acquisition step and a second end of said at least one of the two drops in another line of pixels which is acquired last during the acquisition step, the production frequency also being calculated on the basis of the deformation;
  • an initial image acquisition time is less than 10 ms
  • the image capture device it is provided, before the acquisition step, to arrange the image capture device relative to the fluid channel so that, on the initial image, the longitudinal direction of the fluid channel forms an angle of less than 10 degrees with the lines;
  • the invention also provides a method for producing a series of drops, the series of drops being in motion in a fluidic channel of a fluidic device, the method comprising the following steps:
  • the invention also relates to a device for determining a production frequency of a series of drops moving in a fluid channel, the system comprising an image capture device with a rolling shutter adapted to acquire an initial image of at least two drops in series in the fluid channel, the initial image comprising a matrix of pixels forming lines and columns, the lines being acquired sequentially one after the other by means of the rolling shutter, and a computer programmed to implement:
  • the invention finally relates to a drop sorting system comprising a device as described above.
  • the system is a microfluidic device or a flow cytometer.
  • FIG. 1 is a schematic view of a system for determining a frequency of production of drops moving in a fluid channel.
  • FIG. 2 is a schematic illustration of a rolling shutter image acquisition showing operations on sensor lines as a function of time (t).
  • FIG. 3 is a block diagram of a sequence of steps for determining the speed and frequency of production of moving drops in a fluid channel using the system of Fig. 1.
  • FIG. 4 is an image sequentially acquired, using the system of FIG. 1, of a plurality of drops moving in a fluid channel.
  • FIG. 5 is an image derived from the image of Figure 4 constructed by shifting the pixel lines with a first shift value.
  • FIG. 6 is another image derived from the image of Figure 4 constructed by shifting the pixel lines with another offset value.
  • FIG. 7 is yet another image derived from the image of Figure 4 constructed by shifting the pixel lines with yet another offset value.
  • FIG. 8 is a representation of a processing of the image of Figure 6 illustrating a determination of the contours of the drops.
  • FIG. 9 is a graphical representation of droplet circularity indices on derived images (as shown in Figs. 6, 7 and 8) as a function of the offsets used to construct the derived images, together with a fitting curve for determining an optimum offset value.
  • FIG. 10 is a schematic representation of a drop of the plurality of drops of Fig. 4 allowing a deformation of the drops to be determined.
  • FIG. 11 is a block diagram of a sequence of steps allowing the production of drops with a regulation of their production frequency.
  • FIG. 12 is a schematic representation of a drop (left) and a sequentially acquired image of that drop (right), with the drop moving perpendicular to the pixel lines during image acquisition.
  • Figure 1 shows a system 1 for determining a production frequency fp of a series of drops 2 moving in a fluidic device 3.
  • the drops 2 are more particularly moving in a fluidic channel 31 of the fluidic device 3.
  • the fluidic channel 31, hereinafter called channel 31 is here rectilinear in a longitudinal direction.
  • the drops 2 thus have a rectilinear translational movement in the channel 31.
  • the drops 2 move rectilinearly from left to right parallel to the longitudinal direction of the channel 31.
  • the drops 2 of the series are located one behind the other along the longitudinal direction, this means that the series of drops 2 forms a line of drops 2.
  • the fluidic device 3 is more particularly a microfluidic device 3, also called a microfluidic chip, as shown in FIG. 1.
  • the channel 31 is then a microfluidic channel.
  • the section of the channel 31 is then for example between 10 pm 2 and 150,000 pm 2 and the length between 50 pm and 1 cm.
  • the drops 2 are then more particularly microdroplets 2, which means that their size, i.e. here their diameter, is for example between 1 pm and 300 pm.
  • the drops 2 have in the channel 31 a shape which is generally spherical or a flattened sphere shape.
  • the fluidic device 3 is here substantially flat.
  • the plane of the fluidic device 3, referenced PI in FIG. 1, is in particular parallel to the main direction. Parallel to this plane PI, the drops 2 have a circular shape, which means that their outline is generally a circle.
  • the microfluidic device 3 also comprises a central injection channel 32 and two lateral injection channels 33 opening onto a junction 35 with the central channel 32, on either side of, and perpendicular to, this junction 35.
  • the central channel 32 contains a sample liquid which is for example pure water or an aqueous medium such as phosphate buffered saline (PBS), and the lateral channels 33 a sheath liquid which is for example oil.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the drops 2 are then microdroplets of water suspended in the oil.
  • the drops 2 are produced when the oil flows 4 divide the water flow 5 into separate volumes.
  • the production of the drops 2 takes place here at the junction 35 of the central channel 32 with the lateral channels 33.
  • the drops 2 are for example collected in a reservoir 34 connected to the outlet of the channel 31.
  • the drops 2 are sorted (mechanism not shown) before being collected.
  • the drops 2 are for example analyzed by fluorescence using a laser.
  • a drop of interest is detected, it is then extracted from the channel to be oriented in a collection channel. Knowing the production frequency fp of the drops 2 is then important to synchronize the extraction of the drop from the liquid flow.
  • microfluidic device 3 Other configurations of the microfluidic device 3 are conceivable. Similarly, other sample liquids and other sheath liquids can be used, for example to form microdrops of oil suspended in water.
  • the fluidic device is a flow cytometer.
  • the drops then have a diameter which is for example between 30 ⁇ m and 300 ⁇ m.
  • the fluidic channel can then be open in the sense that it is not delimited by glass or plastic walls but by air.
  • the drops are produced in the flow by the vibration of a piezoelectric actuator.
  • the production frequency fp of the drops 2 is here defined as the inverse of the time separating the production of two successive drops 2, i.e. two drops 2 produced one after the other.
  • the production frequency fp is here equal to the frequency of passage in the microfluidic channel 31.
  • the system 1 comprises an image capture device
  • the channel 31 comprising the drops 2 is located in the field of view C of the image capture device 11.
  • the system 1 also comprises a light source 12 located opposite the image capture device 11 relative to the channel 31. The channel 31 is thus interposed between the light source
  • the lighting can be done on the same side as the image capture device, by reflection on the fluidic device 3.
  • FIG. 1 schematically represents two planes which are in practice distinct and more particularly orthogonal.
  • a first plane is the plane PI of the fluidic device 3 (corresponding to the plane of the figure) and a second plane is that according to which the image capture device 11 and the light source 12 are aligned.
  • the image capture device 11 and the light source 12 are in practice aligned in a direction perpendicular to the plane of Figure 1 and the fluidic device 3 shown in Figure 1 corresponds to an image which could be acquired by the image capture device 11.
  • the image capture device 11 more particularly comprises a rolling shutter. Each image that it acquires is thus acquired sequentially in the sense that it is acquired line by line.
  • the rolling shutter is here produced electronically.
  • the image capture device 11 more particularly comprises a detector consisting of a plurality of sensors, here CMOS sensors, arranged in a matrix forming lines LI, L2 and columns (the terms lines and columns being interchangeable since they are conventional).
  • the operation of the image capture device 11 is illustrated in FIG. 2.
  • Each image is acquired sequentially, line of sensors by line of sensors.
  • the first line L1 of sensors here the top one, is initialized (block I in FIG. 2), then integrates the light coming from the channel 31 illuminated by the light source 12 (block E in FIG. 2), then the electrical signals produced by the sensors are read (block L in FIG. 2), i.e. collected by a dedicated electrical circuit.
  • the second line L2 of sensors is acquired with a time offset relative to the first line L1.
  • the rolling shutter mechanism is obtained by electronic unrolling of the detector.
  • Each acquired image comprises a matrix of pixels forming rows and columns.
  • the rows of pixels extend from right to left and the columns from top to bottom.
  • the rows of pixels correspond to the rows L1, L2 of sensors and the columns of pixels correspond to the columns of sensors.
  • each image is also acquired sequentially row of pixels by row of pixels.
  • the image capture device 11 also includes its own processor designed to interpret the signals collected by the dedicated electrical circuit in order to construct the images.
  • the time between the acquisition of two successive sensor lines is an intrinsic datum of the image capture device 11.
  • the line time tL is more specifically equal to a delay between two identical actions of the image capture device 11 on two successive sensor lines, for example the first line L1 and the second line L2.
  • the line time tL therefore corresponds to the aforementioned time offset.
  • the line time tL is therefore also equal to the delay between the acquisition of a pixel line and the acquisition of the following pixel line, i.e. the delay between the acquisition of two successive pixel lines, the acquisition of a pixel line starting at the initialization (block I) of the corresponding sensor line.
  • the line time tL is for example the delay between the start of the initialization of a line of sensors and the start of the initialization of the next line of sensors (as shown in FIG. 2) or the delay between the start of the reading of a line and the start of the reading of the next line of sensors. In practice, this data is provided by the manufacturer of the image capture device 11.
  • the image capture device 11 is selected so as to have a line time tL less than 10 ps.
  • the line time tL corresponds to a construction parameter of the image capture device 11 with rolling shutter.
  • the line time tL remains constant for a given image capture device with rolling shutter.
  • the system 1 also comprises a computer 13 configured to control the image capture device 11.
  • the computer 13 here comprises at least one memory and at least one processor.
  • the memory is a computer-readable recording medium comprising instructions which, when executed by the processor, make it possible to control the image capture device 11.
  • the computer 13 is in particular configured to trigger the image captures.
  • the computer 13 is more particularly programmed to implement a method for determining the production frequency fp of the drops 2, and this from the capture of a single image 40, subsequently called the initial image 40, by the image capture device 11. This method is here implemented by the system 1. Of course, it can be implemented by any appropriate system which is based on a sequential acquisition of images.
  • the method for determining the production frequency fp comprises the following main steps:
  • the method here comprises a step of determining the deformation rate T which is an intermediate parameter used to determine the production frequency fp.
  • the deformation rate T is representative of the movement, i.e. the speed, of the drop 2 in the channel 31.
  • the deformation rate T here corresponds to a partially dimensionless value of the speed of the drops 2 in the sense that it is expressed in pixels per unit of time.
  • the deformation rate T depends on the speed of the drops 2 and on the arrangement of the image capture device 3 relative to the channel 31.
  • the contour 21 of the drop 2 provides information on the movement of the drop 2 during the acquisition of the initial image 40. Indeed, since the drop 2 advances during the acquisition, its contour 21 appears deformed relative to a circle.
  • the method comprises a prior step (not shown) of arranging the image capture device 11 relative to the channel 31 so that, on the initial image 40, a main direction DI in which the drops 2 are moving or the longitudinal direction of the microfluidic channel 31 forms an angle of less than 10 degrees with the pixel lines.
  • the longitudinal direction of the microfluidic channel 31 is parallel to the main direction Dl.
  • the initial image 40, the main direction D1 or the longitudinal direction of the microfluidic channel 31 is parallel to the lines of pixels, as is the case in FIG. 4 in which two lines of pixels LP1, LP2 are represented.
  • the method begins more particularly with a first step E1 of acquiring the initial image 40.
  • the light source 12 is here switched on.
  • the light source 12 is switched on continuously throughout the entire method.
  • a plurality of drops 2, here about twenty drops 2 is included in the field of view C during the acquisition of the initial image 40. Consequently, the plurality of drops 2 is represented on the initial image 40. As will appear later, having several drops 2 on the initial image 40 makes it possible to determine average (or median) values, which increases the precision of the determination of the production frequency fp.
  • the drops 2 of this plurality i.e. the drops 2 represented on the initial image 40, are subsequently called “the drops”.
