EP4669990A1 - Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame - Google Patents

Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame

Info

Publication number
EP4669990A1
EP4669990A1 EP24705703.7A EP24705703A EP4669990A1 EP 4669990 A1 EP4669990 A1 EP 4669990A1 EP 24705703 A EP24705703 A EP 24705703A EP 4669990 A1 EP4669990 A1 EP 4669990A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
optical
internal reflection
total internal
incidence
angle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24705703.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Anita MOUTTOU
Aude LEREU
Julien Lumeau
Fabien LEMARCHAND
Cyril FAVARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Ecole Centrale de Marseille
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Ecole Centrale de Marseille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Montpellier, Ecole Centrale de Marseille filed Critical Aix Marseille Universite
Publication of EP4669990A1 publication Critical patent/EP4669990A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B1/00—Optical elements characterised by the material of which they are made; Optical coatings for optical elements
    • G02B1/002—Optical elements characterised by the material of which they are made; Optical coatings for optical elements made of materials engineered to provide properties not available in nature, e.g. metamaterials
    • G02B1/005—Optical elements characterised by the material of which they are made; Optical coatings for optical elements made of materials engineered to provide properties not available in nature, e.g. metamaterials made of photonic crystals or photonic band gap materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/56—Optics using evanescent waves, i.e. inhomogeneous waves
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/20—Filters
    • G02B5/26—Reflecting filters
    • G02B5/265—Reflecting filters involving total internal reflection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • Optical blade for an optical device by total internal reflection its manufacturing method and optical device comprising such a blade
  • the invention relates to the field of optical devices. More particularly, the invention relates to a new concept of optical plate based on a multilayer stack as a support for enhancing the electromagnetic field suitable for optical devices by total internal reflection, such as for example a total internal reflection fluorescence microscope.
  • the invention applies in particular, but not exclusively, to the field of imaging of biological samples by total internal reflection fluorescence microscopy or TIRF microscopy (acronym in English for “Total Internal Reflection Fluorescence”).
  • TIRF microscopy acronym in English for “Total Internal Reflection Fluorescence”.
  • Such an imaging technique is particularly well suited to the visualization, analysis and quantification of molecular events occurring in particular at the plasma membrane of biological cells.
  • Evanescent wave fluorescence microscopy is a fluorescence microscopy technique in which the excitation of fluorescent molecules contained in the observed sample is confined to a region of nanometric thickness, located in the immediate vicinity of the sample slide. In particular, it allows selective observation of structures and processes located on a cell membrane, with an axial resolution much better than the diffraction limit. In addition, compared to more conventional epi-fluorescence techniques, it allows better contrast of the fluorescence image to be obtained and the effects of photobleaching and irradiation damage to cells to be reduced.
  • FIG. 1A The principle underlying evanescent wave fluorescence microscopy is illustrated in FIG. 1A.
  • the substrate SB may consist of a sample-holding slide, or of a glass element on which such a slide is placed, while the ambient medium MA may be an aqueous solution containing, in suspension, cells marked by fluorophores.
  • a light beam FLI, coming from the substrate SB, is incident on the surface Se; its direction of propagation forms with the normal z s to the surface an angle 0 greater than a critical value Oc (limit angle) (1).
  • the FLI beam undergoes a total internal reflection (RTI) forming a reflected beam FLR and producing an evanescent wave OE in the ambient medium MA.
  • the evanescent wave excites the fluorophores contained in the ambient medium, but only over a thickness of the order of ⁇ , because beyond that its intensity quickly becomes negligible.
  • Figure 1B illustrates the most commonly used configuration in TIRF microscopy.
  • the same microscope objective OBJ located on the side of the substrate opposite to the MA medium, is used both to generate the evanescent waves by RTI and to collect the fluorescence radiation.
  • the images obtained have multiple qualities: first of all, they benefit from low background noise (because the fluorophores located in the deep layers of the sample (outside the evanescent field) are only very weakly excited) and from a relatively high axial resolution.
  • Microscope slides with complex structures have also been designed to locally enhance the evanescent electromagnetic field.
  • Such optical slides which are based on the principle of surface plasmon resonance, make it possible to improve the sensitivity of microscopy imaging.
  • this known solution remains limited in terms of field enhancement value and in the choice of materials, i.e. noble metals, which limit the usable illumination conditions as well as biocompatibility, which is not optimal.
  • an object of the invention is a method of manufacturing an optical slide intended to receive a biological sample in an optical device by total internal reflection, said method comprising a step of designing said optical slide and a step of material manufacturing of said optical slide thus designed, said method being characterized in that the design phase comprises the following steps:
  • a first structure comprising a first stack of thin dielectric layers arranged above a so-called substrate (SB) layer transparent in a predetermined spectral region. comprising said illumination wavelength in , said first stack comprising N > 7 of successive and alternating thin layers of the first dielectric material and of the second dielectric material, a first respective thickness of each dielectric thin layer and said number N of dielectric thin layers being adapted so that the first structure exhibits a resonant absorption at the illumination wavelength in and at the optimal angle of incidence 0 in , in the total internal reflection regime
  • said optical blade which comprises a second stack of thin dielectric layers called an optimized stack arranged above the substrate (SB), the optimized stack comprising a number M ⁇ N, M > 7 of successive and alternating thin dielectric layers of the first dielectric material and of the second dielectric material, each of the layers having a respective so-called optimized thickness, the optimized thicknesses and the number M of thin dielectric layers being determined by an optimization of a merit function F based on the first function F and the second function F 2 so that said optical blade has a first resonant absorption at the illumination wavelength in and at a first angle of incidence 0 in the total internal reflection regime and has a second resonant absorption at the illumination wavelength in and at a second angle of incidence 0 2 in the total internal reflection regime, with [0016]
  • a can be comprised between 0.3 and 0.7.
  • the optimization may consist in finding the optimized thicknesses and the number M of thin dielectric layers for which said value of the transmission of the first structure in the predetermined spectral region is maximum and for which said intensity of the evanescent electric field is maximum.
  • an upper layer of the first stack may be in the second dielectric material and have a first thickness of between 1.1 ⁇ in /4 and 1.8 in /4 and in which the N - 1 lower layers of the first stack each have a first thickness of between 0.9 ⁇ in /4 and 1.1 ⁇ in /4.
  • the first function F1 may be representative of a transmission of fluorescence radiation induced indirectly by an absorption of said illumination wavelength in in total internal reflection in said first stack illuminated with said optimal angle of incidence 0 in , the fluorescence radiation having a spectrum included in said spectral region, the transmission being integrated over an angular range of incidence of the fluorescence radiation on said optical plate between 0 and 80°.
  • Another object of the invention is an optical slide intended to receive a biological sample in an optical device by total internal reflection, the optical slide comprising:
  • a so-called optimized stack arranged above the substrate and comprising a number M > 7 of successive and alternating thin dielectric layers of a first dielectric material and a second dielectric material, each layers having a respective so-called optimized thickness, the optimized thicknesses and the number M of thin dielectric layers being adapted so that said optical plate has at least: o a first resonant absorption at a so-called illumination wavelength in and at a first angle of incidence 6 ⁇ in total internal reflection mode, and o a second resonant absorption at the illumination wavelength in and at a second angle of incidence 0 2 in total internal reflection mode,
  • the first dielectric material may have a refractive index n a of between 1.8 and 3.5;
  • the second dielectric material may have a refractive index n b between 1.2 and 1.7.
  • the first material may be based on Nb2O5
  • the second material may be based on SiO2 .
  • the number M of thin dielectric layers may be less than 30, preferably less than 20.
  • the optimized thicknesses and the number M of thin dielectric layers may be such that said optical blade has a total thickness of less than 5 ⁇ m and preferably between 0.5 ⁇ m and 2 ⁇ m.
  • the optimized thicknesses may be greater than or equal to 10 nm.
  • Another object of the invention is an optical device by total internal reflection comprising: - an optical blade according to the invention as defined above,
  • a light source adapted to emit a light beam having the illumination wavelength
  • an optical device adapted to shape the light beam so that it illuminates said optical blade with said optimized angle of incidence d in
  • a detector adapted to detect fluorescence radiation emitted when a sample is deposited in correspondence with a region of a surface of said optical plate where evanescent waves are produced by total internal reflection in said optical plate of the shaped light beam, said fluorescence radiation being excited by said evanescent waves.
  • the total internal reflection optical device according to the invention may consist of a total internal reflection fluorescence microscope.
  • the optical device may be a microscope objective.
  • FIG.1 A a schematic diagram of the operation of a prior art total internal reflection fluorescence microscope
  • FIG.1 B a schematic view of a prior art total internal reflection microscope
  • FIG.2 a schematic view of a total internal reflection microscopy device according to the invention
  • FIG.3 a schematic view of an optical slide according to the invention, intended to receive a biological sample in a total internal reflection microscopy device
  • FIG.4A the absorption of an optical plate according to a preferred embodiment of the invention in total internal reflection mode, as a function of the angle of incidence and the wavelength of the incident beam;
  • FIG.4B the enhancement factor of the evanescent electric field generated on the surface of an optical plate according to a preferred embodiment of the invention in total internal reflection mode, as a function of the angle of incidence of the incident beam;
  • FIG.5A a first graph representing the evolution of the enhancement factor of the evanescent electric field generated on the surface of an optical plate according to a preferred embodiment of the invention in total internal reflection mode, as a function of the angle of incidence of the incident beam, for a first divergence different from the incident beam,
  • FIG.5B a second graph representing the evolution of the enhancement factor of the evanescent electric field generated on the surface of an optical plate according to a preferred embodiment of the invention in total internal reflection mode, as a function of the angle of incidence of the incident beam, for a second different divergence of the incident beam;
  • FIG.7 a schematic representation of the steps of the design phase of the manufacturing process according to the invention.
  • Figure 2 illustrates in a simplified manner a device D for total internal reflection microscopy according to the invention.
  • the device D comprises an optical slide LO according to the invention, a light source SL, an optical device Obj and a fluorescence detector Del.
  • the optical blade LO is a blade, preferably biocompatible, intended to receive a biological sample E for microscopy imaging purposes according to an RTL configuration.
  • An example of an optical blade structure in accordance with the invention is described later in relation to FIG. 3 which schematically illustrates a section along the xz plane of the optical blade LO according to the invention.
  • the light source SL is adapted to emit a light beam Lin having a predetermined so-called illumination wavelength in .
