EP4565708A1 - Mycosporines glucosylees par voie enzymatique pour le developpement de produits anti-uv innovants - Google Patents

Mycosporines glucosylees par voie enzymatique pour le developpement de produits anti-uv innovants

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EP4565708A1
EP4565708A1 EP23758701.9A EP23758701A EP4565708A1 EP 4565708 A1 EP4565708 A1 EP 4565708A1 EP 23758701 A EP23758701 A EP 23758701A EP 4565708 A1 EP4565708 A1 EP 4565708A1
Authority
EP
European Patent Office
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mycosporin
mser
glucosylated
glucosyl units
glucosylation
Prior art date
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Pending
Application number
EP23758701.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Susana FERNANDES
Claire Moulis
Elodie BASCANS
Marion CLAVERIE
Etienne Severac
Magali Remaud-Simeon
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Universite de Pau et des Pays de lAdour
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Universite de Pau et des Pays de lAdour
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA, Universite de Pau et des Pays de lAdour, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4565708A1 publication Critical patent/EP4565708A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12P13/001—Amines; Imines
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Definitions

  • the present invention relates to the preparation of glucosylated mycosporins by an enzymatic cascade process using a-transglucosylases and sucrose, and their use in particular for their anti-UV properties (e.g. UV absorption and protection properties, properties antioxidants).
  • anti-UV properties e.g. UV absorption and protection properties, properties antioxidants.
  • the present invention finds, for example, applications in the field of ophthalmology, dermatology, cosmetology, materials and agriculture.
  • references in parentheses [ ] refer to the list of references presented at the end of the text.
  • Mycosporins and mycosporin-like amino acids are small molecules of approximately 400 dalton (Da), organized around a cyclohexenone or cyclohexenimine ring. Due to their structure, these zwitterions exhibit unique UV absorption capabilities, with an absorption range of 309 to 362 nm and an extinction coefficient of 21,800 cnr 1 .M' 1 to 50,000 cnr 1 .M' 1 [5]. They therefore cover both the UV-A and UV-B range. Mycosporins are also described as powerful antioxidants.
  • Mycosporins are present in a very wide diversity of organisms. UV radiation impacts life on land, but it can also penetrate waters from 0.5 to 47 meters deep, depending on water clarity and weather conditions [1].
  • Mycosporins have thus been identified in cyanobacteria, but also in heterotrophic bacteria and marine fungi, microalgae, macroalgae (mostly red and brown algae), phytoplankton (diatoms, dinoflagellates), corals, molluscs and fish [7,8]. They have also been identified in terrestrial organisms, such as lichens living in sometimes very extreme conditions [9]. This is the case of mycosporin-serinol MSer(OH) present in particular in the species Lichina pygmea, present in the mid-littoral areas of the coasts of Western Europe.
  • mycosporins can accumulate rapidly in tissues of the outer layers exposed to sunlight, such as the skin of the dorsal surface, as well as sensitive organs such as the digestive tract, reproductive organs, and also the eyes [1,5,7,8]. In the eye, they are particularly concentrated in the cornea and the lens, thus protecting the retina from photooxidative damage caused by UV rays [10].
  • mycosporins in the ocular tissues of fish is a particularly interesting subject of bioinspiration, particularly in the implementation of preventive and/or curative biomedical solutions in the ophthalmological field.
  • the formulation of biomedical products from currently available mycosporins is complicated due to their small sizes which leads to their rapid elimination from the mucous membranes (especially the eye).
  • Glycosylated mycosporins are already present in nature with essentially a degree of polymerization (DP) of 1 to 2 glycosylated units (/e. xylose, galactose, glucosamine, etc.), exceptionally up to 8 glycosylated units of different nature (/e. xylose, galactose, glucosamine, etc.) for a case of mycosporin of the mycosporin-glycine type [11].
  • DP degree of polymerization
  • mycosporins have been identified (shinorin, porphyra-334, palythine, mycosporin-glycine, mycosporin-glutamicol) linked to different glycosylated units (galactose, glucosamine, xylose, etc.). Although the role of these glycosylated mycosporins has not been fully discovered, they probably provide a multifunctional role in protection against UV rays but also against thermal stress or dessication. The benefit of sugars covalently linked to mycosporins is also not fully elucidated, even if it is strongly suggested that this would improve interactions with the exopolysaccharide matrix of these cyanobacteria [13].
  • glycosylated mycosporins In addition to increased stability and non-covalent attachment to the extracellular glycan matrix, significant proportion of glycosylated mycosporins surely testifies to another useful role: Ishihara et al. thus identified that 86.5% of the total mycosporins of Nostoc sphaericum were p-galactose-porphyra-334; 13.2% were hexose-shinorins and only 0.2% were free porphyra-334 [14],
  • the inventors have therefore developed a new process capable of adding a long glucosyl chain to mycosporins, which has made it possible to obtain new products or biomaterials that are environmentally friendly and highly UV protective, replacing current UV filters. , capable of extending the retention time of mycosporins in organs, such as the eyes.
  • the nature of the carbohydrate chain (composed solely of glucosyl units) should help reduce the risk of allergic reactions.
  • biomolecules obtained protect against UV rays with a prolonged retention time using exclusively natural precursors, can be applied in cosmetic formulations, medical products (e.g. in ophthalmology), biomaterials and outdoor materials as alternatives to common active ingredients.
  • enzymatic glycosylation appeared to be the most effective process.
  • a family of enzymes appeared to be particularly interesting for this type of enzymatic catalysis. These are a-transglucosylases of the Glycoside Hydrolase family 70 (GH-70) [15], enzymes that are naturally found in lactic acid bacteria of the genera Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, Oenococcus or Weissela sp. [16]. These enzymes are of significant industrial interest due to their catalytic mechanism, illustrated in Figure 16.
  • GH-70 can transfer the glucosyl unit to [17]:
  • step 3 in Figure 16 to carry out a hydrolysis reaction, in this case there is formation of free glucose (mainly taking place at the start of the reaction for the very good polymerases of the GH-70 family ).
  • a-glucans a glucose and gradually glucose oligosaccharides of increasing size (step 4 in Figure 16), to carry out the synthesis of homopolymers of aD-glucosyl units, called a-glucans.
  • a-glucans represent a wide diversity of polymers, ranging from 10 3 to 10 9 Da and composed of osidic bonds of different natures (a-1,2; a-1,3; a-1,4 and/or a-1 ,6).
  • dextran it is a more or less linear polymer containing a majority of glucosyl units linked in a-1,6 and which has numerous applications in industry (agri-food, cosmetics and pharmaceutical fields for example).
  • step 5 in Figure 16 there is then formation of isomers of sucrose, such as leucrose for example. These products are nevertheless in the minority.
  • acceptor reaction an exogenous acceptor molecule added to the medium at the start of the reaction (glycone or aglycone), possessing at least one hydroxyl function (step 6 in Figure 16), this catalytic action is called the acceptor reaction.
  • the present invention therefore aims to produce glucosylated derivatives of mycosporins, in particular myscosporin-serinol (hereinafter referred to as MSer(OH)) originating in particular from the marine lichen Lichina pygmea, using an enzymatic cascade process using a -transglucosylases of the Glycoside Hydrolase family 70 (GH-70) and sucrose.
  • MSer(OH) myscosporin-serinol
  • these enzymes use sucrose from beets or sugar cane to synthesize (polymerases) or decorate (branching sucrases) polymers with high molar mass glucosyl units (a-glucans).
  • sucrose phosphorylases which also use sucrose as a glucosyl unit donor, as well as commercial CGTases belonging to the GH-13 family which use starch (another natural and abundant substrate) as a glucosyl unit donor were also tested, but without success.
  • glucosylated mycosporins is carried out in a completely aqueous medium without the addition of organic solvent.
  • Glucosylation can be carried out in a single step (co-synthesis or one-pot synthesis) or in two steps as follows:
  • mycosporin-serinol e.g. mycosporin-serinol, MSer(OH)
  • GS-D a-transglucosylase of the GH-70 family
  • mycosporin-glu e.g. MSer(OH)-glu
  • mycosporin-polym e.g. MSer(OH)-polym
  • This second step of the enzymatic cascade allows the “custom” synthesis of mycosporin linked covalently to glucosylated chains of varied lengths and saccharide bonds (a-1,2; a-1,3; a-1,4 and /or a-1,6) depending on the enzymes and the reaction conditions used.
  • the mycosporin-glu intermediate products can carry up to 4 glucosyl units with an average degree of polymerization (DP) mainly centered between 1 and 2 glucosyl units
  • the mycosporin-polym final products eg MSer(OH)-polym
  • DP average degree of polymerization
  • the mycosporin-polym final products eg MSer(OH)-polym
  • DP average degree of polymerization
  • the present invention therefore relates to a process for producing a glucosylated mycosporin, said process comprising a step a) of glucosylation of a mycosporin by the enzyme a-transglucosylase GS-D from sucrose to obtain a glucosylation intermediate product being a glucosylated mycosporin having a degree of polymerization ranging from 1 to 4 glucosyl units, preferably an average degree of polymerization of 1 to 2 glucosyl units.
  • the method may further comprise a step b) of elongation of the carbohydrate part of the intermediate glucosylation product obtained in step a) from sucrose by at least one different a-transglucosylase a-transglucosylase GS-D for obtaining a glucosylated mycosporin having an average degree of polymerization ranging from 3 to 1,000,000 glucosyl units, from 3 to 800,000 glucosyl units, from 3 to 500,000 glucosyl units, from 3 to 24,000 glucosyl units (for a very good polymerase such as for example the dextran-sucrase enzyme DSR-OK A1), from 3 to 60 glucosyl units, from 3 to 41 glucosyl units; preferably from 9 to 1,000,000 glucosyl units, from 9 to 800,000 glucosyl units, from 9 to 500,000 glucosyl units, from 9 to 24,000 glucosyl units, from 9 to 60 glucosyl units, or from 9 to 41
  • steps a) and b) can be carried out concomitantly, namely that said process comprises the glucosylation of a mycosporin and the elongation of its carbohydrate part.
