EP4605554A1 - Kombinierte zellspezifische markierung und anreicherung von biomarkern - Google Patents

Kombinierte zellspezifische markierung und anreicherung von biomarkern

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EP4605554A1
EP4605554A1 EP23785985.5A EP23785985A EP4605554A1 EP 4605554 A1 EP4605554 A1 EP 4605554A1 EP 23785985 A EP23785985 A EP 23785985A EP 4605554 A1 EP4605554 A1 EP 4605554A1
Authority
EP
European Patent Office
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microcavity
cell
amplification
primer
biomarker
Prior art date
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Pending
Application number
EP23785985.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Anke Timm
Samir KADIC
Christian GRUMAZ
Sebastian PILSL
Michael Knapp
Astrid LUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4605554A1 publication Critical patent/EP4605554A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Definitions

  • a biomarker is a measurable biological characteristic with prognostic or diagnostic significance. In molecular diagnostics, diseases can be detected on the basis of nucleic acid biomarkers and appropriate therapies can be initiated. These biomarkers can be deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) biomarkers.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • Droplet-based, microtub-based or valve-based microstructured substrates are known with which cells can be spatially isolated.
  • none of these systems meets the requirements of carrying out a highly parallelized enrichment of DNA and/or RNA-encoded biomarkers with a clear molecular labeling of the target amplificates in just a few process steps in order to be able to carry out point-of-care analyses, for example.
  • a microfluidic device as described in the as yet unpublished application with the file number 102022203848.7 is provided.
  • This has at least one carrier substrate for receiving a sample liquid.
  • the carrier substrate has at least one microcavity and furthermore at least one electrode which is arranged on or in the microcavity in order to generate an electric field which is designed to capture a cell, in particular a nucleated cell, and/or a primer particle in the microcavity.
  • the DEP cages can be implemented using active components, such as transistors or memory elements. These are integrated within individual electrodes using Complementary Metal Oxide Semiconductor technology (CMOS technology).
  • CMOS technology Complementary Metal Oxide Semiconductor technology
  • step f conditions are created which lead to lysis of the cell and to release of the primers from the primer particle.
  • Such conditions are created, for example, by increasing the temperature, for example to above 70°C for more than one minute, and/or by electroporation and/or by ultrasound and/or by other conditions or reagents which promote this reaction, which have been introduced, for example, by means of the amplification mixture.
  • step g) the at least one primer population binds to biomarker regions of the DNA and/or RNA which were released from the cell during cell lysis, so that an amplification of the biomarker target region occurs and the biomarker target amplificate is cell-specifically labeled.
  • different populations of primers are reversibly coupled to the primer particle.
  • the primer particle comprises, for example, a polystyrene, in particular in the form of a polystyrene bead.
  • the different primer populations are in particular biomarker-specific forward primers (Specific Forward Primer, SFP), biomarker-specific reverse primers (Specific Reverse Primer, SRP) and/or randomized primers (Random Primer, RP).
  • the primer populations are coupled to the primer particle, for example, via base pairings that can be dissolved by certain temperatures or via specific sequences or other chemical modifications in the base composition that can be dissolved by enzymes or light of a certain wavelength.
  • This can be, for example, a cleavage site for a restriction enzyme or the base analogue dUTP for the uracil-DNA glycosylase (UDG).
  • the selection marker enables subsequent positive selection of the biomarker target amplification products.
  • the universal sequence is required, for example, for subsequent amplification of a sequencing library or a known sequence with a function of choice, such as a restriction site, in particular for releasing the biomarker target amplification product from a capture molecule, for example.
  • Another advantage is that, since the individual biomarker target amplification products are marked with a cell barcode, they can be clearly assigned to the individual cells. Further analyses of a large number of cells, for example of a molecular genetic nature using NGS, in which relevant biomarkers can be assigned to the individual cells, for example from isolated cells from tissue biopsies, can be of great benefit, for example in the diagnosis and therapy monitoring of tumor patients.
  • biomarker target region several, in particular 2-4, SFP and SRP with different specific forward and reverse target sequences flanking the biomarker target region are used for each biomarker target region. These can also be used in different concentrations, for example.
  • the advantage here is that, for example, with an increasing number of SFPs or SRPs per biomarker target region, not only the amplification rate but also the chances of binding of the SFPs or SRPs to the target region increase or, in another example, by adjusting the concentration of the SFPs or SRPs of individual biomarker target regions that are, for example, more difficult to amplify, a more uniform amplification is achieved compared to other biomarker target regions.
  • the random primers are supplied with the amplification mixture for amplification, in particular for an ssMDA (described below).
  • ssMDA ssMDA
  • the advantage here is that the target amplificates are produced directly on the primer particle and can be held (captured) by means of the DEP forces after removal of the non-aqueous phase and purified directly in the microcavity.
  • no capture molecules are necessary, since the amplification of the biomarker target region takes place via the SFP and SRP bound to the primer particle.
  • a selection marker can be omitted here.
  • the universal sequence of the SFP and SRP is selected such that a direct linkage point in the form of a specific sequence is introduced for further amplification, in particular for the completion of a sequencing library.
  • the advantage here is that additional amplification or preparation of the purified biomarker target amplificates is possible using other sequencing technologies, for example from another manufacturer.
  • the necessary asymmetric design can be implemented, for example, in such a way that all SFPs receive a first universal sequence and all SRPs receive a second universal sequence that differs from the first universal sequence.
  • all SFPs receive a first universal sequence
  • all SRPs receive a second universal sequence that differs from the first universal sequence.
  • a highly standardized PCR for example an index PCR
  • a flexible By using universal sequences, it can be ensured that the method is compatible with downstream, preferred analysis methods, such as various NGS technologies, for single-cell analysis.
  • the advantage here is that no individual process steps are required for cell lysis and mixing with the amplification mixture, and the respective reagents can be stored pre-mixed. This leads to time, reagent and cost savings. Furthermore, the reduced steps minimize dilution effects and losses that would otherwise result from repeated rinsing. This results in an increase in efficiency.
  • the amplification is an isothermal amplification, in particular a semi-specific multiple displacement amplification (ssMDA).
  • ssMDA semi-specific multiple displacement amplification
  • the ssMDA offers the option of simultaneously enriching DNA and RNA from minimal amounts both across the entire genome and the entire transcriptome, as well as preferentially amplifying and enriching individual biomarker-relevant regions, i.e. the biomarker target regions.
  • the SFP and SRP in the ssMDA have a single-strand break cleavage site.
  • This single-strand break cleavage site provides an additional amplification starting point for a polymerase after the single-strand break has been generated by a suitably added single-strand break-inducing endonuclease (nicking enzyme). This allows biomarker target amplification to continue at these sites without further primer hybridization, which increases processivity.
  • a single-strand break-inducing endonuclease is added to the polymerase.
  • the endonuclease is preferably selected from the group consisting of Nt.Alwl, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.Bsml, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI, Nt.BstNBI, Nb.BtsI and Nt.CviPII.
  • the RPs in ssMDA are preferably primers that have at least one modification selected from the group consisting of LNA (Locked Nucleic Acid), MGB (Minor Groove Binder), C-5 Propynyl-Deoxycytidine, C-5 Propynyl-Deoxyuridine, Aminoethyl-Phenoxazine-Deoxycytidine, 5-Methyl-Deoxycytidine, 2-Amino-Deoxyadenosine, Trimethoxystilbene, Pyrene and Spermine.
  • ZNA primers Zip Nucleic Acids
  • These are spermine-modified primers.
  • the ssMDA occurs isothermally, for example at temperatures between 40-72°C for more than 10 minutes.
  • an SD polymerase is preferably used.
  • the SD polymerase can, for example, be an enzyme mutant of the DNA polymerase of Bacillus subtilis phage Phi29, in particular Equi Phi29, or of Thermococcus litoralis, in particular Vent (exo-).
  • the SD polymerase Vent (exo-) has the advantage that it is stable and processive up to temperatures of 100°C. It can therefore be added before denaturing the DNA and/or RNA without being damaged by the high denaturation temperature. However, these SD polymerases do not exhibit RNA processivity.
  • the SD polymerase is preferably an enzyme mutant of the DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus. In addition to their processivity towards DNA, these SD polymerases also have processivity towards RNA. Particularly preferred enzyme mutants of the DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus are selected from the group consisting of Bst, Bst 2.0 and Bst 3.0. Among these enzyme mutants, Bst 3.0 has the highest RNA processivity, which is why Bst 3.0 is particularly preferred.
  • SD polymerase is a DNA polymerase that is suitable for isothermal amplification reactions and is already known for its high strand displacement activity in amplification reactions.
  • SD polymerase has several advantages. It enables isothermal amplification. In addition, some SD polymerases tolerate high temperatures during isothermal amplification, which increases the reaction speed to such an extent that the reaction time can be significantly shortened. Finally, some SD polymerases can use RNA as a template for amplification in addition to DNA.
  • RNA as well as DNA it is preferable that at least one reverse transcriptase is also used in ssMDA. In particular, this is RTx or SSIV. In principle, however, all reverse transcriptases that process under similar reaction conditions to the SD polymerase used are conceivable. This specifically supports the amplification of RNA, so that the required amplification period can be shortened even further. If an SD polymerase is used that does not have RNA processivity, then the use of a reverse transcriptase is necessary in order to process RNA as well as DNA.
  • the DNA and/or RNA to be amplified is denatured, in particular by heating to a suitable temperature.
  • a suitable temperature for example Vent (exo-) polymerase
  • the Denaturation preferably at a temperature in the range of 75°C to 98°C and most preferably at a temperature in the range of 80°C to 95°C.
  • the heating is carried out for a period of more than 10 seconds, most preferably for a period in the range of 30 seconds to 120 seconds.