  • the source SL is a laser source configured to emit at a wavelength typically between 350 and 1300 nm so as to excite the fluorophores contained in the sample E and thus produce the emission of fluorescence radiation FL while being at least partially transmitted by the optical plate LO.
  • the optical device Obj is adapted to shape the light beam Un so that it illuminates the optical blade with a so-called optimized angle of incidence 6 in greater than the critical angle.
  • the optical device Obj is a microscope objective.
  • the microscope objective may have a variable focal length and a variable numerical aperture (greater than 1.45). It comprises an optic or a more or less complex assembly of optical lenses capable of allowing the formation of the light beam Lin by focusing it in the direction of the optical plate. It is also capable of collecting the reflected and/or backscattered beam from the optical plate in an angular cone from 0 to a maximum angle given by the numerical aperture of the objective.
  • the objective is generally of the immersion type.
  • an objective Obj with a high numerical aperture ON is advantageous because it allows the incident light beam L in to be displaced relative to the optical axis OA and thus obtains a strong deviation of the incident beam L in by the objective, the beam L in thus being able to propagate with a high incidence angle 0 in sufficient to obtain an RTI.
  • the optical device Obj comprises one or more lenses and/or mirrors for focusing the light beam Lin and optionally a prism or a metasurface so that the light beam Lin illuminates the optical blade with the optimized angle of incidence 0 in .
  • This optimized angle of incidence 0 in is greater than the critical angle 0 c at the interface between a surface SE of the slide intended to receive the sample E and the ambient medium (typically liquid) comprising the sample.
  • the optimized angle of incidence d in is typically between 62 and 80 degrees for a biological environment with a refractive index of between 1.33 and 1.35.
  • the RTI of the light beam Lin on said interface produces evanescent waves OE.
  • the sample E being placed in correspondence with a region of the surface SE where the evanescent waves are produced, the fluorophores of the sample will generate fluorescence radiation FL excited by the evanescent waves OE.
  • the emitted fluorescence radiation FL is then collected by the objective Obj and is then directed towards the detector Det in order to be detected.
  • This detector Det is typically a CCD or CMOS camera whose spectral band is adapted to the detection of the re-emitted fluorescence radiation FL coming from the sample E. It converts the light intensity received into an electrical signal intended for a processing unit (not shown in the figures).
  • the processing unit is electrically connected to the light source SL, to the detector Det and to the microscope objective Obj so as to be able to control these elements for the purpose of acquiring images of the sample E in RTI mode.
  • the optimized angle of incidence 0 in is between 62 and 80 degrees.
  • the lower limit of the aforementioned range (62 degrees) is given by the refractive index value of the sample studied.
  • the upper limit of the aforementioned range (80 degrees) it is defined according to the value of the numerical aperture used for microscopy observation.
  • the typical numerical aperture of the microscope objective Obj of the device D is greater than or equal to 1.45.
  • the microscope objective Obj is preferably of numerical aperture and variable focal length.
  • the optical blade LO has the first face SE, and a second face SI, opposite the first, and defines a stacking axis extending between these two opposite faces in the z direction.
  • the first face SE is intended to receive the biological sample E to be observed and the second face SI is the face illuminated by the light beam L in .
  • the first face SE constitutes the interface where an exaltation of the evanescent electromagnetic field OE is produced by the optical blade 10.
  • the optical slide LO and the microscope objective Obj are arranged such that the stacking axis of the slide coincides with the optical axis OA of the objective.
  • the optical slide LO and the microscope objective Obj are oriented relative to each other such that the optical interface formed between the optical slide LO and the sample E is perpendicular to the optical axis OA, in the x direction.
  • the optical blade LO comprises an optically transparent substrate SB in a spectral region which comprises the illumination wavelength in and which comprises the spectral range of the radiation of FL fluorescence.
  • the SB substrate is a soda-lime glass microscope slide with an index of 1.5 (or any other optically transparent support calibrated in thickness).
  • the optical blade LO comprises a stack of dielectric layers (hereinafter called optimized stack EO) arranged directly above the substrate SB.
  • This optimized stack EO is particularly suitable for enabling an enhancement of the evanescent electric field OE produced at the surface SE in an RTI configuration of the beam L in .
  • the evanescent wave OE created by the RTI sees its intensity amplified thanks to the resonant structure of the EO stack, which makes it possible to significantly increase the imaging performance of TIRF microscopy, in particular in terms of sensitivity and axial resolution.
  • this EO stack is formed from a succession of M > 7 alternating thin layers of a first dielectric material with refractive index n a (thin layers referenced C ) and a second dielectric material with refractive index n b (thin layers referenced C 2 ), with n b ⁇ na ⁇
  • the thin layer intended to be in contact with the sample E (called the upper layer) is made of one of the two dielectric materials.
  • this layer is made of a biocompatible dielectric material, for example SiO2, TiO2, Nb2O5, etc.
  • the upper face of this upper layer corresponds to the face SE previously introduced.
  • the face SI illuminated by the beam L in it corresponds to the lower face of the substrate SB.
  • each of the dielectric layers has a respective so-called optimized thickness chosen in particular as a function of the illumination wavelength ⁇ £n , of the optimized angle of incidence 0 in , of the incident polarization and refractive indices n 1 and n 2 .
  • the manufacturing method and the design face of the optical blade LO of the invention will be detailed later in the description of FIG. 7.
  • optical blade LO of the invention can comprise more than two resonances as long as the aforementioned conditions remain verified.
  • the EO stack of dielectric multilayers coupled to the SB substrate makes it possible to ensure a significant enhancement of the evanescent electromagnetic field OE at the interface between the optical blade and the sample with an angular tolerance much greater than the optical blades of the prior art.
  • This enhancement makes it possible to increase the intensity of the fluorescence radiation FL, which improves the sensitivity of the microscopic imaging as well as the axial resolution of the device D.
  • the resonant optical blades of the prior art are optimized to exhibit a spectrally and angularly narrow resonance, for a predetermined optimal angle of incidence and for a theoretically planar illumination wave. They thus exhibit a very high "theoretical" enhancement factor of the evanescent electromagnetic field.
  • the beam L in exhibits a non-negligible natural angular divergence after passing through the lens (typically between 0.5° and 1°).
  • the beam incident on the optical plate LO actually has a plurality of incidence angles centered around the optimum incidence angle. This implies that the evanescent wave enhancement factor OE induced by the optical plate for rays at incidence angles other than the optimum incidence angle is in practice significantly lower than the "theoretical" enhancement factor.
  • the presence of two (or more) angularly close resonances allows a partial overlap between the resonance bands. This overlap makes it possible to widen the angular tolerance of the optical plate LO so that it has a "real" enhancement factor six to ten times greater than the optical plates of the prior art (see FIG. 6) (see more in the case of multi-resonances).
  • the angular tolerance of the plate of the invention is specifically chosen to be greater than or equal to the divergence of the beam L in after it passes through the objective of the microscope Obj which is typically between 0.5° and 1°.
  • the optimized thickness of each layer of the stack is chosen in particular as a function of the illumination wavelength A in , the optimized angle of incidence 0 in , the polarization and the refractive indices n and n 2 .
  • the optimized angle of incidence 0 in here corresponds to the angle of incidence at which the beam L in must illuminate the optical plate at illumination wavelength i n to obtain an evanescent wave enhancement factor OE with an optimized angular tolerance. It is between and 0 2 (or between 0 2 > 0 2 ) to benefit from the overlap of the band of the first resonant absorption and the band of the second resonant absorption.
  • the optimized thicknesses are generally between 5 and 500 nanometers. Preferably, the optimized thicknesses are greater than or equal to 10 nm in order to facilitate the manufacture of the optical blade LO. Indeed, the Precise control of the thickness of layers less than 10 nm thick is technically complex to achieve.
  • the first dielectric material has a refractive index n a of between 1.8 and 3.5 and the second dielectric material has a refractive index n b of between 1.2 and 1.7.
  • the first material is based on Nb2O5
  • the second material is based on SiO2.
  • the number M of thin dielectric layers is less than 30, preferably less than 20.
  • the inventors have observed that, compared to an optical plate LO with a number of layers less than 20, a number of dielectric layers greater than or equal to 20 increases the complexity of the manufacturing process but only allows a minimal gain (or even zero) in the evanescent wave enhancement factor.
  • the optimized thicknesses and the number M of thin dielectric layers are such that said optical blade has a thickness of less than 5 ⁇ m and preferably between 0.5 ⁇ m and 2 ⁇ m.
  • the optimized stack EO of the optical blade LO comprises 14 alternating dielectric layers of SiO2 and Nb 2 O 5 .
  • the upper layer of the stack (the one intended to be in contact with the sample) is made of SiO2.
  • the optimized thicknesses of the thin dielectric layers are, from the upper layer to the lower layer in contact with the substrate, respectively: 20 nm, 26.5 nm, 91.6 nm, 101.8 nm, 242.7 nm, 60.25 nm, 30.2 nm, 20 nm, 273.4 nm, 29.1 nm, 83.1 nm, 20 nm, 530.6 nm, 97.6 nm.
  • Figure 4A is a graph showing the optical absorption of the EO stack according to the preferred embodiment of the invention, with a liquid medium above the upper layer, as a function of the angle of incidence and the illumination wavelength.
  • Four resonance bands are observed, including the band of the first resonant absorption (referenced B1 in Figure 4A) and the band of the second resonant absorption (referenced B2 in Figure 4A).
  • the curve of Figure 4B includes the two enhancement peaks associated with the first and second resonant absorption fî 1 , fî 2 .
  • this value of the enhancement factor is a "theoretical" value obtained for illumination with a plane wave.
  • the beam divergence L in must be taken into account to estimate the real value of the enhancement factor.
  • the curve of Figure 5A is obtained for a divergence of 0.6° while the curve of Figure 5B is obtained for a divergence of 0.9°.
  • the optical plate LO makes it possible to obtain an enhancement factor of approximately 35 for a divergence of 0.6° and approximately 30 for a divergence of 0.9°.
  • a greater divergence implies a greater angular averaging of the first and second resonant absorption B 1( B 2 and therefore a greater reduction in the enhancement factor.
  • the value of the enhancement factor is calculated with an integration on an angular cone ranging from 0° to 80° of the fluorescence radiation FL, taking into account the average transmission of the optical plate LO, then is normalized with respect to the value of the enhancement factor obtained by a glass plate.