  • the production frequency fp can be determined on the basis of only two drops 2. In other words, imaging only two drops 2 (therefore successive) can be sufficient to determine the distance and therefore the production frequency fp. On the other hand, imaging a single drop 2 is sufficient to determine the deformation rate T.
  • the portion of the channel 31 imaged here is regular, in the sense that it has a constant section over the entire initial image 40. Consequently, the drops 2 all move with the same speed, their deformation rate T is therefore identical.
  • the portion of the channel 31 imaged is irregular, only a regular section, or the most regular possible, of this portion is taken into account in the method.
  • the initial image 40 is acquired pixel line by pixel line.
  • the first line LP1 located at the top of FIG. 4 is acquired first, the other lines are successively acquired starting from the first line LP1.
  • the determination of the deformation rate T is based on the construction of derived images 41.
  • the idea of this first embodiment is to recalibrate the initial image 40 using the derived images 41 so as to obtain drops 2 of circular shape on at least one derived image 41.
  • the recalibration making it possible to obtain a circular shape provides information on the movement of the drops 2 during the acquisition of the initial image 40, and therefore on the deformation rate T of the drops 2.
  • the method continues with a second step E2 during which the calculator 13 constructs the derived images 41.
  • the second step E2 firstly comprises the determination of offset values.
  • the offset values are positive integers distinct from each other.
  • the offset values are preferably all positive integers from 1 to a maximum offset value N.
  • the maximum offset value N is here predetermined. It is for example between 20 and 1000.
  • the maximum offset value N can here depend on an estimated speed of the drops.
  • Each derived image 41 is associated bijectively with an offset value.
  • Each derived image 41 is then constructed by successively translating the pixel lines by a number of pixels proportional to the offset value that is associated with said derived image 41.
  • Translating here means moving or shifting the pixel lines relative to their position on the initial image 40. In other words, the translation is a shift in the direction of the pixel lines (i.e. from right to left in FIG. 4).
  • the pixel lines are translated opposite to the movement of the drops 2, i.e. a direction contrary to the movement of the drops 2. This makes it possible to compensate, on the derived images 41, for the deformation of the drops due to their movement during the acquisition of the image 41.
  • the pixel lines are thus translated to the left since the drops move to the right.
  • Each line of pixels of each derived image 41 is more specifically translated by a number of pixels equal to the offset value multiplied by an index of said line of pixels.
  • the indices are here positive integers counted from the top line, index 1, to the bottom line. This construction of derived images 41 is illustrated in detail in FIGS. 5, 6 and 7.
  • Figure 5 illustrates a first derived image 41A corresponding to the offset value 5, from the initial image 40 shown in Figure 4.
  • the first line LP1 i.e. the top line with index 1
  • the second line LP2 i.e. the line in second position from the top and with index 2
  • the first line LP1 and the second line LP2 which are strictly opposite each other on the initial image 40, are therefore now offset by 5 pixels relative to each other on the first derived image 41A.
  • the third line with index 3 is translated by 15 pixels and so on.
  • Figure 6 illustrates a second derived image 41B corresponding to the offset value 10, from the initial image 40 shown in Figure 4.
  • the first line of index 1 is translated by 10 pixels (10x1), the second line of index 2 by 20 pixels (10x2) and so on.
  • Figure 7 illustrates a third derived image 41C corresponding to the offset value 15, from the initial image 40 shown in Figure 4.
  • the first line of index 1 is translated by 15 pixels (15x1), the second line of index 2 by 30 pixels (15x2) and so on.
  • the shape of the drops 2 appears to be closest to a circular shape for the offset value 10. Beyond the value 10, the circularity of the drops 2 deteriorates again.
  • 25 derived images 41 are constructed in the second step E2 for offset values ranging from 1 to 25 in steps of 1.
  • the method continues with a third step E3 of detecting the contours 21' of the drops 2 on the derived images 41.
  • the contours of the drops 2 on the derived images 41 are subsequently called derived contours 21'.
  • the calculator 13 more particularly detects the derived contour 21' of each drop 2 on each derived image 41.
  • the drops 2 represented in their entirety are taken into account, those partially represented which are located at the edge of the image are excluded.
  • the derived contours 21' are for example detected by means of a thresholding on the intensity of the pixels. Indeed, as shown in FIGS. 4 to 7, there is a contrast between the sample liquid and the sheath liquid, which makes it possible to extract the surfaces 22 corresponding to the drops 2.
  • the drops 2 are here darker than the sheath liquid. However, the drops 2 can also appear lighter than the sheath liquid or sometimes as a simple white or black border corresponding to the contour (only the contours are then visible).
  • the method for extracting the derived contours 21' is adapted to the situation.
  • the surfaces 22 of the drops shown in FIG. 6 are for example illustrated in FIG. 8. As shown in FIG. 8, the derived contours 21' are then determined as the edge of these surfaces 22. Preferably, the intensity thresholding is local.
  • the derived contours 21' can also be detected by means of a filter for contour detection, such as a Sobel filter or a Kany filter, or by means of a filter for searching for circular objects, for example by a Hough transform.
  • a filter for contour detection such as a Sobel filter or a Kany filter
  • a filter for searching for circular objects for example by a Hough transform.
  • the method then comprises a fourth step E4 in which the calculator 13 calculates a circularity index of each derived contour 21'.
  • a circularity index is a value, here positive real, representative of the proximity of shape of a contour 21 or of a derived contour 21' with a circle.
  • a circularity index of a contour 21 or of a derived contour 21' of a drop 2 is for example calculated on the basis of a ratio between the perimeter of the drop 2 and the area of the drop 2.
  • the circularity index is calculated according to the Heywood index. It can also be calculated on the basis of a ratio between a major axis and a minor axis of the drop 2.
  • an average circularity index is calculated as the average of the circularity indices of each drop 2 represented on the derived image 41.
  • the fourth step E4 comprises the calculation of 25 average circularity indices for the 25 derived images 41 constructed in the second step E2.
  • the method then comprises a fifth step E5 of determining, on the basis of the average circularity indices, an optimum offset value M.
  • the optimum offset value M is the one which best corrects the contour 21 of the drop 2 to approach a circle.
  • the optimum offset value M is here a dimensionless real value.
  • the optimum offset value M is in fact expressed in pixels in the sense that its value is a real number representative of a number of pixels.
  • the fifth step E5 here comprises the determination by the calculator 13 of an adjustment curve 50 of the average circularity indices as a function of the offset values.
  • Each derived image 41 being associated with an offset value, each average circularity index is therefore also associated with an offset value.
  • a graphical representation of the average circularity indices as a function of the offset values appears in FIG. 9.
  • the adjustment curve 50 is here obtained by adjusting, for example by the least squares method, a polynomial function with the offset values as input and the average circularity indices as output.
  • the adjustment curve 50 is thus a polynomial function which statistically represents the average circularity indices as a function of the offset values.
  • the adjustment curve 50 is thus here obtained by a polynomial regression.
  • the polynomial function has for example a degree between 2 and 6.
  • the adjustment curve could also be obtained by an exponential regression.
  • Figure 9 illustrates the adjustment curve 50 obtained for the 25 average circularity indices calculated in the fourth step E4.
  • the calculator 13 determines the minimum of the adjustment curve 50. This determination is for example carried out by means of an analysis of the derivative of the adjustment curve 50.
  • the optimum offset value M is then defined as the abscissa M of the minimum of the adjustment curve 50.
  • the optimum offset value M is therefore that whose image by the adjustment curve 50 is minimum.
  • the precision on the optimum offset value M is greater than the resolution of the initial image 40 (in the sense that it is a value with decimal and not integer) because all the offset values used to construct the derived images 41 are taken into account with the adjustment curve 50.
  • the method then comprises a sixth step E6 of calculating the deformation rate T of the drops 2.
  • the deformation rate T of the drops 2 is determined on the basis of the optimum offset value M and the line time ti_.
  • the calculator 13 more specifically calculates the deformation rate T as the ratio of the optimum offset value M to the line time ti_.
  • the deformation rate dimension T is therefore here the inverse of a time.
  • the line time ti. being here expressed in ps, the deformation rate T is expressed in pixels per microsecond.
  • the maximum offset value N is not predetermined but the derived images are constructed until a stopping criterion is reached, i.e. without knowing in advance the number of derived images that will be constructed.
  • a “while” type loop is implemented instead of a “for” type loop.
  • steps E3, E4 and E5 are then implemented so as to calculate the average circularity index of said derived image.
  • This stopping criterion is for example the fact that the last average circularity index calculated (i.e.
  • the fitting curve can also be adjusted as the average circularity indices are calculated.
  • the stopping criterion can then also be the fact that the fitting curve becomes decreasing again or reaches a second local minimum, the optimum shift value then being defined as the abscissa of the first local minimum of the fitting curve.
  • the maximum shift value N is then that corresponding to the stopping criterion.
  • the calculator determines a deformation of the contour 21 of the drop 2 directly from the initial image. 40.
  • the deformation is representative of a difference between a shape of a drop 2 in the channel 31 and a shape of this drop 2 on the initial image 40.
  • This second embodiment can also comprise the detection of the contours 21 of the drops 2 represented on the initial image 40. An average contour can then be reconstructed as the average of these contours 21. The first end 24 and the second end 25 are then respectively the highest point and the lowest point, perpendicular to the direction of the lines of pixels, of the average contour.
  • the deformation is then equal to the distance D in pixels along the pixel lines between the first end 24 and the second end 25 of the drop 2 divided by the height H of the drop 2 in pixels along the columns.
  • the drop 2 being of generally circular shape in the plane PI of the fluidic device 3, the first end 24 and the second end 25 should be located one vertically to the other on an undistorted image. The deformation is therefore well representative of the movement of the drop 2 during the acquisition of the image.
  • the deformation is representative of the comparison between the shape of this drop 2 on the initial image 40 (directly or via the derived images) with a circle, i.e. with the shape of this drop 2 in the fluidic device 3 parallel to the plane PI of the fluidic device 3.
  • the calculator 13 calculates the deformation rate T as the ratio of the deformation over the line time ti_.
  • the method for determining the production frequency fp then comprises a seventh step E7 for determining a distance between two successive drops 2.
  • the distance between the two successive drops 2 is an average taken over all the drops 2 represented in the initial image 40. This increases the precision of the determination of the distance, and therefore of the determination of the frequency of fp production.
  • the seventh step E7 includes for example the calculation of the distance between five drops 2 produced successively, and the division of this distance by four (i.e. the number of intervals between the five drops) to obtain the distance between two successive drops 2.
  • the distance between the two successive drops 2 is more particularly a step P between these two drops 2.
  • the step P is here determined on the basis of the initial image 40. Alternatively, it can be determined on the basis of the derived images 41.
  • the pitch P is here a distance between two corresponding points of each drop 2, i.e. the same respective points on each of the drops 2.
  • the pitch P with the second drop 2 is calculated as the distance between said point and the most upstream point of the second drop 2.
  • the corresponding points are the centers of gravity G of the drops 2, which makes it possible to average the positions of the drops 2 for a more precise determination of the pitch P.
  • the centers of gravity G also makes it possible to avoid possible fluctuations in diameters from one drop to another.
  • the pitch P between two drops 2 is the distance between their center of gravity G, as shown in FIG. 4.
  • the pitch P between the drops 2 is then calculated as the norm of a vector connecting the centers of gravity G of the two drops 2.