  • a-transglucosylase GS-D and at least one other a-transglucosylase different from a-transglucosylase GS-D from sucrose for obtaining a glucosylated mycosporin having an average degree of polymerization ranging from 3 to 1,000,000 glucosyl units, from 3 to 800,000 glucosyl units, from 3 to 500,000 glucosyl units, from 3 to 24,000 glucosyl units (for a very good polymerase such as for example the dextran-sucrase enzyme DSR-OK A1) , from 3 to 60 glucosyl units, from 3 to 41 glucosyl units; preferably from 9 to 1,000,000 glucosyl units, from 9 to 800,000 glucosyl units, from 9 to
  • average degree of polymerization within the meaning of the present invention means the degree of polymerization determined at the apex of the peaks obtained by high-performance size exclusion chromatography analysis coupled with a UV detector and calibration/ calibration of the column using commercial dextrans with a molar mass between 342 g/mol and 70,000 g/mol.
  • said at least one a-transglucosylase from step b) is chosen from the group consisting of: glucan-sucroses GS-A, GS-B, GS-C, GS-F A1, and GS-FS; dextran-sucroses DSR-M A1, DSR-M A2 W624A, DSR-G A1, DSR-S vardel A4N, and DSR-OK A1; alternan-sucrase ASR A1.
  • the mycosporin of step a) is chosen from the group consisting of: pure or purified mycosporin, extract of lichen Lichina pygmea enriched in mycosporin from 0 to 50% by weight of extract , preferably from 5 to 35% by weight of extract, preferably from 15 to 25% by weight of extract, most preferably from 10% by weight of extract.
  • the mycosporin used in step a) is mycosporin-serinol (MSer(OH)).
  • the latter can be isolated from extracts of cyanolichens such as Lichina pygmae and Lichina confiais, from different species of Peltigera, Stereum hirsutum, Alternaria chrysanthemi, Ascochyta pisi, Ophiobolus graminis, Pleospora herbarum, or more Pyronema omphalodes. It can also be produced from its precursor (gadusol) by synthetic biology.
  • the present invention also relates to an intermediate glucosylation product obtained by the process of the present invention, said intermediate glucosylation product being a glucosylated mycosporin having a degree of average polymerization ranging from 1 to 4 glucosyl units (alpha type bonds), preferably from 1 to 2 glucosyl units (alpha type bonds).
  • the present invention also relates to a glucosylated mycosporin obtained by the process of the present invention, said glucosylated mycosporin having an average degree of polymerization ranging from 3 to 1,00,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 3 to 800,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 3 to 500,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 3 to 24,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 3 to 60 glucosyl units (alpha type bonds), or from 3 to 41 glucosyl units (alpha type bonds); preferably from 9 to 1,000,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 9 to 800,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 9 to 500,000 glucosyl units (alpha type bonds), from 9 to 24,000 glucosyl units (alpha type bonds) from 9 to 60 glucosyl units (alpha type bonds), or from 9 to 41 glucosyl units (alpha type bonds).
  • the present invention also relates to the cosmetic use of a glucosylated mycosporin according to the present invention, as an anti-UV agent, to (i) protect the skin from UV rays, (ii) fight against photoaging.
  • the present invention also relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, as active ingredient, a glucosylated mycosporin according to the present invention.
  • the present invention also relates to the cosmetic use of a cosmetic composition according to the present invention, to (i) protect the skin from UV rays, (ii) fight against photoaging.
  • the present invention also relates to a glucosylated mycosporin according to the present invention for use as a medicament, for use in the prevention or treatment, for example, of cataracts, of skin diseases associated with UV sensitivity such as xeroderma pigmentosum, hereditary genetic diseases such as albinism, or even skin cancer.
  • the invention implements green processes and mobilizes natural resources, namely mycosporins, in particular from a lichen growing on the seaside, and sucrose.
  • This last resource serving as a substrate for enzymes of the GH-70 family, is available in large quantities and at lower cost. Enzymatic reactions are processes under conditions gentle and do not produce (toxic) waste.
  • Certain glucosylated chains have signatures of dextran, an a-glucan widely used in the cosmetic and biomedical field, because it is very well supported by the body.
  • the dextran chain of MSer(OH)-polym products being modular “to order” (e.g. in terms of saccharide bonds, carbohydrate chain size), it can easily be adapted to the type of application targeted.
  • UV protection molecules such as oxybenzone (a UVA and UVB blocker) which causes bleaching of coral reefs [4]
  • glucosylated mycosporins do not cause such damage.
  • Figure 1 represents the principle of the enzymatic cascade allowing the glucosylation of mycosporins from sucrose and involving a-transglucosylases of the GH-70 family: a first glucosylation step carried out by the GS-D enzyme then an elongation of the glucosidic chain by different enzymes of the family, allowing both control of the size and structure of this chain (different types of ⁇ -saccharide bonds depending on the enzyme chosen).
  • the numbering 1 -8 identifies the different MSer(OH)-glu glucosylation products which were obtained at the end of the first step of the enzymatic cascade.
  • Figure 5 represents (A) the chemical structure of MSer(OH) with carbon numbering and illustration of possible glucosylation positions.
  • Hexagons represent glucosyl units linked to MSer(OH) (B) examples of structures of DP2 produced by glucosylation of MSer(OH) by the enzyme GS-D (C) examples of structure of DP3 produced by glucosylation of MSer(OH) by the enzyme GS-D (D) examples of structures of products resulting from the enzymatic cascade (glucosylation+elongation).
  • Figure 6 represents the 1H NMR spectra (spectrum A) and HMBC (spectrum B) confirming the glucosylation of MSer(OH) by GS-D into an intermediate glucosylation product (MSer(OH)-glu) having an average degree of polymerization ranging from 1 to 2 glucosyl units.
  • the enzymes used in the second step are indicated on the chromatograms.
  • the chromatogram annotated DEX 10,000 Da is that of a commercial dextran with an average molar mass of 10,000 g/mol.
  • Asterisks identify the majority population(s) for each reaction. Peaks DP1 and DP2 correspond respectively to Peak 1 and Peak 2 in Figure 4.
  • the chromatogram annotated DEX 70,000 Da is that of a commercial dextran with an average molar mass of 70,000 g/mol.
  • Figure 12 shows the absorbance scans of MSer(OH) and the products MSer(OH)-glu and MSer(OH)-polym for wavelengths ranging from 200 nm to 800 nm (area of interest shown : 200 to 400nm).
  • Figure 15 represents the chromatograms of the cosynthesis polymerizations. MSer(OH)-glu products are less efficiently consumed by polymerases, less MSer(OH)-polym is produced.
  • Figure 16 represents the diagram of the different catalytic mechanisms of GH-70.
  • Figure 17 represents the quantum yield of MSer(OH) and of the different MSer(OH)-glu and Mser(OH)-polym glucosylation products obtained by the process of the invention.
  • Figure 18 represents the TEAC score of MSer(OH) and the products of the enzymatic cascade of the process of the invention, with and without MSer(OH).
  • EXAMPLE 1 EXAMPLE OF IMPLEMENTATION OF THE METHOD OF THE INVENTION
  • MSer(OH) mycosporin-serinol
  • the cells were then broken with ultrasound according to the following protocol: 5 cycles of 20 seconds at 30% of the maximum power of the probe, cold, spaced by 4 minutes of rest on ice.
  • the sonication supernatants containing the soluble enzymes of interest were then collected after 30 min of centrifugation (15,000 g, 6°C) and stored at 4°C. [Table 2]
  • Enzymatic activity was determined by measuring the initial rate of production of reducing sugars using the dinitrosalicilic acid (DNS) method [23].
  • 100 ⁇ L of reaction medium were taken and the reaction was stopped by adding an equivalent volume of DNS.
  • a standard range of 0 to 2 g/L of fructose made it possible to establish a link between absorbance value and reducing sugar concentration.
  • the reaction was incubated at 30°C with shaking at 500 rpm. After 24 hours, the reaction mix was incubated at 70°C for 10 minutes to inactivate the enzymes.
  • the reaction media were diluted 1/10 in water and centrifuged for 5 minutes at 2000 g.
  • the mobile phase was composed of a mixture of ultrapure water (solvent A) / LC-MS grade acetonitrile (solvent B) at a flow rate of 0.2 mL/min. Separation was ensured in 75 minutes by a linear gradient, as defined in Table 3.
  • the GS-D enzyme turned out to be by far the most efficient ( Figures 2 and 3), converting 95% of MSer(OH) into 8 different glucosylated products while for all the other enzymes tested, the conversion rate was between 0% and 6.5%. Representing alone 72.3% of the area of all MSer(OH)-glu products, the majority peaks are the peaks numbered 1 and 2 in Figure 4. Their analyzes by liquid chromatography coupled with a mass detector (LC-MS) showed that they had a degree of polymerization (DP) of 1 and 2 glucosyl units respectively. The minority peaks (products 3 to 8 in Figure 4) would have a degree of polymerization (DP) of 3 to 4 glucosyl units.
  • LC-MS liquid chromatography coupled with a mass detector
  • the glucosylation reaction of MSer(OH) by GS-D was tested on a concentration of MSer(OH) of 50 mM, i.e. a concentration 10 times higher than during the screening. .
  • the protocol followed was, moreover, identical to that described previously.
  • the sucrose concentration being kept at 292 mM
  • the sucrose:MSer(OH) molar ratio increased from 60:1 to 6:1.
  • the comparison of the chromatograms for these two reactions is shown in Figure 7.
  • the conversion rate of MSer(OH) to MSer(OH)-glu went from only 95% with 5 mM MSer(OH) to 90% with 50 mM MSer(OH).
  • MSer(OH)-glu glucosylated products from sucrose by certain polymerases of the GH-70 family was the subject of a second screening (see Table 1).
  • An MSer(OH)-polym product was obtained whose glucosidic part was very significantly lengthened compared to that obtained by GS-D.
  • MSer(OH)-glu was carried out under conditions similar to those described in the first screening but in larger quantities.
  • MSer(OH)-polym The separation of the different products (MSer(OH)-polym) was carried out in the same way as for the MSer(OH)-glu during the first screening.