  • Figure 6 includes a shaded area that corresponds to the divergence range of a laser beam focused by a commercial microscope.
  • Figure 6 shows that the LO optical slide according to the preferred embodiment of the invention makes it possible to obtain high enhancement factors for a wide divergence range that includes most existing commercial microscopes. More precisely, the LO optical slide makes it possible to obtain a standardized fluorescence enhancement factor of the order of 7.
  • This manufacturing method comprises a phase of designing the optical blade and then a phase of physical manufacturing of the designed optical blade.
  • the different steps A to E of the design phase are illustrated in FIG. 7.
  • the first dielectric material of index r ⁇ and the second dielectric material of index n2 are selected such that n > n2 .
  • the material of index n2 is preferably silica for biological compatibility and the material of index m can be for example Nb2O5, TiO2, HfO2 or Ta2O5.
  • the illumination wavelength i n and the optimum angle of incidence 6 in are selected as a function of the total internal reflection microscopy device for which the optical slide is intended. This typically involves choosing an illumination wavelength in equal to the wavelength of the light source of the microscopy device.
  • the optimum angle of incidence 0j n is chosen so as to be greater than the critical angle of RTI for an interface formed between a liquid medium and a layer in the second dielectric material. and depending on the value of the numerical aperture used for microscopy observation.
  • the design phase comprises a step C consisting in designing a first structure comprising a first stack of thin dielectric layers arranged above a substrate SB.
  • the substrate SB is transparent in a predetermined spectral region comprising the illumination wavelength in and the fluorescence radiation FL generated indirectly by the illumination wavelength in .
  • the first stack comprises N > 7 successive and alternating thin layers of the first dielectric material and the second dielectric material, each dielectric thin layer having a respective first thickness.
  • the first thicknesses and the number N of dielectric thin layers are adapted so that the first structure has a single resonant absorption at the illumination wavelength in and at the optimal angle of incidence 6 in in the total internal reflection regime.
  • This step C is known per se and is carried out by means of software for simulating and optimizing optical thin layers such as Optilayer or by means of a direct calculation.
  • the upper layer of the first stack is in the second dielectric material and has a first thickness of between 1.1 ⁇ in /4 and 1.8 in /4.
  • the exact value of the thickness of the upper layer depends on the indices of the dielectric materials, the desired resonance wavelength and the desired resonance angle.
  • the N - 1 lower layers of the first stack i.e. those below the upper layer
  • the layer upper is in SiO2 and has a first thickness equal to 1.44 ⁇ in /4.
  • the other layers have a first thickness equal to ⁇ in /4.
  • the design phase includes a step D consisting of determining two functions F and F 2 each representative of the two critical parameters of the optical blade for the intended application: the transmission of the fluorescence radiation and the enhancement of the evanescent field generated in RTI.
  • the function F is representative of the value of the transmission of the fluorescence radiation FL as a function of the number of dielectric thin layers and the thickness of each dielectric thin layer.
  • this is the fluorescence radiation FL induced indirectly by the absorption in the first stack of the illumination wavelength in in RTI with the optimal angle of incidence 6 in .
  • the transmission is integrated over a wide angular range of the angle of incidence of the fluorescence radiation on the optical plate, for example for an angle of incidence between 0° and 80° as well as over the spectral range associated with the fluorescence emission.
  • the function F 2 is representative of the intensity of the evanescent electric field generated by the first RTI stack at the illumination wavelength in and at the optimal incidence angle 6 in as a function of the number of dielectric thin layers and the thickness of each dielectric thin layer.
  • the real enhancement factor of the optical slide that is to say that of the fluorescence radiation collected by the microscope objective, is multifactorial and depends on:
  • the functions F and F 2 have the following form for the design of the optical blade LO: with T the transmission of the structure for a plane wave illuminated under incidenceO at wavelength A, with E the amplitude of the electric field at the upper interface of the structure, AO the angular interval chosen for the optimization of the field, typically between 0.2 and 1.5 degrees.
  • the design phase comprises a final step E of optimizing the first stack so as to obtain the optimized stack EO of the optical blade LO.
  • the optimized thicknesses and the number M ⁇ N, M > 7 of thin dielectric layers of the optimized stack EO are determined by optimizing a merit function F based on the first function F and the second function F 2 so that the optical blade has:
  • This optimization is carried out using thin optical layer simulation and optimization software such as Optilayer.
  • the parameter alpha influences the respective weights of the transmission of the fluorescence by the blade with respect to the exaltation of the evanescent field and is preferably between 0.3 and 0.7 because the two parameters being important, it is appropriate to consider them both in a non-negligible manner.
  • This form of merit function has a sufficient number of degrees of freedom to simultaneously optimize the three parameters influencing the actual enhancement factor of the optical plate.
  • the optimization typically consists of finding the optimized thicknesses and the number M of thin dielectric layers for which the value of the transmission of the fluorescence radiation is maximum and for which the intensity of the evanescent electric field is maximum.
  • each thin layer is carried out using any technique known to those skilled in the art, for example by one of the following techniques: vacuum evaporation, vacuum spraying, sol-gel process, centrifugal coating, chemical vapor deposition, plasma deposition.
  • the invention thus offers the possibility of producing optical blades with electromagnetic field enhancement whose characteristics can be easily adapted according to the imaging parameters required by the microscopy system.
  • the thickness, number and type of material are characteristics of the stack according to the invention that can be adapted on a case-by-case basis, depending in particular on the imaging parameters of the system and the desired or imposed lighting conditions.
  • Optically transparent materials in the spectral band used to conduct the study will be preferred, whose refractive index and absorption coefficient dispersion values are known and controlled.
  • Such characteristics must allow, at a predetermined optimized angle of incidence and illumination wavelength of the optical plate in total reflection mode, optical absorption with improved angular tolerance in the upper layer of the optimized stack, thus enhancing the evanescent electromagnetic field at the interface of said stack.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

Lame optique (LO) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) dans un dispositif optique par réflexion totale interne, la lame optique comprenant : - une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée - un empilement dit optimisé disposé au dessus du substrat (SB) et comprenant un nombre M > 7 de couches minces diélectriques successives et alternées d'un premier matériau diélectrique et d'un deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que ladite lame optique présente au moins : o une première absorption résonnante à une longueur d'onde dite d'illumination λin et à un premier angle d'incidence θ 1 en régime de réflexion totale interne, et - une deuxième absorption résonnante à la longueur d'onde d'illumination λin et à un deuxième angle d'incidence θ 2 en régime de réflexion totale interne, avec Δθ = |θ 1 - θ 2| ∈ [0.4°; 3°] et θ 2 < θ in < θ 1 ou θ 1 < θ in < θ 2.

Description

DESCRIPTION
Titre de l'invention : Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame
Domaine technique :
[0001] L’invention s’inscrit dans le domaine des dispositifs optiques. Plus particulièrement, l’invention concerne un nouveau concept de lame optique basée sur un empilement multicouche comme support d’exaltation du champ électromagnétique adapté à des dispositifs optiques par réflexion totale interne, tels que par exemple un microscope à fluorescence par réflexion totale interne.
[0002] L’invention s’applique notamment, mais non exclusivement, au domaine de l’imagerie d’échantillons biologiques par microscopie de fluorescence à réflexion totale interne ou microscopie TIRF (acronyme en langue anglaise pour « Total Internal Reflection Fluorescence »). Une telle technique d’imagerie est particulièrement bien adaptée à la visualisation, l’analyse et la quantification d’évènements moléculaires s’effectuant notamment à la membrane plasmique des cellules biologiques.
Technique antérieure :
[0003] La microscopie de fluorescence à onde évanescente est une technique de microscopie de fluorescence dans laquelle l’excitation des molécules fluorescentes contenues dans l’échantillon observé est confinée à une région d’épaisseur nanométrique, située à proximité immédiate de la lamelle porte-échantillon. Elle permet, en particulier, d’observer de manière sélective des structures et processus localisés sur une membrane cellulaire, avec une résolution axiale bien meilleure que la limite de diffraction. En outre, par rapport aux techniques d’épi-fluorescence plus conventionnelles, elle permet d’obtenir un meilleur contraste de l’image de fluorescence et de réduire les effets de photo-blanchiment et des dégâts d’irradiation des cellules.
[0004] Il est connu de la publication scientifique « Directing Fluorescence with Plasmonic and Photonic Structures », Sharmistha Dutta Choudhhury et al, qui décrit entre autres l’utilisation de matériaux diélectriques nommés, « 1 dimensional photonic cristal » pour diriger un faisceau d’excitation et contrôler une émission de fluorescence de molécules posées sur une surface. Cette publication ne mentionne pas, toutefois, la diminution rapide, voire la perte, de l’exaltation de l’émission de fluorescence lorsque le faisceau d’excitation est divergent, ce qui est le cas à minima dans les dispositifs optiques de type microscopes TIRF.
[0005] Le principe à la base de la microscopie de fluorescence à onde évanescente est illustré sur la figure 1A. On considère le cas d’un substrat SB d’indice de réfraction n2, présentant une surface Se en contact avec un milieu ambiant MA d’indice m<n2. Par exemple, le substrat SB peut être constitué par une lamelle porte- échantillon, ou par un élément en verre sur lequel est posée une telle lamelle, tandis que le milieu ambiant MA peut être une solution aqueuse contenant, en suspension, des cellules marquées par des fluorophores. Un faisceau lumineux FLI, provenant du substrat SB, est incident sur la surface Se ; sa direction de propagation forme avec la normale zs à la surface un angle 0 supérieur à une valeur critique Oc (angle limite) (1 ).
[0006] Par conséquent le faisceau FLI subit une réflexion totale interne (RTI) formant un faisceau réfléchi FLR et produisant une onde évanescente OE dans le milieu ambiant MA. Cette onde évanescente présente une intensité qui décroit exponentiellement avec la distance z de la surface S : où la s? 4 longueur de penetration ô est donnée par ô = (1 bis), X étant la longueur d’onde du rayonnement lumineux. L’onde évanescente excite les fluorophores contenus dans le milieu ambiant, mais seulement sur une épaisseur de l’ordre de ô, car au-delà son intensité devient rapidement négligeable. A titre d’exemple, pour 7=488 nm, n2=1 ,514 (verre BK7), m=1 ,33 (eau) et 0 = 67° > 0C ~ 61,45°, on trouve ô «93 nm, ce qui signifie que seuls les fluorophores situés dans une couche d’environ 100 nm d’épaisseur sont excités et contribuent à la réalisation d’une image de fluorescence.
