EP4615985A1 - Procede de biomethanation ex-situ - Google Patents

Procede de biomethanation ex-situ

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Publication number
EP4615985A1
EP4615985A1 EP23801437.7A EP23801437A EP4615985A1 EP 4615985 A1 EP4615985 A1 EP 4615985A1 EP 23801437 A EP23801437 A EP 23801437A EP 4615985 A1 EP4615985 A1 EP 4615985A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gas
liquid
bioreactor
methanogenic microorganism
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23801437.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre FONTANILLE
Christophe Vial
Jean-Sébastien GUEZ
Khaled FADHLAOUI
Pascal DUBESSAY
Alina-Violeta URSU
Misagh KERAMATI SHEY JANI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clermont Auvergne Inp
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Clermont Auvergne
Original Assignee
Clermont Auvergne Inp
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Clermont Auvergne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clermont Auvergne Inp, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Clermont Auvergne filed Critical Clermont Auvergne Inp
Publication of EP4615985A1 publication Critical patent/EP4615985A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/023—Methane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/04—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing gas, e.g. biogas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to an ex-situ biomethanation process as well as a device allowing its implementation.
  • the invention relates to a process for producing methane ex-situ comprising the steps of bringing into contact at least one methanogenic microorganism, a culture support and optionally a first culture medium in a gas/liquid bioreactor optionally comprising a second culture medium and the production of methane by the reaction of incoming gases with at least one methanogenic microorganism, characterized in that the culture support is immobilized or not in the gas bioreactor /liquid ; and at least one methanogenic microorganism is fixed on the culture support; as well as the device for implementing the process.
  • Methanation is a synthesis reaction of methane from dihydrogen and carbon dioxide.
  • the present invention makes it possible to obtain an ex-situ biomethanation process and a device which surprisingly resolve the drawbacks of known biological processes and are an interesting alternative to catalytic processes which are difficult to industrialize.
  • the present invention thus makes it possible to increase the robustness and longevity of the process at lower pressure and temperature compared to the catalytic route, but also to increase the methane content of the outgoing gas, and thus the conversion efficiency, the productivity and the robustness of biological processes by reducing the need for external energy input compared to known prior art technologies.
  • a first object of the present invention is a process for producing methane ex-situ comprising the following steps: a) bringing into contact with at least one methanogenic microorganism, a culture support and optionally a first culture medium; b) introduction of the mixture obtained in step a) into a gas/liquid bioreactor optionally comprising a second culture medium; c) bringing incoming gases into contact in the gas/liquid bioreactor obtained in step b); d) reaction of the incoming gases with the at least one methanogenic microorganism; e) recovery of outgoing gases obtained in step d); characterized in that
  • the culture support is immobilized or not in the gas/liquid bioreactor
  • steps a) and b) can occur sequentially or simultaneously.
  • steps c), d) and e) can occur sequentially and/or simultaneously.
  • At least one methanogenic microorganism is meant herein a consortium of microorganisms comprising at least one methanogenic strain or a pure methanogenic strain.
  • the at least one methanogenic microorganism may comprise a microorganism belonging to the phylum Euryarchaeota and may be chosen from the classes Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri or Methanomicrobia.
  • the at least one methanogenic microorganism may comprise at least one strain of Methanothermobacter.
  • the at least one methanogenic microorganism is the strain of Methanothermobacter marburgensis CLERMONT deposited according to the Budapest Treaty on October 20, 2022; with the DSMZ (Leibniz Institute Deutsche Sammlung von Mikro expn und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrafte 7B 38124 Braunschweig GERMANY) under number DSM 34405.
  • the at least one methanogenic microorganism can be included in a preculture liquid.
  • the preculture medium may be identical to or different from the first culture medium.
  • culture support is meant a support allowing its colonization by hydrogenotrophic and/or methanogenic microorganisms.
  • the support can be in the form of beads, chips, pebbles, gel, foam, pellets, rings, towers or biochips.
  • the culture support may be spherical or pseudospherical.
  • the culture support can be an organic or inorganic support, of natural or synthetic origin.
  • the organic culture support of natural origin can be chosen from: alginate, K-carrageenan, chitosan, sawdust, straw, charcoal, plant fibers, corn cob, bagasse, rice, sunflower seed pods, diatomite, mycelium and a mixture thereof.
  • the organic culture support of synthetic origin may be a polymer.
  • the polymer may be expanded or unexpanded.
  • the polymer can be chosen from: polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polystyrene, polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyamide (PA), and polylactic acid (PLA) and a mixture of these latter.
  • the organic culture support, of synthetic origin is an expanded polymer.
  • the culture support can be chosen from porous polyurethane foam cubes impregnated with powdered activated carbon and/or rigid polyethylene biochips.
  • the inorganic culture support of natural or synthetic origin, can be chosen from: magnetite, volcanic rocks, vermiculite, porous glass, silica-based materials, ceramics, nanoparticles and a mixture of these.
  • the culture support can be chosen from sepiolite, pozzolan and/or porous glass (for example expanded glass which can be marketed under the name Poraver (registered trademark)).
  • the culture support can be chosen from sepiolite, pozzolan and/or porous glass and be of spherical or pseudo-spherical shape.
  • the culture support can be chosen from porous cubes of polyurethane foam impregnated with powdered activated carbon, rigid polyethylene biochips, sepiolite, pozzolan and/or porous glass.
  • immobilized that all the elements of the solid support are without relative movement between them and in relation to the body of the reactor (case of a downward liquid flow, an ascending liquid flow at low speed for a solid with a density greater than that liquid, or solid supports whose movement is blocked mechanically, for example by means of a grid).
  • not immobilized we mean that the solid supports are suspended in a liquid flow. ascending, in “fluidized bed” mode, in movement relative to each other and relative to the reactor body, but that the net speed of all the solid supports is zero relative to the reactor body.
  • At least one methanogenic microorganism is fixed on the culture support
  • the microorganism is not free in its environment (culture medium or other) and that when bringing the at least one methanogenic microorganism fixed on the support into contact with a culture medium, a system with two distinct phases appears.
  • from 0.01 to 100% (by mass) of the at least one methanogenic microorganism is fixed on the support, preferably from 60 to 100% and even more preferably from 80 to 100%.
  • culture medium is meant a culture medium in which at least one microorganism can be maintained to generate a mixture of gases, and in which incoming gases will be injected and dissolved, that this medium allows or not the production of biomass.
  • the culture medium may comprise water, nutrients, trace elements, or even a mixture of these.
  • the culture medium may include sources of nutrients (nitrogen, calcium, sodium, potassium, sulfur, phosphorus, magnesium) and trace elements (iron, zinc, copper, cobalt, nickel, molybdenum, iodine and boron) necessary for maintenance of microorganisms or the growth of microorganisms and microbial activity.
  • the culture medium can be a continuous liquid phase.
  • continuous liquid phase within the meaning of the present invention is understood to mean a volume of liquid having physical continuity, as opposed to a discontinuous liquid volume consisting of a set of liquid phases without contact with each other such as liquid drops. percolating in a gas phase.
  • the pH of the culture medium can be within a range of 7 to 9.
  • the pH of the culture medium can be 8.
  • at least one of the steps has ) or b) can use at least one culture medium.
  • the contacting of step a) can be carried out between at least one methanogenic microorganism and a culture support before the mixture obtained is introduced in step b) into a gas/liquid bioreactor comprising a medium of culture.
  • the contacting of step a) can be carried out between at least one methanogenic microorganism, a culture support and a culture medium before the mixture obtained is introduced in step b) into a gas/liquid bioreactor not yet comprising a culture medium.
  • step a) can be carried out between at least one methanogenic microorganism, a culture support and a first culture medium before the mixture obtained is introduced in step b) into a gas bioreactor /liquid comprising a second culture medium.
  • the first and second culture medium may be identical or different.
  • the process according to the invention can be continuous, semi-continuous or discontinuous (batch operation).
  • the process for producing methane ex-situ comprises the following steps: a) bringing at least one methanogenic microorganism into contact with a culture support; b) introduction of the mixture obtained in step a) into a gas/liquid bioreactor comprising a culture medium; c) bringing incoming gases into contact in the gas/liquid bioreactor obtained in step b); d) reaction of the incoming gases with the at least one methanogenic microorganism; e) recovery of outgoing gases obtained in step d); characterized in that
  • the culture support is immobilized or not in the gas/liquid bioreactor
  • the process for producing methane ex-situ comprises the following steps: a) bringing into contact with at least one methanogenic microorganism, a culture support and a culture environment; b) introducing the mixture obtained in step a) into a gas/liquid bioreactor; c) bringing incoming gases into contact in the gas/liquid bioreactor obtained in step b); d) reaction of the incoming gases with at least one methanogenic microorganism; e) recovery of outgoing gases obtained in step d); characterized in that - the culture support is immobilized or not in the gas/liquid bioreactor; And
  • the process for producing methane ex-situ comprises the following steps: a) bringing into contact with at least one methanogenic microorganism, a culture support and a first culture medium; b) introducing the mixture obtained in step a) into a gas/liquid bioreactor comprising a second culture medium; c) bringing incoming gases into contact in the gas/liquid bioreactor obtained in step b); d) reaction of the incoming gases with at least one methanogenic microorganism; e) recovery of outgoing gases obtained in step d); characterized in that
  • the gas/liquid bioreactor can be chosen from a pneumatic stirring reactor such as a bubble column with ascending or descending liquid circulation or an airlift reactor, a mechanical stirring column with ascending or descending liquid circulation , a continuous flow stirred tank reactor (CSTR), a flooded fixed bed reactor, a fluidized bed reactor, a sprinkled bed reactor.
  • a pneumatic stirring reactor such as a bubble column with ascending or descending liquid circulation or an airlift reactor, a mechanical stirring column with ascending or descending liquid circulation , a continuous flow stirred tank reactor (CSTR), a flooded fixed bed reactor, a fluidized bed reactor, a sprinkled bed reactor.
  • the gas/liquid bioreactor can be chosen from a reactor with pneumatic stirring, preferably with descending liquid circulation.
