EP4548095A1 - Test fonctionnel pour une determination rapide du statut immunitaire - Google Patents

Test fonctionnel pour une determination rapide du statut immunitaire

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EP4548095A1
EP4548095A1 EP23750644.9A EP23750644A EP4548095A1 EP 4548095 A1 EP4548095 A1 EP 4548095A1 EP 23750644 A EP23750644 A EP 23750644A EP 4548095 A1 EP4548095 A1 EP 4548095A1
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EP
European Patent Office
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stimulation
ifny
whole blood
pha
individual
Prior art date
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Pending
Application number
EP23750644.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Franck BERTHIER
Soizic DANIEL
Sandrine DUCROT
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
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    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
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    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma

Definitions

  • the present invention relates to the assessment and determination of the immune status of an individual. More particularly, it relates to methods and tools dedicated to measuring the overall level of cell-mediated immunity of an individual, and whose operating principle is that of a functional immune test.
  • the invention is advantageously positioned as a valuable aid offered to clinicians in their decision-making.
  • the immune status of an individual corresponds to the functional state of their immune system, that is to say the capacity of their body to be able to defend itself against potentially dangerous agents.
  • These defense and protection mechanisms are deployed mainly against pathogens of infectious origin and exogenous to the body, such as microorganisms - such as viruses, bacteria, fungi and protozoa -. They can also be deployed against endogenous agents, in particular against cells transformed following physical and/or chemical damage (as may be the case for infected cells, cancer cells or senescent cells).
  • the response of the immune system to an attack by a potentially dangerous agent, exogenous or endogenous, is a dynamic phenomenon which, when adapted, ensures the maintenance of the integrity of the organism.
  • a weakened, insufficient or unbalanced immune response exposes the body to a high risk of developing pathologies.
  • a weak or ineffective immune response thus promotes opportunistic infections, the occurrence of sepsis and/or viral reactivations, while an exacerbated immune response can explain the occurrence of allergies, autoimmune diseases (for example, sclerosis plaque, type 1 diabetes, lupus, autoimmune thyroiditis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Goujerot-Sjogren syndrome, Crohn's disease).
  • immunotherapy treatment in particular treatment with CAR-T cells (for “Chimeric Antigenic Receptor-T”) and treatment based on an injection of antibodies called anti-checkpoint antibodies ).
  • TPL lymphocyte proliferation test
  • TTL lymphoblastic transformation test
  • mitogens e.g. lectins such as phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (conA) and Pokeweed mitogen (PWM)
  • PHA phytohemagglutinin
  • conA concanavalin A
  • PWM Pokeweed mitogen
  • HLA-DR for “human leukocyte antigen - D related”
  • HLA-DR for “human leukocyte antigen - D related”
  • the persistence of a low level of monocyte expression of HLA-DR generally indicates a poor chance of survival.
  • the methods for determining the immune status which are qualified as functional immune tests are based on the measurement of cellular activity (involving one or more types of immune cells -lymphocytes, macrophages, monocytes, dendritic cells, granulocytes-) in response to a particular stimulation.
  • the level of immunity studied is either a level of specific immunity, that is to say an immune response specifically deployed and directed against a given target pathogen, or a overall level of immunity that reflects the general state of that individual's immune system.
  • the measurement of said cellular activity consists of an assay of one or more cytokines whose expression is modulated by the stimulation (for example IFNy, TNFa, interleukins.
  • the stimulant(s) used generally take up epitope motifs (protein and/or glycosidic) originating from the targeted pathogen (for example, for an immune status possibly directed against Mycobacterium tuberculosis, all or part of the sequence protein markers like ESAT-6, CFP-10 and TB7.7 are frequently used for stimulation).
  • epitope motifs protein and/or glycosidic
  • the targeted pathogen for example, for an immune status possibly directed against Mycobacterium tuberculosis, all or part of the sequence protein markers like ESAT-6, CFP-10 and TB7.7 are frequently used for stimulation.
  • non-specific stimulants are used.
  • PKA protein kinase A
  • PMA phorbol myristate acetate
  • SEB Staphylococcal Enterotoxin B
  • LPS lipopolysaccharide
  • cytokines such as interleukins IL-1, IL-2 and IL-12.
  • Anti-CD3 (or more rarely anti-CD2) monoclonal antibodies are also used such as OKT-3 with or without anti-CD28.
  • the present invention is more particularly interested in functional immune tests dedicated to determining the overall level of cellular immunity of an individual, as is the case for the ImmuKnow® (Cylex Inc., United States) and QuantiFERON Monitor tests. ® (Qiagen GmbH, Germany), both commercially available.
  • the implementation of the ImmuKnow® test consists of stimulating a sample of whole blood, for 15 to 18 hours and with a mitogen, in this case PHA.
  • the CD4 + T lymphocytes are then purified and then lysed to extract F ATP.
  • the latter is finally measured quantitatively by bioluminescence using a luciferin/luciferase system (Stewart, 2012 - “ImmuKnow as an immune monitoring tool following organ transplantation” - Le courier de la transplantation, 2012, vol. VII n°l).
  • QuantiFERON Monitor® test Douglas et al., 2020 (“The QuantiFERON Monitor® assay is predictive of infection post allogeneic hematopoietic cell transplantation” - Transplant Infectious Disease, 2020, 22(3): 1-9) describes its use for prognostic purposes of the risk of infection in patients who have undergone allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
  • a heparinized whole blood sample is stimulated at 37°C for 16 to 24 hours, using a composition of active ingredients, called QFM LyoSphereTM.
  • This composition contains an R848 reagent and a TLR7 receptor agonist, to stimulate the patient's innate immunity, as well as an anti-CD3 antibody to stimulate their adaptive immunity.
  • the plasma is collected and the interferon gamma (IFNY) content is measured.
  • IFNY interferon gamma
  • the QuantiFERON Monitor® test suffers from a particularly long implementation time; an excessive duration mainly due to the stimulation phase which, alone, requires more than 15-16 hours.
  • the present invention therefore aims to provide a functional immune test capable of allowing a determination, an evaluation of the immune status of a patient in a significantly reduced time compared to the functional immune tests currently available commercially.
  • the present invention aims to propose a method for determining in vitro or ex vivo the immune status of an individual, the implementation of which is intended to be simple, quick and achievable with technical equipment accessible to healthcare centers and medical analysis laboratories.
  • the present invention meets all of the above-mentioned objectives. Before presenting its characteristics and particularities in more detail, the following definitions are given to allow a better understanding.
  • the term “determine/evaluate the immune status” means the fact of giving an indication of the capacity of an individual's organism to be able to implement an immune response in order to defend, protect oneself against potentially dangerous agents. Very similar to “immune status”, we can also use the expression “immunity level” without distinction.
  • the immune status determined/evaluated with the present invention can be reported by means of a value, which can be numerical or categorical, and which results directly or indirectly from a measurement of IFNy produced in response to stimulation carried out in accordance with the present invention.
  • a result given in the form of a numerical value corresponds to a discrete or continuous variable, representative of the level of immunity.
  • a result given in the form of a category value can, for example, associate the immune status of an individual with qualifiers such as “normal”, “low” or “high”. Such an indication results from an interpretation/extrapolation based on the level of IFNy production measured after stimulation and/or a comparison of this level with one or more reference IFNy expression levels.