[0007] La figure 1 B illustre la configuration la plus communément utilisée en microscopie TIRF. Dans le cas de la figure 1 B, un même objectif de microscope OBJ, situé du côté du substrat opposé au milieu MA, est utilisé à la fois pour générer les ondes évanescentes par RTI et pour collecter le rayonnement de fluorescence.
[0008] Ainsi, par cette technique connue, les images obtenues présentent de multiples qualités : elles bénéficient tout d’abord d’un faible bruit de fond (car les fluorophores situés dans les couches profondes de l’échantillon (hors du champ évanescent) ne sont que très faiblement excités) et d’une résolution axiale relativement élevée.
[0009] Des lames de microscope à structure complexe, comme celles basées sur une métallisation en surface ont été par ailleurs conçues pour exalter localement le champ électromagnétique évanescent. De telles lames optiques, qui reposent sur le principe de la résonance de plasmon de surface, permettent d’améliorer la sensibilité de l’imagerie de microscopie. Toutefois, cette solution connue reste limitée en termes de valeur d’exaltation du champ et dans le choix des matériaux, i.e. métaux nobles, qui limitent les conditions d’illumination utilisables ainsi que la biocompatibilité, ce qui n’est pas optimal.
[0010] Une autre technique connue, décrite dans le document de brevet US 2016/0238830, repose sur un guide d’onde multicouches dont les épaisseurs de couche et les indices de réfraction sont choisis pour supporter un mode de fuite guidé. Or les expériences d’imagerie de microscopie effectuées avec cette technique demeurent encore limitées du point de vue sensibilité et résolution notamment.
[0011] En outre, il est connu de la demande FR2108879 de réaliser des lamelles de microscopie recouvertes d’empilements de couches nanométriques de matériaux diélectriques conçus pour exalter le champ électromagnétique évanescent à l’interface entre la lamelle et les objets biologiques déposés dessus. Ce type de structure permet d’améliorer la sensibilité des microscopes en réflexion totale interne qui utilisent un objectif du microscope pour atteindre l’angle critique de réflexion totale comme illustré dans la figure 1 B.
[0012] L’utilisation de ces empilements diélectriques permet de générer cette exaltation à toutes les longueurs d’ondes du spectre visible/proche infrarouge et à tous les angles d’illumination au-delà de l’angle critique de RTI. Cependant cette méthode est optimisée pour des illuminations avec des ondes planes, ce qui n’est pas le cas dans un microscope éclairant l’objet au travers de l’objectif.
[0013] En effet, une des limitations principales des structures résonantes en RTI est leur faible tolérance angulaire, celle-ci étant d’autant plus faible que la structure est résonante. Or, contrairement aux applications capteur qui recherchent une exaltation du champ évanescent la plus intense et la plus fine spectralement et angulairement, en microscopie, la résonance voulue est associée à une exaltation plus faible (de la dizaine à quelques centaines) avec une tolérance angulaire au moins de l’ordre de grandeur de la divergence de l’illumination par l’objectif du microscope.
[0014] En conséquence, il existe un besoin pour une lame optique destinée à un dispositif optique par réflexion totale interne, notamment un microscope à fluorescence, permettant d’exalter le champ évanescent à l’interface entre la lamelle et les objets biologiques déposés dessus avec une tolérance angulaire accrue par rapport aux lames de l’art antérieur.
Résumé de l’invention :
[0015] A cet effet, un objet de l’invention est un procédé de fabrication d’une lame optique destinée à recevoir un échantillon biologique dans un dispositif optique par réflexion totale interne, ledit procédé comprenant une étape de conception de ladite lame optique et une étape de fabrication matérielle de ladite lame optique ainsi conçue, ledit procédé étant caractérisé en ce que la phase de conception comprend les étapes suivantes :
A. la sélection d’un premier matériau diélectrique présentant un indice de réfraction na et d’un deuxième matériau diélectrique présentant un indice de réfraction nb tel que na > nb
B. la sélection d’une longueur d’onde dite d’illumination in et d’un angle d’incidence dit optimal 6in en fonction dudit dispositif optique par réflexion totale interne auquel ladite lame optique est destinée
C. la conception d’une première structure comprenant un premier empilement de couches minces diélectriques disposé au-dessus d’une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée comprenant ladite longueur d’onde d’illumination in, ledit premier empilement comprenant N > 7 de couches minces successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, une première épaisseur respective de chaque couche mince diélectrique et ledit nombre N de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que la première structure présente une absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à l’angle d’incidence optimal 0in, en régime de réflexion totale interne
D. la détermination d’une première fonction F représentative d’une valeur d’une transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et d’une épaisseur de chaque couche mince diélectrique, et la détermination d’une deuxième fonction F2 représentative d’une intensité d’un champ électrique évanescent généré par la lame optique en régime de réflexion totale interne à la longueur d’onde d’illumination in et à l’angle d’incidence optimal 6in en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et de ladite première épaisseur de chaque couche mince diélectrique
E. la conception de ladite lame optique qui comprend un deuxième empilement de couches minces diélectriques dit empilement optimisé disposé au- dessus du substrat (SB), l’empilement optimisé comprenant un nombre M < N, M > 7 de couches minces diélectriques successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques étant déterminés par une optimisation d’une fonction de mérite F basée sur la première fonction F et la deuxième fonction F2 de manière à ce que ladite lame optique présente une première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à un premier angle d’incidence 0 en régime de réflexion totale interne et présente une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à un deuxième angle d’incidence 02 en régime de réflexion totale interne, avec [0016] De manière préférentielle, la fonction de mérite F est telle que F = aF^ + (1 - a)F2, avec 0 < a < 1 un paramètre permettant de pondérer un poids respectif de la première fonction F et de la deuxième fonction F2 dans ladite optimisation.
[0017] De manière préférentielle, a peut être compris en 0.3 et 0.7.
[0018] De manière préférentielle, l’optimisation peut être telle que A0 = \0 - 02| G [0.4°; 1.5°].
[0019] Selon un mode de réalisation, l’optimisation peut consister à trouver les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques pour lesquels ladite valeur de la transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée est maximale et pour lesquels ladite intensité du champ électrique évanescent est maximale.
[0020] Selon un mode de réalisation, dans le premier empilement, une couche supérieure du premier empilement peut être dans le deuxième matériau diélectrique et présenter une première épaisseur comprise entre l.lÂin/4 et 1.8 in/4 et dans laquelle les N - 1 couches inférieures du premier empilement présentent chacune une première épaisseur comprise entre 0.9Âin/4 et l.lÂin/4.
[0021] Selon un mode de réalisation, la première fonction F1 peut être représentative d’une transmission d’un rayonnement de fluorescence induit indirectement par une absorption de ladite longueur d’onde d’illumination in en réflexion totale interne dans ledit premier empilement illuminé avec ledit angle d’incidence optimal 0in, le rayonnement de fluoresence présentant un spectre compris dans ladite région spectrale, la transmission étant intégrée sur une gamme angulaire d’incidence du rayonnement de fluorescence sur ladite lame optique comprise entre 0 et 80°.
[0022] Un autre objet de l’invention est une lame optique destinée à recevoir un échantillon biologique dans un dispositif optique par réflexion totale interne, la lame optique comprenant :
- une couche dite substrat transparente dans une région spectrale prédéterminée
- un empilement dit optimisé disposé au-dessus du substrat et comprenant un nombre M > 7 de couches minces diélectriques successives et alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que ladite lame optique présente au moins : o une première absorption résonnante à une longueur d’onde dite d’illumination in et à un premier angle d’incidence 6± en régime de réflexion totale interne, et o une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à un deuxième angle d’incidence 02 en régime de réflexion totale interne,
[0023] Selon un mode de réalisation avantageux de la lame optique selon l’invention :
- le premier matériau diélectrique peut présenter un indice de réfraction na compris entre 1 ,8 et 3,5 ;
- le deuxième matériau diélectrique peut présenter un indice de réfraction nb compris entre 1 ,2 et 1 ,7.
[0024] Selon un mode de réalisation de la lame optique selon l’invention, le premier matériau peut être à base de Nb2Û5, et le deuxième matériau peut être à base de SiO2.
[0025] Selon un mode de réalisation de la lame optique selon l’invention, le nombre M de couches minces diélectriques peut être inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 20.
[0026] Selon un mode de réalisation de la lame optique selon l’invention, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques peuvent être tels que ladite lame optique présente une épaisseur totale inférieure à 5 [im et préférentiellement comprise entre 0,5 /zm et 2 /zm.
[0027] Selon un mode de réalisation, les épaisseurs optimisées peuvent être supérieures ou égales à 10 nm.
[0028] Un autre objet de l’invention est un dispositif optique par réflexion totale interne comprenant : - une lame optique selon l’invention telle que définie précédemment,
- une source de lumière adaptée pour émettre un faisceau lumineux présentant la longueur d’onde d’illumination in
- un dispositif optique adapté pour mettre en forme le faisceau lumineux de manière à ce qu’il illumine ladite lame optique avec ledit angle d’incidence optimisé din
- un détecteur adapté pour détecter un rayonnement de fluorescence émis lorsqu’un échantillon est déposé en correspondance d’une région d’une surface de ladite lame optique où sont produites des ondes évanescentes par une réflexion totale interne dans ladite lame optique du faisceau lumineux mis en forme, ledit rayonnement de fluorescence étant excité par lesdites ondes évanescentes.
[0029] De manière préférentielle, le dispositif optique par réflexion totale interne selon l’invention peut consister en un microscope à fluorescence par réflexion totale interne.
[0030] De préférence, le dispositif optique peut être un objectif de microscope.