  • steps a) and b) of the process according to the invention can be carried out under a pressure of between 1 and 20 bar (absolute pressure).
  • the pressure of steps a) and b) can be between 1 and 3 bar.
  • the pressure of steps a) and b) can be 2 bar.
  • the method according to the invention may further comprise an intermediate step a'), implemented between steps a) and b) allowing the proliferation of at least one methanogenic microorganism on the support before its introduction. in the gas/liquid bioreactor.
  • the proliferation stage a') may last less than or equal to 6 months.
  • the duration of step a') can be 30 days.
  • Steps a) and a') allow the formation of a methanation catalyst (support colonized by at least one methanogenic microorganism).
  • the methanation catalyst may or may not be isolated from the first liquid medium before carrying out step b).
  • the "mixture resulting from step a)" can represent the mixture comprising the catalyst and the first culture medium, or the catalyst only, when the culture medium is absent from step a), or when it is present. was isolated.
  • the method according to the invention may further comprise an intermediate step b'), implemented between steps b) and c) allowing the proliferation of at least one methanogenic microorganism on the support in the bioreactor gas/liquid before the introduction of incoming gases.
  • Proliferation stage b’) may last less than or equal to 3 months.
  • the duration of step b’) can be 15 days.
  • the incoming gases of step c) of the process according to the invention can be carbon dioxide (CO2) and dihydrogen (H2).
  • Incoming gases are not limited to CO2 and H2. They may in particular include any other gas, such as for example methane, carbon monoxide, dinitrogen, ammonia and/or hydrogen sulphide.
  • the H2/CO2 volume ratio can be included in a range from 2/1 to 6/1. Preferably, the H2/CO2 volume ratio can be 4:1.
  • the flow rate of the H2 entering from step c), d) or e) of the process according to the invention can be included in a range going from 0.1 to 10 NL/L reactor /h, this which is equivalent to 2.4 to 240 NL/Lreactor/day.
  • the flow rate of incoming H2 may be 10 NL/Lreactor/h, which is equivalent to 240 NL/Lreactor/day.
  • the flow rate of CO2 entering from step c), d) or e) of the process according to the invention can be included in a range going from 0.025 to 2.5 NL/Lreactor/h, which is equivalent to 0.6 to 60 NL/Lreactor/day.
  • the flow of incoming CO2 perhaps 2.5 NL/Lreactor/h, which is equivalent to 60 NL/Lreactor/day.
  • the liquid is recirculated in a loop in the reactor, via a recirculation loop in order to homogenize the reaction medium.
  • the liquid recirculation flow rate is within a range of 0.1 to 1 L/L reactor /min.
  • the reaction temperature of step d) of the process according to the invention can be included in a range ranging from 25 to 70°C. Preferably, the temperature can be 55°C.
  • the pressure inside the bioreactor during steps c), d) and e) of the process according to the invention can be included in a range from 1 to 20 bar.
  • the pressure of step c), d) and e) can be between 2 and 6 bar or between 1 and 3 bar. Even more preferably, the pressure of step c), d) and e) can be 2 bar.
  • the outgoing gases may include methane (CH).
  • CH methane
  • the outgoing gases may also include water vapor.
  • the volume ratio of methane (Ch) relative to the other outgoing gases (CO2 and H2) can be included in a range from 2/3 to 9.9/10.
  • the flow rate of the outgoing gases can be included in a range ranging from 0.025 to 2.5 NL/Lreactor/h, which is equivalent to 0.6 to 60 NL/Lreactor/day.
  • the flow rate of the outgoing gases can be 2.5 NL/Lreactor/h, which is equivalent to 60 NL/Lreactor/day.
  • the method according to the invention may further comprise a step of) replenishing the culture medium with nutrients.
  • This step makes it possible to compensate for the reduction in the nutrient concentration of the culture medium, the latter being consumed by the microorganisms during the production of methane, in step d) of the process.
  • a second object of the present invention is a device 1 for producing methane ex-situ comprising:
  • a gas/liquid bioreactor 11 comprising a tank 12, a gas inlet 13, a gas outlet 14, a liquid inlet 15 and a liquid outlet 16, at least one methanogenic microorganism 121 fixed on a culture support 122, immobilized or not, and a culture medium 123;
  • liquid injection means 18 making it possible to inject said continuous liquid phase 123 into the gas/liquid bioreactor 11;
  • the volume of the tank 12 of the bioreactor can be included in a range going from 0.01 to 150 m 3
  • the volume of the tank 12 of the bioreactor 11 can be less than 50 m 3 for an installation agricultural and greater than 50 m 3 for an industrial installation. Even more preferably, the volume of the tank 12 of the bioreactor 11 can be 100 m 3 for an industrial installation.
  • the height/diameter ratio of the tank 12 can be between 10/1 and 10/3.
  • gas injection means any device making it possible to inject incoming gases into the continuous liquid phase contained in a gas/liquid bioreactor.
  • the gas injection means 17 can be chosen from fine bubble diffusers such as a porous column bottom diffuser, a pierced tube, a porous membrane made of polymers or ceramic material, a valve bubbler. , or among bubble-free membrane contactors such as hollow fiber membranes, or among hydroejectors or static mixers.
  • the gas injection means 17 can be a porous column bottom diffuser.
  • the gas/liquid bioreactor 11 can be configured to be continuously supplied with incoming gas, particularly during steps d) and e).
  • the gas injection means 17 is connected to the gas inlet 13 of the bioreactor 11.
  • connection means a direct or indirect connection between two elements of the device.
  • liquid injection means we mean any device making it possible to inject a continuous liquid phase into a gas/liquid bioreactor.
  • the liquid injection means 18 is connected to the liquid inlet 15 of the bioreactor 11.
  • the device according to the invention may comprise a liquid recirculation loop 24 connected to the liquid outlet 16 and to the liquid inlet 15.
  • the recirculation loop can be connected to the purge means 20.
  • the loop liquid recirculation can comprise a pump 23 and the liquid injection means 18.
  • the pump can be a peristaltic pump.
  • the liquid injection means 18 is chosen from multi-orifice static dispersion systems (in the shape of a crown or comb for example).
  • the liquid injection means 18 can be a comb-shaped multi-orifice.
  • the device 1 may further comprise a purging means 20 making it possible to purge said continuous liquid phase included in the gas/liquid bioreactor 11.
  • the purging means 20 is connected to the liquid outlet 16 of the bioreactor 11.
  • the gas/liquid bioreactor 11 can be configured so that the supply of nutrients and/or the purging of the culture medium is carried out continuously or discontinuously.
  • recovery means any device making it possible to recover outgoing gases from a gas/liquid bioreactor.
  • the recovery means 19 can be chosen from, a simple gas outlet, a gas outlet with condenser (in particular to eliminate the residual water vapor contained in the outgoing gases), an outlet associated with a system recirculation of outgoing gases.
  • the recovery means 19 can be an outlet associated with an outgoing gas recirculation system.
  • the gas/liquid bioreactor 11 can be configured so that the recovery of outgoing gases is carried out continuously.
  • the recovery means 19 is connected to the gas outlet 14 of the bioreactor 11.
  • the water vapor condensates can either be reinjected into the bioreactor 11, or extracted from the device 1.
  • the methanation reaction produces water, this has the advantage of being able to modulate the quantity of water in the device 1.
  • the device 1 can include a gas outlet 14 equipped with a condenser.
  • the device 1 can include a gas outlet 14 equipped with a counter.
  • the device 1 can comprise a gas loop connected to analyzers, preferably chromatograph type analyzers.
  • the device 1 can comprise a gas recirculation loop from the upper part of the bioreactor 11 to the lower part.
  • the device 1 can comprise a mixer of the recirculated gases with the incoming gases.
  • the device 1 can comprise a set of probes allowing the verification of the concentration of an incoming gas, the redox potential or the pH in the culture medium 123 (directly in the bioreactor 11).
  • the probe allowing the measurement of pH advantageously allows the temperature to be measured.
  • the device 1 can include gas bottles allowing the supply of incoming gas.
  • the bottles can be connected to the gas injection means 17.
  • the gas injection means 17 can also include a mixer, so as to control the CO2/H2 ratio of the incoming gases. Said mixer may be identical to or different from the mixer of the recirculated gases with the incoming gases.
  • the device 1 can comprise a set of flow meters, preferably mass flow meters. Said mass flow meters allow the adjustment of the inlet flow rates of the incoming gases.
  • the device 1 can include a gas meter.
  • the device 1 can comprise a sampling means. Said sampling means makes it possible to take liquid samples for the analysis of compounds and to monitor the progress of the process, for example.
  • the device 1 can comprise a set of valves.
  • the device 1 can include a pH regulation system.
  • the device 1 can comprise a sub-device housed inside the tank so as to compartmentalize it using a grid.
  • the sub-device is present in the case where several culture media of different nature are used.
  • the invention also relates to a kit, said kit once assembled making it possible to obtain the device 1 according to the invention, comprising:
  • the invention also relates to a methanation catalyst comprising a support 122 obtained in step a) of the process according to the invention.
  • the catalyst comprises at least one methanogenic microorganism 123 fixed on a support 122.
  • Another object of the present invention relates to the use of the strain of Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 for the production of methane.
  • Another subject of the present invention relates to the use of the Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 strain for the implementation of a biomethanation process.
  • Figure 1 represents a device 1 for the production of methane according to the present invention comprising:
  • a gas/liquid bioreactor 11 comprising a tank 12, a gas inlet 13, a gas outlet 14, a liquid inlet 15 and a liquid outlet 16, at least one methanogenic microorganism 121 fixed on a culture support 122, a culture medium 123, a gas injection means 17, a gas recovery means 19 and a liquid recirculation loop 24, connected to the liquid inlet 15 and to the liquid outlet 16, comprising a pump 23 and liquid injection means 18 making it possible to inject said continuous liquid phase 123 into the gas/liquid bioreactor 11
  • a purge means 20 connected to the recirculation loop 24 and comprising a valve 21.
  • Figure 2 represents the evolution over time of the growth of bacteria and archaea in a stirred bioreactor, in the absence ( ⁇ without support) or in the presence of polyethylene culture supports at a low filling rate (• TR_low) or high ( ⁇ TR_high), in the presence of modified basal BA medium 100 RPM and at 55°C, with supplementation of H2 and CO2.
