EP4532744A1 - Procédé d'identification des enzymes blse chez les entérobactéries - Google Patents

Procédé d'identification des enzymes blse chez les entérobactéries

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EP4532744A1
EP4532744A1 EP23728398.1A EP23728398A EP4532744A1 EP 4532744 A1 EP4532744 A1 EP 4532744A1 EP 23728398 A EP23728398 A EP 23728398A EP 4532744 A1 EP4532744 A1 EP 4532744A1
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EP
European Patent Office
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peptides
seq
analysis
mass spectrometry
esbl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP23728398.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jérôme Lemoine
Eva PEYRACHE
Frédéric ROBIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre Hospitalier Universitaire
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Clermont Auvergne
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre Hospitalier Universitaire
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Clermont Auvergne
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Filing date
Publication date
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)

Definitions

  • the present invention relates to an analytical method using reversed phase liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) to detect extended spectrum B-lactamase (ESBL) type activities linked to the presence of certain enzymes produced by enterobacteria.
  • LC-MS/MS reversed phase liquid chromatography coupled with mass spectrometry
  • ESBL extended spectrum B-lactamase
  • Sepsis refers to any generalized inflammatory reaction associated with a serious bacterial infection. According to the Pasteur Institute, one person dies from sepsis every 5 seconds worldwide. In France, this infection is fatal for 27% of patients, and this figure can rise to more than 50% in the event of septic shock.
  • the WHO classified sepsis as a public health priority, and published a list of pathogens that should be studied as a priority for determining new therapeutic approaches; this list contains in particular the bacteria Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and enterobacteria producing carbapenemases or enzymes with extended spectrum B-lactamase activity (ESBL).
  • B-lactam which includes penicillins, cephalosporins, monobactams and carbapenems. B-lactams act by inhibiting the synthesis of the bacterial wall by blocking the production of peptidoglycan. These molecules have a common structure corresponding to the presence of a four-atom ring, B-lactam, which is their active site.
  • the Ambler classification and the Bush-Jacoby-Medeiros classification are the two existing classifications for B-lactamases.
  • Ambler's scheme proposes a molecular classification and divides these enzymes into 4 classes: A, B, C and D. Those of class A, C and D are called active serine while those of class B are called metallo-B- lactamases (carbapenemases). With the exception of OXA type ESBLs (class D), ESBLs are class A B-lactamases.
  • Group 1 enzymes are cephalosporinases which belong to molecular class C. They are carried by the plasmids of many enterobacteria and by some other organisms, and are generally resistant to inhibition by clavulanic acid and active on cephamycins (example: cefoxitin). They have a high affinity for aztreonam unlike class A cephalosporinases.
  • the enzymes belonging to this subgroup are CMY, MIR, MOX, LAT, FOX, DHA, ACT, ACC and CFE.
  • Group 2 enzymes represent the largest group of B-lactamases.
  • the enzymes of subgroups 2a, 2b, 2be, 2br, 2ber, 2c, 2ce, 2e and 2f belong to molecular class A, and those of subgroups 2d, 2de and 2df belong to molecular class D.
  • the subgroup 2a groups together mainly chromosomal penicillinases. They are the predominant B-lactamases of Gram-positive bacteria such as staphylococci and occasionally enterococci. These enzymes hydrolyze benzylpenicillin and many penicillin derivatives, but with difficulty cephalosporins, carbapenems and monobactams.
  • ⁇ Subgroup 2b includes penicillinases and cephalosporinases. These enzymes readily hydrolyze first-generation penicillins and cephalosporins, and are strongly inhibited by clavulanic acid and tazobactam.
  • TEM-1, TEM-2 and SHV-1 are part of this subgroup.
  • o Subgroup 2br brings together enzymes which hydrolyze penicillins and first generation cephalosporins, and which are resistant to clavulanic acid and tazobactam. To date, 2br brings together variants of TEM (e.g. TEM-30) and SHV (e.g.
  • o Subgroup 2be contains ESBLs. These enzymes hydrolyze penicillins, first to fourth generation cephalosporins, monobactams and further hydrolyze one or more oxyimino-B-lactams, such as cefotaxime, ceftazidime and aztreonam.
  • ESBL-producing strains remain sensitive to cephamycins, carbapenems and inhibition by clavulanic acid. This compound is therefore sometimes administered in combination with B-lactam antibiotics, to limit the action of resistance enzymes.
  • This subgroup notably includes the enzymes TEM-3, SHV-2 and CTX-M-15.
  • the 2ber subgroup includes TEM enzymes with ESBL-like activity and resistance to clavulanic acid and tazobactam. These enzymes are also called B-lactamase CMT (TEM mutant complex). TEM-50 is part of the 2ber subgroup.
  • o Subgroup 2c contains penicillinases which can hydrolyze carbenicillin. Clavulanic acid or tazobactam can inhibit these enzymes. PSE-1 and CARB-3 are part of subgroup 2c.
  • o Subgroup 2ce contains carbenicillinase with broad activity against cefepime and cefpirome. RTG-4 is part of this subgroup.
  • o Subgroup 2d includes B-lactamases which hydrolyze oxacillin.
  • OXA enzymes are known as OXA enzymes and are variably inhibited by clavulanic acid.
  • the enzymes notably found in this subgroup are OXA-1 and OXA-10.
  • Subgroup 2de groups together OXA enzymes with an extended spectrum which includes oxyimino-B-lactams but not carbapenems.
  • OXA-11 and OXA-15 are part of subgroup 2de.
  • the 2df subgroup contains OXA enzymes with carbapenem hydrolysis activities.
  • OXA-23 and OXA-48 are part of the 2df subgroup.
  • Subgroup 2e contains the extended spectrum cephalosporinases and are inhibited by clavulanic acid or tazobactam.
  • Subgroup 2f contains carbapenemases of molecular class A. These enzymes are better inhibited by tazobactam than by clavulanic acid.
  • KPC-2, IMI-1 and SME-1 are enzymes that belong to subgroup 2f.
  • Group 3 enzymes are carbapenemases which belong to molecular class B. They are resistant to inhibition by clavulanic acid and tazobactam. The enzymes that belong to this subgroup are IMP-1, VIM-1, CcrA,
  • ESBLs of the TEM and SHV type are part of the 2be and 2ber subgroups, that is to say they are capable of hydrolyzing penicillins, 1st to 4th generation cephalosporins and monobactams.
  • ESBL-producing strains remain sensitive to cephamycins and carbapenems. Furthermore, ESBLs of subgroup 2be are inhibited by clavulanic acid. This compound is therefore sometimes administered in combination with B-lactam antibiotics, to limit the action of resistance enzymes.
  • Enzymes with ESBL activity are increasingly found during blood infections in patients.
  • ESBLs are a major source of public health concern. Indeed, they induce a high degree of resistance to antibiotics, including third generation cephalosporins. Sepsis is already characterized by a high mortality rate which increases rapidly over time, in the absence of appropriate treatment. After 5 hours without appropriate treatment, the survival rate of patients has already halved. It is only 10% after 24 hours and drops to less than 5% after 36 hours.
  • a blood sample is taken and this blood is cultured (blood culture). If bacteria are present in the sample collected, they will multiply over the hours until they reach a sufficient concentration for the sample to be declared positive. It takes at least 6 to 8 hours for a blood culture to be declared positive and an additional 6 hours for the bacteria to be identified.
  • the assessment of potential antibiotic resistance is the longest step to carry out, and sometimes requires up to 24-48 hours before obtaining the results. However, it is common to start antibiotic treatment before obtaining these results, because such a period of time without treatment would result in a very low patient survival rate.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • sequencing Numerous molecular biology studies using PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification followed by sequencing have been tested.
  • Real-time PCR and direct pyrosequencing of products can notably enable the identification of CTX-M variants with ESBL characteristics.
  • Pyrosequencing is carried out using cycles of denaturation, annihilation and extension of the chain, then sequencing.
  • the use of PCR has disadvantages such as the high cost of probes, as well as the lack of information on the actual expression of proteins involved in resistance mechanisms.
  • MALDI-TOF has been used as a routine bacteriological analysis method in hospitals since its implementation ten years ago. This technique made it possible to reduce the time needed to identify bacteria, particularly in the case of blood infections. MALDI-TOF requires less data reprocessing time than conventional biochemical analysis methods in terms of identification. Therefore, the use of this analytical technique quickly spread in hospital laboratories and became a technique of choice for routine testing in clinical microbiology.
  • MALDI-TOF is still not used as a routine method for the characterization of ESBLs. Indeed, for the Enterobacteriaceae group in particular, differentiation between certain resistance mechanisms is not always possible, because they present a remarkably similar profile (Hou et al., 2019).
  • Top-down proteomics enables the direct analysis of proteins through the use of high-resolution mass spectrometry (HRMS) such as Orbitrap technology, powerful software and extensive databases.
  • HRMS high-resolution mass spectrometry
  • This technology is particularly suitable for high-throughput screening analyzes and can be used in targeted approaches as well as for quantitative analyses.
  • the difficulty of obtaining a precise understanding of this instrumentation and its high cost explain the limits of its application in a routine setting.
  • LC-MS/MS is particularly promising and allows the separation and identification of peptides in bacteriology. Peptides are obtained by enzymatic digestion of proteins. This approach is easier to apply in hospital laboratories because it is simpler to use, more affordable, and less time-consuming in terms of reprocessing.
  • bottom-up proteomics does not cover the entire protein sequence. It is therefore necessary to choose the best candidate peptides from the complete sequence, that is to say those particularly specific to an ESBL, which will be characterized by mass spectrometry to precisely detect and identify the ESBL(s). present in the sample studied.
  • the article by presents a method for identifying bacteria resistant to beta-lactamases by MS/MS mass spectrometry coupled with liquid chromatography.
  • the processed samples are blood samples cultured and identified as being “positive”, that is to say comprising a bacterial population of the E. coli and/or K. pneumoniae species.
  • Patent application US 2017/0052198 describes a method for detecting resistance to cephalosporin (beta-lactamase enzyme) based on detection of specific peptides by MS/MS mass spectrometry coupled with liquid chromatography.
  • cephalosporin beta-lactamase enzyme
  • MS/MS mass spectrometry coupled with liquid chromatography.
  • the peptides are previously obtained by enzymatic digestion.
  • Patent EP 2 699 692 details a low resolution RPLC-MS/MS analysis strategy to detect at least one mechanism of resistance to cephalosporins. Different resistance mechanisms are being sought, such as resistance to TEM-type B-lactams in strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes and other species capable of producing B-lactamases. This process indicates that “only the part of the gradient between 3 and 34 minutes is useful for the analysis”.
  • the present invention proposes a solution to this problem of non-detection of certain ESBL-specific peptides, due to their short sequence and therefore their non-retention on reversed-phase chromatography columns, by ascending mass spectrometry.
  • the present invention relates to a method for determining the resistance properties to beta-lactam antibiotics of a strain of enterobacterium present in a biological sample, comprising the following steps: a) lysis of the bacteria and hydrolysis of the bacterial proteins, to obtain a mixture of peptides, b) analysis of this mixture of peptides by targeted mass spectrometry coupled with reversed-phase liquid chromatography, the detection of at least one peptide specific for an enzyme with extended spectrum beta-lactamase activity (ESBL ) being indicative of the resistance to beta-lactams of the enterobacteria strain present in said biological sample, said method being characterized in that step (b) of analysis is carried out in the presence of a matching agent d ion (IPR) added to the chromatography column or to the peptide mixture.
  • a matching agent d ion (IPR) added to the chromatography column or to the peptide mixture.
  • the present invention also relates to a kit for its use in implementing the method described above, said kit comprising trypsin and heptafluorobutyric acid.
  • FIG. 1 Chromatogram illustrating the detection of the SG ⁇ GK peptide (SEQ ID NO. 8) in sample no. 27.
  • the retention time of this peptide is 2.2 minutes, under the conditions of the process of the invention.
  • FIG. 7 Impact of the concentration of the HFBA solution injected upstream of the analysis to increase the retention time of said peptides on the stationary phase, that is to say to slow down their elution with the mobile phase.
  • the percentage of HFBA tested is between 0 and 0.5%.
  • the retention time for each peptide tested is indicated in minutes. 7 short sequence peptides (less than 7 residues) and therefore exhibiting very little retention in reversed phase were used: SGASER (SEQ ID NO.7), SGAGER (SEQ ID NO.21), TGASER (SEQ ID NO.25 ), TGAGER (SEQ ID NO.33), SGAGK (SEQ ID NO.8), TGASK (SEQ ID NO.26), and SGTGK (SEQ ID NO.9).
  • FIG. 3 Impact of the addition of HFBA on the area under the chromatographic peaks of the different monitored peptides containing 5 or 6 amino acids.
  • the HFBA is injected just before the LC-MS/MS analysis using an injection program.
  • the areas were normalized by a test analysis without HFBA where the peptides co-elute at the dead time.
  • the drastic drop in the area under the peak curve (between 30 mM and 38 mM) demonstrates significant ion suppression during the co-elution of the peptides of interest with HFBA.
  • FIG. 4 Chromatogram showing the HFBA signal for an injected quantity of 30 mM.
  • the abscissa axis is graduated in units of time (minutes).
  • the y axis corresponds to the signal intensity detected by MS/MS.
  • the present invention relates more particularly to an improvement in the technology for detecting enzymes with ESBL activity in a sample, as described in patent EP 2 699 692.
  • the present invention relates to a method for determining the resistance properties to beta-lactam antibiotics of a strain of enterobacteria present in a biological sample, comprising the following steps: a) lysis of the bacteria and hydrolysis of the bacterial proteins, to obtain a mixture of peptides, b) analysis of this mixture of peptides by targeted mass spectrometry coupled with reversed-phase liquid chromatography, the detection of at least one peptide specific for an enzyme with extended spectrum beta-lactamase activity (ESBL) being indicative of the resistance to beta-lactams of the strain of enterobacteria present in said biological sample, said method being characterized in that step (b) of analysis is carried out in the presence of an agent of ion pairing (IPR) added to the chromatography column or to the peptide mixture.
  • IPR agent of ion pairing
  • Beta-lactam antibiotics refer to antibiotics whose molecular structure contains a beta-lactam nucleus. This large family of compounds includes penicillin derivatives, cephalosporins, monobactams, carbapenems and B-lactamase inhibitors.
  • a strain of enterobacterium designates a strain of the Enterobacteriaceae family.
  • This large family of gram-negative bacteria includes the following pathogenic species: Salmonella, Escherichia coli, Klebsiella, Shigella, Enterobacter and Citrobacter.
  • an “enzyme with extended spectrum beta-lactamase activity (ESBL)” designates a bacterial enzyme capable of inactivating at least one B-lactam by hydrolyzing its B-lactam ring.
  • ESBL beta-lactamase activity
  • variants Two types are particularly well known, these are the TEM and SHV enzymes.
  • IPRs are known, such as formic acid, perfluorinated acids such as trifluoroacetic acid (TFA), pentafluoropropionic acid (PFPA) and heptafluorobutyric acid (HFBA), as well as n-compounds. butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl and n-octyl-1-sulfonate.
  • short sequence peptide means peptides consisting of less than 7 amino acid residues, in particular peptides consisting of 5 or 6 amino acids.
  • peptide specific for an extended spectrum beta-lactamase means a peptide obtained by the hydrolysis of bacterial proteins of the beta-lactamase type, as defined in the introduction, and in particular the ESBL enzymes of TEM and SHV type, and indicating the “ESBL” character of the enzyme. This concerns in particular peptides having the following sequences:
  • I PR ion-pairing reagent
  • the article (Sadjadi et al., 2017) concerns the separation of compounds such as aminoglycosides, catecholamines and paraquat, but does not provide guidance on the separation of peptides.
  • This article shows that the retention time of compounds to be separated is increased by adding an ion pairing agent directly into the sample, rather than into the chromatography mobile phase.
  • different IPRs were tested, including n-heptyl-1 -sulfonate, added in concentrations between 5 and 75 mM.
  • lysing bacterial cells can be used. Examples include thermal methods (temperature above 100°C for 10 minutes, or freezing in liquid nitrogen), enzymatic (action of lysozyme or lyticase) or mechanical (high pressure, grinding or sonication).
  • the lysis of bacteria is carried out by sonication.
  • pepsin which hydrolyzes peptide bonds preferentially before aromatic amino acids (Tyrosine, Tryptophan and Phenylalanine), endoproteinase GluC which cuts the peptide bond at the level of glutamate residues, or trypsin which cleaves proteins on the C-terminal side of the amino acids lysine and arginine.
  • trypsin is used as an enzyme for the bacterial protein hydrolysis step. Trypsin is in fact preferred for the specific nature of its activity, the suitable size of the peptides that it generates, and the nature of the “tryptic” peptides which have on the C-terminal side an amino acid that can be positively charged (lysine or arginine), thus facilitating the analysis by mass spectrometry (analysis of charged molecules).
  • This step (a) also includes a centrifugation step making it possible to separate the mixture of peptides from the cellular debris; this step is well known to those skilled in the art and does not require further comment.
  • Mass spectrometers include: i) an ionization source (called an “electrospray”) intended to ionize the molecules to be analyzed, that is to say to confer a positive or negative charge on these molecules; ii) a mass analyzer intended to separate the ionized molecules according to their mass to charge ratio (m / z); iii) a detector intended to measure the signal produced either directly by the molecular ions, or by ions produced from the molecular ions, as detailed below.
  • an ionization source called an “electrospray”
  • a mass analyzer intended to separate the ionized molecules according to their mass to charge ratio (m / z)
  • a detector intended to measure the signal produced either directly by the molecular ions, or by ions produced from the molecular ions, as detailed below.
  • Targeted mass spectrometry is a variant in which the molecules of interest sought by this analysis technique are known beforehand, and the analysis is used to identify their presence or not in a sample.
  • SRM mode or even MRM mode
  • MRM mode is to specifically select a precursor ion, to fragment it, then to specifically select one of its fragment ions.
  • triple quadrupole type devices or triple quadrupole ion trap hybrids are generally used.
  • the mass spectrometry analysis is targeted during the analysis (SRM/MRM, MRM3, PRM type mode).
  • the analysis by targeted mass spectrometry is carried out in MRM or MRM3 mode, and very preferably is carried out in MRM3 mode.
  • This technique is particularly suitable for subsequent analysis of compounds in mass spectrometry, the IPR being completely eluted from the column during the washing step. and therefore not interfering with the following step of analyzing the compounds by mass spectrometry. In addition, this limits the progressive clogging of the mass spectrometer.
  • the solvent used in reversed phase chromatography is in particular an aqueous solution of acetonitrile (H2O/ACN 98/2; v/v) acidified with 2% formic acid.
  • heptafluorobutyric acid is used at a concentration of at least 0.4%, in an aqueous solution.
  • concentration of heptafluorobutyric acid can also be between 0.4% and 0.6%, or be equal to 0.4%, 0.5%, or 0.6%.
  • mass spectrometry is targeted for the detection of peptides having a short sequence, that is to say being made up of less than 7 amino acids, in particular peptides made up of 5 to 6 amino acids. , and in particular the peptides having the following sequences:
  • the sample on which the method of the invention is implemented is any sample likely to contain a target bacterial strain.
  • This biological sample can be of human or animal origin.
  • the biological sample is chosen from:
  • a bacterial culture such as a blood culture, a colony on agar or culture broth,
  • a food sample such as for example a sample of dairy product, meat, fish, egg, fruit, vegetable or a drink, and
  • any other type of biological sample such as for example a water sample or a sample taken from a surface.
  • It will preferably be a biological fluid, in particular a blood sample (blood, serum, plasma).
  • a blood sample blood, serum, plasma.
  • blood culture we mean a blood sample taken from a patient then incubated under appropriate conditions to allow proliferation of any bacteria present in said sample.
  • This blood culture can be carried out in blood culture bottles such as those marketed in the Bact/ ⁇ lert range distributed by BioMérieux, or those in the Bactec range distributed by Becton Dickinson.
  • the present invention also relates to a kit for its use in implementing the process as described above, comprising reagents making it possible to implement the process, in particular:
  • the ion pairing agent may in particular be chosen from formic acid, perfluorinated acids such as trifluoroacetic acid (TFA), pentafluoropropionic acid (PFPA) and heptafluorobutyric acid (HFBA), as well as among the compounds n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl and n-octyl-1-sulfonate.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • PFPA pentafluoropropionic acid
  • HFBA heptafluorobutyric acid
  • kit will also include preparation and/or use instructions, in particular a notice specifying the conditions for implementing the process.
  • HFBA heptafluorobutyric acid
  • the bacterial samples that were analyzed by LC-MS/MS are reported in Table 4 below. These samples are agar (bacterial culture), but the analysis presented can also be carried out with blood cultures. All these samples were subjected to enzymatic digestion. The protocol that was used is as follows. The first 3 steps are optional and are only carried out if pre-concentration of the sample is necessary.
  • the mobile phase gradient used is presented in TABLE 5 below.
  • the program used for the injection is as follows:
  • the system used does not allow an injection program to be carried out, then it is also possible to use two chromatographic methods in succession to analyze the samples.
  • the first method would be isocratic with 98% mobile phase A and a duration of a few seconds to inject the acid at the top of the column.
  • the second method would allow the sample to be injected and analyzed with the classic chromatographic conditions described above and the mobile phase gradient presented in TABLE 5.
  • Liquid chromatography is coupled to a Sciex 6500+ mass spectrometer.
  • the peptides resulting from the enzymatic digestion of bacterial strains are analyzed by mass spectrometry in MRM mode (positive electrospray ionization).
  • Peptides specific to TEM and SHV type enzymes, as well as ribosomal peptides found in enterobacteria were monitored.
  • the 42 peptides monitored in the method are described in TABLE 6 below.
  • 34 peptides come from a TEM and/or SHV type enzyme; among these, 8 are indicative of the ESBL activity of the enzyme considered; and 8 peptides are ribosomal peptides detected for normalization/quantification purposes.
  • MRM detection window 60 seconds
  • Auxiliary gas 1 (Ion Source Gas 1): 70 psi
  • Auxiliary Gas 2 (Ion Source Gas 2): 60 psi
  • the start of the analysis is not analyzed by mass spectrometry.
  • the ionization of the compounds begins after 1.2 minutes.
  • each peptide is validated if the transitions studied are aligned, if the intensity ratios between the transitions are consistent with those of synthetic peptides identical to those analyzed, and finally if the detected intensity threshold is equivalent to at least three times the noise intensity for the transition studied.
  • the results obtained are described in TABLE 8A, TABLE 8B, TABLE 8C.
  • the “-” corresponds to the absence of detection while “yes” indicates the presence of the peptide. When the presence of the peptide implies an ESBL-type enzymatic activity, the “yes” is in bold.
  • All samples tested present at least one peptide specific to a TEM or SHV type enzyme.
  • the bacterial strains tested are therefore at least resistant to the action of first-generation penicillins and cephalosporins.
  • the samples Sample 1, Sample 2, Sample 4, Sample 6, Sample 9, Sample 10, Sample 16, Sample 17, Sample 18, Sample 19, Sample 25, Sample 26, Sample 27, Sample 28, Sample 29, Sample 30 contain at least one peptide specific to the ESBL character of these enzymes. These bacterial strains are therefore resistant to penicillins, first to fourth generation cephalosporins, and monobactams.
  • FIG. 1 shows a chromatogram which illustrates the detection of the SGAGK peptide (SEQ ID NO. 8) in sample Ech 27.
  • samples Ech 6 and Ech 9 had their resistance profile correctly characterized thanks to the identification of 6 amino acid peptides, respectively TGASER (SEQ ID NO. 25 ) and SGASER (SEQ ID NO. 7), which are the only ESBL-specific peptides found in these samples.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d'une souche d'entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d'au moins un peptide spécifique d'une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d'entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape (b) d'analyse est effectuée en présence d'un agent d'appariement d'ion (IPR) additionné dans la colonne de chromatographie ou dans le mélange de peptides.

Description

Procédé d’identification des enzymes BLSE chez les entérobactéries
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une méthode d’analyse utilisant la chromatographie liquide en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pour détecter les activités de type B-lactamase à spectre étendu (BLSE) liées à la présence de certaines enzymes produites par les entérobactéries.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La septicémie désigne toute réaction inflammatoire généralisée associée à une infection bactérienne grave. Selon l'institut Pasteur, une personne meurt de septicémie toutes les 5 secondes dans le monde. En France, cette infection est fatale pour 27% des patients, et ce chiffre peut monter jusqu’à plus de 50% en cas de choc septique. En 2017, l'OMS a classé la septicémie comme priorité de santé publique, et a publié une liste des agents pathogènes devant être étudiés de manière prioritaire pour la détermination de nouvelles approches thérapeutiques ; cette liste contient notamment les bactéries Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et les entérobactéries productrices de carbapénémases ou d’enzymes à activité de B-lactamases à spectre étendu (BLSE).
Actuellement, différentes familles d'antibiotiques sont utilisées pour soigner les septicémies en milieu hospitalier. L'une des plus connues et utilisées est la famille des B-lactamines, qui regroupe les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes. Les B-lactamines agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne en bloquant la production du peptidoglycane. Ces molécules ont une structure commune correspondant à la présence d’un cycle à quatre atomes, le B-lactame, qui est leur site actif.
Les enzymes B-lactamases à spectre étendu (BLSE)
Il existe des mécanismes dits « de résistance » qui empêchent l'action de ces antibiotiques : en particulier les systèmes d'efflux, l’imperméabilité de la paroi bactérienne et les B- lactamases. Ces enzymes inactivent les B-lactamines en hydrolysant leur cycle B-lactame. La première B-lactamase TEM, qui hydrolyse l’ampicilline et les céphalosporines de première génération, a été identifiée chez la bactérie Escherichia coli. Pour faire face à ce problème, de nouveaux antibiotiques à spectre étendu ont été mis au point, mais leur utilisation abusive chez l’Homme et dans les élevages d’animaux a conduit à l'apparition des B- lactamases à spectre étendu (BLSE).
La classification d’Ambler et celle de Bush-Jacoby-Medeiros sont les deux classifications existantes pour les B-lactamases. Le schéma d ’Ambler propose une classification moléculaire et répartit ces enzymes en 4 classes : A, B, C et D. Celles de classe A, C et D sont dites à sérine active tandis que celles de classe B sont appelées métallo-B-lactamases (carbapénèmases). A l’exception des BLSE de type OXA (classe D), les BLSE sont des B-lactamases de classe A.
La classification de Bush-Jacoby-Medeiros permet de classer ces enzymes selon leurs groupes fonctionnels. Cette classification a été mise à jour en 2010 et répartit les B-lactamases en 3 groupes : 1 , 2 et 3 (Bush & Jacoby, 2010).
• Les enzymes du groupe 1 sont des céphalosporinases qui appartiennent à la classe moléculaire C. Elles sont portées par les plasmides de nombreuses entérobactéries et par quelques autres organismes, et sont généralement résistantes à l'inhibition par l'acide clavulanique et actives sur les céphamycines (exemple : la céfoxitine). Elles ont une grande affinité pour l'aztréonam contrairement aux céphalosporinases de classe A. Les enzymes appartenant à ce sous-groupe sont CMY, MIR, MOX, LAT, FOX, DHA, ACT, ACC et CFE.
• Les enzymes du groupe 2 représentent le plus grand groupe de B-lactamases. Les enzymes des sous-groupes 2a, 2b, 2be, 2br, 2ber, 2c, 2ce, 2e et 2f appartiennent à la classe moléculaire A, et celles des sous-groupes 2d, 2de et 2df appartiennent à la classe moléculaire D. o Le sous-groupe 2a regroupe des pénicillinases majoritairement chromosomiques. Ce sont les B-lactamases prédominantes des bactéries à Gram-positifs telles que les staphylocoques et occasionnellement les entérocoques. Ces enzymes hydrolysent la benzylpénicilline et de nombreux dérivés de la pénicilline, mais difficilement les céphalosporines, les carbapénèmes et les monobactames. Ces enzymes sont inhibées par l'acide clavulanique et le tazobactam. Ce sous-groupe contient notamment l’enzyme PC-1. o Le sous-groupe 2b regroupe des pénicillinases et des céphalosporinases. Ces enzymes hydrolysent facilement les pénicillines et les céphalosporines de première génération, et sont fortement inhibées par l'acide clavulanique et le tazobactam. TEM-1 , TEM-2 et SHV-1 font partie de ce sous-groupe. o Le sous-groupe 2br regroupe les enzymes qui hydrolysent les pénicillines et les céphalosporines de première génération, et qui résistent à l'acide clavulanique et au tazobactam. A ce jour, 2br regroupe des variants de TEM (ex : TEM-30) et de SHV (ex : SHV-10). o Le sous-groupe 2be contient les BLSE. Ces enzymes hydrolysent les pénicillines, les céphalosporines de première à quatrième génération, les monobactames et hydrolysent en outre une ou plusieurs oxyimino-B- lactamines, telles que la céfotaxime, la ceftazidime et l'aztréonam. En général, les souches productrices de BLSE restent sensibles aux céphamycines, aux carbapénèmes et à l'inhibition par l'acide clavulanique. Ce composé est donc parfois administré en association avec les antibiotiques B- lactamines, pour limiter l'action des enzymes de résistance. Ce sous-groupe regroupe notamment les enzymes TEM-3, SHV-2 et CTX-M-15. o Le sous-groupe 2ber comprend les enzymes TEM avec une activité de type BLSE et une résistance à l'acide clavulanique et au tazobactam. Ces enzymes sont aussi nommées B-lactamase CMT (complex mutant TEM). TEM-50 fait partie du sous-groupe 2ber. o Le sous-groupe 2c contient les pénicillinases qui peuvent hydrolyser la carbénicilline. L'acide clavulanique ou le tazobactam peut inhiber ces enzymes. PSE-1 et CARB-3 font partie du sous-groupe 2c. o Le sous-groupe 2ce contient la carbénicillinase avec une activité étendue contre le céfépime et le cefpirome. RTG-4 fait partie de ce sous-groupe. o Le sous-groupe 2d comprend des B-lactamases qui hydrolyse l'oxacilline. Ces enzymes sont connues sous le nom d'enzymes OXA et sont variablement inhibées par l'acide clavulanique. Les enzymes notamment retrouvées dans ce sous-groupe sont OXA-1 et OXA-10. o Le sous-groupe 2de regroupe les enzymes OXA avec un spectre étendu qui inclut les oxyimino-B-lactames mais pas les carbapénèmes. OXA-11 et OXA-15 font partie du sous-groupe 2de. o Le sous-groupe 2df contient les enzymes OXA avec des activités d'hydrolyse des carbapénèmes. OXA-23 et OXA-48 font partie du sous-groupe 2df. o Le sous-groupe 2e contient les céphalosporinases à spectre étendu et sont inhibées par l'acide clavulanique ou le tazobactam. Une enzyme retrouvée dans ce groupe est notamment CepA. o Le sous-groupe 2f contient les carbapénémases de la classe moléculaire A. Ces enzymes sont mieux inhibées par le tazobactam que par l'acide clavulanique. KPC-2, IMI-1 et SME-1 sont des enzymes qui appartiennent au sous-groupe 2f.
• Les enzymes du groupe 3 sont des carbapénémases qui appartiennent à la classe moléculaire B. Elles sont résistantes à l'inhibition par l'acide clavulanique et au tazobactam. Les enzymes qui appartenant à ce sous-groupe sont IMP-1 , VIM-1 , CcrA,
I ND- 1 , L1 , CAU-1 , GOB-1 , FEZ- 1 , CphA et Sfh-1.
Les BLSE de type TEM et SHV font partie des sous-groupes 2be et 2ber, c'est-à-dire qu’elles sont capables d’hydrolyser les pénicillines, les céphalosporines de 1ère à 4ème génération et les monobactames.
En général, les souches productrices de BLSE restent sensibles aux céphamycines et aux carbapénèmes. Par ailleurs, les BLSE du sous-groupe 2be sont inhibées par l'acide clavulanique. Ce composé est donc parfois administré en association avec les antibiotiques B-lactamines, pour limiter l'action des enzymes de résistance.
Conséquences cliniques de l’existence de ces enzymes BLSE induisant une résistance aux antibiotiques 8-lactamines
Les enzymes à activité BLSE, désignées ci-après "BLSE", sont de plus en plus retrouvées lors d’infections sanguines chez des patients.
Ces enzymes sont induites par les plasmides des bactéries gram-négatives, résultant pour la plupart de mutations de beta-lactamases naturelles telles que TEM-1 , TEM-2 ou SHV-1 .
Les BLSE sont une source de préoccupation majeure en termes de santé publique. En effet, elles induisent un degré élevé de résistance aux antibiotiques, y compris aux céphalosporines de troisième génération. La septicémie se caractérise déjà par un taux de mortalité élevé qui augmente rapidement au cours des heures, en absence de traitement adapté. Après 5 heures sans traitement adapté, le taux de survie des patients a déjà diminué de moitié. Il n’est plus que de 10% après 24 heures et descend à moins de 5% après 36 heures.
Lorsqu’il y a une suspicion de sepsis chez un patient, un prélèvement sanguin est réalisé et ce sang est mis en culture (hémoculture). Si des bactéries sont présentes dans l’échantillon recueilli, elles vont se multiplier au cours des heures jusqu’à atteindre une concentration suffisante pour que l’échantillon soit déclaré positif. Il faut au minimum 6 à 8 heures pour qu’une hémoculture soit déclarée positive et 6 heures supplémentaires pour réaliser l’identification de la bactérie. L’évaluation d’une potentielle résistance aux antibiotiques est l’étape la plus longue à réaliser, et nécessite parfois jusqu’à 24h-48h avant d’obtenir les résultats. Cependant, il est fréquent de débuter le traitement antibiotique avant d’obtenir ces résultats, car un tel laps de temps sans traitement induirait un taux de survie des patients très faible.
La solution utilisée en milieu hospitalier pour pallier aux longues méthodes d’identification de la bactérie et de l’évaluation des mécanismes de résistance est de donner au patient des antibiotiques à spectre étendu, puis d’ajuster le traitement au cours du temps. Cependant, ce choix implique différents problèmes subséquents, notamment une augmentation de l’antibiorésistance dans la population. Techniques actuelles de détection et d’identification des BLSE
L’élaboration de méthodes analytiques rapides, efficaces et robustes est primordiale en diagnostic afin de pouvoir offrir dès que possible le traitement approprié à chaque patient.
Actuellement, les méthodes de détection des BLSE en routine sont limitées et nécessitent plusieurs dizaines d’heures pour obtenir un antibiogramme. Ils reposent majoritairement sur l’utilisation des disques de diffusion, notamment le test de synergie entre le mélange amoxicilline et acide clavulanique (AMC), et une C3G (par exemple la ceftazidime) ou l’aztréonam. Les automates de bactériologie (Vitek 2®, Alfred 60AST®, Mini-Api®, Phoenix®, Microscan®) sont de plus en plus utilisés car plus rapides, par exemple VITEK® 2 peut fournir des résultats d’identification et d'antibiogramme en moins de 5 heures.
Cependant, la sensibilité et la spécificité de ces automates ne sont pas toujours suffisantes et peuvent nécessiter des tests supplémentaires.
De nombreuses études en biologie moléculaire utilisant l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) suivies d’un séquençage ont été testées. La PCR en temps réel et le pyroséquençage direct des produits peuvent notamment permettre l’identification des variants de CTX-M à caractère BLSE. Le pyroséquençage est réalisé grâce à des cycles de dénaturation, annihilation et extension de la chaîne, puis d’un séquençage. Toutefois, l’utilisation de la PCR présente des inconvénients tels que le coût élevé des sondes, ainsi que l’absence d'information sur l'expression réelle des protéines impliquées dans les mécanismes de résistances.
En réponse au besoin actuel de détection et évaluation des niveaux d’expression des BLSE, de nouvelles stratégies d’analyse commencent à émerger afin de déterminer rapidement les profils de résistance des bactéries.
Suite aux premières études concernant l’identification de bactéries par MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight), la spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée.
Le MALDI-TOF est utilisé comme méthode d'analyse bactériologique de routine dans les hôpitaux depuis sa mise en œuvre il y a dix ans. Cette technique a permis de réduire le temps nécessaire à l'identification des bactéries, notamment dans le cas d'infections sanguines. Le MALDI-TOF nécessite moins de temps de retraitement des données que les méthodes d'analyse biochimique conventionnelles en termes d'identification. C'est pourquoi l'utilisation de cette technique analytique s'est rapidement répandue dans les laboratoires des hôpitaux et est devenue une technique de choix pour les tests de routine en microbiologie clinique.
Au cours des dernières années, différentes études ont mis en évidence la possibilité d'utiliser le MALDI-TOF pour identifier le mécanisme d'antibiorésistance et l'activité des B-lactamases (Oviano et al., 2014). Certaines études utilisent aussi le MALDI-TOF pour réaliser un miniséquençage notamment dans le domaine de l'antibiorésistance aux B-lactamases à spectre étendu (BLSE).
Malgré son efficacité, le MALDI-TOF n’est toujours pas utilisé en méthode de routine pour la caractérisation des BLSE. En effet, pour le groupe des entérobactéries notamment, la différenciation entre certains mécanismes de résistance n'est pas toujours possible, car ils présentent un profil remarquablement similaire (Hou et al., 2019).
Deux types d'approches sont généralement utilisés pour étudier les protéines par spectrométrie de masse : la protéomique descendante et la protéomique ascendante.
La protéomique descendante permet l'analyse directe des protéines grâce à l'utilisation de la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) telle que la technologie Orbitrap, de logiciels puissants et de bases de données étendues. Cette technologie est particulièrement adaptée aux analyses de criblage à haut débit et peut être utilisée dans des approches ciblées ainsi que pour des analyses quantitatives. Cependant, la difficulté d'obtenir une compréhension précise de cette instrumentation et son coût élevé expliquent les limites de son application dans un cadre de routine.
Au contraire, la spectrométrie de masse ascendante est une technique plus abordable basée sur l'analyse des peptides par spectrométrie de masse, le plus souvent à basse résolution (LRMS). La LC-MS/MS est notamment très prometteuse et permet la séparation et l'identification des peptides en bactériologie. Les peptides sont obtenus par digestion enzymatique des protéines. Cette approche est plus facile à appliquer dans les laboratoires hospitaliers car elle est plus simple à utiliser, plus abordable, et moins longue en termes de retraitement.
Contrairement à la protéomique descendante, la protéomique ascendante ne couvre pas la totalité de la séquence protéique. Il est donc nécessaire de choisir les meilleurs peptides candidats issus de la séquence complète, c’est-à-dire ceux particulièrement spécifiques d’une BLSE, qui seront caractérisés par spectrométrie de masse pour détecter et identifier précisément la ou les BLSE(s) présente(s) dans l’échantillon étudié.
L’article de (Fleurbaaij et al., 2017) présente un procédé d’identification de bactéries résistantes aux beta- lactamases par spectrométrie de masse MS/MS couplée à une chromatographie en phase liquide. Les échantillons traités sont des échantillons de sang mis en culture et identifiés comme étant « positifs », c’est-à-dire comprenant une population bactérienne des espèces E. coli et/ou K. pneumoniae.
La demande de brevet US 2017/0052198 décrit une méthode pour détecter la résistance à la céphalosporine (enzyme beta- lactamase) basée sur une détection de peptides spécifiques par spectrométrie de masse MS/MS couplée à une chromatographie en phase liquide. Les peptides sont préalablement obtenus par digestion enzymatique.
Le brevet EP 2 699 692 détaille une stratégie d’analyse en RPLC-MS/MS basse résolution pour détecter au moins un mécanisme de résistance aux céphalosporines. Différents mécanismes de résistance sont recherchés tels que la résistance au B-lactamines de type TEM chez des souches d’ Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes et d’autres espèces susceptibles de produire des B-lactamases. Ce procédé indique que « seule la partie du gradient comprise entre 3 et 34 minutes est utile à l’analyse ».
Toutefois, plusieurs peptides spécifiques des BLSE, cités dans ce brevet, éluent avant 3 minutes. Par exemple, le peptide SGASER (SEQ ID NO. 7) retrouvé dans certains variants de TEM élue à 1 ,4 minutes, et ne peut donc pas être identifié avec la méthode telle que décrite.
Il a été constaté par les inventeurs que certains peptides de courte séquence, constitués de 5 ou 6 acides aminés, sont très peu retenus en phase inverse, ce qui est un véritable obstacle à leur détection par LC -MS/MS.
La présente invention propose une solution à ce problème de non-détection de certains peptides spécifiques des BLSE, du fait de leur courte séquence et donc de leur non-rétention sur les colonnes de chromatographie en phase inverse, par la spectrométrie de masse ascendante.
BREF EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR) additionné dans la colonne de chromatographie ou dans le mélange de peptides.
La présente invention concerne également un kit pour son utilisation dans la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus, ledit kit comprenant de la trypsine et de l’acide heptafluorobutyrique. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Chromatogramme illustrant la détection du peptide SGÀGK (SEQ ID NO. 8) dans l’échantillon n°27. Le temps de rétention de ce peptide est de 2,2 minutes, dans les conditions du procédé de l’invention.
Figure 2. Impact de la concentration de la solution d’HFBA injectée en amont de l’analyse pour augmenter le temps de rétention desdits peptides sur la phase stationnaire, c’est-à- dire pour ralentir leur élution avec la phase mobile. Le pourcentage d’HFBA testé est compris entre 0 et 0.5%. Le temps de rétention pour chaque peptide testé est indiqué en minutes. 7 peptides de courte séquence (moins de 7 résidus) et présentant donc très peu de rétention en phase inverse ont été utilisés : SGASER (SEQ ID NO.7), SGAGER (SEQ ID NO.21 ), TGASER (SEQ ID NO.25), TGAGER (SEQ ID NO.33), SGAGK (SEQ ID NO.8), TGASK (SEQ ID NO.26), et SGTGK (SEQ ID NO.9).
Figure 3. Impact de l'ajout d’HFBA sur l'aire sous les pics chromatographiques des différents peptides suivis contenant 5 ou 6 acides aminés. L’HFBA est injecté juste en amont de l’analyse LC-MS/MS à l’aide d’un programme d’injection. Les aires ont été normalisées par une analyse test sans HFBA où les peptides co-éluent au temps mort. La chute drastique de l’aire des sous la courbe des pics (entre 30 mM et 38 mM) témoigne d’une suppression d’ions importante lors de la co-élution des peptides d’intérêts avec l’HFBA.
Figure 4. Chromatogramme montrant le signal de l’HFBA pour une quantité de 30 mM injectée. L’axe des abscisses est gradué en unités de temps (minutes). L’axe des ordonnées correspond à l’intensité du signal détecté par MS/MS.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L’invention présentée ici permet la caractérisation, en moins d’une heure, à partir d’une hémoculture positive, du profil de résistance de souches d’entérobactéries qui expriment les enzymes à activité BLSE de type TEM ou SHV.
Cette détection rapide du profil de résistance des entérobactéries présentes dans l’échantillon permet d’administrer rapidement le traitement approprié à chaque patient souffrant d’une infection bactérienne, en particulier d’une septicémie.
La présente invention concerne plus particulièrement une amélioration de la technologie de détection d’enzymes à activité BLSE dans un échantillon, telle que décrite dans le brevet EP 2 699 692.
En effet, la technique d’analyse décrite dans le brevet EP 2 699 692 ne permet pas de caractériser 20% des enzymes à activité BLSE de type TEM, et 90% des enzymes BLSE de type SHV, car des peptides spécifiques de ces enzymes BLSE ne peuvent pas être détectés dans les échantillons par le procédé considéré (calculs réalisés à l’aide du site bldb.eu).
Une solution à ce problème est ici proposée. Elle consiste à augmenter le temps de rétention des peptides non visualisés dans la méthode décrite dans EP 2 699 692, du fait de leur courte séquence, en utilisant lors de l’analyse un agent d’appariement d’ion (IPR).
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR) additionné dans la colonne de chromatographie ou dans le mélange de peptides.
Les termes utilisés dans la présente demande sont présentés ci-dessous pour mieux définir l’invention.
Les « antibiotiques de type beta-lactamines » désignent des antibiotiques dont la structure moléculaire contient un noyau beta-lactame. Cette grande famille de composés comprend les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes et les inhibiteurs de la B-lactamase.
Au sens de l’invention, une souche d’entérobactérie désigne une souche de la famille des Enterobacteriaceae. Cette grande famille de bactéries gram -négatives inclut notamment les espèces pathogènes suivantes : Salmonella, Escherichia coli, Klebsiella, Shigella, Enterobacter et Citrobacter.
Au sens de l’invention, une «enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) » désigne une enzyme bactérienne capable d’inactiver au moins une B-lactamine en hydrolysant son cycle B-lactame. Ces enzymes à activité BLSE sont également désignés dans la présente demande comme des « variants », car elles dérivent d’enzymes ne possédant pas cette activité BLSE. Deux types sont particulièrement connus, il s’agit des enzymes TEM et SHV.
Au sens de l’invention, un « agent d’appariement d’ion », également dénommé par son acronyme IPR (lon-pairing reagent), désigne un composé permettant de réduire les interactions ioniques entre les peptides et la phase stationnaire hydrophobe de la chromatographie. De nombreux IPR sont connus, tels que par exemple l’acide formique, les acides perfluorés tels que l’acide trifluoroacétique (TFA), l’acide pentafluoropropionique (PFPA) et l’acide heptafluorobutyrique (HFBA), ainsi que les composés n-butyl, n-pentyl, n- hexyl, n-heptyl et n-octyl-1 -sulfonate.
L’utilisation d’un tel IPR peut rendre difficile la détection des peptides par spectrométrie de masse. Les solutions sont soit d’adapter les concentrations d’IPR utilisées, soit de choisir un IPR plus approprié.
Dans le cadre de l’invention, on entend par « élution des peptides » l’étape de la chromatographie en phase liquide où les peptides « sortent » de la colonne de chromatographie avec la phase mobile.
On entend par « peptide de courte séquence « des peptides constitués de moins de 7 résidus d’acides aminés, en particulier des peptides constitués de 5 ou de 6 acides aminés.
On entend par « peptide spécifique d’une beta- lactamase à spectre étendu (BLSE) » un peptide obtenu par l’hydrolyse des protéines bactériennes de type beta-lactamases, telles que définies dans l’introduction, et en particulier les enzymes BLSE de type TEM et SHV, et indiquant le caractère « BLSE » de l’enzyme. Il s’agit en particulier des peptides présentant les séquences suivantes :
- IHYSQNDLVK (SEQ ID NO. 4),
- LDHWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 5),
- LDSWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 6),
- SGASER (SEQ ID NO. 7),
- SGAGK (SEQ ID NO. 8),
- SGTGK (SEQ ID NO. 9),
- TGASER (SEQ ID NO. 25) et
- TGASK (SEQ ID NO. 26).
Eléments scientifiques sous-tendant l’invention
L’invention repose sur l’analyse en LC-MS/MS basse résolution de peptides issus de la digestion enzymatique de protéines des souches bactériennes pour détecter les activités de type B-lactamase à spectre étendu (BLSE) des enzymes de type TEM et SHV exprimées par les entérobactéries.
Un agent d’appariement d’ion est utilisé pour augmenter la rétention des peptides de courte séquence sur la phase stationnaire de la chromatographie, et donc de retarder leur élution avec la phase mobile. La détection de ces peptides de courte séquence est en effet nécessaire pour caractériser les souches bactériennes présentant une activité enzymatique BLSE. Les articles de (Guo et al., 1987) et (Shibue et al., 2005) décrivent les effets de composés dits « ion-pairing reagent » (I PR) et de leur concentration sur la rétention des peptides, dans le cadre d’une séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Dans ces méthodes de séparation de peptides, l’IPR est présent dans la phase mobile pendant toute la durée de la séparation chromatographique. Les effets de la présence de cet IPR sur une analyse ultérieure des peptides par spectrométrie de masse ne sont pas abordés.
L’article de (Gussakovsky et al., 2020) est relatif à l’application de cette méthode à un groupe de données protéomiques comprenant plus de 12 000 peptides, analysé en RPLC- MS/MS (Reverse Phase Liquid Chromatography - spectrométrie MS/MS). L’ajout de 0.005% d’acide heptafluorobutyrique (HFBA) dans la phase mobile constituée d’eau et d’acétonitrile, acidifiée avec 0.1% d’acide formique, permet d’augmenter la rétention des peptides, jusqu’à 10% en acétonitrile pour les peptides de courte séquence hydrophiles. Toutefois, la suppression ionique due à la présence de HFBA entraîne une nette perte de sensibilité du signal des peptides (en moyenne la réduction du signal est de 3.75 pour la population complète de peptides).
L’article (Sadjadi et al., 2017) concerne la séparation de composés tels que les aminoglycosides, les catécholamines et le paraquat, mais ne donne pas d’indications quant à la séparation de peptides. Cet article montre que le temps de rétention des composés à séparer est augmenté en ajoutant un agent d’appariement d’ion directement dans l’échantillon, plutôt que dans la phase mobile de chromatographie. Dans cet article, différents IPRs ont été testés, dont le n-heptyl-1 -sulfonate, ajouté dans des concentrations comprises entre 5 et 75 mM.
L’utilisation d’agent d’appariement d’ion a déjà été proposée pour retarder l’élution de peptides de courte séquence et/ou hydrophiles. Toutefois, il s’agit ici de la première fois que cette technologie est appliquée à la détection de peptides issus de protéines BLSE. En effet, il n’était pas prévisible que l’hydrolyse de protéines BLSE générerait autant de peptides indétectables par une utilisation « classique » de la spectrométrie de masse ciblée, telle que décrite dans le brevet EP 2 699 692.
De plus, la méthode de l’invention comprend une addition d’IPR dans la colonne de chromatographie ou dans l’échantillon, et non dans la phase mobile de la chromatographie, comme cela était décrit dans les précédentes études relatives à la détection de peptides.
Etape (a) du procédé de l’invention : lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes
Les bactéries présentes dans l’échantillon biologique peuvent être isolées par centrifugation. Il est entendu que cet échantillon soumis au procédé de l’invention est un échantillon identifié comme « positif » lors d’une étape préalable, c’est-à-dire comportant en son sein des bactéries dont une éventuelle résistance à des antibiotiques est inconnue.
Différentes méthodes de lyse des cellules bactériennes peuvent être employées. On citera par exemple les méthodes thermiques (température supérieure à 100° C pendant 10 minutes, ou congélation dans l’azote liquide), enzymatiques (action du lysozyme ou de la lyticase) ou mécanique (haute pression, broyage ou sonication).
Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l’invention, la lyse des bactéries est réalisée par sonication.
L’hydrolyse des protéines bactériennes en peptides est généralement réalisée suivant l’un des deux procédés suivants : a) Par action d’agents chimiques tels que les radicaux hydroxyles qui induisent des coupures aléatoires au niveau des liaisons peptidiques, ou b) Par action d’enzymes protéolytiques (protéases) qui ont une action d’hydrolyse des liaisons protéiques.
Selon une mise en œuvre préférée du procédé, l’hydrolyse des protéines bactériennes est une hydrolyse enzymatique.
La digestion enzymatique est réalisée par des enzymes nommées peptidases (ou protéases) qui vont hydrolyser les liaisons peptidiques des protéines. Deux classes de peptidases existent et sont définies en fonction de la localisation de la coupure dans la chaîne peptidique : les exopeptidases et les endopeptidases.
Les exopeptidases permettent de cliver la chaîne peptidique entre l’acide aminé terminal de la chaîne peptidique et le reste de la chaîne. Ces enzymes sont divisées en deux sous- classes nommées aminopeptidases et carboxypeptidases en fonction de si l’hydrolyse permet la libération de l'acide aminé N-terminal ou C-terminal.
Les endopeptidases peuvent hydrolyser les liaisons peptidiques à l’intérieur de la chaîne. Selon leur spécificité, ces enzymes peuvent cliver les liaisons formées avec certains acides aminés. Parmi les endopeptidases les plus connues, la trypsine permet l’hydrolyse des liaisons peptidiques au niveau d’un groupe carboxyle engagé avec une lysine ou une arginine.
Parmi les protéases couramment utilisées, on citera la pepsine qui hydrolyse les liaisons peptidiques préférentiellement avant les acides aminés aromatiques (Tyrosine, Tryptophane et Phénylalanine), l’endoprotéinase GluC qui coupe la liaison peptidique au niveau des résidus glutamates, ou encore la trypsine qui clive les protéines du coté C-terminal des acides aminés lysine et arginine.
Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l’invention, la trypsine est utilisée comme enzyme pour l’étape d’hydrolyse des protéines bactériennes. La trypsine est en effet préférée pour le caractère spécifique de son activité, la taille adaptée des peptides qu’elle génère, et la nature des peptides « tryptiques » qui possèdent du coté C-terminal un acide aminé pouvant être chargé positivement (lysine ou arginine), facilitant ainsi l’analyse par spectrométrie de masse (analyse de molécules chargées).
Cette étape (a) comprend également une étape de centrifugation permettant de séparer le mélange de peptides des débris cellulaires ; cette étape est bien connue de l’Homme de l’art et ne nécessite pas d’être commentée plus avant.
Cette étape (a) peut également comprendre une étape d’ajout d’un acide dans le milieu, destinée à neutraliser l’enzyme effectuant l’hydrolyse des protéines après un temps d’incubation suffisant ; ceci est également bien connu de l’Homme de l’art.
Etape (b): Analyse du mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie en phase inverse, réalisée en présence d’un agent d’appariement d’ion
La présente invention se base sur une technique d’analyse dite « ascendante » telle que définie ci-dessus.
Selon une mise en œuvre de l’invention, l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIA/SWATH).
La spectrométrie de masse est une technologie physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt. Elle est également connue sous le nom de single reaction monitoring, ou multiple reaction monitoring, ou parellel reaction monitoring. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).
Les spectromètres de masse comportent : i) une source d'ionisation (dite « electrospray ») destinée à ioniser les molécules à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces molécules ; ii) un analyseur de masse destiné à séparer les molécules ionisées en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ; iii) un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci- après.
L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisées en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. Il est à noter que les deux modes positif et négatif ne peuvent pas être utilisés en même temps : ainsi, dans l'exemple 4, seul l'HFBA est suivi en mode négatif, les peptides ne pouvant être suivis lors de la même analyse car ils doivent être suivis en mode positif.
L'analyseur de masse dans lequel est mis en œuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripole ou quadrupole (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), et l’orbitrap.
La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en oeuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS3.
La spectrométrie de masse ciblée est une variante dans laquelle les molécules d’intérêt recherchées par cette technique d’analyse sont préalablement connues, et l’analyse sert à identifier leur présence ou non dans un échantillon.
Les approches ciblées (Multiple Reaction Monitoring, MRM ; Parallel Reaction Monitoring, PRM ; Multiple Reaction Monitoring-High Resolution, MRM-HR ; Multiple Reaction Monitoring cubed, MRM3, DIA/SWATH) consistent en la sélection par un premier analyseur d’une masse précise correspondant au peptide d’intérêt qui est ensuite fragmenté dans une cellule de collision. Les fragments générés sont ensuite monitorés par un troisième analyseur et leur signal/intensité est mesuré.
Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripole ou des hybrides triple quadripole à trappe ionique sont généralement utilisés.
Le mode d’analyse DIA/SWATH consiste à enregistrer des spectres de fragmentation de fenêtres de sélection contiguës d’ions précurseurs, le plus souvent chevauchantes de 1 unité de rapport masse sur charge (m/z), les fenêtres étant caractérisées par une largeur fixe ou variable en m/z, ou bien en utilisant une fenêtre glissante de largeur fixe en m/z, tout en faisant en sorte que le temps de cycle total pour couvrir l’ensemble de ces fenêtres permet d’échantillonner chaque pic chromatographique par au moins 5 points. Dans le cas des couplages chromatographiques, le signal des fragments est mesuré en fonction du temps pour être représenté sous forme de chromatogramme, l’apparition de pics chromatographiques concomitants (détection simultanée des fragments) étant donc témoin de la présence du peptide dans l’échantillon.
Ces approches nécessitent un travail préalable de sélection et de validation des peptides ciblés pour s’assurer de leur unicité de séquence/masse (ou ratio masse/charge, m/z) et de leur détectabilité.
Selon une mise en œuvre de l’invention, l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM).
Selon une autre mise en œuvre de l’invention, l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée après l’analyse (mode de type DIA/SWATH).
Plus préférentiellement, l’analyse par spectrométrie de masse ciblée est réalisée en mode MRM ou MRM3, et de manière tout à fait préférée est réalisée en mode MRM3.
La spectrométrie de masse ciblée est couplée à une étape de chromatographie liquide en phase inverse. La chromatographie en phase inverse est une technique très utilisée pour séparer les peptides. Les phases mobiles utilisées sont volatiles, ce qui facilite les étapes de concentration/lyophilisation. Les solvants les plus utilisés sont l’eau et l’acétonitrile.
Lors de cette étape de séparation par chromatographie, les peptides sont « élués », c’est à dire qu’ils sortent de la colonne de chromatographie (phase stationnaire) avec la phase mobile (liquide) à différents moments, en fonction de leur charge et de leur masse. L’ajout d’un agent d’appariement d’ion permet de retarder cette élution, car les peptides restent ainsi un peu plus longtemps appariés à la phase stationnaire.
Dans le procédé de l’invention, afin de contrer au maximum la suppression ionique et ainsi de limiter la perte de signal des composés étudiés, l’agent d’appariement d’ion (IPR) est injecté en amont de l’analyse, c’est-à-dire additionné dans la colonne de chromatographie, et non directement dans la phase mobile. Cet agent peut également être ajouté directement dans le mélange de peptides, après la digestion enzymatique.
On distingue donc deux mises en œuvre du procédé de l’invention :
1 ) L’IPR est injecté directement dans la colonne de chromatographie, grâce à un injecteur intégré au système ; il est donc « additionné dans la colonne de chromatographie » ; ou bien
2) L’IPR est additionné dans le mélange de peptides, qui peut également désigné par le terme « échantillon ».
Cette technique est particulièrement adaptée pour une analyse ultérieure des composés en spectrométrie de masse, l’IPR étant totalement élué de la colonne pendant l’étape de lavage et n’interférant donc pas avec l’étape suivante d’analyse des composés par spectrométrie de masse. De plus, ceci limite l’encrassement progressif du spectromètre de masse.
La figure 4 représente l’élution au cours du temps d’un I PR injecté en amont de l’analyse dans la colonne de chromatographie : celui-ci est détectable par spectrométrie de masse en mode négatif uniquement pendant une partie de l’analyse et non sur sa durée totale, contrairement au cas où l’IPR serait ajouté dans la phase mobile.
La figure 3 souligne quant à elle l’impact de la co-élution de l’IPR avec les peptides, sur l’intensité du signal mesurée par spectrométrie de masse. Lorsque la quantité d’IPR injectée est trop importante, sa zone d’élution coïncide avec celle des composés d’intérêts et cela entraine une chute drastique du signal relatif aux peptides.
L’agent d’appariement d’ion préféré est l’acide heptafluorobutyrique (HFBA), mais tout autre composé capable de former des paires d’ions pourra également être utilisé. La concentration en acide de la phase mobile a été optimisée afin de trouver le meilleur compromis possible entre le gain de rétention et la suppression du signal.
L’IPR est présent en une quantité suffisante pour ralentir l’élution des peptides de courte séquence, constitués de moins de 7 acides aminés. La personne de l’art saura adapter la concentration d’IPR en fonction de sa nature, des solvants utilisés et des types de peptides à retenir.
Le solvant utilisé dans la chromatographie en phase inverse est notamment une solution aqueuse d’acétonitrile (H2O/ACN 98/2; v/v) acidifiée avec 2% d’acide formique.
Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, l’acide heptafluorobutyrique est utilisé à une concentration d’au moins 0.4%, dans une solution aqueuse. La concentration d’acide heptafluorobutyrique peut aussi être comprise entre 0.4% et 0.6%, ou être égale à 0.4%, 0.5%, ou 0.6%.
L’IPR est soit injecté dans la colonne de chromatographie en amont de la séparation des peptides sur ladite colonne, soit ajouté au mélange de peptides avant son dépôt sur la colonne de chromatographie.
Peptides détectés dans le procédé selon l’invention
Selon une mise en œuvre de l’invention, la beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) dont la présence dans un échantillon est détectée grâce au procédé de l’invention est une enzyme de type TEM ou SHV.
Comme indiqué ci-dessus, le procédé de l’invention est particulièrement indiqué pour détecter des peptides de courte séquence (inférieure à 7 acides aminés).
Comme indiqué, la spectrométrie de masse (c’est-à-dire l’analyse par spectrométrie de masse) est ciblée, ce qui signifie que la présence de peptides particuliers est recherchée, ces peptides faisant partie d’une liste prédéfinie. On les désigne également par « peptides ciblés ».
Selon une mise en œuvre particulière, la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides constitués de 5 à 20 acides aminés. Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides choisis parmi le groupe de 34 peptides présentant les séquences suivantes : SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 34, tels que listés dans le tableau 1 ci- dessous.
Selon une mise en œuvre particulière du procédé, la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides ayant une courte séquence, c’est à dire étant constitués de moins de 7 acides aminés, en particulier les peptides constitués de 5 à 6 acides aminés, et tout particulièrement les peptides présentant les séquences suivantes :
- SGASER (SEQ ID NO. 7)
- SGAGK (SEQ ID NO. 8)
- SGTGK (SEQ ID NO. 9)
- SGAGER (SEQ ID NO. 21 ) - TGASER (SEQ ID NO. 25)
- TGASK (SEQ ID NO. 26) et
- TGAGER (SEQ ID NO. 33)
Selon une autre mise en œuvre particulière du procédé, les peptides ciblés sont tout particulièrement ceux indicatifs d’une activité BLSE de l’enzyme, et notamment les peptides présentant les séquences suivantes : - IHYSQNDLVK (SEQ ID NO. 4),
- LDHWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 5),
- LDSWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 6),
- SGASER (SEQ ID NO. 7),
- SGAGK (SEQ ID NO. 8),
- SGTGK (SEQ ID NO. 9),
- TGASER (SEQ ID NO. 25) et
- TGASK (SEQ ID NO. 26).
Enfin, selon une autre mise en œuvre du procédé, les peptides ciblés sont tout particulièrement ceux ayant une courte séquence et étant indicatifs d’une activité BLSE de l’enzyme, et en particulier les peptides présentant les séquences suivantes :
- SGASER (SEQ ID NO. 7),
- SGAGK (SEQ ID NO. 8),
- SGTGK (SEQ ID NO. 9),
- TGASER (SEQ ID NO. 25) et
- TGASK (SEQ ID NO. 26).
Echantillon biologique testé
Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, l’entérobactérie présente dans l’échantillon biologique est de l’espèce Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis ou Enterobacter cloacae.
L’échantillon sur lequel le procédé de l’invention est mis en œuvre est tout échantillon susceptible de contenir une souche bactérienne cible. Cet échantillon biologique peut être d’origine humaine ou animale.
Selon une mise en œuvre de l’invention, l’échantillon biologique est choisi parmi :
- Un fluide biologique tel que du sang, du sérum, du plasma, de l’urine, du liquide céphalorachidien ou des larmes,
- Une culture bactérienne telle qu’une hémoculture, une colonie sur gélose ou un bouillon de culture,
- Un échantillon alimentaire, tel que par exemple un échantillon de produit lacté, de viande, de poisson, d’œuf, de fruit, de légume ou d’une boisson, et
- tout autre type d’échantillon biologique, comme par exemple un prélèvement d’eau ou un prélèvement effectué sur une surface.
Il s’agira préférentiellement d’un fluide biologique, en particulier d’un échantillon sanguin (sang, sérum, plasma).
Il s’agira plus particulièrement d’une hémoculture positive. Par « hémoculture », on entend un échantillon de sang prélevé chez un patient puis incubé dans des conditions adéquates pour permettre une prolifération des éventuelles bactéries présentes dans ledit échantillon. Cette hémoculture pourra être réalisée dans des flacons d’hémoculture tels que ceux commercialisés dans la gamme Bact/Àlert distribuée par BioMérieux, ou ceux de la gamme Bactec distribuée par Becton Dickinson.
Kit
La présente invention concerne également un kit pour son utilisation dans la mise en œuvre du procédé tel que décrit ci-dessus, comprenant des réactifs permettant de mettre en œuvre du procédé, notamment :
- une enzyme permettant l’hydrolyse des protéines, telle que de la trypsine, et
- un agent d’appariement d’ion.
L’agent d’appariement d’ion pourra notamment être choisi parmi l’acide formique, les acides perfluorés tels que l’acide trifluoroacétique (TFA), l’acide pentafluoropropionique (PFPA) et l’acide heptafluorobutyrique (HFBA), ainsi que parmi les composés n-butyl, n- pentyl, n-hexyl, n-heptyl et n-octyl-1 -sulfonate.
De manière préférée, il s’agira de l’acide heptafluorobutyrique.
Optionnellement, un tel kit comprendra aussi des instructions de préparation et/ou d’utilisation, en particulier une notice précisant les conditions de mise en œuvre du procédé.
EXEMPLES
Les exemples présentés ci-après ont pour but d’illustrer le procédé selon l’invention, mais ne limitent en rien l’objet de l’invention.
Exemple 1 . Identification des peptides spécifiques des enzymes BLSE de type TEM et SHV
Afin de déterminer les peptides à suivre pour couvrir le maximum de variants possible des enzymes TEM et SHV, une étude préliminaire a été réalisée pour identifier les peptides spécifiques à ces deux enzymes, ainsi que les peptides spécifiques au caractère BLSE. Cette étude a été réalisée à l’aide de la base de données BLDB.
Ainsi, les peptides spécifiques des enzymes de type TEM, retrouvés dans plus de 95% des variants, sont SALPAGWFIADK (SEQ ID NO. 20), VDAGQEQLGR (SEQ ID NO. 22) et VGYIELDLNSGK (SEQ ID NO. 23). Le peptide VAGPLLR (SEQ ID NO. 2) est également retrouvé dans la quasi-totalité des variants de TEM (99%), mais ne peut pas être suivi en spectrométrie de masse comme marqueur spécifique de TEM. En effet, la protéine de SHV possède dans sa séquence le peptide très proche VAGPLIR (SEQ ID NO. 3) qui est de masse identique.
Les peptides spécifiques de SHV, retrouvés dans plus de 92% des variants, sont DTTTPASMAATLR (SEQ ID NO. 27), GIVALLGPNNK (SEQ ID NO. 28), QIGDNVTR (SEQ ID NO. 30) et QLLQWMVDDR (SEQ ID NO. 31 ). Les peptides VAGPLIR (SEQ ID NO. 3) et FPMMSTFK (SEQ ID NO. 1 ) sont également retrouvés dans la quasi-totalité des variants (>95%), mais ils ne peuvent pas être suivis pour caractériser spécifiquement SHV car on retrouve VAGPLLR (SEQ ID NO. 2, masse identique au peptide de séquence SEQ ID NO. 3) et FPMMSTFK (SEQ ID NO.
1 ) dans la séquence peptidique de l’enzyme de type TEM. L’étude des différentes mutations possibles de TEM montre que les peptides spécifiques indiquant une activité BLSE sont majoritairement : IHYSQNDLVK (SEQ ID NO. 4), LDSWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 6), LDHWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 5), SGASER (SEQ ID NO. 7), SGTGK (SEQ ID NO. 9), SGAGK (SEQ ID NO. 8).
De la même façon, les peptides spécifiques de l’activité BLSE chez SHV sont TGASER (SEQ ID NO. 25) et TGASK (SEQ ID NO. 26).
En analysant ces peptides par LC-MS/MS, il est possible d’identifier la totalité des variants de TEM et SHV les plus retrouvés en France en milieu hospitalier. Il est également possible d’identifier la majorité des variants à caractère BLSE existants disponibles sur le site BLDB : environ 90% des variants chez TEM et 75% chez SHV, sachant que ces chiffres sont probablement sous-estimés puisque la base de données est incomplète pour les variants les moins fréquents.
Les variants de TEM les plus fréquemment retrouvés en France sont reportés dans le TABLEAU 2. Les parties de la séquence protéique en gras dans le tableau correspondent aux peptides à suivre pour connaître le profil de résistance du variant étudié. Les variants de SHV les plus fréquemment retrouvés en France sont reportés dans le TABLEAU 3. Les parties de la séquence protéique en gras dans le tableau correspondent aux peptides à suivre pour connaître le profil de résistance du variant étudié.
Exemple 2. Ajustement des paramètres pour optimiser le temps de rétention des peptides
Plusieurs concentrations en acide heptafluorobutyrique (HFBA) ont été testées dans le cadre de la mise au point du procédé selon l’invention.
En pratique, 5 pL de solution d'HFBA ont été injectés dans la colonne de chromatographie avant l'injection de 5 L d'échantillon de mélange de peptides ; ce mélange de peptides est compris dans une solution aqueuse acide comprenant 2% d’acide formique (FA), cette acidification du milieu permettant de stopper la digestion enzymatique par la trypsine.
Les pourcentages suivants ont été testés :
- 0.05% de HFBA (3.8 mM)
- 0.1 % HFBA (7.6 mM)
- 0.2 % HFBA (16.2 mM)
- 0.3 % HFBA (23.8 mM)
- 0.4 % HFBA (31.4 mM)
- 0.5 % HFBA (38 mM)
Les résultats obtenus pour 7 peptides : SGASER (SEQ ID NO.7), SGAGER (SEQ ID NO.21 ), TGASER (SEQ ID NO.25), TGAGER (SEQ ID NO.33), SGAGK (SEQ ID NO.8), TGASK (SEQ ID NO.26), et SGTGK (SEQ ID NO.9), sont présentés en figure 2.
Il apparait clairement que la rétention des peptides constitués de 5 ou 6 acides aminés est satisfaisante à partir d’un pourcentage de 0.4 % (31 mM) de HFBA.
Exemple 3. Identification des profils de résistance (BLSE ou pénicillinase) de souches d’entérobactéries exprimant une enzyme de type TEM ou SHV
Les échantillons bactériens qui ont été analysés par LC-MS/MS sont reportés dans le tableau 4 ci-dessous. Ces échantillons sont des géloses (culture bactérienne), mais l’analyse qui est présentée peut également être effectuée avec des hémocultures. Tous ces échantillons ont été soumis à une digestion enzymatique. Le protocole qui a été utilisé est le suivant. Les 3 premières étapes sont facultatives et ne sont réalisées que si une pré-concentration de l’échantillon est nécessaire.
1) Centrifugation de 1 mL de culture bactérienne à 10000 rpm pendant 5 minutes
2) Elimination du surnageant, conservation uniquement du culot bactérien
3) Reprise de l’échantillon dans 200 pL d’eau (MS grade)
4) Ajout de bille de verre (environ 1 /3 du volume final)
5) Ajout de 50 pL d’une solution de trypsine (1 mg/mL dans du bicarbonate d’ammonium à 150 mmol)
6) Passage aux ultrasons (Bioruptor® de Diagenode), 10 cycles de 30 secondes ultrasons et 30 secondes de repos à 50° C
7) Arrêt de la digestion avec 5 pL d’acide formique
8) Centrifugation de l’échantillon à WOOOrpm pendant 5 minutes
9) Analyse du surnageant (mélange de peptides) par LC-MS/MS.
Les conditions chromatographiques pour les analyses sont les suivantes :
• Chaîne chromatographique : Agilent 1290 Infinity de Agilent Technologies
• Colonne : Waters XBridge® Peptide BEH C18, 2,1x100mm, taille de particule de 3,5mm, 130Â
• Four : PerkinElmer Series 200 Peltier Column
• Solvant A : Eau (H2O) + 0.1% d’acide formique
• Solvant B : Acétonitrile (ACN) + 0.1% d’acide formique
• Débit de phase mobile : 300 pL/min
• Température du four : 60° C
• Volumes d’injection : 5 pL de solution d’HFBA (0.4% dans H2O), puis 5 pL d’échantillon
Le gradient de phase mobile utilisé est présenté dans le TABLEAU 5 ci-dessous. Le programme utilisé pour l’injection est le suivant :
• Prélever 5 pL du vial contenant la solution d’HFBA
• Injecter
• Prélever 5 pL du vial contenant l’échantillon à analyser
• Injecter
Si le système utilisé ne permet pas de réaliser un programme d’injection, alors il est également possible d’utiliser deux méthodes chromatographiques à la suite pour analyser les échantillons. La première méthode serait en isocratique à 98% de phase mobile A et d’une durée de quelques secondes pour injecter l’acide en tête de colonne. La seconde méthode permettrait d’injecter l’échantillon et de l’analyser avec les conditions chromatographiques classiques décrites ci-dessus et le gradient de phase mobile présenté dans le TABLEAU 5.
Si la mise en place de ces deux méthodes d’analyse est un frein pour l’utilisateur, il est également possible de rajouter l’HFBA directement dans l’échantillon et de procéder à une simple injection, ce qui rajouterait une étape à la préparation d’échantillon.
La chromatographie liquide est couplée à un spectromètre de masse Sciex 6500+. Les peptides issus de la digestion enzymatique des souches bactériennes sont analysés par spectrométrie de masse en mode MRM (ionisation electrospray en positif). Des peptides spécifiques des enzymes de type TEM, SHV, ainsi que des peptides ribosomaux retrouvés dans les entérobactéries ont été monitorés. Les 42 peptides suivis dans la méthode sont décrits dans le TABLEAU 6 ci-dessous.
34 peptides sont issus d’une enzyme de type TEM et/ou SHV ; parmi ceux-ci, 8 sont indicatifs de l’activité BLSE de l’enzyme considérée ; et 8 peptides sont des peptides ribosomaux détectés dans un but de normalisation / quantification.
Tableau 6.
Les paramètres utilisés pour détecter les transitions citées dans le TABLEAU 6 sont :
• Les temps de rétentions des différents peptides
• Les rapports m/z (masse sur charges) du précurseur et des ions fragments • L’énergie de collision (CE - Collision Energy)
• Le potentiel de dissociation ou d’orifice (DP - Declustering Potential)
• Le potentiel en sortie de cellule de collision (CXP - Cell eXit Potential)
Ces paramètres sont décrits dans le TABLEAU 7 pour chacune des transitions.
Tableau 7.
Les autres paramètres de masse utilisés pour l’analyse de l’ensemble des échantillons sont :
Scheduled AARM Polarité : positive
Source d’ionisation : Turbo Spray
Fenêtre de détection MRM : 60 secondes
- Temps de cycle : 1 ,32 secondes
Potentiel d’entrée (EP - Entrance Potential) : 10 V
Gaz rideau (CUR - Curtain Gas) : 50 psi
Gaz de collision (CAD) : haut
- Tension de cône (IS - lonSpray Voltage) : 5500 V
- Température (TEM) : 550° C
Gaz auxiliaire 1 (Ion Source Gas 1 ) : 70 psi
Gaz auxiliaire 2 (Ion Source Gas 2) : 60 psi
Résolution Q1 : unité
Résolution Q3 : unité
Pause entre les changements de masse : 5,007 ms
Afin d’éviter tout encrassement de l’appareil causé par le volume mort, le début de l’analyse n’est pas analysé par spectrométrie de masse. L’ionisation des composés débute au bout de 1 ,2 minutes.
La détection de chaque peptide est validée si les transitions étudiées sont alignées, si les rapports d’intensité entre les transitions sont cohérents avec ceux de peptides synthétiques identiques à ceux analysés, et enfin si le seuil d’intensité détecté est équivalent au minimum à trois fois l’intensité du bruit pour la transition étudiée. Les résultats obtenus sont décrits dans les TABLEAU 8A, TABLEAU 8B, TABLEAU 8C. Le « - » correspond à l’absence de détection tandis que « oui » indique la présence du peptide. Lorsque la présence du peptide implique une activité enzymatique de type BLSE, le « oui » est en gras.
Tableau 8A.
Tableau 8B.
Tableau 8C.
Tous les échantillons testés présentent au minimum un peptide spécifique d’une enzyme de type TEM ou SHV. Les souches bactériennes testées sont donc résistantes a minima à l’action des pénicillines et des céphalosporines de première génération. Les échantillons Ech 1 , Ech 2, Ech 4, Ech 6, Ech 9, Ech 10, Ech 16, Ech 17, Ech 18, Ech 19, Ech 25, Ech 26, Ech 27, Ech 28, Ech 29, Ech 30 contiennent au moins un peptide spécifique du caractère BLSE de ces enzymes. Ces souches bactériennes sont donc résistantes aux pénicillines, aux céphalosporines de première à quatrième génération, et aux monobactames. Au moins un peptide parmi SGAGER, SGASER, SGAGK, SGTGK, TGAGER, TGASER et TGASK a été détecté dans les échantillons Ech 1 , Ech 3, Ech 4, Ech 6, Ech 7, Ech 9, Ech 1 1 , Ech 13, Ech 15, Ech 16, Ech 17, Ech 18, Ech 19, Ech 20, Ech 25, Ech 27, Ech 28, Ech 29 et Ech 30. La figure 1 montre un chromatogramme qui illustre la détection du peptide SGAGK (SEQ ID NO. 8) dans l’échantillon Ech 27.
Parmi les échantillons avec une activité enzymatique de type BLSE cités ci-dessus, les échantillons Ech 6 et Ech 9 ont eu leur profil de résistance correctement caractérisé grâce à l’identification de peptides à 6 acides aminés, respectivement TGASER (SEQ ID NO. 25) et SGASER (SEQ ID NO. 7), qui sont les seuls peptides spécifiques aux BLSE retrouvés dans ces échantillons.
La méthode d’analyse selon l’invention, utilisant l’HFBA pour mieux retenir certains peptides, permet donc d’identifier des souches d’entérobactéries à caractère BLSE qui n’auraient pas pu être détectées en conditions chromatographiques classiques (phase inverse et phase mobile usuelle).
Exemple 4. L’addition d’HFBA directement dans la colonne de chromatographie plutôt que dans la phase mobile permet de ne pas diminuer la sensibilité de détection du signal des peptides
Les figures 3 et 4 illustrent l’intérêt d’ajouter l’HFBA uniquement en amont de l’injection, c’est-à-dire directement sur la colonne de chromatographie.
Des peptides synthétiques de séquences TGASK, TGAGER, TGASER, SGAGER et SGASER ont été utilisés pour tester différentes conditions d’utilisation de l’HFBA, un agent d’appariement d’ions.
La figure 3 montre la perte de signal mesurée lorsque l’HFBA est mélangé à la phase mobile de chromatographie. Dans ce cas, l’HFBA co-élue avec les peptides d’intérêts.
Lors de leur détection par spectrométrie de masse en tandem, la quantité de signal des peptides TGASK, TGAGER, TGASER, SGAGER, SGASER est divisée par 5, voire par 8 pour le peptide TGASK. Pour SGAGK, le signal est divisé par 2, probablement parce que son pic chromatographique co-élue seulement partiellement avec celui de l’HFBA. Enfin, pour SGTGK, ce dernier ne co-élue pas dans les conditions de l’expérience avec l’HFBA, il n’y a donc pas de suppression d’ions de son signal.
La figure 3 souligne l’impact de la co-élution de l’IPR avec les peptides, sur l’intensité du signal mesurée par spectrométrie de masse. Lorsque la quantité d’IPR injectée est trop importante, sa zone d’élution coïncide avec celle des composés d’intérêts et cela entraine une chute drastique du signal relatif aux peptides.
La figure 4 est un chromatogramme obtenu en suivant, exclusivement en mode négatif, le signal de l’HFBA. La quantité d’HFBA injectée en amont de l’analyse est de 30 mM.
La méthode chromatographique utilisée est la même que celle utilisée pour l’analyse des peptides ci-dessus. Cette figure représente L’élution au cours du temps de l’HFBA : la zone d’élution de l’HFBA est répartie uniquement sur une partie du chromatogramme, qui correspond à la zone située après l’élution des peptides à cinq et six acides aminés. Ainsi, celui-ci est détectable uniquement pendant une partie de l’analyse, et non sur sa durée totale, contrairement au cas où l’IPR serait ajouté directement dans la phase mobile.
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EP 2 699 692
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type bêtalactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR) additionné dans la colonne de chromatographie ou dans le mélange de peptides.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l’IPR est présent en une quantité suffisante pour ralentir l’élution des peptides de moins de 7 résidus d’acides aminés.
3. Procédé selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIA/SWATH).
4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’agent d’appariement d’ion est l’acide heptafluorobutyrique.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l’acide heptafluorobutyrique est présent dans une solution aqueuse à une concentration d’au moins 0.4%.
6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’hydrolyse des protéines bactériennes à l’étape (a) est une hydrolyse enzymatique, en particulier est une hydrolyse par la trypsine.
7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides constitués de 5 à 20 acides aminés.
8. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides choisis parmi le groupe de 34 peptides présentant les séquences suivantes : SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 34.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides choisis parmi le groupe de 7 peptides présentant les séquences suivantes : - SGASER (SEQ ID NO. 7)
- SGAGK (SEQ ID NO. 8)
- SGTGK (SEQ ID NO. 9)
- SGAGER (SEQ ID NO. 21)
- TGASER (SEQ ID NO. 25)
- TGASK (SEQ ID NO. 26)
- TGAGER (SEQ ID NO. 33).
10. Procédé selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’entérobactérie est de l’espèce Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis ou Enterobacter cloacae.
11. Procédé selon l’une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est choisi parmi :
- Un fluide biologique tel que le sang, le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalorachidien ou les larmes,
- Une culture bactérienne telle qu’une hémoculture, une colonie sur gélose ou un bouillon de culture,
- Un échantillon alimentaire, et
- tout autre type d’échantillon biologique.
12. Kit pour son utilisation dans la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications
1 à 11 , comprenant de la trypsine et de l’acide heptafluorobutyrique.
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