  • the 11 polymerases tested made it possible to extend the MSer(OH)-glu intermediates with chains of glucosyl units of variable size and nature depending on the binding specificity of the enzyme tested. Across all reactions, at least 67.6% and up to 97.7% of the MSer(OH)-glu intermediate products were elongated (Table 4). Peaks 1 and 2 of the MSer(OH)-glu intermediate products (the vast majority of species in the medium) were mainly consumed by the polymerases, the conversion percentage of each of these two peaks being able to vary depending on the specificity of the enzyme used. (Table 4). For most enzymatic cascades, peak 2 (MSer(OH) diglucosylated) is consumed preferentially and sometimes almost entirely.
  • the average mass of the carbohydrate chains of the elongated MSer(OH)-glu was analyzed by size exclusion chromatography (HPSEC) on a Shodex 802.5 column.
  • HPSEC size exclusion chromatography
  • the elution was carried out isocratically at a water flow rate of 0.3 mL/min and at a temperature of 70°C.
  • the HPSEC analysis was carried out by combining a Shodex column 805 and a Shodex 802.5 column as standard. The elution was carried out with a mixture of NaNOs at 450mM, 1% v/v ethylene glycol.
  • the calibration of the separation was based on a standard range of commercial dextrans (polymers of ⁇ -1,6-linked glucosyl units) of increasing sizes between 342 and 70,000 Da.
  • the average MM average masses of the products have were determined at the apex of the elution peaks.
  • the enzymes DSR-M A1, DSR-M A2 and DSR-M A2 W624A very efficiently lengthened MSer(OH)-glu since they allowed a conversion of MSer(OH)-glu of 80.2% and 90.4% respectively. They produced a dextran type motif, composed exclusively of glucosyl units linked by ⁇ -1,6 bonds (natural motif of these enzymes); which gives them a lower risk of anaphylactic shock. As illustrated in Figure 11, it was possible to control the size of the polymers by enzyme engineering, DSR-M A2 W624A being a variant of the DSR-M A1 enzyme [24].
  • the W624A mutation made it possible to obtain MSer(OH)-polym of reduced average molar mass (10 units) while the reaction with the enzyme DSR-M A1 produced MSer(OH)-polym of higher average molar mass, comprising on average 37 units glucosyl.
  • Low molar mass dextrans are already marketed for pharmaceutical applications, particularly in certain ophthalmological products. In free form, they are used as an eye lubricant or artificial tears (see https://www.dextran.com/application-areas/eve). Their coupling to an MSer(OH) presenting a strong UV absorption capacity should allow the development of new products, formulations, (bio)materials, drugs combining the properties of sugars and mycosporins.
  • the glucosylation reaction was also tested on a crude extract of Lichina pygmea, more easily sourced, which can be obtained from an aqueous or hydroalcoholic extraction, possibly followed by lyophilization.
  • the extract comes directly from the lichen Lichina pygmea, not purified but enriched in MSer(OH) up to 10% of the total mass of the extract.
  • the first step of glucosylation by GS-D gave identical results to the reactions carried out on pure MSer(OH), i.e. 95% glucosylated MSer(OH) ( Figure 13).
  • the second step involving the polymerases was also as effective as when carried out with purified MSer(OH) ( Figure 14 with the DSR-M A1 enzyme).
  • the enzymes are not inhibited by other components of the crude medium. This is particularly advantageous for an industrial approach to the process that avoids the costly MSer(OH) purification step.
  • This quantum yield represents the ratio between the photo-degraded molecules and the number of photons received by these molecules, and is calculated according to the following formula: where ro is the photo-decomposition rate (mol.L' 1 .s' 1 ), V is the volume of the solution (L), NA is the Avogadro number (mol -1 ), lo the number of photons emitted in the region of the absorbance band of MSer(OH) and A the absorbance of the solution of the different samples. The experiments were carried out in triplicate.
  • Glucosylation of mycosporin therefore does not impact photostability. This is due to the fact that the glucosylation positions do not prevent the delocalization of the electronic cloud allowing the dissipation of the energy received in the form of heat. Also, the length of the carbohydrate chain does not modify the photostability of the products.
  • the antioxidant power of the MSer(OH)-glu and Mser(OH)-polym glucosylation products was determined using the TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) method.
  • the TEAC test is well established for the assessment of radical scavenging properties and allows comparison of TEAC scores with a broad bibliography. Based on the reduction of the previously oxidized ABTS+ form, this spectrophotometric method is easy to implement [27].

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Abstract

La présente invention a pour objet la préparation de mycosporines glucosylées par un procédé de cascade enzymatique mettant en œuvre des α-transglucosylases et du saccharose, et leur utilisation notamment pour leurs propriétés anti-UV.

Description

MYCOSPORINES GLUCOSYLEES PAR VOIE ENZYMATIQUE POUR LE DEVELOPPEMENT DE PRODUITS ANTI-UV INNOVANTS DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention concerne la préparation de mycosporines glucosylées par un procédé de cascade enzymatique mettant en œuvre des a-transglucosylases et du saccharose, et leur utilisation en particulier pour leurs propriétés anti-UV (e.g. propriétés d’absorption et de protection des UV, propriétés antioxydantes).
La présente invention trouve par exemple des applications dans le domaine de l’ophtalmologie, la dermatologie, la cosmétologie, des matériaux, de l’agriculture. Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
La prévention et la protection sont essentielles pour faire face aux dommages chroniques et aigües causés par les rayonnements UV sur la santé humaine, en particulier sur la peau et les yeux. Ainsi, la réduction de l’exposition aux UV et l’application d’un écran solaire est fortement recommandée en prévention des maladies de peau. Les écrans solaires inorganiques à large spectre composés de dioxyde de titane (TiC ) et d’oxyde de zinc (ZnO), agissant essentiellement par absorption mais également par diffusion des radiations, sont communément utilisés [1]. Cependant, leur aspect généralement couvrant et blanc n’est pas accepté par tous les consommateurs, et l’éventuelle cytotoxicité de l’accumulation des nanoparticules dans l’organisme n’est pas encore suffisamment étudiée [2], Les filtres organiques composés de molécules synthétiques ont été accusés d’avoir une efficacité relativement limitée pour la protection de la peau, d’être parfois allergisants, et d’être des perturbateurs endocriniens [1 ,2], Certains sont même soupçonnés de se dégrader en composés cancérigènes, comme l’octocrylène [3] dont il a été récemment établi qu’il se dégradait au fil du temps en benzophénone. De plus, le manque de photostabilité de certains composés pourrait créer un effet contre-productif en créant des ROS (Reactive Oxygen Species) et en augmentant le stress oxydatif. Enfin, d’un point de vue environnemental, ces deux types de filtres sont accusés de s’accumuler dans les eaux du littoral, provoquant des changements endocriniens chez les poissons et des phénomènes de blanchiment de coraux [4,1], En outre, dans les écrans solaires, les filtres chimiques tels que l’oxybenzone provoquent des allergies et des effets secondaires chez les humains, et sont connus pour endommager les récifs coraliens [4], Il est donc nécessaire de développer de nouvelles solutions s’appuyant sur des ressources naturelles et mettant en œuvre des procédés respectueux de l’environnement.
Les mycosporines et les acides aminés de type mycosporines (Mycosporine- like Amino-Acids, MAA) (ci-après tous deux dénommés sous le terme générique de mycosporines) sont de petites molécules d’environ 400 dalton (Da), organisés autour d’un cycle cyclohexénone ou cyclohexénimine. En raison de leur structure, ces zwitterions présentent des capacités uniques d’absorption des rayons UV, avec une gamme d’absorption allant de 309 à 362 nm et un coefficient d’extinction de 21 800 cnr1.M’1 à 50 000 cnr1.M’1 [5]. Ils couvrent donc à la fois la plage des UV-A et UV-B. Les mycosporines sont également décrites comme de puissants antioxydants. Ce sont des métabolites secondaires et leur rôle comme filtre solaire naturel est étudié depuis des années. Leur potentiel est prometteur pour plusieurs raisons : (i) elles peuvent agir comme filtre UV et antioxydants, une combinaison efficace pour protéger l’organisme contre les multiples dommages des photolésions, (ii) elles sont également étudiées pour leurs propriétés anticancéreuses, anti-vieillissement et anti-inflammatoires, et (iii) elles présentent un fort potentiel pour favoriser la cicatrisation des blessures [1]. Leur mécanisme d’action est le suivant : dans un état photoexcité, elles subissent une rapide conversion interne vers l’état électronique fondamental (S0) en dégageant de la chaleur ou bien en effectuant une isomérisation réversible [1 ,6]. Grâce à ce mécanisme, plus de 90% de l’énergie reçue est libérée par transfert de chaleur vers le milieu environnant sans génération de ROS. Aucune émission de fluorescence n’a été particulièrement rapportée [7],
Les mycosporines sont présentes dans une très grande diversité d’organismes. Les radiations UV impactent la vie terrestre, mais elles peuvent aussi pénétrer dans les eaux de 0,5 à 47 mètres de profondeur, selon la clarté de l’eau et les conditions météorologiques [1]. Les mycosporines ont ainsi été identifiées dans des cyanobactéries, mais aussi dans des bactéries hétérotrophes et des champignons marins, des microalgues, des macroalgues (en majorité des algues rouges et brunes), du phytoplancton (diatomées, dinoflagellés), des coraux, des mollusques et des poissons [7,8]. Elles ont également été identifiées dans des organismes terrestres, tels que les lichens vivant dans des conditions parfois très extrêmes [9]. C’est le cas de la mycosporine-sérinol MSer(OH) présente notamment dans l’espèce Lichina pygmea, présente dans les zones médiolittorales des côtes de l’Europe de l’ouest.
Chez les métazoaires comme les poissons, les mycosporines peuvent s’accumuler rapidement dans les tissus des couches externes exposées au soleil, comme par exemple la peau de la surface dorsale, ainsi que les organes sensibles comme les voies digestives, les organes reproducteurs, et également les yeux [1 ,5,7,8]. Dans l’œil, elles sont particulièrement concentrées dans la cornée et le cristallin, préservant ainsi la rétine des dommages photooxydatifs causés par les rayons UV [10].