  • whole blood sample is meant a venous blood sample, obtained from a sample taken from an individual/patient and essentially consisting of erythrocytes, leukocytes, platelets and plasma.
  • an anticoagulant an optional dilution and/or possible storage between 2°C and 8°C, the whole blood sample directly subjected to the process of the invention has not undergone any other treatment, in particular no prior treatment likely to significantly modify its composition (in terms of constituents and proportions between the constituents).
  • evaluating the level of IFNy production in this case the production induced by a stimulation carried out in accordance with the present invention, we do not necessarily mean the fact of measuring with more or less precision the quantity of IFNy which is actually and specifically produced/secreted in response to stimulation.
  • Such an evaluation can in fact consist of a reasoned estimate of indicators/parameters such as: - the total concentration/quantity of IFNy found in the reaction mixture [whole blood -stimulation solution], or in a subfraction of this mixture;
  • the term “individual” designates a human being, whatever their state of health.
  • a “healthy individual” within the meaning of the present invention is an individual who apparently does not present any disturbance in the immune system.
  • the term "patient” designates an individual in contact with a health professional - such as a doctor (for example, a general practitioner) - and/or a medical structure (for example, the emergency or intensive care unit). a hospital, or an intensive care unit) or even a medical analysis laboratory.
  • the present invention therefore relates to a method for determining the immune status of an individual; which includes the following steps:
  • PHA phytohemagglutinin
  • the stimulation duration does not exceed 8 hours and, preferably, it does not exceed 6 hours.
  • stimulation of whole blood with PHA causes a cell-mediated immune reaction resulting in IFNy production; 3 to 4 hours of stimulation are enough to induce IFNy production that is sufficiently intense to be able to be quantified, including by assay methods and equipment easily accessible to healthcare centers and medical analysis laboratories; 2) PHA stimulation, even of short duration, 3 to 4 hours, induces IFNy production which varies depending on the functional state of the individuals' immune system;
  • the production of IFNy induced by PHA is sufficiently sensitive to variations in the functional state of the immune system so that the difference between two particular functional states results in a difference in the production of IFNy, easily measurable including by the technical means commonly made available to healthcare centers and medical analysis laboratories.
  • the production of IFNy in response to stimulation of whole blood by PHA thus appears to be a parameter of choice for the development of a system for stratifying the overall state of the immune system of individuals.
  • the method for determining the immune status according to the invention advantageously makes it possible to distinguish the immune status of immunodeficient individuals from that of healthy patients. It also makes it possible to distinguish different levels of immunocompetence in healthy individuals, and different levels of immunodeficiency in immunocompromised patients.
  • the biological sample tested is a whole blood sample. Unlike other blood fractions, this contains all leukocytes, erythrocytes, platelets and plasma.
  • cells that can be stimulated by PHA and cells expressing IFNy in response to stimulation by PHA benefit from a relatively well preserved cellular and biochemical environment, and in which the physiological interactions between the different cell populations involved in the immune response remain possible.
  • the method for determining the immune status according to the invention thus advantageously takes into account all the complexity of the intra- and intercellular mechanisms of the cell-mediated immune response, and also applies to individuals/patients under the influence of a medicinal or environmental active with immunomodulatory effects.
  • the whole blood sample is venous blood, collected by venous route.
  • it prior to the implementation of the process according to the invention, it has not undergone any treatment other than the possible addition of an anticoagulant and/or dilution.
  • the whole blood sample was treated with an anticoagulant, preferably just after its collection.
  • the whole blood sample has been heparinized (treated for example with lithium heparin).
  • the whole blood sample is subjected to a stimulation/incubation step with phytohemagglutinin (PHA), a lectin synthesized by plants and particularly known for its mitogenic action on T lymphocytes.
  • PHA phytohemagglutinin
  • the stimulation/incubation step (equivalently, we can also speak of the incubation step) is implemented with phytohemagglutinin P (PHA-P).
  • PHA-P phytohemagglutinin P
  • the stimulation/incubation step is carried out with PHA, in particular with PHA-P, in a quantity at least equal to 20 pg per mL of whole blood.
  • the quantity of PHA, in particular PHA-P is of the order of 40 pg per mL of whole blood.
  • the stimulation/incubation step is carried out at a temperature between 35°C and 39°C.
  • this temperature is 37°C.
  • the duration of the stimulation/incubation stage this is at least equal to 3 hours and does not exceed 8 hours. Preferably, it is between 3:30 and 6 hours. Even more preferably, the minimum stimulation/incubation duration is 3h30.
  • the level of IFNy production induced by PHA stimulation is evaluated by measuring the IFNy present in the reaction mixture, the latter being composed of the whole blood sample to which the PHA has been added - for example in the form of a PHA solution -.
  • the level of IFNy production induced by PHA stimulation is evaluated by measuring the IFNy present in the liquid fraction of the mixture. reaction. To do this, once the stimulation/incubation step is completed, the liquid fraction is recovered from the reaction mixture, possibly after a decantation or centrifugation step.
  • the level of FNy production induced by the stimulation is evaluated by carrying out an IFNy assay using an immunoassay technique (or immunoassay).
  • Immunoassay methods are widely known to those skilled in the art. It may for example be an enzyme immunoassay type (or EIA test, for “Enzyme Immunoassay”), that is to say an immunoassay test in which the interaction between binding partner and the target analyte is revealed by the hydrolysis of a substrate (an enzyme-catalyzed hydrolysis), and the release of an easily detectable and measurable lysis product. The detection and measurement of the lysis product thus takes into account the presence and concentration of the target analyte in the tested sample.
  • EIA test enzyme-catalyzed hydrolysis
  • enzymatic hydrolysis releases a colorimetric lysis product (we then speak of an ELISA test, for “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”), fluorescent (ELF A test, for “Enzyme Linked Fluorescent Assay”) or chemiluminescent (CLIA test, for “Chemiluminescence Immuno Assays”), detectable and easy to measure intensity.
  • ELISA test for “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”
  • fluorescent for “Enzyme Linked Fluorescent Assay”
  • CLIA test chemiluminescent Immuno Assays
  • the production of IFNy is evaluated by measuring the IFNy using an ELFA test.
  • immunoassay and “immunoassay” are to be understood in the broad sense. They do not refer strictly and only to techniques for detecting and/or quantifying a target analyte, the operating principle of which is based on antigen-antibody recognition and coupling which, therefore, requires the 'use of tools of immune nature or origin, such as antibodies or antibody fragments (fragments of the Fab, Fab', F(ab')2, scFv ("Single chain fragment variable”) and dsFv ( “Double-stranded fragment variable”).
  • binding partners for the implementation of an IFNy immunoassay within the meaning of the present invention, the following can be cited:
  • - binding partners of immunological nature or origin such as anti-IFNy antibodies (monoclonal or polyclonal), or fragments of these antibodies (such as Fab fragments, Fab', F(ab')2, scFv chains (“Single chain fragment variable”) and dsFv (“Doublestranded fragment variable”));
  • F IFNy receptor without immunological origin
  • F IFNy receptor or a fragment of this receptor capable of recognizing and fixing F IFNy, or even oligonucleotides, nanofitins, aptamers, DARPins (for “Designed Ankyrin Repeat ProteINS ”) or any other synthetic molecule which could recognize and bind to F IFNy.
  • oligonucleotides nanofitins, aptamers, DARPins (for “Designed Ankyrin Repeat ProteINS ”) or any other synthetic molecule which could recognize and bind to F IFNy.
  • DARPins for “Designed Ankyrin Repeat ProteINS ”
  • the production of IFNy induced by stimulation is evaluated by means of an immunoassay method. This can be quantitative or semi-quantitative.
  • Non-limiting examples of immodosing instruments suitable for the implementation of the present invention include the instruments of the VIDAS® range (bioMérieux, France), the Simoa® HD-1 (Quanterix, United States), the Cobas ® or Elecsys® (Roche Diagnostic, Switzerland), LIAISON® (DiaSorin, Italy), Architect® (Abbott, United States), Access 2 (Beckman Coulter, United States), ClarityTM (Singulex, United States) and Vitros® (Johnson & Johnson, United States).
  • the method for determining the immune status comprises an additional step of rendering the result, by which said result is delivered in the form of an indication chosen from:
  • At least one discrete numerical value reflecting the level of immunity of the individual/patient tested said at least one numerical value corresponding to:
  • the method according to the invention thus provides an indication as to the evolution over time of the immune status of said individual/patient, and/or as to the impact of a possible treatment on their immune system;
  • the method according to the invention thus provides an indication as to the possible membership of said individual/patient to the reference population and/or its immune positioning in relation to this reference population.
  • the method according to the invention finds numerous important clinical applications. Also, according to another aspect, the present invention relates to the use of a method for determining the immune status of an individual/patient according to the invention, for at least one of the following particular and specific applications:
  • EXAMPLE 1 Stimulation of whole blood from healthy donors and patients undergoing chemotherapy.
  • a first batch comes from 27 healthy, adult individuals who do not a priori present any symptoms of immunodeficiency.
  • the samples from this first batch were collected by the French Blood Establishments (EFS).
  • a second batch of blood samples came from 16 patients undergoing chemotherapy. These samples were collected in a hospital environment. Each of the whole blood samples was collected in sterile Vacutainer® tubes (Becton-Dickinson) containing lithium heparin, then stored in a vertical position and at 2-8°C while awaiting implementation of the blood method. 'invention.
  • 300 pL of a PBS buffer (without PHA-P) is added to 300 pL of whole blood.
  • reaction mixtures are then incubated for 3h30 at a temperature of 37°C, with controlled evaporation.
  • the stimulation/incubation step is undertaken here using an immunoassay instrument, the VIDAS® 3.
  • the dosage part of a VIDAS® TB-IGRA kit operating according to the principle of an ELFA test, is used.
  • the VIDAS® IFNY RUO kit can be used for the same purpose.
  • Table 1 Dosage of IFNy without and after stimulation with PHA-P, on whole blood from healthy donors and patients undergoing chemotherapy.
  • FIG. 1 presents these same results of the IFNy assays, in graphic and statistical form.
  • EXAMPLE 2 Stimulation of whole blood from healthy donors and patients with liver transplants.
  • the whole blood samples used in this example come from a cohort of volunteers enrolled in the EdMonHG clinical study (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03995537), including:
  • the IFNy present in the reaction medium is assayed following the same assay protocol as previously described.
  • Table 2 Dosage of T IFNy without and after stimulation with PHA-P, on whole blood from healthy donors and patients who have undergone a liver transplant.
  • Figure 2 shows these same IFNy dosage results, in graphic and statistical form.
  • EXAMPLE 3 Stimulation of whole blood from healthy donors and patients after septic shock
  • the whole blood samples used in this example come from 11 healthy volunteers and 22 patients admitted to intensive care at the Edouard Herriot Hospital in Lyon (France), after septic shock.
  • the IFNy present in the reaction medium is assayed following the same assay protocol as previously described.
  • Table 3 Dosage of T IFNy without and after stimulation with PHA-P, on whole blood from healthy donors and patients followed after septic shock.
  • Figure 3 shows all of these IFNy dosage results, in graphical and statistical form.
  • Figure 4 shows these results of IFNy dosages after stimulation, in graphic and statistical form, differentiating the data associated with patients alive (sp) during the follow-up week, from those associated with patients who died (dp) during this period. follow-up or shortly thereafter.

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Abstract

La présente invention porte sur un procédé permettant une détermination rapide du statut immunitaire d'un individu. Pour ce faire, ledit procédé comprend les étapes suivantes : disposer d'un volume d'échantillon de sang total provenant dudit individu; stimuler ledit échantillon de sang total en l'incubant avec une quantité de phytohémagglutinine (PHA), à une température comprise entre 35°C et 39°C, pendant une durée minimale de 3h00-3h30; évaluer le niveau de production d'ZFNy induite par cette incubation/ stimulation; ledit niveau ainsi évalué donne une indication quant au statut immunitaire dudit individu.

Description

TEST FONCTIONNEL POUR UNE DETERMINATION RAPIDE
DU STATUT IMMUNITAIRE
La présente invention concerne l’évaluation et la détermination du statut immunitaire d'un individu. Plus particulièrement, elle a trait aux méthodes et outils dédiés à la mesure du niveau global d’immunité à médiation cellulaire d’un individu, et dont le principe de fonctionnement est celui d’un test immunitaire fonctionnel.
En proposant une méthode et des outils cliniques aptes à permettre une évaluation fiable et rapide du statut immunitaire d’un patient et/ou le diagnostic d’un éventuel dysfonctionnement ou déséquilibre dans sa réponse immunitaire (déficit ou hyperactivité immunitaire), l’invention se positionne avantageusement comme une aide précieuse proposée aux cliniciens dans leurs prises de décision.
Le statut immunitaire d’un individu correspond à l’état fonctionnel de son système immunitaire, c’est-à-dire à la capacité qu’a son organisme de pouvoir se défendre contre des agents potentiellement dangereux. Ces mécanismes de défense et de protection sont déployés principalement contre des pathogènes d’origine infectieuse et exogène à l’organisme, comme les microorganismes -tels que virus, bactéries, champignons et protozoaires-. Ils peuvent être déployés également contre des agents endogènes, notamment contre des cellules transformées suite à des dommages physiques et/ou chimiques (comme cela peut être le cas pour des cellules infectées, des cellules cancéreuses ou des cellules sénescentes).
La réponse du système immunitaire à une agression par un agent potentiellement dangereux, exogène ou endogène, est un phénomène dynamique qui, lorsqu’elle est adaptée, permet d’assurer le maintien de l’intégrité de l’organisme. A l’inverse, une réponse immunitaire affaiblie, insuffisante ou déséquilibrée expose l’organisme à un risque élevé de développer des pathologies. Une réponse immunitaire faible ou inefficace favorise ainsi les infections opportunistes, la survenue d’un sepsis et/ou les réactivations virales, alors qu’une réponse immunitaire exacerbée peut expliquer la survenue d’allergies, de maladies auto-immunes (par exemple, sclérose en plaques, diabète de type 1, lupus, thyroïdites auto-immunes, polyarthrite rhumatoïde, spondylarthrite ankylosante, syndrome de Goujerot- Sjôgren, maladie de Crohn).
Pouvoir déterminer le statut immunitaire d’un patient et/ou surveiller l’évolution de son statut immunitaire revêtent par conséquent un enjeu clinique majeur. A cet égard, de nombreux exemples d’utilités cliniques peuvent être cités, en particulier : - l’identification de patients avec un éventuel déficit immunitaire (chronique ou aiguë, acquis ou provoqué) et, le cas échéant, pouvoir :
- dispenser des soins et un encadrement médical adaptés ; et/ou
- prévenir une intolérance à des vaccins vivants atténués, à des médicaments contre-indiqués en cas d’immunodéficience ;
- le suivi de l’évolution du statut immunitaire de patients placés sous thérapie immunosuppressive -par exemple, des candidats à une greffe d’organe solide, des patients nouvellement greffés- ; cela permettrait d’adapter au mieux la posologie des immunosuppresseurs utilisés aux fins d’instaurer un niveau d’immunité estimé comme approprié pour prévenir le risque de rejet de greffe, tout en minimisant le risque d’infection, de réactivation de virus oncogènes et d’inhiber l’immunité antitumorale des patients ;
- le suivi de la reconstitution du système immunitaire de patients après une thérapie immunosuppressive, en vue de s’assurer du bon déroulement ;
- le suivi de l’impact d’une chimiothérapie sur le statut immunitaire d’un patient, et permettre un éventuel réajustement ou changement dans la thérapie ; ou encore
- la prise en charge et le suivi de patients recevant un traitement d’immunothérapie (notamment du type traitement par cellules CAR-T (pour « Chimeric Antigenic Receptor-T ») et traitement basé sur une injection d’anticorps dits anticorps anti-checkpoints).
Pouvoir déterminer le statut immunitaire d’un individu et pouvoir en suivre l’évolution présente également un grand intérêt pour l’industrie pharmaceutique et la recherche fondamentale sur la santé humaine. A cet égard, de nombreux exemples d’applications peuvent être cités, en particulier :
- dans le cadre du développement d’un médicament où il convient d’évaluer son impact sur le système immunitaire ;
- dans le cadre du développement d’un vaccin, par exemple pour en apprécier ses effets sur une éventuelle polarisation de la réponse immunitaire, vers une réponse de type Thl et/ou Th2 ; ou encore
- pour apprécier l’impact éventuel d’une pathologie, d’un facteur environnemental sur le système immunitaire d’un individu.
Parmi les méthodes connues à ce jour comme étant aptes à pouvoir déterminer et/ou évaluer le statut immunitaire d’un individu, nous pouvons citer en premier lieu, le test de prolifération lymphocytaire (TPL) et le test de transformation lymphoblastique (TTL), lesquels visent à quantifier la prolifération des lymphocytes suite à une stimulation par des mitogènes (par exemple des lectines telles que la phytohémagglutinine (PHA), la concanavaline A (conA) et le Pokeweed mitogène (PWM)) ou par des antigènes spécifiques d’un pathogène. La mise en œuvre de ces tests est particulièrement longue. En particulier, après avoir été isolées, les cellules mononucléées doivent être placées sous stimulation, pendant 3 à 7 jours. Les cellules sont ensuite récupérées et la réplication de l’ADN ou la division cellulaire est mesurée par cytométrie en flux, grâce à l’incorporation de traceurs.
De mise en œuvre bien plus rapide, le dosage de HLA-DR par cytométrie en flux permet de mesurer l’expression de HLA-DR (pour « human leucocyte antigen - D related ») à la surface des monocytes ; une faible expression de ce marqueur est le signe d’une défaillance du système immunitaire. Egalement, chez des patients en choc septique, la persistance d’un faible taux d’expression monocytaire de HLA-DR est généralement le présage de faibles chances de survie.
Parce que pour l’heure, cette méthode de dosage de HLA-DR ne peut se faire que par cytométrie en flux et rares sont les centres de soins et les laboratoires d’analyses médicales pouvant disposer d’un équipement approprié, une telle méthode de détermination du statut immunitaire est davantage adaptée à des études observationnelles, à des travaux de recherche exploratoire, qu’à une utilisation en diagnostic pour une finalité clinique. Qui plus est, elle s’avère lourde et délicate à mettre en œuvre, et reste très compliquée à standardiser/normaliser ; la température et la durée de conservation des cellules avant leur marquage, ainsi que la lyse des globules rouges, sont autant de facteurs ayant un fort impact sur la variabilité des mesures et qu’il convient donc de contrôler finement (Fink et al., 2003 - « Standardisation de la mesure de l ’antigène HLA-DR monocytaire par cytométrie en flux : résultat préliminaire et application dans le suivi des chocs septiques » - Ann. Biol. Clin., 2003, 61 : 441-448).
Nécessitant un équipement plus accessible et bénéficiant d’une mise en œuvre moins contraignante, les méthodes de détermination du statut immunitaire qui sont qualifiées de tests immunitaires fonctionnels (ou IFA, acronyme anglo-saxon pour « Immune Functional assays »), se basent sur la mesure d’une activité cellulaire (impliquant un ou plusieurs types de cellules immunitaires -lymphocytes, macrophages, monocytes, cellules dendritiques, granulocytes-) en réponse à une stimulation particulière. Selon la nature du ou des stimulants utilisés à cet effet, le niveau d’immunité étudié est soit un niveau d’immunité spécifique, c’est- à-dire une réponse immunitaire spécifiquement déployée et dirigée contre un pathogène-cible donné, soit un niveau global d’immunité qui reflète l’état général du système immunitaire de cet individu. Dans les deux cas, la mesure de ladite activité cellulaire consiste en un dosage d’une ou de plusieurs cytokines dont l’expression se trouve modulée par la stimulation (par exemple IFNy, TNFa, les interleukines. .
Pour déterminer un niveau d’immunité spécifique, le ou les stimulants utilisés reprennent généralement des motifs épitopiques (protéiques et/ou glycosidiques) provenant du pathogène ciblé (par exemple, pour un statut immunitaire éventuellement dirigé contre Mycobacterium tuberculosis, tout ou partie de la séquence protéique de marqueurs comme ESAT-6, CFP-10 et TB7.7 est fréquemment utilisé pour la stimulation). Pour la détermination d’un niveau global d’immunité, un ou plusieurs stimulants dits non-spécifiques sont utilisés. On peut citer à titre d’exemples, la protéine kinase A (PKA), le phorbol myristate acétate (phorbol-12-myristate-13-acetate ou PMA), la PHA, la conA, la Staphylococcal Entérotoxine B (SEB) ou encore le lipopolysaccharide (LPS), mais également des cytokines comme les interleukines IL-1, IL-2 et IL- 12. Des anticorps monoclonaux anti-CD3 (ou plus rarement anti- CD2) sont aussi utilisés tels que OKT-3 avec ou sans anti-CD28.
La présente invention s’intéresse plus spécialement aux tests immunitaires fonctionnels dédiés à la détermination du niveau global d’immunité cellulaire d’un individu, comme cela est le cas pour les tests ImmuKnow® (Cylex Inc., Etat-Unis) et QuantiFERON Monitor® (Qiagen GmbH, Allemagne), tous deux disponibles dans le commerce.
Le test ImmuKnow®, proposé pour le suivi immunologique de patients placés sous immunosuppresseurs après une transplantation d’organe, a pour vocation d’identifier les situations de sous- et de surdosage. Le principe de ce test repose sur un dosage d’ATP (adénosine triphosphate) intracellulaire synthétisée par les lymphocytes T CD4+ stimulés. Ce niveau d’ATP intracellulaire ainsi dosé est censé être corrélé à l’activité globale lymphocytaire du patient. Un niveau d’activité identifié comme faible révèle ainsi un surdosage d’immunosuppresseur et un risque d’infection pour le patient, alors qu’un niveau d’activité identifié comme élevé est signe d’un sous-dosage d’immunosuppresseur et un risque de rejet de greffe.
La mise en œuvre du test ImmuKnow® consiste à stimuler un échantillon de sang total, pendant 15 à 18 heures et avec un mitogène, en l’occurrence de la PHA. Les lymphocytes T CD4+ sont ensuite purifiés puis lysés pour en extraire F ATP. Ce dernier est finalement mesuré quantitativement par bioluminescence en utilisant un système luciférine/luciférase (Stewart, 2012 - « ImmuKnow as an immune monitoring tool following organ transplantation » - Le courrier de la transplantation, 2012, vol. VII n°l).
S’agissant du test QuantiFERON Monitor®, Douglas et al., 2020 (« The QuantiFERON Monitor® assay is predictive of infection post allogeneic hematopoietic cell transplantation » - Transplant Infectious Disease, 2020, 22(3): 1-9) décrit son utilisation à des fins de pronostic du risque d’infection chez des patients ayant subi une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques. Pour ce faire, un échantillon de sang total hépariné est stimulé à 37°C pendant 16 à 24 heures, en utilisant une composition d’actifs, appelée QFM LyoSphere™. Cette composition renferme un réactif R848 et un agoniste du récepteur TLR7, pour stimuler l’immunité innée du patient, ainsi qu’un anticorps anti-CD3 pour stimuler son immunité adaptative. Au terme de ces 16 à 24 heures de stimulation, le plasma est récupéré et la teneur en interféron gamma (IFNY) est mesurée. Cette dernière donne une indication quant au statut immunitaire du patient, en l’occurrence une indication sur son niveau global d’immunité à médiation cellulaire. Ce test prend en compte cumulativement les composantes de l’immunité innée et de l’immunité adaptative.
A l’instar du test ImmuKnow®, le test QuantiFERON Monitor® souffre d’une mise en œuvre particulièrement longue ; une durée excessive tenant essentiellement à la phase de stimulation qui, à elle seule, requiert plus de 15-16 heures.
Parce que les patients immunodéficients ont souvent besoin d’une prise en charge clinique et/ou thérapeutique particulière pour pouvoir faire face à leur susceptibilité élevée aux infections, le dépistage d’une immunodéficience peut revêtir un caractère d’urgence dans bien de situations cliniques, par exemple :
- lors de leur admission dans un centre de soin,
- avant une chirurgie,
- avant la prescription de médicaments/traitements contre-indiqués aux patients immunodéprimés,
- dans le cas d’un état septique, où une surveillance particulièrement soutenue et étroite est requise,
- le besoin est ainsi bien réel pour les cliniciens de pouvoir disposer d’un test diagnostic/pronostic d’un état d’immunodéficience, bénéficiant d’une mise en œuvre rapide et capable de rendre un résultat en un temps le plus court possible.
La présente invention a ainsi pour objet de proposer un test immunitaire fonctionnel apte à permettre une détermination, une évaluation du statut immunitaire d’un patient en un temps significativement réduit en comparaison aux tests immunitaires fonctionnels actuellement disponibles dans le commerce.
De manière plus générale, la présente invention a pour objectif de proposer un procédé de détermination in vitro ou ex vivo du statut immunitaire d’un individu dont la mise en œuvre se veut simple, rapide et réalisable avec un équipement technique accessible aux centres de soins et aux laboratoires d’analyses médicales.
La présente invention répond à l’ensemble des objectifs sus-évoqués. Avant d’en présenter plus précisément les caractéristiques et particularités, les définitions suivantes sont données pour en permettre une meilleure compréhension.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « déterminer/évaluer le statut immunitaire » le fait de donner une indication sur la capacité qu’à l'organisme d’un individu à pouvoir mettre en œuvre une réponse immunitaire en vue de se défendre, se protéger contre des agents potentiellement dangereux. De façon très similaire à « statut immunitaire», on pourra utiliser également et indifféremment l’expression « niveau d’immunité ».
Le statut immunitaire déterminé/évalué avec la présente invention peut être rapporté au moyen d’une valeur, qui peut être numérique ou de catégorie, et qui résulte directement ou indirectement d’une mesure d’IFNy produite en réponse à une stimulation réalisée conformément à la présente invention. Un résultat donné sous la forme d’une valeur numérique correspond alors à une variable discrète ou continue, représentative du niveau d’immunité. Un résultat donné sous la forme d’une valeur de catégorie peut par exemple associer le statut immunitaire d’un individu à des qualificatifs tels que « normal », « faible » ou « élevé ». Une telle indication résulte d’une interprétation/extrapolation basée sur le niveau de production d’IFNy mesuré après stimulation et/ou d’une comparaison de ce niveau avec un ou plusieurs niveaux d’expression d’IFNy de référence.
Par « échantillon de sang total », on entend un échantillon sanguin veineux, obtenu d’un prélèvement réalisé sur un individu/patient et essentiellement constitué d'érythrocytes, de leucocytes, de plaquettes et de plasma. Hormis l’ajout éventuel d’un anticoagulant, une optionnelle dilution et/ou une possible conservation entre 2°C et 8°C, l’échantillon de sang total directement soumis au procédé de l’invention n’a subi aucun autre traitement, en particulier aucun traitement préalable susceptible d’en modifier notablement la composition (en termes de constituants et de proportions entre les constituants).
Par « évaluer le niveau de production d’IFNy », en l’occurrence la production induite par une stimulation réalisée conformément à la présente invention, on n’entend pas nécessairement le fait de mesurer avec plus ou moins de précision la quantité d’IFNy qui est effectivement et spécifiquement produite/sécrétée en réponse à la stimulation. Une telle évaluation peut en effet consister en une estimation raisonnée d’indicateurs/paramètres tels que : - la concentration/quantité totale d’IFNy retrouvé dans le mélange réactionnel [sang total -solution de stimulation], ou dans une sous-fraction de ce mélange ;
- la quantité d’ARNm transcrit en réponse à la stimulation de l’IFNy, et qui, à quelques facteurs et/ou approximations près, rendent valablement compte de la production d’IFNy ainsi étudiée.
Enfin, le terme « individu » désigne un être humain, quel que soit son état de santé. Un « individu sain » au sens de la présente invention est un individu qui ne présente apparemment pas de dérèglement du système immunitaire. Le terme « patient » désigne un individu en contact avec un professionnel de la santé - tel qu'un médecin (par exemple, un médecin généraliste)- et/ou une structure médicale (par exemple, le service des urgences ou de réanimation d'un hôpital, ou une unité de soins intensifs) ou encore un laboratoire d’analyses médicales.
La présente invention concerne donc un procédé pour déterminer le statut immunitaire d’un individu ; lequel comprend les étapes suivantes :
- disposer d’un volume d’échantillon de sang total provenant dudit individu ;
- stimuler ledit échantillon de sang total en l’incubant avec une quantité de phytohémagglutinine (PHA), à une température comprise entre 35°C et 39°C, pendant une durée minimale de 3 heures, par exemple pendant une durée de 3 heures à 8 heures ;
- évaluer le niveau de production d’IFNy induite ; ledit niveau ainsi évalué donne une indication quant au statut immunitaire dudit individu.
Selon la un mode de réalisation particulier, la durée de stimulation n’excède pas 8 heures et, de préférence, elle n’excède pas 6 heures.
Les inventeurs ont ainsi mis au point un test immunitaire fonctionnel fiable pouvant rendre un résultat en un temps particulièrement court. En effet et contre toute attente, ceux-ci sont parvenus à réduire significativement la durée de l’étape de stimulation. Tout ceci a été rendu possible essentiellement grâce aux constats et démonstrations suivants :
1) la stimulation du sang total par de la PHA provoque une réaction de l’immunité à médiation cellulaire se traduisant par une production d’IFNy ; 3 à 4 heures de stimulation suffisent pour induire une production d’IFNy suffisamment intense pour pouvoir être quantifiée et ce, y compris par des méthodes et un équipement de dosage facilement accessibles aux centres de soins et aux laboratoires d’analyses médicales ; 2) une stimulation à la PHA, même de courte durée, de 3 à 4 heures, induit une production d’IFNy qui varie selon l’état fonctionnel du système immunitaire des individus ;
3) la production d’IFNy induite par la PHA est suffisamment sensible aux variations de l’état fonctionnel du système immunitaire pour que la différence entre deux états fonctionnels particuliers se traduise par une différence dans la production d’IFNy, facilement mesurable y compris par les moyens techniques couramment mis à la disposition des centres de soins et des laboratoires d’analyses médicales.
La production d’IFNy en réponse à une stimulation de sang total par la PHA apparait ainsi comme un paramètre de choix pour l’élaboration d’un système de stratification de l’état global du système immunitaire des individus. Le procédé de détermination du statut immunitaire selon l’invention permet avantageusement de distinguer le statut immunitaire d’individus immunodéficients de celui de patients sains. Il permet aussi de distinguer différents niveaux d’immunocompétence chez des individus sains, et différents niveaux d’immunodéficience chez des patients immunodéprimés.
Selon l’invention, l’échantillon biologique testé est un échantillon de sang total. A la différence d’autres fractions sanguines, celui-ci renferme l’ensemble des leucocytes, érythrocytes, plaquettes et le plasma. De ce fait, les cellules stimulables par la PHA et les cellules exprimant l’IFNy en réponse à une stimulation par la PHA, bénéficient d’un environnement cellulaire et biochimique relativement bien préservé, et dans lequel les interactions physiologiques entre les différentes populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire restent possibles. Le procédé de détermination du statut immunitaire selon l’invention tient ainsi avantageusement compte de toute la complexité des mécanismes intra- et intercellulaire de la réponse immunitaire à médiation cellulaire, et s’applique aussi à des individus/patients sous l’influence d’un actif médicamenteux ou environnemental aux effets immunomodulateurs.
Avantageusement et selon l’invention, l’échantillon de sang total est du sang veineux, collecté par voie veineuse. Selon l’invention, préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l’invention, celui-ci n’a subi aucun traitement autre que l’addition éventuelle d’un anticoagulant et/ou qu’une dilution.
Selon l’invention, l’échantillon de sang total est soumis à l’étape de stimulation (de façon équivalente, on pourra aussi parler d’étape d’incubation ou d’étape de stimulation/incubation) dans les 32 heures qui suivent le prélèvement. Après son prélèvement et jusqu’à la mise en œuvre du procédé de l’invention, l’échantillon de sang total est conservé entre 2°C et 8°C.
Avantageusement et selon l’invention, l’échantillon de sang total a été traité avec un anticoagulant, de préférence juste après son prélèvement.
Avantageusement et selon l’invention, l’échantillon de sang total a été hépariné (traité par exemple à l’héparine de lithium).
Selon l’invention, l’échantillon de sang total est soumis à une étape de stimulation/incubation par de la phytohémagglutinine (PHA), une lectine synthétisée par les plantes et particulièrement connue pour son action mitogène sur les lymphocytes T.
Avantageusement et selon l’invention, l’étape de stimulation/incubation (de façon équivalente, on peut aussi parler d’étape d’incubation) est mise en œuvre avec de la phytohémagglutinine P (PHA-P).
Avantageusement et selon l’invention, l’étape de stimulation/incubation est réalisée avec de la PHA, en particulier avec de la PHA-P, en quantité au moins égale à 20 pg par mL de sang total. Selon un mode de réalisation préféré, la quantité de PHA, en particulier de PHA-P, est de l’ordre de 40 pg par mL de sang total.
Egalement et selon l’invention, l’étape de stimulation/incubation est effectuée à une température comprise entre 35°C et 39°C. Avantageusement et selon l’invention, cette température est de 37°C.
S’agissant de la durée de l’étape de stimulation/incubation, celle-ci est au moins égale à 3 heures et ne dépasse pas 8 heures. De préférence, elle est comprise entre 3h30 et 6 heures. De manière encore plus préférée, la durée de stimulation/incubation minimale est de 3h30.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le niveau de production d’IFNy induite par la stimulation à la PHA, est évalué en dosant l’IFNy présent dans le mélange réactionnel, ce dernier étant composé de l’échantillon de sang total auquel de la PHA a été ajoutée -par exemple sous la forme d’une solution de PHA-.
Selon une variante de réalisation, le niveau de production d’IFNy induite par la stimulation à la PHA, est évalué en dosant l’IFNy présent dans la fraction liquide du mélange réactionnel. Pour ce faire, une fois l’étape de stimulation/incubation achevée, la fraction liquide est récupérée à partir du mélange réactionnel, éventuellement après une étape de décantation ou de centrifugation.
Selon un mode de réalisation préféré, le niveau de production d’FNy induite par la stimulation est évalué en effectuant un dosage d’IFNy par une technique d’immunodosage (ou immunoessai).
Les méthodes d’immunodosage sont largement connues de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un dosage du type immuno-enzymatique (ou test EIA, pour « Enzyme Immunoassay »), c’est-à-dire un test d’immunodosage dans lequel l’interaction entre partenaire de liaison et l’analyte-cible est révélée par l’hydrolyse d’un substrat (une hydrolyse catalysée par une enzyme), et la libération d’un produit de lyse facilement détectable et mesurable. La détection et la mesure du produit de lyse rendent ainsi compte de la présence et de la concentration de l’analyte-cible dans l’échantillon testé.
Selon nature du substrat enzymatique choisi pour mettre en œuvre le dosage, l’hydrolyse enzymatique libère un produit de lyse colorimétrique (on parle alors de test ELISA, pour « Enzyme-Linked Immunosorbent Assay »), fluorescent (test ELF A, pour « Enzyme Linked Fluorescent Assay ») ou chimiluminescent (test CLIA, pour « Chemiluminescence Immuno Assays »), détectable et d’intensité facile à mesurer.
Avantageusement et selon l’invention, la production d’IFNy est évaluée en dosant l’IFNy au moyen d’un test ELFA.
Dans ce contexte particulier et au sens de la présente description, les termes « immunodosage » et « immunoessai » sont à comprendre au sens large. Ils ne font pas référence stricto sensu et uniquement à des techniques de détection et/ou de quantification d’un analyte-cible, dont le principe de fonctionnement est basé sur une reconnaissance et un couplage antigène-anticorps qui, de ce fait, nécessite l’emploi d’outils de nature ou d’origine immunitaire, comme les anticorps ou les fragments d’anticorps (fragments du type Fab, Fab', F(ab')2, scFv (« Single chain fragment variable ») et dsFv (« Double-stranded fragment variable »)). Ils font plus généralement référence à des techniques de détection et/ou de quantification d’un analyte- cible, dans lesquels des anticorps ou tout autre composé fonctionnellement analogue, non nécessairement de nature ou d’origine immunitaire, peuvent être utilisés comme partenaires de liaison dans un processus de reconnaissance et de couplage à l’analyte-cible (ou ligand). A cet égard, à titre d’exemples de partenaire de liaison pour la mise en œuvre d’un immunodosage d’IFNy au sens de la présente invention, on peut citer :
- les partenaires de liaison de nature ou d’origine immunologique, tels que des anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) anti-IFNy, ou des fragments de ces anticorps (tels que fragments Fab, Fab', F(ab')2, chaînes scFv (« Single chain fragment variable ») et dsFv (« Doublestranded fragment variable »)) ;
- les partenaires de liaison sans provenance immunologique tels que le récepteur de F IFNy ou un fragment de ce récepteur apte à reconnaître et à fixer F IFNy, ou encore des oligonucléotides, des nanofitines, des aptamères, des DARPins (pour « Designed Ankyrin Repeat ProteINS ») ou toute autre molécule de synthèse qui pourrait reconnaître et se lier à F IFNy.
Ainsi, avantageusement et selon l’invention, la production d’IFNy induite par la stimulation est évaluée au moyen d’une méthode d’ immunodosage. Celle-ci peut être quantitative ou semi-quantitative.
Des exemples non limitatifs d’instruments d’immodosage adaptés pour la mise en œuvre de la présente invention comprennent les instruments de la gamme VIDAS® (bioMérieux, France), le Simoa® HD-1 (Quanterix, Etat-Unis), le Cobas® ou l’Elecsys® (Roche Diagnostic, Suisse), le LIAISON® (DiaSorin, Italie), l’Architect® (Abbott, Etats-Unis), l’Access 2 (Beckman Coulter, Etats-Unis), le Clarity™ (Singulex, Etats-Unis) et le Vitros® (Johnson & Johnson, Etats-Unis).
Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l’invention, celui-ci comprend, en outre, une mesure du niveau basal d’IFNy. Cette mesure est réalisée dans les mêmes conditions que pour une détermination de la production d’IFNy induite par une stimulation réalisée conformément à la présente invention, mais à la différence que l’échantillon de sang total n’est soumis à aucune stimulation. Autrement dit, préalablement au dosage de F IFNy, l’échantillon de sang total est incubé dans les mêmes conditions qu’un échantillon sanguin stimulé, notamment en termes de température et de temps d’incubation, mais en l'absence de la PHA et de tout autre stimulant. Cette mesure particulière d’IFNy, qui peut être utilisée comme une mesure contrôle, permet l’obtention d’une valeur en lien avec le niveau basal d’IFNy, propre à l’échantillon de sang total analysé. Avantageusement, le procédé de détermination du statut immunitaire selon l’invention comprend une étape supplémentaire de rendu de résultat, par laquelle ledit résultat est délivré sous la forme d’une indication choisie parmi :
- au moins une valeur numérique discrète rendant compte du niveau d’immunité de l’individu/patient testé, ladite au moins une valeur numérique correspondant à :
- la valeur du dosage d’IFNy produit en réponse à une stimulation par la PHA ;
- la différence entre la valeur du dosage d’IFNy produit en réponse à une stimulation par la PHA et le niveau basal d’IFNy mesuré ; et/ou
- un ratio entre la valeur du dosage d’IFNy produit en réponse à une stimulation par la PHA et le niveau basal d’IFNy mesuré ;
- au moins une valeur de catégorie déduite de la comparaison entre au moins une des valeurs numériques précédemment listées et au moins une valeur de référence :
- ladite au moins une valeur de référence ayant été préalablement déterminée à partir d’un échantillon de sang total provenant du même individu/patient mais prélevé à un moment différent ; le procédé selon l’invention apporte ainsi une indication quant à l’évolution dans le temps du statut immunitaire dudit individu/patient, et/ou quant à l’impact d’un éventuel traitement sur son système immunitaire ; et/ou
- ladite au moins une valeur de référence ayant été préalablement déterminée à partir d’un ensemble d’échantillons de sang total collectés auprès d’une population d’individus partageant une même particularité au niveau de leur système immunitaire (par exemple une population d’individus sains, une population d’individus immunodéprimés) ; le procédé selon l’invention apporte ainsi une indication quant à l’éventuelle appartenance dudit individu/patient à la population de référence et/ou son positionnement immunitaire par rapport cette population de référence.
Au-delà de l’identification du statut immunitaire d’un individu/d’un patient, le procédé selon l’invention trouve de nombreuses applications cliniques d’importance. Aussi, selon un autre aspect, la présente invention concerne l’utilisation d’un procédé de détermination du statut immunitaire d’un individu/patient selon l’invention, pour au moins une des applications particulières et spécifiques suivantes :
- la détection d’une éventuelle déficience immunitaire ; - le suivi de l’évolution du statut immunitaire d’un patient placé sous thérapie immunosuppressive ;
- le suivi de la reconstitution du système immunitaire d’un patient après une thérapie immunosuppressive ;
- le suivi de l’impact d’une chimiothérapie sur le statut immunitaire d’un patient, et permettre un éventuel réajustement ou changement dans la thérapie ;
- l’étude d’un actif médicamenteux et de son impact éventuel sur le système immunitaire ;
- l’étude d’un facteur environnemental et de son impact éventuel sur le système immunitaire ;
- la détection et/ou l’ étude d’un agent infectieux et de son impact éventuel sur le système immunitaire ;
- le diagnostic et/ou l’étude d’une maladie et de son impact éventuel sur le système immunitaire.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description détaillée qui va suivre et des exemples développés ci-après. Ces exemples se réfèrent aux figures 1 à 4 annexées, lesquelles présentent, sous la forme d’un diagramme en boîte, les résultats de différente mise en œuvre d’un procédé selon l’invention.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Stimulation de sang total provenant de donneurs sains et de patients sous chimiothérapie.
Origines des échantillons de sans analysés
Parmi les échantillons de sang total utilisés dans cet exemple, un premier lot provient de 27 individus sains, adultes et ne présentant a priori aucun symptôme d’immunodéfaillance. Les échantillons de ce premier lot ont été collectés par les Etablissements Français du Sang (EFS).