  • Figure 4 represents an image of a methanation catalyst in polyethylene biochips taken by SEM at 0 days of growth of Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405, in modified BA medium, at 55°C with supplementation of H2 and CO2.
  • Figure 5 represents an image of a methanation catalyst in polyethylene biochips taken by SEM at 14 days of growth of Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405, in modified BA medium, at 55°C with supplementation of H2 and CO2.
  • Figure 6 represents an image of a methanation catalyst in polyethylene biochips taken by SEM at 34 days of growth of Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405, in modified BA medium, at 55°C with supplementation of H2 and CO2.
  • the composition of the gas phase is analyzed continuously by gas chromatography (Agilent analyzer, Technologies 3000A®) equipped with two separation modules and a thermal conductivity detector (TCD).
  • Module A equipped with a 5 ⁇ molecular sieve allows hydrogen, nitrogen, oxygen and methane to be separated under an argon flow.
  • Module B equipped with a PoraPlot U column (Agilent) allows the separation of carbon dioxide and hydrogen sulfide, under a hydrogen flow.
  • a hydrophobic filter is placed at the analyzer inlet to protect it from humidity. Gas analyzes of the bioreactor are carried out every hour.
  • a volume of 1 mL of culture sample is mixed with 125 ⁇ L of Ba(OH)2 8H2O (0.3 M) and 125 ⁇ L of ZnSO 7H2O (5% w/v) and centrifuged (5 min; 10,000 g ). The supernatant is then filtered to 0.22 ⁇ m and transferred to an HPLC vial stored at 4°C before injection.
  • the cells were then pelleted by centrifugation at 18,000 g (20 min, 14°C) on 400 mesh copper grids coated with carbon (Formvar, Pelanne Instruments, France) then contrasted by immersion in 20 ⁇ L of carbon acetate. uranyl at 2%.
  • Example 1 Evaluation of the tolerance of the Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405 strain to exposure to dioxygen (O2)
  • Module A equipped with a 5 ⁇ molecular sieve makes it possible to separate hydrogen, nitrogen, oxygen and methane, under an argon flow.
  • Module B equipped with a PoraPlot U column (Agilent) allows the separation of carbon dioxide and hydrogen sulfide, under a hydrogen flow, in the gas phase. Isolation on a solid medium is then carried out using the Roll-tube method (Hungate, 1969). For this, 0.1 g of agar-agar (BactoTM Agar) are added to 5 mL of modified BA medium (Hungate tube), under a flow of N2, then autoclaved. The agar medium is then liquefied in a water bath at 100°C, then placed at 45°C in order to slow down its gelling.
  • the agar medium After inoculation by the last series of positive dilution in culture medium, the agar medium is placed uniformly in a thin layer on the internal face of the tube thanks to the rotating movement of the Spinner tube and using an ice cube on the external face to solidify the environment.
  • the tubes are then incubated at 55°C for 168 hours in a vertical position to avoid contamination of the colonies due to condensation.
  • the tubes showing the presence of a mother entity of microorganism (colony), visible to the naked eye, comprising a large number of identical microorganisms, and a production of CP, are opened in an anaerobic chamber with controlled atmosphere (pressure atmospheric) to collect colonies using a sterile Pasteur pipette.
  • the colonies are resuspended in 5 mL of culture medium.
  • the purity of liquid cultures is confirmed by carrying out several successive serial dilutions (10-1 to 10-5) and verifications using an optical microscope (Labophot, Nikon). Analyzes can be carried out on the strain thus isolated.
  • Table 1 Influence of exposure to dioxygen on the growth and metabolic activity of the Methanothermobacter marburgensis CLERMONT isolate
  • the ex-situ methane production process implemented comprises the following step: a) bringing into contact a consortium, a culture support made of polyethylene biochips and a culture medium.
  • the consortium from a methanization unit (Ennezat, 63) is taken from the methanization tank.
  • the liquid or digestate sample is sieved (5 mm) to remove solids > 5 mm and frozen.
  • the culture medium used is derived from the BA medium described by Bu et al., 2018 and its composition is described in Table 2.
  • the culture medium is adjusted to pH 7.5 with a 3 M NaOH solution.
  • Table 2 List of compounds in modified BA medium.
  • Figures 4, 5 and 6 illustrate that the Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 strain develops over time when placed in the presence of a polyethylene biochip culture support.
  • Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 strain develops more efficiently when placed in the presence of a culture support according to the invention in the presence of dihydrogen and carbon dioxide. Indeed, the optical density of the samples over time is lower in the case where a culture support is present (figure 2).
  • Example 3 Device for implementing the process according to the invention
  • the process for producing methane ex-situ implemented according to the invention also comprises the following steps: b) introduction of the mixture obtained at step a) (example 2) in a gas/liquid bioreactor; c) bringing incoming gases into contact with the gas/liquid bioreactor obtained in step b); d) reaction of the incoming gases with at least one methanogenic microorganism; e) recovery of outgoing gases obtained in step d); characterized in that
  • the device as described in Figure 1 allows the implementation of the method according to the invention.
  • the bioreactor of step b) was custom built from a section of a 316 stainless steel cylinder 2 mm thick. It has an internal diameter of 54 mm and a height of 1400 mm. The height/diameter ratio of the bubble column type gas/liquid bioreactor is 25.9. The volume of the tank is 3.5 L.
  • a sintered glass or stainless steel gas distributor of known porosity is coupled to the reactor using a GL18 tri-ring connection. The gases exit through an opening at the top of the column, coupled to the gas circuit by a V ⁇ G thread.
  • the gas outlet from the reactor is connected to a condenser in which water circulates at 4°C (Lauda Eco RE1225 silver).
  • a high-precision volume flow meter (Bioprocess control / Microflow 1100-3100) measures the gas flow leaving the condenser. The gas is then analyzed by gas chromatography (Agilent analyzer, Technologies 3000A®).
  • a culture medium recirculation system based on the use of a peristaltic pump (AB pump, Type PSF2) allows circulation of liquid against the current of the ascending gas bubbles, at an hourly volumetric speed of 10 L/Lreactor /h, which is equivalent to 0.166 L/L reactor /min.
  • the liquid recirculation loop includes an electrode for measuring redox potential, pH and temperature (Mettler Toledo INPR04260i/SG/120 52005381).
  • the pH being regulated to 7.5 if necessary by the addition of acidic or basic titrants.
  • the temperature of 55°C is controlled using a thermostatic bath (Lauda Eco RE1225 silver).
  • the recirculation system is equipped with a septum for taking samples, adding stock solutions (constituents of the culture medium, Na2S 9H2O) or withdrawing volumes of culture medium.
  • the incoming gases of step c) are dihydrogen and carbon dioxide. They are injected into the bioreactor at a total gas flow rate gradually increasing from 3.61 to 18.21 NL/L reactor /day for CO2 and gradually increasing from 14.37 to 72.85 NL/L reactor/day for H2 thanks to to flow meters masses (Brooks instrument, SLA5800), as indicated in table 3 below.
  • the H2/CO2 ratio is adjusted, if necessary, to obtain a value of 4/1 ⁇ 0.1.
  • the system pressure is 1 bar.
  • the gas mixture is continuously distributed by a diffuser, countercurrent to the flow of the aqueous phase.
  • the gases leaving step e) mainly consist of methane and water vapor (the water vapor being recondensed). They are recovered from the bioreactor at a total output gas flow rate gradually increasing from 5.52 to 18.67 NL/Lreactor/day, as shown in Table 3 below.
  • Table 3 Evolution of the specific incoming flow rate of CO2 and H2 and the specific production of CH4 (expressed in NL/Lreactor/day) as a function of the age of the culture (expressed in days).
  • the process according to the invention implemented by the device of Figure 1 makes it possible to obtain methane yields higher than conventional processes.
  • the increase in pressure in the system increases the solubility of hydrogen in the culture medium.
  • the presence of supports colonized by at least one methanogenic microorganism increases the quantity of catalyst per unit of reactor volume.
  • the at least one cultured methanogenic microorganism is selected for its ability to produce methane.
  • the presence of supports colonized by at least one methanogenic microorganism increases the residence time of the gas in the culture medium and promotes the solubility of hydrogen in the liquid. It increases system performance by a factor of 3.6.
  • Reference 1 Bu, F.; Dong, N.; Kumar Khanal, S.; Xie, L; Zhou, Q. Effects of CO on Hydrogenotrophic Methanogenesis under Thermophilic and Extreme-Thermophilic Conditions: Microbial Community and Biomethanation Pathways.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de biométhanation ex-situ ainsi que le dispositif pour sa mise en œuvre. L'invention se rapporte à un procédé de production de méthane ex-situ comprenant les étapes de mise en contact d'au moins un micro-organisme méthanogène, d'un support de culture et optionnellement d'un premier milieu de culture dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant optionnellement un second milieu de culture et la production de méthane par la réaction de gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène, caractérisé en ce que le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide; et le au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture; ainsi que le dispositif de mise en œuvre du procédé.

Description

DESCRIPTION
Titre : PROCEDE DE BIOMETHANATION EX-SITU
Domaine technique de l’invention
[001] La présente invention se rapporte à un procédé de biométhanation ex-situ ainsi qu’à un dispositif permettant sa mise en œuvre.
[002] L’invention se rapporte à un procédé de production de méthane ex-situ comprenant les étapes de mise en contact d’au moins un micro-organisme méthanogène, d’un support de culture et optionnellement d’un premier milieu de culture dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant optionnellement un second milieu de culture et la production de méthane par la réaction de gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène, caractérisé en ce que le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide ; et au moins un microorganisme méthanogène est fixé sur le support de culture ; ainsi que le dispositif de mise en œuvre du procédé.
Art antérieur
[003] La méthanation est une réaction de synthèse du méthane à partir du dihydrogène et du dioxyde de carbone.