La présence de mycosporines dans les tissus oculaires des poissons est un sujet de bioinspiration particulièrement intéressant, notamment dans la mise en place de solutions biomédicales préventives et/ou curatives dans le domaine ophtalmologique. Cependant, la formulation de produits biomédicaux à partir des mycosporines actuellement disponibles est compliquée du fait de leurs petites tailles qui conduit à leur rapide élimination des muqueuses (notamment de l’œil).
Les mycosporines glycosylées sont déjà présentes dans la nature avec essentiellement un degré de polymérisation (DP) de 1 à 2 unités glycosylé (/.e. xylose, galactose, glucosamine, etc...), exceptionnellement jusqu’à 8 unités glycosylé de différente nature (/.e. xylose, galactose, glucosamine, etc...) pour un cas de mycosporine de type mycosporine-glycine [11]. Cependant, les plus largement décrites sont celles retrouvées dans la matrice exopolysaccharidique de cyanobactéries terrestres du genre Nostoc (Nostoc commune, Nostoc sphaericum) [12-14], Dans ces organismes, différentes mycosporines ont été identifiées (shinorine, porphyra-334, palythine, mycosporine-glycine, mycosporine-glutamicol) liées à différentes unités glycosylé (galactose, glucosamine, xylose, etc...). Bien que le rôle de ces mycosporines glycosylées n’ait pas été totalement découvert, elles assurent probablement un rôle plurifonctionnel de protection envers les UV mais également envers le stress thermique ou la dessication. L’intérêt des sucres liés de manière covalente aux mycosporines n’est pas non plus totalement élucidé, même s’il est fortement avancé que cela améliorerait les interactions envers la matrice exopolysaccharidique de ces cyanobactéries [13]. En plus de la stabilité accrue et de l’attachement non covalent à la matrice extracellulaire de glycanes, la proportion importante de mycosporines glycosylées témoigne sûrement d’un autre rôle utile : Ishihara et al. ont ainsi identifié que 86,5% du total des mycosporines de Nostoc sphaericum étaient des p-galactose-porphyra-334 ; 13,2% étaient des hexose-shinorines et seulement 0,2% étaient des porphyra-334 libres [14],
Description de l’invention
Les Inventeurs ont émis l’hypothèse qu’il pourrait être intéressant d’intégrer de longues chaînes glucosylées aux mycosporines afin de voir si les molécules obtenues seraient suffisamment stables et conserveraient leurs propriétés anti-UV (photostabilité) pour être utilisables.
Les Inventeurs ont donc mis au point un nouveau procédé capable d’ajouter une longue chaîne glucosyle aux mycosporines, ce qui a permis d’obtenir de nouveaux produits ou biomatériaux respectueux de l’environnement et hautement protecteurs des UV, en remplacement des filtres UV actuels, capables de rallonger le temps de rétention des mycosporines dans des organes, comme par exemple les yeux. La nature de la chaine glucidique (uniquement composée d’unités glucosyle) devrait permettre de diminuer le risque de réaction allergique.
Les biomolécules obtenues (mycosporine glucosylées) protectrices contre les UV avec un temps prolongé de rétention utilisant des précurseurs exclusivement naturels, peuvent être appliquées dans des formulations cosmétiques, des produits médicaux (e.g. en ophtalmologie), des biomatériaux et matériaux d’extérieur comme alternatives aux ingrédients actifs courants.
Pour cela, bien qu’elle n’ait encore jamais été étudiée en relation avec les mycosporines, la glycosylation par voie enzymatique est apparue comme le procédé le plus efficace. Une famille d’enzyme est apparue comme particulièrement intéressante pour ce type de catalyse enzymatique. Il s’agit des a-transglucosylases de la famille 70 des Glycosides Hydrolases (GH-70) [15], des enzymes que l’on retrouve naturellement dans les bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, Oenococcus ou Weissela sp. [16]. Ces enzymes présentent un intérêt industriel non négligeable du fait de leur mécanisme catalytique, illustré à la Figure 16. A partir de saccharose, un substrat très bon marché et issu de ressources renouvelables (betterave et canne à sucre), ces enzymes sont capables de former divers produits en fonction de la nature de la molécule acceptrice. Après avoir formé un intermédiaire covalent (étape 1 sur la Figure 16), les GH-70 peuvent transférer l’unité glucosyle sur [17] :
- de l’eau (étape 3 sur la Figure 16) pour réaliser une réaction d’hydrolyse, il y a dans ce cas formation de glucose libre (ayant lieu majoritairement en début de réaction pour les très bonnes polymérases de la famille GH-70).
- un glucose et progressivement des oligosaccharides de glucose de taille croissante (étape 4 sur la Figure 16), pour réaliser la synthèse d’homopolymères d’unités a-D-glucosyle, appelés a-glucanes. Ceux-ci représentent une large diversité de polymères, allant de 103 à 109 Da et composés de liaisons osidiques de différentes natures (a-1 ,2 ; a-1 ,3 ; a-1 ,4 et/ou a-1 ,6). Parmi ces a-glucanes, l’un des plus connus est le dextrane. C’est un polymère plus ou moins linéaire contenant une majorité d’unités glucosyle liées en a-1 ,6 et qui possède de nombreuses applications en industrie (domaines agroalimentaire, cosmétique et pharmaceutique par exemple).
- du fructose (étape 5 sur la Figure 16), il y a alors formation d’isomères du saccharose, tel que le leucrose par exemple. Ces produits sont néanmoins minoritaires.
- une molécule acceptrice exogène rajoutée dans le milieu en début de réaction (glycone ou aglycone), possédant au moins une fonction hydroxyle (étape 6 de la Figure 16), cette action catalytique est nommée la réaction d’accepteur.
La capacité à transférer les unités glucosyle sur ces molécules exogènes dépend de plusieurs facteurs dont la structure de l’accepteur et celle du site actif de l’enzyme. Un accepteur qualifié d’efficace pourra rediriger la quasi-totalité du transfert des unités glucosyle non pas vers la formation de polymères mais vers sa propre glucosylation. A ce jour, une grande variété d’accepteurs a déjà été testée, dont par exemple les flavonoïdes tels que la quercétine et la lutéoline [18].
La présente invention vise donc à produire des dérivés glucosylés de mycosporines, en particulier de la myscosporine-sérinol (nommée ci-après MSer(OH)) issue notamment du lichen marin Lichina pygmea, grâce à un procédé de cascade enzymatique mettant en œuvre des a-transglucosylases de la famille 70 des Glycoside Hydrolases (GH-70) et du saccharose. Naturellement, ces enzymes utilisent le saccharose issu de la betterave ou de la canne à sucre pour synthétiser (polymérases) ou décorer (branching sucrases) des polymères d’unités glucosyle de haute masse molaire (a-glucanes). A titre de comparaison, certaines sucrose phosphorylases qui utilisent également le saccharose comme donneur d’unités glucosyle, ainsi que des CGTases commerciales appartenant à la famille GH-13 qui utilisent l’amidon (un autre substrat naturel et abondant) comme donneur d’unités glucosyle ont également été testées, mais sans succès.
La méthode de cascade enzymatique décrite ici (Figure 1 ) a l’avantage de ne pas mettre en œuvre de réaction chimique ; cela permet d’éviter plusieurs étapes de protection/déprotection des fonctions hydroxyles des sucres qui demandent en général l’utilisation de catalyseurs métalliques ou d’acides forts. Ces derniers sont connus pour générer de grandes quantités de déchets à traiter et peuvent conduire à des réactions parasites non maitrisées.
La production de mycosporines glucosylées est réalisée dans un milieu totalement aqueux sans ajout de solvant organique.
La glucosylation peut être réalisée en une seule étape (co-synthèse ou synthèse one-pot) ou en deux étapes comme suit :
1/ glucosylation d’une mycosporine (e.g. de la mycosporine-sérinol, MSer(OH)) par l’enzyme GS-D (a-transglucosylase de la famille GH-70) à partir de saccharose, permettant l’obtention de produits intermédiaires de glucosylation nommés mycosporine-glu (e.g. MSer(OH)-glu) ;
2/ allongement des produits intermédiaires de glucosylation mycosporine-glu (e.g. MSer(OH)-glu) par d’autres a-transglucosylases de la famille GH-70 à partir de saccharose, permettant l’obtention de produits de glucosylation finaux nommés mycosporine-polym (e.g. MSer(OH)-polym).
Cette seconde étape de la cascade enzymatique permet la synthèse « à façon » de mycosporine liée de manière covalente à des chaînes glucosylées de longueurs et de liaisons osidiques variées (a-1 ,2 ; a-1 ,3 ; a-1 ,4 et/ou a-1 ,6) selon les enzymes et les conditions de réaction mises en œuvre. Les produits intermédiaires mycosporine-glu (e.g. MSer(OH)-glu) peuvent porter jusqu’à 4 unités glucosyle avec un degré de polymérisation (DP) moyen majoritairement centré entre 1 et 2 unités glucosyle, tandis que les produits finaux mycosporine-polym (e.g. MSer(OH)-polym) peuvent présenter entre 2 et 1 00 000 unités glucosyle, avec un degré de polymérisation (DP) moyen centré entre 3 et 1 000 000, entre 3 et 800 000, entre 3 et 500 000, entre 3 et 24 000, entre 3 et 60, ou entre 3 et 41 unités glucosyle, selon les enzymes utilisées. Les mycosporines étant qualifiées de filtres solaires naturels, les dérivés de mycosporines développés par le procédé de la présente invention composés de mycosporines possédant une longue chaîne glucosylée pourraient facilement être utilisés pour la prévention et protection des cellules (dermiques et oculaires) et avoir des applications à visées cosmétiques, médicales et/ou pharmaceutiques. Notamment, des applications dans des produits ophtalmologiques pour la protection de l’œil (e.g. prévention de la cataracte) ou pour la protection des personnes ayant des anomalies génétiques et héréditaires telles que l’albinisme et xeroderma pigmentosum, peuvent être envisagées. Une autre application serait d’intégrer ces mycosporines glucosylées dans des crèmes solaires biosourcées, biodégradables et sans conséquences environnementales telles que le blanchissement des coraux. Enfin, ces myscosporines glucosylées peuvent également être utilisées pour la protection de matériaux utilisés en extérieur [19].
La présente invention a donc pour objet un procédé de production d’une mycosporine glucosylée, ledit procédé comprenant une étape a) de glucosylation d’une mycosporine par l’enzyme a-transglucosylase GS-D à partir de saccharose pour l’obtention d’un produit intermédiaire de glucosylation étant une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation allant de 1 à 4 unités glucosyle, de préférence un degré de polymérisation moyen de 1 à 2 unités glucosyle.
Selon un mode particulier de la présente invention, le procédé peut comprendre en outre une étape b) d’élongation de la partie glucidique du produit intermédiaire de glucosylation obtenu à l’étape a) à partir de saccharose par au moins une a-transglucosylase différente de l’a-transglucosylase GS-D pour l’obtention d’une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000 000 unités glucosyle, de 3 à 800 000 unités glucosyle, de 3 à 500 000 unités glucosyle, de 3 à 24 000 unités glucosyle (pour une très bonne polymérase comme par exemple l’enzyme dextrane-saccharase DSR-OK A1 ), de 3 à 60 unités glucosyle, de 3 à 41 unités glucosyle ; de préférence de 9 à 1 000 000 unités glucosyle, de 9 à 800 000 unités glucosyle, de 9 à 500 000 unités glucosyle, de 9 à 24 000 unités glucosyle, de 9 à 60 unités glucosyle, ou de 9 à 41 unités glucosyle.
Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, les étapes a) et b) peuvent être réalisées de manière concomitante, à savoir que ledit procédé comprend la glucosylation d’une mycosporine et l’élongation de sa partie glucidique par l’enzyme a-transglucosylase GS-D et au moins une autre a-transglucosylase différente de l’a-transglucosylase GS-D à partir de saccharose, pour l’obtention d’une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000000 unités glucosyle, de 3 à 800 000 unités glucosyle, de 3 à 500 000 unités glucosyle, de 3 à 24 000 unités glucosyle (pour une très bonne polymérase comme par exemple l’enzyme dextrane-saccharase DSR-OK A1 ), de 3 à 60 unités glucosyle, de 3 à 41 unités glucosyle ; de préférence de 9 à 1 000 000 unités glucosyle, de 9 à 800 000 unités glucosyle, de 9 à 500 000 unités glucosyle, de 9 à 24 000 unités glucosyle, de 9 à 60 unités glucosyle, ou de 9 à 41 unités glucosyle.
On entend par « degré de polymérisation (DP) moyen » au sens de la présente invention, le degré de polymérisation déterminé à l’apex des pics obtenus par analyse de chromatographie d’exclusion de taille haute performance couplée à un détecteur UV et étalonnage/calibration de la colonne à l’aide de dextranes commerciaux de masse molaire comprise entre 342 g/mol et 70 000 g/mol.
Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, ladite au moins une a-transglucosylase de l’étape b) est choisie dans le groupe constituée de : glucane-saccharases GS-A, GS-B, GS-C, GS-F A1 , et GS-FS ; dextrane- saccharases DSR-M A1 , DSR-M A2 W624A, DSR-G A1 , DSR-S vardel A4N, et DSR-OK A1 ; alternane-saccharase ASR A1 .
Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, la mycosporine de l’étape a) est choisie dans le groupe constitué de : mycosporine pure ou purifiée, extrait de lichen Lichina pygmea enrichi en mycosporine de 0 à 50% en poids d’extrait, de préférence de 5 à 35 % en poids d’extrait, préférentiellement de 15 à 25% en poids d’extrait, tout préférentiellement de 10% en poids d’extrait. De préférence, la mycosporine utilisée à l’étape a) est la mycosporine-sérinol (MSer(OH)). Cette dernière peut être isolée à partir d’extrait de cyanolichens tels que Lichina pygmae et Lichina confiais, de différentes espèces de Peltigera, de Stereum hirsutum, d’Alternaria chrysanthemi, d’Ascochyta pisi, d'Ophiobolus graminis, de Pleospora herbarum, ou encore de Pyronema omphalodes. Elle peut également être produite à partir de son précurseur (gadusol) par biologie de synthèse.
La présente invention a encore pour objet, un produit intermédiaire de glucosylation obtenu par le procédé de la présente invention, ledit produit intermédiaire de glucosylation étant une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 1 à 4 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de préférence de 1 à 2 unités glucosyle (liaisons de type alpha).
La présente invention a encore pour objet, une mycosporine glucosylée obtenue par le procédé de la présente invention, ladite mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 00 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 3 à 800 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 3 à 500 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 3 à 24 000 unités glucosyles (liaisons de type alpha), de 3 à 60 unités glucosyles (liaisons de type alpha), ou de 3 à 41 unités glucosyle (liaisons de type alpha) ; de préférence de 9 à 1 000 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 9 à 800 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 9 à 500 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha), de 9 à 24 000 unités glucosyle (liaisons de type alpha) de 9 à 60 unités glucosyle (liaisons de type alpha), ou de 9 à 41 unités glucosyle (liaisons de type alpha).
La présente invention a encore pour objet l’utilisation cosmétique d’une mycosporine glucosylée selon la présente invention, comme agent anti-UV, pour (i) protéger la peau des rayons UV, (ii) lutter contre le photo-vieillissement.
La présente invention a encore pour objet une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif une mycosporine glucosylée selon la présente invention.
La présente invention a encore pour objet l’utilisation cosmétique d’une composition cosmétique selon la présente invention, pour (i) protéger la peau des rayons UV, (ii) lutter contre le photo-vieillissement.
La présente invention a encore pour objet une mycosporine glucosylée selon la présente invention pour une utilisation comme médicament, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement, par exemple, de la cataracte, de maladies de peau associées à une sensibilité aux UV telles que le xeroderma pigmentosum, de maladies génétiques héréditaires telles que l’albinisme, ou encore du cancer de la peau.
En conclusion, l’invention met en place des procédés verts et mobilise des ressources naturelles à savoir des mycosporines, notamment issues d’un lichen se développant en bord de mer, et du saccharose. Cette dernière ressource, servant de substrat aux enzymes de la famille GH-70, est disponible en grande quantité et à moindre coût. Les réactions enzymatiques sont des procédés en conditions douces et ne produisent pas de déchets (toxiques). Certaines chaînes glucosylées ont des signatures de dextrane, un a-glucane très utilisé dans le domaine cosmétique et biomédical, car très bien supporté par l’organisme. La chaîne dextrane des produits MSer(OH)-polym étant modulable « à façon » (/.e. en terme de liaisons osidiques, de taille de chaine glucidique), elle peut facilement être adaptée au type d’application visée. Dans la nature, dans le mucus et le cristallin des poissons par exemple, les mycosporines sont liées à des protéines [7,20,21], Dans le cadre de la présente invention, ce phénomène a été imité en produisant des dérivés de mycosporines MSer(OH)-polym ayant une chaîne glucidique allongée. Par rapport aux molécules de mycosporines libres, les mycosporines glucosylées obtenues par le procédé de la présente invention présentent de meilleures propriétés, notamment de photostabilité.
Par rapport aux molécules commerciales de protection contre les UV, comme e.g. l’oxybenzone (un bloqueur d’UVA et d’UVB) qui provoque le blanchiment des récifs coraliens [4], les mycosporines glucosylées ne provoqueraient pas de tels dégâts.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente le principe de la cascade enzymatique permettant la glucosylation de mycosporines à partir de saccharose et impliquant des a- transglucosylases de la famille GH-70 : une première étape de glucosylation réalisée par l’enzyme GS-D puis un allongement de la chaîne glucosidique par différentes enzymes de la famille, permettant à la fois un contrôle de la taille et de la structure de cette chaîne (différents types de liaisons a-osidiques selon l’enzyme choisie).
La Figure 2 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des enzymes a-transglucosylases de la famille GH-70 criblées pour la glucosylation de MSer(OH). Seule l’enzyme GS-D parvient à glucosyler efficacement MSer(OH).
La Figure 3 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des enzymes CGTases et sucrose-phosphorylases commerciales criblées pour la glucosylation de MSer(OH).
La Figure 4 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des différents produits de glucosylation de 5 mM de MSer(OH) par GS-D, nommés MSer(OH)-glu. La numérotation 1 -8 identifie les différents produits de glucosylation MSer(OH)-glu qui ont été obtenus à l’issue de la première étape de la cascade enzymatique. La Figure 5 représente (A) la structure chimique de la MSer(OH) avec la numérotation des carbones et l’illustration des positions éventuelles de glucosylation. Les hexagones représentent des unités glucosyle liées à la MSer(OH) (B) exemples de structures des DP2 produits par la glucosylation de MSer(OH) par l’enzyme GS-D (C) exemples de structure de DP3 produits par la glucosylation de MSer(OH) par l’enzyme GS-D (D) exemples de structures de produits issus de la cascade enzymatique (glucosylation+elongation).
La Figure 6 représente les spectres RMN 1H (spectre A) et HMBC (spectre B) confirmant la glucosylation de MSer(OH) par GS-D en produit intermédiaire de glucosylation (MSer(OH)-glu) ayant un degré de polymérisation moyen allant de 1 à 2 unités glucosyle.
La Figure 7 représente la comparaison des chromatogrammes UV (À=310 nm) des réactions de glucosylation de MSer(OH) par GS-D, à 5 et 50 mM de MSer(OH).
La Figure 8 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) des polymérisations en cascade enzymatique GS-D puis une polymérase (i.e. une autre a-transglucosylase de la famille GH-70). Les enzymes utilisées en seconde étape sont indiquées sur les chromatogrammes.
La Figure 9 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) de 6 des 11 différentes réactions, séparées par chromatographie d’exclusion de taille haute performance (HPSEC). Le chromatogramme annoté DEX 10 000 Da est celui d’un dextrane commercial de masse molaire moyenne 10 000 g/mol. Les astérisques identifient la ou les populations majoritaires pour chaque réaction. Les pics DP1 et DP2 correspondent respectivement aux Pic 1 et Pic 2 de la Figure 4.
La Figure 10 représente les chromatogrammes UV (À=310 nm) de 3 des 11 différentes réactions, séparées par chromatographie d’exclusion de taille haute performance (HPSEC). Le chromatogramme annoté DEX 70 000 Da est celui d’un dextrane commercial de masse molaire moyenne 70 000 g/mol.
La figure 11 représente la comparaison des analyses par CLHP sur colonne C18 Synergi™ Fusion-RP couplée à un détecteur UV (À=310 nm) des réactions de polymérisation des produits MSer(OH)-glu par l’enzyme DSR-M A2 et son mutant DSR-M A2 W624A.
La figure 12 représente les scans de l’absorbance de MSer(OH) et des produits MSer(OH)-glu et MSer(OH)-polym pour des longueurs d’onde allant de 200 nm à 800 nm (zone d’intérêt présentée : 200 à 400nm). La Figure 13 représente la comparaison des chromatogrammes UV (À=310 nm) des réactions de glucosylation de GS-D sur la MSer(OH) purifiée et présente à hauteur de 10% dans un extrait brut de lichen Lichina pygmea, lors de réactions réalisées avec 6,37 mM de MSer(OH) et 292 mM de saccharose.
La Figure 14 représente la comparaison des chromatogrammes UV (À=310 nm) des réactions de glucosylation de GS-D puis DSR-M A1 sur la MSer(OH) purifiée et celle présente dans l’extrait brut issu du lichen Lichina pygmea.
La Figure 15 représente les chromatogrammes des polymérisations en cosynthèse. Les produits MSer(OH)-glu sont moins efficacement consommés par les polymérases, moins de MSer(OH)-polym sont produits.
La Figure 16 représente le schéma des différents mécanismes catalytiques des GH-70.
La Figure 17 représente le rendement quantique du MSer(OH) et des différents produits de glucosylation MSer(OH)-glu et Mser(OH)-polym obtenus par le procédé de l’invention.
La Figure 18 représente le score TEAC du MSer(OH) et des produits de la cascade enzymatique du procédé de l’invention, avec et sans MSer(OH).
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : EXEMPLE DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE DE L’INVENTION
Premier criblage :
Une collection d’a-transglucosylases des familles GH70 et GH13 a été criblée pour leur aptitude à glucosyler la molécule de mycosporine-sérinol (MSer(OH)) à partir de saccharose ou éventuellement d’amidon. Dans un premier temps, les travaux ont été réalisés à partir de MSer(OH) pure obtenue à partir d’un extrait de Lichina pygmea. Les enzymes référencées dans le Tableau 1 ci-dessous ont toutes été produites sous forme recombinante chez Escherichia coli, hormis les CGTases et sucrose-phosphorylase (enzymes n°22, 23 et 24) qui sont des formulations commerciales.
Tableau 1
L.=Leuconostoc Lb.=Lactobacillus Bb.=Bifidobacterium P=Polymérase ; B=Branching sucrase ; Bif=bifonctionnelle ; GT=a-glucano transférases ; S- Php=phosphorolyse du saccharose ; N.D=non déterminé.
Les enzymes ont été produites à partir des cellules d’E. coli BL21 Star (DE3) transformées avec le plasmide contenant le gène des enzymes cibles (Tableau 2). 300 pL du mélange de transformation ont permis d’ensemencer un volume de 30 mL de LB (Lysogeny Both), supplémenté en ampicilline à 100 pg/mL. Le milieu a été mis à incuber sur la nuit à 37 °C afin de préparer une préculture. Des cultures de 1 L en milieu ZYM5052 modifié [22], dont les caractéristiques sont présentées dans le Tableau 2, ont été ensemencées à une DO (À=600nm) initiale de 0,05 à partir de la préculture de la veille, puis mises à incuber 26 heures à 21 °C et à 150 rpm.
En fin de fermentation, les milieux de culture ont été centrifugés (15 minutes, 800 g, 8 °C) et les culots ont été concentrés à une DO (À=600nm) de 80 dans du tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les cellules ont alors été cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30% de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Les surnageants de sonication contenant les enzymes d’intérêt solubles ont ensuite été récupérés après 30 minutes de centrifugation (15 000 g, 6 °C) et conservés à 4 °C. [Tableau 2]
Gly=Glycérol ; Glu=Glucose ; a-Lac=a-Lactose ; L-Ara=L-arabinose
L’activité enzymatique a été déterminée en mesurant la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide dinitrosalicilique (DNS) [23]. Une unité enzymatique a représenté la quantité d’enzyme qui libère une pmole de fructose par minute, à 30 °C, à partir de 100 g/L de saccharose dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH=5,75. Au cours d’une cinétique, 100 pL de milieu réactionnel ont été prélevés et la réaction a été stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons ont ensuite été chauffés 5 minutes à 95°C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance a été lue à À=540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g/L de fructose a permis d’établir un lien entre valeur d’absorbance et concentration en sucres réducteurs.
Le premier criblage, qui a impliqué l’ensemble des enzymes du Tableau 1 , a été réalisé dans un volume de 25 pL contenant 5 mM de MSer(OH), 292 mM de saccharose et 50 mM de tampon acétate de sodium à pH=5,75. La réaction a été incubée à 30 °C sous une agitation de 500 rpm. Au bout de 24 heures, le mix réactionnel a été incubé à 70 °C pendant 10 minutes afin d’inactiver les enzymes. En vue de leurs analyses, les milieux réactionnels ont été dilués au 1/10 dans de l’eau et centrifugés 5 minutes à 2000 g.
La séparation des différents produits (MSer(OH)-glu) été effectuée en phase inverse avec une colonne C18 Synergi™ Fusion-RP 250 mm x 2 mm (porosité : 80 Â, granulométrie : 4 pm, Phenomenex, USA). Cette colonne a été maintenue à 30 °C sur un système CLHP Thermo Ultimate 3 000 équipé d’un détecteur UV (Thermo Ultimate 3 000) à À=310 nm et d’un détecteur CAD (Charged Aerosol Detector) Corona Véo (température de nébulisation : 50 °C). La phase mobile était composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité LC-MS (solvant B) à un débit de 0,2 mL/min. La séparation a été assurée en 75 minutes par un gradient linéaire, tel que défini dans le Tableau 3.
[Tableau 3]
Lors de cette étape, l’enzyme GS-D s’est avérée être de loin la plus performante (Figures 2 et 3), convertissant 95% de MSer(OH) en 8 produits glucosylés différents alors que pour toutes les autres enzymes testées, le taux de conversion a été compris entre 0% et 6,5%. Représentant à eux seuls 72,3% d’aires de l’ensemble des produits MSer(OH)-glu, les pics majoritaires sont les pics numérotés 1 et 2 sur la Figure 4. Leurs analyses par chromatographie liquide couplée à un détecteur de masse (LC-MS) ont montré qu’ils présentaient un degré de polymérisation (DP) de 1 et 2 unités glucosyle respectivement. Les pics minoritaires (produits 3 à 8 sur la Figure 4) seraient de degré de polymérisation (DP) de 3 à 4 unités glucosyle.
Afin d’identifier la position des unités glucosyle sur MSer(OH)-glu, des analyses de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont été réalisées. Les spectres 1H, 13C, JMod, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298K avec une sonde BBI 5 mm z-gradient H-BB-D. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.5. L’ensemble de ces analyses ont mis en évidence que la glucosylation a eu lieu sur les hydroxyles portés par le carbone C8 et les carbones équivalents C10/C11 de MSer(OH) (Figure 5A). Les Figures 5B-D précisent la structure des produits obtenus par le procédé de l’invention, et que le nombre de substitutions par des unités glucosyles peut varier de 1 à 2, possiblement 3, et la variété des produits glucosylés que le milieu de culture peut comprendre.
Afin d’évaluer la possibilité d’une application industrielle, la réaction de glucosylation de MSer(OH) par GS-D a été testée sur une concentration de MSer(OH) de 50 mM soit une concentration 10 fois plus importante que lors du criblage. Le protocole suivi a été, par ailleurs, identique à celui décrit précédemment. Notamment, la concentration en saccharose étant conservée à 292 mM, le ratio molaire sacccharose:MSer(OH) est passé de 60:1 à 6:1. La comparaison des chromatogrammes pour ces deux réactions est représentée sur la Figure 7. Le taux de conversion de MSer(OH) en MSer(OH)-glu est passé seulement de 95% avec 5 mM de MSer(OH) à 90% avec 50 mM de MSer(OH). Ce nouveau taux de conversion satisfaisant a montré qu’il était envisageable d’augmenter les quantités de produit glucosylé lors d’une réaction en mode batch. Il a été observé que la proportion relative entre les pics 1 et 2 évoluait légèrement, le produit correspondant à la MSer(OH) diglucosylée (pic 2) étant favorisé quand la concentration initiale est de 5 mM (i.e. quand le ratio saccharose:MSer(OH) est le plus élevé).
Second criblage :
Suite à ces premiers résultats, la prolongation des produits glucosylés MSer(OH)-glu à partir de saccharose par certaines polymérases de la famille GH- 70 a fait l’objet d’un second criblage (cf. Tableau 1 ). Un produit MSer(OH)-polym a été obtenu dont la partie glucosidique a été très nettement rallongée par rapport à celle obtenue par GS-D.
Une production de MSer(OH)-glu a été réalisée dans des conditions similaires à celles décrites en premier criblage mais en quantité plus importante. La réaction a ainsi été conduite dans un volume de 50 pL contenant 25 mM de MSer(OH) pure, 292 mM de saccharose, 1 U.mL’1 de GS-D, et 50 mM de tampon acétate de sodium à pH=5,75. Celle-ci a été incubée à 30 °C sous une agitation de 500 rpm. Au bout de 24 heures, le milieu réactionnel a été incubé à 70 °C pendant 10 minutes afin d’inactiver l’enzyme. L’allongement des produits intermédiaires MSer(OH)-glu par d’autres enzymes de la même famille a été réalisé sans étape de purification préalable de MSer(OH)-glu : 5 pL de milieu réactionnel de l’étape 1 ont été incorporés dans une nouvelle réaction de 25 pL de telle manière que la concentration molaire finale en MSer(OH)-glu soit équivalente à 5 mM de MSer(OH) libre. A cela ont été rajoutés l’équivalent de 292 mM de saccharose et 1 U.mL’1 d’enzyme sélectionnée pour la seconde étape de la cascade enzymatique (cf. Tableau 1 ). Ce nouveau milieu contenait également 50 mM de tampon acétate de sodium à pH=5,75. Les réactions ont été incubées à 30 °C sous une agitation de 500 rpm pendant 24 heures, puis stoppées par un chauffage à 70 °C pendant 10 minutes.
La séparation des différents produits (MSer(OH)-polym) a été réalisée de la même façon que pour les MSer(OH)-glu lors du premier criblage.
Comme le montre la Figure 8, les 11 polymérases testées ont permis de rallonger les intermédiaires MSer(OH)-glu avec des chaînes d’unités glucosyle de taille et de nature variables selon la spécificité de liaison de l’enzyme testée. Sur l’ensemble des réactions, au minimum 67,6% et jusqu’à 97,7% des produits intermédiaires MSer(OH)-glu ont été allongés (Tableau 4). Les pics 1 et 2 des produits intermédiaires MSer(OH)-glu (espèces très majoritaires dans le milieu) ont été principalement consommés par les polymérases, le pourcentage de conversion de chacun de ces deux pics pouvant varier selon la spécificité de l’enzyme utilisée (Tableau 4). Pour la plupart des cascades enzymatiques, le pic 2 (MSer(OH) di glucosylée) est consommé préférentiellement et parfois en quasi-totalité.
La masse moyenne des chaînes glucidiques des MSer(OH)-glu allongées (/.e. MSer(OH)-polym) a été analysée par chromatographie d’exclusion de taille (HPSEC) sur colonne Shodex 802.5. L’élution a été réalisée de manière isocratique à un débit d’eau à 0,3 mL/min et à une température de 70°C. Dans le cas de l’allongement des produits intermédiaires MSer(OH)-glu par les enzymes DSR-OK A1 et DSR-S vardel A4N qui forment des polymères naturels beaucoup plus grands, l’analyse HPSEC a été réalisée en associant une colonne Shodex 805 et une colonne Shodex 802.5 en série. L’élution a été réalisée avec un mélange NaNOs à 450mM, 1 % v/v éthylène glycol.
L’étalonnage de la séparation s’est appuyé sur une gamme étalon de dextranes (polymères d’unités glucosyle liées en a-1 ,6) commerciaux de tailles croissantes entre 342 et 70 000 Da. Les masses moyennes MMmoy des produits ont été déterminées à l’apex des pics d’élution. Le degré de polymérisation moyen (DPmoy) visible en UV a été estimé grâce à la relation suivante : DPmoy = MMmoy / 162.
Selon la polymérase utilisée lors de cette seconde étape, des chaînes d’unités glucosyle allant en moyenne de 3 à 41 unités ont pu être identifiées (Tableau 4, Figures 9 et 10).
[Tableau 4]
Pic 1 = MSer(OH)-monoglucosylée ; Pic 2 = MSer(OH)-diglucosylée ; n.d : non déterminé
De façon notable, les enzymes DSR-M A1, DSR-M A2 et DSR-M A2 W624A ont rallongé très efficacement MSer(OH)-glu puisqu’elles ont permis une conversion de MSer(OH)-glu de 80,2% et 90,4% respectivement. Elles ont produit un motif de type dextrane, composé exclusivement d’unités glucosyle liées par liaisons a-1 ,6 (motif naturel de ces enzymes) ; ce qui leur confère un moindre risque de choc anaphylactique. Comme illustré dans la Figure 11 , il a été possible de contrôler la taille des polymères par ingénierie des enzymes, DSR-M A2 W624A étant un variant de l’enzyme DSR-M A1 [24], La mutation W624A a permis en effet d’obtenir des MSer(OH)-polym de masse molaire moyenne réduite (10 unités) alors que la réaction avec l’enzyme DSR-M A1 a produit des MSer(OH)-polym de masse molaire moyenne supérieure, comprenant en moyenne 37 unités glucosyle.
Les dextranes de faible masse molaire sont déjà commercialisés pour des applications pharmaceutiques, notamment dans certains produits ophtalmologiques. Sous forme libre, ils sont utilisés comme lubrifiant oculaire ou larmes artificielles (cf. https://www.dextran.com/application-areas/eve). Leur couplage à une MSer(OH) présentant une forte capacité d’absorption des UV devrait permettre le développement de nouveaux produits, formulations, (bio)matériaux, médicaments combinant les propriétés des sucres et des mycosporines.
La capacité d’absorption des mycosporines n’a pas été affectée par le greffage d’une chaîne polysaccharidique. En effet, les scans de l’absorbance entre À=200 nm et À=800 nm des produits MSer(OH)-polym obtenus avec l’ensemble des enzymes testées, réalisés à l’aide d’un spectrophotomètre CARY 3 500 ont montré que la glucosylation et l’allongement des chaînes glucosyle sur les MSer(OH) n’ont pas provoqué de changement de longueurs d’onde maximales ÀMAX d’absorbance (Figure 12).
Enfin, la réaction de glucosylation a également été testée sur un extrait brut de Lichina pygmea, plus facilement sourçable, pouvant être obtenu à partir d’une extraction aqueuse ou hydroalcoolique, suivi éventuellement d’une lyophilisation. L’extrait est issu directement du lichen Lichina pygmea, non purifié mais enrichi en MSer(OH) à hauteur de 10% de la masse totale de l’extrait. La première étape de glucosylation par GS-D a donné des résultats identiques aux réactions menées sur MSer(OH) pure, i.e. 95% de MSer(OH) glucosylée (Figure 13). La deuxième étape mettant en jeu les polymérases a été également aussi efficace qu’en la réalisant avec la MSer(OH) purifiée (Figure 14 avec l’enzyme DSR-M A1 ). Ainsi, les enzymes ne sont pas inhibées par d’autres composants du milieu brut. Ceci est particulièrement avantageux pour une approche industrielle du procédé s’affranchissant de la coûteuse étape de purification de MSer(OH).
Avantage de la cascade enzymatique en 2 étapes vs synthèse « one-pot » :
L’utilisation de la GS-D et d’une autre polymérase en synergie (synthèse one- pot ou co-synthèse pour la glucosylation et le rallongement simultanés de MSer(OH)) a été évaluée et comparée aux rendements de glucosylation obtenus lors des cascades enzymatiques en deux étapes.
Cependant, comme illustrée par la comparaison des Figure 8 (cascade enzymatique) et 15 (co-synthèse), les conversions globales de MSer(OH) obtenues sont moins intéressantes en co-synthèse que lors de la cascade enzymatique. En co-synthèse, les produits MSer(OH)-glu sont moins consommés par les polymérases, il y a donc une population plus importante de MSer(OH)-glu et une plus faible population de MSer(OH)-polym.
EXEMPLE 2 : PROPRIETES DES MSer(OH)-glu et MSer(OH)-polym
Les propriétés antioxydantes et la photostabilité des produits MSer(OH) ; MSer(OH)-glu et MSer(OH)-polym générés par le procédé de l’invention ont été testées sur des milieux réactionnels purifiés de l’ADN présent dans les extraits cellulaires ayant servi à la glucosylation de MSer(OH), afin d’éviter les interférences de l’ADN dans les phénomènes étudiés. Cette purification a été réalisée par une chromatographie échangeuse d’anions, avec une résine Diaion.
Photostabilité des produits synthétisés :
La photostabilité a été évaluée sur les différents produits de glucosylation de MSer(OH). Pour cela, les échantillons ont été irradiés dans un simulateur solaire Sun Test XLS (Atlas Material Testing Solutions, USA). Le filtre solaire a été choisi pour reproduire une exposition solaire classique. La concentration en molécules restantes a été suivie par mesure de l’absorbance à À=310 nm. Les cinétiques de photodégradation obtenues permettent le calcul du rendement quantique de photodégradation des produits. Ce rendement quantique représente le rapport entre les molécules photo-dégradées et le nombre de photons reçus par ces molécules, et se calcule d’après la formule suivante : où ro est le taux de photo-décomposition (mol.L’1.s’1), V est le volume de la solution (L), NA est le nombre d'Avogadro (mol-1), lo le nombre de photons émis dans le domaine de la bande d'absorbance de MSer(OH) et A l'absorbance de la solution des différents échantillons. Les expériences ont été réalisées en triplicat.
Tous les produits de glucosylation et d’élongation de la MSer(OH) présentent une forte photostabilité, avec des rendements quantiques de l’ordre de 10-5 (Figure 17), comparables à ceux de certains filtres solaires ainsi qu’à d’autres mycosporines [25, 26],
La glucosylation de la mycosporine n’impacte donc pas la photostabilité. Cela est dû au fait que les positions de glucosylation n’empêchent pas la délocalisation du nuage électronique permettant la dissipation de l’énergie reçue sous forme de chaleur. Également, la longueur de la chaîne glucidique ne modifie pas la photostabilité des produits.
Cependant, des tests préliminaires ont permis de mettre en évidence l’intéraction de l’ADN dans la photostabilité des produits, par l’intermédiaire de la génération d’espèces réactives. Cela se traduit par une moins bonne photostabilité du produit issu de la cascade MSer(OH)+GS-D+DSR-M A2 W624A, dont la purification de l’ADN a été la moins efficace.
Enfin, il apparait que le produit de la cascade MSer(OH)+GS-D+DSR-OK A1 possède une plus importante photostabilité que la MSer(OH) libre. Cela peut s’expliquer par le rôle de protection physique que procure la longue chaine de dextrane, qui protège la MSer(OH) des irradiations.
Pouvoir antioxydant :
Le pouvoir antioxydant des produits de glucosylation MSer(OH)-glu et Mser(OH)-polym a été déterminé selon la méthode du TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Le test TEAC est bien établi pour l'évaluation des propriétés de piégeage des radicaux et permet de comparer les scores TEAC avec une large bibliographie. Basée sur la réduction de la forme ABTS+ préalablement oxydée, cette méthode spectrophotométrique est facile à mettre en œuvre [27], La réduction de l’ABTS+ se traduit par une baisse de l’absorbance à À=734 nm et est proportionnelle à la concentration en molécule antioxydante. Le score TEAC s’établit en comparant les coefficients directeurs de %inhibition = ^concentration antioxydant) avec ceux obtenus avec le Trolox, une molécule antioxydante de référence. Les expériences ont été réalisées en triplicat.
Les scores obtenus pour la MSer(OH) ainsi que ses dérivés glucosylés sont tous supérieurs à 1 (Figure 18). Les produits testés présentent donc un fort pouvoir antioxydant et ce pouvoir est conservé pour tous les produits de glucosylation obtenus, contrairement à ce qui avait été observé lors de la glucosylation de flavonoïdes tels que la lutéoline [28]. Le pouvoir antioxydants de produits issus des cascades enzymatiques sans MSer(OH) a été évalué comme quasiment nul, ce qui atteste que cette propriété biologique est effectivement due à la partie mycosporine de la molécule.
Afin de vérifier la bonne exécution du test nous avons également vérifié le score TEAC d’un antioxydant connu, l’acide ascorbique ou vitamine C. La valeur obtenue (0.8 TEAC) est en accord avec celles de la bibliographie [29]. Ainsi, d’après notre test, tous les produits de la cascade enzymatique possèdent un pouvoir antioxydant supérieur à celui de l’acide ascorbique.
Liste de références
1. Lawrence, K. P., Long, P. F. & Young, A. R. Mycosporine-Like Amino Acids for Skin Photoprotection. Curr. Med. Chem. 25, 5512-5527 (2018)
2. de la Coba, F. et al. UVA and UVB Photoprotective Capabilities of Topical Formulations Containing Mycosporine-like Amino Acids (MAAs) through Different Biological Effective Protection Factors (BEPFs). Mar. Drugs 17 (2019)
3. Downs, C. A., DiNardo, J. C., Stien, D., Rodrigues, A. M. S. & Lebaron, P. Benzophenone Accumulates over Time from the Degradation of Octocrylene in Commercial Sunscreen Products. Chem. Res. Toxicol. 34, 1046-1054 (2021 )
4. Vuckovic, D. et al. Conversion of oxybenzone sunscreen to phototoxic glucoside conjugates by sea anemones and corals. Science 376, 644-648 (2022)
5. Chrapusta, E. et al. Mycosporine-Like Amino Acids: Potential Health and Beauty Ingredients. Mar. Drugs 15 (2017)
6. Woolley, J. M. et al. Unravelling the Photoprotection Properties of Mycosporine Amino Acid Motifs. J. Phys. Chem. Lett. 9, 3043-3048 (2018)
7. Carreto, J. I. & Carignan, M. O. Mycosporine-Like Amino Acids: Relevant Secondary Metabolites. Chemical and EcologicalAspects. Mar. Drugs 9, 387-446 (2011 )
8. Claverie, M., McReynolds, C., Petitpas, A., Thomas, M. & Fernandes, S. C. M. Marine-Derived Polymeric Materials and Biomimetics: An Overview. Polymers 12, 1002 (2020)
9. La Barre, S., Roullier, C. & Boustie, J. Mycosporine-Like Amino Acids (MAAs) in Biological Photosystems, in Outstanding Marine Molecules: Chemistry, Biology, Analysis (ed. Stéphane La Barre, J.-M. K. (eds. )) 333-360 (Wiley-CH Verlag GmbH, 2014). doi:10.1002/9783527681501 ,ch15
10. Shick, J. M. & Dunlap, W. C. Mycosporine-like amino acids and related Gadusols: biosynthesis, acumulation, and UV-protective functions in aquatic organisms. Annu. Rev. Physiol. 64, 223-262 (2002)
11. Bôhm, G. A., Pfleiderer, W., Bôger, P. & Scherer, S. Structure of a novel oligosaccharide-mycosporine-amino acid ultraviolet A/B sunscreen pigment from the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune. J. Biol. Chem. 270, 853-8539 (1995) 12. Matsui, K. etal. Novel glycosylated mycosporine-like amino acids with radical scavenging activity from the cyanobacterium Nostoc commune. J. Photochem. Photobiol. B 105, 81-89 (2011 )
13. Nazifi, E. et al. Characterization of the chemical diversity of glycosylated mycosporine-like amino acids in the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune. J. Photochem. Photobiol. B 142, 154-168 (2015)
14. Ishihara, K. et al. Novel glycosylated mycosporine-like amino acid, 13-O-(0- galactosyl)-porphyra-334, from the edible cyanobacterium Nostoc sphaericum- protective activity on human kératinocytes from UV light. J. Photochem. Photobiol. B 72, 102-108 (2017)
15. C AZy - G H 70. http://www.cazv.org/GH70.html
16. Molina, M., Cioci, G., Moulis, C., Séverac, E. & Remaud-Siméon, M. Bacterial a-Glucan and Branching Sucrases from GH70 Family: Discovery, Structure- Function Relationship Studies and Engineering. Microorganisms 9, 1607 (2021 )
17. Vuillemin, M. et al. Characterization of the First a-(1-3) Branching Sucrases of the GH70 Family. J. Biol. Chem. 291, 7687-7702 (2016)
18. Malbert, Y. et al. Engineering a branching sucrase for flavonoid glucoside diversification. Sci. Rep. 8, 15153 (2018)
19. Fernandes, S. C. M. et al. Exploiting Mycosporines as Natural Molecular Sunscreens for the Fabrication of UV-Absorbing Green Materials. ACSAppl. Mater. Interfaces 7, 16558-16564 (2015)
20. Dunlap, W. C., Williams, D. M., Chalker, B. E. & Banaszak, A. T. Biochemical photoadaptation in vision : U.V.-absorbing pigments in fish eye tissues. Comp. Biochem. Physiol. Part B Comp. Biochem. 93, 601 (1989)
21. Wada, N., Sakamoto, T. & Matsugo, S. Mycosporine-Like Amino Acids and Their Derivatives as Natural Antioxidants. Antioxidants 4, 603-646 (2015)
22. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005)
23. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959)
24. Claverie, M. et al. Futile Encounter Engineering of the DSR-M Dextransucrase Modifies the Resulting Polymer Length. Biochemistry 58, 2853- 2859 (2019) 25. Jones, A. E., « A spectroscopic study of sunscreens ». Doctoral, Durham University, http://etheses.dur.ac.uk/4261/
26. Conde, F. R. et al. The Photoprotector Mechanism of Mycosporine-like Amino Acids. Excited-State Properties and Photostability of Porphyra-334 in Aqueous Solution. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 56 (2-3), 139-44
(2000)
27. P. Noury. Dosage en microplaque du statut total en substances antioxydantes par la méthode du TEAC. 2016, pp.12. hal-02602438v2
28. Malbert, Y., et al. Extending the Structural Diversity of a-Flavonoid Glycosides with Engineered Glucansucrases. ChemCatChem 6 (8), 2282-91 (2014)
29. Mira, L. M., et al. Measurement of Relative Antioxidant Activity of Compounds: A Methodological Note. Redox Report: Communications in Free Radical Research 4 (1-2): 69-74 (1999)

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Procédé de production d’une mycosporine glucosylée, ledit procédé comprenant une étape a) de glucosylation d’une mycosporine par l’enzyme a- transglucosylase GS-D à partir de saccharose, pour l’obtention d’un produit intermédiaire de glucosylation qui est une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 1 à 2 unités glucosyle.
2) Procédé selon la revendication 1 comprenant en outre une étape b) d’élongation de la partie glucidique du produit intermédiaire de glucosylation obtenu à l’étape a) par au moins une a-transglucosylase GH-70 différente de l’a- transglucosylase GS-D à partir de saccharose, pour l’obtention d’une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000 000 unités glucosyle.
3) Procédé selon la revendication 2, dans lequel les étapes a) et b) sont réalisées de manière concomitante et comprennent la glucosylation d’une mycosporine par l’enzyme a-transglucosylase GS-D et au moins une a- transglucosylase GH-70 différente de l’a-transglucosylase GS-D à partir de saccharose, pour l’obtention d’une mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000 000 unités glucosyle.
4) Procédé selon la revendication 2 ou 3, où ladite au moins une a- transglucosylase de l’étape b) est choisie dans le groupe constituée de : glucane- saccharases GS-A, GS-B, GS-C, GS-F A1 et GS-FS, dextrane-saccharases DSR- M A1 , DSR-M A2 W624A, DSR-G A1 , DSR-S vardel A4N, et DSR-OK A1 , alternane-saccharase ASR A1 .
5) Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, où la mycosporine de l’étape a) est choisie dans le groupe constitué de : mycosporine pure, extrait de lichen Lichina pygmea enrichi en mycosporine de 0 à 10% en poids d’extrait.
6) Procédé selon la revendication 5, où la mycosporine est la mycosporine-sérinol (MSer(OH)).
7) Mycosporine glucosylée obtenue par un procédé selon la revendication 1 , ladite mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 1 à 2 unités glucosyle. 8) Mycosporine glucosylée obtenue selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, ladite mycosporine glucosylée ayant un degré de polymérisation moyen allant de 3 à 1 000 000 unités glucosyle, de préférence de 3 à 800 000 unités glucosyle. 9) Composition cosmétique comprenant à titre de principe actif une mycosporine glucosylée telle que définie dans la revendication 7 ou 8.
10) Mycosporine glucosylée selon la revendication 7 ou 8, pour une utilisation comme médicament.
11 ) Mycosporine glucosylée selon la revendication 7 ou 8, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement de la cataracte, de l’albinisme, du xeroderma pigmentosum, du cancer de la peau.
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