EP4658767A1 - Testsystem aufweisend stabil cyp-transfizierte oder transduzierte säugetierzellen - Google Patents

Testsystem aufweisend stabil cyp-transfizierte oder transduzierte säugetierzellen

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EP4658767A1
EP4658767A1 EP24704324.3A EP24704324A EP4658767A1 EP 4658767 A1 EP4658767 A1 EP 4658767A1 EP 24704324 A EP24704324 A EP 24704324A EP 4658767 A1 EP4658767 A1 EP 4658767A1
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EP
European Patent Office
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cytochrome
cells
cyp
mammalian cell
cho
Prior art date
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Pending
Application number
EP24704324.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jan-Heiner KÜPPER
Christian Schulz
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Brandenburgische Technische Universitaet Cottbus
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Brandenburgische Technische Universitaet Cottbus
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Publication date
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • Test system comprising stable CYP-transfected or transduced mammalian cells
  • the invention relates to a mammalian cell or cell line, preferably CHO cell, containing, after transfection or transduction, polynucleotides encoding at least one cytochrome P450 (CYP) and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase (CPR, POR) stably integrated into the genome, the use thereof and a test system obtainable therefrom, preferably by providing microsome (fractions) or suspension cells.
  • CYP cytochrome P450
  • CPR, POR NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase
  • liver is a central detoxification organ of the metabolism.
  • Liver cells hepatocytes represent 70-80% of all cells in the liver and have the important physiological liver functions (Elaut et al. (2006) ).
  • the liver uses biotransformation or metabolism to excrete or detoxify ingested substances (e.g. drugs, toxins, natural substances).
  • ingested substances e.g. drugs, toxins, natural substances.
  • the phase I enzymes of the cytochrome P450 (CYP450) system are particularly important for biotransformation.
  • the CYP450 enzymes are oxidoreductases that cause oxidative degradation or metabolism of numerous substances, including drugs.
  • the isoenzymes CYP1A2, - 2C9, -2C19, -2D6, -2E1 and -3A4 alone are responsible for approx. 90% of all oxidative metabolism of drugs.
  • CPR NADPH cytochrome P450 oxidoreductase
  • ADME test systems absorption, distribution, metabolism, excretion
  • Microsomes from recombinant expression systems are currently mostly used in ADME studies to elucidate the CYPs involved in drug metabolism.
  • Established models include recombinant microsomes with human CYPs (including cofactors) from baculovirus-infected insect cells (so-called “Supersomes” or "BACULOSOMES” - BD Biosciences, Corning, ThermoFisher, Merck), from E.
  • the established insect cell models offer at the cellular level due to the lytic culture system according to Baculovirus infection only offers limited possibilities for long-term cultures.
  • the mammalian models described were the human CYP genes and cofactors specifically integrated into the genome in a stable manner, so that they are present in the cell nucleus as an episomal recombinant viral genome after transfection or infection using modified adenoviruses, for example. Furthermore, the mammalian cell lines modified with human CYPs are adherent and serum-dependent cell culture models. Both factors limit the possibilities for upscaling and pharmaceutical/therapeutic use of metabolites.
  • test system with no or very low endogenous CYP background for testing substances, in particular xenobiotics, active substances (candidates) and medicinal products as test substances, in particular the interaction of a test substance with at least one CYP.
  • the invention relates to a mammalian cell or a cell line obtainable therefrom containing, after transfection or transduction, polynucleotides encoding at least one cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase which are stably integrated into the genome, wherein the polynucleotides are preferably introduced into the mammalian cell with at least one expression vector.
  • the test system comprises mammalian cell (lines) with at least one cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase, which are provided as a suspension culture in a high cell density of an average of 5xl 0 6 cells/mL at >80% vitality.
  • the methods for measuring cell numbers and vitality are known to those skilled in the art.
  • Microsomal fractions are obtained from the mammalian cells according to the invention using methods known to those skilled in the art, which advantageously give a protein yield of at least 100 pg (amount of protein or
  • enzyme quantity and more, in particular at least 200 pg (protein quantity or enzyme quantity) or at least 300 pg (protein quantity or enzyme quantity). Due to the high protein yield, a very measurable conversion of CYP enzyme activity or the metabolites formed is possible. An example of this is a conversion with the substance phenacetin in a mammalian cell with CYP1A2 and CPR a phenacetin
  • the sensitivity limit of the test system according to the invention for CYP-specific enzyme activity when reacted with microsomes from mammalian cells according to the invention with at least one cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase is a maximum of 1-10 pg of microsomal protein in a 50 pL reaction and 10 min reaction time with a P450 Glo assay.
  • this assay known to the person skilled in the art (e.g. P450 Gio Assays from Promega), a substrate specific to the respective CYP is offered and the CYP enzyme activity can be detected using a luminescence reaction.
  • the detection of a metabolite formed via CYP e.g.
  • metabolite of a drug can be carried out, for example, using the HPLC analysis method known to the person skilled in the art.
  • the sensitivity limit for the formation of such a metabolite in the test system according to the invention is preferably 30-300 pg total microsomal protein in a 200 pL test reaction and 30 min reaction time.
  • CHO are particularly preferred (Chinese hamster ovary cells) cells and cell lines obtainable therefrom, since these advantageously have no or low endogenous CYP background activity, and consequently at least one cytochrome P450 (CYP) introduced by stable transfection or transduction is present without a relevant background activity of endogenous CYPs.
  • CYP cytochrome P450
  • the enzyme activity is advantageously enhanced by the further introduced CPR.
  • a low or non-existent background activity of endogenous CYPs is present if, using the HPLC method for detecting metabolites formed, this is below the detection limit and/or is a maximum of 1 - 5%, preferably 1% of the specific activity in pmol/mg/min for at least one introduced cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase.
  • the background activity of endogenous CYPs in the parental mammalian cells can be determined prior to stable introduction of the CYP / CPR complex into the mammalian cell according to the invention .
  • the parental mammalian cells can serve as a negative control .
  • mammalian cells or the corresponding cell line are obtained as suspension cells or as microsomes.
  • microsome also includes microsome fractions and can be obtained by processing the mammalian cell or the corresponding cell line provided. Microsome and microsome fraction are therefore synonymous.
  • the polynucleotides can be Cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase can be taken from the usual databases.
  • gene sequences can be taken from databases of the National Center for Biotechnology (NCBI) and the National Library of Medicine (NLM). Human cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase polynucleotide sequences are particularly preferred.
  • cDNA sequences for CPR (NM_000941.2), CYP1A2 (BC067428.1), CYP2B6 (BC067430.1) or CYP3A4 (NM_017460.6), but also for the other CYPs relevant for biotransformation, which can be introduced into an expression vector.
  • Table 1 mRNA IDs and primer sequences of human target genes
  • Target genes fw AAGGGCGGTGCCCACATCTAC
  • cytochrome P450 or CYPs can be used which are expressed in primary human liver cells and other cells, are relevant for the biotransformation of drugs and xenobiotics or will become relevant in the future, and are selected from the group CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C 8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, C YP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43 , CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11,
  • the above-mentioned obtained mammalian cells, cell lines, suspension cells or microsomes according to the invention can be mixed with at least one test substance and the metabolites can be identified and characterized.
  • the test system is used to detect metabolites, in particular due to the specific CYP test substance interaction, whereby an enzymatic conversion of the test substance takes place with one or more CYP450 enzymes that have been stably introduced via transfection or transduction, and specific metabolites can be obtained.
  • the use of a test system with microsomes is particularly preferred.
  • test system due to the low or completely lacking background enzyme activity of endogenous CYP450 enzymes, the test system is suitable for identifying or characterizing the responsibility or function of the CYP450 enzyme(s) that have been stably introduced via transfection or transduction for the metabolic conversion of chemical substances, xenobiotics or drugs.
  • the invention relates to a test system for detecting an interaction of at least one test substance with at least one CYP450 enzyme.
  • the invention relates to a test system for detecting the or the one responsible for the biotransformation of at least one test substance by at least one CYP450 enzyme, whereby an enzymatic conversion of at least one test substance takes place with one or more CYP450 enzymes.
  • a further advantage of the test system according to the invention is that the inhibition or activation of the CYP450 enzyme(s) that were stably introduced via transfection or transduction can be investigated by at least one test substance without a background of endogenous CYP450 enzymes. This makes it advantageous to investigate interactions of drugs with regard to metabolic conversion by a specific CYP450 enzyme and activation or inhibition of another CYP450 enzyme.
  • test system is particularly suitable for in-vitro ADME tests (supra).
  • ADME describes the processes that the body carries out on the active substances contained in a drug after it has been administered, particularly with regard to toxicology.
  • the invention also relates to a method for carrying out the aforementioned test systems according to the invention or to the use of such a test system according to the invention for carrying out a method, in particular wherein an enzymatic conversion of at least one test substance takes place with one or more CYP450 enzymes which have been stably introduced via transfection or transduction.
  • the invention also relates to a screening method for detecting a test substance, wherein an enzymatic conversion of at least one test substance is carried out with one or more CYP450 enzymes which have been stably introduced via transfection or transduction.