  • the centers of gravity G of the drops 2 are here determined by detecting the contours 21 of the drops 2 on the initial image 40 and by determining the barycenters of the contours 21.
  • the centers of gravity G of the drops 2 are here determined by detecting the derived contours 21' and by determining the barycenters of the derived contours 21'.
  • the method finally comprises an eighth step E8, in which the calculator 13 calculates the production frequency fp by dividing the deformation rate T of the two drops 2 by the distance between the two drops 2.
  • the distance between two drops 2 is expressed in pixels in the sense that its value is a real number representative of a number of pixels.
  • the deformation rate T is also expressed in pixels (per unit of time)
  • the calculated fp production frequency is directly the inverse of a time.
  • System 1 can thus be quickly and simply implemented.
  • the method makes it possible to determine very high production frequencies fp, for example between 10 and 60 kHz (i.e. 10,000 and 60,000 drops per second). Indeed, as shown in FIG. 4, the method is suitable for determining the production frequency fp of drops 2 very close to each other, or even in contact with each other.
  • the method for determining the production frequency fp is here implemented in a method for producing the drops 2 illustrated in FIG. 11.
  • the idea of this method is, by determining the production frequency fp throughout the production of the drops 2, to control the production frequency fp to a reference frequency fr.
  • the method for producing the drops 2 conventionally comprises producing the drops 2 in the channel 31 by injecting the sample liquid and the sheath liquid by means of pumps and/or syringe pumps.
  • the method for producing the drops 2 begins more particularly with a step E0 of selecting the reference frequency fr for producing the drops 2.
  • This reference frequency fr makes it possible to estimate initial pressure setpoints, when pumps are used to produce the drops 2, or flow rate, when syringe pumps are used to produce the drops 2. These initial setpoints make it possible to produce the drops 2 whose production frequency fp is determined as described above.
  • the method firstly comprises a step E9 of determining the frequency of production of the drops 2 in the channel 31 by means of the method of determining the production frequency fp.
  • step E9 corresponds to the combination of steps E1 to E8 described previously.
  • the method then comprises a step E10 of comparing the production frequency fp measured in step E9 with the reference frequency fr selected in step E0.
  • the calculator 13 here calculates the difference between the production frequency fp and the reference frequency fr.
  • the method finally comprises a step Eli for determining adjusted flow rate or pressure setpoints for the liquids injected into the fluidic device 3 upstream of the channel 31.
  • the adjusted setpoints here comprise one or more flow rate setpoints and/or one or more pressure setpoints.
  • the production frequency varies over time.
  • the adjusted setpoints are calculated so as to control the production frequency fp to the reference frequency fr.
  • the reference frequency fr For example, when the production frequency fp is lower than the reference frequency fr, the adjusted setpoint for the injection flow rate of the liquid of the drops 2 is higher than the reference setpoint, so as to accelerate the production of the drops 2.
  • the adjusted setpoint for the injection flow rate of the liquid of the drops 2 is lower than the reference setpoint, so as to slow down the production of the drops 2.
  • steps E9, E10 and Eli are here implemented iteratively.
  • the adjusted instructions make it possible to correct in real time the temporal variations of the production frequency fp so that it is equal to the reference frequency fr.
  • the adjusted instructions are therefore scalable over time to maintain the production frequency fp at the initial setpoint value, i.e. at the production frequency fp-
  • the method for determining the production frequency fp requires little computing power, in particular because the processing of the initial image 40 is based on simple matrix operations. Thus, it is possible to repeat the determination of the production frequency fp at a high rate, which makes it possible to establish a precise and fast feedback thanks to adjusted instructions.
  • Step E9 of determining the production frequency fp is for example executed at a rate between 0.01 and 150 Hz.
  • the system 1 also makes it possible to implement a method for determining the speed of the drops 2.
  • the speed of a drop 2 is here expressed in meters (or in units derived from the meter such as micrometers) per unit of time, and not in pixels per unit of time like the deformation rate T.
  • the speed thus corresponds to a dimensioned value of the deformation rate T.
  • the speed is an absolute value and independent of this arrangement.
  • the speed is thus expressed in dimensioned units of the SI system.
  • the effective size for example in micrometers, of a pixel of the initial image 40. This can be done by taking into account optical parameters of the image capture device 11 in particular the magnification or the focal lengths of the lenses of the image capture device 11. This can also be done by taking into account a predetermined distance which is represented on the initial image such as the width of the channel which is for example 50 pm.
  • the deformation may not be a single real value.
  • the deformation may be a two-dimensional representation of the outline of a drop.
  • the deformation is for example recorded in the form of a table of values. It is then possible to determine the speed by comparing this outline to a list of pre-established outlines, for example during a series of tests with drops traveling through the channel at known speeds. The speed can then be determined by searching for the pre-established outline whose shape is closest to the outline on the initial image, the speed is then determined as the speed corresponding to this pre-established outline.
  • the main direction in which a drop is moving can also form an angle greater than 10 degrees with the pixel lines.
  • the lines of pixels are perpendicular to the movement of the drops 2, i.e. to the main direction D1.
  • the drop 2 when the movement of the drop 2 is perpendicular to the lines of pixels (which are here aligned horizontally), the drop 2 then has, on the initial image 40 (on the right of FIG. 12) an elongated shape of axial symmetry along the main direction D1. This shape also provides information on the speed of the drop 2, in the sense that it makes it possible to determine it: the more elongated the drop, the faster it goes.
  • the drop 2 moves by a quantity Q in the microfluidic channel 31 (on the left of FIG. 12, the drop is shown at the start and end of the acquisition of the initial image) and thus appears on the initial image 40 with an oval shape.
  • the method for determining the production frequency may comprise the construction of derived images.
  • the derived images are constructed by applying a variable homothety coefficient to the vertical dimension of the initial image 40. By varying this homothety coefficient, a series of derived images are obtained on which the drop appears more or less deformed.
  • the outline of the drop On one of the derived images, the outline of the drop has an optimal circularity value, in the sense that the outline of the drop is as close as possible to a circle (the circle corresponding to the real shape of the drop, visible on the left of FIG. 12).
  • the homothety coefficient of this derived image illustrated schematically in FIG. 12, is called the optimum coefficient a.
  • This optimum coefficient a can also be obtained directly from the contour 21 of the drop 2, in the manner of the second embodiment. It is then calculated as the ratio of the length L2 of the drop 2 on the initial image 40 to the width L3 of the drop 2 on the initial image 40. The length L2 and the width L3 of the drop 2 are expressed in pixels.
  • the speed of movement of drop 2 is then equal to: L2(la)/ti_ (with L2 the length of drop 2, a the optimum coefficient, and ti. the line time).
  • the speed of drop 2 is therefore expressed in pixels per unit of time.
  • L2(la) is for its part equal to the quantity Q of movement of drop 2 during the acquisition of the initial image 40.
  • the production frequency is finally calculated by dividing this speed by the vertical distance (in pixels) between two successive drops present on the initial image (at least two drops are present on the initial image although, for simplicity, only one is shown in Figure 12).
  • the production frequency of the drops can thus be calculated on the basis of their contour even when they move perpendicular to the lines of the camera.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination d'une fréquence de production d'une série de gouttes (2) en mouvement dans un canal fluidique (31), le procédé comprenant les étapes suivantes : - acquisition, au moyen d'un dispositif de capture d'images (11) à obturateur déroulant, d'une image initiale d'au moins deux gouttes en série dans le canal fluidique, l'image initiale comprenant une matrice de pixels formant des lignes et des colonnes, les lignes étant acquises séquentiellement les unes après les autres au moyen de l'obturateur déroulant; - détection, à partir de l'image initiale, d'un contour d'au moins une des deux gouttes; - calcul de la fréquence de production sur la base du contour, d'un délai entre l'acquisition de deux lignes de pixels successives, et d'une distance entre les deux gouttes.

Description

Description
Titre de l'invention : Procédé de détermination d'une fréquence de production d'une série de gouttes en mouvement dans un canal fluidique
Domaine technique
[0001] La présente invention concerne de manière générale le domaine technique de la fluidique.
[0002] Elle concerne plus particulièrement un procédé de détermination d'une fréquence de production ou de passage d'une série de gouttes en mouvement dans un canal fluidique.
[0003] L'invention trouve une application particulièrement avantageuse dans la réalisation d'un asservissement de la fréquence de production de gouttes sur une fréquence de référence.
Arrière-plan technologique
[0004] Obtenir une production régulière d'une série de gouttes dans un système fluidique, en particulier dans les systèmes microfluidiques, c'est-à-dire à une fréquence de référence ou de consigne prédéterminée, est un enjeu majeur, notamment en vue d'un tri dynamique de ces gouttes. Toutefois, il ne suffit pas que la pression ou le débit d'injection des fluides, typiquement de l'huile et de l'eau, soient fixés pour obtenir une de production régulière de gouttes en série, en particulier de microgouttes.
[0005] En effet, la fréquence de production des gouttes dépend de la pression au sein du canal fluidique dans lequel les gouttes sont produites, et cette pression au sein du canal met un certain temps à s'établir. Plus le canal est étroit, plus cela prend du temps. Ainsi, avec une pression et un débit constant d'injections des fluides, la fréquence de production des gouttes varie dans le temps.
[0006] Il est donc nécessaire de mesurer, sur les gouttes en mouvement au sein du canal, cette fréquence de production pour la comparer à la fréquence de référence afin de pouvoir établir une contre réaction en ajustant la pression ou le débit d'injection des fluides.
[0007] Il existe des méthodes électriques, basées sur une détection par impédance ou par - ondes des gouttes, pour mesurer la fréquence de production des gouttes. Ces méthodes souffrent cependant d'une fréquence maximum détectable faible (inférieure à 3kHz) puisque les gouttes doivent être suffisamment espacées pour être détectées. Ces méthodes sont donc inadaptées pour un grand nombre d'applications.
[0008] Il existe aussi des méthodes optiques permettant de mesurer des fréquences de production plus élevées pouvant atteindre plusieurs dizaines de kilohertz. Certaines de ces méthodes optiques sont basées sur un codage fluorescent, ce qui nécessite de charger les gouttes avec un liquide fluorescent, d'utiliser un laser et un détecteur très sensible (car le signal fluorescent est faible). Pour se passer de la fluorescence, d'autres méthodes sont basées sur une imagerie très haute fréquence combinée à un comptage des gouttes en série. Dans les deux cas, ces méthodes nécessitent des détecteurs coûteux.
[0009] Il est ainsi apparu le besoin de mesurer à faible coût la fréquence de production des gouttes dans le canal fluidique.
Résumé de l'invention
[0010] Dans ce contexte, la présente invention propose un procédé de détermination d'une fréquence de production d'une série de gouttes en mouvement dans un canal fluidique, le procédé comprenant les étapes suivantes :
- acquisition, au moyen d'un dispositif de capture d'images à obturateur déroulant, d'une image initiale d'au moins deux gouttes en série dans le canal fluidique, l'image initiale comprenant une matrice de pixels formant des lignes et des colonnes, les lignes étant acquises séquentiellement les unes après les autres au moyen de l'obturateur déroulant ;
- détection, à partir de l'image initiale, d'un contour d'au moins une des deux gouttes ;
- calcul de la fréquence de production sur la base du contour, d'un délai entre l'acquisition de deux lignes de pixels successives, et d'une distance entre les deux gouttes.