De même, un second lot d’échantillons de sang provient de 16 patients sous chimiothérapie. Ces échantillons ont été collectés en milieu hospitalier. Chacun des échantillons de sang total a été prélevé dans des tubes Vacutainer® (Becton-Dickinson) stériles contenant de l’héparine de lithium, puis conservés en position verticale et à 2-8°C en attendant la mise en œuvre du procédé de l’invention.
Stimulation des échantillons
Pour chaque échantillon de sang total, après homogénéisation, 300 pL sont prélevés et transférés dans un puits d’une barrette VIDAS® (bioMérieux, France). 300 pL d’une solution de PHA-P à 40 pg/mL (Medicago AB, Suède) dilué au PB S, y sont alors ajoutés.
De la même manière, dans un deuxième puits, afin de déterminer le niveau basal d’ZFNy, 300 pL d’un tampon de PBS (sans PHA-P) sont ajoutés à 300 pL de sang total.
Les mélanges réactionnels sont alors incubés pendant 3h30 à une température de 37°C, avec évaporation contrôlée. L’étape de stimulation/incubation est ici entreprise au moyen d’un instrument d’immunodosage, le VIDAS® 3.
Dosage de l’INF y produit après stimulation
A l’issue des 3h30 de stimulation/incubation, 90 pL de la fraction liquide du mélange réactionnel sont prélevés et la teneur en IFNY est mesurée. Pour ce faire, la partie dosage d’un kit VIDAS® TB-IGRA, fonctionnant selon le principe d’un test ELFA, est utilisée. De façon similaire, le kit VIDAS® IFNY RUO peut être utilisé à cette même fin.
Résultats
Les résultats obtenus sont compilés dans le tableau 1 ci-après, dans lequel la production d’ INFy après une stimulation par de la PHA-P (et sans stimulation), est exprimée en intensité de fluorescence relevée (RFV, pour « Relative Fluorescence Value ») et en concentration d’IFNy estimée.
Tableau 1 : Dosage de l’IFNy sans et après stimulation à la PHA-P, sur sang total provenant de donneurs sains et de patients sous chimiothérapie.
La Figure 1 présente ces mêmes résultats des dosages d’IFNy, sous formes graphique et statistique. EXEMPLE 2 : Stimulation de sang total provenant de donneurs sains et de patients avec une greffe de foie.
Origine des échantillons de sang analysés
Les échantillons de sang total utilisés dans cet exemple proviennent d’une cohorte de volontaires enrôlés pour une l’étude clinique EdMonHG (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03995537), parmi laquelle on compte :
- 11 volontaires adultes sains (c’est-à-dire qui ne présente aucun symptôme d’immunodéfaillance) ; et
- 19 patients suivis pour une greffe de foie et sous immunosuppresseur. Pour chacun de ces patients, un prélèvement de sang a été réalisé avant la greffe (échantillons notés Pre TH), puis chaque semaine suivant la greffe, pendant un mois (échantillons notés successivement Dl- 7, D8-14, D15-21 et D22-31).
Stimulation des échantillons et dosage de ITFNy sécrété après stimulation
Les échantillons de sang total ont été stimulés par la PHA en suivant le même protocole de stimulation que précédemment décrit.
A l’issue des 3h30 de stimulation, l’IFNy présent dans le milieu réactionnel est dosé en suivant le même protocole de dosage que précédemment décrit.
Résultats
Les résultats obtenus sont compilés dans le tableau 2 ci-après, dans lequel la production d’INFy après stimulation (et sans stimulation), est exprimée en intensité de fluorescence relevée (RFV, pour « Relative Fluorescence Value ») et en concentration d’IFNy estimée.
Tableau 2 : Dosage de T IFNy sans et après stimulation à la PHA-P, sur sang total de donneurs sains et de patients ayant subi une greffe de foie. La Figure 2 reprend ces mêmes résultats de dosage d’IFNy, sous formes graphique et statistique.
EXEMPLE 3 : Stimulation de sang total provenant de donneurs sains et de patients après un choc septique
Origine des échantillons de sans analysés
Les échantillons de sang total utilisés dans cet exemple proviennent de 11 volontaires sains et de 22 patients admis en réanimation à l’Hôpital Edouard Herriot de Lyon (France), après un choc septique.
Pour chacun de ces patients suivis après un choc septique, un premier prélèvement de sang a été réalisé le jour de leur admission ou le jour suivant, puis si cela était possible, un deuxième prélèvement au 3-4eme, et enfin au 5-8eme jours (échantillons notés successivement Dl-2, D3-4, D5-8). 4 de ces patients sont décédés pendant cette période ou peu de temps après.
Stimulation des échantillons et dosage de l’IFNy sécrété après stimulation
Les échantillons de sang total ont été stimulés par la PHA en suivant le même protocole de stimulation que précédemment décrit.
A l’issue des 3h30 de stimulation, l’IFNy présent dans le milieu réactionnel est dosé en suivant le même protocole de dosage que précédemment décrit.
Résultats
Les résultats obtenus sont compilés dans le tableau 3 ci-après, dans lequel la production d’INFy après stimulation (et sans stimulation) est exprimée en intensité de fluorescence relevée (RFV, pour « Relative Fluorescence Value ») et en concentration d’IFNy estimée.
Tableau 3 : Dosage de T IFNy sans et après stimulation à la PHA-P, sur sang total de donneurs sains et de patients suivis après un choc septique.
La Figure 3 reprend l’ensemble de ces résultats de dosage d’IFNy, sous formes graphique et statistique.
La Figure 4 reprend ces résultats de dosages d’IFNy après stimulation, sous formes graphique et statistique, en différenciant les données associées aux patients en vie (sp) pendant la semaine de suivi, de celles associées aux patients décédés (dp) pendant cette période de suivi ou peu de temps après.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination du statut immunitaire d’un individu, comprenant les étapes suivantes :
- disposer d’un volume d’échantillon de sang total provenant dudit individu ;
- stimuler ledit échantillon de sang total en l’incubant avec une quantité de phytohémagglutinine (PHA), à une température comprise entre 35°C et 39°C, pendant une durée minimale de 3h00 ;
- évaluer le niveau de production d’IFNy induite par cette incubation/stimulation ; ledit niveau ainsi évalué donne une indication quant au statut immunitaire dudit individu.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite durée minimale est de 3h30.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la durée de l’étape de stimulation/incubation est comprise entre 3h00 et 8h00.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la durée de l’étape de stimulation/incubation est comprise entre 3h30 et 6 heures.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape de stimulation/incubation est mise en œuvre avec de la phytohémagglutinine P (PHA-P).
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape de stimulation/incubation est mise en œuvre avec une quantité de PHA au moins égale de 20 pg par mL de sang total.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape de stimulation/incubation est mise en œuvre avec de l’ordre de 40 pg de PHA par mL de sang total.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la température de l’étape de stimulation/incubation est de l’ordre de 37°C.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la production d’IFNy est évaluée en dosant l’IFNy au moyen d’une technique d’immunodosage.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la production d’IFNy est évaluée en dosant l’IFNy au moyen d’un test ELFA.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon de sang total est hépariné.
12. Utilisation d’un procédé de détermination du statut immunitaire d’un individu selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, à des fins de détection d’une éventuelle déficience immunitaire.
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