Brève description des figures :
[0031 ] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d’exemple et qui représentent, respectivement :
[0032] [Fig.1 A] un schéma de principe de fonctionnement d’un microscope à fluorescence par réflexion totale interne de l’art antérieur,
[0033] [Fig.1 B] une vue schématique d’un microscope par réflexion totale interne de l’art antérieur ;
[0034] [Fig.2], une vue schématique d’un dispositif de microscopie par réflexion totale interne selon l’invention ; [0035] [Fig.3], une vue schématique d’une lame optique selon l’invention, destinée à recevoir un échantillon biologique dans un dispositif de microscopie par réflexion totale interne ;
[0036] [Fig.4A], l’absorption d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence et de la longueur d’onde du faisceau incident ;
[0037] [Fig.4B], le facteur d’exaltation du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident ;
[0038] [Fig.5A], un premier graphique représentant l’évolution du facteur d’exaltation du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident, pour une première divergence différente du faisceau incident,
[0039] [Fig.5B], un deuxième graphique représentant l’évolution du facteur d’exaltation du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident, pour une deuxième divergence différente du faisceau incident ;
[0040] [Fig.6], le facteur d’exaltation normalisé par rapport à une lame en verre du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident,
[0041] [Fig.7], une représentation schématique des étapes de la phase de conception du procédé de fabrication selon l’invention.
[0042] Dans les figures, sauf contre-indication, les éléments ne sont pas à l’échelle et les références identiques désignent des éléments identiques ou des étapes identiques. Description détaillée :
[0043] La figure 2 illustre de manière simplifiée un dispositif D de microscopie par réflexion totale interne selon l’invention. Le dispositif D comprend une lame optique LO selon l’invention, une source de lumière SL, un dispositif optique Obj et un détecteur de fluorescence Del
[0044] On s’attache tout d’abord à décrire le fonctionnement du dispositif D avant de détailler la structure de la lame optique LO. Enfin, on décrira un procédé de fabrication selon l’invention permettant d’obtenir la lame optique LO.
[0045] La lame optique LO est une lame, préférentiellement biocompatible, destinée à recevoir un échantillon biologique E à des fins d’imagerie de microscopie selon une configuration en RTL Un exemple de structure de lame optique conforme à l’invention est décrit plus loin en relation avec la figure 3 qui illustre schématiquement une coupe selon le plan xz de la lame optique LO selon l’invention.
[0046] La source de lumière SL est adaptée pour émettre un faisceau lumineux Lin présentant une longueur d’onde dite d’illumination in prédéterminée. La source SL est une source laser configurée pour émettre à une longueur d’onde typiquement comprise entre 350 et 1300 nm de manière à exciter les fluorophores contenus dans l’échantillon E et ainsi produire l’émission d’un rayonnement de fluorescence FL en étant au moins partiellement transmis par la lame optique LO.
[0047] Le dispositif optique Obj est adapté pour mettre en forme le faisceau lumineux Un de manière à ce qu’il illumine la lame optique avec un angle d’incidence dit optimisé 6in supérieur à l’angle critique.
[0048] De manière préférentielle, comme illustré dans la figure 2, le dispositif optique Obj est un objectif de microscope. L’objectif de microscope peut être à focale variable et à ouverture numérique variable (supérieure à 1 ,45). Il comprend une optique ou un assemblage plus ou moins complexe de lentilles optiques apte à permettre la formation du faisceau lumineux Lin en le focalisant en direction de la lame optique. Il est en outre apte à collecter le faisceau réfléchi et/ou rétrodiffusé issu de la lame optique dans un cône angulaire de 0 à un angle maximum donné par l’ouverture numérique de l’objectif. L’objectif est généralement du type à immersion dans l’huile et peut présenter une ouverture numérique (O. N.) importante, par exemple de l’ordre de 1 ,45, ce qui permet d’obtenir une résolution spatiale latérale (perpendiculairement à la direction z) élevée car la résolution spatiale latérale d est donnée par d = De plus, un objectif Obj avec une ouverture numérique O. N. élevée est avantageux car cela permet de déplacer le faisceau lumineux incident Lin par rapport à l’axe optique OA et ainsi obtenir une forte déviation du faisceau incident Lin par l’objectif, le faisceau Lin pouvant ainsi se propager avec un angle d’incidence 0in élevé et suffisant pour obtenir une RTI.
[0049] Alternativement, le dispositif optique Obj comprend un ou plusieurs lentilles et/ou miroirs pour focaliser le faisceau lumineux Lin et éventuellement un prisme ou une métasurface pour que le faisceau lumineux Lin illumine la lame optique avec l’angle d’incidence optimisé 0in.
[0050] Cet angle d’incidence optimisé 0in est supérieur à l’angle critique 0c à l’interface entre une surface SE de la lame destinée à recevoir l’échantillon E et le milieu ambiant (typiquement liquide) comprenant l’échantillon. L’angle d’incidence optimisé din est typiquement compris entre 62 et 80 degrés pour un environnement biologique d’indice de réfraction compris entre 1 ,33 et 1 ,35. Ainsi, la RTI du faisceau lumineux Lin sur ladite interface produit des ondes évanescentes OE. L’échantillon E étant placé en correspondance d’une région de la surface SE où sont produites les ondes évanescentes, les fluorophores de l’échantillon vont générer un rayonnement de fluorescence FL excité par les ondes évanescentes OE.
[0051] Le rayonnement de fluorescence FL émis est alors collecté par l’objectif Obj puis est dirigé, vers le détecteur Det afin d’être détecté. Ce détecteur Det est typiquement une caméra CCD ou CMOS dont la bande spectrale est adaptée à la détection du rayonnement de fluorescence FL réémis en provenance de l’échantillon E. Il convertit l’intensité lumineuse reçue en un signal électrique à destination d’une unité de traitement (non représentée sur les figures). L’unité de traitement est raccordée électriquement à la source de lumière SL, au détecteur Det et à l’objectif de microscope Obj de manière à pouvoir piloter ces éléments à des fins d’acquisition d’images de l’échantillon E en régime de RTI. [0052] A titre d’exemple non limitatif, le dispositif D illustré dans la figure 2 repose sur le principe d’épifluorescence dont l’observation de la fluorescence est effectuée dans une configuration par réflexion au moyen d’une lame ou d’un miroir dichroïque 50 par exemple. Cette configuration particulière permet de dissocier le chemin optique emprunté par la lumière d’excitation Lin, du chemin optique emprunté par le rayonnement de fluorescence FL.
[0053] De manière préférentielle, l’angle d’incidence optimisé 0in est compris entre 62 et 80 degrés. La borne basse de la plage précitée (62 degrés) est donnée par la valeur d’indice de réfraction de l’échantillon étudié. Quant à la borne haute de la plage précitée (80 degrés), elle est définie en fonction de la valeur de l’ouverture numérique utilisée pour l’observation de microscopie. L’ouverture numérique typique de l’objectif de microscope Obj du dispositif D est supérieure ou égale à 1 ,45. L’objectif de microscope Obj est de préférence à ouverture numérique et à focale variable.
[0054] On s’attache à décrire ci-après avec plus de détails la structure de la lame optique selon l’invention, telle que représentée dans la figure 3.
[0055] La lame optique LO possède la première face SE, et une deuxième face SI, opposée à la première, et définit un axe d’empilement s’étendant entre ces deux faces opposées selon la direction z. La première face SE est destinée à recevoir l’échantillon biologique E à observer et la deuxième face SI est la face illuminée par le faisceau lumineux Lin. La première face SE constitue l’interface où une exaltation du champ électromagnétique évanescent OE est produite par la lame optique 10.
[0056] Selon le mode de réalisation illustré dans la figure 2, la lame optique LO et l’objectif de microscope Obj sont agencés de sorte que l’axe d’empilement de la lame soit confondu avec l’axe optique OA de l’objectif. Autrement dit, la lame optique LO et l’objectif de microscope Obj sont orientés l’un par rapport à l’autre de manière à ce que l’interface optique formée entre la lame optique LO et l’échantillon E soit perpendiculaire à l’axe optique OA, selon la direction x.
[0057] Selon l’invention, la lame optique LO comprend un substrat SB transparent optiquement dans une région spectrale qui comprend la longueur d’onde d’illumination in et qui comprend la gamme spectrale du rayonnement de fluorescence FL. Par exemple, le substrat SB est une lamelle de microscope en verre sodocalcique d’indice 1 ,5 (ou tout autre support optiquement transparent calibré en épaisseur).
[0058] En outre, la lame optique LO comprend un empilement de couches diélectriques (appelé empilement optimisé EO ci-après) disposé directement au dessus du substrat SB. Cet empilement optimisé EO est particulièrement adapté pour permettre une exaltation du champ électrique évanescent OE produit à la surface SE dans une configuration de RTI du faisceau Lin. Ainsi, lorsque le dispositif de la figure 2 est en fonctionnement, l’échantillon biologique E qui est disposé sur la couche supérieure est illuminé par le faisceau Lin à la longueur d’onde d’illumination in après avoir traversé la lame optique. Plus précisément, le faisceau Lin traverse le substrat SB, puis l’empilement diélectrique EO jusqu’à atteindre l’interface entre la couche supérieure et l’échantillon E sous l’angle d’incidence optimisé 6in. L’onde évanescente OE créée par la RTI voit son intensité amplifiée grâce à la structure résonnante de l’empilement EO, ce qui permet d’augmenter significativement les performances d’imagerie de microscopie TIRF, en particulier en termes de sensibilité et de résolution axiale.
[0059] Comme illustré sur la figure 3, cet empilement EO est formé d’une succession de M > 7 couches minces alternées d’un premier matériau diélectrique à indice de réfraction na (couches minces référencées C ) et d’un deuxième matériau diélectrique à indice de réfraction nb (couches minces référencées C2), avec nb < n-a ■
[0060] La couche mince destinée à être contact avec l’échantillon E (appelée couche supérieure) est réalisée dans l’un des deux matériaux diélectriques. De préférence, cette couche est réalisée dans un matériau diélectrique biocompatible, par exemple en SiO2, TiO2, Nb2Û5 ... . La face supérieure de cette couche supérieure correspond à la face SE précédemment introduite. Quant à la face SI illuminée par le faisceau Lin, elle correspond à la face inférieure du substrat SB.
[0061 ] Dans la lame optique LO de l’invention, chacune des couches diélectriques présente une épaisseur dite optimisée respective choisie notamment en fonction de la longueur d’onde d’illumination £n, de l’angle d’incidence optimisé 0in, de la polarisation incidente et des indices de réfraction n1 et n2. Le procédé de fabrication et la face de conception de la lame optique LO de l’invention seront détaillés plus loin dans la description de la figure 7. On se limitera brièvement à préciser que les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques sont adaptés de manière à ce que la lame optique LO présente au moins une double résonance à la longueur d’onde d’illumination in en RTI pour deux angles d’incidence distincts. Plus précisément, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques sont tels que la lame optique présente :
- une première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à un premier angle d’incidence 6± en RTI, et
- une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à un deuxième angle d’incidence 02 en RTI.