[0011] Ainsi grâce à l'invention, la fréquence de productions des gouttes est déterminée au moyen d'un dispositif de capture d'images à obturateur déroulant, c'est-à-dire un dispositif de capture d'images peu coûteux. Les dispositifs de capture d'images à obturateur déroulant sont en effet très bon marché, notamment en comparaison des dispositifs à obturateurglobal utilisés dans les méthodes d'imagerie très haute fréquence de l'art antérieur.
[0012] De façon remarquable et contre intuitive, le contour d'une goutte renseigne sur le mouvement de la goutte dans le canal grâce à l'information temporelle contenue dans l'image. En effet, puisque cette unique image est acquise ligne par ligne, i.e. séquentiellement, la forme du contour de la goutte sur cette image dépend de la vitesse de la goutte. Ainsi, évaluer une déformation des gouttes via leur contour permet donc de déterminer leur mouvement dans le canal.
[0013] Par conséquent, en combinant la mesure de la déformation (qui permet de déduire le taux de déformation) à une simple mesure de la distance entre les deux gouttes, l'invention permet de déterminer la fréquence de production de façon peu coûteuse. Avantageusement, la méthode de la présente divulgation ne requiert pas de codage fluorescent de la goutte.
[0014] De manière remarquable, l'image initiale étant composée de pixels, le taux de déformation est exprimé en pixels par unité de temps et la distance entre les deux microgouttes est exprimée en pixels. Ainsi, la dimension du ratio du taux de déformation sur la distance, i.e. la fréquence de production, est directement l'inverse d'un temps. Il n'est donc pas nécessaire de déterminer une vitesse de la goutte en mètres par unité de temps, ce qui nécessite de déterminer un grand nombre de paramètre du système optique, notamment le grossissement du système optique d'imagerie.
[0015] En d'autres termes, le procédé selon l'invention ne nécessite aucune calibration pour déterminer la fréquence de production des gouttes puisque la dimension « pixel » s'élimine dans le ratio du taux de déformation sur la distance. Cela rend notamment l'invention très simple à mettre en œuvre.
[0016] D'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives du procédé conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- il est prévu de : construire des images dérivées à partir de l'image initiale, chaque image dérivée étant associée à une valeur de décalage, les lignes de chaque image dérivée étant successivement translatées, par rapport à leur position sur l'image initiale, d'un nombre de pixels proportionnel à la valeur de décalage associée ladite image dérivée ; détecter, sur chaque image dérivée, un contour dérivé de ladite au moins une des deux gouttes ; déterminer la fréquence de production sur la base additionnelle des contours dérivés déduits des images dérivées ;
- les valeurs de décalage sont croissantes de 1 à un nombre entier positif et chaque ligne de chaque image dérivée est translatée, par rapport à sa position sur l'image initiale, d'un nombre de pixels égal à la valeur de décalage multipliée par un indice de ladite ligne ;
- il est prévu de : calculer un indice de circularité de chaque contour dérivé associé à chaque image dérivée ; déterminer une courbe d'ajustement des indices de circularité en fonction des valeurs de décalage ; déterminer la fréquence de production en fonction d'un minium de la courbe d'ajustement ;
- il est prévu de déterminer une déformation, qui est représentative d'une différence entre une forme de ladite au moins une des deux gouttes sur l'image initiale et une forme circulaire, sur la base d'une différence de position entre une première extrémité de ladite au moins une des deux gouttes dans une ligne de pixels qui est acquise en première lors de l'étape d'acquisition et une deuxième extrémité de ladite au moins une des deux gouttes dans une autre ligne de pixels qui est acquise en dernière lors de l'étape d'acquisition, la fréquence de production étant aussi calculée sur la base de la déformation ;
- il est prévu de : détecter un contour de l'autre des deux gouttes, calculer la fréquence de production sur la base d'une moyenne du contour de ladite au moins une des deux gouttes et du contour de l'autre des deux gouttes ;
- un temps d'acquisition de l'image initiale est inférieur à 10 ms ;
- le canal fluidique ayant une direction longitudinale, il est prévu, avant l'étape d'acquisition, d'agencer le dispositif de capture d'images par rapport au canal fluidique de sorte que, sur l'image initiale, la direction longitudinale du canal fluidique forme un angle inférieur à 10 degrés avec les lignes ;
- il prévu d'éclairer le canal fluidique et lesdites au moins deux gouttes tout au long de l'acquisition au moyen d'une source de lumière ;
- il est prévu de déterminer un centre de gravité de chacune des deux goutte et de calculer la distance entre les deux gouttes comme la distance entre les deux centres de gravité ;
- il est prévu de déterminer une vitesse de ladite au moins une des deux gouttes sur la base du contour, du délai et en prenant en compte au moins un paramètre optique du dispositif de capture d'images ou une distance prédéterminée représentée sur l'image initiale.
[0017] L'invention propose aussi un procédé de production d'une série de gouttes, la série de gouttes étant en mouvement dans un canal fluidique d'un dispositif fluidique, le procédé comprenant les étapes suivantes :
- sélection d'une fréquence de référence pour la production de la série de gouttes ; - détermination d'une fréquence de production de la série gouttes dans le canal fluidique par un procédé tel que décrit ci-dessus ;
- comparaison de la fréquence de production et de la fréquence de référence ;
- détermination, sur la base de la comparaison, d'une consigne de débit ou de pression d'un fluide injecté dans le dispositif fluidique en amont du canal fluidique pour produire la série de gouttes.
[0018] L'invention concerne aussi un dispositif de détermination d'une fréquence de production d'une série de gouttes en mouvement dans un canal fluidique, le système comprenant un dispositif de capture d'images à obturateur déroulant adapté à acquérir une image initiale d'au moins deux gouttes en série dans le canal fluidique, l'image initiale comprenant une matrice de pixels formant des lignes et des colonnes, les lignes étant acquises séquentiellement les unes après les autres au moyen de l'obturateur déroulant, et un calculateur programmé pour mettre en œuvre :
- la détection, à partir de l'image initiale l'image initiale, d'un contour d'au moins une des deux gouttes ;
- le calcul de la fréquence de production, sur la base du contour, d'un délai entre l'acquisition de deux lignes de pixels successives et d'une distance entre les deux gouttes.
[0019] L'invention concerne enfin un système de tri de gouttes comprenant un dispositif tel que décrit ci-dessus.
[0020] Avantageusement, le système est un dispositif microfluidique ou un cytomètre en flux.
[0021] Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
Description de l'invention
[0022] La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.
[0023] Sur les dessins annexés : [0024] [Fig. 1] est une vue schématique d'un système de détermination d'une fréquence de production de gouttes en mouvement dans un canal fluidique.
[0025] [Fig. 2] est une illustration schématique d'une acquisition d'une image par obturateur déroulant représentant des opérations sur des lignes de capteurs en fonction du temps (t).
[0026] [Fig. 3] est un schéma bloc d'une séquence d'étapes permettant de déterminer la vitesse et la fréquence de production de gouttes en mouvement dans un canal fluidique au moyen du système de la figure 1.
[0027] [Fig. 4] est une image acquise séquentiellement, au moyen du système de la figure 1, d'une pluralité de gouttes en mouvement dans un canal fluidique.
[0028] [Fig. 5] est une image dérivée de l'image de la figure 4 construite en décalant les lignes de pixels avec une première valeur de décalage.
[0029] [Fig. 6] est une autre image dérivée de l'image de la figure 4 construite en décalant les lignes de pixels avec une autre valeur de décalage.
[0030] [Fig. 7] est encore une autre image dérivée de l'image de la figure 4 construite en décalant les lignes de pixels avec encore une autre valeur de décalage.
[0031] [Fig. 8] est une représentation d'un traitement de l'image de la figure 6 illustrant une détermination des contours des gouttes.
[0032] [Fig. 9] est une représentation graphique d'indices de circularité des gouttes sur des images dérivées (comme représenté sur les figures 6, 7 et 8) en fonction des décalages utilisés pour construire les images dérivées, ainsi que d'une courbe d'ajustement permettant de déterminer une valeur de décalage optimum.
[0033] [Fig. 10] est une représentation schématique d'une goutte de la pluralité de gouttes de la figure 4 permettant de déterminer une déformation des gouttes.
[0034] [Fig. 11] est un schéma bloc d'une séquence d'étapes permettant la production de gouttes avec une régulation de leur fréquence de production.
[0035] [Fig. 12] est une représentation schématique d'une goutte (gauche) et d'une image acquise séquentiellement de cette goutte (droite), la goutte se déplaçant perpendiculairement aux lignes de pixels pendant l'acquisition de l'image. [0036] La figure 1 représente un système 1 de détermination d'une fréquence de production fp d'une série de gouttes 2 en mouvement dans un dispositif fluidique 3. Les gouttes 2 sont plus particulièrement en mouvement dans un canal fluidique 31 du dispositif fluidique 3. Comme le montre la figure 1, le canal fluidique 31, par la suite appelé canal 31, est ici rectiligne suivant une direction longitudinale. Les gouttes 2 ont ainsi un mouvement de translation rectiligne dans le canal 31. Sur la figure 4, les gouttes 2 se déplacent rectilignement de gauche à droite parallèlement à la direction longitudinale du canal 31. Comme le montre la figure 1, les gouttes 2 de la série sont situées les unes derrière les autres le long de la direction longitudinale, cela signifie que la série de gouttes 2 forme une ligne de gouttes 2.
[0037] Dans l'exemple de réalisation décrit ici, c'est-à-dire en référence aux figures 1 à 11, le dispositif fluidique 3 est plus particulièrement un dispositif microfluidique 3, aussi appelé puce microfluidique, tel que représenté en figure 1. Dans cet exemple, le canal 31 est alors un canal microfluidique. La section du canal 31 est alors par exemple comprise entre 10 pm2 et 150 000 pm2 et la longueur entre 50 pm et 1 cm. Les gouttes 2 sont alors plus particulièrement des microgouttes 2, ce qui signifie que leur taille, i.e. ici leur diamètre, est par exemple comprise entre 1 pm et 300 pm.
[0038] Les gouttes 2 ont dans le canal 31 une forme qui est globalement sphérique ou une forme de sphère aplatie. Le dispositif fluidique 3 est ici sensiblement plan. Le plan du dispositif fluidique 3, référencé PI sur la figure 1, est notamment parallèle à la direction principale. Parallèlement à ce plan PI, les gouttes 2 présentent une forme circulaire, ce qui signifie que leur contour est globalement un cercle.
[0039] Le dispositif microfluidique 3 comprend aussi un canal central 32 d'injection et deux canaux latéraux 33 d'injection débouchant sur une jonction 35 avec le canal central 32, de part et d'autre de, et perpendiculairement à, cette jonction 35. Le canal central 32 contient un liquide d'échantillon qui est par exemple de l'eau pure ou un milieu aqueux tel qu'un tampon phosphate salin (PBS), et les canaux latéraux 33 un liquide de gaine qui est par exemple de l'huile. Dans ce cas, les gouttes 2 sont alors des microgouttes d'eau en suspension dans l'huile. Les gouttes 2 sont produites lorsque les flux d'huile 4 divisent le flux d'eau 5 en volumes distincts. La production des gouttes 2 a ici lieu à la jonction 35 du canal central 32 avec les canaux latéraux 33. Après avoir parcouru le canal 31, les gouttes 2 sont par exemple collectées dans un réservoir 34 connecté en sortie du canal 31. [0040] De préférence, les gouttes 2 sont triées (mécanisme non représenté) avant d'être collectées. Pour cela, les gouttes 2 sont par exemple analysées par fluorescence au moyen d'un laser. Lorsqu'une goutte d'intérêt est détectée, elle est alors extraite canal pour être orientée dans un canal de collection. Connaître la fréquence de production fp des gouttes 2 est alors important pour synchroniser l'extraction de la goutte du flux de liquide.