[004] Depuis quelques années, la méthanation est directement associée au développement des énergies éoliennes et solaires, qui dépend de la capacité à pouvoir stocker massivement l’électricité produite mais non consommée. La conversion d’électricité en gaz, appelée aussi Power-to-gas, est une solution prometteuse permettant de convertir cette électricité excédentaire en hydrogène par électrolyse de l’eau. Toutefois la filière hydrogène étant encore en construction, la conversion de cet hydrogène en méthane par méthanation permet de stocker massivement cette énergie en utilisant les infrastructures gazières existantes, c’est le concept du power-to-methane. L’autre avantage de la méthanation est de capter et stocker du dioxyde de carbone lors de cette conversion réduisant ainsi les impacts environnementaux liés aux rejets de dioxyde de carbone (biogaz issu de la méthanisation, gaz de synthèse obtenu par pyrolyse ou gazéification, effluent gazeux de combustion ou équivalents). Ce double avantage qui caractérise la méthanation en fait une technologie d’avenir.
[005] Il existe deux voies concurrentes pour la méthanation : la voie catalytique, qui peine à s’industrialiser depuis de nombreuses années, et la voie biologique, plus robuste (vis-à-vis des impuretés telles que le CO, NH3, H2S, etc.) et présentant une plus faible empreinte environnementale notamment par des coûts énergétiques réduits.
[006] Cependant, à ce jour, aucune technologie de biométhanation in situ ou ex-situ n’est encore mature ou économiquement viable, et les différents procédés dédiés nécessitent d’être encore investigués.
[007] L’inconvénient majeur de la voie biologique réside dans la cinétique de production de méthane, plus lente que par voie catalytique. Ce verrou cinétique résulte en partie d’une limitation par les processus physicochimiques de transfert de matière de dihydrogène gazeux vers la phase liquide. Des solutions classiques consistent à augmenter la pression et/ou à intensifier l’agitation, ce qui peut avoir un effet antagoniste sur les processus biologiques à cause de la sensibilité au stress mécanique des micro-organismes, et en particulier des archées méthanogènes hydrogénotrophes, et peut réduire leur productivité. Un besoin concernant l’industrialisation d’un procédé biologique ayant un coût énergétique acceptable et donc un coût économique réduit existe.
Exposé de l’invention
[008] La présente invention permet l’obtention d’un procédé de biométhanation ex- situ et d’un dispositif qui résolvent de manière surprenante les inconvénients des procédés biologiques connus et sont une alternative intéressante aux procédés catalytiques difficilement industrialisâmes. La présente invention permet ainsi d’augmenter la robustesse et la longévité du procédé à pression et température plus basses par rapport à la voie catalytique, mais aussi d’augmenter la teneur en méthane du gaz sortant, et ainsi le rendement de conversion, la productivité et la robustesse des procédés biologiques en réduisant les besoins d’apport externe en énergie par rapport aux technologies de l’art antérieur connues.
[009] Un premier objet de la présente invention est un procédé de production de méthane ex-situ comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d’au moins un micro-organisme méthanogène, d’un support de culture et optionnellement d’un premier milieu de culture ; b) introduction du mélange obtenu à l’étape a) dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant optionnellement un deuxième milieu de culture; c) mise en contact de gaz entrants dans le bioréacteur gaz/liquide obtenu à l’étape b) ; d) réaction des gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène ; e) récupération de gaz sortants obtenus à l’étape d) ; caractérisé en ce que
- le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide ; et
- au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture. [0010] Avantageusement, les étapes a) et b) peuvent se produire de manière séquentielle ou simultanée.
[0011] Avantageusement, les étapes c), d) et e) peuvent se produire de manière séquentielle et/ou simultanée.
[0012] Par « au moins un micro-organisme méthanogène », on entend dans la présente un consortium de micro-organismes comprenant au moins une souche méthanogène ou une souche méthanogène pure.
[0013] Avantageusement, le au moins un micro-organisme méthanogène peut comprendre un micro-organisme appartenant à l’embranchement des Euryarchaeota et peut être choisi parmi les classes des Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri ou Methanomicrobia. De préférence, le au moins un micro-organisme méthanogène peut comprendre au moins une souche de Methanothermobacter.
Référence à du matériel biologique déposé
[0014] Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le au moins un micro-organisme méthanogène est la souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT déposée selon le Traité de Budapest le 20 octobre 2022 ; auprès du DSMZ (Leibniz Institute Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrafte 7B 38124 Braunschweig GERMANY) sous le numéro DSM 34405.
[0015] Le au moins un micro-organisme méthanogène peut être compris dans un liquide de préculture. Le milieu de préculture peut être identique ou différent du premier milieu de culture.
[0016] Par « support de culture », on entend un support permettant sa colonisation par des micro-organismes hydrogénotrophes et/ou méthanogènes. Le support peut être sous forme de billes, copeaux, galets, gel, mousse, pastilles, anneaux, tour ou biochips. De préférence, le support de culture peut être sphérique ou pseudosphérique.
[0017] Avantageusement, le support de culture peut être un support organique ou inorganique, d’origine naturelle ou synthétique. [0018] Avantageusement, le support de culture organique, d’origine naturelle peut être choisi parmi : l'alginate, le K-carraghénane, le chitosane, la sciure de bois, la paille, le charbon de bois, les fibres végétales, la rafle de maïs, la bagasse, le riz, les cosses de graines de tournesol, la diatomite, le mycélium et un mélange de ces derniers.
[0019] Avantageusement, le support de culture organique, d’origine synthétique peut être un polymère. Le polymère peut être expansé ou non expansé. Le polymère peut être choisi parmi : le polyéthylène, le polypropylène, le chlorure de polyvinyle, le polystyrène, le polyuréthane, le polyacrylonitrile, l'alcool polyvinylique, le polyamide (PA), et l’acide polylactique (PLA) et un mélange de ces derniers. De préférence, le support de culture organique, d’origine synthétique est un polymère expansé. De préférence, le support de culture peut être choisi parmi des cubes poreux en mousse de polyuréthane imprégnée de charbon actif en poudre et/ou des biochips rigides de polyéthylène.
[0020] Avantageusement, le support de culture inorganique, d’origine naturelle ou synthétique peut être choisi parmi : la magnétite, les roches volcaniques, la vermiculite, le verre poreux, les matériaux à base de silice, les céramiques, les nanoparticules et un mélange de ces derniers. De préférence, le support de culture peut être choisi parmi de la sépiolite, de la pouzzolane et/ou du verre poreux (par exemple du verre expansé pouvant être commercialisé sous le nom Poraver (marque déposée)). De manière encore préféré, le support de culture peut être choisi parmi de la sépiolite, de la pouzzolane et/ou du verre poreux et être de forme sphérique ou pseudo-sphérique.
[0021] Avantageusement, le support de culture peut être choisi parmi des cubes poreux en mousse de polyuréthane imprégnée de charbon actif en poudre, des biochips rigides de polyéthylène, de la sépiolite, de la pouzzolane et/ou du verre poreux.
[0022] Par « immobilisé ou non », on entend dans la présente dans le cas
« immobilisé » que tous les éléments du support solide sont sans mouvement relatif entre eux et par rapport au corps du réacteur (cas d’un flux liquide descendant, d’un flux liquide ascendant à faible vitesse pour un solide de masse volumique supérieure à celle du liquide, ou de supports solides dont le mouvement est bloqué mécaniquement, par exemple au moyen d’une grille). A contrario, on entend par « non immobilisé » que les supports solides sont en suspension dans un flux liquide ascendant, en mode « lit fluidisé », en mouvement les uns par rapport aux autres et par rapport au corps du réacteur, mais que la vitesse nette de l’ensemble des supports solides est nulle par rapport au corps du réacteur.
[0023] Par « au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture », on entend dans la présente que le micro-organisme n’est pas libre dans son environnement (milieu de culture ou autre) et que lors de la mise en contact du au moins un micro-organisme méthanogène fixé sur le support avec un milieu de culture, il y a apparition d’un système à deux phases distinctes. Généralement, de 0,01 à 100 % (en masse) du au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support, de préférence de 60 à 100 % et de manière encore préférée de 80 à 100 %.
[0024] Par « milieu de culture », on entend un milieu de culture dans lequel le au moins un micro-organisme peut être maintenu pour générer un mélange de gaz, et dans lequel des gaz entrants vont être injectés et dissous, que ce milieu permette ou non la production de biomasse.
[0025] Avantageusement, le milieu de culture peut comprendre de l’eau, des nutriments, des oligoéléments, ou encore un mélange de ces derniers. De préférence, le milieu de culture peut comprendre des sources de nutriments (azote, calcium, sodium, potassium, souffre, phosphore, magnésium) et des oligoéléments (fer, zinc, cuivre, cobalt, nickel, molybdène, iode et bore) nécessaires au maintien des microorganismes ou à la croissance des microorganismes et à l’activité microbienne.
[0026] Avantageusement, le milieu de culture peut être une phase liquide continue. On entend par « phase liquide continue » au sens de la présente invention un volume de liquide présentant une continuité physique, par opposition à un volume liquide discontinu constitué d’un ensemble de phases liquides sans contact les unes avec les autres tels que des gouttes liquides percolant dans une phase gaz.
[0027] Avantageusement, le pH du milieu de culture peut être compris dans un intervalle allant de 7 à 9. De préférence, le pH du milieu de culture peut être de 8. [0028] Avantageusement, au moins l’une des étapes a) ou b) peut mettre en œuvre au moins un milieu de culture. La mise en contact de l’étape a) peut être réalisée entre au moins un micro-organisme méthanogène et un support de culture avant que le mélange obtenu ne soit introduit à l’étape b) dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant un milieu de culture. La mise en contact de l’étape a) peut être réalisée entre au moins un micro-organisme méthanogène, un support de culture et un milieu de culture avant que le mélange obtenu ne soit introduit à l’étape b) dans un bioréacteur gaz/liquide ne comprenant pas encore de milieu de culture. La mise en contact de l’étape a) peut être réalisée entre au moins un micro-organisme méthanogène, un support de culture et un premier milieu de culture avant que le mélange obtenu ne soit introduit à l’étape b) dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant un deuxième milieu de culture. Le premier et deuxième milieu de culture peuvent être identiques ou différents.