[0062] Les angles d’incidence 6± et 02sont choisis de manière à ce que A0 = \6 - 02 \ soit compris entre 0.4° et 3°, préférentiellement compris entre 0.4° et 1 .5°. Plus précisément, on souhaite avoir A0 de l’ordre de grandeur de la divergence du microscope donc selon les systèmes
[0063] Il est entendu que la lame optique LO de l’invention peut comprendre plus de deux résonances tant que les conditions précitées restent vérifiées.
[0064] L’empilement EO de multicouches diélectriques couplé au substrat SB permet d’assurer une exaltation significative du champ électromagnétique évanescent OE à l’interface entre la lame optique et l’échantillon avec une tolérance angulaire très supérieure aux lames optiques de l’art antérieur. Cette exaltation permet d’accroitre l’intensité du rayonnement de fluorescence FL, ce qui améliore la sensibilité de l’imagerie microscopique ainsi que la résolution axiale du dispositif D.
[0065] En effet, les lames optiques résonantes de l’art antérieur sont optimisées pour présenter une résonance étroite spectralement et angulairement, pour un angle d’incidence optimal prédéterminé et pour une onde d’illumination théoriquement plane. Elles présentent ainsi un facteur d’exaltation « théorique >> du champ électromagnétique évanescent très élevé. Cependant, selon les lois de l’optique géométrique, le faisceau Lin présente une divergence angulaire naturelle non négligeable après avoir traversé l’objectif (typiquement comprise entre 0.5° et 1 °). Aussi, le faisceau incident sur la lame optique LO présente en réalité une pluralité d’angles d’incidences centrés autour de l’angle d’incidence optimal. Cela implique que le facteur d’exaltation des ondes évanescentes OE induit par la lame optique pour rayons selon les angles d’incidences autres que l’angle d’incidence optimal est en pratique nettement plus faible que le facteur d’exaltation « théorique >>.
[0066] Dans l’invention, la présence de deux résonances (ou plus) proches angulairement permet un recouvrement partiel entre les bandes de résonnances. Ce chevauchement permet d’élargir la tolérance angulaire de la lame optique LO afin qu’elle présente un facteur d’exaltation « réel >> six à dix fois plus important que les lames optiques de l’art antérieur (voir figure 6) (voir plus dans le cas de multi- résonances). La tolérance angulaire de la lame de l’invention est spécifiquement choisie afin d’être supérieure ou égale à la divergence du faisceau Lin après sa traversée de l’objectif du microscope Obj qui est typiquement comprise entre 0.5° et 1 °.
[0067] Par de nombreuses simulations et expériences, les inventeurs ont observé que cette résonance multiple n’était possible qu’avec un empilement EO comprenant un nombre M > 7 de couches minces diélectriques.
[0068] Comme évoqué précédemment, l’épaisseur optimisée de chaque couche de l’empilement est choisie notamment en fonction de la longueur d’onde d’illumination Ain, de l’angle d’incidence optimisé 0in, de la polarisation et des indices de réfraction n et n2. L’angle d’incidence optimisé 0in correspond ici à l’angle d’incidence sous lequel le faisceau Lin doit illuminer la lame optique à longueur d’onde d’illumination in pour obtenir un facteur d’exaltation des ondes évanescentes OE avec une tolérance angulaire optimisée. Il est compris entre et 02 (ou entre 02 > 02) pour bénéficier du chevauchement de la bande de la première absorption résonante et de la bande de la deuxième absorption résonante. Préférentiellement, les épaisseurs optimisées et le nombre M sont tels que 0in = (0X + 02)/2.
[0069] Les épaisseurs optimisées sont généralement comprises entre 5 et 500 nanomètres. De manière préférentielle, les épaisseurs optimisées sont supérieures ou égale à 10 nm afin de faciliter la fabrication de la lame optique LO. En effet, le contrôle précis de l’épaisseur de couches d’épaisseur inférieure à 10 nm est techniquement complexe à réaliser.
[0070] De manière préférentielle, le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction na compris entre 1 ,8 et 3,5 et le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction nb compris entre 1 ,2 et 1 ,7. Par exemple, le premier matériau est à base de Nb2Û5, le deuxième matériau est à base de SiÛ2.
[0071] De manière préférentielle, le nombre M de couches minces diélectriques est inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 20. En effet, les inventeurs ont observés que, comparativement à une lame optique LO avec un nombre de couche inférieur à 20, un nombre de couches diélectriques supérieur ou égal à 20 augmente la complexité du procédé de fabrication mais ne permet qu’un gain minime (voir nul) du facteur d’exaltation des ondes évanescentes.
[0072] De manière préférentielle, afin de limiter les aberrations optiques induites par l’utilisation de la lame optique dans le dispositif D, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques sont tels que ladite lame optique présente une épaisseur inférieure à 5 [im et préférentiellement comprise entre 0,5 /zm et 2 /zm.
Exemple préféré :
[0073] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, l’empilement optimisé EO de la lame optique LO comprend 14 couches diélectriques alternées de SiÛ2 et Nb2O5. La couche supérieure de l’empilement (celle destinée à être en contact avec l’échantillon) est en SiÛ2. Les épaisseurs optimisées des couches minces diélectriques sont, de la couche supérieure à la couche inférieure en contact avec le substrat, respectivement : 20 nm, 26.5 nm, 91.6 nm, 101.8 nm, 242.7 nm, 60.25 nm, 30.2 nm, 20 nm, 273.4 nm, 29.1 nm, 83.1 nm, 20 nm, 530.6 nm, 97.6 nm.
[0074] Cette structure est optimisée pour une longueur d’onde d’illumination in = 561 nm et pour un angle d’incidence optimisé 6in = 68°.Ces épaisseurs optimisées sont déterminées par la méthode de la figure 7 décrite plus loin._Les indices des couches sont respectivement n2(SiÛ2) = 1 .486 et ni(Nb2Û5) = 2.292 à 561 nm.
[0075] La transmission moyenne de cette structure, intégrée angulairement entre 0 et 80 degrés, et spectralement entre 561 et 700 nm est de 53%.
[0076] La figure 4A est un graphique présentant l’absorption optique de l’empilement EO selon le mode de réalisation préféré de l’invention, avec un milieu liquide au- dessus de la couche supérieure, en fonction de l’angle d’incidence et la longueur d’onde d’illumination. On observe quatre bandes de résonances, dont la bande de la première absorption résonante (référencée B1 sur la figure 4A) et la bande de la deuxième absorption résonante (référencée B2 sur la figure 4A). A la longueur d’onde d’illumination £n, la première absorption résonante est centrée sur l’angle 01 = 68,4° et la deuxième absorption résonante est centrée sur l’angle 02 = 67,65°. On rappelle ici que le tracé de la figure 4A représente une courbe d’absorption et, par conséquent, n’est qu’un tracé indirect de l’exaltation du champ évanescent généré en RTI sur la surface SE. En effet, la dépendance entre l’exaltation et l’absorption n’est pas linéaire, et la tolérance angulaire de l’exaltation résonante ne peut être directement déterminée à partir de la figure 4A. Le calcul exact montre qu’elle est néanmoins d’environ 1 °. Comme évoqué précédemment, cette valeur de tolérance angulaire correspond à la borne supérieure de la divergence typique du faisceau Lin après sa traversée de l’objectif du microscope Obj.
[0077] La figure 4B est une courbe qui représente la valeur du facteur d'exaltation du champ évanescent généré en RTI par la lame optique selon le mode de réalisation préféré de l’invention en fonction de l’angle d’incidence du faisceau Lin, à la longueur d’onde d’illumination in = 561nm. La courbe de la figure 4B correspond à une coupe horizontale de la figure précédente pour la longueur d’onde d’illumination in = 561nm, mais pour l’intensité du champ évanescent et non pas l’absorption. Comme attendu, la courbe de la figure 4B comprend les deux pics d’exaltation associés à la première et la deuxième absorption résonante fî1,fî2. On observe que ces absorptions résonantes permettent d’obtenir un facteur d’exaltation respectif de l’intensité du champ évanescent de l’ordre de 75. Cependant, cette valeur du facteur d’exaltation est une valeur « théorique >> obtenue pour une illumination avec une onde plane. En pratique, il faut tenir compte de la divergence du faisceau Lin pour estimer la valeur réelle du facteur d’exaltation.
[0078] Pour cela, les figures 5A et 5B représentent une courbe de la valeur du facteur l’exaltation de l’intensité du champ évanescent généré en RTI en fonction de l’angle d’incidence du faisceau Lin, à la longueur d’onde d’illumination in = 561nm et pour deux divergences différentes du faisceau Lin. La courbe de la figure 5A est obtenue pour une divergence de 0,6° alors que la courbe de la figure 5B est obtenue pour une divergence de 0,9°.
[0079] On observe que la prise en compte de la divergence du faisceau produit une intégration angulaire de la première et la deuxième absorption résonante qui fait disparaitre cette double résonance B1(B2 au profit d’une seule résonance « moyennée >> centrée sur l’angle d’incidence optimisé 6in = 68°. Cette résonance « moyennée >> présente un facteur d’exaltation de valeur inférieure aux valeurs associées aux résonances simples B1(B2 (c’est-à-dire la valeur « théorique >> de la figure 4B) mais plus élevée que ce qui peut être obtenu avec une unique résonance optimisée.
[0080] Ainsi, pour un faisceau Lin à la longueur d’onde d’illumination in = 561nm et pour l’angle d’incidence optimisé 6in = 68°, la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention permet d’obtenir un facteur d’exaltation d’environ 35 pour une divergence de 0,6° et d’environ 30 pour une divergence de 0,9°. De manière logique, une divergence plus importante implique un moyennage angulaire plus important de la première et la deuxième absorption résonante B1(B2 et donc une réduction plus importante du facteur d’exaltation.
[0081] La figure 6 est une courbe qui présente la valeur du facteur d’exaltation du rayonnement de fluorescence produit par la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention en fonction de la divergence du faisceau incident, pour l’angle d’incidence optimisé 0in = 68°. La valeur du facteur d’exaltation est calculée avec une intégration sur un cône angulaire allant de 0° à 80° du rayonnement de fluorescence FL, en tenant compte de la transmission moyenne de la lame optique LO, puis est normalisée par rapport à la valeur du facteur d’exaltation obtenue par une lame en verre. [0082] En outre, la figure 6 comprend une zone grisée qui correspond à la gamme de divergence d’un faisceau laser focalisé par un microscope commercial.