  • the test system according to the invention can be used particularly advantageously for long-term studies, since it enables an almost complete simulation of the human liver with regard to biotransformation.
  • the identified metabolites can be used, for example, to determine the side effects of a drug by producing the metabolite formed in an appropriate amount and testing it toxicologically on target cells or organs.
  • the test substance contains at least one chemical substance, a mixture of substances, in particular at least one drug or active ingredient or a xenobiotic.
  • the chemical substances are preferably an organic molecule which, in addition to carbon (C) and hydrogen (H), can contain heteroatoms, such as oxygen (O), nitrogen (N), sulfur (S) or phosphorus (P).
  • the chemical substances can have linear and/or ring-shaped carbon chains including heteroatoms.
  • Organic molecules with less than 1,500 g/mol, in particular less than 750 g/mol, less than 500 g/mol, less than 250 g/mol are preferred. It is also preferred that at least one chemical substance contains at least one chiral carbon atom.
  • the substances obtained from the test substances or metabolites obtained in the presence of one or more enzymes can be adequately analyzed, for example, by means of combined analytical methods such as GC/LC-MS, IR, NMR and, in particular, can be routinely subjected to structural elucidation.
  • An “enzyme” in the sense of this invention is a protein, namely at least one selected cytochrome P450 (CYP) or a complex of cytochrome P450 (CYP) and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase (CPR, POR), which can catalyze one or more biochemical reactions.
  • CYP cytochrome P450
  • CPR, POR NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase
  • a The enzyme according to the invention is capable of obtaining a first (enzyme) product or products, namely metabolites, from a test substance (substrate). In particular, a metabolite profile can be created.
  • the "specific activity" of an enzyme in the sense of this invention is the amount of a substrate metabolite formed by an enzyme (in pmol) per protein used (mg) in a certain time (minute). In the case of cells or microsomes, if no specific purified protein is present, the total protein is used as the reference value.
  • the invention also includes transgenic mammalian cells which are produced using viral vectors (e.g. lentiviruses, e.g. DE 69830663 T2).
  • viral vectors e.g. lentiviruses, e.g. DE 69830663 T2
  • the production of such mammalian cells is known to the person skilled in the art.
  • Preferred suitable promoters for expression vectors are, but are not limited to, EF-1, SV-40, CMV, RSV, GAG, and many more. also conditionable, i.e. inducible promoters such as TET on, - off, cumate-inducible promoter, dexamethasone-inducible promoter, ecdysone-inducible promoter, T7 RNA polymerase inducible promoter, light-dependent promoters or stress-inducible promoters (e.g.
  • auxiliary sequences such as IRES (internal ribosome entry site), sequences for antibody detection and protein purification such as V5 tag, Flag tag, c-myc tag, His tag, GST tag, Strep tag, GFP, LacZ, luciferase and others, sequences for protein cleavage of such tags such as picornavirus 2A protease, sequences for thrombin-mediated cleavage and others.
  • IRES internal ribosome entry site
  • sequences for antibody detection and protein purification such as V5 tag, Flag tag, c-myc tag, His tag, GST tag, Strep tag, GFP, LacZ, luciferase and others, sequences for protein cleavage of such tags such as picornavirus 2A protease, sequences for thrombin-mediated cleavage and others.
  • promoters and auxiliary sequences are known to the person skilled in the art.
  • test system can comprise a conventional medium, culture medium, culture fluid, and in particular contain further co-factors.
  • Suitable cell cultures and culture media are known to the person skilled in the art and are commercially available.
  • a cell suspension can be provided according to the invention.
  • test system can be fixed in vitro on a solid support. Synonymously, this can be referred to as an assay.
  • the generation of mono-CYP CHO cell lines was carried out in a 2-step modification process.
  • the CHO-Kl parental cell line serum-free suspension culture
  • CPR cytochrome P450 oxidoreductase
  • CPR is an essential co-factor for CYP enzyme activity, as it exclusively enables the sequential electron transport from NADPH to CYP enzymes.
  • the increased expression and activity of human CPR in selected CHO-CPR clones was characterized and the most suitable clone 12 was selected for further genetic modification with human CYP enzymes ( Figure 1).
  • the most suitable CHO-CPR clone 12 was again equipped with the human CYP cDNA of CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4, CYP2D6 or CYP2C19 by lentiviral gene transfer. These cDNAs are regulated by a CMV promoter, analogous to CPR.
  • the CHO-Kl parental cell line without increased CPR activity was also equipped with the respective CYP cDNAs. The subsequent characterization and selection of the best performing cell clones showed the expected specific CYP expression in comparison to the parental cell lines CHO-Kl and CHO-CPR ( Figure 2). Only for CYP2B6 and CYP2D6 a weak protein band was also detected in the parental cell lines.
  • CHO-CPR/CYP2D6 Cl , C9 & C18 were also tested for Metabolism of the prototypical substances phenacetin (CYP1A2), testosterone (CYP3A4) and luciferin-ME EGE (CYP2D6) was used to gain insights into the enzyme activity and yields of the main metabolites formed ( Figure 6).
  • the yields determined using standards of the main metabolites of phenacetin and testosterone in the 200 pL metabolism mixtures were in the range of 100 - 200 ng and were partly of a magnitude comparable to HLM.
  • Example of an implementation to demonstrate the involvement of a specific CYP450 enzyme in the metabolism of a test substance or an active ingredient CYP screening using the example of bupropion metabolism
  • a test substance e.g. bupropion (BUP)
  • BUP bupropion
  • conversion studies are carried out with isolated microsomes of CHO clones with recombinant CPR and different recombinant CYP activities (e.g. CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6).
  • Bupropion is a norepinephrine and dopamine reuptake inhibitor that is used to treat depression, seasonal affective disorder and used to help people quit smoking.
  • microsomes in this test system has the advantage that primary and secondary metabolizations apart from the CYP-dependent phase-1 biotransformation are avoided, since the corresponding phase-2 biotransformation enzymes are absent in this predominantly ER-based cell fraction.
  • the aqueous supernatant of each CYP450 sample is examined using appropriate analytics (HPLC, LC-MS, etc.). The amount of the test substance that decreases during metabolism by a specific CYP enzyme and the formation of metabolites are detected, and their identity is determined using mass spectrometric methods if necessary.
  • microsomes with specific CYP450 activity are incubated together with an NADPH regeneration system (consisting of NADP+, glucose-6-phosphate and the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase) and the test substance (final concentration of 0.5 mM) in a 200 pL mixture for 60 minutes at 37 °C.
  • NADPH regeneration system consisting of NADP+, glucose-6-phosphate and the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • test substance final concentration of 0.5 mM
  • the quantification of the test substance remaining in a sample and the creation of metabolite profiles are carried out by subsequent HPLC analysis, initially with DAD detection.
  • the HPLC setup consists of a modular (U) HPLC system of the Nexera series (LC-40, SHIMADZU, Kyoto, Japan) with a ZORBAX SB-C18 column (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US), which is mounted on 25 °C.
  • U modular
  • ZORBAX SB-C18 column Algilent Technologies, Santa Clara, CA, US
  • 20 pL of sample are isocratically separated in the mobile phase consisting of 45% methanol and 55% KH2PO4 buffer (50 mM, pH 5.5) at a flow rate of 0.8 mL/min for 25 minutes.
  • Bupropion (BUP) and the most prominent CYP450-formed main metabolite hydroxybupropion (HBUP) are detected based on their elution time at 254 and 214 nm respectively.
  • the detected substances are quantified using standard solutions of commercially available references in the range of 0.1 - 1 mM for BUP and 1 - 75 pM for HBUP.
  • BUP and HBUP are dissolved in methanol.
  • Ketoconazole is a drug which is used, among other things, to treat or prevent fungal infections such as blastomycosis, candidiasis, coccidioidomycosis, histoplasmosis, chromomycosis and paracoccidioidomycosis.
  • fungal infections such as blastomycosis, candidiasis, coccidioidomycosis, histoplasmosis, chromomycosis and paracoccidioidomycosis.
  • One of the interactions of this drug is that it is a strong inhibitor of CYP3A4 enzyme activity. In the human organism, this can result in the biotransformation of drugs primarily metabolized by CYP3A4 being inhibited, which leads to an increased and/or prolonged effect of these drugs.
  • prodrugs that are activated by CYP3A4 can have a reduced and/or slower effect when used with ketoconazole.
  • ketoconazole shows the great benefit of in-vitro test systems, such as the system according to the invention, to clarify such drug interactions at an early stage.
  • ketoconazole To investigate the influence of ketoconazole on CYP3A4 activity, conversion studies are performed using isolated microsomes from CHO clones with recombinant CPR and specific recombinant CYP3A4 activity (e.g. CHO-CPR/CYP3A4 CI) in the presence and absence of ketoconazole. Differences in CYP3A4 activity are investigated either by commercially available enzyme activity assays (e.g. CYP3A4-G1O Assay from Promega) or analysis of the aqueous supernatants using appropriate analytics (HPLC, LC-MS etc.). The latter is described in the following example.
