EP4526428A1 - Micro-impression d'anticorps et de biomolecules pour le phenotypage et l'activation cellulaires - Google Patents

Micro-impression d'anticorps et de biomolecules pour le phenotypage et l'activation cellulaires

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EP4526428A1
EP4526428A1 EP23723218.6A EP23723218A EP4526428A1 EP 4526428 A1 EP4526428 A1 EP 4526428A1 EP 23723218 A EP23723218 A EP 23723218A EP 4526428 A1 EP4526428 A1 EP 4526428A1
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EP
European Patent Office
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zone
antibody
cell
cells
type
Prior art date
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Pending
Application number
EP23723218.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Olivier THEODOLY-LANNES
Philippe Robert
Geoffrey DELHAYE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Aix Marseille Universite
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • the invention generally relates to the field of quantification of the expression of membrane molecules and cellular functions.
  • the invention relates more particularly to a functional test for clinical immunology.
  • lymphocyte functions in particular flow cytometry, lymphocyte proliferation and the production of cytokines.
  • a “CD45 antibody” will designate the antibody targeting the marker designated by “CD45” in the nomenclature of classes or “clusters” of differentiation.
  • a “CDx antibody” where x is a natural number, such that CDx belongs to the nomenclature of “clusters” of differentiation will designate an antibody targeting the family of membrane glycoproteins or marker or antigen or membrane antigen designated by “CDx”.
  • membrane protein for a cell will mean any glycoprotein present on the external surface of the cell and capable of forming a bond, with a specific antibody, in particular:
  • CD3 is a membrane protein as described in the document “A novel Leukocyte Adhesion Deficiency III variant: Kindlin 3 defect results in integrin and non-integrin related defects in different steps of leukocyte adhesion” (Philippe Robert, J Immunol May 1, 2011, 186 (9) 5273-5283; DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1003141)
  • CD4 is a membrane protein as described in the document “A microfuidic device for practical label -free CD4+ T cell counting of HIV-infected subjects. » (Xuanhong Cheng-Lab on a chip 2007, Volume 7 Issue 2 170-178 doi: 10.1039/b612966h).
  • the membrane protein will be a membrane protein for adhesion to the substrate, the adhesion in question then being measured by the energy of the antigen-antibody bond and such as to maintain the cell at a distance from a substrate equal to the length of the antigen-antibody bond and have a detectable optical effect.
  • Antigen-antibody binding energy is generally measured by the terms “affinity” or binding stability by “avidity” for multivalent antigens and antibodies.
  • antibody designates both a specific antibody and one having cross-reactivity, both monovalent and multivalent; that is to say any known antibody capable of being deposited on a biocompatible substrate and of binding to a membrane protein.
  • the name antibody within the meaning of the present application may be understood to mean molecules which are not designated by "antibodies” in the prior art but which are capable of assemble to another molecule by a protein domain coming from an antibody, for example in the case of CAR T cells which adhere to their ligand via a chimeric antibody domain.
  • the antigen-antibody bonds considered in the present application are those which maintain the antigen fixed in the antibody site and which are, according to the prior art, of non-covalent nature. This includes hydrogen bonds, electrostatic bonds, Van der Waals forces and hydrophobic bonds. Multiple bonds between the antigen and the antibody ensure a stable interaction between these two molecules and those considered in the present request, are those which make it possible to physically maintain the cell at a fixed distance from a substrate and therefore to use physical means to detect the presence of the cell in the vicinity of the substrate, in particular optically.
  • interferential optical reflection or “interferential reflection contrast microscopy” designate in the present application the technique known in English by the acronym IRM (Interferential Reflection Microscopy).
  • the present application relates to a device which comprises a substrate comprising a first zone on which a protein capable of binding to a first membrane molecule is adsorbed and comprising a second zone on which an antibody targeting a second membrane molecule is adsorbed, in which the first zone and the second zone extend together in length over a dimension comparable to the length of a cell.
  • the present application relates to a device characterized in that it comprises a substrate, the substrate comprising a first zone on which is adsorbed a protein capable of binding specifically to a cell by interacting with a first membrane molecule and comprising a second zone on which is adsorbed an antibody targeting a second membrane molecule expressed on the surface of said cell, said first zone representing a first surface defining a first area A1, said second zone representing a second surface, defining a second area A2, where l The total area represented by the sum of areas Al and A2 is less than or equal to the area of the projected surface of said cell in suspension ( Figure 1).
  • the device comprises two zones which are organized so that a cell can interact with the first zone, or the second zone, or both zones simultaneously.
  • the objective is to detect the covering of the first zone or the second zone or both zones and thus to phenotype the cell determined using the protein and the antibody each adsorbed respectively on the first and the second zone.
  • the first and the second zone have a particular configuration so that the total area corresponding to the sum of the area of the first and the second zone is less than or equal to the area of the projected surface of said cell.
  • said cell is capable of recognizing the protein adsorbed on the first zone, said cell will adhere to it, which will form a contrast in an optical microscope by contrast interference in reflection in the first zone which will appear dark, the second zone remaining clear in appearance ( Figure 2B).
  • said cell having interacted with the first zone is capable of interacting with the antibody adsorbed on the second zone, the cell adhering to the first zone will spread over the second zone to adhere there, which will form a contrast in an optical microscope by contrast in reflection (which is a possible mode of revealing the signal generated by the device) in the second zone which will also appear dark (Figure 2C).
  • Figure 2A Figure 3
  • projected surface of a suspended cell we mean in the invention the plane defined by the largest dimensions of a cell when the latter is observed from above.
  • the projected surface will be the disk of radius r, r being the radius of the perfect sphere.
  • the projected surface will then have an area 7ir 2 and total area (A1+A2) will be less than 7ir 2 .
  • Length being the largest dimension of a two-dimensional or three-dimensional geometric shape (as opposed to width and height).
  • a two-dimensional shape has an area less than or equal to its length squared; a three-dimensional shape has a projected area less than or equal to its length squared.
  • the device can be made with different geometric shapes, it is defined in the invention according to the length of the cells with which the device is likely to interact. In other words, we will define the device and the zones it contains according to the cell considered.
  • the cells in suspension correspond either to cells which spontaneously are non-adherent (blood or hematopoietic cells), or adherent cells which have been detached from their support (for example by treatment with trypsin).
  • the first membrane molecule is a membrane molecule common to a first type of cells and in which the second membrane molecule is a membrane molecule common to a subtype of the first type of cells.
  • the first membrane molecule is a membrane molecule common to a first type of cells and in which the second membrane molecule is a membrane molecule common to a second type of cells capable of interacting with the first type of cells.
  • the protein is an antibody targeting CD4 and the antibody is an antibody targeting CD8.
  • the protein is an antibody targeting CD3.
  • the antibody is an antibody targeting CD69.
  • the antibody is an antibody targeting CD25.
  • the antibody is an antibody targeting CD107.
  • the antibody is an anti-collagen antibody.
  • the antibody is an antibody targeting CD86.
  • the device makes it possible, via the protein adsorbed on the first zone, to identify a cell, and the antibody adsorbed on the second zone also makes it possible to identify the cell, for example to confirm its phenotype.