[0041] D'autres configurations du dispositif microfluidique 3 sont envisageables. De même d'autres liquides d'échantillon et d'autres liquides de gaine peuvent être utilisées, par exemple pour former des microgouttes d'huile en suspension dans de l'eau.
[0042] En variante de l'exemple représenté sur les figures, le dispositif fluidique est un cytomètre en flux. Les gouttes présentent alors un diamètre qui est par exemple compris entre 30 pm et 300 pm. Le canal fluidique peut alors être ouvert dans le sens où il n'est pas délimité par des parois en verre ou en plastique mais par de l'air. Les gouttes sont produites dans le flux par la vibration d'un actionneur piézoélectrique.
[0043] De façon générale, la fréquence de production fp des gouttes 2 est ici définie comme l'inverse du temps séparant la production de deux gouttes 2 successives, i.e. deux gouttes 2 produites l'une après l'autre. La fréquence de production fp est ici égale à la fréquence de passage dans le canal microfluidique 31.
[0044] Comme le montre la figure 1, le système 1 comprend un dispositif de capture d'images
11 agencé pour acquérir au moins une image des gouttes 2. Le canal 31 comprenant les gouttes 2 est situé dans le champ de vue C du dispositif de capture d'images 11. Ici, le système 1 comprend aussi une source de lumière 12 située à l'opposé du dispositif de capture d'images 11 par rapport au canal 31. Le canal 31 est ainsi interposé entre la source de lumière
12 et le dispositif de capture d'images 11 de sorte à être imagé par transparence. En variante, l'éclairage peut se faire du même côté que le dispositif de capture d'images, par réflexion sur le dispositif fluidique 3.
[0045] Pour simplifier la compréhension, la figure 1 représente schématiquement deux plans qui sont en pratique distincts et plus particulièrement orthogonaux. Un premier plan est le plan PI du dispositif fluidique 3 (correspondant au plan de la figure) et un deuxième plan est celui selon lequel sont alignés le dispositif de capture d'images 11 et la source de lumière 12. En d'autres termes, le dispositif de capture d'images 11 et la source de lumière 12 sont en pratique alignés selon une direction perpendiculaire au plan de la figure 1 et le dispositif fluidique 3 représenté en figure 1 correspond à une image qui pourrait être acquise par le dispositif de capture d'images 11.
[0046] Le dispositif de capture d'images 11 comprend plus particulièrement un obturateur déroulant, plus connu sous le nom anglais de « rolling shutter ». Chaque image qu'il acquiert est ainsi acquise de manière séquentielle dans le sens où elle est acquise ligne par ligne.
[0047] Classiquement, l'obturateur déroulant est ici réalisé de manière électronique.
[0048] Le dispositif de capture d'images 11 comprend plus particulièrement un détecteur constitué d'une pluralité de capteurs, ici des capteurs CMOS, agencés selon une matrice formant des lignes LI, L2 et des colonnes (les termes lignes et colonnes étant interchangeables puisque conventionnelles). Le fonctionnement du dispositif de capture d'images 11 est illustré en figure 2. Chaque image est acquise séquentiellement, ligne de capteurs par ligne de capteurs. La première ligne L1 de capteurs, ici celle du haut, est initialisée (bloc I sur la figure 2), puis intègre la lumière provenant du canal 31 éclairée par la source de lumière 12 (bloc E sur la figure 2), puis les signaux électriques produits par les capteurs sont lus (bloc L sur la figure 2), i.e. collectés par un circuit électrique dédié. La deuxième ligne L2 de capteurs est acquise avec un décalage temporel par rapport à la première ligne Ll. Cela signifie que : i) la deuxième ligne L2 est initialisée après la fin de l'initialisation de la première ligne Ll, ii) les temps d'intégration des deux lignes se superposent partiellement, iii) la deuxième ligne L2 est lue après la fin de la lecture de la première ligne Ll. Comme le montre la figure 2, il en va de même pour les lignes suivantes.
[0049] Ainsi, le mécanisme d'obturateur déroulant est obtenu par un déroulement électronique du détecteur.
[0050] Chaque image acquise comprend une matrice de pixels formant des lignes et des colonnes. Sur la figure 4, les lignes de pixels s'étendent de droite à gauche et les colonnes de haut en bas. Les lignes de pixels correspondent aux lignes Ll, L2 de capteurs et les colonnes de pixels correspondent aux colonnes de capteurs. En d'autres termes, chaque image est aussi acquise séquentiellement ligne de pixels par ligne de pixels. Ainsi, un objet en mouvement dans le champ de vue C du dispositif de capture d'images 11 lors de l'acquisition de l'image apparaît déformé puisque ses différentes portions sont acquises par différentes lignes LI, L2 de capteurs à des instants successifs.
[0051] Le dispositif de capture d'images 11 comprend aussi son propre processeur conçu pour interpréter les signaux collectés par le circuit électrique dédié afin de construire les images.
[0052] Le temps entre l'acquisition de deux lignes de capteurs successives, appelé par la suite temps ligne ti., est une donnée intrinsèque du dispositif de capture d'images 11. Le temps ligne tL est plus spécifiquement égal à un délai entre deux actions identiques du dispositif de capture d'images 11 sur deux lignes de capteurs successives, par exemple la première ligne L1 et la deuxième ligne L2. Le temps ligne tL correspond donc au décalage temporel précité. Le temps ligne tL est donc aussi égal au délai entre l'acquisition d'une ligne de pixels et l'acquisition de la ligne de pixels suivante, c'est-à-dire au délai entre l'acquisition de deux lignes de pixels successives, l'acquisition d'une ligne de pixels débutant à l'initialisation (bloc I) de la ligne de capteurs correspondante.
[0053] Le temps ligne tL est par exemple le délai entre le début de l'initialisation d'une ligne de capteurs et le début de l'initialisation de la ligne de capteurs suivante (comme cela est représenté sur la figure 2) ou encore le délai entre le début de la lecture d'une ligne et le début de la lecture de la ligne de capteurs suivante. En pratique, cette donnée est fournie par le constructeur du dispositif de capture d'images 11. De préférence, le dispositif de capture d'images 11 est sélectionné de sorte à présenter un temps ligne tL inférieur à 10 ps. Le temps ligne tL correspond à un paramètre de construction du dispositif de capture d'images 11 à obturateur déroulant. Le temps ligne tL reste constant pour un dispositif de capture d'images à obturateur déroulant donné.
[0054] Comme le montre la figure 1, le système 1 comprend aussi un calculateur 13 configuré pour commander le dispositif de capture d'images 11. Le calculateur 13 comprend ici au moins une mémoire et au moins un processeur. La mémoire est un support d'enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu'elles sont exécutées par le processeur permettent de commander le dispositif de capture d'images 11. Le calculateur 13 est notamment configuré pour déclencher les captures d'images. [0055] Le calculateur 13 est plus particulièrement programmé pour mettre en œuvre un procédé de détermination de la fréquence de production fp des gouttes 2, et cela à partir de la capture d'une seule image 40, appelée par la suite image initiale 40, par le dispositif de capture d'images 11. Ce procédé est ici mis en œuvre par le système 1. Bien entendu, il peut être mis en œuvre par tout système approprié qui se base sur une acquisition séquentielle d'images.
[0056] Le procédé de détermination de la fréquence de production fp comprend les étapes principales suivantes :
- acquisition, au moyen du dispositif de capture d'images 11 à obturateur déroulant, de l'image initiale 40 d'au moins deux gouttes 2 dans le canal 31 ;
- détection, à partir de l'image initiale 40, d'un contour 21 d'une des deux gouttes 2 ;
- détermination, sur la base du contour 21, d'un taux de déformation T de la goutte 2 ;
- détermination d'une distance entre les deux gouttes 2 ;
- calcul, sur la base du taux de déformation T, du temps ligne ti., et de la distance entre les deux gouttes 2, de la fréquence de production fp.
[0057] Le procédé comprend ici une étape de détermination du taux de déformation T qui est un paramètre intermédiaire servant à la détermination de la fréquence de production fp. Le taux de déformation T est représentatif du mouvement, c'est-à-dire la vitesse, de la goutte 2 dans le canal 31. Le taux de déformation T correspond ici à une valeur partiellement adimensionnée de la vitesse des gouttes 2 dans le sens où il est exprimé en pixels par unité de temps. Le taux de déformation T dépend de la vitesse des gouttes 2 et de l'agencement du dispositif de capture d'image 3 par rapport au canal 31.
[0058] Le contour 21 de la goutte 2 renseigne sur le déplacement de la goutte 2 au cours de l'acquisition de l'image initiale 40. En effet, puisque la goutte 2 avance au cours de l'acquisition, son contour 21 apparait déformé par rapport à un cercle.
[0059] De préférence, le procédé comprend une étape préalable (non représentée) d'agencement du dispositif de capture d'images 11 par rapport au canal 31 de sorte que, sur l'image initiale 40, une direction principale DI selon laquelle les gouttes 2 sont en mouvement ou la direction longitudinale du canal microfluidique 31 forme un angle inférieur à 10 degrés avec les lignes de pixels. Ici, la direction longitudinale du canal microfluidique 31 est parallèle à la direction principale Dl.
[0060] De manière encore plus préférentielle, l'image initiale 40, la direction principale Dl ou la direction longitudinale du canal microfluidique 31 est parallèle aux lignes de pixels, comme c'est le cas sur la figure 4 sur laquelle deux lignes de pixels LP1, LP2 sont représentées.
[0061] Comme le montre la figure 3, le procédé commence plus particulièrement par une première étape El d'acquisition de l'image initiale 40. Au cours de la première étape El, la source de lumière 12 est ici allumée. De préférence, la source de lumière 12 est allumée en continu pendant l'intégralité du procédé.
[0062] Dans l'exemple représenté en figure 4, une pluralité de gouttes 2, ici une vingtaine de gouttes 2, est comprise dans le champ de vue C au cours de l'acquisition de l'image initiale 40. En conséquence, la pluralité de gouttes 2 est représentée sur l'image initiale 40. Comme cela apparaît par la suite, avoir plusieurs gouttes 2 sur l'image initiale 40 permet de déterminer des valeurs moyennes (ou médianes) ce qui augmente la précision de la détermination de la fréquence de production fp. Les gouttes 2 de cette pluralité, i.e les gouttes 2 représentées sur l'image initiale 40, sont par la suite appelés « les gouttes ».
[0063] Toutefois, la fréquence de production fp peut être déterminée sur la base de seulement deux gouttes 2. En d'autres termes, imager seulement deux gouttes 2 (donc successives) peut suffire à déterminer la distance et donc la fréquence de production fp. En revanche, imager une seule goutte 2 suffit pour déterminer le taux de déformation T.
[0064] La portion du canal 31 imagée est ici régulière, en ce sens qu'il présente une section constante sur toute l'image initiale 40. Par conséquent, les gouttes 2 se déplacent toutes avec la même vitesse, leur taux de déformation T est donc identique. En variante, lorsque la portion du canal 31 imagée est irrégulière, seule une section régulière, ou la plus régulière possible, de cette portion est prise en compte dans le procédé.