  • the quantification of the amount of testosterone remaining in a sample and the detection of the main metabolite 6ß-hydroxytestosterone (6ß-OH-T) formed by CYP3A4 are carried out by subsequent HPLC analysis with DAD detection.
  • the HPLC setup consists of a modular (U) HPLC system from the Nexera series (LC-40, SHIMADZU, Kyoto, Japan) with a ZORBAX SB-C18 column (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US), which is equilibrated to 25 °C.
  • the analytes are quantified using standard solutions of commercially available references in the range of 0.1 - 1 mM for testosterone and 1 - 75 pM for 6ß-OH-T. From the chromatograms of the measured samples, the signals (peaks) for testosterone and 6ß-OH-T are quantitatively evaluated using the standard lines and the decreasing CYP3A4 activity with increasing concentration is determined. of ketoconazole. It is shown that with increasing ketoconazole concentrations, the amount of 6ß-OH-T formed via CYP3A4 decreases. This is an example of a drug interaction between ketoconazole and testosterone, in that the CYP3A4 metabolism of testosterone is inhibited by ketoconazole.
  • FIG. 1 Recombinant CPR expression and activity in selected CHO-CPR cell clones.
  • CPR expression was analyzed at mRNA level by RT-qPCR (A) and at protein level by Western blotting (B). Increased CPR expression was further confirmed by indirect immunofluorescence (CPR in red, cell nuclei in blue) (D).
  • Figure 8 shows an example expression vector. Cited .
  • Literature
  • Cytochrome P450 CYP1B1 interacts with 8- methoxypsoralen (8-MOP) and influences psoralen-ultraviolet A (PUVA) sensitivity. Pios one. 2013;8(9):e75494.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Säugetierzelle oder Zelllinie, vorzugsweise CHO-Zelle, enthaltend nach Transformation stabil in das Genom integrierte Polynukleotide kodierend für mindestens ein P450-Cytochrom (CYP) und NADPH- P450-Cytochrom (CPR, POR), deren Verwendung sowie ein daraus erhältliches Testsystem, vorzugsweise durch Bereitstellung von Mikrosom(-fraktionen) oder Suspensionszellen.

Description

Testsystem aufweisend stabil CYP-transf izierte oder transduzierte Säugetierzellen
Beschreibung
Gegenstand der Erfindung ist eine Säugetierzelle oder Zelllinie, vorzugsweise CHO-Zelle, enthaltend nach Transfektion oder Transduktion stabil in das Genom integrierte Polynukleotide kodierend für mindestens ein Cytochrom-P450 (CYP) und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CPR, POR) , deren Verwendung sowie ein daraus erhältliches Testsystem, vorzugsweise durch Bereitstellung von Mikrosom (-fraktionen) oder Suspensionszellen.
Die Leber ist ein zentrales Entgiftungsorgan des Stoffwechsels. Leberzellen (Hepatozyten) repräsentieren 70-80% aller Zellen in der Leber und verfügen über die wichtigen physiologischen Leberfunktionen (Elaut et al. (2006) ) .
Die Leber verwendet die Biotransformation oder Metabolisierung, um aufgenommene Substanzen (z.B. Medikamente, Toxine, Naturstoffe) ausscheiden zu können bzw. zu entgiften. Für die Biotransformation wichtig sind insbesondere die Phase- I-Enzyme des Cytochrom-P450 (CYP450) Systems. Es handelt sich bei den CYP450-Enyzmen um Oxidoreduktasen, die einen oxidativen Abbau bzw. Metabolisierung zahlreicher Substanzen wie u.a. auch Arzneistoffe bewirken. Von den zahlreichen CYP450-Isoenzymen mit unterschiedlicher Substratspezifität, die es beim Menschen gibt, sind allein die Isoenzyme CYP1A2, - 2C9, -2C19, -2D6, -2E1 und -3A4 für ca. 90 % sämtlicher oxidativer Metabolisierungen von Medikamenten verantwortlich. In vielen Fällen erhalten eine Vielzahl von Medikamenten erst durch diese biochemischen Veränderungen ihre curative Wirksamkeit oder verursachen gar giftige Metaboliten mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen . Zum überwiegenden Teil findet die Metabolisierung von Fremdsubstanzen über Mechanismen der Biotrans formation unter Beteiligung entsprechender Enzym- und Transportsysteme in der Leber statt . Metabolisierungsreaktionen von Wirk-/ Fremdsubstanzen in der Phase- 1 Biotrans formation, welche Gegenstand der beschriebenen Erfindung sind, werden überwiegend durch Enzyme der Cytochrom- P450-Familie ( CYPs ) umgesetzt , welche im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert sind . Alle durch CYPs katalysierten Metabolisierungsreaktionen sind hierbei von der ebenfalls im ER lokalisierten NADPH-Cytochrom-P450 Oxidoreduktase ( CPR, POR) abhängig, welche als essentieller Ko-Faktor benötigte Elektronen von NADPH sequenziell an CYPs überträgt .
Die Aufklärung, welche CYPs an der Metabolisierung einer Wirksubstanz beteiligt sind, welche Metaboliten vom j eweiligen CYP gebildet und wie diese ggf . durch weitere CYP-abhängige Reaktionen weiter verstof fwechselt werden, ist stets einer der initialen Schritte bei der Entwicklung neuer Medikamente . Für die exakte Aufklärung von Metaboliten sowie deren Bereitstellung in ausreichenden Mengen für weitergehende Analysen werden insbesondere ADME-Testsysteme (Absorption, Distribution, Metabolismus , Exkretion) benötigt , welche verlässliche Erkenntnisse zu CYP-spezi f ischen Metabolisierungsreaktionen liefern . Durch die Komplexität dieser Vorgänge gestaltet sich die Identi fi zierung beteiligter CYPs und damit die Voraussage von Stof fwechselvorgängen und Interaktionen in der menschlichen Leber mitunter schwierig .
Im Stand der Technik werden in toxikologischen in-vitro- Wirkstof f Studien vornehmlich humane Testsysteme wie Zellkulturen von Primärzellen sowie Krebs zelllinien mit diversen Modi fi zierungen eingesetzt , um Vorgänge in der menschlichen Leber möglichst patientennah abzubilden . Hierbei wichtig sind für Phase- I-Studien auch subzelluläre I solate des ER, so genannte Mikrosomen, da zumeist CYPs ( inkl . des Ko- Faktors CPR, POR) in diesem Zellkompartiment lokalisiert sind . Ein großer Nachteil dieser Systeme hinsichtlich der Identi fi zierung und Charakterisierung spezi fischer CYP- Metabolisierungen ist die fehlende Spezi fität , da in Leberzellen die physiologische CYP-Population bestehend aus mehreren unterschiedlichen CYPs exprimiert und aktiv ist . Weitergehend kann die Aktivität mancher relevanter CYPs gegenüber möglichen Wirkstof f kandidaten zu gering ausgeprägt sein, so dass von diesem gebildete Metaboliten nicht detektiert , geschweige denn ausreichende Mengen für weitergehende Studien produziert werden können .
Im Rahmen von ADME-Studien zur Aufklärung an einer Wirkstof fmetabolisierung beteiligter CYPs kommen derzeit zumeist Mikrosomen aus rekombinanten Expressionssystemen zum Einsatz . Etablierte Modelle sind beispielsweise rekombinante Mikrosomen mit humanen CYPs ( inkl . Ko-Faktoren) aus Baculovirus infi zierten Insektenzellen ( sog . „Supersomes" bzw . „BACULOSOMES" - BD Biosciences , Corning, ThermoFisher, Merck) , aus E . coli basierten Expressionssystemen ( sog . Cypex Bactosomes als "Classic Bactosomes" und "EasyCYPs" - Sekisui XenoTech) sowie getrocknete Präparationen des Hefepil zes Pichia pastoris ( sog . "CypExpress" von Oxford Biomedical Research bzw . "EZCyp" von BioVision) . Ergänzend werden ebenfalls Präparationen der rekombinanten Expression mikrobieller CYPs aus Aktinomyceten in E . coli kommerziell vermarktet ( sog . PolyCYPs - Hypha Discovery) . Insbesondere das auf Baculovirusinf ektion basierende Insektenmodell zeichnet sich durch eine vom j eweiligen exprimierten CYP abhängige hohe Enzymaktivität aus und kann als derzeit geltender Goldstandard angesehen werden . Allen beschriebenen Expressionssystemen ist gemein, dass diese für die Expression humaner Enzyme verwendeten Zellmodelle nicht Säuger-basiert sind und somit relevante Unterschiede der rekombinant exprimierten CYPs zu humanen Enzymen und deren Funktion nicht ausgeschlossen werden können . Weitergehend ist anhand der einschlägigen Literatur nicht endgültig geklärt , ob die für die rekombinante CYP- Expression verwendeten Zellmodelle unspezi fische für die Metabolisierung eines Wirkstof fes relevante ( CYP ) - Hintergrundaktivitäten auf zellulärer und mikrosomaler Ebene aufweisen . Als Beispiel kann hier das Insektenzellmodell genannt werden, bei dem die wissenschaftliche Meinung geteilt ist . Brandon et al . weisen in einem 2003 veröf fentlichten Review darauf hin, dass Insektenzellen keine endogene CYP- Aktivität aufweisen . Demgegenüber beschreiben Nauen et al . in einem 2021 veröf fentlichten Ubersichtsartikel eine vorhandene endogene CYP-Hintergrundaktivität im Baculovirus Insektenzellexpressionssystem . Insbesondere S f 9 Zellen weisen für einige Substanzklassen eine basale Detoxi f i zierungsaktivität auf . Diese soll bei der High Five Insektenzelllinie (Eierstockzellen der Kohlschrecke ;
Zelllinie : BTI-TN-5B1-4 ) deutlich geringer sein . Es zeigt sich entweder eine unspezi fische CYP-Hintergrundaktivität der Control Supersomes ( EDA Studie NL0060848 aus dem Jahr 2005 zur Metabolisierung von Asenapin) oder deutliche Unterschiede in der Umsetzungskinetik von Wirkstof fen beim Vergleich Insektenzell-basierter CYP3A4 -Mikrosomen ( CYP3A4-Supersomes ) mit aus humanen Leberepithel zellen (mit rekombinanter CYP3A4 Expression) hergestellten Mikrosomen ( Christensen et al .