[0029] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut être continu, semi- continu ou discontinu (fonctionnement par batch).
[0030] Dans une première variante, le procédé de production de méthane ex-situ selon l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d’au moins un micro-organisme méthanogène et d’un support de culture ; b) introduction du mélange obtenu à l’étape a) dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant un milieu de culture ; c) mise en contact de gaz entrants dans le bioréacteur gaz/liquide obtenu à l’étape b) ; d) réaction des gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène ; e) récupération de gaz sortants obtenus à l’étape d) ; caractérisé en ce que
- le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide ; et
- au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture. [0031] Dans une deuxième variante, le procédé de production de méthane ex-situ selon l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d’au moins un micro-organisme méthanogène, d’un support de culture et d’un milieu de culture ; b) introduction du mélange obtenu à l’étape a) dans un bioréacteur gaz/liquide ; c) mise en contact de gaz entrants dans le bioréacteur gaz/liquide obtenu à l’étape b) ; d) réaction des gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène ; e) récupération de gaz sortants obtenus à l’étape d) ; caractérisé en ce que - le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide ; et
- au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture. [0032] Dans une troisième variante, le procédé de production de méthane ex-situ selon l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d’au moins un micro-organisme méthanogène, d’un support de culture et d’un premier milieu de culture; b) introduction du mélange obtenu à l’étape a) dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant un deuxième milieu de culture; c) mise en contact de gaz entrants dans le bioréacteur gaz/liquide obtenu à l’étape b) ; d) réaction des gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène ; e) récupération de gaz sortants obtenus à l’étape d) ; caractérisé en ce que
- le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide ; et
- au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture. [0033] Par « bioréacteur gaz/liquide », on entend dans la présente un fermenteur capable de mettre en œuvre une réaction biologique nécessitant la dissolution d’au moins un réactif présent à l’état gazeux dans un milieu de culture.
[0034] Avantageusement, le bioréacteur gaz/liquide peut être choisi parmi un réacteur à agitation pneumatique tel qu’une colonne à bulles à circulation de liquide ascendante ou descendante ou un réacteur airlift, une colonne à agitation mécanique à circulation de liquide ascendante ou descendante, un réacteur à cuve agitée à flux continu (CSTR), un réacteur à lit fixe noyé, un réacteur à lit fluidisé, un réacteur à lit arrosé. De préférence, le bioréacteur gaz/liquide peut être choisi parmi un réacteur à agitation pneumatique, de préférence à circulation de liquide descendante.
[0035] Avantageusement, les étapes a) et b) du procédé selon l’invention peuvent être réalisées à une température comprise entre 25 et 70 °C. De préférence, la température de l’étape a) et b) peut être de 55 °C.
[0036] Avantageusement, l’étape a) et b) du procédé selon l’invention peuvent être réalisées sous une pression comprise entre 1 et 20 bar (pression absolue). De préférence, la pression de l’étape a) et b) peut être comprise entre 1 et 3 bar. De manière encore préféré, la pression de l’étape a) et b) peut être de 2 bar. [0037] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape intermédiaire a’), mise en œuvre entre les étapes a) et b) permettant la prolifération du au moins un micro-organisme méthanogène sur le support avant son introduction dans le bioréacteur gaz/liquide. L’étape a’) de prolifération peut avoir une durée inférieure ou égale 6 mois. De préférence, la durée de l’étape a’) peut être de 30 jours.
[0038] Les étapes a) et a') permettent la formation d'un catalyseur de méthanation (support colonisé par au moins un micro-organisme méthanogène). A l'issue de l'étape a), ou optionnellement a'), le catalyseur de méthanation peut être isolé ou non du premier milieu liquide avant la mise en œuvre de l'étape b). Ainsi le "mélange issu de l'étape a)" peut représenter le mélange comprenant le catalyseur et le premier milieu de culture, ou le catalyseur uniquement, lorsque le milieu culture est absent de l'étape a), ou lorsqu'il il en a été isolé.
[0039] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape intermédiaire b’), mise en œuvre entre les étapes b) et c) permettant la prolifération du au moins un micro-organisme méthanogène sur le support dans le bioréacteur gaz/liquide avant l’introduction de gaz entrants. L’étape b’) de prolifération peut avoir une durée inférieure ou égale 3 mois. De préférence, la durée de l’étape b’) peut être de 15 jours.
[0040] Avantageusement, les gaz entrants de l’étape c) du procédé selon l’invention peuvent être le dioxyde de carbone (CO2) et le dihydrogène (H2). Les gaz entrants ne sont pas limités au CO2 et H2. Ils peuvent notamment comprendre tout autre gaz, tel que par exemple du méthane, du monoxyde de carbone, du diazote, de l’ammoniac et/ou du sulfure d’hydrogène. Le ratio volumique H2/CO2 peut être compris dans un intervalle allant de 2/1 à 6/1 . De préférence, le ratio volumique H2/CO2 peut être de 4 : 1 .
[0041 ] Avantageusement, le débit du H2 entrant de l’étape c), d) ou e) du procédé selon l’invention peut être compris dans un intervalle allant de 0,1 à 10 NL/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 2,4 à 240 NL/Lréacteur/jour. De préférence, le débit du H2 entrant peut-être de 10 NL/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 240 NL/Lréacteur/jour. [0042] Avantageusement, le débit du CO2 entrant de l’étape c), d) ou e) du procédé selon l’invention peut être compris dans un intervalle allant de 0,025 à 2,5 NL/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 0,6 à 60 NL/Lréacteur/jour. De préférence, le débit du CO2 entrant peut-être de 2,5 NL/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 60 NL/Lréacteur/jOUr.
[0043] Avantageusement, le liquide est recirculé en boucle dans le réacteur, via une boucle de recirculation afin d’homogénéiser le milieu réactionnel. Le débit de recirculation du liquide est compris dans un intervalle allant de 0,1 à 1 L/Lréacteur/min. [0044] Avantageusement, la température de réaction de l’étape d) du procédé selon l’invention peut être comprise dans un intervalle allant de 25 à 70°C. De préférence, la température peut être de 55°C.
[0045] Avantageusement, la pression à l’intérieur du bioréacteur lors des étapes c), d) et e) du procédé selon l’invention peut être comprise dans un intervalle allant de 1 à 20 bar. De préférence, la pression de l’étape c), d) et e) peut être comprise entre 2 et 6 bar ou entre 1 et 3 bar. De manière encore préféré, la pression de l’étape c), d) et e) peut être de 2 bar.
[0046] Avantageusement, les gaz sortants peuvent comprendre du méthane (CH ). Les gaz sortants peuvent comprendre en outre de la vapeur d’eau.
[0047] Avantageusement, le ratio volumique de méthane (Ch ) par rapport aux autres gaz sortants (CO2 et H2) peut être compris dans un intervalle allant de 2/3 à 9,9/10.
[0048] Avantageusement, le débit des gaz sortants peut être compris dans un intervalle allant de 0,025 à 2,5 NL/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 0,6 à 60 NL/Lréacteur/jour. De préférence, le débit des gaz sortants peut être de 2,5 NL/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 60 NL/Lréacteur/jour.
[0049] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape d’) de réalimentation du milieu de culture en nutriments. Cette étape permet de compenser la diminution de la concentration du milieu de culture en nutriments, ces derniers étant consommés par les micro-organismes lors de la production de méthane, à l’étape d) du procédé.
[0050] Un second objet de la présente invention est un dispositif 1 de production de méthane ex-situ comprenant :
- un bioréacteur gaz/liquide 11 comprenant une cuve 12, une entrée de gaz 13, une sortie de gaz 14, une entrée de liquide 15 et une sortie de liquide 16, au moins un micro-organisme méthanogène 121 fixé sur un support de culture 122, immobilisé ou non, et un milieu de culture 123;
- un moyen d’injection de gaz 17 permettant d’injecter des gaz entrants dans ladite phase liquide continue contenue 123 dans le bioréacteur gaz/liquide 11 ;
- un moyen d’injection de liquide 18 permettant d’injecter ladite phase liquide continue 123 dans le bioréacteur gaz/liquide 11 ;
- un moyen de récupération 19 permettant de récupérer des gaz sortants issu du bioréacteur gaz/liquide 11 .
[0051] Les définitions décrites précédemment s’appliquent aussi au dispositif mentionné, lorsqu’elles sont applicables.
[0052] Avantageusement, le volume de la cuve 12 du bioréacteur peut être compris dans un intervalle allant de 0,01 à 150 m3 De préférence, le volume de la cuve 12 du bioréacteur 11 peut être inférieur à 50 m3 pour une installation agricole et supérieur à 50 m3 pour une installation industrielle. De manière encore préféré, le volume de la cuve 12 du bioréacteur 11 peut être de 100 m3 pour une installation industrielle. Le ratio hauteur/diamètre de la cuve 12 peut être compris entre 10/1 et 10/3.
[0053] Par « moyen d’injection de gaz », on entend tout dispositif permettant d’injecter des gaz entrants dans la phase liquide continue contenue dans un bioréacteur gaz/liquide.
[0054] Avantageusement, le moyen d’injection de gaz 17 peut être choisi parmi les diffuseurs fines bulles tels qu’un diffuseur poreux de fond de colonne, un tube percé, une membrane poreuse en polymères ou en matériau céramique, un bulleur à clapet, ou parmi les contacteurs membranaires sans bulles tels que les membranes fibre creuse, ou parmi les hydroéjecteurs ou les mélangeurs statiques. De préférence, le moyen d’injection de gaz 17 peut être un diffuseur poreux de fond de colonne. Le bioréacteur gaz/liquide 11 peut être configuré pour être continuellement alimenté en gaz entrants, notamment lors des étapes d) et e). Le moyen d’injection de gaz 17 est relié à l’entrée de gaz 13 du bioréacteur 11 .
[0055] Dans la présente, on entend par « relié », une connexion directe ou indirecte entre deux éléments du dispositif.
[0056] Par « moyen d’injection de liquide », on entend tout dispositif permettant d’injecter une phase liquide continue dans un bioréacteur gaz/liquide. Le moyen d’injection de liquide 18 est relié à l’entrée de liquide 15 du bioréacteur 11.
[0057] Avantageusement, le dispositif selon l’invention peut comprendre une boucle de recirculation de liquide 24 reliée à la sortie 16 de liquide et à l’entrée 15 de liquide. La boucle de recirculation peut être reliée au moyen de purge 20. La boucle de recirculation de liquide peut comprendre une pompe 23 et le moyen d’injection de liquide 18. La pompe peut être une pompe péristaltique.
[0058] Avantageusement, le moyen d’injection de liquide 18 est choisi parmi des systèmes de dispersion statique multi-orifices (en forme de couronne ou de peigne par exemple). De préférence, le moyen d’injection de liquide 18 peut être un multiorifices en forme de peigne.
[0059] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre en outre un moyen de purge 20 permettant de purger ladite phase liquide continue comprise dans le bioréacteur gaz/liquide 11. Le moyen de purge 20 est relié à la sortie de liquide 16 du bioréacteur 11 .
[0060] Le bioréacteur gaz/liquide 11 peut être configuré pour que l’apport en nutriments et/ou la purge du milieu de culture soit réalisée de manière continue ou discontinue.
[0061] Par « moyen de récupération », on entend tout dispositif permettant de récupérer des gaz sortants issu d’un bioréacteur gaz/liquide.
[0062] Avantageusement, le moyen de récupération 19 peut être choisi parmi, une sortie de gaz simple, une sortie de gaz avec condenseur (notamment pour éliminer la vapeur d’eau résiduelle contenue dans les gaz sortants), une sortie associée à un système de recirculation des gaz sortants. De préférence, le moyen de récupération 19 peut être une sortie associée à un système de recirculation des gaz sortants. Le bioréacteur gaz/liquide 11 peut être configuré pour que la récupération de gaz sortants soit réalisée de manière continue. Le moyen de récupération 19 est relié à la sortie de gaz 14 du bioréacteur 11 . Les condensats de vapeur d’eau peuvent être soit réinjecté dans le bioréacteur 11 , soit extrait hors du dispositif 1 . La réaction de méthanation produisant de l’eau, cela présente un avantage de pouvoir moduler la quantité d’eau dans le dispositif 1 .
[0063] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre une sortie de gaz 14 équipée d’un condenseur.
[0064] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre une sortie de gaz 14 équipée d’un compteur.
[0065] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre une boucle de gaz reliées à des analyseurs, de préférence des analyseurs de type chromatographe. [0066] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre une boucle de recirculation des gaz de la partie supérieure du bioréacteur 11 vers la partie inférieure.
[0067] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un mélangeur des gaz recirculés avec les gaz entrants.
[0068] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un ensemble de sondes permettant la vérification de la concentration d’un gaz entrant, le potentiel redox ou le pH dans le milieu de culture 123 (directement dans le bioréacteur 11 ). La sonde permettant la mesure du pH permet avantageusement de mesurer la température. [0069] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre des bouteilles de gaz permettant l’approvisionnement en gaz entrants. Les bouteilles peuvent être reliées au moyen d’injection des gaz 17. Le moyen d’injection des gaz 17 peut comprendre en outre un mélangeur, de sorte à contrôler le ratio CO2/H2 des gaz entrants. Ledit mélangeur peut être identique ou différent du mélangeur des gaz recirculés avec les gaz entrants.
[0070] On entend par « bouteille » un moyen de stockage de gaz ; ledit moyen de stockage pouvant être substitué par tout autre moyen de stockage compatible. [0071] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un ensemble de débitmètres, de préférence des débitmètres massiques. Lesdits débitmètres massiques permettent l’ajustement des débits d’entrée des gaz entrants.
[0072] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un compteur de gaz. [0073] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un moyen de prélèvement. Ledit moyen de prélèvement permet de prélever des échantillons de liquide pour l’analyse des composés et suivre l’avancement du procédé, par exemple.
[0074] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un moyen de prélèvement d’échantillon de la composition du mélange de gaz sortant pour l’analyse des composés.
[0075] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un ensemble de vannes. [0076] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un système de régulation de pH.
[0077] Avantageusement, le dispositif 1 peut comprendre un sous-dispositif logé à l’intérieur de la cuve de sorte à le compartimenter à l’aide de grille. De préférence, le sous-dispositif est présent dans le cas où plusieurs supports de culture de nature différente sont utilisés.
[0078] L’invention se rapporte encore à un kit, ledit kit une fois assemblé permettant d’obtenir le dispositif 1 selon l’invention, comprenant :
- un support 122 ;
- au moins un micro-organisme méthanogène 123 ;
- optionnellement un bioréacteur gaz/liquide 11 ;
- optionnellement un moyen d’injection de gaz 17 ;
- optionnellement un moyen d’injection de liquide 18 ;
- optionnellement un moyen de récupération 19.
[0079] L’invention se rapporte encore à un catalyseur de méthanation comprenant un support 122 obtenu à l’étape a) du procédé selon l’invention. Le catalyseur comprend au moins un microorganisme méthanogène 123 fixé sur un support 122. [0080] Un autre objet de la présente invention se rapporte à l’utilisation de la souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 pour la production de méthane.
[0081] Un autre objet de la présente invention se rapporte à l’utilisation de la souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 pour la mise en œuvre d’un procédé de biométhanation.
[0082] D’autres avantages apparaîtront encore à la lumière des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatifs, en référence aux figures annexées. Brève description des figures
[0083] [Fig. 1] La figure 1 représente un dispositif 1 pour la production de méthane selon la présente invention comprenant :
- un bioréacteur gaz/liquide 11 comprenant une cuve 12, une entrée de gaz 13, une sortie de gaz 14, une entrée de liquide 15 et une sortie de liquide 16, au moins un micro-organisme méthanogène 121 fixé sur un support de culture 122, un milieu de culture 123 , un moyen d’injection de gaz 17, un moyen de récupération de gaz 19 et une boucle de recirculation de liquide 24, reliée à l’entrée de liquide 15 et à la sortie de liquide 16, comprenant une pompe 23 et un moyen d’injection de liquide 18 permettant d’injecter ladite phase liquide continue 123 dans le bioréacteur gaz/liquide 11
- deux sources de gaz entrants reliées par deux vannes 21 au moyen d’injection de gaz 17 ; - un chromatographe 22 relié par une vanne 21 au moyen de récupération 19;
- un moyen de purge 20 relié à la boucle de recirculation 24 et comprenant une vanne 21 .
[0084] [Fig. 2] La figure 2 représente l’évolution au cours du temps de la croissance des bactéries et archées en bioréacteur agité, en absence (■ sans support) ou en présence de supports de culture en polyéthylène à un taux de remplissage faible (• TR_faible) ou élevé (▲ TR_élevé), en présence du milieu BA basal modifié 100 RPM et à 55°C, avec supplémentation en H2 et CO2.
[0085] [Fig. 3] La figure 3 représente l’évolution du nombre total d’archées et de bactéries en absence (sans support, gauche) ou en présence de supports de culture à un taux de remplissage faible (TR_faible, centre) ou élevé (TR_élevé, droite) de supports de culture en polyéthylène. La culture en bioréacteur agité est réalisée en présence du milieu BA basal modifié, à 100 RPM et à 55°C, avec supplémentation en H2 et CO2.
[0086] [Fig. 4] La figure 4 représente une image d’un catalyseur de méthanation en biochips de polyéthylène prise au MEB à 0 jours de croissance de Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405, en milieu BA modifié, à 55°C avec supplémentation en H2 et CO2.
[0087] [Fig. 5] La figure 5 représente une image d’un catalyseur de méthanation en biochips de polyéthylène prise au MEB à 14 jours de croissance de Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405, en milieu BA modifié, à 55°C avec supplémentation en H2 et CO2.
[0088] [Fig. 6] La figure 6 représente une image d’un catalyseur de méthanation en biochips de polyéthylène prise au MEB à 34 jours de croissance de Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405, en milieu BA modifié, à 55°C avec supplémentation en H2 et CO2.
EXEMPLES
[0089] D’autres avantages, buts et caractéristiques particulières de la présente invention ressortiront des exemples qui vont suivre, faits dans un but explicatif et nullement limitatif.
[0090] Dans les exemples qui vont suivre, les différents paramètres ont été mesurés par les techniques ci-après détaillées :
[0091] Mesure de la tolérance du au moins un micro-organisme méthanogène à une exposition au dioxygène (O2) [0092] Plusieurs expositions à l’air libre d’une durée de 1 min, 10 min, 30 min, 60 min et 180 min sont réalisées dans l’enceinte d’une hotte à flux laminaire (PSM II Cytosafe, Faster).
[0093] Pour chaque durée d’exposition, trois flacons contenant 30 mL de milieu de culture comprenant le au moins un microorganisme méthanogène sont inoculés avec 3 mL d’un milieu de culture comprenant au moins un microorganisme méthanogène en phase exponentielle de croissance. Pour rétablir l’anaérobiose, l’C>2 est éliminé en purgeant les flacons avec le mélange H2/CO2, la pression est ensuite ajustée à 1 ,5 bar. Les cultures sont incubées à 55°C pendant 10 jours. La capacité à croitre de nouveau après exposition à l’C>2 est suivie par le dosage du CP et par spectrophotométrie (Cell Density Meter, Fisherbrand).
[0094] Mesure de la composition de la phase gaz
[0095] La composition de la phase gaz est analysée en continue par chromatographie gazeuse (analyseur Agilent, Technologies 3000A®) équipé de deux modules de séparation et d'un détecteur de conductivité thermique (TCD). Le module A équipé d’un tamis moléculaire 5Â permet de séparer l’hydrogène, l’azote, l’oxygène et le méthane, sous flux d’argon. Le module B équipé d’une colonne PoraPlot U (Agilent) permet la séparation du dioxyde de carbone et du sulfure d’hydrogène, sous flux d’hydrogène. Un filtre hydrophobe est placé en entrée d’analyseur afin de le protéger de l’humidité. Les analyses gaz du bioréacteur sont réalisées toutes les heures.