[0065] Comme expliqué précédemment, l'image initiale 40 est acquise ligne de pixels par ligne de pixels. Ici, la première ligne LP1 située en haut de la figure 4 est acquise en première, les autres lignes sont successivement acquises en partant de la première ligne LP1.
[0066] Avantageusement, lorsque la direction principale Dl est parallèle aux lignes de pixels, des portions correspondantes des gouttes 2 sont acquises en même temps puisque situées sur une même ligne de pixels. Les déformations des différentes gouttes 2 représentées sur l'image initiale 40 sont ainsi sensiblement identiques, ce qui augmente la précision de la détermination du taux de déformation T.
[0067] Dans un premier mode de réalisation du procédé de détermination du taux de déformation T, représenté en figure 3, la détermination du taux de déformation T est basée sur la construction d'images dérivées 41. L'idée de ce premier mode de réalisation est de recaler l'image initiale 40 au moyen des images dérivés 41 de manière à obtenir des gouttes 2 de forme circulaire sur au moins une image dérivée 41. Le recalage permettant d'obtenir une forme circulaire renseigne sur le déplacement des gouttes 2 au cours de l'acquisition de l'image initiale 40, et donc du taux de déformation T des gouttes 2.
[0068] Ainsi, dans le premier mode de réalisation, le procédé continue avec une deuxième étape E2 au cours de laquelle le calculateur 13 construit les images dérivées 41.
[0069] La deuxième étape E2 comprend tout d'abord la détermination de valeurs de décalage. De façon générale, les valeurs de décalage sont des nombres entiers positifs distincts les uns des autres. Les valeurs de décalage sont de préférence tous les nombres entiers positifs de 1 à une valeur de décalage maximum N. Les valeurs de décalage peuvent aussi varier de n à N par pas de p, avec n>l et p>l, par exemple n=p=5. Cela permet, au détriment de la précision sur la détermination du taux de déformation T, de réduire le temps de calcul. La valeur de décalage maximum N est ici prédéterminée. Elle est par exemple comprise entre 20 et 1000. La valeur de décalage maximum N peut ici dépendre d'une vitesse estimée des gouttes.
[0070] Chaque image dérivée 41 est associée de manière bijective à une valeur de décalage. Chaque image dérivée 41 est alors construite en translatant successivement les lignes de pixels d'un nombre de pixels proportionnel à la valeur de décalage qui est associée à ladite image dérivée 41. Translater signifie ici déplacer ou décaler les lignes de pixels par rapport à leur position sur l'image initiale 40. En d'autres termes, la translation est un décalage dans la direction des lignes de pixels (i.e. de droite à gauche sur la figure 4). Les lignes de pixels sont translatées à l'opposé du mouvement des gouttes 2, i.e. un sens contraire au mouvement des gouttes 2. Cela permet de compenser, sur les images dérivées 41 la déformation des gouttes due à leur déplacement au cours de l'acquisition de l'image 41. Ici, en référence à la figure 4, les lignes de pixels sont ainsi translatées vers la gauche puisque les gouttes se déplacent vers la droite.
[0071] Chaque ligne de pixels de chaque image dérivée 41 est plus spécifiquement translatée d'un nombre de pixels égal à la valeur de décalage multipliée par un indice de ladite ligne de pixels. Par convention, sur l'image initiale 40 illustrée en figure 4, les indices sont ici des nombres entiers positifs comptés de la ligne du haut, d'indice 1, à la ligne du bas. Cette construction d'images dérivées 41 est illustrée en détails sur les figures 5, 6 et 7.
[0072] La figure 5 illustre une première image dérivée 41A correspondant à la valeur de décalage 5, à partir de l'image initiale 40 représentée en figure 4. La première ligne LP1, i.e. la ligne du haut d'indice 1, est translatée de 5 pixels (5x1) vers la gauche. Ensuite, la deuxième ligne LP2, i.e. la ligne en deuxième position en partant du haut et d'indice 2, est translatée de 10 pixels (5x2) vers la gauche. La première ligne LP1 et la deuxième ligne LP2, qui sont strictement en vis-à-vis sur l'image initiale 40, sont donc désormais décalées de 5 pixels l'une par rapport à l'autre sur la première image dérivée 41A. De façon itérative, la troisième ligne d'indice 3 est translatée de 15 pixels et ainsi de suite.
[0073] La figure 6 illustre une deuxième image dérivée 41B correspondant à la valeur de décalage 10, à partir de l'image initiale 40 représentée en figure 4. La première ligne d'indice 1 est translatée de 10 pixels (10x1), la deuxième ligne d'indice 2 de 20 pixels (10x2) et ainsi de suite. La figure 7 illustre une troisième image dérivée 41C correspondant à la valeur de décalage 15, à partir de l'image initiale 40 représentée en figure 4. La première ligne d'indice 1 est translatée de 15 pixels (15x1), la deuxième ligne d'indice 2 de 30 pixels (15x2) et ainsi de suite. Sur les figures 5 à 7, la forme des gouttes 2 semble être la plus proche d'une forme circulaire pour la valeur de décalage 10. Au-delà de la valeur 10, la circularité des gouttes 2 se dégrade à nouveau.
[0074] A titre d'exemple, 25 images dérivées 41 sont construites à la deuxième étape E2 pour des valeurs de décalage allant de 1 à 25 par pas de 1.
[0075] Une fois les images dérivées 41 construites, le procédé se poursuit par une troisième étape E3 de détection des contours 21' des gouttes 2 sur les images dérivées 41. Les contours des gouttes 2 sur les images dérivées 41 sont par la suite appelée contours dérivés 21'. [0076] Au cours de la troisième étape E3, le calculateur 13 détecte plus particulièrement le contour dérivé 21' de chaque goutte 2 sur chaque image dérivée 41. Ici, seules les gouttes 2 représentées en intégralité sont prises en compte, celles partiellement représentées qui se situent en bordure d'image sont exclues.
[0077] Les contours dérivés 21' sont par exemple détectés au moyen d'un seuillage sur l'intensité des pixels. En effet, comme le montrent les figures 4 à 7, il existe un contraste entre le liquide d'échantillon et le liquide de gaine, ce qui permet d'extraire les surfaces 22 correspondant aux gouttes 2. les gouttes 2 sont ici plus sombres que le liquide de gaine. Toutefois, les gouttes 2 peuvent aussi apparaître plus clair que le liquide de gaine ou parfois comme un simple liseré blanc ou noir correspondant au contour (seuls les contours sont alors visibles). La méthode d'extraction des contours dérivés 21' est adaptée à la situation.
[0078] Les surfaces 22 des gouttes représentées en figure 6 sont par exemple illustrées en figure 8. Comme le montre la figure 8, les contours dérivés 21' sont alors déterminés comme le bord de ces surfaces 22. De préférence, le seuillage en intensité est local.
[0079] Les contours dérivés 21' peuvent aussi être détectés au moyen d'un filtrage pour détection de contours, tel qu'un filtre Sobel ou un filtre de Kany, ou grâce à un filtre de recherche d'objets circulaires par exemple par une transformée de Hough.
[0080] Le procédé comprend ensuite une quatrième étape E4 dans laquelle le calculateur 13 calcule un indice de circularité de chaque contour dérivé 21'. Un indice de circularité est une valeur, ici réelle positive, représentative de la proximité de forme d'un contour 21 ou d'un contour dérivé 21' avec un cercle. Un indice de circularité d'un contour 21 ou d'un contour dérivé 21' d'une goutte 2 est par exemple calculé sur la base d'un ratio entre le périmètre de la goutte 2 et l'aire de la goutte 2. Ici, l'indice de circularité est calculé selon l'indice de Heywood. Il peut aussi être calculé sur la base d'un ratio entre un grand axe et un petit axe de la goutte 2.
[0081] Ici, pour chaque image dérivée 41, un indice de circularité moyen est calculé comme la moyenne des indices de circularité de chaque goutte 2 représentée sur l'image dérivée 41. En suivant l'exemple précédent, la quatrième étape E4 comprend le calcul de 25 indices de circularité moyens pour les 25 images dérivées 41 construites à la deuxième étape E2. [0082] Le procédé comprend ensuite une cinquième étape E5 de détermination, sur la base des indices de circularité moyens, d'une valeur de décalage optimum M. La valeur de décalage optimum M est celle qui corrige le mieux le contour 21 de la goutte 2 pour approcher un cercle. La valeur de décalage optimum M est ici une valeur réelle sans dimension. La valeur de décalage optimum M est en effet exprimée en pixels dans le sens où sa valeur est un nombre réel représentatif d'un nombre de pixels.
[0083] La cinquième étape E5 comprend ici la détermination par le calculateur 13 d'une courbe d'ajustement 50 des indices de circularité moyens en fonction des valeurs de décalage. Chaque image dérivée 41 étant associée à une valeur de décalage, chaque indice de circularité moyen est donc aussi associé à une valeur de décalage. Une représentation graphique des indices de circularité moyens en fonction des valeurs de décalage apparaît sur la figure 9.
[0084] La courbe d'ajustement 50 est ici obtenue en ajustant, par exemple par la méthode des moindres carrés, une fonction polynomiale avec en entrée les valeurs de décalage et en sortie les indices de circularité moyens. La courbe d'ajustement 50 ainsi une fonction polynomiale qui représente statistiquement les indices de circularité moyens en fonction des valeurs de décalage. La courbe d'ajustement 50 est ainsi ici obtenue par une régression polynomiale. La fonction polynomiale présente par exemple un degré compris entre 2 et 6. En variante, la courbe d'ajustement pourrait aussi être obtenue par une régression exponentielle.
[0085] En suivant l'exemple précédant, la figure 9 illustre la courbe d'ajustement 50 obtenue pour les 25 indices de circularité moyens calculés à la quatrième étape E4.
[0086] Une fois la courbe d'ajustement 50 calculée, le calculateur 13 détermine le minimum de la courbe d'ajustement 50. Cette détermination est par exemple réalisée au moyen d'une analyse de la dérivée de la courbe d'ajustement 50.
[0087] Comme le montre la figure 9, dans ce premier mode de réalisation, la valeur de décalage optimum M est alors définie comme l'abscisse M du minimum de la courbe d'ajustement 50. La valeur de décalage optimum M est donc celle dont l'image par la courbe d'ajustement 50 est minimum.
[0088] Ainsi, de façon remarquable, la précision sur la valeur de décalage optimum M est supérieure à la résolution de l'image initiale 40 (en ce sens qu'elle est une valeur avec des décimale et non pas entière) car toutes les valeurs de décalage utilisées pour construire les images dérivées 41 sont prises en compte avec la courbe d'ajustement 50.
[0089] En variante, il est possible de ne pas implémenter la cinquième étape E5 et de simplement déterminer valeur de décalage optimum comme égale à la valeur de décalage correspondant à l'indice de circularité moyen le plus petit.
[0090] Le procédé comprend ensuite une sixième étape E6 de calcul du taux de déformation T des gouttes 2. Le taux de déformation T des gouttes 2 est déterminé sur la base de valeur de décalage optimum M et du temps ligne ti_. Le calculateur 13 calcule plus spécifiquement le taux de déformation T comme le ratio de valeur de décalage optimum M sur le temps ligne ti_. La dimension taux de déformation T est donc ici l'inverse d'un temps. Le temps ligne ti. étant ici exprimé en ps, le taux de déformation T est exprimée en pixels par microseconde.