  • An example of this device comprises absorbed on the first zone a protein which is an antibody targeting the CD3 antigen and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting any one of the CD4 or CD8 antigens, or a mixture of those -this.
  • the device makes it possible, via the protein adsorbed on the first zone, to identify a cell, and the antibody adsorbed on the second zone makes it possible to activate the cell, for example to induce a new cellular function, or even induce cellular differentiation.
  • a device examples include:
  • the protein adsorbed on the first zone is an antibody targeting the CD45RO antigen and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting the CD3 antigen, or a mixture of antibodies targeting the CD3 antigen and the CD28 antigen , Or
  • the protein adsorbed on the first zone is an antibody targeting the CD56 or CX3CR1 antigen and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting the CD20 antigen (rituximab), or ii - the protein adsorbed on the first zone is an antibody targeting the CD 14 antigen and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting any of the CD 16, CD32 or CD64 markers, or targeting membrane lipopolysaccharides (LPS).
  • LPS membrane lipopolysaccharides
  • the device allows, via the protein adsorbed on the first zone, to activate a cell, and the antibody adsorbed on the second zone makes it possible to detect a cellular response in the form of expressed membrane molecules, such as of activation or senescence, i.e. read this answer.
  • a cellular response in the form of expressed membrane molecules such as of activation or senescence
  • the protein adsorbed on the first zone is CD 19 or a chimeric protein comprising CD 19 and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting any of the antigens CD69, CD107, CD25, CD57, TIM-3 and LAG -3, or - the protein adsorbed on the first zone is an antibody targeting the CD20 antigen (rituximab) and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting the CD107 antigen.
  • the device makes it possible, via the protein adsorbed on the first zone, to identify a cell, and the antibody adsorbed on the second zone makes it possible to detect a cellular response in the form of expressed membrane molecules, such as of activation or senescence, i.e. read this answer.
  • a cellular response in the form of expressed membrane molecules such as of activation or senescence
  • An example of such a device is such that the protein adsorbed on the first zone is CD 19 and the antibody adsorbed on the second zone is an antibody targeting any one of the antigens CD69, CD 107, CD25, CD57, TIM- 3 and LAG-3.
  • a device as defined above is also described, in which the first membrane molecule is a membrane molecule expressed on the surface of a first cell type and in which the second membrane molecule is a membrane molecule expressed on the surface of a subtype of said first cell type, said subtype of said first cell type expressing on its surface said first and said second membrane molecules.
  • the present application also relates to a process which comprises the following steps:
  • the present application also relates to a variant of the method for quantifying and monitoring the kinetics of cell activation, which comprises the following steps:
  • the present application also relates to a variant of the method for selecting a cell type and for triggering its activation, which comprises the following steps: - adsorb on a substrate a protein capable of binding to a first membrane molecule common to a first type of cells, in a first zone of subcellular dimensions,
  • the present application also relates to a variant of the method for detecting cell membrane molecules, which comprises the following steps:
  • the present application also relates to a variant of the method for detecting an interaction of two cells, which comprises the following steps:
  • a substrate to characterize the state of activation or differentiation of a specific cell in a population of cells
  • said substrate comprising a first zone on which a protein is adsorbed capable of binding specifically to said determined cell by interacting with a first membrane molecule specific to said determined cell and comprising a second zone on which is adsorbed an antibody targeting a second membrane molecule expressed on the surface of said determined cell, said first zone representing a first surface defining a first area Al, said second zone representing a second surface, defining a second area A2, where the total area represented by the sum of the areas Al and A2 is less than or equal to the area of the projected surface of said cell in suspension, said second membrane molecule being expressed on the surface of said determined cell when said cell is activated or differentiated.
  • the invention is based on a method which makes it possible to analyze phenotypically and at the single cell level, in particular the activation properties of immune cells as illustrated in Figures 1 to 5
  • the method can use optical microscopy to generate multiple micropatterns of different proteins and subcellular sizes ( Figure 3), and these microengineered substrates are capable of performing multiple functional assays on suspensions of immune cells or whole blood, such as (i) selecting/identifying a cell type of interest, (ii) triggering an activation signal, and (iii) reading the kinetics of activation immune.
  • the invention is not limited to such optical microscopy, and any instrument projecting ultraviolet rays (for example a confocal microscope) or any (micro-)imprinting technique can also be used. A person skilled in the art will be able to determine the most appropriate instrumentation.
  • micropattern proteins which are generally antibodies with specific affinities and effective actions.
  • the cell membrane of the suspension expresses the antibody target on the substrate, the cell spreads over the corresponding pattern ( Figure 2) and the imprint of cell adhesion can be detected by interferometric microscopy ( Figure 2).
  • Detection is not limited to reflection interference contrast imaging, and detection by transmission imaging and image collection to detect cell outline can also be used.
  • those skilled in the art will be able to determine which technique is most appropriate.
  • micropattern The different functions performed by the micropattern can be evaluated by taking a single image and analyzing the spread of cells in each pattern. Importantly, reading does not require any of the tedious manipulations usually involved in immunostaining-based techniques (cell preparation, incubations, rinsing). In a typical interference microscopy image, dark areas indicate adhesion and light areas non-adhesion ( Figure 2 and 3). In practice, the operator's tasks are limited to placing the smart substrate on a dedicated optical microscope and depositing the cell sample on the substrate.
  • Figure 1 in A, example of a printed pattern shown in plan at the top, and in section at the bottom.
  • the pattern has two concentric zones (1 and 2) each carrying an antibody of a particular specificity, in the example CD3 in the center (1) and CD69 in the periphery (2).
  • B example of a circulating cell (a T lymphocyte) represented at the same scale, of which a membrane marker is represented on its surface (CD3 here), which would be likely to interact with the central zone of the pattern.
  • the largest dimension of the pattern (10pm) is less than that of the cell (12pm).
  • Figure 2 examples of interactions of different cells with a pattern identical to that of Figure 1, with a side view at the top, and at the bottom a plan view of the signal obtained in interference contrast in reflection (which is a possible mode revealing the signal generated by the device).
  • A example of interaction between a cell not carrying a membrane marker corresponding to the specificities of the antibodies present.
  • a B lymphocyte (whose marker CD20 is shown) does not express a membrane ligand to interact with the pattern antibodies and does not adhere to the surface; the resulting appearance in interference contrast in reflection is an absence of signal.
  • B example of interaction between a cell carrying a single type of membrane marker corresponding to one of the specificities of the antibodies present on the pattern.
  • An unactivated T cell expresses CD3 but not CD69.
  • CD3 molecules are captured by antibodies in the central area of the pattern, and its membrane therefore adheres to this zone. This causes the appearance of the interfering contrast! el for the central area of the pattern.
  • C example of interaction between a cell carrying the two types of membrane markers corresponding to the specificities of the two types of antibodies present on the pattern.
  • CD3 molecules are captured by the antibodies in the central area of the pattern, and its CD69 molecules are captured by the antibodies present in the peripheral area of the pattern; its membrane therefore adheres to both areas. This causes the appearance of interference contrast for the central zone and the peripheral zone of the pattern.