2009 ) . Weitergehend bieten die etablierten Insektenzellmodelle auf Zellebene aufgrund des lytisches Kultursystems nach Baculovirusinf ektion nur eingeschränkte Möglichkeiten für Langzeitkulturen .
Rekombinante Expressionssysteme humaner CYPs mit Säugerzellmodellen sind beschrieben, zu nennen sind beispielsweise Studien mit heterologer Expression humaner CYPs (inkl. Ko-Faktoren) in humanen HEK293FT Nierenepithelzellen (Kumondai et al. 2020) sowie in Lungen- (V79 Zellen: Jacob et al. 1996; Krebsfänger et al. 2003; Scheuenpflug et al. 2005) und Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-DUKX-Bll Zelllinie: Ding et al. 1997 & 2001, Deeni et al. 2013 sowie ein Messeposter CXR Biosciences, Deeni 2009) . In keinem der beschriebenen Säugermodelle wurden die humanen CYP-Gene sowie Ko-Faktoren gezielt stabil in das Genom integriert, so dass diese z.B. nach Transfektion bzw. Infektion mittels modifizierter Adenoviren als episomales rekombinantes virales Genom im Zellkern vorliegen. Weitergehend handelt es sich bei den mit humanen CYPs modifizierten Säugerzelllinien um adhärente und serumabhängige Zellkulturmodelle. Beide Faktoren wirken sich limitierend auf die Möglichkeiten eines Upscaling sowie einer pharmazeutischen/ therapeutischen Nutzung von Metaboliten aus.
Es besteht daher ein großes Bedürfnis an einem Testsystem ohne oder mit einem sehr geringen endogenen CYP-Hintergrund zur Testung von Stoffen, insbesondere Xenobiotika, Wirkstoff (kandidat) en und Arzneimitteln als Testsubstanz , insbesondere die Interaktion einer Testsubstanz mit mindestens einem CYP .
Daher bestehen folgende Aufgaben zu der Erfindung, insbesondere in der Bereitstellung eines geeigneten Testsystems, welches a.) Cytochrom-P450 (CYP) und NADPH- Cytochrom-P450-Oxidoreduktase ( CPR, POR) in ausreichender Menge und Qualität in Überexpression bereitstellt , und b . ) eine möglichst geringe bis keine endogene CYP- Hintergrundaktivität eines Expressionssystems aufweist .
Die Aufgaben werden im Wesentlichen durch mindestens einen Patentanspruch gelöst .
Daher betri f ft die Erfindung eine Säugetierzelle oder eine daraus erhältliche Zelllinie enthaltend nach Trans fektion oder Transduktion stabil in das Genom integrierter Polynukleotide kodierend für mindestens ein Cytochrom-P450 und NADPH- Cytochrom-P450-Oxidoreduktase , wobei vorzugsweise die Polynukleotide mit mindestens einem Expressionsvektor in die Säugetierzelle eingebracht wird .
In einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung weist das Testsystem Säugetierzell ( lini ) en mit mindestens einem Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase auf , welche als Suspensionskultur in hoher Zelldichte von durchschnittlich 5xl 06 Zellen/mL bei >80% Vitalität bereitgestellt werden . Die Methoden zur Messung von Zell zahlen und Vitalität sind dem Fachmann bekannt . Aus den erfindungsgemäßen Säugetierzellen werden mikrosomale Fraktionen mit dem Fachmann bekannten Methoden gewonnen, die bezogen auf Ixl O7 Ausgangs zeilen vorteilhaft eine Proteinausbeute von mindestens 100 pg ( Proteinmenge bzw .
Enzymmenge ) und mehr aufweisen, insbesondere mindestens 200 pg ( Proteinmenge bzw . Enzymmenge ) oder mindestens 300 pg ( Proteinmenge bzw . Enzymmenge ) . Aufgrund der hohen Proteinausbeute ist eine sehr gut messbare Umsetzung von CYP- Enzymaktivität bzw . den gebildeten Metaboliten möglich . Beispielhaft zeigt eine Umsetzung mit dem Stof f Phenacetin in einer Säugetierzelle mit CYP1A2 sowie CPR eine Phenacetin-
Metabolitproduktion von 17 pg nach 2h und 101 pg nach 48 h.
Die Sensitivitätsgrenze des erfindungsgemäßen Testsystems für CYP-spezif ische Enzymaktivität bei Umsetzung mit Mikrosomen aus erfindungsgemäßen Säugetierzellen mit mindestens einem Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase liegt bei maximal 1-10 pg mikrosomalem Protein in einer 50 pL Reaktion und 10 min Umsetzungszeit mit einem P450 Glo-Assay. Bei diesem dem Fachmann bekannten Assay (z.B. P450 Gio Assays der Firma Promega) wird ein für das jeweilige CYP spezifisches Substrat angeboten und die CYP-Enzymaktivität ist mit Hilfe einer Lumineszenzreaktion detektierbar . Der Nachweis eines über CYP gebildeten Metaboliten (z.B. Metabolit eines Arzneistoffs) kann beispielsweise über die dem Fachmann bekannte Methode der HPLC-Analytik erfolgen. Die Sensitivitätsgrenze für die Bildung eines derartigen Metaboliten in dem erfindungsgemäßen Testsystem liegt bei vorzugsweise 30-300 pg mikrosomalem Gesamtprotein in einer 200 pL Testreaktion und 30 min Umsetzungszeit.
Bevorzugt ist weiterhin, dass die Säugetierzelle keine Leberzelle bzw. nicht-hepatische Zelle ist und ausgewählt ist aus der Gruppe HEK293-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, BHK- Zellen, L929-Zellen oder jeweilige Zelllinien sowie Säugetier- Zelllinien der ZKBS-Liste, die nicht von Hepatozyten abstammen (Zelllinienliste der Zentralen Kommission für Biologische Sicherheit : https :// zag . bvl . bund .de/zelllinien/ index .jsf;jsessionid=af9u6C dFQWhIMTatr j eI47SX_vzdBRAe8bzcchSe . subs 208 ?dswid=l 187 &dsrid=42
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt sind CHO ( Ovarienzellen des chinesischen Hamsters ) -Zellen und daraus erhältliche Zelllinien, da diese vorteilhaft keine bzw . geringe endogene CYP-Hintergrundaktivität aufweisen, und folglich das mindestens eine durch stabile Trans fektion oder Transduktion eingebrachte Cytochrom-P450 ( CYP ) ohne eine relevante Hintergrundaktivität endogener CYPs vorliegt . Die Enzymaktivität wird durch das weiter eingebrachte CPR vorteilhaft verstärkt .
Eine geringe oder nicht vorhandene Hintergrundaktivität endogener CYPs liegt vor, falls mit der Methode des HPLC- Nachweises für gebildete Metabolite diese unter der Detektionsgrenze ist und / oder maximal 1 - 5 % , vorzugsweise 1 % der spezi fischen Aktivität in pmol/mg/min für mindestens ein eingebrachtes Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom-P450- Oxidoreduktase beträgt .
Die Hintergrundaktivität endogener CYPs in den parentalen Säugetierzellen kann vor erfindungsgemäßer stabiler Einbringung des CYP / CPR - Komplexes in der Säugetierzelle bestimmt werden . Die parentalen Säugetierzellen können als Negativkontrolle dienen .
Weiterhin ist bevorzugt , dass Säugetierzelle oder die entsprechende Zelllinie als Suspensions zellen oder als Mikrosom erhalten werden .
Der Begri f f Mikrosom umfasst ebenfalls Mikrosomfraktionen und kann durch Aufarbeitung der aus bereitgestellten Säugetierzelle oder der entsprechenden Zelllinie erhalten werden . Mikrosom und Mikrosomfraktion sind daher synonym zu lesen .
Im Rahmen dieser Erfindung können die Polynukleotide zu Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase den üblichen Datenbanken entnommen werden. Beispielsweise können Gensequenzen aus Datenbanken des National Center for Biotechnology (NCBI) und der National Library of Medicine (NLM) entnommen werden. Besonders bevorzugt sind humane Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase Polynukleotidsequenzen. In den erwähnten Datenbanken gibt es beispielsweise cDNA-Sequenzen für CPR (NM_000941.2 ) , CYP1A2 (BC067428.1) , CYP2B6 (BC067430.1) oder CYP3A4 (NM_017460.6 ) , aber auch für die anderen für Biotransformation relevanten CYPs, welche in einen Expressionsvektor eingebracht werden können .
Tabelle 1: mRNA IDs und Primer Sequenzen humaner Zielgene (target genes)
Gen mRNA ID Primer Sequenzen
Target genes fw AAGGCGGTGCCCACATCTAC
CPR NM_000941.2 rev TAGCGGCCCTTGGTCATCAG fw CTGGAGACCTTCCGACACTC
CYP1A2 BC067428.1 rev AGGGCTTGTTAATGGCAGTG fw CTCTCCATGACCCACACTAC
CYP2B6 BC067430.1 rev TGTTGGGGGTATTTTGCCCA fw GTGGGGCTTTTATGATGGTCA
CYP3A4 NM 017460.6 rev GCCTCAGATTTCTCACCAACACA
Im Rahmen dieser Erfindung können Cytochrom-P450 bzw. CYPs verwendet werden, die in primären humanen Leberzellen sowie anderen Zellen exprimiert, für die Biotransformation von Medikamenten und Xenobiotika relevant sind oder in Zukunft relevant werden, und ausgewählt sind aus der Gruppe CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C 8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, C YP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43 , CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, C YP4F12, CYP4F22, CYP4V2, CYP4X1, CYP4Z2, CYP5A1, CYP7A1, CYP7B 1, CYP8A1, CYP8B1, CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1 , CYP20A1, CYP21A1, CYP21A2, CYP24A1, CYP26A1, CYP26B1, CYP26C 1, CYP27A1, CYP27B1, CYP27C1, CYP39A1, CYP46A1, CYP51A1.
Die vorgenannten gewonnenen erfindungsgemäßen Säugetierzellen, Zelllinien, Suspensionszellen oder Mikrosomen können mit mindestens einer Testsubstanz versetzt, und die Metabolite identifiziert und charakterisiert werden.
Daher dient das Testsystem zum Nachweis von Metaboliten, insbesondere aufgrund der spezifischen CYP-Testsubstanz- Interaktion, wobei eine enzymatische Umsetzung der Testsubstanz mit ein oder mehreren CYP450 Enzymen erfolgt, die über Transfektion oder Transduktion stabil eingebracht wurden, und spezifische Metabolite erhalten werden können. Besonders bevorzugt ist der Einsatz eines Testsystems mit Mikrosomen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Testsystems besteht darin, dass aufgrund geringer oder gänzlich fehlender Hintergrundenzymaktivität endogener CYP450 Enzyme das Testsystem geeignet ist, die Zuständigkeit oder Funktion des oder der CYP450 Enzyme, die über Transfektion oder Transduktion stabil eingebracht wurden, für die metabolische Umsetzung von chemischen Stoffen, Xenobiotika oder Medikamenten zu identifizieren oder zu charakterisieren.
Daher betrifft die Erfindung ein Testsystem zum Nachweis einer Interaktion von mindestens einer Testsubstanz an mindestens einem CYP450 Enzym.
Daher betrifft die Erfindung ein Testsystem zum Nachweis des oder der für die Biotrans formation von mindestens einer Testsubstanz mindestens einem zuständigen CYP450 Enzyms , wobei eine enzymatische Umsetzung mindestens einer Testsubstanz mit ein oder mehreren CYP450 Enzymen erfolgt .
Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil des Testsystems besteht darin, dass auch die Hemmung oder Aktivierung des oder der CYP450 Enzyme , die über Trans fektion oder Transduktion stabil eingebracht wurden, durch mindestens eine Testsubstanz ohne Hintergrund endogener CYP450 Enzyme untersucht werden können . Somit können vorteilhaft Interaktionen von Medikamenten bezüglich metabolischer Umsetzung durch ein bestimmtes CYP450 Enzym und Aktivierung bzw . Hemmung eines anderen CYP450 Enzyms untersucht werden .
Das Testsystem ist besonders geeignet zur in-vitro Durchführung von ADME-Tests ( supra ) . ADME beschreibt die Prozesse , welche der Körper nach der Verabreichung eines Medikaments auf die darin enthaltenen Wirkstof fe ausübt , insbesondere hinsichtlich der Toxikologie .
Daher betri f ft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Aus führung der vorgenannten erfindungsgemäßen Testsysteme oder die Verwendung eines solchen erfindungsgemäßen Testsystems zur Durchführung eines Verfahrens , insbesondere wobei eine enzymatische Umsetzung mindestens einer Testsubstanz mit ein oder mehreren CYP450 Enzymen erfolgt , die über Trans fektion oder Transduktion stabil eingebracht wurden .
Daher betri f ft die Erfindung ebenfalls ein Screeningverfahren zum Nachweis einer Testsubstanz , wobei eine enzymatische Umsetzung mindestens einer Testsubstanz mit ein oder mehreren CYP450 Enzymen erfolgt , die über Trans fektion oder Transduktion stabil eingebracht wurden . Besonders vorteilhaft kann das erfindungsgemäße Testsystem für Langzeitstudien verwendet werden, da eine nahezu vollständige Simulation der menschlichen Leber bezüglich Biotransformation gelingt. Anhand der identifizierten Metabolite können bspw. Nebenwirkungen eines Medikaments eruiert werden, indem etwa der gebildete Metabolit in geeigneter Menge erzeugt und auf Zielzellen oder Organe toxikologisch getestet wird.
Die Testsubstanz enthält mindestens eine chemische Substanz, ein Substanzgemisch, insbesondere mindestens einen Arzneioder Wirkstoff oder ein Xenobiotikum. Die chemischen Substanzen sind vorzugsweise ein organisches Molekül, welches neben Kohlenstoff (C) und Wasserstoff (H) Heteroatome enthalten können, wie Sauerstoff (0) , Stickstoff (N) , Schwefel (S) oder Phosphor (P) . Die chemischen Substanzen können lineare und/oder ringförmige Kohlenstoff ketten samt Heteroatomen aufweisen. Bevorzugt sind organische Moleküle mit weniger als 1.500 g/mol, insbesondere weniger als 750 g/mol, weniger als 500 g/mol, weniger als 250 g/mol. Weiterhin ist bevorzugt, dass mindestens eine chemische Substanz mindestens ein chirales Kohlenstoff atom enthält.
Die aus den Testsubstanzen erhaltenen Stoffe bzw. in Gegenwart ein oder mehrerer Enzyme erhaltenen Metabolite können z.B. mittels kombinierten analytischen Verfahren, wie GC/LC-MS, IR, NMR hinreichend analysiert werden und insbesondere einer Strukturaufklärung routinemäßig unterzogen werden.
Ein „Enzym" im Sinne dieser Erfindung ist ein Protein, nämlich mindestens ein ausgewähltes Cytochrom-P450 (CYP) oder ein Komplex aus Cytochrom-P450 (CYP) und NADPH-Cytochrom-P450- Oxidoreduktase (CPR, POR) , welches eine oder mehrere biochemische Reaktionen katalysieren kann. Ein erfindungsgemäßes Enzym ist in der Lage aus einer Testsubstanz (Substrat) ein erstes (Enzym- ) Produkt oder Produkte, und zwar Metabolite zu erhalten. Insbesondere kann ein Metabolitenprof il erstellt werden.
Die „spezifische Aktivität" eines Enzyms ist im Sinne dieser Erfindung die Menge eines durch ein Enzym gebildeten Substratmetaboliten (in pmol) pro eingesetztes Protein (mg) in einer bestimmten Zeit (Minute) . Im Fall von Zellen oder Mikrosomen, wenn kein spezifisches gereinigtes Protein vorliegt, wird als Bezugsgröße das Gesamtprotein angesetzt.
Ebenfalls sind erfindungsgemäß solche transgene Säugetierzellen umfasst, welche mittels viraler Vektoren (z.B. Lentiviren, z.B. DE 69830663 T2) hergestellt werden. Die Herstellung solcher Säugetierzellen ist dem Fachmann bekannt.
Bevorzugte geeignete Promotoren für Expressionsvektoren sind, nicht abschließend, EF-1, SV-40, CMV, RSV, GAG, u.v.a. auch konditionierbare, d.h. induzierbare Promotoren wie TET on, - off, Cumat-induzierbarer Promotor, Dexamethason-induzierbarer Promotor, Ecdyson-induzierbarer Promotor, T7-RNA-Polymerase induzierbarer Promotor, lichtabhängige Promotoren oder stressinduzierbare Promotoren (z.B. Temperatur) als auch mit Hilfe der Verwendung von Hilfssequenzen wie IRES (internal ribosome entry site) , Sequenzen für Antikörpernachweis und Proteinreinigung wie V5-Tag, Flag-Tag, c-myc Tag, His-Tag, GST-Tag, Strep-Tag, GFP, LacZ, Luciferase u.a., Sequenzen für Proteinabspaltung derartiger Tags wie Picornavirus 2A Protease, Sequenzen für Thrombin-vermittelte Spaltung u.a.. Solche Promotoren und Hilfssequenzen sind dem Fachmann einschlägig bekannt.
Beispielhafte Expressionsvektoren sind in Figur 8 gezeigt. Das Testsystem kann ein übliches Medium, Kulturmedium, Kulturf lüssigkeit aufweisen, insbesondere weitere Ko-Faktoren enthalten . Geeignete Zellkulturen und Kulturmedien sind dem Fachmann einschlägig bekannt und käuflich erwerblich . Vorzugsweise kann erfindungsgemäß eine Zellsuspension bereitgestellt werden .
Das Testsystem kann in-vitro auf einem festen Träger fixiert werden . Synonym kann von einem Assay gesprochen werden .
Nachfolgende Beispiele und Figuren dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne j edoch die Erfindung auf diese Beispiele und Figuren zu begrenzen .
Beispiele und Figuren :
Beispiel 1 :
Generierung von Mono-CYP CHO Zelllinien
Die Generierung von Mono-CYP CHO Zelllinien wurde in einem 2- stufigen Modi fi zierungsprozess durchgeführt . Initial wurde die CHO-Kl Parental zelllinie ( serumfreie Suspensionskultur ) mittels lentiviralem Gentrans fer mit der humanen cDNA für die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase ( CPR, POR) unter Kontrolle eines CMV-Promotors stabil genetisch modi fi ziert . CPR stellt einen essentiellen Ko-Faktor für die CYP-Enzymaktivität dar, da es exklusiv den sequenziellen Elektronentransport von NADPH auf CYP-Enzyme ermöglicht . Die erhöhte Expression und Aktivität von humanem CPR in ausgewählten CHO-CPR Klonen wurde charakterisiert und der am besten geeignete Klon 12 für die weitere genetische Modi fi zierung mit humanen CYP-Enzymen ausgewählt ( Figur 1 ) . Im zweiten Schritt des Modi fi zierungsprozesses wurde der am besten geeignete CHO-CPR Klon 12 erneut durch lentiviralen Gentrans fer j eweils mit der humanen CYP-cDNA von CYP1A2 , CYP2B6 , CYP3A4 , CYP2D6 oder CYP2C19 ausgestattet . Diese cDNAs sind analog CPR durch einen CMV-Promotor reguliert . Um vergleichende Versuche zur CPR-Abhängigkeit verschiedener CYPs zu ermöglichen, wurde auch die CHO-Kl Parental zelllinie ohne erhöhte CPR-Aktivität mit den j eweiligen CYP-cDNAs ausgestattet . Die anschließende Charakterisierung und Auswahl der am besten performenden Zellklone zeigte die erwartete spezi fische CYP-Expression im Vergleich zu den Parental zelllinien CHO-Kl und CHO-CPR ( Figur 2 ) . Lediglich bei CYP2B6 und CYP2D6 wurde eine schwache Proteinbande ebenfalls in den Parental zelllinien detektiert .
Beispiel 2 :
Spezi fische CYP-Aktivität von Mono-CYP CHO Zellklonen im zellulären Suspensionskulturmode 11
Kommerzielle CYP-Aktivitätsassays ( Glo-Assays - Promega )
Initiale Enzymaktivitätsstudien mit den ausgewählten Mono-CYP CHO Zelllinien (mit und ohne arti fi zielles humanes CPR) unter Verwendung kommerzieller Kits wiesen bei allen CHO-CYP Klonen auf eine spezi fische Mono-CYP Aktivität hin . Bei keinem der untersuchten CYPs wurde eine Hintergrundaktivität bei den Parental zelllinien CHO-Kl und CHO-CPR Klon 12 detektiert ( Figur 3 ) .
Beispiel 3 :
Umsetzungsstudien mit prototypischen Substanzen Metabolisierungsstudien zum Nachweis einer CYP spezifischen Umsetzung prototypischer Substanzen wurden bisher mit den Mono-CYP CHO Zellklonen CHO-CPR/CYP1A2 K9 (Phenacetin) und CHO- CPR/CYP3A4 Kl (Testosteron) vergleichend mit den Parentalzelllinien im Labormaßstab (Suspensionskulturen bis 10 mL) über einen Zeitraum von maximal 48 h durchgeführt . Die Zellen wurden entsprechend des aktuellen optimierten Kulturmodells vorbehandelt und die Metabolisierung in Zellkulturmedium durchgeführt . Die Ergebnisse der entsprechenden Überstandsanalytik mittels HPLC sind in Figur 4 dargestellt . Anhand der Normierung zu vermessenen Standards des j eweiligen Hauptmetaboliten konnten nach 48 h Umsetzungszeit erreichte Ausbeuten in den Suspensionskulturen im pg-Maßstab extrapoliert werden (CYP1A2 : mAcetamnophen = 101 ± 4 pg; CYP3A4 : m6ß-oH- = 17.3 ± 1.4 pg) . Im gleichen Zuge konnte erste detailliertere Erkenntnisse zur Enzymkinetik gewonnen werden, welche in weitere Optimierungen des Zellkulturmodells und des Umsetzungsprotokolls einfließen werden .
Beispiel 4 a :
Spezi fische Mono-CYP Enzymaktivität in Mono-CYP CHO Mikrosomen Kommerzielle Glo-Assays ( Promega )
Enzymaktivitätsstudien wurden im Rahmen der Optimierung einer Zellvorbehandlung mit Ko-Faktoren sowie des Mikrosomenisolierungsprotokolls durchgeführt ( Figur 5 ) .
Beispiel 4 b :
Umsetzungsstudien mit prototypischen Substanzen
Die für Umsetzungsstudien in 4a verwendeten Mikrosomen der
Mono-CYP CHO Klone ( CHO-CPR/CYP1A2 K9 , CHO-CPR/CYP3A4 Kl und
CHO-CPR/CYP2D6 Cl , C9 & C18 ) wurden ebenfalls für die Metabolisierung der prototypischen Substanzen Phenacetin ( CYP1A2 ) , Testosteron ( CYP3A4 ) und Luci ferin-ME EGE ( CYP2D6 ) eingesetzt , um Erkenntnisse zur Enzymaktivität und Ausbeuten gebildeter Hauptmetaboliten zu gewinnen ( Figur 6 ) . Die anhand von Standards der Hauptmetaboliten von Phenacetin und Testosteron ermittelten Ausbeuten in den 200 pL Metabolisierungsansät zen lagen im Bereich von 100 - 200 ng und waren teils in einer zu HLM vergleichbaren Größenordnung .
Der direkte Vergleich von Mono-CYP CHO Mikrosomen für CYP1A2 , CYP3A4 und CYP2D6 mit Mikrosomen aus den Parental zelllinien CHO-Kl und/oder CHO-CPR K12 zeigte anhand von Umsetzungsstudien mit prototypischen Substraten keine detektierbare CYP-basierte Hintergrundumsetzung in den Parentalmikrosomen ( Figur 7 ) . Die Ausbeuten an Hauptmetaboliten von Phenacetin (Acetaminophen) und Testosteron ( 6ß- Hydroxytestosteron) lagen bei den Mono-CYP Mikrosomen in den 200 pL Ansätzen wie zuvor im Bereich von bis zu 100 ng .
Beispiel 5 :
Ausführungsbeispiel zum Nachweis der Beteiligung eines spezifischen CYP450-Enzyms an der Metabolisierung einer Testsubstanz bzw . eines Wirkstoffes (CYP Screening am Beispiel einer Bupropionmetabolisierung)
Um zu eruieren ob eine Testsubstanz z . B . Bupropion (BUP) über ein spezifisches CYP450 Enzym metabolisiert wird, werden Umsetzungsstudien mit isolierten Mikrosomen von CHO Klonen mit rekombinanter CPR und unterschiedlicher rekombinanter CYP Aktivität ( z . B . CYP3A4 , CYP1A2 , CYP2B6 ) durchgeführt . Bupropion ist ein Norepinephrin- und Dopamin-Wiederaufnahmehemmer, der zur Behandlung von Depressionen, saisonal abhängigen Störungen und zur Raucherentwöhnung eingesetzt wird. Die Verwendung von Mikrosomen in diesem Testsystem bringt den Vorteil mit sich, dass Primär- als auch Sekundärmetabolisierungen abseits der CYP- abhängigen Phase-1 Biotransformation vermieden werden, da entsprechende Phase-2 Biotransformationsenzyme in dieser vornehmlich ER-basierten Zellfraktion abwesend sind . Nach der Umsetzungsreaktion wird der wässrige Überstand einer j eden CYP450 Probe mittels entsprechender Analytik (HPLC, LC-MS etc . ) untersucht . Hierbei werden die sich bei Metabolisierung durch ein bestimmtes CYP-Enzym verringernde Menge der Testsubstanz und die Bildung von Metaboliten detektiert sowie deren Identität ggf . mittels massenspetrometrischer Verfahren aufgeklärt .
Entsprechend des standardisierten Protokolls werden j eweils 30 pg Mikrosomen mit spezifischer CYP450 Aktivität (Gesamtproteinmenge ) zusammen mit einem NADPH Regenerationssystem (bestehend aus NADP+ , Glucose-6-Phosphat und dem Enzym Glucose- 6- Phosphatdehydrogenase ) und der Testsubstanz ( finale Konzentration von 0 , 5 mM) in einem 200 pL Ansatz für 60 min bei 37 °C inkubiert . Nach der Umsetzungsreaktion werden die Proben im Verhältnis 1 : 1 mit eiskaltem Acetonitril gemischt, geschüttelt und die enthaltenen Proteine mittels Zentrifugation ( 15 min, 16. 000 x g) aus der Lösung gefällt . Durch diesen Arbeitsschritt wird eine weitergehende Metabolisierung gestoppt sowie für die HPLC- Analytik interferierende proteinogene Bestandteile aus der Probe entfernt .
Die Quantifizierung der in einer Probe verbliebenen Testsubstanz sowie die Erstellung von Metabolitenprof ilen erfolgt durch anschließende HPLC-Analyse zunächst mit DAD Detektion . Der HPLC- Aufbau besteht aus einer modularen (U) HPLC Anlage der Nexera Serie (LC-40 , SHIMADZU, Kyoto, Japan) mit einer ZORBAX SB-C18- Säule (Agilent Technologies , Santa Clara, CA, US ) , welche auf 25 °C äquilibriert wird. Für den Nachweis der verbliebenen Testsubstanz BUP sowie möglicher Metaboliten werden 20 pL Probe in der mobilen Phase, bestehend aus 45% Methanol und 55% KH2PO4- Puffer ( 50 mM, pH 5, 5 ) , bei einer Flussrate von 0, 8 mL/min für 25 Minuten isokratisch getrennt . Bupropion (BUP) und der prominenteste CYP450 gebildete Hauptmetabolit Hydroxybupropion (HBUP) werden anhand ihrer Elutionszeit bei 254 bzw . 214 nm detektiert . Die Quantifizierung der nachgewiesenen Substanzen erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel unter Verwendung von Standardlösungen handelsüblicher Referenzen im Bereich von 0 , 1 - 1 mM für BUP und 1 - 75 pM für HBUP . Für die Herstellung der Stammlösungen werden BUP und HBUP in Methanol gelöst . Im Falle des Auftretens unbekannter Signale ( Peaks ) im Chromatogramm j eweiliger CYP450-Mikrosomen, was auf die Bildung weiterer Metaboliten hindeuten würde, werden die Proben erneut mittels LC- MS vermessen und die chemische Identität unbekannter Signale anhand ihres Fragmentierungsmusters in Korrelation mit theoretischen Voraussagen der Fragmentierung chemisch möglicher Metaboliten aufgeklärt .
Im Fall der Testsubstanz Bupropion ist eine Verringerung der ursprünglichen Substanzmenge in der Probe und die Bildung von HBUP ausschließlich bei Mikrosomen mit spezifischer CYP2B6 Aktivität detektierbar . Mikrosomen mit spezifischer CYP1A2 bzw. CYP3A4 Aktivität weisen weder eine Verringerung der ursprünglichen Bupropionmenge noch die Bildung von Metaboliten dieser Testsubstanz auf .
Beispiel 6 :
Ausführungsbeispiel zum Nachweis von Wirkstoff Interaktionen mit dem CYP450 Enzymsystem. Das angeführte Beispiel beschreibt den Nachweis einer Medikamenteninteraktion durch Inhibierung der CYP3A4 Enzymaktivität mittels Ketoconazol . Ketoconazol ist ein Arzneistoff, welcher u . a . zur Behandlung oder Vorbeugung von Pilzinfektionen wie Blastomykose, Candidose, Kokzidioidomykose, Histoplasmose, Chromomykose und Parakokzidioidomykose eingesetzt wird . Eine der Wechselwirkungen dieses Medikamentes ist, dass es einen starken Inhibitor der CYP3A4 Enzymaktivität darstellt . Im menschlichen Organismus kann dies zur Folge haben, dass die Biotransformation von vornehmlich CYP3A4 metabolisierten Medikamenten gehemmt wird, was zu einer verstärkten und/oder verlängerten Wirkung dieser Arzneimittel führt . Im Gegenzug können Prodrugs, die durch CYP3A4 aktiviert werden ( z . B . Tamoxifen) , durch den Einsatz von Ketoconazol eine verminderte und/oder verlangsamte Wirkung aufweisen . Am Beispiel von Ketoconazol zeigt sich der große Nutzen von in-vitro Testsystemen, wie dem erfindungsgemäßen System, um solche Wirkstoff Interaktionen frühzeitig aufzuklären .
Um den Einfluss von Ketoconazol auf die CYP3A4 Aktivität zu untersuchen, werden Umsetzungsstudien mit isolierten Mikrosomen von CHO Klonen mit rekombinanter CPR und spezifischer rekombinanter CYP3A4 Aktivität ( z . B . CHO-CPR/CYP3A4 CI ) in An- und Abwesenheit von Ketoconazol durchgeführt . Unterschiede in der CYP3A4 Aktivität werden entweder über kommerziell erhältliche Enzymaktivitätsassays ( z . B . CYP3A4-G1O Assay von Promega) oder Analyse der wässrigen Überstände unter Verwendung entsprechender Analytik (HPLC, LC-MS etc . ) untersucht . Im folgenden Beispiel wird letzteres beschrieben .
Analog Beispiel 5 werden j eweils 30 pg Mikrosomen (Gesamtproteinmenge ) aus dem Zellklon CHO-CPR/CYP3A4 CI mit spezifischer CYP3A4 Aktivität zusammen mit einem NADPH Regenerationssystem (bestehend aus NADP+ , Glucose- 6-Phosphat und dem Enzym Glucose- 6-Phosphatdehydrogenase) , dem prototypischen CYP3A4 Substrat Testosteron ( finale Konzentration von 0 , 5 mM) und verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanz Ketoconazol (Bereich zwischen 5 und 100 pM) in einem 200 pL Ansatz für 60 min bei 37 °C inkubiert . Nach der Umsetzungsreaktion werden die Proben im Verhältnis 1 : 1 mit eiskaltem Acetonitril gemischt, geschüttelt und die enthaltenen Proteine mittels Zentrifugation ( 15 min, 16. 000 x g) aus der Lösung gefällt .
Die Quantifizierung der in einer Probe verbliebenen Menge Testosteron sowie die Detektion des von CYP3A4 gebildeten Hauptmetaboliten 6ß-Hydroxytestosteron ( 6ß-OH-T ) erfolgt durch anschließende HPLC-Analyse mit DAD Detektion . Der HPLC-Aufbau besteht aus einer modularen (U) HPLC Anlage der Nexera Serie (LC- 40 , SHIMADZU, Kyoto, Japan) mit einer ZORBAX SB-C18-Säule (Agilent Technologies , Santa Clara, CA, US ) , welche auf 25 °C äquilibriert wird . Für den quantitativen Nachweis verbliebenen Substrates sowie gebildetem 6ß-OH-T werden 20 pL Probe in einem Gradienten aus KH2PO4-Puf f er ( 10 mM, pH 3, mobile Phase A) und Acetonitril (mobile Phase B) bei einer Flussrate von 1 mL/min getrennt . Die Metaboliten werden anhand der Elutionszeit mit DAD ( SPD-M10AvP) bei 245 nm nachgewiesen . Der Gradient ist wie folgt : 0-3 min 30% B, 20 , 5 min 55% B, 22 , 5 min 55% B, 23 min 95% B, 26 min 95% B, 26, 5 min 20% B, 29 min 20% B, 30 min 30% B . Die Quantifizierung von Analyten erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel unter Verwendung von Standardlösungen handelsüblicher Referenzen im Bereich von 0 , 1 - 1 mM für Testosteron und 1 - 75 pM für 6ß-OH-T . Aus den Chromatogrammen der gemessenen Proben werden die Signale ( Peaks ) für Testosteron und 6ß-OH-T anhand der Standardgeraden quantitativ ausgewertet und die abnehmende CYP3A4 Aktivität bei steigender Konzentration von Ketoconazol nachgewiesen . Es zeigt sich, dass bei steigenden Ketoconazolkonzentrationen die Menge des über CYP3A4 gebildeten 6ß-OH-T abnimmt . Damit ist exemplarisch gezeigt, dass es eine Medikamenteninteraktion von Ketoconazol und Testosteron gibt, indem die CYP3A4 Metabolisierung von Testosteron durch Ketoconazol gehemmt wird.
Figur 1 : Rekombinante CPR-Expression und Aktivität in ausgewählten CHO-CPR Zellklonen . Die CPR- Expression wurde auf mRNA-Ebene durch RT-qPCR (A) und auf Proteinebene durch Western Blotting (B ) analysiert . Die erhöhte CPR-Expression wurde außerdem durch indirekte Immunfluores zenz ( CPR in Rot , Zellkerne in blau) bestätigt ( D) . Die CPR-Aktivität wurde aus isolierten mikrosomalen Fraktionen von rekombinanten CPR- exprimierenden CHO-Klonen im Vergleich zu HepG2 , HHM und parentalen CHO bestimmt ( C ) (HHM = humane hepatozytäre Mikrosomen; mRNA-Expression mit n = 6 und CPR- Aktivitätsdaten mit n = 11 dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; p < 0 , 05 mit * im Vergleich zu CHO; * im Vergleich zu HHM; * im Vergleich zu HepG2 ; * im Vergleich zwischen CPR-Klonen) .
Figur 2 : Rekombinante CYP und CPR/CYP Gen- und Proteinexpression in modi fi zierten CHO-Klonen . Dargestellt sind ausgewählte CHO-Klone mit CYP1A2 , CYP2B6 , CYP3A4 und CYP2D6 Modi fi zierung, die das j eweilige CYP am stärksten auf mRNA- (A) und Proteinebene (B ) exprimieren . In allen Klonen wurde eine deutliche und spezi fische Überexpression des j eweiligen trans f i zierten CYP- Enzyms nachgewiesen . Auch eine Überexpression von CPR war in allen CHO-CPR/CYP-Klonen nachweisbar (mRNA-Expressionsdaten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; n = 3 ) . Figur 3 : Mono-CYP-Aktivität in modi fi zierten CHO-Klonen mit arti fi zieller Phase- 1 -Enzymexpression .
(A) Vergleichende Analyse der spezi fischen CYP-Aktivität von erzeugten Mono-CYP CHO-Klonen für CYP1A2 , CYP2B6 und CYP3A4 mit und ohne Überexpression von CPR, verglichen mit den Parental zelllinien CHO-Kl und CHO-CPR Klon 12 ( Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; * p < 0 , 05 im Vergleich zu CHO; # im Vergleich zwischen CYP- Klonen; n = 12 für CHO-basierte Klone ; n = 6 für HepG2-CYP überexprimierende Positivkontrollen) .
(B ) Vergleichende Analyse der spezi fischen CYP-Aktivität von erzeugten Mono-CYP CHO-Klonen für CYP2D6 und CYP2C19 mit Überexpression von CPR, verglichen mit den Parental zelllinien CHO-Kl und CHO-CPR Klon 12 ( Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; n = 3 ; für HepG2-CYP Überexprimierer als Positivkontrolle ) .
Figur 4 : Metabolisierung prototypischer Substrate in Mono-CYP CHO Suspensionskulturen . Vergleichende Analyse der spezi fischen CYP-Aktivität von erzeugten Mono-CYP CHO-Klonen mit CPR- Überexpression verglichen mit den Parental zelllinien CHO-Kl und CHO-CPR Klon 12 ( Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; BG = Umsetzungsansatz ohne Zellen, CHO = Parental zelllinie CHO-Kl , CPR = Parental zelllinie CHO-CPR Klon 12 ; HPLC-Analytik mit n = 4 anhand zwei facher Quanti fi zierung zweier unabhängiger Metabolisierungsexperimente ) .
Figur 5 : Mono-CYP-Aktivität in modi fi zierten CHO-Klonen nach Vorbehandlung der Zellen mit Ko- Faktoren . Vergleichende Analyse der spezi fischen CYP-Aktivität von erzeugten Mono-CYP CHO-Klonen mit CPR-Überexpression nach Vorbehandlung der Zellen mit Hemin (Vehikel : DMSO) . Unbehandelte HHM dienten als physiologische Positivkontrolle (Umsetzungen mit 1 pg Protein für 10 min in 50 pL ; Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; n = 6 aus zwei unabhängigen Experimenten) .
Figur 6 : Mono-CYP-Aktivität in modi fi zierten CHO-Klonen nach Vorbehandlung der Zellen mit Ko-Faktoren . Vergleichende Analyse der spezi fischen CYP-Aktivität von erzeugten Mono-CYP CHO- Mikrosomen mit CPR-Überexpression nach Vorbehandlung der Zellen mit DMSO und Kombinationen von DMSO mit Hemin . Unbehandelte HLM dienten als physiologische Positivkontrolle (Umsetzungen mit 30 pg Protein für 30 min in 200 pL ; Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; n = 2 ) .
Figur 7 : (A) Mono-CYP-Aktivität in CPR sowie CYP1A2 und CYP3A4 trans f ektierten CHO-Klonen vergleichend mit Parental zelllinien . Vergleichende Analyse der spezi fischen CYP-Aktivität von erzeugten Mono-CYP CHO-Mikrosomen mit Parental zelllinien ( CHO und CHO-CPR C12 ) nach Vorbehandlung der Zellen mit DMSO . Unbehandelte HLM dienten als physiologische Positivkontrolle (Umsetzungen mit 30 pg Protein für 30 min in 200 pL ; Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung; n = 6 ) . (B ) Mono-CYP-Aktivität in CPR und CYP2D6 trans f ektierten CHO-Klonen vergleichend mit der Parental zelllinie CHO-CPR C12 zur Auswahl geeigneter Klone mit CYP2D6 Aktivität . Unbehandelte HLM dienten als physiologische Positivkontrolle (Umsetzungen mit 1 pg Protein für 10 min in
50 pL in einem G1O-CYP2D6 Assay; Daten dargestellt als
Mittelwert ± Standardabweichung; n = 12 )
Figur 8 zeigt einen beispielhaften Expressionsvektor . Zit . Literatur :
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Claims

Patentansprüche
1 . Säugetierzelle enthaltend nach Trans fektion oder Transduktion stabil in das Genom integrierte Polynukleotide kodierend für mindestens ein Cytochrom- P450 und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase .
2 . Säugetierzelle nach Anspruch 1 aufweisend keine oder eine geringe Hintergrundaktivität endogener Cytochrom-P450 für den mindestens einen Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom- P450-Oxidoreduktase .
3 . Säugetierzelle nach Anspruch 2 , wobei die geringe Hintergrundaktivität endogener Cytochrom-P450 entweder mit der Methode des HPLC-Nachweises für gebildete Metabolite unter der Detektionsgrenze liegt und / oder maximal 5% der spezi fischen Aktivität in pmol/mg/min für den mindestens einen Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom- P450-Oxidoreduktase beträgt .
4 . Zelllinie enthaltend eine Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3 .
5 . Mikrosom erhalten aus einer Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3 oder aus einer Zelllinie nach Anspruch 4 .
6 . Mikrosom nach Anspruch 5 , wobei aus 107 Säugetierzellen mindestens 100 pg Proteinmenge enthaltend sind .
7 . Suspensions zellen erhalten aus einer Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3 oder aus einer Zelllinie nach Anspruch 4 .
8. Testsystem aufweisend Cytochrom-P450 (CYP) und NADPH- Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CPR, POR) aus ein oder mehreren Säugetierzellen nach einem der Ansprüche 1 - 3 oder aus einer Zelllinie nach Anspruch 4 oder in oder aus einem Mikrosom nach einem der Ansprüche 5 - 6 und / oder in oder aus Suspensionszellen nach Anspruch 7.
9. Testsystem nach Anspruch 8 zum Nachweis von Metaboliten aus Stoffen, insbesondere Xenobiotika, Wirkstoffe, Arzneimittel .
10. Testsystem nach Anspruch 8 zum Nachweis des oder der für die Biotransformation von mindestens einer Testsubstanz mindestens einem zuständigen CYP450 Enzym, wobei eine enzymatische Umsetzung mindestens einer Testsubstanz mit ein oder mehreren CYP450 Enzymen erfolgt.
11. Testsystem nach Anspruch 8 zum Nachweis einer Interaktion von mindestens einer Testsubstanz an mindestens einem CYP450 Enzym.
12. Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3 ausgewählt aus der Gruppe nicht hepatischer Zellen, insbesondere HEK2 93-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, BHK-Zellen, L929- Zellen .
13. Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3, wobei das Cytochrom-P450 ausgewählt ist aus der Gruppe
CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3 , CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4V2, CYP4X1, CYP4 Z2, CYP5A1, CYP7A1, CYP7B1, CYP8A1, CYP8B1, CYP11A1, CYP1 1B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1, CYP20A1, CYP21A1, CYP21A2 , CYP24A1, CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1, CYP27A1, CYP27B1, C YP27C1, CYP39A1, CYP46A1, CYP51A1.
14. Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3, wobei die Cytochrom-P450 und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase überexprimiert sind.
15. Säugetierzelle nach einem der Ansprüche 1 - 3, wobei die in das Säugerzellgenom integrierten Polynukleotide kodierend für mindestens ein Cytochrom-P450 und NADPH- Cytochrom-P450-Oxidoreduktase in einem Expressionsvektor enthaltend sind und durch mindestens einen Promotor kontrolliert werden.
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