[0083] La figure 6 permet d’observer que la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention permet d’obtenir des facteurs d’exaltations élevés pour une plage de divergences larges qui regroupe la plupart des microscopes commerciaux existants. Plus précisément, la lame optique LO permet d’obtenir un facteur d’exaltation de fluorescence normalisé de l’ordre de 7.
[0084] Bien que les courbes des figures 4A à 6 aient été décrites en relation avec la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention, l’homme de l’art saura reproduire des résultats équivalents sans sortir du cadre de l’invention avec des matériaux diélectriques différents, et/ou des épaisseurs optimisées différentes et/ou un nombre de couches M différent en les adaptant à une longueur d’onde in et un angle d’incidence optimisé 6in prédéterminés.
[0085] On s’attache maintenant à décrire le procédé de fabrication de la lame optique LO selon l’invention. Ce procédé de fabrication comprend une phase de conception de la lame optique puis une phase de fabrication matérielle de la lame optique conçue. Les différentes étapes A à E de la phase de conception sont illustrées dans la figure 7.
[0086] Dans une première étape A, on sélectionne le premier matériau diélectrique d’indice r^et le deuxième matériau diélectrique d’indice n2 tel que n > n2. Le matériau d’indice n2 est de préférence de la silice pour la compatibilité biologique et le matériaux d’indice m peut être par exemple du Nb2O5, du TiO2, du HfO2 ou du Ta2O5.
[0087] Dans une deuxième étape B, on sélectionne la longueur d’onde d’illumination in et l’angle d’incidence optimal 6in en fonction du dispositif de microscopie par réflexion totale interne auquel la lame optique est destinée. Il s’agit ici typiquement de choisir une longueur d’onde d’illumination in égale à la longueur d’onde de la source de lumière du dispositif de microscopie. L’angle d’incidence optimal 0jnest choisi de manière à être supérieur à l’angle critique de RTI pour une interface formée entre un milieu liquide et une couche dans le deuxième matériau diélectrique et en fonction de la valeur de l’ouverture numérique utilisée pour l’observation de microscopie.
[0088] Après l’étape B, la phase de conception comprend une étape C consistant à concevoir une première structure comprenant un premier empilement de couches minces diélectriques disposé au-dessus d’un substrat SB. Le substrat SB est transparent dans une région spectrale prédéterminée comprenant la longueur d’onde d’illumination in et le rayonnement de fluorescence FL généré indirectement par la longueur d’onde d’illumination in.
[0089] Le premier empilement comprend N > 7 couches minces successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, chaque couche mince diélectrique présentant une première épaisseur respective. Les premières épaisseurs et le nombre N de couches minces diélectriques sont adaptés de manière à ce que la première structure présente une unique absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à l’angle d’incidence optimal 6in en régime de réflexion totale interne.
[0090] Cette étape C est connue en soit et est effectuée par le biais d’un logiciel de simulation et d'optimisation de couches minces optiques comme par exemple Optilayer ou par le biais d’un calcul direct.
[0091] Selon un mode de réalisation, dans le premier empilement, la couche supérieure du premier empilement est dans le deuxième matériau diélectrique et présente une première épaisseur comprise entre l.lÂin/4 et 1.8 in/4 . La valeur exacte de l’épaisseur de la couche supérieure dépend des indices des matériaux diélectriques, de la longueur d’onde de résonnance souhaitée et de l’angle de résonnance souhaité. En outre, les N - 1 couches inférieures du premier empilement (c’est-à-dire celles en dessous de la couche supérieure) présentent chacune une première épaisseur comprise entre 0.9Âin/4 et l.lÂin/4.
Préférentiellement, ce sont des couches d’épaisseur Âin/4.
[0092] Par exemple, afin de concevoir la lame optique du mode de réalisation préféré de l’invention précédemment décrite, le premier empilement de l’étape B comprend N=15 couches diélectriques alternées de SiÛ2 et de Nb2Û5. La couche supérieure est en SiO2 et présente une première épaisseur égale à l,44Âin/4. Les autres couches présentent une première épaisseur égale à Âin/4.
[0093] Après l’étape C, la phase de conception comprend une étape D consistant à déterminer deux fonctions F et F2 chacune représentative des deux paramètres critiques de la lame optique pour l’application visée : la transmission du rayonnement de fluorescence et l’exaltation du champ évanescent généré en RTI.
[0094] Plus précisément, la fonction F est représentative de la valeur de la transmission du rayonnement de fluorescence FL en fonction du nombre de couches minces diélectriques et de l’épaisseur de chaque couche mince diélectrique. Pour clarifier, il s’agit ici du rayonnement de fluorescence FL induit indirectement par l’absorption dans le premier empilement de la longueur d’onde d’illumination in en RTI avec l’angle d’incidence optimal 6in. Afin de tenir compte de l’émission lambertienne du rayonnement de fluorescence, la transmission est intégrée sur une gamme angulaire étendue d’angle d’incidence du rayonnement de fluorescence sur la lame optique, par exemple pour un angle d’incidence compris entre 0° et 80° ainsi que sur la gamme spectrale associée à l’émission de fluorescence.
[0095] La fonction F2 est représentative de l’intensité du champ électrique évanescent généré par le premier empilement en RTI à la longueur d’onde d’illumination in et à l’angle d’incidence optimal 6in en fonction du nombre de couches minces diélectriques et de l’épaisseur de chaque couche mince diélectrique
[0096] En effet, le facteur d’exaltation réel de la lame optique, c’est-à-dire celui du rayonnement de fluorescence collecté par l’objectif de microscope, est multifactoriel et dépend de :
- la transmission de la structure pour le rayonnement de fluorescence. Celui-ci doit être maximisée afin d’augmenter le rayonnement de fluorescence collecté. Cela revient par exemple à maximiser la transmission de la lame pour un angle d’incidence compris entre 0 et 80 degrés, pour une illumination avec une longueur d’onde comprise entre 400 nm et 800 nm,
- le facteur d’exaltation du champ évanescent généré en RTI, qui doit aussi être maximisé - la tolérance angulaire de ce facteur d’exaltation, comme expliqué précédemment.
[0097] L’optimisation simultanée de ces trois paramètres n’est réellement possible qu’en augmentant le nombre de degrés de libertés. C’est pourquoi il est nécessaire de construire les fonctions F et F2 qui serviront pour l’étape suivante E.
[0098] Par exemple, selon le mode de réalisation préféré de l’invention, les fonctions F et F2 ont la forme suivante pour la conception de la lame optique LO: avec T la transmission de la structure pour une onde plane éclairée sous incidenceO à la longueur d’onde À, avec E l’amplitude du champ électrique à l’interface supérieure de la structure, AO l’intervalle angulaire choisi pour l’optimisation du champ, typiquement entre 0.2 et 1 .5 degrés.
[0099] Enfin, après la détermination des fonctions F et F2, la phase de conception comprend une dernière étape E d’optimisation du premier empilement de manière à obtenir l’empilement optimisé EO de la lame optique LO. Les épaisseurs optimisées et le nombre M < N, M > 7de couches minces diélectriques de l’empilement optimisé EO sont déterminés par l’optimisation d’une fonction de mérite F basée sur la première fonction F et la deuxième fonction F2 de manière à ce que la lame optique présente :
- la première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et à l’angle d’incidence 6± en RTI, et la deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination in et au deuxième angle d’incidence 02 en RTI. [0100] Comme mentionné plus haut, l’optimisation est telle que A0 = - 021 e [0.4°; 3°] et 02 < Vin < 01 OU i < 0in < 02.
[0101] Cette optimisation est effectuée par le biais d’un logiciel de simulation et d'optimisation de couches minces optiques comme par exemple Optilayer.
[0102] De manière préférentielle, la fonction de mérite F à maximiser est telle que F = aF + (1 - a)F2, avec 0 < a < 1 un paramètre permettant de pondérer un poids respectif de la première fonction F et de la deuxième fonction F2 dans l’optimisation. Le paramètre alpha influe sur les poids respectifs de la transmission de la fluorescence par la lame vis-à-vis de l’exaltation du champ évanescent et est préférentiellement compris entre 0.3 et 0.7 car les deux paramètres étant importants, il convient de les considérer tous les deux de manière non négligeable.
[0103] Cette forme de fonction de mérite présente un nombre suffisant de degrés de liberté suffisant pour optimiser simultanément les trois paramètres influant sur le facteur d’exaltation réel de la lame optique.
[0104] L’optimisation consiste typiquement à trouver les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques pour lesquels la valeur de la transmission du rayonnement de fluorescence est maximale et pour lesquels l’intensité du champ électrique évanescent est maximale.
[0105] Selon un mode de réalisation préféré, l’optimisation est telle que A0 = \0 - 02| G [0.4°; 1.5°]. Cela permet d’obtenir une double résonance séparée angulairement d’une valeur correspondant à la divergence typique d’un faisceau laser focalisé par un objectif de microscope commercial. On maximise ainsi la valeur du facteur d’exaltation réel de la lame optique LO de l’invention.
[0106] Concernant la phase de fabrication matérielle, le dépôt de chaque couche mince est réalisé au moyen de toute technique connue de l’homme de l’art, par exemple par une des techniques suivantes : évaporation sous vide, pulvérisations sous vide, procédé sol-gel, enduction centrifuge, dépôt chimique en phase vapeur, dépôt par plasma.
[0107] L’invention offre ainsi la possibilité d’une production de lames optiques à exaltation de champ électromagnétique dont les caractéristiques peuvent être aisément adaptées en fonction des paramètres d’imagerie requis par le système de microscopie.
[0108] Comme indiqué plus haut, l’épaisseur, le nombre et le type de matériau sont des caractéristiques de l’empilement selon l’invention qui peuvent être adaptées au cas par cas, en fonction notamment des paramètres d’imagerie du système et des conditions d’éclairage souhaitées ou imposées. On privilégiera des matériaux optiquement transparents dans la bande spectrale utilisée pour mener l’étude, dont les valeurs de dispersion de l’indice de réfraction et du coefficient d’absorption sont connues et maitrisées. De telles caractéristiques doivent permettre, à un angle d’incidence optimisé et une longueur d’onde d’illumination prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale, une absorption optique à tolérance angulaire améliorée dans la couche supérieure de l’empilement optimisé, exaltant ainsi le champ électromagnétique évanescent à l’interface dudit empilement.