  • Figure 3 Examples of real images obtained during an experiment carried out with the type of pattern described in Figures 1 and 2, repeated to form an array of patterns on a glass slide.
  • A transmission light microscope image, showing T cells each adhered to a pattern location in the matrix. Some locations did not capture a cell.
  • B appearance resulting in interference contrast in reflection at the same magnification showing that each cell having adhered to a pattern in A produces a contrast on the central area of the pattern in B, identifying each cell as expressing CD3 on its surface and therefore being a cell T.
  • a portion of the cells produces a more or less complete contrast on the peripheral zone of the pattern to which it adheres, identifying these cells as expressing CD69 on their surface and therefore as activated T cells.
  • Figure 4 examples of possible patterns with two zones, each carrying a type of antibody with a particular specificity (identical to the patterns described in Figures 1 and 2).
  • the total dimensions of the pattern remain less than 10 pm, which is less than the suspended dimension of the targeted cell type (here, leukocytes).
  • Figure 5 examples of a pattern with three zones, each carrying a type of antibody with a particular specificity. The total dimensions of the pattern remain less than 10 pm, which is less than the suspended dimension of the targeted cell type (here, leukocytes).
  • the invention can be carried out for the substrate by means of LIMAP technology which makes it possible to align and adsorb proteins on substrates covered with a PEG (Polyethylene Glycol) brush exposed in an ultraviolet light pattern, which makes it possible to obtain specific adhesion of a protein in the exposed areas.
  • LIMAP LIMAP technology
  • PEG Polyethylene Glycol
  • a first zone (1) is printed locally by the combined action of a photo-initiator (PLPP, Alvéole), placed in solution on a PEG-SVA brush and subjected to a projection of an ultraviolet pattern at 375 nm (step 1).
  • a first antibody is then incubated for 12 hours at 4°C (step 2).
  • a second zone (2) is printed by LIMAP (step 3).
  • a second antibody is deposited there then incubated for 12 hours, at 4°C (step 4).
  • the second antibody adsorbs non-specifically to the second zone (i.e. not limited to the most recently illuminated pattern), because it is also adsorbed in the first zone.
  • the anti-fouling substrate (PEG brush) is in fact made adhesive in the first zone by the first illumination and in the second zone by the second illumination, which implies for the second antibody to adsorb not only in the second zone but also in the first zone. Verification of these properties can be done for example by epifluorescence, using distinct fluorescence markers for the antibodies and observing them using interference filters isolating the wavelength of each fluorescence marker.
  • the best passivation solution found is PEG-SVA at 0.23 mg/ml of lOmM baking soda in Milli-Q water for 15 minutes at room temperature.
  • LIMAP technology can be used to produce a periodic pattern comprising two potential adhesion zones for cells: one specific for T lymphocytes as a whole and one for activated T cells. It will also be possible to create as many adhesion zones as necessary by illuminating each zone, exposing it to an antibody chosen for the zone, then passivating then illuminating the next zone and so on.
  • the zone taken as a pattern of a spatially periodic structure will be duplicated in a spatially periodic manner, by shifting the pattern on the substrate to allow deposition of the same antibody and passivation in a single operation, of all the illuminated patterns.
  • the duplication will be carried out conveniently, in a known manner, by LIMAP technology, in which a matrix of micro-mirrors is used to produce the periodic pattern and is imaged on the substrate in ultraviolet light, in one go.
  • each antibody is only adsorbed in its zone, i.e. in a manner specific to this zone, the antibodies are adsorbed in contiguous zones forming a pattern of length, that is to say of larger geometric dimension, comparable, i.e. that is to say less than or equal to the length (i.e. again the largest of the geometric dimensions) of the cell to be adhered and with patterns spaced so that a single cell can adhere to each pattern.
  • a pattern of length that is to say of larger geometric dimension, comparable, i.e. that is to say less than or equal to the length (i.e. again the largest of the geometric dimensions) of the cell to be adhered and with patterns spaced so that a single cell can adhere to each pattern.
  • Those skilled in the art will be able to adapt, through simple execution operations, the shape, the length of each zone and the distance between the patterns to ensure, for a particular type of cell, that only one cell adheres per pattern and in a given order of adhesion or a given spatial configuration of adhesion.
  • aCD45RO type (“antibody targeting CD45RO”) delimited inside a circle
  • a second adhesion zone of the aCD69 type (“antibody targeting CD69”) delimited on a circular ring concentric with the first zone.
  • a first adhesion zone of the aCD45RO type (“antibody targeting CD45RO”) mixed with aCD3 and aCD28 to make all the memory T lymphocytes adhere (all expressing CD45RO) then trigger the activation of the cells having adhered (by CD3+CD28), the first zone still being delimited inside a circle and the same second zone of aCD69 type adhesion (“antibody targeting CD69”) delimited on a circular ring concentric with the first zone to adhere only activated memory T lymphocyte cells which specifically express CD69.
  • the device of the invention can therefore be used in a versatile manner either statically for phenotyping activated memory T lymphocytes, or dynamically for monitoring activation of naive memory T lymphocytes by adding to a common adhesion antibody to all memory T cells, a memory T cell antibody.
  • Such a device can be adapted without difficulty to any type of cell that can be activated.
  • This size is of the order of a few micrometers, for example from 4pm to 12.5pm to cause the adhesion of a single immune cell.
  • the CD45 antibody or a CD45/CD3/CD28 mixture of antibodies as long as it causes non-specific adhesion of any activated T lymphocyte. or not activated, in particular memory T lymphocytes.
  • each second zone the CD69 antibody or a mixture of antibodies containing it such as CD69+CD25 or a third contiguous zone containing CD25, as long as it causes the specific adhesion of all activated T lymphocytes, in particular memory T lymphocytes. It will also be possible to deposit only CD25, to observe secondary T lymphocyte activation rather than primary activation (i.e. temporally preceding the secondary) with CD69 or rather than both with CD69+CD25. We can follow the activation kinetics in a known manner using MRI microscopy, the light zones revealing non-adhesion, which implies that the non-activated T lymphocytes will have a first dark zone and a second zone which is even lighter. that adhesion will be weak or their distance from the substrate will be strong or that their activation will be weak.
  • the shape of the area printed or deposited or covered with an antibody may be contained in a circle or in a ring.
  • a pattern suitable for the first zone is a disc and a pattern suitable for the second zone is a ring concentric with the disc, both of maximum dimension equal to around ten microns.
  • adhesion on the ring of a pattern is synonymous with activation of the T lymphocyte captured on the pattern and the absence of adhesion on the ring is characteristic of a non-activated T lymphocyte.
  • the appearance of the ring of a pattern is synonymous with activation of the T lymphocyte captured on the pattern and the absence of appearance of the ring is characteristic of a non-activated T lymphocyte.
  • a first antibody allowing the adhesion of any T lymphocyte, activated or non-activated (i.e. an antibody not specific for lymphocytes activated T lymphocytes) then to deposit in a second micrometric zone a second antibody allowing the adhesion of any activated T lymphocyte (i.e. an antibody specific for activated T lymphocytes)
  • the invention therefore makes it possible to monitor in real time, from the start of an infection or a transplant, the activation of the immune functions of T lymphocytes.
  • the CD20 antibody could be used in place of the CD45RO antibody.
  • non-limiting and in particular, non-concentric zones may be in the teaching of the present application for certain types of cells.
  • the present application thus describes a widely distributed and easily adaptable tool for the study of various cells and their states, in a quantitative and qualitative manner with a test that can be carried out with only a microscope equipped for MRI for the observation of the results and conventional means of preparing cells either without a particular state or with.
  • This tool can be used in particular as new clusters of differentiation and their associated antibodies are discovered.
  • the invention is capable of industrial application in the field of tests for clinical immunology and oncology, in the field of cellular tests for pharmaceutical research, and in the field of cellular tests for fundamental research.
  • the invention is intended to carry out cellular phenotyping tests.
  • an antibody targeting CD3 can be deposited in a mixture with an antibody targeting CD28 in a first zone, an antibody targeting CD4 in a second zone, an antibody targeting CD8 in a third zone, an antibody targeting CD69 in a fourth zone.
  • the antibody targeting CD69 could be replaced by an antibody targeting CD25 or a fifth zone could be added with the antibody targeting CD25.
  • an anti-CD 16 antibody can be deposited in a first zone, an antibody targeting CD56 in a second zone, and an antibody targeting CD 107 in a third zone.
  • an anti-CD 16 antibody can be deposited in a first zone, an antibody targeting CD 14 in a second zone, and an antibody targeting CD86 in a third zone.
  • the antibody targeting CD16 could be replaced by an antibody targeting CD32.
  • the invention aims to carry out cellular activation tests during intercellular interactions.
  • an anti-CD 14 antibody can be deposited in a first zone and an antibody targeting CD69 in a second zone.
  • the antibody targeting CD69 could be replaced by an antibody targeting CD25.
  • CD 16 known to bind K562 target cells, can be deposited in a first zone and an antibody targeting CD 107 in a second zone.
  • the invention can be completed by adding one or more zones each containing a protein targeting a membrane molecule or an antibody targeting a membrane molecule of a cell type selected by the zones of the modes described above. .
  • Application example 1 Substrates selecting lymphocytes, without substrate activation and with substrate activation readout.
  • APTS (200pL/slide): in milliQ water + 1% (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTS) (ref A3648 Sigma-Aldrich) + 0.03% acetic acid 196pL milliQ water + 2p acetic acid 3 % + 2pL APTS
  • PEG-SVA solution (10pL/well): milliQ water, lOmM of carbonate buffer at pH 8.5 and 23% PEG-SVA (mPEG-SUCCINIMIDY VALERATE MW 5000Da, ref: 109681 INTERCE1IM).
  • PEG-SVA mPEG-SUCCINIMIDY VALERATE MW 5000Da, ref: 109681 INTERCE1IM.
  • final solution 36pL milliQ water, 4pL of 100mM carbonate buffer and 0.0092g of PEG S VA
  • Anti-CD3-CD28 Antibody Deposition at respectively 100pg/ml-100pg/ml-50pg/ml (final volume 20pl/well) For one well: 2pl of CD3 and CD28, Ipl CD45, 15pl of PB S
  • Anti-CD69 Antibody Deposition at 1OOpg/ml (final volume 20 ⁇ l/well)
  • Anti hCD45 Ab ref NBP2-34804, clone SPM570, NovusBio
  • Anti hCD3 Ac Ultra leaf purified, ref 300438, clone UCHT1, Biolegend
  • Anti hCD28 Ac Ultra leaf purified, ref 302933, clone CD28.2, Biolegend
  • Anti hCD69 ac ref MAB2359, clone 298633, R&D system.
  • Application example 2 Substrates selecting and identifying memory T lymphocytes, with activation by the substrate and readout of activation by the substrate.
  • Figure 3 gives an example of measurement in a device with micropatterns designed to accommodate single T cells and to detect their activation by the TCR complex. These patterns were composed of two distinct zones, each with a specific function: the central zone contained anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody to select and activate T cells, and the side zone contained anti-CD69 antibody to read CD69 expression of activated cells. The interferometric reading is shown in Figure 3B, right. We can see that some anti-CD69 areas are dark, which means that these cells Captured T cells are activated in this experiment (confirmed by immunofluorescence).
  • This example illustrates the concept of "smart" substrates featuring multiple antibodies, which is very flexible and adaptable to different applications and cell types by choosing the printed antibodies accordingly.
  • the technology described in the present invention allows functional assays allowing personalized use of new immunotherapies by monitoring the activation of immune cells. Evaluating the effectiveness of immunotherapies and stratifying patients as potential responders can optimize the use of these expensive treatments. This is an important medical issue. Functional explorations are most often too slow and too complex to be translated into clinical contexts where the costs of human manipulation and expertise are very restrictive, and remain the domain of academic research.
  • the technology developed by the inventors of "smart" substrates with multiple functional micropatterns makes it possible to measure leukocyte activation in a few hours and can effectively address an unmet need for the development of rapid, clinically accepted functional assays.
  • Table 1 Antibodies and proteins relevant to micropatterns capable of carrying out specific functions (identification, selection, activation, stimulation, response reading) with different cell types.
  • glass slides (SCHOTT Nexterion) are treated with plasma for 15 minutes and mounted with a PDMS mold (P olydimethyl siloxane, Sylgard 184) so as to obtain channels.
  • PDMS mold P olydimethyl siloxane, Sylgard 184
  • a solution of APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane, Sigma) diluted to 1% in milliQ water with 0.03% acetic acid is incubated on the glass for 2 hours at 4°C. The surface is then rinsed with water and placed for 15 minutes at 95°C.
  • a solution of PEG-SVA (MW: 5000 Da, INTERCHIM) in a carbonate buffer (NaHCO3) at 10 mM is then incubated on the glass for 12 hours at 4°C.
  • the canal is then rinsed with water and a solution of PLPP (15.5 mg.mL-1, Alveole) is introduced into the canals and agitated using a syringe pump (NEMESYS, Cetoni) with a flow of 4pL.s -1 during the entire insolation.
  • the surface is exposed with a UV dose of 3000 mJ.mnr 2 to create the attachment pattern via the PRIMO platform (Alveole), then incubated with

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Abstract

Dispositif qui comprend un substrat comprenant une première zone (1) sur laquelle est absorbée une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire et comprenant une deuxième zone (2), sur laquelle est absorbé un anticorps, ciblant une deuxième molécule membranaire, dans lequel la première zone et la deuxième zone s'étendent ensemble en longueur sur une dimension comparable à la longueur d'une cellule.

Description

MICRO-IMPRESSION D’ANTICORPS ET DE BIOMOLECULES POUR LE PHENOTYPAGE ET L’ACTIVATION CELLULAIRES
DOMAINE TECHNIQUE :
L’invention concerne en général le domaine de la quantification de l’expression de molécules membranaires et de fonctions cellulaires.