[0096] Mesure da la teneur en métabolites et acides organiques
[0097] La teneur en métabolites et acides organiques est analysée par chromatographie liquide (HPLC Agilent Technologies, 1260 Infinity). La séparation est assurée par deux colonnes d’exclusion ionique (Rezex ROA 300x7, 8 nm, Phenomenex, USA) montées en série et chauffées à 50°C. Le détecteur utilisé pour identifier les différents composés est un réfractomètre (HP série 1100). La phase liquide est constituée d’une solution d’acide sulfurique (2 mM) circulant à un débit de 0,7 mL/min. Avant injection, les échantillons sont déprotéinisés. Un volume de 1 mL d’échantillon de culture est mélangé à 125 pL de Ba(OH)2 8H2O (0,3 M) et 125 pl de ZnSO 7H2O (5% p/v) et centrifugé (5 min ; 10 000 g). Le surnageant est ensuite filtré à 0,22 pm et transféré dans un vial d’HPLC conservé à 4°C avant injection.
[0098] Mesure de la croissance des microorganismes [0099] L’évolution de la croissance des microorganismes est suivie par spectrophotométrie (llvisco, V-1800) à 600 nm.
[00100] Observation microscopique
[00101] Un volume de 0.5 ml d’une culture sur milieu BA (Basal anaerobic) décrit par Bu et al., (référence 1) puis modifié, ont été prélevés puis fixés avec une solution de formaldéhyde (2%, concentration finale). Les cellules ont ensuite été culottées par centrifugation à 18000 g (20 min, 14°C) sur des grilles en cuivre de 400 mailles recouvertes de carbone (Formvar, Pelanne Instruments, France) puis contrastées par immersion dans 20 pL d’acétate d’uranyle à 2%. Après rinçage à l’eau distillée et séchage sur papier absorbant, les observations ont été réalisées au microscope électronique à transmission (MET) JEOL 2100 plus (Akishikma, Tokyo, Japon, Plateforme UCA Partner CYSTEM) équipé d'une caméra Gatan CMOS RIO 9 (Gatan Ametek, Pleasanton, USA) à une tension d'accélération de 80 kV. Les échantillons issus des supports de culture ont été fixés avec une solution comprenant du glutaraldéhyde à 2.5% et du rouge de ruthénium à 0.15%, en tampon cacodylate de sodium 0.2M, pH 7.4 pendant une nuit à 4°C. Après rinçage dans le même tampon (3x10min), ils sont post-fixés 1h à température ambiance avec de l'acide osmique à 1 % en tampon cacodylate de sodium 0.2M, pH 7.4. Puis les échantillons sont rincés à l'eau distillée pendant 20 minutes et déshydratés par des bains d'éthanol de degré croissant (25° à 100°), 10 minutes/bains. La dernière étape de déshydratation s'effectue avec un mélange VA/ éthanol 1007 hexaméthyldisilazane pendant 10 minutes puis hexaméthyldisilazane pur (évaporation la nuit sous sorbonne). Les échantillons sont ensuite déposés sur un plot métallique à l'aide d'un scotch carbone double face. Une métallisation au chrome (5nm) est effectuée avec le métalliseur Quorum Q150 TES Plus. Les observations sont réalisées à l'aide du microscope électronique à balayage Hitachi Regulus 8230 à une tension d’accélération de 1 kV et avec le détecteur d’électrons secondaires.
[00102] Exemple 1 : Evaluation de la tolérance de la souche Methanothermobacter marburgensis Clermont DSM 34405 à une exposition au dioxygène (O2)
[00103] La simplification d’un consortium issu d’une unité de méthanisation (Ennezat, 63) par sélection des micro-organismes hydrogénotrophes a permis l’isolement d’une nouvelle souche méthanogène surproductrice de méthane. [00104] Pour isoler la souche archéenne ayant la teneur la plus élevée dans le bioréacteur, un échantillon de 50 mL du consortium issu du digestat d’une unité de méthanisation (Ennezat, 63) est prélevé en conditions stériles et anaérobies. Dans certains cas, l’échantillon est cultivé en condition sélective des souches hydrogénotrophes méthanogènes, en présence d’un mélange H2/CO2 dans un ratio 4/1 à une température de 55°C durant une période de 6 semaines. Après une incubation de 72 heures à 55°C (température du bioréacteur), un repiquage est réalisé dans un milieu BA modifié (inoculation à 10% : 0.5 mL d’inoculum dans 5 mL de milieu de culture). Des dilutions sérielles (de 10-1 à 10-10) sont effectuées en respectant les conditions physicochimiques du bioréacteur (55°C, 1 ,5 bar et pH=7,5). Le tube de la dernière dilution positive (turbidité et production de CH4) sert d’inoculum pour ensemencer la série suivante. La croissance est suivie par spectrophotométrie (Cell Density Meter, Fisherbrand) et le dosage des gaz par micro-chromatographie (analyseur Agilent, Technologies 3000A®) équipé de deux modules de séparation et d'un détecteur de conductivité thermique (TCD). Le module A équipé d’un tamis moléculaire 5Â permet de séparer l’hydrogène, l’azote, l’oxygène et le méthane, sous flux d’argon. Le module B équipé d’une colonne PoraPlot U (Agilent) permet la séparation du dioxyde de carbone et du sulfure d’hydrogène, sous flux d’hydrogène, en phase gazeuse. Un isolement sur milieu solide est réalisé ensuite en adoptant la méthode de Roll-tube (Hungate,1969). Pour cela, 0,1 g d’agar-agar (BactoTM Agar) sont ajoutés à 5 mL de milieu BA modifié (tube Hungate), sous flux de N2, puis autoclavés. Le milieu gélosé est ensuite liquéfié dans un bain-marie à 100°C, puis placé à 45°C dans le but de ralentir sa gélification. Après inoculation par la dernière série de dilution positive en milieu de culture, le milieu gélosé est disposé uniformément en une couche fine sur la face interne du tube grâce au mouvement rotatif du tube Spinner et en se servant d’un glaçon sur la face externe pour solidifier le milieu. Les tubes sont ensuite incubés à 55°C pendant 168 heures en position verticale pour éviter la contamination des colonies du fait de la condensation. Les tubes montrant la présence d’une entité mère de microorganisme (colonie), visible à l’œil nu, comprenant un grand nombre de micro-organismes identiques, et une production de CP , sont ouverts dans une chambre anaérobie à atmosphère contrôlée (pression atmosphérique) pour prélever des colonies à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Les colonies sont remises en suspension dans 5 mL de milieu de culture. La pureté des cultures liquides est confirmée en réalisant plusieurs dilutions sérielles successives (10-1 à 10-5) et des vérifications au microscope optique (Labophot, Nikon). Des analyses peuvent être réalisées sur la souche ainsi isolée.
[00105] Tableau 1 : Influence de l’exposition au dioxygène sur la croissance et l’activité métabolique de l’isolat Methanothermobacter marburgensis CLERMONT
DSM 34405
[Table 1]
[00106] Il apparait que l’exposition au dioxygène selon la méthode décrite précédemment n’a pas eu d’effet significatif sur la croissance et les activités hydrogénotrophe et méthanogène de la souche Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 entre 0 et 60 min d’exposition. Un faible retard de croissance est observé après 180 min d’exposition au dioxygène (Tableau 1 ). La performance méthanogène de la souche Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 n’étant pas ou peu affectée par l’exposition à l’oxygène et donc l’air, les différentes modalités de passage de l’étape a) à l’étape b) peuvent être réalisées dans des conditions non anaérobie sans impact sur les étapes c), d) et e). [00107] Exemple 2 : Evaluation du catalyseur de méthanation issu de l’étape a) du procédé selon l’invention
[00108] Le procédé de production de méthane ex-situ mis en œuvre comprend l’étape suivante : a) mise en contact d’un consortium, d’un support de culture en biochips de polyéthylène et d’un milieu de culture.
[00109] Le consortium issu d’une unité de méthanisation (Ennezat, 63) est prélevé à partir de la cuve de méthanisation. L’échantillon liquide ou digestat est tamisé (5 mm) afin de retirer les solides > 5 mm et congelé.
[00110] Le milieu de culture utilisé est dérivé du milieu BA décrit par Bu et al., 2018 et sa composition est décrite dans le tableau 2. Le milieu de culture est ajusté à pH 7,5 avec une solution de NaOH 3 M.
[00111 ] Tableau 2 : Liste des composés du milieu BA modifié.
[Table 2]
00112] La cinétique de colonisation des supports de biochips en polyéthylène par Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 est suivie par imagerie MEB (FEG SEM, Hitachi Regulus 8230). Le processus débute lorsque les microbes associés à la surface passent d'un mode d'attachement réversible (pouvant être décroché sans remise en cause de l’intégrité) à un mode d'attachement irréversible, suivi de l'agrégation des cellules et de leur prolifération ultérieure. Les cellules du biofilm sont enfermées dans une matrice de polymères de type EPS (substances polymériques extracellulaires). L’observation au MEB permet de visualiser les grains d’EPS, la matrice, les cellules ainsi que des structures filaires appelés fibraeum.
[00113] Les figures 4, 5 et 6 illustrent que la souche Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 se développe au cours du temps lorsqu’elle est mise en présence d’un support de culture en biochips de polyéthylène.
[00114] De plus, il apparait que la souche Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 se développe plus efficacement lorsqu’elle est mise en présence d’un support de culture selon l’invention en présence de dihydrogène et de dioxyde de carbone. En effet, la densité optique des échantillons au cours du temps est inférieure dans le cas où un support de culture est présent (figure 2).
[00115] Par ailleurs, une analyse de la croissance des microorganismes par spectrophotométrie (UVisco, V-1800) à 600 nm indique que le nombre de microorganisme après 24 jours de colonisation est trois fois supérieur en présence d’un support de culture de biochips en polyéthylène (figure 3).
[00116] Ces résultats permettent de conclure que le procédé selon l’invention permet d’obtenir un meilleur rendement en méthanation. En effet, il y a une meilleure croissance des micro-organismes lorsque ces derniers sont fixés sur un support de culture.
[00117] Exemple 3 : Dispositif de mise en œuvre du procédé selon l’invention [00118] Le procédé de production de méthane ex-situ mis en œuvre selon l’invention comprend aussi les étapes suivantes : b) introduction du mélange obtenu à l’étape a) ( exemple 2) dans un bioréacteur gaz/liquide ; c) mise en contact de gaz entrants dans le bioréacteur gaz/liquide obtenu à l’étape b) ; d) réaction des gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène ; e) récupération de gaz sortants obtenus à l’étape d) ; caractérisé en ce que
- le support de culture est non immobilisé dans le bioréacteur gaz/liquide ; et
- au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture. [00119] Dans le présent exemple, le dispositif tel que décrit sur la figure 1 permet la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
[00120] Le bioréacteur de l’étape b) a été construit à façon à partir d'une section d'un cylindre en inox 316 d’épaisseur 2 mm. Il possède un diamètre interne de 54 mm et une hauteur de 1400 mm. Le rapport hauteur/diamètre du bioréacteur gaz/liquide de type colonne à bulle est 25,9. Le volume de la cuve est de 3,5 L. Un distributeur de gaz de type fritté verre ou inox de porosité connue est couplé au réacteur à l’aide d’un raccord tri-bague GL18. La sortie des gaz se fait par une ouverture au sommet de la colonne, couplée au circuit de gaz par un filetage VÀG. La sortie de gaz du réacteur est reliée à un condenseur dans lequel circule de l’eau à 4°C (Lauda Eco RE1225 silver). Un débitmètre volumique de haute précision (Bioprocess control / Microflow 1100-3100) mesure le débit de gaz sortant du condenseur. Le gaz est ensuite analysé par chromatographie gazeuse (analyseur Agilent, Technologies 3000A®). Un système de recirculation du milieu de culture basé sur l’utilisation d’une pompe péristaltique (pompe AB, Type PSF2) permet une circulation de liquide à contre-courant des bulles de gaz ascendantes, à une vitesse volumétrique horaire de 10 L/Lréacteur/h, ce qui est équivalent à 0,166 L/Lréacteur/min. La boucle de recirculation liquide comprend une électrode permettant de mesurer le potentiel d’oxydo-réduction, le pH et la température (Mettler Toledo INPR04260i/SG/120 52005381 ). Le pH étant régulé à 7,5 si nécessaire par l’ajout de titrants acides ou basiques. La température de 55 °C est contrôlée à l’aide d’un bain thermostaté (Lauda Eco RE1225 silver). Le système de recirculation est muni d’un septum pour la prise d’échantillon, l’ajout de solutions stocks (constituants du milieu de culture, Na2S 9H2O) ou le soutirage de volume de milieu de culture.
[00121 ] Les gaz entrants de l’étape c) sont le dihydrogène et le dioxyde de carbone. Ils sont injectés dans le bioréacteur à un débit total de gaz augmentant progressivement de 3,61 à 18,21 NL/Lréacteur/jour pour CO2 et augmentant progressivement de 14,37 à 72,85 NL/Lréacteur/jour pour H2 grâce à des débitmètres massiques (Brooks instrument, SLA5800), tels qu’indiqué dans le tableau 3 ci- dessous. Le rapport H2/CO2 est ajusté, si nécessaire, pour obtenir une valeur de 4/1 ±0,1. La pression du système est de 1 bars. Le mélange de gaz est distribué en continu par un diffuseur, à contre-courant du flux de la phase aqueuse.
[00122] Les gaz sortants de l’étape e) sont principalement constitués de méthane et de la vapeur d’eau (la vapeur d’eau étant recondensée). Ils sont récupérés du bioréacteur à un débit total de gaz sortant augmentant progressivement de 5,52 à 18,67 NL/Lréacteur/jour, tel qu’indiqué dans le tableau 3 ci-dessous.
[00123] Tableau 3 : Evolution du débit spécifique entrant de CO2 et de H2 et de la production spécifique en CH4 (exprimés en NL/Lréacteur/jour) en fonction de l’âge de la culture (exprimée en jour).
[Table 3]
[00124] Au regard des résultats de l’exemple 2, le procédé selon l’invention mis en œuvre par le dispositif de la figure 1 permet l’obtention de rendement de méthane supérieur aux procédés classiques. En effet, l’augmentation de pression dans le système augmente la solubilité de l’hydrogène dans le milieu de culture. La présence de supports colonisés par au moins un microorganisme méthanogène augmente la quantité de catalyseur par unité de volume de réacteur. Le au moins un microorganisme méthanogène cultivé est sélectionné pour sa capacité à produire du méthane. La présence de supports colonisés par au moins un microorganisme méthanogène augmente le temps de séjour du gaz dans le milieu de culture et favorise la solubilité de l’hydrogène dans le liquide. Il permet d’augmenter d’un facteur 3,6 les performances du système.
Références bibliographiques
[00125] Référence 1 : Bu, F.; Dong, N.; Kumar Khanal, S.; Xie, L; Zhou, Q. Effects of CO on Hydrogenotrophic Methanogenesis under Thermophilic and Extreme- Thermophilic Conditions: Microbial Community and Biomethanation Pathways.
Bioresource Technology 2018, 266, 364-373, doi:10.1016/j.biortech.2018.03.092.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Procédé de production de méthane ex-situ comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d’au moins un micro-organisme méthanogène, d’un support de culture et optionnellement d’un premier milieu de culture et; b) introduction du mélange obtenu à l’étape a) dans un bioréacteur gaz/liquide comprenant optionnellement un deuxième milieu de culture; c) mise en contact de gaz entrants dans le bioréacteur gaz/liquide obtenu à l’étape b) ; d) réaction des gaz entrants avec le au moins un micro-organisme méthanogène ; e) récupération de gaz sortants obtenus à l’étape d) ; caractérisé en ce que
- le support de culture est immobilisé ou non dans le bioréacteur gaz/liquide ; et
- au moins un micro-organisme méthanogène est fixé sur le support de culture.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les gaz entrants sont le dioxyde de carbone, CO2, et le dihydrogène, H2, de préférence en un ratio volumique H2/CO2 compris entre 3/1 et 5/1 , et plus préférentiellement de 4/1 .
[Revendication 3] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le au moins un micro-organisme méthanogène est un consortium ou une souche méthanogène pure.
[Revendication 4] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le au moins un micro-organisme méthanogène comprend un micro-organisme appartenant au règne des euryarchéotes et choisi parmi les classes des Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri ou Methanomicrobia.
[Revendication 5] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le au moins un micro-organisme méthanogène comprend au moins une souche de Methanothermobacter, de préférence la souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405.
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bioréacteur gaz/liquide (11 ) est choisi parmi un réacteur à agitation pneumatique et à circulation de liquide descendante.
[Revendication 7] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support de culture (122) comprend des cubes poreux en mousse de polyuréthane imprégnée de charbon actif en poudre, des biochips rigides de polyéthylène, de la sépiolite, de la pouzzolane et/ou du verre poreux.
[Revendication 8] Dispositif (1 ) de production de méthane ex-situ comprenant :
- un bioréacteur gaz/liquide (11 ) comprenant une cuve (12), une entrée de gaz (13), une sortie de gaz (14), une entrée de liquide (15) et une sortie de liquide (16), au moins un micro-organisme méthanogène (121 ) fixé sur un support de culture (122), immobilisé ou non, et un milieu de culture (123);
- un moyen d’injection de gaz (17) permettant d’injecter des gaz entrants dans ladite phase liquide continue contenue (123) dans le bioréacteur gaz/liquide (11 );
- un moyen d’injection de liquide (18) permettant d’injecter ladite phase liquide continue (123) dans le bioréacteur gaz/liquide (11 );
- un moyen de récupération (19) permettant de récupérer des gaz sortants issu du bioréacteur gaz/liquide (11 ).
[Revendication 9] Dispositif selon la revendication 8, dans lequel le bioréacteur gaz/liquide (11 ) est choisi parmi une colonne à bulles, une colonne à agitation mécanique, un réacteur à cuve agitée à flux continu (CSTR), un réacteur airlift, un réacteur à lit fixe noyé, un réacteur à lit arrosé, un réacteur à agitation pneumatique, à circulation de liquide descendante.
[Revendication 10] Dispositif selon la revendication 8 ou 9, dans lequel le bioréacteur gaz/liquide (11 ) est choisi parmi un réacteur à agitation pneumatique et à circulation de liquide descendante.
[Revendication 11 ] Dispositif selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel le support de culture (122) est organique ou inorganique, d’origine naturelle ou synthétique.
[Revendication 12] Dispositif selon la revendication 8 à 11 , dans lequel le support de culture (122) comprend des cubes poreux en mousse de polyuréthane imprégnée de charbon actif en poudre, des biochips rigides de polyéthylène, de la sépiolite, de la pouzzolane et/ou du verre poreux, de préférence des cubes poreux en mousse de polyuréthane imprégnée de charbon actif en poudre et/ou des biochips rigides de polyéthylène.
[Revendication 13] Dispositif selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, dans lequel le au moins un micro-organisme méthanogène (121 ) comprend au moins une souche de Methanothermobacter, de préférence la souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405.
[Revendication 14] Kit d’obtention du dispositif (1 ) selon l’une quelconque des revendications 8 à 13, comprenant :
- un support (122) ;
- au moins un micro-organisme méthanogène (123) ;
- optionnellement un bioréacteur gaz/liquide (11 ) ;
- optionnellement un moyen d’injection de gaz (17) ;
- optionnellement un moyen d’injection de liquide (18) ;
- optionnellement un moyen de récupération (19).
[Revendication 15] Kit selon la revendication 14, dans lequel le support de culture (122) comprend des cubes poreux en mousse de polyuréthane imprégnée de charbon actif en poudre, des biochips rigides de polyéthylène, de la sépiolite, de la pouzzolane et/ou du verre poreux.
[Revendication 16] Utilisation de la souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405 pour la production de méthane.
[Revendication 17] Catalyseur de méthanation comprenant au moins un microorganisme méthanogène 123 fixé sur un support 122, de préférence le microorganisme méthanogène est une souche de Methanothermobacter marburgensis CLERMONT DSM 34405.
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