Claims

Revendications
1 . Procédé de fabrication d’une lame optique (LO) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) dans un dispositif optique par réflexion totale interne, ledit procédé comprenant une étape de conception de ladite lame optique (LO) et une étape de fabrication matérielle de ladite lame optique (LO) ainsi conçue, ledit procédé étant caractérisé en ce que la phase de conception comprend les étapes suivantes :
A. la sélection d’un premier matériau diélectrique présentant un indice de réfraction na et d’un deuxième matériau diélectrique présentant un indice de réfraction nb tel que na > nb
B. la sélection d’une longueur d’onde dite d’illumination Xin et d’un angle d’incidence dit optimal 0in en fonction dudit dispositif optique par réflexion totale interne auquel ladite lame optique est destinée
C. la conception d’une première structure comprenant un premier empilement de couches minces diélectriques disposé au dessus d’une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée comprenant ladite longueur d’onde d’illumination Xin, ledit premier empilement comprenant N > 7 de couches minces successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, une première épaisseur respective de chaque couche mince diélectrique et ledit nombre N de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que la première structure présente une absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination Xin et à l’angle d’incidence optimal 0in, en régime de réflexion totale interne
D. la détermination d’une première fonction Fr représentative d’une valeur d’une transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et d’une épaisseur de chaque couche mince diélectrique, et la détermination d’une deuxième fonction F2 représentative d’une intensité d’un champ électrique évanescent généré par la lame optique en régime de réflexion totale interne à la longueur d’onde d’illumination Xin et à l’angle d’incidence
FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP optimal 6in en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et de ladite première épaisseur de chaque couche mince diélectrique
E. la conception de ladite lame optique qui comprend un deuxième empilement de couches minces diélectriques dit empilement optimisé disposé au dessus du substrat (SB), l’empilement optimisé comprenant un nombre M < N, M > 7 de couches minces diélectriques successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques étant déterminés par une optimisation d’une fonction de mérite F basée sur la première fonction F et la deuxième fonction F2 de manière à ce que ladite lame optique présente une première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination Xin et à un premier angle d’incidence en régime de réflexion totale interne et présente une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination Xin et à un deuxième angle d’incidence 02 en régime de réflexion totale interne, avec A0 = |0X - 02| e [o.4°; 3°] et e2 < ein < e1 ou 0i < ein < e2.
2. Procédé de fabrication selon la revendication précédente, dans lequel ladite fonction de mérite F est telle que F = aFr + (1 - a)F2, avec 0 < a < 1 un paramètre permettant de pondérer un poids respectif de la première fonction Ft et de la deuxième fonction F2 dans ladite optimisation.
3. Procédé de fabrication selon la revendication précédente, dans lequel a est compris en 0.3 et 0.7.
4. Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite optimisation est telle que A0 = |0X - 02| e [0.4°; 1.5°].
5. Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite optimisation consiste à trouver les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques pour lesquels ladite valeur de la transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée est maximale et pour lesquels ladite intensité du champ électrique évanescent est maximale.
FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP
6. Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, dans le premier empilement, une couche supérieure du premier empilement est dans le deuxième matériau diélectrique et présente une première épaisseur comprise entre l.lAin/4 et 1.8Ain/4 et dans laquelle les N - 1 couches inférieures du premier empilement présentent chacune une première épaisseur comprise entre 0.9Ain/4 et l.lAin/4.
7. Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la première fonction F1 est représentative d’une transmission d’un rayonnement de fluorescence induit indirectement par une absorption de ladite longueur d’onde d’illumination Ain en réflexion totale interne dans ledit premier empilement illuminé avec ledit angle d’incidence optimal 0in, le rayonnement de fluoresence présentant un spectre compris dans ladite région spectrale, la transmission étant intégrée sur une gamme angulaire d’incidence du rayonnement de fluorescence sur ladite lame optique comprise entre 0 et 80°.
8. Lame optique (LO) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) dans un dispositif (D) optique par réflexion totale interne, la lame optique comprenant :
- une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée
- un empilement dit optimisé disposé (EO) au dessus du substrat (SB) et comprenant un nombre M > 7 de couches minces diélectriques successives et alternées (C1; C2) d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que ladite lame optique présente au moins : o une première absorption résonnante à une longueur d’onde dite d’illumination Ain et à un premier angle régime de réflexion totale interne, et o une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination Ain et à un deuxième angle d’incidence 02 en régime de réflexion totale interne, avec A0 = |0X - 02| e [0.4°; 3°].
9. Lame optique selon la revendication précédente, dans laquelle :
FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction na compris entre 1 ,8 et 3,5 ;
- le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction nb compris entre 1 ,2 et 1 ,7.
10. Lame optique selon la revendication précédente, dans laquelle le premier matériau est à base de Nb20s, le deuxième matériau est à base de SiC>2.
11 . Lame optique selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle le nombre M de couches minces diélectriques est inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 20.
12. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 8 à 11 , dans laquelle les épaisseurs optimisées et le nombre M de couches minces diélectriques sont tels que ladite lame optique présente une épaisseur inférieure à 5 /m et préférentiellement comprise entre 0,5 fim et 2 fim.
13. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, dans laquelle les épaisseurs optimisées sont supérieures ou égales à 10 nm.
14. Dispositif (D) optique par réflexion totale interne comprenant :
- une lame optique (LO) selon l’une quelconque des revendications 8 à 13,
- une source de lumière (SL) adaptée pour émettre un faisceau lumineux (Lin) présentant la longueur d’onde d’illumination Ain
- un dispositif optique (Obj) adapté pour mettre en forme le faisceau lumineux (Ln) de manière à ce qu’il illumine ladite lame optique avec ledit angle d’incidence optimisé 0in
- un détecteur (Det) adapté pour détecter un rayonnement de fluorescence (FL) émis lorsqu’un échantillon (E) est déposé en correspondance d’une région d’une surface (SE) de ladite lame optique où sont produites des ondes évanescentes (OE) par une réflexion totale interne dans ladite lame optique du faisceau lumineux (Ln) mis en forme, ledit rayonnement de fluorescence (Fl) étant excité par lesdites ondes évanescentes (OE).
15. Dispositif selon la revendication précédente 14, consistant en un microscope à fluorescence par réflexion totale interne.
FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP
16. Dispositif selon la revendication 15, dans lequel le dispositif optique (Obj) est un objectif de microscope.
FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP
EP24705703.7A 2023-02-23 2024-02-22 Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame Pending EP4669990A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2301673A FR3146214B1 (fr) 2023-02-23 2023-02-23 Lame optique destinée à la microscopie par réflexion totale interne, dispositif de microscopie par réflexion totale interne comportant une telle lame et procédé de fabrication d’une telle lame
PCT/EP2024/054550 WO2024175729A1 (fr) 2023-02-23 2024-02-22 Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4669990A1 true EP4669990A1 (fr) 2025-12-31

Family

ID=86331845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP24705703.7A Pending EP4669990A1 (fr) 2023-02-23 2024-02-22 Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4669990A1 (fr)
FR (1) FR3146214B1 (fr)
WO (1) WO2024175729A1 (fr)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2108879A1 (fr) 1970-10-12 1972-05-26 Goiffon Leon Ets
US9733465B2 (en) 2015-02-12 2017-08-15 The Penn State Research Foundation Waveguides for enhanced total internal reflection fluorescence microscopy
DE102019102604A1 (de) * 2019-02-01 2020-08-06 Carl Zeiss Jena Gmbh Funktionalisierter Wellenleiter für ein Detektorsystem

Also Published As

Publication number Publication date
FR3146214A1 (fr) 2024-08-30
WO2024175729A1 (fr) 2024-08-29
FR3146214B1 (fr) 2025-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2734884B1 (fr) Dispositif optique d&#39;éclairage conoscopique a cone creux pour microscope optique et procédé de microscopie optique en conoscopie
EP3513171B1 (fr) Dispositif optique de caractérisation d&#39;un échantillon
EP4052073B1 (fr) Element optique diffractif comprenant une metasurface pour la microscopie tirf
FR3065132A1 (fr) Dispositif et procede d&#39;imagerie multispectrale dans l&#39;infrarouge
FR2596863A1 (fr) Dispositif de microscopie analytique, propre a former a la fois une sonde raman et une sonde electronique
EP4260116B1 (fr) Microscope confocal avec réallocation de photons
FR2942049A1 (fr) Microscope de plasmon de surface a haute resolution comportant un interferometre heterodyne fibre
EP2297745A1 (fr) Dispositif de piégeage de particules
EP4669990A1 (fr) Lame optique pour un dispositif optique par réflexion totale interne, son procédé de fabrication et dispositif optique comportant une telle lame
EP2710351A2 (fr) Dispositif de type biopuce
EP3751258B1 (fr) Dispositif et procédé d&#39;observation d&#39;un échantillon fluorescent
FR3052923A1 (fr) Reflecteur optique resonant a multiples couches minces de materiaux dielectriques, capteur optique et dispositif d&#39;amplification laser comportant un tel reflecteur
EP3980749A1 (fr) Procédé et dispositif d&#39;analyse d&#39;un échantillon, mettant en oeuvre un support résonant, illuminé par un rayonnement infra-rouge
WO2010106289A1 (fr) Dispositif de microscopie de fluorescence et methode d&#39;observation associee
WO2023025842A1 (fr) Lame optique biocompatible destinee a la microscopie a reflexion totale interne et systeme d&#39;imagerie microscopique comportant une telle lame
EP4591108B1 (fr) Microscope optique avec résonateur
EP3575774B1 (fr) Procédé d&#39;observation de particules, en particulier des particules submicroniques
Shavit Quantitative evanescent-field imaging: smart surfaces and concurrent sample-plane and back-focal plane image analysis
FR2915804A1 (fr) Cellule spectroscopique a double paire de lentille
FR3052913A1 (fr) Capteur optique comportant un reflecteur optique resonant a multiples couches minces de materiaux dielectriques
FR2858422A1 (fr) Dispositif d&#39;imagerie

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20250912

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC ME MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR