EP4573194A1 - Leistungsverbesserte protease-varianten ix - Google Patents

Leistungsverbesserte protease-varianten ix

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Publication number
EP4573194A1
EP4573194A1 EP23758225.9A EP23758225A EP4573194A1 EP 4573194 A1 EP4573194 A1 EP 4573194A1 EP 23758225 A EP23758225 A EP 23758225A EP 4573194 A1 EP4573194 A1 EP 4573194A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protease
amino acid
positions
seq
cleaning
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23758225.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shohana ISLAM
Christian DEGERING
Susanne Wieland
Inken Prueser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102022208890.5A external-priority patent/DE102022208890A1/de
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP4573194A1 publication Critical patent/EP4573194A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38618—Protease or amylase in liquid compositions only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/94—Pancreatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)

Definitions

  • the invention lies in the field of enzyme technology.
  • the invention relates to proteases whose amino acid sequence has been changed, particularly with a view to use in detergents and cleaning agents, in particular with regard to liquid detergents and cleaning agents, in order to improve their cleaning performance, and to the nucleic acids encoding them and their production.
  • the invention further relates to the uses of these proteases and processes in which they are used, as well as agents containing them, in particular detergents and cleaning agents, in particular liquid detergents and cleaning agents.
  • proteases are suitable for use in liquid surfactant-containing preparations. Many proteases do not show any in such preparations sufficient catalytic performance or they are not sufficiently stable. For the use of proteases in cleaning agents, high catalytic activity and stability under conditions such as those encountered during a washing process are therefore particularly desirable.
  • protease from Bacillus pumilus or a sufficiently similar protease (based on the sequence identity), which, based on the numbering according to SEQ ID NO: 1 (i), is at positions corresponding to positions 9, 89, 130 , 133, 144, 189, 217, 224, 252 and 271 correspond, the amino acid substitutions P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T and Q271 E and (II) in at least one and increasingly preferred to two , three, four, five or six of the positions corresponding to positions 6, 61, 62, 101, 170 and 188, at least one and increasingly preferably two, three, four, five or six amino acid substitution (s), preferably from the a group consisting of Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G and N188G
  • the invention therefore relates to a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence specified in SEQ ID NO:1 over its entire length to at least 70% and increasingly preferably to at least 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96, 5%, 97%, 97.5% and 98% is identical, and each based on the numbering according to SEQ ID NO:1, (i) at the positions corresponding to positions 9, 89, 130, 133, 144, 189 , 217, 224, 252 and 271, the amino acid substitutions P9T, S89A, N130D, T133A
  • a further subject of the invention is a method for producing a protease as defined above, comprising introducing (i) the amino acid substitutions P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T and Q271 E at the positions referred to to the numbering according to SEQ ID NO:1 correspond to positions 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 and 271, and (ii) at least one and increasingly preferably two, three, four, five or six Amino acid substitution(s) at at least one and increasingly preferably two, three, four, five or six of the positions corresponding to positions 6, 61, 62, 101, 170 and 188 based on the numbering according to SEQ ID NO:1, preferably selected from the group consisting of Y6W, F61 G, Q62N, D101 S, D101 E, D101A, K170G and N188G, into a starting molecule
  • a protease within the meaning of the present patent application therefore includes both the protease as such and a protease produced using a method according to the invention. All statements on the protease therefore refer both to the protease as such and to the proteases produced using appropriate processes.
  • proteases relate to the nucleic acids encoding these proteases, non-human host cells containing proteases according to the invention or nucleic acids, and agents comprising proteases according to the invention, in particular detergents and cleaning agents, in particular liquid detergents and cleaning agents, washing and cleaning processes, and uses of the proteases according to the invention in detergents or cleaning agents to remove protease-sensitive soiling.
  • agents comprising proteases according to the invention, in particular detergents and cleaning agents, in particular liquid detergents and cleaning agents, washing and cleaning processes, and uses of the proteases according to the invention in detergents or cleaning agents to remove protease-sensitive soiling.
  • At least one means one or more, i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or more .
  • agent and cleaning agent or “washing or cleaning agent” as used herein is synonymous with the term “agent” and refers to a composition for cleaning textiles and / or hard surfaces, in particular dishes, as in the description explained.
  • “Substantially free of” means that the composition or agent contains less than 2% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0.5% by weight and particularly preferably less than 0. 1% by weight of the corresponding substance, based on the total weight of the composition/agent.
  • Liquid as used herein includes liquids and gels as well as pasty compositions. It is preferred that the liquid compositions be flowable and pourable at room temperature, but it is also possible that they have a yield point.
  • a substance for example a composition or an agent, is solid according to the definition of the invention if it is in the solid state at 25 ° C and 1013 mbar.
  • Liquid also includes gel form.
  • Variant refers to natural or artificially created variations of a native protease that have an amino acid sequence modified from the reference form.
  • the present invention is based on the inventors' surprising finding that amino acid substitutions at the positions described herein result in improved cleaning performance of this modified protease in detergents and cleaning agents.
  • the changes according to the invention result in (i) at the positions which correspond to positions 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 and 271 based on the numbering according to SEQ ID NO:1, and ( ii) at least one of the positions that correspond to positions 6, 61, 62, 101, 170 and 188 based on the numbering according to SEQ ID NO:1, to an improved cleaning performance of this modified protease in detergents and cleaning agents, in particular liquid laundry detergents - and cleaning agents, on at least one and increasingly preferably two, three, four or five protease-sensitive soils, preferably from blood, egg (yellow), milk and other protein-containing soils existing group is/are selected.
  • Proteases according to the invention consequently enable improved removal of at least, preferably several, protease-sensitive stains on textiles and/or hard surfaces, for example dishes.
  • the protease (i) has the amino acid substitutions P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T and Q271 E and (ii) at least one, and increasingly preferably two, three, four, five or six, of the positions corresponding to positions 6, 61, 62, 101, 170 and 188 and increasingly preferably two, three, four, five or six amino acid substitution(s) selected from the group consisting of Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G and N188G, the combination of the amino acid substitutions being Group (i) and the at least one amino acid substitution from group (ii) to an improved cleaning performance of this modified protease in detergents and cleaning agents on at least one and increasingly preferably two, three, four or five protease-sensitive soil(s), which preferably come from the blood, egg (yellow), milk
  • the protease according to the invention is a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which is at least 70% and increasingly preferably at least 71%, 72%, 73% of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO:1 over its entire length.
  • the protease according to the invention is a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which is at least 70% and increasingly preferably at least 71%, 72%, 73% of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO:1 over its entire length.
  • the protease according to the invention is a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which is at least 70% and increasingly preferably at least 71%, 72%, 73% of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO:1 over its entire length.
  • the protease according to the invention is a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which is at least 70% and increasingly preferably at least 71%, 72%, 73% of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO:1 over its entire length.
  • the protease according to the invention is a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which is at least 70% and increasingly preferably at least 71%, 72%, 73% of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO:1 over its entire length.
  • protease activity can be determined via the release of the chromophore para-nitroaniline (pNA) from the substrate suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide (AAPF).
  • pNA chromophore para-nitroaniline
  • the protease cleaves the substrate and releases pNA.
  • the release of pNA causes an increase in the absorbance at 410 nm, the time course of which is a measure of the enzymatic activity (cf. Del Mar et al., 1979).
  • the measurement is carried out at a temperature of 25°C, at pH 8.6, and a wavelength of 410 nm.
  • the measurement time is 5 min and the measurement interval is 20 s to 60 s.
  • the protease activity is usually expressed in protease units (PE ) specified. Suitable protease activities are, for example, 2.25, 5 or 10 PE per ml of wash liquor. However, the protease activity is not zero.
  • An alternative test for determining the proteolytic activity of the proteases according to the invention is an optical measurement method, preferably a photometric method.
  • the test suitable for this involves the protease-dependent cleavage of the substrate protein casein. This is broken down by the protease into a large number of smaller partial products. The entirety of these partial products has an increased absorption at 290 nm compared to non-cleaved casein, whereby this increased absorption can be determined using a photometer and thus a conclusion can be drawn about the enzymatic activity of the protease.
  • the protein concentration can be determined using known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid; 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the Biuret method (Gornall et al., J. Biol. Chem. 177 (1948): 751-766).
  • the active protein concentration can be determined by titrating the active centers using a suitable irreversible inhibitor and determining the residual activity (cf. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966): 5890-5913).
  • Such another compound can also be another protein, which is bound to a protein according to the invention, for example via bifunctional chemical compounds.
  • Derivatization also means covalent binding to a macromolecular carrier, or non-covalent inclusion in suitable macromolecular cage structures. Derivatizations can, for example, influence the substrate specificity or the binding strength to the substrate or cause a temporary blocking of the enzymatic activity if the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the storage period. Such modifications may further affect stability or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and/or immunogenicity of the protein and thus, for example, to increase its skin compatibility.
  • couplings with macromolecular compounds can improve the protein in terms of stability and/or skin compatibility.
  • Derivatives of a protein according to the invention can also be understood in the broadest sense as preparations of these proteins.
  • a protein can be combined with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein can also have been specifically mixed with other substances, for example to increase its storage stability. All preparations of a protein according to the invention are therefore also in accordance with the invention. This is also independent of whether it actually develops this enzymatic activity in a particular preparation or not.
  • proteases or protease variants and/or derivatives described above those whose storage stability and/or their cleaning performance are particularly preferred in the context of the present invention the initial variant is improved, with the cleaning performance in a washing system being determined as described herein.
  • a further subject of the invention is a nucleic acid which codes for a protease according to the invention, and a vector containing such a nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.
  • a nucleic acid which codes for a protease according to the invention
  • a vector containing such a nucleic acid in particular a cloning vector or an expression vector.
  • These can be DNA or RNA molecules. They can be present as a single strand, as a single strand complementary to this single strand, or as a double strand.
  • the sequences of both complementary strands must be taken into account in all three possible reading frames.
  • different codons i.e. base triplets, can code for the same amino acids, so that a specific amino acid sequence can be coded by several different nucleic acids.
  • Codon use means the translation of the genetic code into amino acids by the respective organism. Bottlenecks in protein biosynthesis can occur if the codons on the nucleic acid are confronted with a comparatively small number of loaded tRNA molecules in the organism. Although encoding the same amino acid, this results in a codon being translated less efficiently in the organism than a synonymous codon encoding the same amino acid. Due to the presence of a higher number of tRNA molecules for the synonymous codon, it can be translated more efficiently in the organism.
  • vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. They can exist extrachromosomally as separate units or integrate into a chromosome or chromosomal DNA.
  • Expression vectors include nucleic acid sequences which enable them to replicate in the host cells containing them, preferably microorganisms, particularly preferably bacteria, and to express a nucleic acid contained there. Expression is particularly influenced by the promoter(s) that regulate transcription. In principle, expression can take place through the natural promoter originally located in front of the nucleic acid to be expressed, but also through a host cell promoter provided on the expression vector or through a modified or a completely different promoter from another organism or another host cell.
  • At least one promoter for the expression of a nucleic acid according to the invention is made available and used for its expression.
  • Expression vectors can also be regulated, for example by changing the cultivation conditions or when the host cells they contain reach a certain cell density or by adding certain substances, in particular activators of gene expression.
  • An example of such a substance is the galactose derivative isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG), which is used as an activator of the bacterial lactose operon (lac operon).
  • IPTG galactose derivative isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside
  • lac operon lac operon
  • a further subject of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention, or which contains a protease according to the invention, in particular one which secretes the protease into the medium surrounding the host cell.
  • a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention is preferably transformed into a microorganism, which then represents a host cell according to the invention.
  • individual components, ie nucleic acid parts or fragments of a nucleic acid according to the invention can also be introduced into a host cell in such a way that the resulting host cell then contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
  • This procedure is particularly suitable if the host cell already contains one or more components of a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention and the other components are then supplemented accordingly.
  • Methods for transforming cells are established in the prior art and are well known to those skilled in the art. In principle, all cells are suitable as host cells, i.e. prokaryotic or eukaryotic cells. Preferred are those host cells that can be handled in a genetically advantageous manner, for example in terms of transformation with the nucleic acid or vector and its stable establishment, for example single-celled fungi or bacteria. Furthermore, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological manageability.
  • Preferred host cells according to the invention secrete the (transgenically) expressed protein into the medium surrounding the host cells.
  • the proteases can be modified by the cells that produce them after their production, for example by attaching sugar molecules, formylation, amination, etc. Such post-translational modifications can functionally influence the protease.
  • Further preferred embodiments represent host cells whose activity can be regulated due to genetic regulatory elements that are provided, for example, on the vector, but can also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the cultivation conditions or when a certain cell density is reached, these can be stimulated to express themselves. This enables economical production of the proteins according to the invention.
  • An example of such a connection is IPTG as described above.
  • Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells.
  • Bacteria are characterized by short generation times and low demands on cultivation conditions. This allows cost-effective cultivation processes or manufacturing processes to be established. The expert also has a wealth of experience with bacteria in fermentation technology.
  • Gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a specific production for a variety of reasons that can be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time required, etc.
  • gram-negative bacteria such as Escherichia coli, a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, i.e. into the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be advantageous for special applications.
  • gram-negative bacteria can also be designed in such a way that they release the expressed proteins not only into the periplasmic space, but into the medium surrounding the bacterium.
  • Gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of the Actinomycetales do not have an outer membrane, so that secreted proteins are immediately released into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium, from which the expressed proteins can be purified. They can be isolated directly from the medium or further processed.
  • gram-positive bacteria are related or identical to most organisms of origin for technically important enzymes and usually produce comparable enzymes themselves, so that they have similar codon usage and their protein synthesis apparatus is naturally aligned accordingly.
  • Host cells according to the invention can be modified in terms of their requirements for the culture conditions, have other or additional selection markers or express other or additional proteins. In particular, these can also be host cells that transgenically express several proteins or enzymes.
  • the present invention is in principle applicable to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, particularly preferably to those of the genus Bacillus, and means that proteins according to the invention can be produced by using such microorganisms. Such microorganisms then represent host cells within the meaning of the invention.
  • the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the group of genera Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacte um, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one, which is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus camosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces co
  • the host cell can also be a eukaryotic cell, which is characterized by the fact that it has a nucleus.
  • a further subject of the invention is therefore a host cell which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples of this are fungi such as actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. This can be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in connection with their synthesis that make such systems possible.
  • modifications that eukaryotic systems carry out, particularly in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low-molecular compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to reduce the allergenicity of an expressed protein. Co-expression with the enzymes naturally formed by such cells, such as cellulases, can also be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems can be particularly suitable for expressing temperature-stable proteins or variants.
  • the host cells according to the invention are cultivated and fermented in the usual way, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after a period of time to be determined experimentally.
  • Continuous fermentations are characterized by reaching a steady state in which cells partially die over a comparatively long period of time but also grow back and at the same time the protein formed can be removed from the medium.
  • Host cells according to the invention are preferably used to produce proteases according to the invention.
  • a further subject of the invention is therefore a method for producing a protease comprising a) cultivating a host cell according to the invention, and b) isolating the protease from the culture medium or from the host cell.
  • This subject matter of the invention preferably includes fermentation processes. Fermentation processes are known from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example that according to the invention Proteases. All fermentation processes that are based on a corresponding process for producing a protease according to the invention represent embodiments of this subject matter of the invention. Fermentation processes that are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy are particularly suitable. The media components that are consumed by ongoing cultivation are added. As a result, considerable increases can be achieved both in cell density and in cell mass or dry mass and/or in particular in the activity of the protease of interest.
  • the fermentation can also be designed in such a way that undesirable metabolic products are filtered out or neutralized by adding buffer or appropriate counterions.
  • the produced protease can be harvested from the fermentation medium. Such a fermentation process is preferred over isolation of the protease from the host cell, ie product preparation from the cell mass (dry mass), but requires the provision of suitable host cells or one or more suitable secretion markers or mechanisms and / or transport systems so that the host cells Secrete protease into the fermentation medium.
  • the protease can be isolated from the host cell, ie purified from the cell mass, for example by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, or by chromatographic purification.
  • a further subject of the invention is an agent which is characterized in that it contains a protease according to the invention as described above.
  • the agent is preferably a detergent or cleaning agent.
  • the detergent and cleaning agent is essentially free of boron-containing compounds. “Substantially free of boron-containing compounds” in this context means that the agents according to the invention contain less than 2% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0.5% by weight and particularly preferably less than 0.1% by weight of boron-containing compounds, based on the total weight of the agent.
  • the detergents and cleaning agents according to the invention are free of boron-containing compounds, i.e. in particular they do not contain any boric acid and/or phenylboronic acid derivatives.
  • the detergents or cleaning agents according to the invention which can be present as powdery or granular solids, in compressed or post-compacted particle form, as homogeneous solutions or suspensions, can contain, in addition to a protease according to the invention, all known ingredients that are customary in such agents, with preferably at least one further ingredient in the means is available.
  • the agents according to the invention can in particular contain surfactants, builders (builders), polymers, glass corrosion inhibitors, corrosion inhibitors, bleaching agents such as peroxygen compounds, bleach activators or bleach catalysts.
  • the embodiments of the present invention include all solid, powdery, liquid, gel or pasty dosage forms of agents according to the invention, which may also consist of several phases and may be in compressed or non-compressed form.
  • the agent can be in the form of a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g/l to 1200 g/l, in particular 500 g/l to 900 g/l or 600 g/l to 850 g/l.
  • the solid dosage forms of the agent also include extrudates, granules, tablets or Pouches.
  • the agent can also be liquid, gel or pasty, for example in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • Liquid assets are generally preferred.
  • the agent can be present as a one-component system. Such means consist of one phase. Alternatively, a means can also consist of several phases. Such a product is therefore divided into several components.
  • the proteases according to the invention are preferably used in liquid detergents for cleaning textiles, particularly preferably in liquid detergents with a pH of about 8 to about 9.
  • Detergents or cleaning agents according to the invention can only contain a protease according to the invention. Alternatively, they can also contain further hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration appropriate for the effectiveness of the agent. A further embodiment of the invention therefore represents agents which further comprise one or more further enzymes.
  • enzymes which can preferably be used are all enzymes which can develop a catalytic activity in the agent according to the invention, in particular a lipase, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xyloglucanase, ß-glucosidase, pectinase, carrageenase, perhydrolase, Oxidase, oxidoreductase or other proteases - which can be distinguished from the proteases according to the invention - and mixtures thereof.
  • Further enzymes are advantageously contained in the agent in an amount of 1 x 10 -8 to 5% by weight based on active protein. Increasingly preferred is each further enzyme in an amount of 1 x 10 -7 to 3% by weight, from 0.00001 to 1% by weight, from 0.00005 to 0.5% by weight, from 0.0001 up to 0.1% by weight and particularly preferably from 0.0001 to 0.05% by weight in agents according to the invention, based on active protein.
  • the enzymes particularly preferably show synergistic cleaning performance against certain dirt or stains, ie the enzymes contained in the agent support each other in their cleaning performance.
  • such a synergism exists between the protease contained according to the invention and a further enzyme of an agent according to the invention, including in particular between the protease mentioned and an amylase and/or a lipase and/or a mannanase and/or a cellulase and/or a pectinase .
  • Synergistic effects can occur not only between different enzymes, but also between one or more enzymes and other ingredients of the agent according to the invention.
  • Textile detergents preferred according to the invention have at least one protease and at least one amylase.
  • textile detergents have at least one protease and at least one cellulase.
  • textile detergents have at least one protease and at least one lipase.
  • textile detergents have at least one protease, at least one amylase and at least one lipase.
  • textile detergents have at least one protease, at least one amylase and at least one cellulase.
  • textile detergents have at least one protease, at least one amylase, at least one cellulase and at least one lipase.
  • Textile detergents which have 3 to 10 different enzymes are particularly preferred, with textile detergents which have 3 to 10 different types of enzymes being particularly preferred in terms of their cleaning performance against a very wide range of stains.
  • proteases are the subtilisins BPN' from Bacillus amyloliquefaciens and Carlsberg from Bacillus! formis, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K and the proteases TW3 and TW7, which are classified as subtilases but no longer as subtilisins in the narrower sense.
  • Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from the company Novozymes.
  • subtilisins 147 and 309 are sold by the company Novozymes under the trade names Esperase® and Savinase®, respectively.
  • Protease variants are derived from the protease from Bacillus lentus DSM 5483, described in e.g. WO 95/23221, WO 92/21760 WO 2013/060621 and EP 3660151.
  • proteases are, for example, those under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase®, Progress Uno 101 L® and Ovozyme® from the company Novozymes, which are sold under the trade names, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase®, Properase®, Preference P100® and Preference P300® from the company Danisco/DuPont, sold under the trade name Lavergy pro 104 LS® from the company BASF, sold under the trade name Protosol® from the company Advanced Biochemicals Ltd., sold under the trade name Wuxi® from the company Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., the enzymes available under the trade names Proleather® and Protease P® from the company Amano Pharmaceuticals Ltd., and the enzymes available under the name Proteinase K-16 from the company Kao Corp.
  • proteases from Bacillus gibsonii and Bacillus pumilus which are disclosed in WO 2008/086916, WO 2007/131656, WO 2017/215925, WO 2021/175696 and WO 2021/175697.
  • Other proteases that can be used are those that are naturally present in the microorganisms Stenotrophomonas maltophilia, in particular Stenotrophomonas maltophilia K279a, Bacillus intermedius and Bacillus sphaericus.
  • amylases are the a-amylases borrowed from Bacillus! formis, Bacillus amyloliquefaciens or Bacillus stearothermophilus and, in particular, their further developments that have been improved for use in detergents or cleaning agents.
  • the enzyme from Bacillus licheniformis is available from the company Novozymes under the name Termamyl® and from the company Danisco/DuPont under the name Purastar® ST. Further development products of this a-amylase are available under the trade names Duramyl® and Termamyl® ultra (both from Novozymes), Purastar® OxAm (Danisco/DuPont) and Keistase® (Daiwa Seiko Inc.).
  • the a-amylase from Bacillus amyloliquefaciens is sold by the Novozymes company under the name BAN®, and derived variants of the a-amylase from Bacillus stearothermophilus under the names BSG® and Novamyl®, also by the Novozymes company. Furthermore, the ⁇ -amylase from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and the cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) from Bacillus agaradherens (DSM 9948) should be highlighted. Fusion products of all the molecules mentioned can also be used.
  • Suitable cellulases include those of bacterial or fungal origin. Chemically modified or protein engineered mutants are included. Suitable cellulases are cellulases from the genera Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, e.g. B. the fungal cellulases from Humicola insolens, Myceliophthora thermophila and Fusarium oxysporum, which are disclosed in US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 and WO 89/09259. Particularly suitable cellulases are the alkaline or neutral cellulases with color-care properties.
  • cellulases examples include cellulases described in EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 and WO 98/08940.
  • Examples of cellulases with endo-1,4-glucanase activity are described in WO 2002/099091, e.g. those with a sequence of at least 97% identity to the amino acid sequence of positions 1 to 773 of SEQ ID NO: 2 of WO 2002/099091.
  • a further example may include a GH44 xyloglucanase, e.g.
  • a xyloglucanase enzyme with a sequence of at least 60% identity to positions 40 to 559 of SEQ ID NO:2 of WO 2001/062903.
  • Commercially available cellulases include CelluzymeTM, CarezymeTM, Carezyme PremiumTM, CellucleanTM (e.g.
  • CellucleanTM 5000L and CellucleanTM 4000T Celluclean ClassicTM, CellusoftTM, Endolase®, Renozyme® and WhitezymeTM (Novozymes A/S) , ClazinaseTM and Puradax HATM (Genencor International Inc.), KAC-500(B)TM (Kao Corporation), RevitalenzTM 1000, RevitalenzTM 2000 and RevitalenzTM 3000 (DuPont), and Ecostone® and Biotouch® (AB Enzymes ).
  • Lipases or cutinases can be used as further enzymes, in particular because of their triglyceride-cleaving activities, but also in order to generate peracids in situ from suitable precursors.
  • Suitable lipases and cutinases are those of bacterial or fungal origin. Chemically modified or protein engineered mutant enzymes are included. Examples are lipase from Thermomyces, for example from T. lanuginosus (formerly called Humicola lanuginosa), as described in EP 0258068 and EP 0305216, cutinase from Humicola, for example H.
  • insolens (WO 96/13580), lipase from strains of Pseudomonas (some of them now renamed Burkholderia), e.g. P. alcaligenes or P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. sp. strain SD705, P.
  • Preferred lipases include, for example, the lipases originally available from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) or further developed therefrom, in particular those with one or more of the following amino acid exchanges starting from the lipase mentioned in the positions D96L, T213R and / or N233R, particularly preferably T213R and N233R.
  • To Preferred commercial lipase products include LipolaseTM, LipexTM, LipolexTM and LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (Genencor/DuPont) and Lipomax (Gist-Brocades).
  • oxidoreductases for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases such as halo-, chloro-, bromo-, lignin-, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases)
  • oxidoreductases for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases such as halo-, chloro-, bromo-, lignin-, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases)
  • organic, particularly preferably aromatic, compounds that interact with the enzymes are added in order to increase the activity of the relevant oxidoreductases (enhancers) or to ensure the flow of electrons in the case of very different redox potentials between the oxidizing enzymes and the soils (mediators).
  • the enzymes to be used can also be formulated together with accompanying substances, for example from fermentation.
  • the enzymes are preferably used as enzyme liquid formulation(s).
  • the enzymes are generally not provided in the form of pure protein, but rather in the form of stabilized, storable and transportable preparations.
  • These prefabricated preparations include, for example, the solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization or, in particular in the case of liquid or gel-like agents, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, with little water and/or mixed with stabilizers or other auxiliaries.
  • the enzymes can be encapsulated for both the solid and liquid dosage forms, for example by spray drying or extrusion of the enzyme solution together with a preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes are enclosed as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is covered with a water-, air- and/or chemical-impermeable protective layer.
  • Additional active ingredients such as stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaches or dyes, can also be applied in superimposed layers.
  • Such capsules are applied using methods known per se, for example by shaking or rolling granulation or in fluid bed processes. Such granules are advantageously low-dust, for example by applying polymeric film formers, and are storage-stable due to the coating.
  • the enzymes can also be incorporated into water-soluble films, such as those used, for example, in the packaging of detergents and cleaning agents in unit dosage form. Such a film allows the enzymes to be released after contact with water.
  • water soluble refers to a film structure that is preferably completely water soluble. Such a film preferably consists of (completely or partially hydrolyzed) polyvinyl alcohol (PVA).
  • PVA polyvinyl alcohol
  • a further subject of the invention is a method for cleaning textiles and/or hard surfaces, in particular dishes, which is characterized in that an agent according to the invention is used in at least one method step.
  • the method described is characterized in that the protease is at a temperature of about 0°C to about 100°C, preferably about 20°C to about 60°C and more preferably about 20°C to about 40°C is used.
  • Methods for cleaning textiles are generally characterized by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned in several process steps and washed off after the exposure time, or that the items to be cleaned are treated in some other way with a detergent or a solution or dilution of this agent.
  • proteases according to the invention naturally already have a hydrolytic activity and also develop this in media that otherwise have no cleaning power, such as in mere buffer, a single and / or the only step of such a method can consist of a protease according to the invention as the only cleaning-active component is brought into contact with the soiling, preferably in a buffer solution or in water. This represents a further embodiment of this subject matter of the invention.
  • Alternative embodiments of this subject matter of the invention also represent processes for the treatment of textile raw materials or for textile care, in which a protease according to the invention becomes active in at least one process step.
  • processes for textile raw materials, fibers or textiles with natural components are preferred, and especially for those with wool or silk.
  • the invention also covers the use of the proteases described herein in detergents or cleaning agents, for example as described above, for (improved) removal of peptide or protein-containing soils, for example from textiles and/or hard surfaces.
  • the invention relates to the use of a protease according to the invention described herein in a washing or cleaning agent to improve the cleaning performance on at least one and increasingly preferably on two, three, four or five protease-sensitive soil(s), preferably from the blood -, egg (yellow), milk and other protein-containing soils is/are selected, the improvement in cleaning performance compared to a reference protease, as described in Example 2, being determined, in particular in a temperature range from about 20 ° C to about 40°C.
  • the invention relates to the use of a protease in a detergent or cleaning agent, in particular liquid detergent or cleaning agent, to improve the cleaning performance on at least one and increasingly preferably on two, three, four or five protease-sensitive soil(s), which is/are preferably selected from the group consisting of blood, egg (yellow), milk and other protein-containing soils, the improvement in cleaning performance compared to a reference protease , as described in Example 2, is determined, in particular in a temperature range of about 20 ° C to about 40 ° C, wherein the protease is a protease that has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence corresponding to that in SEQ ID NO: 1 specified amino acid sequence over their total length to at least 70% and increasingly preferably to at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%
  • Protease activity was determined in a batch assay using casein as substrate.
  • the final concentration of the substrate solution was 12 mg/ml casein (prepared according to Hammarsten; Merck, Darmstadt, #2242) and 30 mM Tris in synthetic tap water.
  • Synthetic tap water is a solution of 0.029% (w/v) CaCh • 2 H2O, 0.014% (w/v) MgCh • 6 H2O and 0.021% (w/v) NaHCCh with 15° dH (German hardness).
  • the substrate solution was heated to 70°C and the pH adjusted to 8.5 at 50°C using 0.1N NaOH.
  • the protease solution was prepared by adding 2% (w/v) anhydrous pentasodium tripolyphosphate to synthetic tap water and adjusting to pH 8.5 with hydrochloric acid. 200 ⁇ l of the enzyme solution were added to 600 ⁇ l of the casein solution. The mixture was incubated at 50°C for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 600 ⁇ l of 0.44 M trichloroacetic acid (TCA), 0.22 M sodium acetate in 3% (w/v). After cooling on ice for 15 minutes, the TCA-insoluble protein was removed by centrifugation.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the cleaning performance was determined in miniwash tests with Bacillus subtilis culture supernatants containing the expressed protease variants.
  • the supernatants were used with the same activity as the benchmark (1.15 pg/ml active enzyme protein in the wash liquor).
  • AY ariante was determined for each protease and all AYvariant values of all stains per variant were summed to determine SAY ariante.
  • both AYpi (for each soiling) and SAYPI (total cleaning performance) were normalized to 100% and the relative cleaning performance of the variants according to the invention was calculated. A >15% increase in overall performance is considered a significant performance increase.
  • proteases P2 to P8 according to the invention show significantly improved washing performance at both 20 ° C and 40 ° C compared to the benchmark protease P1.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Proteasen, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 1, (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61, 62, 101, 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en) aufweist, sowie deren Herstellung und Verwendung. Derartige Proteasen zeigen eine sehr gute Reinigungsleistung.

Description

LEISTUNGSVERBESSERTE PROTEASE-VARIANTEN IX
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Proteasen, deren Aminosäuresequenz insbesondere im Hinblick auf den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln, insbesondere im Hinblick auf flüssige Wasch- und Reinigungsmittel, verändert wurden, um ihre Reinigungsleistung zu verbessern, und die für sie codierende Nukleinsäuren sowie deren Herstellung. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendungen dieser Proteasen und Verfahren, in denen sie eingesetzt werden, sowie diese enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, insbesondere flüssige Wasch- und Reinigungsmittel.
Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Für Wasch- und Reinigungsmittel sind sie die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren Serin-Proteasen sind. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen und hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel "Subtilases: Subtilisin-Iike Proteases" von R. Siezen, Seiten 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet. Hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sezernierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.
Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die alkalische Protease aus Bacillus lentus, insbesondere aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7, sowie Varianten der genannten Proteasen, die eine gegenüber der Ausgangsprotease veränderte Aminosäuresequenz aufweisen. Proteasen werden durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren gezielt oder zufallsbasiert verändert und so beispielsweise für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert. Dazu gehören Punkt-, Deletions- oder Insertionsmutagenese oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen. So sind für die meisten aus dem Stand der Technik bekannten Proteasen entsprechend optimierte Varianten bekannt. In EP 2016175 und WO 2021/175697 sind beispielsweise eine für Wasch- und Reinigungsmittel vorgesehene Protease aus Bacillus pumilus bzw. Varianten davon offenbart.
Generell sind nur ausgewählte Proteasen für den Einsatz in flüssigen tensidhaltigen Zubereitungen überhaupt geeignet. Viele Proteasen zeigen in derartigen Zubereitungen keine ausreichende katalytische Leistung oder aber sie sind nicht ausreichend stabil. Für die Anwendung von Proteasen in Reinigungsmitteln ist daher eine hohe katalytische Aktivität und Stabilität unter Bedingungen, wie sie sich während eines Waschvorgangs darstellen, besonders wünschenswert.
Folglich haben Protease- und Tensid-haltige flüssige Formulierungen aus dem Stand der Technik den Nachteil, dass die enthaltenen Proteasen unter Standard-Waschbedingungen (z.B. in einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 40°C) keine zufriedenstellende proteolytische Aktivität aufweisen und/oder nicht ausreichend lagerstabil sind, und die Formulierungen daher keine optimale Reinigungsleistung an proteasesensitiven Anschmutzungen zeigen. Es besteht weiterhin Bedarf, die Reinigungsleistung von enzymhaltigen, insbesondere proteasehaltigen, Wasch- und Reinigungsmitteln zu verbessern, insbesondere hinsichtlich der Reinigungsleistung an proteasesensitiven Anschmutzungen, insbesondere in einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 40°C.
Überraschenderweise wurde jetzt festgestellt, dass eine Protease aus Bacillus pumilus oder eine hierzu hinreichend ähnliche Protease (bezogen auf die Sequenzidentität), die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G, bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, aufweist, hinsichtlich ihrer Waschleistung gegenüber der Wildtypform (SEQ ID NO:1) bzw. einer Ausgangsvariante (Referenzprotease) verbessert ist, und daher besonders für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln, insbesondere flüssigen Wasch- und Reinigungsmitteln, geeignet ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en) aufweist.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben definierten Protease, umfassend das Einbringen (i) der Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E an den Positionen, die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, und (ii) mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, vorzugsweise ausgewählt aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101 S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe, in ein Ausgangsmolekül, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 70% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
Eine Protease im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung umfasst daher sowohl die Protease als solche als auch eine mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease. Alle Ausführungen zur Protease beziehen sich daher sowohl auf die Protease als solche wie auch auf die mittels entsprechender Verfahren hergestellten Proteasen.
Weitere Aspekte der Erfindung betreffen die für diese Proteasen codierenden Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Proteasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht-menschliche Wirtszellen sowie erfindungsgemäße Proteasen umfassende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, insbesondere flüssige Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren, und Verwendungen der erfindungsgemäßen Proteasen in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Entfernung von proteasesensitiven Anschmutzungen.
Diese und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann aus dem Studium der folgenden detaillierten Beschreibung und Ansprüche ersichtlich. Dabei kann jedes Merkmal aus einem Aspekt der Erfindung in jedem anderen Aspekt der Erfindung eingesetzt werden. Ferner ist es selbstverständlich, dass die hierin enthaltenen Beispiele die Erfindung beschreiben und veranschaulichen sollen, diese aber nicht einschränken und insbesondere die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
Alle Prozentangaben sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozent (Gew.-%). Numerische Bereiche, die in dem Format "von x bis y" angegeben sind, schließen die genannten Werte ein. Wenn mehrere bevorzugte numerische Bereiche in diesem Format angegeben sind, ist es selbstverständlich, dass alle Bereiche, die durch die Kombination der verschiedenen Endpunkte entstehen, ebenfalls erfasst werden.
"Mindestens ein(e)", wie hierin verwendet, bedeutet ein(e) oder mehrere, d.h. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 oder mehr.
Der Begriff "Wasch- und Reinigungsmittel" bzw. "Wasch- oder Reinigungsmittel", wie hierin verwendet, ist gleichbedeutend mit dem Begriff "Mittel" und bezeichnet eine Zusammensetzung zum Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen, insbesondere Geschirr, wie in der Beschreibung erläutert.
"Etwa", "ca." oder "ungefähr", wie hierin in Bezug auf einen Zahlenwert verwendet, beziehen sich auf den entsprechenden Zahlenwert ±10%, vorzugsweise ±5%.
"Im Wesentlichen frei von" bedeutet, dass die Zusammensetzung bzw. das Mittel weniger als 2 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 1 Gew.-%, weiter bevorzugt weniger als 0,5 Gew.-% und besonders bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-%, der entsprechenden Substanz, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung/des Mittels, enthält.
"Flüssig", wie hierin verwendet, schließt Flüssigkeiten und Gele sowie auch pastöse Zusammensetzungen ein. Es ist bevorzugt, dass die flüssigen Zusammensetzungen bei Raumtemperatur fließfähig und gießbar sind, es ist aber auch möglich, dass sie eine Fließgrenze aufweisen. Ein Stoff, z.B. eine Zusammensetzung oder ein Mittel ist gemäß Definition der Erfindung festförmig, wenn sie bei 25°C und 1013 mbar im festen Aggregatzustand vorliegt. Ein Stoff, z.B. eine Zusammensetzung oder ein Mittel ist gemäß Definition der Erfindung flüssig, wenn sie bei 25°C und 1013 mbar im flüssigen Aggregatzustand vorliegt. Dabei umfasst flüssig auch gelförmig.
"Variante", wie hierin verwendet, bezieht sich auf natürliche oder artifiziell erzeugte Variationen einer nativen Protease, die eine gegenüber der Referenzform abgewandelte Aminosäuresequenz aufweist.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass Aminosäuresubstitutionen an den hierin beschriebenen Positionen eine verbesserte Reinigungsleistung dieser veränderten Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln bewirkt.
In bevorzugten Ausführungsformen führen die erfindungsgemäße Veränderungen (i) an den Positionen, die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, zu einer verbesserten Reinigungsleistung dieser veränderten Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln, insbesondere flüssigen Wasch- und Reinigungsmittel, an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind. Erfindungsgemäße Proteasen ermöglichen folglich eine verbesserte Entfernung von mindestens, bevorzugt von mehreren, proteasesensitiven Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberflächen, beispielsweise Geschirr.
In bevorzugten Ausführungsformen weist die erfindungsgemäße Protease (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt ist, auf, wobei die Kombination der Aminosäuresubstitutionen aus Gruppe (i) und der mindestens einen Aminosäuresubstitution aus Gruppe (ii) zu einer verbesserten Reinigungsleistung dieser veränderten Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, führt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens zwei der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens zwei Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens drei der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens drei Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens vier der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens vier Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens fünf der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens fünf Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an den Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , eine der folgenden Aminosäuresubstitutionskombinationen, aufweist: (a) P9T-S89A-D101S-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (b) P9T- S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (c) P9T-S89A-D101 A- N 130D-T133A-N 144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (d) Y6W-P9T-S89A-N 130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (e) Y6W-P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (f) P9T-F61 G-Q62-N-S89A-N130D-T133A-N144K- N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; und (g) Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst die erfindungsgemäße Protease eine der folgenden Aminosäuresubstitutionskombinationen: (a) P9T-S89A-D101S-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (b) P9T-S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E; (c) P9T-S89A-D101 A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E; (d) Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (e) Y6W- P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (f) P9T-F61 G- Q62-N-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; und (g) Y6W-P9T- S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, wobei die Nummerierung jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 ist und wobei die Protease neben den genannten Aminosäuresubstitutionen keine weiteren Änderungen umfasst.
In bevorzugten Ausführungsformen führen die hierin beschriebenen Kombinationen der erfindungsgemäßen Aminosäuresubstitutionen aus Gruppe (i) und (ii) zu einer verbesserten Reinigungsleistung dieser veränderten Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln, insbesondere flüssigen Wasch- und Reinigungsmittel, an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier, fünf oder sechs proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, führt. Erfindungsgemäße Proteasen ermöglichen folglich eine verbesserte Entfernung von mindestens einer, bevorzugt von mehreren, proteasesensitiven Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberflächen, beispielsweise Geschirr. Typische proteasesensitive Anschmutzungen umfassen beispielsweise Ei(gelb)-, Blut-, Milch- und andere proteinhaltige Anschmutzungen. Eine erfindungsgemäße Verbesserung der Reinigungsleistung, insbesondere der proteolytischen Reinigungsleistung, liegt dann vor, wenn die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wie hierin beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, aufweist, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens zwei der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens zwei Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens drei der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens drei Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens vier der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens vier Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens fünf der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens fünf Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an den Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, Aminosäuresubstitutionen, die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Protease eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, und jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , eine der folgenden Aminosäuresubstitutionskombinationen, aufweist: (a) P9T-S89A-D101S-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (b) P9T- S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (c) P9T-S89A-D101 A- N 130D-T133A-N 144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (d) Y6W-P9T-S89A-N 130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (e) Y6W-P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (f) P9T-F61 G-Q62-N-S89A-N130D-T133A-N144K- N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; und (g) Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst die erfindungsgemäße Protease eine der folgenden Aminosäuresubstitutionskombinationen: (a) P9T-S89A-D101S-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (b) P9T-S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E; (c) P9T-S89A-D101 A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E; (d) Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (e) Y6W- P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (f) P9T-F61 G- Q62-N-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; und (g) Y6W-P9T- S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, wobei die Nummerierung jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 ist, wobei die Protease neben den genannten Aminosäuresubstitutionen keine weiteren Änderungen umfasst und wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
Erfindungsgemäße Proteasen verfügen über eine erhöhte katalytische Aktivität in Wasch- oder Reinigungsmitteln. In vielfältigen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Proteasen eine proteolytische Aktivität besitzen, die bezogen auf den Wildtyp (SEQ ID NO:1) und/oder eine bereits leistungsverbesserte Ausgangsvariante der Protease mindestens 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%,
120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%,
134%, 135%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150% oder mehr beträgt. Solche leistungsverbesserten Proteasen ermöglichen verbesserte Waschergebnisse an proteolytisch-sensitiven Anschmutzungen in verschiedenen Temperaturbereichen, insbesondere einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 40°C.
Ferner verfügen bevorzugte Ausführungsformen erfindungsgemäßer Proteasen über eine besondere Stabilität in Wasch- oder Reinigungsmitteln, beispielsweise gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder Chelatoren, und/oder gegenüber Temperatureinflüssen, insbesondere gegenüber hohen Temperaturen, beispielsweise zwischen etwa 50°C und etwa 65°C, insbesondere etwa 60°C, und/oder gegenüber sauren oder alkalischen Bedingungen und/oder gegenüber pH-Wert- Änderungen und/oder gegenüber denaturierenden oder oxidierenden Agentien und/oder gegenüber proteolytischem Abbau und/oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse. Mit besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden folglich leistungsverbesserte und/oder temperaturstabilere Protease- Varianten bereitgestellt. Mit weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden leistungsverbesserte und temperaturstabilere Protease-Varianten bereitgestellt. Solche vorteilhaften Ausführungsformen erfindungsgemäßer Proteasen ermöglichen folglich verbesserte Waschergebnisse an proteasesensitiven Anschmutzungen in einem weiten Temperaturbereich.
Unter Reinigungsleistung wird im Rahmen der Erfindung die Aufhellungsleistung an einer oder mehreren Anschmutzungen, insbesondere auf Wäsche oder Geschirr, verstanden. Im Rahmen der Erfindung weist sowohl das Wasch- oder Reinigungsmittel, welches die Protease umfasst bzw. die durch dieses Mittel gebildete Wasch- oder Reinigungsflotte, als auch die Protease selbst eine jeweilige Reinigungsleistung auf. Die Reinigungsleistung des Enzyms trägt somit zur Reinigungsleistung des Mittels bzw. der durch das Mittel gebildeten Wasch- oder Reinigungsflotte bei. Die Reinigungsleistung wird bevorzugt ermittelt wie weiter unten angegeben.
Unter Waschflotte wird diejenige das Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltende Gebrauchslösung verstanden, die auf Textilien oder Gewebe bzw. harte Oberflächen einwirkt und damit mit den auf Textilien bzw. Geweben oder harten Oberflächen vorhandenen Anschmutzungen in Kontakt kommt. Üblicherweise entsteht die Waschflotte, wenn der Wasch- oder Reinigungsvorgang beginnt und das Wasch- oder Reinigungsmittel beispielsweise in einer Geschirrspülmaschine, einer Waschmaschine oder in einem anderen geeigneten Behältnis mit Wasser verdünnt wird.
Die erfindungsgemäßen Proteasen weisen enzymatische Aktivität auf, d.h. sie sind zur Hydrolyse von Peptiden und Proteinen befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße Protease ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Amid/Peptidbindungen in Protein/Peptid-Substraten katalysiert und dadurch in der Lage ist, Proteine oder Peptide zu spalten. Ferner handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Protease vorzugsweise um eine reife (mature) Protease, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signal- und/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen auf jeweils reife (prozessierte) Enzyme.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist die Protease ein frei vorliegendes Enzym. Dies bedeutet, dass die Protease mit allen Komponenten eines Mittels direkt agieren kann und, falls es sich bei dem Mittel um ein Flüssigmittel handelt, dass die Protease direkt mit dem Lösungsmittel des Mittels (z.B. Wasser) in Kontakt steht. In anderen Ausführungsformen kann ein Mittel Proteasen enthalten, die einen Interaktionskomplex mit anderen Molekülen bilden oder die eine "Umhüllung" enthalten. Hierbei kann ein einzelnes oder mehrere Protease Moleküle durch eine sie umgebende Struktur von den anderen Bestandteilen des Mittels getrennt sein. Eine solche trennende Struktur kann entstehen durch, ist allerdings nicht beschränkt auf, Vesikel, wie etwa eine Micelle oder ein Liposom. Die umgebende Struktur kann aber auch ein Viruspartikel, eine bakterielle Zelle oder eine eukaryotische Zelle sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann ein Mittel Zellen von Bacillus pumilus oder Bacillus subtilis, die die erfindungsgemäßen Proteasen exprimieren, oder Zellkulturüberstände solcher Zellen enthalten.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet das Merkmal, dass eine Protease die angegebenen Substitutionen aufweist, dass sie an der jeweiligen Position eine (der angegebenen) Substitution(en) enthält, d.h. zumindest die angegebenen Positionen nicht anderweitig mutiert oder, beispielsweise durch Fragmentierung der Protease, deletiert sind. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen weisen die hierin beschriebenen Proteasen mit Ausnahme der explizit erwähnten Substitutionen die Sequenz von SEQ ID NO:1 auf, d.h. sind abgesehen von den substituierten Positionen 100% identisch zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO:1.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. z.B. Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215:403-410, und Altschul et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. z.B. Chenna et al. (2003) Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs, Nucleic Acid Res., 31 :3497-3500), T-Coffee (vgl. z.B. Notredame et al. (2000) T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, J. Mol. Biol., 302:205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert, oder Clone Manager 10 (Verwendung der Scoring Matrix BLOSUM 62 für Sequenz-Alignment auf Aminosäureebene). Soweit nicht anders angegeben, wird die hierin angegebene Sequenzidentität mit dem BLAST-Algorithmus bestimmt.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essenzielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, ggf. kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet die Angabe, dass eine Aminosäureposition einer numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO:1 entspricht daher, dass die entsprechende Position der numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO:1 in einem wie oben definierten Alignment zugeordnet ist. Weiterhin richtet sich die Zuordnung der Positionen nach dem reifen (maturen) Protein. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Protease eine höhere Zahl von Aminosäureresten umfasst als die Protease gemäß SEQ ID NO:1 . Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Protease gemäß SEQ ID NO:1 sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Protease diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind.
Zusätzlich zu den vorstehend erläuterten Aminosäureveränderungen können erfindungsgemäße Proteasen weitere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Proteasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen oder anderer Polypeptide genutzt werden. Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität oder katalytische Aktivität der Protease erhöht und dadurch ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierter Proteasen, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität bei Lagerung, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt sein.
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird hierin folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben- Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere oder alternative Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. "130D/V" bedeutet somit, dass die Position 130 zu D oder V mutiert ist. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt oder vor der entsprechenden Position ein A angegeben. Beispielsweise beschreibt P9T die Substitution von Prolin an Position 9 durch Threonin, P9TH die Insertion von Histidin nach der Aminosäure Threonin an Position 9 und P9* oder AP9 die Deletion von Prolin an Position 9. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Protease, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer Protease wie hierin beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, wobei die Protease in der Zählung gemäß SEQ ID NO:1 mindestens eine der vorstehend beschriebenen Aminosäuresubstitutionen aufweist. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z.B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
Alternativ oder ergänzend ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274 oder 275 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die proteolytische Aktivität verloren oder vermindert wird. Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Mutagenese ihre proteolytische Aktivität, d.h. ihre proteolytische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die proteolytische Aktivität mindestens 100%, vorzugsweise mindestens 120% der Aktivität des Ausgangsenzyms. Auch weitere Substitutionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere Substitutionen, der Protease gemäß SEQ ID NO:1 , die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, sind demnach die Positionen, die in einem Alignment den hierin beschriebenen Positionen entsprechen, d.h. in der Zählung gemäß SEQ ID NO:1 . An den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Protease folgende Aminosäurereste: 6Y, 9P, 61 F, 62Q, 89A, 101 D, 130N 133T, 144K, 170K, 188N, 189S, 217Y, 224S, 252N, 271 Q.
Eine weitere Bestätigung der korrekten Zuordnung der zu verändernden Aminosäuren, d.h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise verändert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Protease aus Bacillus pumilus gemäß SEQ ID NO:1 mit einer Veränderung eines enzymatischen Parameters einher, beispielsweise mit der Erhöhung des KM-Wertes, und wird eine entsprechende Veränderung des enzymatischen Parameters, beispielsweise also ebenfalls eine Erhöhung des KM-Wertes, in einer erfindungsgemäßen Protease- Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin eine Bestätigung der korrekten Zuordnung zu sehen.
Alle genannten Sachverhalte sind auch auf die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Protease anwendbar. Demnach umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren ferner einen oder mehrere der folgenden Verfahrensschritte:
(a) Einbringen einer ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäuresubstitution, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, aufweist;
(b) Veränderung der Aminosäuresequenz durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese derart, dass die Protease eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274 oder 275 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, aufweist.
Sämtliche Ausführungsformen gelten auch für die erfindungsgemäßen Verfahren. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Protease stabilisiert, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Mutationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern. Beispiele für hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind vorstehend genannt. Weitere geeignete Sequenzveränderungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Weitere Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:
Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure(n) gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Sequenzveränderungen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;
Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf oder an der Oberfläche des Proteins bewirken;
Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.