L’invention concerne plus particulièrement un test fonctionnel pour l’immunologie clinique.
ART ANTERIEUR :
En sciences biologiques et en médecine, il est très souvent nécessaire d’identifier des types cellulaires et de quantifier leurs fonctions. La présence de molécules particulières à la membrane cellulaire est en particulier un moyen classique et efficace de faire cette identification. Si on prend l’exemple de l’immunité, qui est impliquée très fortement dans la plupart des maladies, la quantification fine et rapide des fonctions immunitaires des êtres humains est d’une grande importance pour déceler rapidement le développement d’une pathologie infectieuse ou l’issue d’une greffe d’organe, le choix de traitements et le suivi de leur efficacité.
La connaissance des réponses précoces du système immunitaire face à un agent pathogène, est ainsi essentielle, dans le diagnostic ou l’application thérapeutique de traitements adaptés.
L’art antérieur connaît ainsi différentes techniques de quantification des fonctions lymphocytaires, notamment la cytométrie de flux, la prolifération lymphocytaire et la production de cytokines.
L’art antérieur connaît aussi l’impression micrométrique de protéines sur un substrat antisalissures (technologie LIMAP) et la technologie de microscopie interférentielle par réflexion (IRM) qui permet de visualiser des zones d’adhérence entre des objets transparents micrométriques.
Toutefois, la visualisation rapide des réponses du système immunitaire est, pour l’art antérieur, un problème difficile alors qu’un besoin de longue date existe dans ce domaine.
Au sens de la présente demande, un « anticorps CD45 » désignera l’anticorps ciblant le marqueur désigné par « CD45 » dans la nomenclature des classes ou « clusters » de différenciation. De façon générale, un « anticorps CDx » où x est un entier naturel, tel que CDx appartient à la nomenclature des « clusters » de différenciation désignera un anticorps ciblant la famille de glycoprotéines membranaires ou marqueur ou antigène ou antigène membranaire désigné par « CDx ».
Au sens de la présente demande, on désignera par protéine membranaire pour une cellule, toute glycoprotéine présente à la surface externe de la cellule et apte à former une liaison, avec un anticorps spécifique ainsi notamment :
- CD3 est une protéine membranaire comme décrit dans le document « A novel Leukocyte Adhesion Deficiency III variant : Kindlin 3 defect results in integrin and non-integrin related defects in different steps of leukocyte adhesion «(Philippe Robert, J Immunol May 1, 2011, 186 (9) 5273-5283; DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1003141 )
- CD4 est une protéine membranaire comme décrit dans le document « A microfuidic device for practical label -free CD4+ T cell counting of HIV-infected subjects. » (Xuanhong Cheng- Lab on a chip 2007, Volume 7 Issue 2 170-178 doi : 10.1039/b612966h).
Si l’anticorps est déposé sur un substrat, la protéine membranaire sera une protéine membranaire d’adhésion au substrat, l’adhésion en cause étant alors mesurée par l’énergie de la liaison antigène-anticorps et de nature à maintenir la cellule à une distance d’un substrat égale à la longueur de la liaison antigène-anticorps et avoir un effet optique détectable.
L’énergie de la liaison antigène-anticorps est mesurée généralement par les termes « affinité » ou la stabilité de la liaison par « avidité » pour les antigènes et anticorps multivalents.
Au sens de la présente demande, « anticorps » désigne aussi bien un anticorps spécifique qu’ayant une réactivité croisée, aussi bien monovalent que multivalent ; c’est-à-dire tout anticorps connu apte à être déposé sur un substrat biocompatible et à se lier à une protéine membranaire.
Notamment, dans des cas intéressant des protéines chimériques ou autres, le nom d’anticorps au sens de la présente demande, pourra s’entendre pour des molécules qui ne sont pas désignées par « anticorps » dans l’art antérieur mais qui sont aptes à s’assembler à une autre molécule par un domaine protéique provenant d’un anticorps, par exemple pour le cas de CAR T cells qui adhèrent à leur ligand via un domaine anticorps chimérique.
Les liaisons antigène-anticorps considérées dans la présente demande, sont celles qui maintiennent l’antigène fixé dans le site anticorps et qui sont, selon l’art antérieur, de nature non-covalente. Cela inclut des liaisons hydrogènes, des liaisons électrostatiques, des forces de Van der Waals et des liaisons hydrophobes. De multiples liaisons entre l’antigène et l’anticorps assurent une interaction stable entre ces deux molécules et celles considérées dans la présente demande, sont celles qui permettent de maintenir physiquement la cellule à une distance fixe d’un substrat et donc d’utiliser des moyens physiques pour détecter la présence de la cellule au voisinage du substrat, notamment optiquement.
Les termes « réflexion optique interférentielle » ou « microscopie en (ou de) contraste interférentiel par réflexion» désignent dans la présente demande la technique connue en anglais sous l’acronyme IRM (Interferential Reflexion Microscopy).
PRESENTATION GENERALE:
Dans ce contexte, la présente demande concerne un dispositif qui comprend un substrat comprenant une première zone sur laquelle est adsorbée une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire et comprenant une deuxième zone sur laquelle est adsorbé un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire, dans lequel la première zone et la deuxième zone s’étendent ensemble en longueur sur une dimension comparable à la longueur d’une cellule.
De manière avantageuse, la présente demande concerne un dispositif caractérisé en ce qu’il comprend un substrat, le substrat comprenant une première zone sur laquelle est adsorbée une protéine apte à se lier spécifiquement à une cellule en interagissant avec une première molécule membranaire et comprenant une deuxième zone sur laquelle est adsorbé un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire exprimée à la surface de ladite cellule, ladite première zone représentant une première surface définissant une première aire Al, ladite deuxième zone représentant une deuxième surface, définissant une deuxième aire A2, où l’aire totale représentée par la somme des aires Al et A2 est inférieure ou égale à l’aire de de la surface projetée de ladite cellule en suspension (Figure 1).
Dans le cadre de la présente invention, le dispositif comprend deux zones qui sont organisées de sorte qu’une cellule puisse interagir avec la première zone, ou la deuxième zone, ou les deux zones simultanément. L’objectif est de détecter le recouvrement de la première zone ou de la deuxième zone ou des deux zones et ainsi de phénotyper la cellule déterminée grâce à la protéine et à l’anticorps chacun adsorbé respectivement sur la première et la deuxième zone. Afin de permettre la détection du recouvrement, la première et la deuxième zone ont une configuration particulière de sorte que l’aire totale correspondant à la somme de l’aire de la première et de la deuxième zone est inférieure ou égale à l’aire de la surface projetée de ladite cellule.
Ainsi, si ladite cellule est capable de reconnaître la protéine adsorbée sur la première zone, ladite cellule y adhérera, ce qui formera un contraste en microscope optique par contraste interférentiel en réflexion dans la première zone qui apparaitra sombre, la deuxième zone restant d’apparence claire (Figure 2B). Si en outre ladite cellule ayant interagi avec la première zone est capable d’interagir avec l’anticorps adsorbé sur la deuxième zone, la cellule adhérant sur la première zone, s’étalera sur la deuxième zone pour y adhérer, ce qui formera un contraste en microscope optique par contraste en réflexion (qui est un mode possible de révélation du signal généré par le dispositif) dans la deuxième zone qui apparaîtra également sombre (Figure 2C). En l’absence d’adhésion de la cellule avec le dispositif, l’ensemble du motif reste clair (Figure 2A, Figure 3). Par surface projetée d’une cellule en suspension, on entend dans l’invention le plan défini par les plus grandes dimensions d’une cellule lorsque cette dernière est observée de dessus. Par exemple si la cellule est une sphère parfaite, la surface projetée sera le disque de rayon r, r étant le rayon de la sphère parfaite. La surface projetée aura alors une aire 7ir2 et Faire totale (A1+A2) sera inférieure à 7ir2. La longueur étant la plus grande dimension d’une forme géométrique bidimensionnelle ou tridimensionnelle (par opposition à la largeur et la hauteur). Une forme bidimensionnelle a une aire inférieure ou égale à sa longueur au carré ; une forme tridimensionnelle a une aire projetée inférieure ou égale à sa longueur au carré.
Le dispositif pouvant être réalisé avec différentes formes géométriques, il est défini dans l’invention en fonction de la longueur des cellules avec lesquelles le dispositif est susceptible d’interagir. En d’autres termes, on définira le dispositif et les zones qu’il contient en fonction de la cellule considérée.
Les cellules en suspension correspondent soit à des cellules qui spontanément sont non adhérentes (cellules sanguines ou hématopoïétiques), ou des cellules adhérentes qui ont été détachées de leur support (par exemple par traitement à la trypsine).
Dans des variantes (Figure 4):
- la première molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un premier type de cellules et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un sous-type du premier type de cellules.
- la première molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un premier type de cellules et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un état particulier du premier type de cellules.
- la première molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un premier type de cellules et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un deuxième type de cellules apte à interagir avec le premier type de cellules.
- la protéine est un anticorps ciblant CD4 et l’anticorps est un anticorps ciblant CD8. - la protéine est un anticorps ciblant CD3.
- la protéine est CD 19.
- l’anticorps est un anticorps ciblant CD69.
- l’anticorps est un anticorps ciblant CD25.
- l’anticorps est un anticorps ciblant CD107.
- l’anticorps est un anticorps anti-collagène.
- l’anticorps est un anticorps ciblant CD86.
De manière avantageuse, le dispositif permet par l’intermédiaire de la protéine adsorbée sur la première zone d’identifier une cellule, et l’anticorps adsorbé sur la deuxième zone permet également d’identifier la cellule, par exemple pour confirmer son phénotype. Un exemple de ce dispositif comprend absorbé sur la première zone une protéine qui est un anticorps ciblant l’antigène CD3 et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l’un quelconque des antigènes CD4 ou CD8 , ou un mélange de ceux-ci.
De manière avantageuse, le dispositif permet par l’intermédiaire de la protéine adsorbée sur la première zone d’identifier une cellule, et l’anticorps adsorbé sur la deuxième zone permet d’activer la cellule, par exemple pour induire une nouvelle fonction cellulaire, ou encore induire une différenciation cellulaire. Des exemples d’un tel dispositif sont tels que :
- la protéine adsorbée sur la première zone est un anticorps ciblant l’antigène CD45RO et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l’antigène CD3, ou un mélange d’anticorps ciblant l’antigène CD3 et l’antigène CD28, ou
- la protéine adsorbée sur la première zone est un anticorps ciblant l’antigène CD56 ou CX3CR1 et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l’antigène CD20 (rituximab), ou ii - la protéine adsorbée sur la première zone est un anticorps ciblant l’antigène CD 14 et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l’un quelconque des marqueurs CD 16, CD32 ou CD64, ou ciblant les lipopolysaccharides membranaires (LPS).
De manière avantageuse, le dispositif permet par l’intermédiaire de la protéine adsorbée sur la première zone d’activer une cellule, et l’anticorps adsorbé sur la deuxième zone permet de détecter une réponse cellulaire sous la forme de molécules membranaires exprimées, telles que de l’activation ou de la senescence, c’est-à-dire lire cette réponse. Des exemples d’un tel dispositif sont tels que :
- la protéine adsorbée sur la première zone est CD 19 ou une protéine chimérique comprenant CD 19 et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l'un quelconque des antigènes CD69, CD107, CD25, CD57, TIM-3 et LAG-3, ou - la protéine adsorbée sur la première zone est un anticorps ciblant l’antigène CD20 (rituximab) et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l’antigène CD107.
De manière avantageuse, le dispositif permet par l’intermédiaire de la protéine adsorbée sur la première zone d’identifier une cellule, et l’anticorps adsorbé sur la deuxième zone permet de détecter une réponse cellulaire sous la forme de molécules membranaires exprimées, telles que de l’activation ou de la senescence, c’est-à-dire lire cette réponse. Un exemple d’un tel dispositif est tel que la protéine adsorbée sur la première zone est CD 19 et l'anticorps adsorbé sur la deuxième zone est un anticorps ciblant l'un quelconque des antigènes CD69, CD 107, CD25, CD57, TIM-3 et LAG-3.
IL est également décrit un dispositif tel que défini ci-dessus, dans lequel la première molécule membranaire est une molécule membranaire exprimée à la surface d’un premier type cellulaire et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire exprimée à la surface d’un sous-type dudit premier type cellulaire, ledit sous-type dudit premier type cellulaire exprimant à sa surface ladite première et ladite deuxième molécule membranaire.
La présente demande concerne aussi un procédé qui comprend les étapes suivantes :
- adsorber sur un substrat une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire, dans une première zone du substrat de dimensions subcellulaires,
- adsorber sur un substrat un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire, dans une deuxième zone du substrat de dimensions subcellulaires.
La présente demande concerne aussi une variante du procédé pour quantifier et suivre la cinétique d’activation de cellules, qui comprend les étapes suivantes :
- adsorber sur un substrat une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire commune à un premier type de cellules, dans une première zone de dimensions subcellulaires,
- adsorber sur un substrat un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire commune à un état particulier du premier type de cellules, dans une deuxième zone de dimensions subcellulaires,
- mettre en contact une population de cellules du premier type comprenant des cellules du premier type admettant une cinétique d’activation vers un état particulier et le substrat,
- détecter la présence d’une cellule du premier type dans la première zone au moyen de la microscopie optique,
- quantifier la cinétique d’activation de la cellule du premier type par la détection de l’adhésion de la cellule du premier type dans la deuxième zone, au moyen de la microscopie optique.
La présente demande concerne aussi une variante du procédé pour sélectionner un type cellulaire et pour déclencher son activation, qui comprend les étapes suivantes : - adsorber sur un substrat une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire commune à un premier type de cellules, dans une première zone de dimensions subcellulaires,
- adsorber sur un substrat un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire connue pour déclencher l’activation du premier type de cellules, dans une deuxième zone de dimensions subcellulaires,
- mettre en contact une population de cellules comprenant des cellules du premier type admettant une activation vers un état particulier et le substrat,
- détecter la présence d’une cellule du premier type de cellules, exprimant la première molécule membranaire dans la première zone au moyen de la microscopie optique,
- détecter le déclenchement de l’activation de la cellule du premier type par la détection de l’adhésion de la cellule du premier type dans la deuxième zone, au moyen de la microscopie optique.
La présente demande concerne aussi une variante du procédé pour détecter des molécules de membrane cellulaire, qui comprend les étapes suivantes :
- adsorber sur un substrat une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire commune à un premier type de cellules, dans une première zone de dimensions subcellulaires,
- adsorber sur un substrat un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire commune à un sous-type du premier type de cellules, dans une deuxième zone de dimensions subcellulaires,
- mettre en contact une population de cellules du premier type comprenant des cellules du sous- type et le substrat,
- détecter la présence d’une cellule du premier type de cellules, exprimant la première molécule membranaire dans la première zone au moyen de la microscopie optique,
- quantifier l’expression de la deuxième molécule membranaire par la cellule par la détection de l’adhésion de la cellule dans la deuxième zone, au moyen de la microscopie optique.
La présente demande concerne aussi une variante du procédé pour détecter une interaction de deux cellules, qui comprend les étapes suivantes :
- adsorber sur un substrat une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire commune à un premier type de cellules, dans une première zone de dimensions subcellulaires,
- adsorber sur un substrat un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire commune à un deuxième type de cellules apte à interagir avec le premier type de cellules, dans une deuxième zone de dimensions subcellulaires,
- mettre en contact une population de cellules comprenant des cellules du premier type et des cellules du deuxième type et le substrat, - détecter la présence d’une cellule du premier type dans la première zone au moyen de la microscopie optique,
- détecter la présence d’une cellule du deuxième type ou quantifier l’expression de la deuxième molécule membranaire par la deuxième cellule dans la deuxième zone au moyen de la microscopie optique.
Il est également décrit l’utilisation, notamment in vitro, d’un substrat pour caractériser l’état d’activation ou de différenciation d’une cellule déterminée dans une population de cellules, ledit substrat comprenant une première zone sur laquelle est adsorbée une protéine apte à se lier spécifiquement à ladite cellule déterminée en interagissant avec une première molécule membranaire spécifique de ladite cellule déterminée et comprenant une deuxième zone sur laquelle est adsorbé un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire exprimée à la surface de ladite cellule déterminée, ladite première zone représentant une première surface définissant une première aire Al, ladite deuxième zone représentant une deuxième surface, définissant une deuxième aire A2, où l’aire totale représentée par la somme des aires Al et A2 est inférieure ou égale à l’aire de de la surface projetée de ladite cellule en suspension, ladite deuxième molécule membranaire étant exprimé à la surface de ladite cellule déterminée lorsque ladite cellule est activée ou différenciée.
De façon générale, l’invention se base sur une méthode qui permet d'analyser phénotypiquement et au niveau de la cellule unique notamment les propriétés d'activation des cellules immunitaires comme l’illustrent les figures 1 à 5
La méthode peut utiliser la microscopie optique pour générer de multiples micro zones (micropatterns) de différentes protéines et tailles subcellulaires (figure 3), et ces substrats micro-ingéniés sont capables d'effectuer de multiples essais fonctionnels sur des suspensions de cellules immunitaires ou du sang entier, tels que (i) la sélection/l'identification d'un type de cellule d'intérêt, (ii) le déclenchement d'un signal d'activation, et (iii) la lecture de la cinétique de l'activation immunitaire. L’invention n’est pas limitée à une telle microscopie optique, et tout instrument projetant des rayons ultraviolets (par exemple un microscope confocal) ou toute technique de (micro-)impression peut également être utilisé. L’homme du métier saura déterminer l’instrumentation la plus appropriée.
L’évaluation de ces fonctions est réalisée par la nature des protéines du micropattern, qui sont généralement des anticorps ayant des affinités spécifiques et des actions efficaces. Lorsque la membrane cellulaire de la suspension exprime la cible des anticorps sur le substrat, la cellule s’étale sur le motif correspondant (figure 2) et l’empreinte de l’adhésion cellulaire peut être détectée par microscopie interférométrique (Figure 2). La détection ne se limite pas à l’imagerie par contraste interférentiel en réflexion, et une détection par imagerie par transmission et collecte d’images pour détecter le contour des cellules peut également être utilisée. Ici encore, l’homme du métier saura déterminer quelle technique est la plus appropriée.
Les différentes fonctions réalisées par le micropattem peuvent être évaluées en prenant une seule image et en analysant l'étalement des cellules dans chaque patron. Il est important de noter que la lecture ne nécessite aucune des manipulations fastidieuses habituellement impliquées dans les techniques basées sur l'immunomarquage (préparation des cellules, incubations, rinçage). Dans une image typique de microscopie interférentielle, les zones sombres indiquent l'adhésion et les zones claires la non-adhésion (figure 2 et 3). En pratique, les tâches de l'opérateur se limitent à placer le substrat intelligent sur un microscope optique dédié et à déposer l'échantillon cellulaire sur le substrat.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES :
Figure 1 : en A, exemple de motif imprimé représenté en plan en haut, et en coupe en bas. Le motif comporte deux zones concentriques (1 et 2) portant chacune un anticorps d’une spécificité particulière, dans l’exemple CD3 au centre (1) et CD69 en périphérie (2). En B, exemple de cellule circulante (un lymphocyte T) représentée à la même échelle, dont un marqueur membranaire est représenté à sa surface (CD3 ici), qui serait susceptible d’interagir avec la zone centrale du motif. Dans cet exemple, la plus grande dimension du motif (10pm) est inférieure à celle de la cellule (12pm).
Figure 2 : exemples d’interactions de différentes cellules avec un motif identique à celui de la figure 1, avec en haut une vue de côté, et en bas une vue en plan du signal obtenu en contraste interférentiel en réflexion (qui est un mode possible de révélation du signal généré par le dispositif). En A, exemple d’interaction entre une cellule ne portant pas de marqueur membranaire correspondant aux spécificités des anticorps présents. Un lymphocyte B (dont le marqueur CD20 est représenté) n’exprime pas de ligand membranaire pour interagir avec les anticorps du motif et n’adhère pas à la surface ; l’aspect résultant en contraste interférentiel en réflexion est une absence de signal. En B, exemple d’interaction entre une cellule portant un seul type de marqueur membranaire correspondant à une des spécificités des anticorps présents sur le motif. Un lymphocyte T non activé exprime CD3 mais pas CD69. Ses molécules CD3 sont capturées par les anticorps de la zone centrale du motif, et sa membrane adhère donc à cette zone. Ceci provoque l’apparition du contraste interfèrent! el pour la zone centrale du motif. En C, exemple d’interaction entre une cellule portant les deux types de marqueurs membranaires correspondant aux spécificités des deux types d’anticorps présents sur le motif. Ses molécules CD3 sont capturées par les anticorps de la zone centrale du motif, et ses molécules CD69 sont capturées par les anticorps présents sur la zone périphérique du motif ; sa membrane adhère donc aux deux zones. Ceci provoque l’apparition du contraste interférentiel pour la zone centrale et la zone périphérique du motif.