[0091] En variante de ce premier mode de réalisation, la valeur de décalage maximum N n'est pas prédéterminée mais les images dérivées sont construites jusqu'à ce qu'un critère d'arrêt soit atteint, i.e. sans connaître à l'avance le nombre d'image dérivées qui seront construites. En d'autres termes, une boucle de type « tant que » est mise en œuvre à la place d'une boucle de type « pour ». Pour chaque image dérivée, les étapes E3, E4 et E5 sont alors implémentées de manière à calculer l'indice de circularité moyen de ladite image dérivée. Ce critère d'arrêt est par exemple la fait que le dernier indice de circularité moyen calculé (i.e. celui de la dernière image dérivée construite) est supérieur à l'indice de circularité moyen de la première image dérivée ou le fait que la différence entre le dernier et l'avant dernier indice de circularité moyen est trois fois supérieure à variance des indices de circularité moyens déjà calculés. La courbe d'ajustement peut aussi être ajustée au fur et à mesure que les indices de circularité moyens sont calculés. Le critère d'arrêt peut alors aussi être le fait que la courbe d'ajustement devient à nouveau décroissante ou atteint un deuxième minium local, la valeur de décalage optimum étant alors définie comme l'abscisse du premier minimum local de la courbe d'ajustement. La valeur de décalage maximum N est alors celle correspondant au critère d'arrêt.
[0092] Dans un deuxième mode de réalisation, représenté en figure 10, le calculateur détermine une déformation du contour 21 de la goutte 2 directement partir de l'image initiale 40. La déformation est représentative d'une différence entre une forme d'une goutte 2 dans le canal 31 et une forme de cette goutte 2 sur l'image initiale 40.
[0093] Pour une goutte 2 donnée, la déformation est alors calculée sur la base d'une différence de position entre :
- une première extrémité 24 de la goutte 2 qui est acquise en première ; et
- une deuxième extrémité 25 de la goutte 2 qui est acquise en dernière.
[0094] Ce deuxième mode de réalisation peut aussi comprendre la détection des contours 21 des gouttes 2 représentées sur l'image initiale 40. Un contour moyen peut alors être reconstruit comme la moyenne de ces contours 21. La première extrémité 24 et la deuxième extrémité 25 sont alors respectivement le point le plus haut et le point le plus bas, perpendiculairement au sens des lignes de pixels, du contour moyen.
[0095] Comme le montre la figure 10, dans ce deuxième mode de réalisation, la déformation est alors égale à la distance D en pixels selon les lignes de pixels entre la première extrémité 24 et la deuxième extrémité 25 de la goutte 2 divisé par la hauteur H de la goutte 2 en pixels selon les colonnes. La goutte 2 étant de forme généralement circulaire dans le plan PI du dispositif fluidique 3, la première extrémité 24 et la deuxième extrémité 25 devraient être situées l'une à la verticale de l'autre sur une image non déformée. La déformation est donc bien représentative du déplacement de la goutte 2 au cours de l'acquisition de l'image.
[0096] Ainsi, dans ce deuxième mode de réalisation, la déformation est représentative de la comparaison entre la forme de cette goutte 2 sur l'image initiale 40 (directement ou via les images dérivées) avec un cercle, i.e. avec la forme de cette goutte 2 dans le dispositif fluidique 3 parallèlement au plan PI du dispositif fluidique 3.
[0097] Enfin, le calculateur 13 calcule le taux de déformation T comme le ratio de la déformation sur le temps ligne ti_.
[0098] Comme le montre la figure 3, quel que soit le mode de réalisation, le procédé de détermination de la fréquence de production fp comprend ensuite une septième étape E7 de détermination d'une distance entre deux gouttes 2 successives.
[0099] De préférence, la distance entre les deux gouttes 2 successives est une moyenne réalisée sur l'ensemble des gouttes 2 représentées sur l'image initiale 40. Ceci augmente la précision de la détermination de la distance, et donc de la détermination de la fréquence de production fp. Pour cela, la septième étape E7 comprend par exemple le calcul de la distance entre cinq gouttes 2 produites successivement, et la division de cette distance par quatre (i.e. le nombre d'intervalles entre les cinq gouttes) pour obtenir la distance entre deux gouttes 2 successives.
[0100] La distance entre les deux gouttes 2 successives est plus particulièrement un pas P entre ces deux gouttes 2. Le pas P est ici déterminé sur la base de l'image initiale 40. Alternativement, elle peut être déterminée sur la base des images dérivées 41.
[0101] Le pas P est ici une distance entre deux points correspondants de chaque goutte 2, i.e. les mêmes points respectifs sur chacune des gouttes 2. A titre d'exemple, lorsque le point le plus en amont (par rapport au sens de déplacement des gouttes, i.e. ici le point le plus à gauche) d'une première goutte 2 est considéré, le pas P avec la deuxième goutte 2 est calculée comme la distance entre ledit point et le point le plus en amont de la deuxième goutte 2.
[0102] De préférence, les points correspondants sont les centres de gravités G des gouttes 2, ce qui permet de moyenner les positions des gouttes 2 pour une détermination plus précise du pas P. Utiliser les centres de gravités G permet de plus de s'affranchir d'éventuelles fluctuations de diamètres d'une goutte à l'autre. Ainsi, de préférence, le pas P entre deux gouttes 2 est la distance entre leur centre de gravité G, comme cela apparaît sur la figure 4. Le pas P entre les gouttes 2 est alors calculée comme la norme d'un vecteur reliant les centres de gravités G des deux gouttes 2.
[0103] Comme cela apparaît sur la figure 10. Les centres de gravité G des gouttes 2 sont ici déterminés en détectant les contours 21 des gouttes 2 sur l'image initiale 40 et en déterminant les barycentres des contours 21. Lorsque les images dérivés 41 sont utilisées, les centres de gravité G des gouttes 2 sont ici déterminés en détectant les contours dérivés 21' et en déterminant les barycentres des contours dérivés 21'.
[0104] Le procédé comprend enfin une huitième étape E8, dans laquelle le calculateur 13 calcule la fréquence de production fp en effectuant la division du taux de déformation T des deux gouttes 2 par la distance entre les deux gouttes 2.
[0105] Avantageusement, la distance entre deux gouttes 2 est exprimée en pixels dans le sens où sa valeur est un nombre réel représentatif d'un nombre de pixels. Ainsi, puisque le taux de déformation T est aussi exprimée en pixels (par unité de temps), la dimension de la fréquence de production fp calculée est directement l'inverse d'un temps. En d'autres termes, il n'est pas nécessaire d'exprimer les valeurs intermédiaires de calcul (distance, taux de déformation) en mètres ou micromètres pour déterminer la fréquence de production fp car la dimension « pixel » s'annule lors de la division. Cela évite de recourir à une calibration du système ou à une détermination complexe des paramètres optiques du système 1. Le système 1 peut ainsi être rapidement et simplement mis en œuvre.
[0106] De façon remarquable, le procédé permet de déterminer des fréquences de production fp très élevées, par exemple comprises en 10 et 60 kHz (i.e. 10000 et 60 000 gouttes par seconde). En effet, comme le montre la figure 4, le procédé est adapté à déterminer la fréquence de production fp de gouttes 2 très proches les unes des autres, voire au contact les unes des autres.
[0107] Le procédé de détermination de la fréquence de production fp est ici mis en œuvre dans un procédé de production des gouttes 2 illustré en figure 11. L'idée de ce procédé est, en déterminant la fréquence de production fp tout au long de la production des gouttes 2, d'asservir la fréquence de production fp sur une fréquence de référence fr.
[0108] Le procédé de production des gouttes 2 comprend classiquement la production des gouttes 2 dans le canal 31 en injectant le liquide d'échantillon et le liquide de gaine au moyen de pompes et/ou de pousse-seringues.
[0109] Comme le montre la figure 11, le procédé de production des gouttes 2 commence plus particulièrement par une étape E0 de sélection de la fréquence de référence fr pour la production des gouttes 2. Cette fréquence de référence fr permet d'estimer des consignes initiales de pression, lorsque des pompes sont utilisées pour produire les gouttes 2, ou de débit, lorsque des pousse-seringues sont utilisées pour produire les gouttes 2. Ces consignes initiales permettent de produire les gouttes 2 dont la fréquence de production fp est déterminée tel que décrit ci-dessus.
[0110] Comme expliqué en introduction, il est très complexe voire impossible de précisément estimer ces consignes initiales de manière à atteindre la fréquence de référence fr puisque la pression dans le dispositif fluidique 3 varie au cours du temps. Cependant, grâce à la mesure de la fréquence de production fp, les consignes initiales peuvent être modifiées pour stabiliser la fréquence de production fp autour de la fréquence de référence fr. [0111] Pour cela, le procédé comprend tout d'abord une étape E9 de détermination de la fréquence de production des gouttes 2 dans le canal 31 au moyen du procédé de détermination de la fréquence de production fp. Ici, l'étape E9 correspond à la combinaison des étapes El à E8 décrites précédemment.
[0112] Le procédé comprend ensuite une étape E10 de comparaison de la fréquence de production fp mesurée à l'étape E9 avec la fréquence de référence fr sélectionnée à l'étape E0. Lors de l'étape E10, le calculateur 13 effectue ici la différence entre la fréquence de production fp et la fréquence de référence fr.
[0113] Le procédé comprend enfin une étape Eli de détermination de consignes ajustées de débit ou de pression pour les liquides injectés dans le dispositif fluidique 3 en amont du canal 31. Les consignes ajustées comprennent ici une ou plusieurs consignes de débit et/ou une ou plusieurs consignes de pression. Comme expliqué en introduction, la fréquence de production varie au cours du temps. Ainsi, les consignes ajustées sont calculées de sorte à asservir la fréquence de production fp sur la fréquence de référence fr. A titre d'exemple, lorsque la fréquence de production fp est inférieure à la fréquence de référence fr, la consigne ajustée de débit d'injection du liquide des gouttes 2 est supérieure à la consigne de référence, de sorte à accélérer la production des gouttes 2. Inversement, lorsque la fréquence de production fp est supérieure à la fréquence de référence fr, la consigne ajustée de débit d'injection du liquide des gouttes 2 est inférieure à la consigne de référence, de sorte à ralentir la production des gouttes 2.
[0114] Comme le montre la figure 2, les étapes E9, E10 et Eli sont ici implémentées de façon itérative. Ainsi, les consignes ajustées permettent de corriger en temps réel les variations temporelles de la fréquence de production fp pour qu'elle soit égale à la fréquence de référence fr. Les consignes ajustées sont donc évolutives dans le temps pour maintenir la fréquence de production fp à la valeur de consigne initiale, i.e. à la fréquence de production fp-
[0115] Avantageusement, le procédé de détermination de la fréquence de production fp nécessite peu de puissance de calcul, notamment car le traitement de l'image initiale 40 se base sur des opérations matricielles simples. Ainsi, il est possible de répéter la détermination de la fréquence de production fp à une cadence élevée, ce qui permet d'établir une rétroaction précise et rapide grâce aux consignes ajustées. L'étape E9 de détermination de la fréquence de production fp est par exemple exécutée à une cadence comprise entre 0,01 et 150 Hz.
[0116] De façon remarquable, le système 1 permet aussi de mettre en œuvre un procédé de détermination de la vitesse des gouttes 2. La vitesse d'une goutte 2 est ici exprimée en mètres (ou en unités dérivées du mètre comme les micromètres) par unité de temps, et non pas en pixels par unité de temps comme le taux de déformation T. La vitesse correspond ainsi à une valeur dimensionnée du taux de déformation T. Contrairement au taux de déformation T qui dépend de l'agencement du dispositif de capture d'images 11 par rapport au dispositif fluidique 3, la vitesse est une valeur absolue et indépendante de cet agencement.
[0117] La vitesse est ainsi exprimée dans des unités dimensionnées du système SI. Pour cela, il est par exemple possible de déterminer la taille effective, par exemple en micromètres, d'un pixel de l'image initiale 40. Cela peut être fait en prenant en compte des paramètres optiques du dispositif de capture d'images 11 notamment le grandissement ou les focales des lentilles du dispositif de capture d'images 11. Cela peut aussi être fait en prenant en compte une distance prédéterminée qui est représentée sur l'image initiale telle que la largeur du canal qui est par exemple de 50 pm.
[0118] La présente invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés, mais l'homme du métier saura y apporter toute variante conforme à l'invention.
[0119] De même, la déformation peut ne pas être une unique valeur réelle. Par exemple, la déformation peut être une représentation en deux dimensions du contour d'une goutte. La déformation est par exemple enregistrée sous la forme d'un tableau de valeurs. Il est alors possible de déterminer la vitesse en comparant ce contour à une liste de contours préétablis, par exemple au cours d'une série de tests avec des gouttes parcourant le canal à des vitesses connues. La vitesse peut alors être déterminée en recherchant le contour préétabli dont la forme est la plus proche du contour sur l'image initiale, la vitesse est alors déterminée comme la vitesse correspondant à ce contour préétabli.
[0120] La direction principale selon laquelle une goutte est en mouvement peut aussi former un angle supérieur à 10 degrés avec les lignes de pixels. [0121] Dans un troisième mode de réalisation, les lignes de pixels (toujours acquises séquentiellement) sont perpendiculaires au mouvement des gouttes 2, c'est-à-dire à la direction principale Dl. Comme le montre la figure 12, lorsque le mouvement de la goutte 2 est perpendiculaire aux lignes de pixels (qui sont ici alignées horizontalement), la goutte 2 présente alors, sur l'image initiale 40 (à droite de la figure 12) une forme allongée de symétrie axiale selon la direction principale Dl. Cette forme renseigne aussi sur la vitesse de la goutte 2, en ce sens qu'elle permet de la déterminer : plus la goutte est allongée plus elle va vite.
[0122] Dans ce troisième mode de réalisation, au cours de l'acquisition de l'image initiale 40, la goutte 2 se déplace d'une quantité Q dans le canal microfluidique 31 (à gauche de la figure 12, la goutte est représentée au début et à la fin de l'acquisition de l'image initiale) et apparait ainsi sur l'image initiale 40 avec une forme ovale.
[0123] Comme dans le premier mode de réalisation, le procédé de détermination de la fréquence de production peut comprendre la construction d'images dérivées. Les images dérivées sont construites en appliquant un coefficient d'homothétie variable à la dimension verticale de l'image initiale 40. En faisant varier ce coefficient d'homothétie, on obtient une série d'images dérivées sur lesquelles la goutte apparait plus ou moins déformée. Sur l'une des images dérivées, le contour de la goutte présente une valeur optimale de circularité, en ce sens que le contour de la goutte est aussi proche que possible d'un cercle (le cercle correspondant à la forme réelle de la goutte, visible sur la gauche de la figure 12). Le coefficient d'homothétie de cette image dérivée, illustré schématiquement sur la figure 12, est appelé coefficient optimum a.
[0124] Ce coefficient optimum a peut aussi être obtenu directement à partir du contour 21 de la goutte 2, à la manière du deuxième mode de réalisation. Il est alors calculé comme le ratio de la longueur L2 de la goutte 2 sur l'image initiale 40 sur la largeur L3 de la goutte 2 sur l'image initiale 40. La longueur L2 et la largeur L3 de la goutte 2 sont exprimées en pixels.
[0125] La vitesse de déplacement de la goutte 2 est alors égale à : L2(l-a)/ti_ (avec L2 la longueur de la goutte 2, a le coefficient optimum, et ti. le temps ligne). La vitesse de la goutte 2 est donc exprimée en pixels par unités de temps. Le terme L2(l-a) est pour sa part égal à la quantité Q de déplacement de la goutte 2 au cours de l'acquisition de l'image initiale 40. [0126] La fréquence de production est finalement calculée en divisant cette vitesse par la distance verticale (en pixels) entre deux gouttes successives présentes sur l'image initiale (au moins deux gouttes sont présentes sur l'image initiale bien que, pour simplifier, une seule soit représentée sur la figure 12). [0127] On peut ainsi calculer la fréquence de production des gouttes sur la base de leur contour même lorsque celles-ci se déplacent perpendiculairement aux lignes de la caméra.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé de détermination d'une fréquence de production (fp) d'une série de gouttes (2) en mouvement dans un canal fluidique (31), le procédé comprenant les étapes suivantes :
- acquisition, au moyen d'un dispositif de capture d'images (11) à obturateur déroulant, d'une image initiale (40) d'au moins deux gouttes (2) en série dans le canal fluidique (31), l'image initiale (40) comprenant une matrice de pixels formant des lignes (LP1, LP2) et des colonnes, les lignes (LP1, LP2) étant acquises séquentiellement les unes après les autres au moyen de l'obturateur déroulant ;
- détection, à partir de l'image initiale (40), d'un contour (21, 21') d'au moins une des deux gouttes (2) ;
- calcul de la fréquence de production (fp) sur la base du contour (21, 21'), d'un délai (ti.) entre l'acquisition de deux lignes de pixels (LP1, LP2) successives, et d'une distance entre les deux gouttes (2).
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, dans lequel il est prévu de :
- construire des images dérivées (41, 41A, 41B, 41C) à partir de l'image initiale (40), chaque image dérivée (41, 41A, 41B, 41C) étant associée à une valeur de décalage, les lignes (LP1, LP2) de chaque image dérivée (41, 41A, 41B, 41C) étant successivement translatées, par rapport à leur position sur l'image initiale (40), d'un nombre de pixels proportionnel à la valeur de décalage associée ladite image dérivée (41, 41A, 41B, 41C) ;
- détecter, sur chaque image dérivée (41, 41A, 41B, 41C), un contour dérivé (21') de ladite au moins une des deux gouttes (2) ;
- déterminer la fréquence de production (fp) sur la base des contours dérivés (21') déduits des images dérivées (41, 41A, 41B, 41C).
[Revendication 3] Procédé selon la revendication 2, dans lequel les valeurs de décalage sont croissantes de 1 à un nombre entier positif (N) et dans lequel chaque ligne (LP1, LP2) de chaque image dérivée (41, 41A, 41B, 41C) est translatée, par rapport à sa position sur l'image initiale (40), d'un nombre de pixels égal à la valeur de décalage multipliée par un indice de ladite ligne (LP1, LP2).
[Revendication 4] Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel il est prévu de :
- calculer un indice de circularité de chaque contour dérivé (21') associé à chaque image dérivée (41, 41A, 41B, 41C);
- déterminer une courbe d'ajustement (50) des indices de circularité en fonction des valeurs de décalage ;
- déterminer la fréquence de production (fp) en fonction d'un minium (M) de la courbe d'ajustement (50).
[Revendication 5] Procédé selon la revendication 1, dans lequel il est prévu de déterminer une déformation, qui est représentative d'une différence entre une forme de ladite au moins une des deux gouttes (2) sur l'image initiale (40) et une forme circulaire, sur la base d'une différence de position entre une première extrémité (24) de ladite au moins une des deux gouttes (2) dans une ligne de pixels qui est acquise en première lors de l'étape d'acquisition et une deuxième extrémité (25) de ladite au moins une des deux gouttes (2) dans une autre ligne de pixels qui est acquise en dernière lors de l'étape d'acquisition, la fréquence de production (fp) étant aussi calculée sur la base de la déformation.
[Revendication 6] Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel il est prévu de :
- détecter un contour (21) de l'autre des deux gouttes (2),
- calculer la fréquence de production (fp) sur la base d'une moyenne du contour (21, 21') de ladite au moins une des deux gouttes (2) et du contour (21) de l'autre des deux gouttes (2).
[Revendication 7] Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel un temps d'acquisition de l'image initiale (40) est inférieur à 10 ms.
[Revendication 8] Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, le canal fluidique (31) ayant une direction longitudinale, dans lequel il est prévu, avant l'étape d'acquisition, d'agencer le dispositif de capture d'images (11) par rapport au canal fluidique (31) de sorte que, sur l'image initiale (40), la direction longitudinale du canal fluidique (31) forme un angle inférieur à 10 degrés avec les lignes (LP1, LP2). Tl
[Revendication 9] Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel il prévu d'éclairer le canal fluidique (31) et lesdites au moins deux gouttes (2) tout au long de l'acquisition au moyen d'une source de lumière (12).
[Revendication 10] Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel il est prévu de déterminer un centre de gravité (G) de chacune des deux gouttes (2) et de calculer la distance entre les deux gouttes (2) comme la distance entre les deux centres de gravité (G).
[Revendication 11] Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel il est prévu de déterminer une vitesse de ladite au moins une des deux gouttes (2) sur la base du contour (21), du délai (tj et en prenant en compte au moins un paramètre optique du dispositif de capture d'images (11) ou une distance prédéterminée représentée sur l'image initiale (40).
[Revendication 12] Procédé de production d'une série de gouttes (2), la série de gouttes (2) étant en mouvement dans un canal fluidique (31) d'un dispositif fluidique (3), le procédé comprenant les étapes suivantes :
- sélection d'une fréquence de référence (fr) pour la production de la série de gouttes (2) ;
- détermination d'une fréquence de production (fp) de la série gouttes (2) dans le canal fluidique (31) par un procédé selon l'une des revendications 1 à 11 ;
- comparaison de la fréquence de production (fp) et de la fréquence de référence (fr) ;
- détermination, sur la base de la comparaison, d'une consigne de débit ou de pression d'un fluide injecté dans le dispositif fluidique (3) en amont du canal fluidique (31) pour produire la série de gouttes (2).
[Revendication 13] Dispositif de détermination d'une fréquence de production (fp) d'une série de gouttes (2) en mouvement dans un canal fluidique (31), le système comprenant un dispositif de capture d'images (11) à obturateur déroulant adapté à acquérir une image initiale (40) d'au moins deux gouttes (2) en série dans le canal fluidique (31), l'image initiale (40) comprenant une matrice de pixels formant des lignes (LP1, LP2) et des colonnes, les lignes (LP1, LP2) étant acquises séquentiellement les unes après les autres au moyen de l'obturateur déroulant, et un calculateur (13) programmé pour mettre en œuvre :
- la détection, à partir de l'image initiale l'image initiale (40), d'un contour (21, 21') d'au moins une des deux gouttes (2) ;
- le calcul de la fréquence de production (fp), sur la base du contour (21, 21'), d'un délai (ti.) entre l'acquisition de deux lignes de pixels (LP1, LP2) successives et d'une distance entre les deux gouttes (2).
[Revendication 14] Système de tri de gouttes comprenant un dispositif selon la revendication 13.
[Revendication 15] Système de tri de gouttes selon la revendication 14, dans lequel le système est un dispositif microfluidique ou un cytomètre en flux.
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