Alternativ oder ergänzend kann die erfindungsgemäße Protease mit mindestens einer reversiblen Inhibitorverbindung, die aus der aus Polyolen, insbesondere Glycerin und 1 ,2-Propylenglykol, Benzamidinhydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester oder Derivate, insbesondere Phenylboronsäurederivate oder 4-Formylphenylboronsäure (4-FPBA), Verbindungen der Formeln (I) oder (II) wobei R jeweils ausgewählt ist aus -COOH, Ci-e-Alkyl-substituierten oder unsubstituierten C2-6- Dicarbonsäuren, Ci-e-Alkyl-substituierten oder unsubstituierten C2-e-Carbonsäuren und -OOC-NR22, wobei R2 gleich oder verschieden und ausgewählt aus Ci-e-Alkyl oder H sind, sowie Salzen, Estern oder Derivaten davon, vorzugsweise Benzoesäure, Phenylmalonsäure, Benzylmalonsäure, Phenylbernsteinsäure, Benzylbernsteinsäure, Methyl-3-Benzoylpropionat, (S)-3-Phenylbuttersäure und Benzylcarbamat, und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, kombiniert werden, um die Stabilität der Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln weiter zu erhöhen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Phenylboronsäurederivat" eine Verbindung mit der Formel (III) verstanden. Die Verbindung der Formel (III) weist folgende Strukturformel auf: wobei R Wasserstoff, eine Hydroxyl-, eine C1-6 Alkyl-, eine substituierte C1-6 Alkyl-, eine C1-6 Alkenyl oder eine substituierte C1-6 Alkenyl-Gruppe ist. Bevorzugt ist der Rest R in dem Phenylboronsäurederivat eine C1-6 Alkyl-Gruppe und hierunter weiter bevorzugt -CH3, -CH3CH2 oder - CH3CH2CH2 sein. Weiter bevorzugt ist der Rest R in dem Phenylboronsäurederivat Wasserstoff. Besonders bevorzugt ist das Phenylboronsäurederivat 4-Formyl-phenylboronsäure (4-FPBA).
Die eingesetzte reversible Inhibitorverbindung kann Borsäure sein.
Die eingesetzte reversible Inhibitorverbindung kann eine Verbindung der Formeln (I) oder (II) wobei R jeweils ausgewählt ist aus -COOH, Ci-e-Alkyl-substituierten oder unsubstituierten C2-6- Dicarbonsäuren, Ci-e-Alkyl-substituierten oder unsubstituierten C2-e-Carbonsäuren und -OOC-NR22, wobei R2 gleich oder verschieden und ausgewählt aus Ci-e-Alkyl oder H sind, sowie Salzen, Estern oder Derivaten davon, und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, sein, vorzugsweise ausgewählt aus der aus Benzoesäure, Phenylmalonsäure, Benzylmalonsäure, Phenylbernsteinsäure, Benzylbernsteinsäure, Methyl-3-Benzoylpropionat, (S)-3-Phenylbuttersäure und Benzylcarbamat bestehenden Gruppe.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die erfindungsgemäße Protease in Mitteln oder Zusammensetzungen eingesetzt, die im Wesentlichen frei von borhaltigen Verbindungen sind. "Im Wesentlichen frei von borhaltigen Verbindungen" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die entsprechende Mittel oder Zusammensetzungen weniger als 2 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 1 Gew.-%, weiter bevorzugt weniger als 0,5 Gew.-% und besonders bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-%, borhaltige Verbindungen, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels/der Zusammensetzung, enthalten. In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen sind diese Mittel/Zusammensetzungen frei von borhaltigen Verbindungen, d.h. sie enthalten insbesondere keine Borsäure und/oder Phenylboronsäurederivate.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung gegenüber dem Wildtypenzym (SEQ ID NO:1) oder einer Ausgangsvariante (Referenzprotease) nicht signifikant verringert ist, d.h. mindestens 80% der Referenzwaschleistung besitzt, vorzugsweise mindestens 100%, noch bevorzugter mindestens 110%, besonders bevorzugt mindestens 120% oder mehr. Die Reinigungsleistung kann in einem Waschsystem bestimmt werden, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 2,0 und 8,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie das Enzym enthält. Die zu vergleichenden Enzyme werden konzentrationsgleich (bezogen auf aktives Protein) eingesetzt. Durch den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Enzyme wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also z.B. die Reinigungsleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Ferner können die zu untersuchenden Enzyme auch in gleicher Stoffmenge oder Gewichtsmenge eingesetzt werden, falls die zu untersuchenden Enzyme in einem Aktivitätstest eine unterschiedliche Affinität an das Testsubstrat aufweisen. Der Ausdruck "gleiche Stoffmenge" bezieht sich in diesem Zusammenhang auf eine molgleiche Verwendung der zu untersuchenden Enzyme. Der Ausdruck "gleiche Gewichtsmenge" bezieht sich auf einen gewichtsgleichen Einsatz der zu untersuchenden Enzyme.
Die Konzentration der Protease in dem für ein solches Waschsystem bestimmten Waschmittel beträgt 0,001 bis 0,1 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 0,06 Gew.-%, bezogen auf aktives Protein.
Unter wasch- bzw. Reinigungsleistung wird das Vermögen eines Wasch- oder Reinigungsmittels, eine vorhandene Anschmutzung teilweise oder vollständig zu entfernen, insbesondere die Aufhellungsleistung an einer oder mehreren Anschmutzungen auf Textilien, insbesondere Baumwolltextilien, Polyestertextilien und/oder Baumwoll-Polyester-Mischtextilien, verstanden. Beispiele für solche Anschmutzungen sind Blut auf Baumwolle oder Schokolade-Milch/Ruß auf Baumwolle, Kakao auf Baumwolle, Eigelb auf Baumwolle, Milch/Ruß auf Baumwolle oder Porridge auf Baumwolle usw. Weitere Beispiele umfassen die vorgenannten Anschmutzungen auch auf Baumwoll- Polyester-Mischtextilien oder polyesterhaltigen Textilien oder anderen Mischtextilien. Im Rahmen der Erfindung weisen sowohl das Wasch- oder Reinigungsmittel, welches die Protease umfasst, bzw. die durch dieses Mittel gebildete Wasch- bzw. Reinigungsflotte, als auch die Protease selbst eine jeweilige Reinigungsleistung auf. Die Reinigungsleistung der Protease trägt somit zur Reinigungsleistung des Mittels bzw. der durch das Mittel gebildeten Wasch- bzw. Reinigungsflotte bei.
Unter wasch- bzw. Reinigungsflotte wird diejenige das Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltende Gebrauchslösung verstanden, die auf die Textilien bzw. harten Oberflächen einwirkt und damit mit den auf den Textilien bzw. harten Oberflächen vorhandenen Anschmutzungen in Kontakt kommt. Üblicherweise entsteht die Wasch- bzw. Reinigungsflotte, wenn der Wasch- bzw. Reinigungsvorgang beginnt und das Wasch- oder Reinigungsmittel z.B. in einer Wasch- oder Spülmaschine oder in einem anderen geeigneten Behältnis mit Wasser verdünnt wird.
Ein flüssiges Referenzwaschmittel für ein solches Waschsystem kann z.B. wie folgt zusammengesetzt sein (alle Angaben in Gewichts-Prozent (Gew.-%)): 4,4% Alkylbenzolsulfonsäure, 5,6% weitere anionische Tenside, 2,4% C12-18 Na-Salze von Fettsäuren (Seifen), 4,4% nicht-ionische Tenside, 0,2% Phosphonate, 1 ,4% Zitronensäure, 0,95% NaOH, 0,01% Entschäumer, 2% Glycerin, 0,08% Konservierungsstoffe, 1% Ethanol, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 7 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.
Die Reinigungsleistung wird gegenüber einer Anschmutzung auf Baumwolle durch Messung des Reinigungsgrades der gewaschenen Textilien bestimmt. Beispielsweise kann der Waschvorgang für 60 Minuten bei einer Temperatur von etwa 20°C oder etwa 40°C erfolgen und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5°dH und 16,5°dH (deutsche Härte) aufweisen. Im Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Reinigungsleistung beispielsweise bei 20°C oder 40°C unter Verwendung eines flüssigen Waschmittels wie z.B. des vorstehend angegebenen, wobei der Waschvorgang vorzugsweise für 60 Minuten bei 600 rpm erfolgt.
Der Weißegrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
Bevorzugte Ausführungsformen erfindungsgemäßer Proteasen erzielen solche vorteilhaften Reinigungsleistungen auch schon bei niedrigen Temperaturen, insbesondere in den Temperaturbereichen zwischen etwa 10°C und etwa 60°C, bevorzugt zwischen etwa 15°C und etwa 50°C und besonders bevorzugt zwischen etwa 20°C und etwa 40°C.
Verfahren zur Bestimmung der Protease-Aktivität dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132. Alternativ kann die Protease- Aktivität über die Freisetzung des Chromophors para-Nitroanilin (pNA) aus dem Substrat suc-L-Ala-L- Ala-L-Pro-L-Phe-p-Nitroanilid (AAPF) bestimmt werden. Die Protease spaltet das Substrat und setzt pNA frei. Die Freisetzung des pNA verursacht eine Zunahme der Extinktion bei 410 nm, deren zeitlicher Verlauf ein Maß für die enzymatische Aktivität ist (vgl. Del Mar et al., 1979). Die Messung erfolgt bei einer Temperatur von 25°C, bei pH 8,6, und einer Wellenlänge von 410 nm. Die Messzeit beträgt 5 min und das Messintervall 20 s bis 60 s. Die Protease-Aktivität wird üblicherweise in Protease-Einheiten (PE) angegeben. Geeignete Protease-Aktivitäten betragen beispielsweise 2,25, 5 oder 10 PE pro ml Waschflotte. Die Protease-Aktivität ist jedoch nicht gleich Null.
Ein alternativer Test zur Feststellung der proteolytischen Aktivität der erfindungsgemäßen Proteasen ist ein optisches Messverfahren, bevorzugt ein photometrisches Verfahren. Der hierfür geeignete Test umfasst die Protease-abhängige Spaltung des Substratproteins Casein. Dieses wird durch die Protease in eine Vielzahl kleinerer Teilprodukte gespalten. Die Gesamtheit dieser Teilprodukte weist eine erhöhte Absorption bei 290 nm gegenüber nicht gespaltenem Casein auf, wobei diese erhöhte Absorption unter Verwendung eines Photometers ermittelt werden und somit ein Rückschluss auf die enzymatische Aktivität der Protease gezogen werden kann.
Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2‘-Bichinolyl-4,4‘-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (Gornall et al., J. Biol. Chem. 177 (1948): 751-766) bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivproteinkonzentration kann diesbezüglich über eine Titration der aktiven Zentren unter Verwendung eines geeigneten irreversiblen Inhibitors und Bestimmung der Restaktivität (vgl. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966): 5890-5913) erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Protease wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Protease mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d.h. die Protease ist derivatisiert. Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergen izität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern. Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen kombiniert sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit spezifischen Inhibitoren ist diesbezüglich möglich. Unter allen vorstehend beschriebenen Proteasen beziehungsweise Protease-Varianten und/oder Derivaten sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung diejenigen besonders bevorzugt, deren Lagerstabilität und/oder deren Reinigungsleistung gegenüber der Ausgangsvariante verbessert ist, wobei die Reinigungsleistung in einem Waschsystem bestimmt wird wie hierin beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. Hierbei kann es sich um DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesem Erfindungsgegenstand eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon- Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA- Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press bekannt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zelllinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bakteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren. Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht-menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Protease beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile oder -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Proteasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationalen Modifikationen können die Protease funktionell beeinflussen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryotische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein. Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren. Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar. In einerweiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacte um, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus camosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryotische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu prokaryotischen Zellen sind eukaryotische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryotische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Co- Expression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.
Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, und b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Proteasen. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar. Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse beziehungsweise Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität der interessierenden Protease erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden. Die hergestellte Protease kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Protease in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.
Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Protease herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße Protease wie vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel. Besonders bevorzugt ist das Wasch- und Reinigungsmittel im Wesentlichen frei von borhaltigen Verbindungen. "Im Wesentlichen frei von borhaltigen Verbindungen" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die erfindungsgemäßen Mittel weniger als 2 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 1 Gew.-%, weiter bevorzugt weniger als 0,5 Gew.-% und besonders bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-%, borhaltige Verbindungen, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels, enthalten. In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmittel frei von borhaltigen Verbindungen, d.h. sie enthalten insbesondere keine Borsäure und/oder Phenylboronsäurederivate.
Unter einem Wasch- oder Reinigungsmittel sind erfindungsgemäß alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsmittelarten zu verstehen, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche bzw. -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen (maschinelle Geschirrspülmittel) oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige oder granuläre Feststoffe, in verdichteter oder nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Protease alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Polymere, Glaskorrosionsinhibitoren, Korrosionsinhibitoren, Bleichmittel wie Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren oder Bleichkatalysatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Enzymstabilisatoren, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Vorteilhafte Inhaltsstoffe erfindungsgemäßer Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die erfindungsgemäße Protease vorteilhafterweise in einer Menge von 2 pg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 pg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 pg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 pg bis 10 mg pro g des Mittels. In verschiedenen Ausführungsformen beträgt die Konzentration der hierin beschriebenen Protease (aktives Enzym) in dem Mittel >0 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,0001 oder 0,001 bis 0,1 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels oder der Zusammensetzung.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die Protease zunehmend bevorzugt in einer Menge von 1 x 10-8 bis 5 Gew.-%, von 0,0001 bis 1 Gew.-%, von 0,0005 bis 0,5 Gew.-%, von 0,001 bis 0,1 Gew.-%, jeweils bezogen auf aktives Protein und bezogen auf das Gesamtgewicht des Waschmittels.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die ggf. auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Flüssige Mittel sind generell bevorzugt. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.
Die erfindungsgemäßen Proteasen werden bevorzugt in flüssigen Waschmitteln zum Reinigen von Textilien eingesetzt, besonders bevorzugt in flüssigen Waschmitteln mit einem pH-Wert von etwa 8 bis etwa 9.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine erfindungsgemäße Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Lipase, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß- Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder andere - von den erfindungsgemäßen Proteasen unterscheidbare - Protease, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 x 10-8 bis 5 Gew.-% bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 x 10-7 bis 3 Gew.-%, von 0,00001 bis 1 Gew.-%, von 0,00005 bis 0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in dem Mittel enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Ganz besonders bevorzugt liegt ein solcher Synergismus vor zwischen der erfindungsgemäß enthaltenen Protease und einem weiteren Enzym eines erfindungsgemäßen Mittels, darunter insbesondere zwischen der genannten Protease und einer Amylase und/oder einer Lipase und/oder einer Mannanase und/oder einer Cellulase und/oder einer Pektinase. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Erfindungsgemäß bevorzugte Textilwaschmittel weisen mindestens eine Protease und mindestens eine Amylase auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen Textilwaschmittel mindestens eine Protease und mindestens eine Cellulase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens eine Protease und mindestens eine Lipase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens eine Protease, mindestens eine Amylase und mindestens eine Lipase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens eine Protease, mindestens eine Amylase und mindestens eine Cellulase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens eine Protease, mindestens eine Amylase, mindestens eine Cellulase und mindestens eine Lipase auf. Besonders bevorzugt sind Textilwaschmittel, welche 3 bis 10 verschiedene Enzyme aufweisen, wobei Textilwaschmittel, welche 3 bis 10 unterschiedliche Enzymarten aufweisen, im Hinblick auf die Reinigungsleistung gegenüber einem sehr großen Fleckenspektrum von besonderer Bevorzugung sein können.
Beispiele für Proteasen sind die Subtilisine BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens und Carlsberg aus Bacillus liehen! formis, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von dem Unternehmen Novozymes erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase® bzw. Savinase® von dem Unternehmen Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich Protease-Varianten ab, beschrieben in z.B. WO 95/23221 , WO 92/21760 WO 2013/060621 und EP 3660151. Weitere brauchbare Proteasen sind z.B. die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase®, Progress Uno 101 L® und Ovozyme® von dem Unternehmen Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase®, Properase®, Preferenz P100® und Preferenz P300® von dem Unternehmen Danisco/DuPont, das unter dem Handelsnamen Lavergy pro 104 LS® von dem Unternehmen BASF, das unter dem Handelsnamen Protosol® von dem Unternehmen Advanced Biochemicals Ltd., das unter dem Handelsnamen Wuxi® von dem Unternehmen Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von dem Unternehmen Amano Pharmaceuticals Ltd., und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von dem Unternehmen Kao Corp, erhältlichen Enzyme. Besonders bevorzugt eingesetzt werden auch die Proteasen aus Bacillus gibsonii und Bacillus pumilus, die offenbart sind in WO 2008/086916, WO 2007/131656, WO 2017/215925, WO 2021/175696 und WO 2021/175697. Weitere verwendbare Proteasen sind diejenigen, die in den Mikroorganismen Stenotrophomonas maltophilia, insbesondere Stenotrophomonas maltophilia K279a, Bacillus intermedius sowie Bacillus sphaericus natürlicherweise vorhanden sind.
Beispiele für Amylasen sind die a-Amylasen aus Bacillus liehen! formis, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus sowie insbesondere auch deren für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus Bacillus licheniformis ist von dem Unternehmen Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von dem Unternehmen Danisco/DuPont unter dem Namen Purastar® ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser a- Amylase sind unter den Handelsnamen Duramyl® und Termamyl® ultra (beide von Novozymes), Purastar® OxAm (Danisco/DuPont) und Keistase® (Daiwa Seiko Inc.) erhältlich. Die a-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens wird von dem Unternehmen Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der a-Amylase aus Bacillus stearothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes. Des Weiteren sind für diesen Zweck die a-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die Cyclodextrin- Glucanotransferase (CGTase) aus Bacillus agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ebenso sind Fusionsprodukte aller genannten Moleküle einsetzbar. Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von dem Unternehmen Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der a-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Weitere vorteilhaft einsetzbare Handelsprodukte sind z.B. die Amylase-LT® und Stainzyme® oder Stainzyme® ultra bzw. Stainzyme® plus sowie Amplify™ 12L oder Amplify Prime™ 100L, letztere ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes, sowie die PREFERENZ S® Serie von dem Unternehmen Danisco/DuPont, umfassend z.B. PREFERENZ S100®, PREFERENZ S1000® oder PREFERENZ S210®. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Geeignete Cellulasen umfassen solche bakterieller oder pilzlicher Herkunft. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen sind Cellulasen aus den Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, z. B. die Pilzcellulasen aus Humicola insolens, Myceliophthora thermophila und Fusarium oxysporum, die in US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 und WO 89/09259 offenbart sind. Besonders geeignete Cellulasen sind die alkalischen oder neutralen Cellulasen mit farbpflegenden Eigenschaften. Beispiele für solche Cellulasen sind Cellulasen, die in EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 und WO 98/08940 beschrieben sind. Beispiele für Cellulasen mit Endo-1 ,4-Glucanase-Aktivität (EC 3.2.1.4) sind in WO 2002/099091 beschrieben, z.B. solche mit einer Sequenz von mindestens 97% Identität zu der Aminosäuresequenz der Positionen 1 bis 773 von SEQ ID NO:2 der WO 2002/099091. Ein weiteres Beispiel kann eine GH44-Xyloglucanase umfassen, z.B. ein Xyloglucanase-Enzym mit einer Sequenz von mindestens 60% Identität zu den Positionen 40 bis 559 der SEQ ID NO:2 der WO 2001/062903. Zu den kommerziell verfügbaren Cellulasen gehören Celluzyme™, Carezyme™, Carezyme Premium™, Celluclean™ (z.B. Celluclean™ 5000L ans Celluclean™ 4000T), Celluclean Classic™, Cellusoft™, Endolase®, Renozyme® und Whitezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ und Puradax HA™ (Genencor International Inc.), KAC-500(B)™ (Kao Corporation), Revitalenz™ 1000, Revitalenz™ 2000 und Revitalenz™ 3000 (DuPont), sowie Ecostone® und Biotouch® (AB Enzymes).
Als weitere Enzyme einsetzbar sind z.B. Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Geeignete Lipasen und Cutinasen sind solche bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs. Chemisch modifizierte oder durch Proteinengineering erzeugte mutierte Enzyme sind eingeschlossen. Beispiele sind Lipase aus Thermomyces, z.B. aus T. lanuginosus (früher Humicola lanuginosa genannt), wie in EP 0258068 und EP 0305216 beschrieben, Cutinase aus Humicola, z.B. H. insolens (WO 96/13580), Lipase aus Stämmen von Pseudomonas (einige davon jetzt umbenannt in Burkholderia), z.B. P. alcaligenes oder P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. sp. Stamm SD705, P. wisconsinensis, Streptomyces-Lipasen vom GDSL-Typ, Cutinase aus Magnaporthe grisea, Cutinase aus Pseudomonas mendocina, Lipase aus Thermobifida fusca, Lipase aus Geobacillus stearothermophilus, Lipase aus Bacillus subtilis und Lipase aus Streptomyces griseus und S. pristinaespiralis. Zu bevorzugten Lipasen gehören z.B. die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen bzw. daraus weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit einem oder mehreren der folgenden Aminosäureaustausche ausgehend von der genannten Lipase in den Positionen D96L, T213R und/oder N233R, besonders bevorzugt T213R und N233R. Zu den bevorzugten kommerziellen Lipaseprodukten gehören Lipolase™, Lipex™, Lipolex™ und Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (Genencor/DuPont) und Lipomax (Gist-Brocades).
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäß Oxidoreduktasen, z.B. Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Manganperoxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluss zu gewährleisten (Mediatoren).
In den hierin beschriebenen Reinigungsmitteln können die einzusetzenden Enzyme ferner zusammen mit Begleitstoffen, etwa aus der Fermentation, konfektioniert sein. In flüssigen Formulierungen werden die Enzyme bevorzugt als Enzymflüssigformulierung(en) eingesetzt.
Die Enzyme werden in der Regel nicht in Form des reinen Proteins, sondern vielmehr in Form stabilisierter, lager- und transportfähiger Zubereitungen bereitgestellt. Zu diesen vorkonfektionierten Zubereitungen zählen beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren oder weiteren Hilfsmitteln versetzt.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale- Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so dass ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
Die Enzyme können auch in wasserlösliche Filme, wie sie beispielsweise bei der Konfektionierung von Wasch- und Reinigungsmitteln in Einheitsdosisform verwendet werden, eingebracht werden. Ein derartiger Film ermöglicht die Freisetzung der Enzyme nach Kontakt mit Wasser. Wie hierin verwendet, bezieht sich "wasserlöslich" auf eine Filmstruktur, die vorzugsweise vollständig wasserlöslich ist. Bevorzugt besteht ein solcher Film aus (vollständig oder teilweise hydrolysiertem) Polyvinylalkohol (PVA). Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reinigung von Textilien und/oder harten Oberflächen, insbesondere Geschirr, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet wird. In verschiedenen Ausführungsformen zeichnet sich das beschriebene Verfahren dadurch aus, dass die Protease bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 100°C, bevorzugt etwa 20°C bis etwa 60°C und weiter bevorzugt etwa 20°C bis etwa 40°C eingesetzt wird.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was z.B. die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird.
Da erfindungsgemäße Proteasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einzige Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass als einzige reinigungsaktive Komponente eine erfindungsgemäße Protease mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Schließlich erfasst die Erfindung auch die Verwendung der hierin beschriebenen Proteasen in Wasch- oder Reinigungsmitteln, beispielsweise wie oben beschrieben, zur (verbesserten) Entfernung von peptid- oder proteinhaltigen Anschmutzungen, beispielsweise von Textilien und/oder harten Oberflächen.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Protease in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Verbesserung der Reinigungsleistung an mindesten einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, wobei die Verbesserung der Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird, insbesondere in einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 40°C.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer Protease in einem Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, zur Verbesserung der Reinigungsleistung an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, wobei die Verbesserung der Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird, insbesondere in einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 40°C, wobei die Protease eine Protease ist, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs weitere Aminosäuresubstitution(en), die aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101 S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Protease und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen gilt.
BEISPIELE
Tabellel : Verwendete Waschmittelmatrix
Tabelle 2: Verwendete Proteasen: Beispiel 1 : Bestimmung der Proteaseaktivität
Die Proteaseaktivität wurde in einem diskontinuierlichen Assay bestimmt, in dem Casein als Substrat verwendet wird. Die Endkonzentration der Substrat-Lösung betrug 12 mg/ml Casein (hergestellt nach Hammarsten; Merck, Darmstadt, #2242) und 30 mM Tris in synthetischem Leitungswasser. Synthetisches Leitungswasser ist eine Lösung aus 0,029% (w/v) CaCh • 2 H2O, 0,014% (w/v) MgCh • 6 H2O und 0,021% (w/v) NaHCCh mit 15° dH (deutscher Härte). Die Substrat- Lösung wurde auf 70°C erhitzt und der pH auf 8,5 bei 50°C unter Verwendung von 0,1 N NaOH eingestellt. Die Protease-Lösung wurde durch Zugabe von 2% (w/v) wasserfreiem Pentanatriumtripolyphosphat in synthetisches Leistungswasser und Einstellung auf pH 8,5 mit Salzsäure hergestellt. Zu 600 pl der Casein-Lösung wurden 200 pl der Enzym-Lösung gegeben. Das Gemisch wurde bei 50°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 600 pl von 0,44 M Trichloressigsäure (TCA), 0,22 M Natriumacetat in 3% (w/v) beendet. Nach einem Kühlungsschritt von 15 Minuten auf Eis wurde das TCA unlösliche Protein durch Zentrifugation entfernt. 900 pl der verbleibenden Lösung wurde mit 300 pl von 2 N NaOH gemischt und die Absorption dieses Gemisches, das TCA lösliche Proteine enthält, wurde bei 290 nm gemessen. Kontrollwerte wurde durch Zugabe von 600 pl TCA-Lösung zu 600 pl Casein-Lösung erzeugt, gefolgt von Zugabe von 200 pl Enzymlösung. Eine Protease-Lösung, die unter diesen Bedingungen eine Absorptionsänderung von 0,500 OD bei 290 nm bewirkt, hat nach vorliegender Bezeichnung eine Aktivität von 10 HPE pro ml.
Beispiel 2: Bestimmung der Reiniqunqsleistunq
Miniwaschtest
Die Reinigungsleistung wurde in Miniwaschtests mit Bacillus subtilis Kulturüberständen, welche die exprimierten Protease-Varianten enthalten, bestimmt. Die Überstände wurde aktivitätsgleich zum Benchmark (1 ,15 pg/ml aktives Enzymprotein in der Waschlauge) eingesetzt.
Bedingungen: 20°C und 40°C, 16° dH Wasser, 1 h
Anschmutzungen:
1 . CS38 (Eigelb/Pigment (eingetrocknet))
2. C05 (Blut/Milch/Tinte)
3. E111 (Blut)
4. PC10 (Milch/Öl)
5. H-MR-B (Milch/Ruß)
Ausgestanzte Gewebe (Durchmesser = 10 mm) wurden in Mikrotiterplatten vorgelegt, Waschlauge auf 40°C vortemperiert, Endkonzentration 3,17 g/L, Lauge und Enzym auf die Anschmutzung gegeben, für 1 h bei 20°C bzw. 40°C und 600 rpm inkubiert, anschließend die Anschmutzung mehrmals mit klarem Wasser gespült, trocknen gelassen und mit einem Farbmessgerät die Helligkeit bestimmt. Je heller das Gewebe, desto besser die Reinigungsleistung. Gemessen wird hier der Y-Wert = Helligkeit, je höher desto heller. Alle gemessenen Y-Werte wurden durch die Leistung der Waschlauge allein (ohne Protease) und durch die Leistung der Waschlauge mit Leervektor korrigiert (Y ariante - Yßiank = AYvariante). Für jede Anschmutzung wurde für jede Protease AY ariante ermittelt und alle AYvariante Werte aller Anschmutzungen pro Variante wurden summiert, um SAY ariante zu bestimmen. Um die Reinigungsleistung der erfindungsgemäßen Varianten mit dem Benchmark (= Protease P1) zu vergleichen, wurden sowohl AYpi (für jede Anschmutzung) als auch SAYPI (Gesamtreinigungsleistung) auf 100% normiert und die relative Reinigungsleistung der erfindungsgemäßen Varianten berechnet. Eine >15%ige Erhöhung der Gesamtleistung wird als eine signifikante Leistungssteigerung angesehen.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefasst.
Tabelle 3: Waschleistunq in % bei 20°C:
Tabelle 4: Waschleistunq in % bei 40°C:
Die erfindungsgemäßen Proteasen P2 bis P8 zeigen sowohl bei 20°C als auch bei 40°C eine signifikant verbesserte Waschleistung im Vergleich zur Benchmark Protease P1 .

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 ,
(i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und
(ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en) aufweist.
2. Protease nach Anspruch 1 , die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 ,
(i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und
(ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
3. Protease nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Protease eine der folgenden Aminosäuresubstitutionskombinationen, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , aufweist:
(a) P9T-S89A-D101 S-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E;
(b) P9T-S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E;
(c) P9T-S89A-D101 A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E;
(d) Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E;
(e) Y6W-P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E; (f) P9T-F61 G-Q62-N-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E; und
(g) Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E.
4. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist;
(b) sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274 oder 275 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
5. Protease nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Protease an mindestens einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, eine verbesserte Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease zeigt, wobei die Reinigungsleistung, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
6. Verfahren zur Herstellung einer Protease, umfassend das Einbringen
(i) der Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E an den Positionen, die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, und
(ii) mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, vorzugsweise ausgewählt aus der aus YQ\I\I, F61 G, Q62N, D101 S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe, in ein Ausgangsmolekül, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 70% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, ferner umfassend einen oder mehreren der folgenden Verfahrensschritte:
(a) Einbringen einer ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäuresubstitution, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist;
(b) Veränderung der Aminosäuresequenz durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese derart, dass die Protease eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274 oder 275 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Protease, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 89, 130, 133, 144, 189, 217, 224, 252 und 271 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T und Q271 E, und (ii) an mindestens einer und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 101 , 170 und 188 entsprechen, mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuresubstitution(en), die vorzugsweise aus der aus Y6W, F61 G, Q62N, D101S, D101 E, D101A, K170G und N188G bestehenden Gruppe ausgewählt sind, aufweist.
8. Nukleinsäure codierend für eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder codierend für eine nach einem Verfahren der Ansprüche 6 bis 7 erhaltene Protease.
9. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 8, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
10. Nicht-menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 8 oder einen Vektor nach Anspruch 9 beinhaltet, oder die eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 5 beinhaltet, oder die eine nach einem Verfahren der Ansprüche 6 bis 7 erhaltene Protease beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.
11 . Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 10 und b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
12. Mittel, insbesondere Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 6 bis 7 erhaltene Protease enthält, wobei das Mittel im Wesentlichen frei von borhaltigen Verbindungen ist und/oder wobei das Mittel einen pH-Wert von etwa 8 bis etwa 9 aufweist.
13. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach Anspruch 12 angewendet wird.
14. Verwendung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 6 bis 7 erhaltene Protease in einem Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, zur Entfernung von peptid- oder proteinhaltigen Anschmutzungen.
15. Verwendung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 6 bis 7 erhaltene Protease in einem Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, zur Verbesserung der Reinigungsleistung an mindesten einer und zunehmend bevorzugt an zwei, drei, vier oder fünf proteasesensitiven Anschmutzung(en), die vorzugsweise aus der aus blut-, ei(gelb)-, milch- und anderen proteinhaltigen Anschmutzungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist/sind, wobei die Verbesserung der Reinigungsleistung gegenüber einer Referenzprotease, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird, insbesondere in einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 40°C.
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