  • temperatures of 65-85°C are preferably used, and particularly preferably temperatures of 72-80°C.
  • the primers for hybridizing the single-stranded DNA and/or RNA can preferably be brought together with the DNA and/or RNA before denaturation, particularly preferably by already dissolving them in the amplification mixture.
  • the hybridization of the primers to the DNA and/or RNA single strands then preferably takes place at a temperature in the range of 4°C to 65°C for a period of time that is preferably more than 10 seconds.
  • the ssMDA is preferably carried out at a constant temperature with a value in the range of 40°C to 72°C.
  • a preferred period of amplification is in the range of 10 minutes to 120 minutes. The higher the temperature during amplification, the faster it proceeds and the shorter the amplification period can usually be advantageously chosen.
  • ssMDA DNA and RNA biomarkers can be simultaneously amplified and enriched from single cells in the same reaction compartment, which represents an enormous improvement and simplification of biomarker enrichment, also with regard to the effort required, the duration of the experimental procedure, the number of work steps and the associated costs.
  • the amplification is carried out using a reverse transcriptase PCR.
  • a reverse transcriptase PCR for example, only one SFP and SRP are used per biomarker target region.
  • the amplification mixture comprises, for example, a Taq polymerase and a reverse transcriptase.
  • an amplification reaction is understood to mean the reaction solution in the reaction compartment after the amplification.
  • the at least one microcavity has a further opening in the wall, in particular one directed downwards.
  • a further opening is closed, for example, by an actuatable membrane during the reaction.
  • the further opening is opened or the actuatable membrane is removed in order to transfer the amplification reaction, in particular downwards, into a microfluidically connected system and to combine the individual amplification reactions if necessary.
  • the microfluidically connected system is, for example, a microfluidically connected reaction chamber with a volume of, for example, 20 pl.
  • the biomarker target amplificates can be further enriched and purified, for example.
  • the biomarker target amplificates are amplified again with the universal sequence if necessary and read out, for example, using NGS.
  • the biomarkers can be clearly assigned to the individual cells again using the cell barcode sequence queried during the readout.
  • the biomarker target amplificates are purified using capture molecules, in particular using capture molecules immobilized on magnetic beads.
  • the capture molecules in particular streptavidin, bind, for example, to the selection marker of the SFP and SRP, in particular biotin.
  • appropriate binding conditions are created for the capture molecules and the biomarker target amplificates comprising the selection marker, and a "bind-wash-elute" process that can be carried out according to known protocols is used.
  • a restriction enzyme can also release the biomarker target amplificates, for example from the capture molecule.
  • a prerequisite for this is that corresponding interface sequences are incorporated into the SFP and SRP in the universal sequence.
  • the protelomerase TelN or an enzyme mutant thereof is used when eluting the biomarker target amplificates from the capture molecule, which covalently links the two single-stranded molecules of the DNA double helix (sense and antisense strands) at the interface, leaving behind a hairpin structure.
  • a hairpin structure is required, for example, for the production of NGS libraries, for example for the sequencing library of the sequencing technology from Pacific Biosciences. The advantage here is that no further steps for adapter ligation need to be carried out.
  • biomarker target amplifications can be achieved using isothermal rolling circle amplification (RCA) without the need for additional sample preparation steps for the amplification.
  • RCA isothermal rolling circle amplification
  • the cells are circulating tumor cells (CTCs).
  • CTCs circulating tumor cells
  • the molecular genetic single cell analysis of these CTCs is, for example, a highly sensitive option for monitoring the therapy of cancer patients in order to collect information early on about the course of therapy (prognostic) and about the adjustment of therapy (diagnostic).
  • the rare CTCs (for example 10 1 to 10 2 per mL of blood; individually or a few as a pool) must be isolated from a high background of "healthy" blood cells (>10 6 leukocytes, >10 9 erythrocytes per mL of blood).
  • the genetic material of these individual, isolated cells must be pre-amplified in order to generate sufficient input for subsequent analyses.
  • the method according to the invention eliminates process steps for pre-amplification of the DNA and/or RNA of the CTCs, as well as previous steps for merging several pre-sorted cells, which significantly shortens the process time, requires fewer work steps, requires fewer reagents and thus also results in lower costs.
  • the invention further relates to a computer program configured to carry out and/or control the steps of the microfluidic method, as well as a machine-readable storage medium on which the computer program is stored.
  • Fig. 1 the schematic representation of an embodiment of a method according to the invention for the combined cell-specific labeling and enrichment of biomarkers in a reaction compartment
  • Fig. 2 Schematic representation of a biomarker-specific forward or
  • Figure 1 shows the method according to the invention for the combined cell-specific labeling and enrichment of biomarkers in a reaction compartment in an embodiment, which is described using an isothermal ssMDA.
  • a device with which the method according to the invention can be carried out is described in the as yet unpublished German application with the file number 102022203848.7.
  • This device has a carrier substrate for receiving a sample liquid.
  • the carrier substrate has at least one microcavity 110 and furthermore at least one electrode which is arranged on or in the microcavity 110 in order to generate an electric field which is designed to capture a cell 510, in particular a nucleated cell 510, and/or a primer particle 512 and/or another particle in the microcavity 110.
  • Figure 1 of the present invention shows only one microcavity 110 of this device.
  • a first sample liquid with cells 510 is introduced into the microfluidic device or placed on the carrier substrate.
  • the cells 510 sediment in the direction of the microcavities.
  • the DEP cage is switched to an open state or switched off so that this cell 510 can enter the microcavity.
  • the DEP cage is closed again so that no further cells can enter it and a maximum of one cell is contained per microcavity.
  • the sample liquid is flushed away.
  • the DEP cage remains closed so that the cell 510 is held until further notice.
  • a cell 510 with a cell nucleus 511 here for example a CTC
  • a second sample liquid with primer particles 512 is introduced into the microfluidic device or placed on the carrier substrate.
  • the first sample liquid located above the carrier substrate, which comprises the cells 510 is displaced.
  • the primer particles can also carry only the SFP and SRP and the RP are introduced via the amplification mixture in step S3.
  • an amplification mixture is then introduced into the microfluidic device or placed on the carrier substrate.
  • the second liquid with the unused primer particles 512 is removed from the carrier substrate beforehand and the amplification mixture is subsequently placed on the carrier substrate, or the liquid with the primer particles 512 is mixed directly with the amplification mixture on the carrier substrate.
  • the amplification mixture comprises a buffer with an SD polymerase 525 and deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), and optionally a reverse transcriptase and/or nicking enzyme.
  • dNTPs deoxyribonucleoside triphosphates
  • step S3 the diffusion-based distribution of the components or the polymerase 525 of the amplification mixture into the microcavity 110 is shown.
  • the DEP cage is closed, which is illustrated by the dashed line with the reference number 520, since the components of the amplification mixture do not represent entities with dielectric properties and can therefore pass through the DEP cage in a diffusion-based manner even when it is closed.
  • the microcavity 110 now contains the cell 510, the primer particle 512 and the SD polymerase 525 as well as other components of the amplification mixture.
  • a step S4 the amplification mixture above the at least one microcavity 110 is displaced by a non-aqueous phase 526, for example an oil phase or air, so that the microcavity 110 is closed in the region of its opening by the non-aqueous phase 526 and thus represents a closed reaction compartment in which the cell 510 and the primer particle 512 are enclosed with the amplification mixture.
  • a non-aqueous phase 526 for example an oil phase or air
  • a lysed cell 510a is shown from which the cell components, for example RNAs 539, have been released, as well as a lysed cell nucleus 511a, which has released the DNA 539 located therein.
  • Such conditions are, for example, achieved by a temperature increase to, for example, over 70°C for, for example, more than one minute and/or by electroporation and/or by ultrasound.
  • amplification reaction is carried out using ssMDA.
  • the random primers 516 bind undirected to regions of the DNA 539 and/or RNA 539, so that an isothermal, strand-displacement-based amplification of the total DNA 539 and/or RNA 539 can be carried out using the polymerases 525. This produces total DNA amplificates 539 and/or total RNA amplificates 539.
  • the SFP 517 binds to the DNA 539 and/or RNA 539 in a forward-facing manner up to 3 kb upstream of the biomarker target region 530, and the SRP 517 binds to the DNA 539 and/or RNA 539 in a backward-facing manner up to 3 kb downstream of the biomarker target region 530.

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Abstract

Es wird ein mikrofluidisches Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment beschrieben, umfassend nachfolgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer mikrofluidischen Vorrichtung, aufweisend zumindest ein Trägersubstrat zum Aufnehmen einer Probenflüssigkeit, wobei das Trägersubstrat zumindest eine Mikrokavität (110) aufweist, und weiterhin aufweisend zumindest eine Elektrode, die an oder in der Mikrokavität (110) angeordnet ist, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, das ausgebildet ist, um eine Zelle (510) und/oder ein Primer-Partikel (512) in der Mikrokavität (110) zu fangen, b) Beladen der zumindest einen Mikrokavität (110) der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Zelle (510) und Fangen dieser, c) Beladen der zumindest einen Mikrokavität (110) der mikrofluidischen Vorrichtung mit einem Primer-Partikel (512) umfassend zumindest eine an diesen gekoppelte Primerpopulation und Fangen des Primer-Partikels (512), wobei die Schritte b) und c) auch in umgekehrter Reihenfolge ablaufen können d) Einbringen einer Amplifikationsmischung in die zumindest eine Mikrokavität (110) e) Verdrängen der Amplifikationsmischung oberhalb der zumindest einen Mikrokavität durch eine nicht wässrige Phase, sodass die Mikrokavität (110) ein geschlossenes Reaktionskompartiment darstellt f) Herbeiführen von zelllysierenden und Primer (516, 517) freisetzenden Bedingungen, g) Binden der zumindest einen Primerpopulation (517) an Biomarker-Regionen der DNA (539) und/oder RNA (539) der lysierten Zelle (510a) zur zellspezifischen Markierung und Amplifikation einer Biomarker-Targetregion (530).

Description

Beschreibung
Titel
Kombinierte Zellspezifische Markierung und Anreicherung von Biomarkern
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrofluidisches Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern, sowie auf ein Steuergerät, eingerichtet die Schritte des Verfahrens auszuführen und/oder anzusteuern, nach Gattung der unabhängigen Ansprüche. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Computerprogramm.
Stand der Technik
Unter einem Biomarker wird ein messbares biologisches Merkmal verstanden mit prognostischer oder diagnostischer Aussagekraft. In der molekularen Diagnostik können Erkrankungen auf Basis von Nukleinsäure-Biomarkern nachgewiesen und entsprechende Therapien eingeleitet werden. Diese Biomarker können Desoxyribonukleinsäure- (DNA) oder Ribonukleinsäure- (RNA) Biomarker sein.
Dabei ist die Abfrage von gezielten, multiplen Biomarkern von hohem Wert und wird beispielsweise in der Infektionsdiagnostik, bei der beispielsweise simultan verschiedene Spezies oder in der Tumordiagnostik, bei der simultan verschiedene Mutationsstellen im Genom abgefragt werden, eingesetzt.
Die Zahl dieser so genannten Biomarker-Targets variiert je nach Assay von wenigen Dutzend bis zu mehreren Zehntausenden. Ziel dabei ist immer eine spezifische Anreicherung dieser Biomarker-Targets gegenüber dem nicht informativen, in der Regel aber hochkonzentrierten Hintergrund, um das Auslesen der Biomarker-Targets einfacher und robuster zu gestalten, beispielsweise mittels quantitativer Echtzeit- Polymerase Kettenreaktion (real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR), der Digitalen Polymerase- Kettenreaktion (Digital Droplet Polymerase Chain Reaction, ddPCR) oder Parallelsequenzierung (Next-Generation-Sequencing, NGS). Für die Anreicherung von Nukleinsäuren werden hauptsächlich zwei grundlegend verschiedene Prinzipien verfolgt - zum einen eine Multiplex-PCR mit spezifischen Primern bzw. Primerpaaren und zum anderen eine hybridisierungsbasierte, positive Selektion mit spezifischen Sonden. Jedoch ist diesen Anreicherungsverfahren gemeinsam, dass sie etliche, aufeinanderfolgende Prozessschritte beinhalten und mehrere Stunden bis zu einem Tag dauern können. Dies macht sie für den Einsatz am Point-of-Care in einer Lab-on-Chip- Umgebung ungeeignet. Zudem werden als Ausgangsmaterial mehrere Nanogramm der Nukleinsäuren benötigt, was beispielsweise bei Probenmaterial mit niedrigem Eintrag (low- input) eine zusätzliche Voramplifikation erfordert (Genomamplifikation, engl. Whole Genome Amplification, WGA und/oder Amplifikation des Ganztranskriptoms, engl. Whole Transcriptome Amplification, WTA), die wiederum zusätzliche Prozessschritte und Zeit kosten.
In zahlreichen Disziplinen der Biologie, wie beispielsweise der Immunologie, Neurobiologie, Onkologie- oder Stammzell- und Entwicklungsbiologie, ist man daran interessiert, möglichst viele (mehrere Hunderttausend bis Millionen) kernhaltige Zellen einer heterogenen Zellpopulation in möglichst kurzer Zeit (Stunden bis wenige Tage) auf Einzelzell-Ebene zu analysieren. Eine Einzelzell-Analyse kann dabei entweder molekular beispielsweise auf DNA-, RNA-, und/oder Protein- Ebene sowie funktional in Form von beispielweise Zellkultivierungen oder/und Medikamententests erfolgen?
Es sind Tröpfchen-basierte, Mikrowannen-basierte oder Ventil-basierte mikrostrukturierte Substrate bekannt mit welchen Zellen räumlich isoliert werden können. Jedoch erfüllt keines dieser Systeme die Erfordernisse mit wenigen Prozessschritten eine hochparallelisierte Anreicherung von DNA- und/oder RNA-kodierten Biomarkern bei einer eindeutigen molekularen Markierung der Target- Amplifikate durchzuführen, um beispielsweise am Point- of-Care- Analysen durchführen zu können.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein mikrofluidisches Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs bereitgestellt.
Eine Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben, ist in der noch nicht veröffentlichten, deutschen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022203848.7 mit Anmeldetag am 19.04.2022 und Prioritätstag am 20.04.2022 beschrieben. Der Inhalt dieser Anmeldung wird durch Bezugnahme auf diese Anmeldung in die Beschreibung eingeschlossen. Es sei angemerkt, dass zweifelsfrei erkennbar ist, dass die Merkmale dieser Anmeldung zur Lösung der der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden technischen Aufgabe beitragen.
Das Mikrofluidische Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment umfasst zumindest die Schritte a) - g).
In Schritt a) wird eine mikrofluidische Vorrichtung, wie sie in der noch nicht veröffentlichten Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022203848.7 beschrieben ist, bereitgestellt. Diese weist zumindest ein Trägersubstrat zum Aufnehmen einer Probenflüssigkeit auf. Das Trägersubstrat weist zumindest eine Mikrokavität auf und weiterhin zumindest eine Elektrode, die an oder in der Mikrokavität angeordnet ist, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, das ausgebildet ist, um eine Zelle, insbesondere eine kernhaltige Zelle, und/oder einen Primer-Partikel in der Mikrokavität zu fangen.
In diese mikrofluidische Vorrichtung können beispielsweise etwa 30.000, einzeln aktuierbare Mikrokavitäten bzw. Reaktionskompartimente pro Quadratzentimeter integriert sein. Diese Mikrokavitäten weisen beispielsweise eine quadratische Grundfläche auf und beispielsweise eine Kavitäten breite von etwa 50 pm. Die Mikrokavitäten sind beispielsweise in einer regulären Matrix angeordnet. Die Mikrokavitäten können einzelne Zellen und/oder Partikel einfangen oder abstoßen. Es können kontrolliert einzelne Zellen in eine Mikrokavität sedimentieren. Zudem können beispielsweise irrelevante Zellen aus den Mikrokavitäten entfernt werden, wohingegen relevante Zellen festgehalten werden können, indem mittels eines elektrischen Felds ein Dielektrophorese- Käfig (D EP- Käfig) in der Mikrokavität erzeugt wird, der in Abhängigkeit von der Stromstärke beispielsweise geöffnet, geschlossen oder abgeschaltet werden kann.
Die DEP-Käfige können beispielsweise durch aktive Bauelemente, beispielsweise als Transistoren oder Speicherelemente realisiert werden. Diese sind innerhalb einzelner Elektroden in Complementary Metal-Oxide-Semiconductor-Technologie (CMOS- Technologie) integriert.
In Schritt b) wird die zumindest eine Mikrokavität der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Zelle, insbesondere einer kernhaltigen Zelle, beladen und die Zelle in der Mikrokavität gefangen. Hierzu wird der DEP-Käfig durch eine Spannungsänderung geschlossen. Sich außerhalb des DEP-Käfigs befindliche weitere Zellen können diesen nicht länger betreten, während die Zelle innerhalb des DEP-Käfigs stabil gefangen ist. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass sich innerhalb der Mikrokavität nur eine einzige Zelle befindet.
In Schritt c) wird die zumindest einen Mikrokavität der mikrofluidischen Vorrichtung mit einem Primer- Partikel (engl. Primer-Bead) beladen und der Primer-Partikel in der Mikrokavität gefangen. Der Primer-Partikel umfasst beispielsweise zumindest eine an diesen gekoppelte Primerpopulation. Sobald der Primer-Partikel in die mit der Zelle befüllte Mikrokavität sedimentiert ist, wird der DEP-Käfig durch eine Spannungsänderung geschlossen. Sich außerhalb des DEP-Käfigs befindliche weitere Primer-Partikel können diesen nicht länger betreten, während die Zelle und der Primer-Partikel innerhalb des DEP-Käfigs stabil gefangen sind. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass sich innerhalb der Mikrokavität nur ein einziger Primer-Partikel befindet.
Die Schritte b), c) und d) können auch in einer beliebig vertauschten Reihenfolge ablaufen, insbesondere können die Schritte b) und c) in umgekehrter Reihenfolge ablaufen.
In Schritt d) wird eine Amplifikationsmischung in die zumindest eine Mikrokavität eingebracht. Hierzu diffundieren die sich in der Amplifikationsmischung befindlichen Bestandteile in die zumindest eine Mikrokavität.
Die Amplifikationsmischung umfasst einen für ihre Bestandteile kompatiblen Puffer, eine Polymerase, insbesondere eine SD- Polymerase, wie beispielsweise Bst, Bst2.0, Bst3.0, EquiPhi, Phi29, Vent exo- und/oder andere. Desweiteren umfasst die Amplifikationsmischung optional eine reverse Transkriptase (RT), bspw. RTx, SSIV und/oder andere. Außerdem umfasst die Amplifikationsmischung Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs) und/oder Analoge derer. Die dNTPs können zusätzlich modifiziert sein. Zudem kann die Amplifikationsmischung auch Bestandteile beinhalten, die die Amplifikationsreaktion und/oder eine Zelllyse und/oder eine Primer- Freisetzung beispielsweise positiv beeinflussen. Solche Bestandteile sind beispielsweise Additive wie Polyethylenglycol (PEG), Dithiothreitol (DTT), Detergenzen oder auch Enzyme wie Restriktionsenzyme oder Einzelstrangbruchinduzierende Enzyme (engl. Nicking Enzmyes).
In Schritt e) wird die Amplifikationsmischung oberhalb der zumindest einen Mikrokavität durch eine nicht-wässrige Phase, insbesondere durch eine Ölphase oder Luft, verdrängt, sodass die Mikrokavität im Bereich ihrer Öffnung durch die nicht-wässrige Phase geschlossen ist und somit ein geschlossenes Reaktionskompartiment darstellt. Umfasst die mikrofluidische Vorrichtung mehrere Mikrokavitäten, so stellen alle Mikrokavitäten voneinander isolierte und geschlossene Reaktionskompartimente dar, in welchen je eine Zelle und ein Primer-Partikel mit der Amplifikationsmischung eingeschlossen sind.
In Schritt f) werden Bedingungen herbeigeführt, welche zu einer Lyse der Zelle und zu einer Freisetzung der Primer von dem Primer-Partikel führen. Solche Bedingungen werden beispielsweise durch eine Erhöhung der Temperatur, beispielsweise auf über 70°C für beispielsweise mehr als eine Minute und/oder durch Elektroporation und/oder durch Ultraschall erzeugt und/oder durch andere dieser Reaktion förderlicher Bedingungen oder Reagenzien, die beispielsweise mittels der Amplifikationsmischung eingebracht wurden.
In Schritt g) bindet die zumindest eine Primerpopulation an Biomarker- Regionen der DNA und/oder RNA, welche bei der Zelllyse aus der Zelle freigesetzt wurden, sodass eine Amplifikation der Biomarker-Targetregion erfolgt und das Biomarker-Targetamplifikat zellspezifisch markiert ist.
Für die Amplifikation werden DNA-Doppelstränge und/oder Sekundär- und/oder Tertiärstrukturen der RNA denaturiert, sodass die DNA und/oder RNA als Einzelstränge vorliegen, beispielsweise mittels geeigneter Temperaturen. In einem weiteren Schritt lagern sich die Primer an die DNA und/oder RNA an, wodurch eine Amplifikation der entsprechenden DNA und/oder RNA initiiert wird.
Vorteilhaft hierbei ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren ein automatisiertes, Lab-on- Chip-taugliches Verfahren ist, mit dem DNA- und/oder RNA-kodierte Biomarker hoch parallelisiert angereichert werden können und das Biomarker-Targetamplifikat eindeutig via molekularem Zellbarcode seiner ursprünglichen Zelle zugeordnet werden kann. Die Biomarker-Targetamplifikate sind so für nachgeschaltete Nachweisverfahren, wie beispielsweise für NGS-Analysen, innerhalb weniger Minuten bis Stunden verfügbar, wodurch das Verfahren für Analysen am Point-of- Care geeignet ist.
Hierfür ist keine weitere Ausstattung notwendig.
Ein großer Vorteil ist außerdem, dass nur wenige Prozessschritte benötigt werden. Es entfallen beispielsweise eine vorherige Voramplifikation/ WGA/ WTA oder vorheriges Zusammenführen (Pooling) mehrerer vorsortierter Einzelzellen. Dies führt zu einer deutlichen Reduzierung der benötigten Prozesszeit, Reagenzien, Kosten und Arbeitsschritte.
Das Verfahren gewährleistet eine eindeutige Markierung jeder einzelnen Zelle, und somit eine nahezu 100%-ige Paarungseffizienz, bei einer ebenfalls nahezu 100%-igen Beladungseffizienz. Das bedeutet, dass jede Mikrokavität genau mit einer Zelle und genau mit einem Primer-Partikel beladen werden kann. Zudem können mehrerer Prozessschritte nacheinander ablaufen, da die Mikrokavitäten mehrfach be- und entladbar sind.
Die gleichzeitige Anreicherung der relevanten DNA- und/oder RNA- Biomarker- Targetregionen kann bei einem Parallelisierungsgrad von beispielsweise 30.000 Mikrokavitäten je cm2 erfolgen.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass das Probeneingabevolumen theoretisch unbegrenzt ist und verschiedene Proben eingegeben werden können, wie beispielsweise Blut oder Speichel. Zudem erlaubt es das Verfahren nur solche Zellen nachgeschaltet zu analysieren, die beispielsweise von Relevanz sind.
Desweiteren vorteilhaft ist, dass der in die Mikrokavität eingetretene Primer-Partikel zusammen mit der Zelle in der Mikrokavität gefangen ist und keine weiteren Zellen oder Primer- Partikel in die Mikrokavität eintreten können.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform sind an den Primer-Partikel verschiedene Populationen von Primern reversibel gekoppelt. Der Primer-Partikel umfasst beispielsweise ein Polystyrol, insbesondere in Form eines Polystyrol- Kügelchens. Die verschiedenen Primer-Populationen sind insbesondere Biomarker-spezifische vorwärts-gerichtete Primer (Specific Forward Primer, SFP), Biomarker-spezifische rückwärts-gerichtete Primer (Specific Reverse- Primer, SRP) und/oder randomisierte Primer (Random Primer, RP).
Die Kopplung der Primer-Populationen an den Primer-Partikel erfolgt beispielsweise über Basenpaarungen, die durch bestimmte Temperaturen gelöst werden können oder über spezifische Sequenzen oder sonstige chemische Modifikationen in der Basenzusammensetzung, die beispielsweise durch Enzyme oder Licht einer bestimmten Wellenlänge gelöst werden können. Dies kann beispielsweise eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym sein oder das Basenanalog dUTP für die Uracil-DNA Glycosylase (UDG).
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfassen die SFP und SRP je einen Selektionsmarker, gekoppelt an eine Universal-Sequenz, eine eindeutige Zellbarcode- Sequenz und entsprechend die Biomarker-Targetregionen flankierende spezifische Target- Sequenzen in forward- und reverse-Orientierung.
Dabei enthält jeder Primer-Partikel klonal eine eindeutige Zellbarcode-Sequenz (BCi-n) mit einer Länge von > 8 Basen. Der Selektionsmarker ist beispielsweise Biotin am 5‘-Ende des SFP bzw. SRP. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist der Selektionsmarker an eine interne, beispielsweise modifizierte Base der Universal-Sequenz gekoppelt, wobei die Universal- Sequenz zum 5'-Ende hin um eine Einzelstrangbruch-Sequenz (Nicking site) verlängert ist, die einen Einzelstrangbruch über ein entsprechendes Nicking Enzym induziert.
Mittels des Selektionsmarkers ist eine spätere positive Selektion der Biomarker- Targetamplifikate möglich. Die Universal-Sequenz wird beispielsweise für eine spätere Amplifikation einer Sequenzier-Bibliothek oder einer bekannten Sequenz mit einer Funktion der Wahl, wie beispielsweise eine Restriktionsschnittstelle, insbesondere zur Freisetzung des Biomarker-Targetamplifikats beispielsweise von einem Fängermolekül, benötigt. Vorteilhaft ist zudem, dass aufgrund der Markierung der einzelnen Biomarker- Targetamp I if ikate mit einem Zellbarcode diese den einzelnen Zellen wieder eindeutig zugeordnet werden können. Weitere Analysen einer Vielzahl von Zellen, beispielsweise molekulargenetischer Art mittels NGS, bei denen relevante Biomarker den einzelnen Zellen zugeordnet werden können, beispielsweise aus vereinzelten Zellen von Gewebe- Biopsaten, kann von großem Nutzen beispielsweise in der Diagnostik und im Therapiemonitoring von Tumorpatienten sein.
Dadurch, dass die Zelle und der Primer-Partikel in der Mikrokavität gefangen sind und keine weiteren Zellen oder Primer-Partikel in die Mikrokavität eintreten können ist eine eindeutige Einzelzellmarkierung möglich, da jeder Primer-Partikel mit einem einzigartigen, molekularen Zellbarcode ausgestattet ist.
Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, für jede Biomarker- Targetregion mehrere, insbesondere 2-4, SFP und SRP mit unterschiedlichen, die Biomarker-Targetregion flankierenden spezifischen Forward- und Reverse-Targetsequenzen einzusetzen. Hierbei können diese beispielsweise auch in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden.
Vorteilhaft hierbei ist, dass beispielsweise mit zunehmender Anzahl der SFP bzw. SRP pro Biomarker-Targetregion neben der Amplifikationsrate auch die Chancen der Bindung der SFP bzw. SRP an die Targetregion steigen oder in einem weiteren Beispiel durch Konzentrationsanpassungen der SFP bzw. SRP einzelner, beispielsweise schwieriger zu amplifizierender Biomarker-Targetregionen eine gleichmäßigere Amplifikation im Vergleich zu anderen Biomarkertarget- Regionen erreicht wird.
Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn SFP und SRP weiterhin einen eindeutigen molekularen Identifikator (engl. unique molecular identifier, UMI) in Form einer randomisierten Sequenz aufweisen. Der UMI kann beispielsweise zwischen der Universal- Sequenz und der Zellbarcode-Sequenz oder zwischen der Zellbarcode-Sequenz und der Forward- bzw. Reverse-Targetsequenz lokalisiert sein. Der UMI hat insbesondere eine Länge von > 6 Basen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform sind die Primer-Partikel so ausgeführt, dass die SFP und SRP bereits über den Selektionsmarker an die Primer-Partikel insbesondere reversibel gebunden sind. Im Fall einer reversiblen Verbindung sind die SFP und SRP beispielsweise über Antikörper, endständig chemische Modifikationen, wie beispielsweise eine Biotin- Kopplung. Weiterhin alternativ können die SFP und SRP auch über Aptamere, temperaturstabile Gruppen oder pH-sensitive Gruppen oder lichtspaltbare Gruppen wie beispielsweise o-Nitrobenzyl, reversibel an die Primer-Partikel gebunden sein.
Die Random Primer werden in dieser Ausführungsform mit der Amplifikationsmischung für die Amplifikation, insbesondere für eine ssMDA (nachfolgend beschrieben), zugeführt. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Target- Amplifikate direkt am Primer-Partikel hergestellt werden und mittels der DEP-Kräfte nach der Entfernung der nicht-wässrigen Phase festgehalten (gefangen) und direkt in der Mikrokavität aufgereinigt werden können. In dieser Ausführungsform sind somit keine Fängermoleküle notwendig, da die Amplifikation der Biomarker-Targetregion über die SFP und SRP angebunden an den Primer-Partikel erfolgt. Ein Selektionsmarker kann hier entfallen.
Ein weiterer Vorteil ist, dass die Biomarker-Targetamplifikate, immobilisiert an den im DEP- Käfig festgehaltenen Primer-Partikel, bei Bedarf in der Mikrokavität weiter prozessiert werden können, beispielsweise durch Zuführen weiterer Primer-Partikel oder durch Flüssigreagenzien.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Universal-Sequenz der SFP und SRP so gewählt, dass ein direkter Anknüpfungspunkt in Form einer spezifischen Sequenz für eine weitere Amplifikation eingeführt ist, insbesondere zur Fertigstellung einer Sequenzierbibliothek.
Vorteilhaft hierbei ist, dass eine zusätzliche Vervielfältigung bzw. Präparation der aufgereinigten Biomarker Target- Amplifikate mittels anderer Sequenziertechnologien, beispielsweise eines anderen Herstellers, ermöglicht wird.
Die dafür notwendige, asymmetrische Ausführung kann beispielsweise so realisiert werden, dass alle SFP eine erste Universal-Sequenz erhalten und alle SRP eine zweite Universalsequenz erhalten, welche sich von der ersten Universalsequenz unterscheidet. Auf diese Weise ist nur noch eine hochstandardisierte PCR, beispielsweise eine Index-PCR, nötig, bevor die Sequenzierbibliothek sequenziert werden kann. Durch einen flexiblen Einsatz der Universal-Sequenzen kann gewährleistet werden, dass das Verfahren entsprechend kompatibel mit nachgeschalteten, bevorzugt angewandten Analyseverfahren, wie beispielsweise verschiedene NGS-Technologien, für eine Einzelzellanalyse ist.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Amplifikationsmischung Zelllyse-unterstützend. Dies kann beispielsweise durch ein Reagenz erreicht werden, das die Zellen lysiert und Nukleinsäuren freisetzt, die anschließende Reaktion jedoch nicht hemmt bzw. sogar fördert, wie beispielsweise mit einem Detergenz oder durch eine Änderung der Osmolarität.
Vorteilhaft hierbei ist, dass keine einzelnen Prozessschritte für die Zelllyse und Mischung mit der Amplifikationsmischung notwendig sind und auch die jeweiligen Reagenzien bereits vorgemischt vorgelagert werden können. Dies führt zu einer Zeit-, Reagenzien- und Kostenersparnis. Des Weiteren werden durch die reduzierten Schritte Verdünnungseffekte sowie Verluste, die sich sonst durch mehrmaliges Überspülen ergäben, minimiert. Hieraus resultiert eine Steigerung der Effizienz.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die Zelllyse nach Einbringen der Amplifikationsmischung durch kurzzeitiges Erhitzen, beispielsweise auf >50 °C für >1 min. In einer weiterhin alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die Zelllyse durch eine Erhöhung des Drucks innerhalb der Mikrokavitäten, beispielsweise durch Anlegen eines Überdrucks.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Amplifikation eine isothermale Amplifikation, insbesondere eine semi-specific Multiple Displacement Amplification (ssMDA). Diese Methode ist auch in der noch nicht veröffentlichten deutschen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022211087.0 beschrieben.
Die ssMDA bietet die Option, simultan DNA und RNA aus geringsten Mengen sowohl gesamtgenomisch bzw. gesamttranskriptomisch anzureichern als auch einzelne Biomarkerrelevante Bereiche, also die Biomarker-Targetregionen, bevorzugt zu amplifizieren und anzureichern.
Dies wird dadurch erreicht, dass neben den Random Primern, beispielsweise RP6 mit der Sequenz NNNNNN oder RP9 mit der Sequenz NNNNNNNNN, wobei das N für eine der Basen A, C, T, oder G steht, bei der ssMDA auch für die Amplifikation der Biomarker- Targetregionen spezifische Forward-Primer und Reverse-Primer eingesetzt werden. Diese lagern sich bezüglich der Biomarker-Targetregion flankierend vorwärts-gerichtet (forward) bis zu 3 Kilobasen (kb) strangaufwärts (upstream) an die DNA bzw. RNA an und flankierend rückwärts-gerichtet (reverse) bis zu 3kb strangabwärts (downstream). Die SFP und SRP sind zusätzlich mit einem Selektionsmarker ausgestattet, beispielsweise Biotin. Eine nachgeschaltete Aufreinigung der Reaktion, beispielsweise mit einem passendem Fängermolekül wie zum Beispiel Streptavidin, erlaubt demnach eine direkte Anreicherung der spezifischen Biomarker Target- Amplifikate gegenüber dem parallel entstandenen Hintergrund-Amplifikat.
Besonders bevorzugt weisen die SFP und SRP bei der ssMDA eine Einzelstrangbruchschnittstelle auf. Diese Einzelstrangbruchschnittstelle stellt nach Erzeugung des Einzelstrangbruchs durch eine passend hinzugefügte Einzelstrangbruchinduzierende Endonuklease (engl. nicking enzyme) einen zusätzlichen Amplifikationsstartpunkt für eine Polymerase zur Verfügung. Hierdurch kann die Biomarker- Targetamplifikation an diesen Stellen ohne weitere Primer-Hybridisierungen fortgeführt werden, was die Prozessivität erhöht.
Bei der Amplifikation wird hierzu der Polymerase eine Einzelstrangbruch-induzierende Endonuklease beigefügt. Die Endonuklease ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nt.Alwl, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.Bsml, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI, Nt.BstNBI, Nb.BtsI und Nt.CviPII.
Die RP sind bei der ssMDA vorzugsweise Primer, die mindestens eine Modifikation aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus LNA (Locked Nucleic Acid), MGB (Minor Groove Binder), C-5 Propynyl-Desoxycytidin, C-5 Propynyl-Desoxyuridin, Aminoethyl-Phenoxazin-Desoxycytidin, 5-Methyl-Desoxycytidin, 2-Amino-Desoxyadenosin, Trimethoxystilben, Pyren und Spermin. ZNA-Primer (Zip Nucleic Acids) sind besonders bevorzugt. Hierbei handelt es sich um sperminmodifizierte Primer. Diese haben den Vorteil, dass sie mit einzelsträngigen Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA) besonders temperaturstabile hybridisierte Nukleinsäuren ausbilden und dass höhere Hybridisierungstemperaturen verwendet werden können, ohne dass es zu einer Sequenzverlängerung der Primer kommen muss. Zudem reduzieren sie bei entsprechender Sperminbeladung der Primer die Selbsthybridisierung der Primer. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die eingesetzten Primer kurz sind und die isothermale Amplifikation bei Temperaturen von mindestens 45°C durchgeführt wird.
Die ssMDA läuft isothermal beispielsweise bei Temperaturen zw. 40-72°C für beispielsweise mehr als 10 Minuten ab.
Für die ssMDA wird bevorzugt eine SD-Polymerase verwendet. Bei der SD-Polymerase kann es sich beispielsweise um eine Enzymmutante der DNA- Polymerase des Bacillus subtilis phage Phi29, insbesondere Equi Phi29, oder des Thermococcus litoralis, insbesondere Vent (exo-), handeln. Dabei besitzt die SD-Polymerase Vent (exo-) den Vorteil, dass sie bis zu Temperaturen von 100°C stabil und prozessiv ist. Deshalb kann sie bereits vor dem Denaturieren der DNA und/oder RNA zugesetzt werden, ohne durch die hohe Denaturierungstemperatur geschädigt werden. Allerdings weisen diese SD- Polymerasen keine RNA-Prozessivität auf.
Dabei ist die SD-Polymerase bevorzugt eine Enzymmutante der DNA-Polymerase des Bacillus stearothermophilus. Diese SD- Polymerasen weisen neben ihrer Prozessivität gegenüber DNA auch eine Prozessivität gegenüber RNA auf. Besonders bevorzugte Enzymmutanten der DNA-Polymerase des Bacillus stearothermophilus sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bst, Bst 2.0 und Bst 3.0. Unter diesen Enzymmutanten weist Bst 3.0 die höchste RNA-Prozessivität auf, weshalb Bst 3.0 ganz besonders bevorzugt ist.
Die SD-Polymerase ist eine DNA-Polymerase, die für isothermale Amplifikationsreaktionen geeignet und für eine hohe Strangverdrändungsaktivität in Amplifikations- Reaktionen bereits bekannt ist.
Die Verwendung der SD-Polymerase hat mehrere Vorteile. Sie ermöglicht eine isothermale Amplifikation. Außerdem tolerieren manche SD- Polymerasen hohe Temperaturen bei der isothermen Amplifikation, welche die Reaktionsgeschwindigkeit so weit erhöhen, dass eine deutliche Verkürzung der Reaktionsdauer möglich ist. Schließlich können manche SD- Polymerasen neben DNA auch RNA als Template zur Amplifikation nutzen.
Auch wenn die SD-Polymerase dazu in der Lage ist neben DNA auch RNA zu prozessieren ist es bevorzugt, dass bei der ssMDA zusätzlich mindestens eine reverse Transkriptase eingesetzt wird. Insbesondere handelt es sich hierbei um RTx oder SSIV. Prinzipiell sind aber alle reversen Transkriptasen denkbar, die unter ähnlichen Reaktionsbedingungen prozessieren, wie die eingesetzte SD-Polymerase. Hierdurch wird die Amplifikation von RNA gezielt unterstützt, sodass der erforderliche Amplifikationszeitraum noch weiter verkürzt werden kann. Wenn eine SD-Polymerase verwendet wird, die keine RNA-Prozessivität aufweist, dann ist die Verwendung einer reversen Transkriptase notwendig, um neben DNA auch RNA zu prozessieren.
Für die Amplifikation mittels ssMDA erfolgt eine Denaturierung der zu amplifizierenden DNA und/oder RNA, insbesondere durch Erhitzen auf eine geeignete Temperatur. Im Fall von thermophilen Polymerasen, beispielsweise der Vent (exo-) Polymerase, erfolgt die Denaturierung bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 75°C bis 98°C und ganz besonders bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 80°C bis 95°C. Bevorzugt wird das Erhitzen für einen Zeitraum von mehr als 10 Sekunden durchgeführt, besonders bevorzugt für einen Zeitraum im Bereich von 30 Sekunden bis 120 Sekunden.
Im Fall von nicht-thermophilen SD-Polymerasen, wie beispielsweise der Bst3.0, werden bevorzugt Temperaturen von 65-85°C, und besonders bevorzugt Temperaturen von 72- 80°C, verwendet.
Die Primer zur Hybridisierung der einzelsträngigen DNA und/oder RNA, können bevorzugt bereits vor dem Denaturieren mit der DNA und/oder RNA zusammengebracht werden, besonders bevorzugt indem sie in der Amplifikationsmischung bereits gelöst sind. Die Hybridisierung der Primer an die DNA- und/oder RNA- Einzelstränge erfolgt dann vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 4°C bis 65°C während eines Zeitraums, der vorzugsweise mehr als 10 Sekunden beträgt.
Die ssMDA erfolgt vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur mit einem Wert im Bereich von 40°C bis 72°C. Ein bevorzugter Zeitraum der Amplifikation liegt im Bereich von 10 Minuten bis 120 Minuten. Je höher die Temperatur bei der Amplifikation ist, desto schneller läuft diese ab und desto geringer kann üblicherweise der Amplifikationszeitraum vorteilhaft gewählt werden.
Vorteilhaft bei der ssMDA ist, dass simultan DNA- und RNA-Biomarker automatisiert in demselben Reaktionskompartiment aus Einzelzellen amplifiziert und angereichert werden können, was eine enorme Verbesserung und Vereinfachung der Biomarker-Anreicherung darstellt, auch im Hinblick des aufzubringenden Aufwands, der Dauer der experimentellen Durchführung, der Anzahl der Arbeitsschritte und der damit verbundenen Kosten.
In einer zu der ssMDA alternativen Ausführungsform wird die Amplifikation mittels einer reversen Transkriptase-PCR durchgeführt. Hier werden beispielsweise nur ein SFP und SRP pro Biomarker-Targetregion eingesetzt. Die Amplifikationsmischung umfasst in dieser Ausführung beispielsweise eine Taq- Polymerase und eine reverse Transkriptase.
Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn zum Überführen einer Amplifikations- Reaktion aus der zumindest einen Mikrokavität und/oder zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- Reaktionen unterschiedlicher Mikrokavitäten, die nicht-wässrige Phase oberhalb der Mikrokavitäten, welche diese im Bereich ihrer Öffnung verschlossen hatte, verdrängt wird. Die Verdrängung kann beispielsweise mit Wasser, einem Elutionspuffer oder einem detergenzhaltigen Puffer erfolgen. Über die Öffnung kann/können die Amplifikations- Reaktionen in ein mikrofluidisch angeschlossenes System überführt werden und die einzelnen Amplifikations- Reaktionen gegebenenfalls zusammengeführt werden. Unter einer Amplifikations- Reaktion ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die sich nach der Amplifikation in dem Reaktionskompartiment befindliche Reaktionslösung zu verstehen.
In einer alternativen vorteilhaften Ausführungsform zum Überführen einer Amplifikations- Reaktion aus der zumindest einen Mikrokavität und/oder zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- Reaktionen unterschiedlicher Mikrokavitäten, weist die zumindest eine Mikrokavität eine, insbesondere nach unten gerichtete, weitere Öffnung in der Wandung auf. Eine solche weitere Öffnung ist beispielsweise während des Reaktionsablaufs durch eine aktuierbare Membran geschlossen. Nach Ablauf der Reaktion wird die weitere Öffnung geöffnet, bzw. die aktuierbare Membran entfernt, um die Amplifikations- Reaktion insbesondere nach unten, in ein mikrofluidisch angeschlossenes System zu überführen und die einzelnen Amplifikations- Reaktionen gegebenenfalls zusammenzuführen.
Das mikrofluidisch angeschlossene System ist beispielsweise eine mikrofluidisch angeschlossene Reaktionskammer mit einem Volumen von beispielsweise 20pl. Hierin können die Biomarker-Targetamplifikate beispielsweise weiter angereichert und aufgereinigt werden. Zur weiteren Anreicherung werden die Biomarker-Targetamplifikate mit der Universal-Sequenz bei Bedarf erneut amplifiziert und beispielsweise mittels NGS ausgelesen. Anhand der bei der Auslese abgefragten Zellbarcode-Sequenz können die Biomarker den einzelnen Zellen wieder eindeutig zugeordnet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung der Biomarker- Targetamplifikate mittels Fängermolekülen, insbesondere mittels an magnetische Beads immobilisierten Fängermolekülen. Die Fängermoleküle, insbesondere Streptavidin, binden beispielsweise an den Selektionsmarker der SFP und SRP, insbesondere Biotin. Hierzu werden beispielsweise entsprechende Bindebedingungen für die Fängermoleküle und die, den Selektionsmarker umfassenden Biomarker-Targetamplifikaten hergestellt und ein nach bekannten Protokollen durchführbares „Bind-Wash- Elute“- Verfahren angewandt.
Alternativ kann statt der klassischen Elution beispielsweise auch ein Restriktionsenzym die Biomarker-Targetamplifikate, beispielsweise von dem Fängermolekül, freisetzen. Eine Voraussetzung hierfür ist, dass in den SFP und SRP entsprechende Schnittstellensequenzen in der Universal-Sequenz eingebaut sind. Hierbei ist es in einer Ausführungsform der Erfindung vorteilhaft, wenn bei einer Elution der Biomarker-Targetamplifikate von dem Fängermolekül die Protelomerase TelN oder eine Enzymmutante derer verwendet wird, welche die beiden Einzelstrangmoleküle der DNA- Doppelhelix (sense- und antisense-Strang) an der Schnittstelle kovalent miteinander verbindet und hierbei eine Haarnadel-Struktur (Hairpin) hinterlässt. Eine solche Haarnadel- Struktur ist beispielsweise für die Herstellung von NGS-Bibliotheken erforderlich, beispielsweise für die Sequenzierbibliothek der Sequenziertechnologie der Fa. Pacific Biosciences. Vorteilhaft hierbei ist, dass keine weiteren Schritte zur Adapterligation durchgeführt werden müssen.
Desweiteren kann beispielsweise eine weitere Anreicherung der Biomarker-Targetamplifikate mittels einer isothermalen Rolling Circle Amplification (RCA) erfolgen ohne, dass für die Amplifikation zusätzliche Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden müssen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform sind die Zellen zirkulierende Tumorzellen (CTCs). Die molekulargenetische Einzelzellanalyse dieser CTCs ist beispielsweise beim Therapiemonitoring von Krebspatienten eine hochsensitive Möglichkeit um frühzeitig einerseits über den Therapieverlauf (prognostisch) und andererseits über die Therapieanpassung (diagnostisch) Informationen zu sammeln. Hierbei müssen die seltenen CTCs (beispielsweise 101 bis 102 pro mL Blut; einzeln oder einige wenige als Pool) aus einem hohen Hintergrund .gesunder“ Blutzellen (>106 Leukozyten, >109 Erythrozyten pro mL Blut) isoliert werden. Nach herkömmlichen Methoden muss das genetische Material dieser einzelnen, isolierten Zellen voramplifiziert werden, um für nachgeschaltete Analysen einen ausreichenden Eintrag (Input) zu generieren.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen Prozessschritte zur Voramplifikation der DNA und/oder RNA der CTCs, sowie vorherige Schritte zum Zusammenführen mehrerer vorsortierter Zellen, wodurch sich die Prozesszeit deutlich verkürzt, weniger Arbeitsschritte notwendig sind, weniger Reagenzien benötigt werden und somit auch geringere Kosten anfallen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zellen können vorher angefärbte Zellen sein, wie z.B. EpCAM-positive CTCs. Diese tragen das Oberflächenantigen EpCAM (epitheliales Zelladhäsionsmolekül, engl. epithelial cell adhesion molecule). Es können aber auch alle Zellen ohne vorherige Anfärbung betrachtet werden, wie beispielsweise alle aus dem Zellverbund eines Gewebes gelöste Einzelzellen.
Alternativ können die Zellen auch mikrobielle Zellen oder solche von Einzellern sein. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Steuergerät, eingerichtet um die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in entsprechenden Einheiten, insbesondere in einer mikrofluidischen Kartusche, auszuführen und/oder anzusteuern.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind desweiteren ein Computerprogramm, eingerichtet die Schritte des mikrofluidischen Verfahrens auszuführen und/oder anzusteuern sowie ein maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm gespeichert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1: die schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment, und
Fig. 2: die schematische Darstellung eines Biomarker-spezifischen Forward- oder
Reverse- Primers.
Ausführungsformen der Erfindung
In Figur 1 ist das erfindungsgemäße Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment in einem Ausführungsbeispiel dargestellt, welches anhand einer isothermalen ssMDA beschrieben wird.
Eine Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, ist in der noch nicht veröffentlichten deutschen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022203848.7 beschrieben. Diese Vorrichtung weist ein Trägersubstrat zum Aufnehmen einer Probenflüssigkeit auf. Das Trägersubstrat weist zumindest eine Mikrokavität 110 auf und weiterhin zumindest eine Elektrode, die an oder in der Mikrokavität 110 angeordnet ist, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, das ausgebildet ist, um eine Zelle 510, insbesondere eine kernhaltige Zelle 510, und/oder einen Primer-Partikel 512 und/oder einen weiteren Partikel in der Mikrokavität 110 zu fangen. Figur 1 der vorliegenden Erfindung zeigt lediglich je eine Mikrokavität 110 dieser Vorrichtung.
In einem nicht in Figur 1 dargestellten, diesem vorgelagerten Schritt 0, wird eine erste Probenflüssigkeit mit Zellen 510 in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht bzw. auf das Trägersubstrat gegeben. Den Zellen 510 sedimentieren Richtung der Mikrokavitäten. Sobald sich eine Zelle 510 der Mikrokavität 110 nähert, wird der DEP-Käfig in einen geöffneten Zustand überführt oder ausgeschaltet, sodass diese Zelle 510 in die Mikrokavität eintreten kann. Sobald die Zelle 510 eingetreten ist, wird der DEP-Käfig wieder geschlossen, sodass keine weitere Zelle in diese eintreten kann und maximal eine Zelle pro Mikrokavität enthalten ist. Wenn alle Zellen sedimentiert sind und beispielsweise alle weiteren Mikrokavitäten ebenfalls mit je einer Zelle beladen sind, wird die Probenflüssigkeit weggespült. Dabei bleibt der DEP-Käfig geschlossen, sodass die Zelle 510 bis auf Weiteres festgehalten wird.
In einem Schritt S1 der Figur 1 ist eine Zelle 510 mit einem Zellkern 511, hier beispielhaft eine CTC, in der Mikrokavität 110 abgebildet. Nun wird eine zweite Probenflüssigkeit mit Primer-Partikeln 512 in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht bzw. auf das Trägersubstrat gegeben. Hierbei wird beispielsweise die sich über dem Trägersubstrat befindliche erste Probenflüssigkeit, welche die Zellen 510 umfasst, verdrängt.
Die Primer-Partikel 512, umfassen beispielsweise einen Partikel 513 aus Polystyrol, mit unterschiedlichen reversibel an diese gekoppelten Primer-Populationen, hier beispielhaft Biomarker-spezifische Forward Primer (SFP) 517 und Biomarker-spezifische Reverse- Primer SRP) 517 mit einem Selektionsmarker 514 und Random Primer (RP) 516. In Figur 1 sind die SFP 517 und SRP 517 optisch nicht voneinander unterscheidbar, es sei jedoch angemerkt, dass es sich um unterschiedliche Populationen von Primern handelt.
In Schritt S2 wird der DEP-Käfig in einem geöffneten oder ausgeschalteten Zustand überführt, sodass ein Primer-Partikel 512 in die Mikrokavität 110 sedimentieren kann Sobald ein Primer-Partikel 512 in die Mikrokavität 110 sedimentiert ist, wird der DEP-Käfig durch eine Spannungsänderung in einen geschlossenen Zustand überführt und der Primer- Partikel 512 mit der Zelle 510 in diesem gefangen. In diesem Zustand können keine weiteren Primer-Partikel 512 in die Mikrokavität 110 eintreten, sodass sichergestellt ist, dass sich neben der einzigen Zelle 510 auch nur ein einziger Primer-Partikel 512 in der Mikrokavität 110 befindet. Die gestrichelte Linie mit dem Bezugszeichen 520 soll bildhaft verdeutlichen, dass der DEP-Käfig nach der Beladung mit dem Primer-Partikel 512 geschlossen ist. In einer alternativen, nicht in Figur 1 dargestellten Ausführungsform kann die Mikrokavität 110 auch zuerst mit einem Primer-Partikel 512 beladen werden und anschließend mit einer Zelle 510.
In einer weiterhin alternativen, nicht in Figur 1 dargestellten Ausführungsform können die Primer-Partikel auch nur die SFP und SRP tragen und die RP werden in Schritt S3 über die Amplifikationsmischung eingebracht.
In einem Schritt S3 wird anschließend eine Amplifikationsmischung in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht bzw. auf das Trägersubstrat gegeben. Hierbei wird entweder zuvor die zweite Flüssigkeit mit den nicht verwendeten Primer-Partikeln 512 von dem Trägersubstrat entfernt und die Amplifikationsmischung nachfolgend auf das Trägersubstrat gegeben oder die Flüssigkeit mit den Primer-Partikeln 512 wird direkt mit der Amplifikationsmischung auf dem Trägersubstrat vermischt. Die Amplifikationsmischung umfasst einen Puffer mit einer SD-Polymerase 525 und Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTPs), sowie optional einer reversen Transkriptase und/oder Nicking Enzyms. In Figur 1 ist zum einfacheren Verständnis lediglich die Polymerase 525 dargestellt.
In Schritt S3 ist die diffusions-basierte Verteilung der Bestandteile bzw. der Polymerase 525 der Amplifikationsmischung in die Mikrokavität 110 dargestellt. Hierbei ist der DEP-Käfig geschlossen, was die gestrichelte Linie mit dem Bezugszeichen 520 bildhaft verdeutlichen soll, da die Bestandteile der Amplifikationsmischung keine Entitäten mit dielektrischen Eigenschaften darstellen und den DEP-Käfig somit auch im geschlossenen Zustand diffusionsbasiert passieren können.
In der Mikrokavität 110 befinden sich nun die Zelle 510, der Primer- Partikel 512 und die SD- Polymerase 525 sowie weitere Bestandteile der Amplifikationsmischung.
In einem Schritt S4 wird die Amplifikationsmischung oberhalb der zumindest einen Mikrokavität 110 durch eine nicht-wässrige Phase 526, beispielsweise eine Ölphase oder Luft, verdrängt, sodass die Mikrokavität 110 im Bereich ihrer Öffnung durch die nichtwässrige Phase 526 geschlossen ist und somit ein geschlossenes Reaktionskompartiment darstellt, in welchem die Zelle 510 und der Primer- Partikel 512 mit der Amplifikationsmischung eingeschlossen sind. Es werden nun Bedingungen herbeigeführt, die zu einer Lyse der Zelle 510 und zu einer Freisetzung der Primer 516, 517 von dem Partikel 513 führen.
In S4 ist eine lysierte Zelle 510a dargestellt, aus welcher die Zellbestandteile, beispielsweise RNAs 539 frei geworden sind, sowie ein lysierter Zellkern 511a, welcher die sich in diesem befindliche DNA 539 freigegeben hat. Solche Bedingungen werden beispielsweise durch eine Temperaturerhöhung auf beispielsweise über 70°C für beispielsweise mehr als eine Minute und/oder durch Elektroporation und/oder durch Ultraschall erzeugt.
Bei der temperaturinduzierten Lyse der Zelle 510 erfolgt gleichzeitig eine Denaturierung der DNA-Doppelstränge und/oder der RNA-Sekundärstrukturen und/oder -Tertiärstrukturen, besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 72°C und 80°C beispielsweise für mehr als eine Minute.
In einem weiteren Schritt S5 erfolgt die Amplifikations-Reaktion mittels ssMDA. Die Random Primer 516 binden ungerichtet an Regionen der DNA 539 und/oder RNA 539, sodass mittels dieser eine isothermale, strand-displacement-basierte Amplifikation der Gesamt-DNA 539 und/oder RNA 539 mithilfe der Polymerasen 525 erfolgen kann. Hierbei entstehen Gesamt- DNA-Amplifikate 539 und/oder Gesamt-RNA-Amplifikate 539. Außerdem binden die spezifischen Forward Primer 517 und die spezifischen Reverse-Primer 517 flankierend strangaufwärts und flankierend strangabwärts von Biomarker-Targetregionen 530 der DNA 539 und/oder RNA 539, sodass eine Amplifikation der Biomarker-Targetregion 530 erfolgt, welche durch den Selektionsmarker 514, beispielsweise Biotin, zellspezifisch markiert ist. Zur Amplifikation binden die Polymerasen 525 an die SFP und SRP, die den SD- Polymerasen 525 den Startpunkt für die Amplifikation vorgeben. Dabei entstehen Biomarker- Targetamp I if ikate 542.
Die SFP und SRP tragen beispielsweise zusätzliche Nicking-Sequenzen am 5‘-Ende, die die Universal-Sequenz verlängern. Bei vorheriger Zugabe eines entsprechenden Nicking- Enzyms mit der Amplifikationsmischung in Schritt S3 kann hier eine zusätzliche, überproportionale Verstärkung der Biomarker-Target- Amplifikation induziert werden, in der die Biomarker-Target- Amplifikate 542 weiterhin die Selektionsmarker 514 tragen.
Die Amplifikation der RNA kann beispielsweise zusätzlich verstärkt werden durch die reverse Transkriptase.
In einem Schritt S6 ist angedeutet, dass zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- Reaktionen aus unterschiedlichen Mikrokavitäten 110, die nicht-wässrige Phase 526 oberhalb der Mikrokavitäten 110, welche diese im Bereich ihrer Öffnung verschlossen hatte, verdrängt wird. Die Verdrängung kann beispielsweise mit einem Elutionspuffer oder einem detergenzhaltigen Puffer erfolgen. Über die Öffnung können die Amplifikations- Reaktionen in ein mikrofluidisch angeschlossenes System, beispielsweise eine mikrofluidisch angeschlossene Reaktionskammer, überführt werden und die einzelnen Amplifikations- Reaktionen zusammengeführt werden.
Hierin können die Biomarker-Targetamplifikate 542 beispielsweise weiter angereichert und aufgereinigt werden. In einem Schritt S7 erfolgt die Aufreinigung der amplifizierten Biomarker-Targetamplifikate 542 mittels Fängermolekülen 543, welche beispielsweise an magnetische Partikel (engl. Beads) immobilisiert sind. Die Fängermoleküle 543, beispielsweise Streptavidin, binden an den Selektionsmarker 514 der SFP 517 und SRP 517, insbesondere Biotin. So können die Biomarker-Targetamplifikate 542 von den übrigen Reaktionsbestandteilen, wie beispielsweise den Gesamt-DNA-Amplifikaten 539 und/oder Gesamt- RN A-Amplifikaten 539, abgetrennt werden. Anschließend erfolgt eine Elution der Biomarker-Targetamplifikate 542 von den Fängermolekülen 543 beispielsweise durch klassische Elutionsverfahren oder durch ein Restriktionsenzym.
In Figur 2 ist beispielhaft ein Biomarker-spezifischer Forward Primer (SFP) 517 bzw. ein Biomarker-spezifischer Reverse-Primer (SRP) 517 dargestellt.
Der SFP bzw. SRP umfasst, beginnend am 5'-Ende, einen Selektionsmarker 514 gekoppelt an eine Universal-Sequenz 501, gefolgt von einer eindeutigen Zellbarcode-Sequenz 503 und einer spezifischen Biomarker-Targetsequenz 506.
Mittels der spezifischen Biomarker-Targetsequenz 506 lagert sich der SFP 517 bezüglich der Biomarker-Targetregion 530 flankierend vorwärts-gerichtet bis zu 3 kb strangaufwärts an die DNA 539 und/oder RNA 539 an und der SRP 517 lagert sich bezüglich der Biomarker- Targetregion 530 flankierend rückwärts-gerichtet bis zu 3kb strangabwärts an die DNA 539 und/oder RNA 539 an.
Die eindeutige Zellbarcode-Sequenz 503 ist klonal in jedem SFP 517 und SRP 517 eines Primer-Partikels 512 enthalten, beispielsweise mit einer Länge von 8 oder mehr Basen. Der Selektionsmarker 514 ist beispielsweise Biotin am 5‘-Ende des SFP 517 bzw. SRP 517. Mittels des Selektionsmarkers 514 ist eine spätere positive Selektion der amplifizierten Biomarker-Targetamplifikate 542 möglich. Die Universal-Sequenz 501 wird beispielsweise für eine spätere Amplifikation einer Sequenzier-Bibliothek oder einer bekannten Sequenz mit einer Funktion der Wahl, wie beispielsweise eine Restriktionsschnittstelle, insbesondere zur Freisetzung des Biomarker-Targetamplifikats 542 beispielsweise von einem Fängermolekül 543, benötigt.
Optional und nicht in Figur 2 dargestellt, kann der SFP 517 bzw. SRP 517 einen eindeutigen molekularen Identifikator (UMI) in Form einer randomisierten Sequenz aufweisen. Der UMI kann beispielsweise zwischen der Universal-Sequenz 501 und der Zellbarcode-Sequenz 503 oder zwischen der Zellbarcode-Sequenz 503 und der spezifischen Biomarker-Targetsequenz 506 lokalisiert sein. Der UMI hat insbesondere eine Länge von 6 oder mehr Basen. Weiterhin optional und nicht in Figur 2 dargestellt, kann der SFP 517 bzw. SRP 517 um eine Nicking-Sequenz am 5‘-Ende der Universal-Sequenz 501 verlängert werden. Der Selektionsmarker ist damit nicht mehr endständig am SFP bzw. SRP lokalisiert, sondern intern am 5‘-Ende der Universalsequenz.

Claims

Ansprüche
1. Mikrofluidisches Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment umfassend nachfolgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer mikrofluidischen Vorrichtung, aufweisend zumindest ein Trägersubstrat zum Aufnehmen einer Probenflüssigkeit, wobei das Trägersubstrat zumindest eine Mikrokavität (110) aufweist, und weiterhin aufweisend zumindest eine Elektrode, die an oder in der Mikrokavität (110) angeordnet ist, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, das ausgebildet ist, um eine Zelle (510) und/oder ein Primer- Partikel (512) in der Mikrokavität (110) zu fangen, b) Beladen der zumindest einen Mikrokavität (110) der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Zelle (510) und Fangen dieser, c) Beladen der zumindest einen Mikrokavität (110) der mikrofluidischen Vorrichtung mit einem Primer-Partikel (512) umfassend zumindest eine an diesen gekoppelte Primerpopulation und Fangen des Primer-Partikels (512), wobei die Schritte b) und c) auch in umgekehrter Reihenfolge ablaufen können d) Einbringen einer Amplifikationsmischung in die zumindest eine Mikrokavität (110) e) Verdrängen der Amplifikationsmischung oberhalb der zumindest einen Mikrokavität (110) durch eine nicht-wässrige Phase (526), sodass die Mikrokavität (110) ein geschlossenes Reaktionskompartiment darstellt f) Herbeiführen von zelllysierenden und Primer (516, 517) freisetzenden Bedingungen, g) Binden der zumindest einen Primerpopulation an Biomarker- Regionen der DNA (539) und/oder RNA (539) der lysierten Zelle (510a) zur zellspezifischen Markierung und Amplifikation einer Biomarker-Targetregion (530)
2. Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 1, wobei an den Primer-Partikel (512), welcher insbesondere ein Polystyrol- Primer- Partikel (512) ist, verschiedene Populationen von Primern reversibel gekoppelt sind, insbesondere Biomarkerspezifische Forward-Primer (517), Biomarker-spezifische Reverse- Primer (517) und/oder Random Primer (516). Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Biomarker-spezifischen Forward- (517) und Reverse- Primer (517) je einen Selektionsmarker (514) umfassen, gekoppelt an eine Universal-Sequenz, eine eindeutige Zellbarcode-Sequenz und entsprechend für die Biomarker-Targetregion (530) eine spezifische Forward- oder Reverse-Targetsequenz. Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 3, wobei für jede Biomarker-Targetregion (530) mehrere, insbesondere 2-4, Biomarker-spezifische Forward- (517) und Reverse- Primer (517) mit unterschiedlichen flankierenden spezifischen Forward- oder Reverse-Targetsequenzen (506) eingesetzt werden. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 2-4, wobei die Biomarkerspezifischen Forward- (517) und Reverse- Primer (517) weiterhin einen eindeutigen molekularen Identifikator (UMI) in Form einer randomisierten Sequenz aufweisen. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 3-5, wobei die Primer-Partikel (512) so ausgeführt sind, dass die Biomarker-spezifischen Forward- (517) und Reverse- Primer (517) über den Selektionsmarker (514) oder über eine reversible Verbindung, an die Primer-Partikel (512) gebunden sind. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 3-6, wobei die Universal- Sequenz (501) der Biomarker-spezifischen Forward- (517) und Reverse- Primer (517) so gewählt ist, dass eine direkte Angriffsfläche für eine weitere Amplifikation eingeführt ist, insbesondere zur Fertigstellung einer Sequenzierbibliothek. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 3-7, wobei die Universal- Sequenz (501) der Biomarker-spezifischen Forward- (517) und Reverse- Primer (517), insbesondere am 5'-Ende, eine Einzelstrangbruch-Sequenz umfasst, über die mittels eines Einzelstrangbruch-induzierenden Enzyms ein Einzelstrangbruch induzierbar ist und/oder wobei der Selektionsmarker an eine interne, nicht endständige Base der Universal-Sequenz gekoppelt ist. Mikrofluidisches Verfahren, nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Amplifikationsmischung Zelllyse-unterstützend ist und/oder ein Einzelstrangbruch- induzierenden Enzyms umfasst. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Amplifikation eine isothermale Amplifikation, insbesondere eine semi-specific Multiple Displacement Amplification (ssMDA) ist. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Überführen einer Amplifikations- Reaktion aus der zumindest einen Mikrokavität (110) und/oder zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- eaktionen unterschiedlicher Mikrokavitäten (110), die nicht-wässrige Phase verdrängt wird oder die zumindest eine Mikrokavität (110) eine, insbesondere nach unten gerichtete, weitere Öffnung in der Wandung aufweist. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Aufreinigung von Biomarker-Targetamplifikaten (542) mittels Fängermolekülen (543), insbesondere mittels an magnetische Beads immobilisierten Fängermolekülen (543), erfolgt. Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 12, wobei bei einer Elution der Biomarker- Targetamplifikate (542) von dem Fängermolekül (543) die Protelomerase TelN oder eine Enzymmutante derer verwendet wird, welche die beiden Einzelstrangmoleküle der DNA-Doppelhelix an der Schnittstelle kovalent miteinander verbindet und hierbei eine Haarnadel-Struktur hinterlässt, insbesondere zur Durchführung einer isothermalen Rolling Circle Amplification (RCA) zur weiteren Anreicherung der Biomarker-Targetamplifikate (542). Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen (510), insbesondere vorab angefärbte, zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind. Steuergerät, das eingerichtet ist, um die Schritte eines Verfahrens gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1-14 in entsprechenden Einheiten, insbesondere in einer mikrofluidischen Kartusche, auszuführen und/oder anzusteuern. Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, die Schritte des mikrofluidischen Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-14 auszuführen und/oder anzusteuern.
17. Maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 16 gespeichert ist.
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