Figure 3 : exemples d’images réelles obtenues au cours d’une expérience réalisée avec le type de motif décrit dans les figures 1 et 2, répété pour former une matrice de motifs sur une lamelle de verre. En A, image en microscope optique en transmission, montrant des lymphocytes T adhérés chacun à un emplacement de motif de la matrice. Certains emplacements n’ont pas capturé de cellule. En B, aspect résultant en contraste interférentiel en réflexion au même grossissement montrant que chaque cellule ayant adhéré à un motif en A produit un contraste sur la zone centrale du motif en B, identifiant chaque cellule comme exprimant CD3 à sa surface et étant donc une cellule T. Une partie des cellules produit un contraste plus ou moins complet sur la zone périphérique du motif auquel elle adhère, identifiant ces cellules comme exprimant CD69 à leur surface et donc comme des cellules T activées. En C, image du même échantillon en microscopie en fluorescence au même grossissement, après fixation des cellules au formaldéhyde et incubation avec un anticorps anti-CD69 fluorescent, montrant l’expression membranaire de la molécule et permettant d’observer la correspondance avec le contraste produit sur la zone périphérique des motifs pour chaque cellule : les cellules brillantes en C occupent généralement la zone périphérique des motifs.
Figure 4 : exemples de motif possibles à deux zones portant chacune un type d’anticorps avec une spécificité particulière (identique aux motifs décrits en figures 1 et 2). Exemple de motif à trois zones portant chacune un type d’anticorps avec une spécificité particulière. Les dimensions totales du motif restent inférieures à 10pm, qui est inférieur à la dimension en suspension du type cellulaire visé (ici, des leucocytes).
Figure 5 : exemples de motif à trois zones portant chacune un type d’anticorps avec une spécificité particulière. Les dimensions totales du motif restent inférieures à 10pm, qui est inférieur à la dimension en suspension du type cellulaire visé (ici, des leucocytes). DESCRIPTION DETAILLEE D’EXEMPLE(S) :
Dans un premier mode de réalisation, en référence à la figure 1 pour les numéros des éléments en gras ou des éléments entre parenthèses, l’invention peut être réalisée pour le substrat au moyen de la technologie LIMAP qui permet d’aligner et d’ adsorber des protéines sur des substrats recouverts d’une brosse de PEG (Polyéthylène Glycol) insolée selon un motif lumineux ultraviolet, ce qui permet d’obtenir une adhésion spécifique d’une protéine dans les zones insolées.
Toutefois, dans chaque cas où l’adhésion de plusieurs protéines est requise et notamment pour deux anticorps, il est nécessaire de pouvoir déposer spécifiquement le premier anticorps puis le deuxième, chacun spécifiquement sur le motif souhaité.
Il est possible une fois un processus spécifique mis au point pour un motif convenant à une seule cellule de dupliquer spatialement en parallèle la réalisation de plusieurs motifs pour obtenir rapidement une matrice de motifs permettant d’obtenir des tests sur autant de cellules capturées que de motifs présents sur le substrat imprimé en LIMAP.
D’un point de vue expérimental, une première zone (1) est imprimée localement par l’action combinée d’un photo-initiateur (PLPP, Alvéole), placé en solution sur une brosse de PEG-SVA et soumis à une projection d’un motif ultraviolet à 375 nm (étape 1). Un premier anticorps est ensuite incubé pendant 12h à 4°C (étape 2). Puis, une deuxième zone (2) est imprimée par LIMAP (étape 3). Un deuxième anticorps y est déposé puis incubé durant 12h, à 4°C (étape 4). Dans ce contexte, le deuxième anticorps s’adsorbe de façon non spécifique à la seconde zone (i.e. non limitée au motif illuminé le plus récemment), car il est aussi adsorbé dans la première zone. Le substrat anti-salissures (brosse de PEG) est en effet rendu adhésif dans la première zone par la première illumination et dans la seconde zone par la seconde illumination, ce qui implique pour le second anticorps de s’ adsorber non seulement dans la deuxième zone mais aussi dans la première zone. La vérification de ces propriétés peut être faite par exemple par épifluorescence, en utilisant des marqueurs de fluorescences distincts pour les anticorps et en les observant à l’aide de filtres interférentiels isolant la longueur d’onde de chaque marqueur de fluorescence.
Pour éviter l’adsorption non spécifique du deuxième anticorps dans la première zone, l’homme du métier pourra utiliser des techniques de passivation connue de l’art antérieur comme l’utilisation de solutions de passivation courantes en biophysique, entre les deux phases d’illumination, notamment :
- BSA à 4% dans du PB S pendant Ih à température ambiante, - BSA à 4% dans du PBS pendant 30 mn suivi de lmg/ml d’IgG de sérum de lapin pendant 30 mn à température ambiante,
- Pluronic F 127 à 1% dans du PBS pendant 15 mn à température ambiante
La meilleure solution de passivation trouvée est du PEG-SVA à 0,23mg/ml de bicarbonate de soude à lOmM dans de l’eau Milli-Q pendant 15 mn à température ambiante.
Une fois la méthode de passivation choisie, en fonction d’une adsorption non spécifique minimale, on pourra utiliser la technologie LIMAP pour réaliser un motif périodique comprenant deux zones d’adhésion potentielle pour les cellules : une spécifique pour les lymphocytes T dans leur ensemble et une pour les lymphocytes T activés. Il sera aussi possible de réaliser autant de zones d’adhésion que nécessaire en illuminant chaque zone, en l’exposant à un anticorps choisi pour la zone, puis en passivant puis en illuminant la zone suivante et ainsi de suite.
De façon commode, pour chaque zone, on dupliquera de façon spatialement périodique la zone prise comme motif d’une structure spatialement périodique, en décalant le motif sur le substrat pour permettre un dépôt d’un même anticorps et une passivation en une seule opération, de tous les motifs illuminés.
La duplication se fera commodément, de façon connue, par une technologie LIMAP, dans laquelle une matrice de micro-miroirs est utilisée pour réaliser le motif périodique et est imagée sur le substrat en lumière ultraviolette, en une seule fois.
Ainsi, chaque anticorps est uniquement adsorbé dans sa zone, i.e. de façon spécifique à cette zone, les anticorps sont adsorbés dans des zones contiguës formant un motif de longueur, c’est- à-dire de plus grande dimension géométrique, comparable, c’est-à-dire inférieure ou égale à la longueur (i.e. à nouveau la plus grande des dimensions géométriques) de la cellule à adhérer et avec des motifs espacés de façon qu’une seule cellule puisse adhérer sur chaque motif. L’homme du métier pourra adapter par de simples opérations d’exécution, la forme, la longueur de chaque zone et la distance entre les motifs pour s’assurer, pour un type de cellule particulier, qu’une seule cellule adhère par motif et dans un ordre d’adhésion donné ou une configuration spatiale d’adhésion donnée.
Par exemple, pour un phénotypage des lymphocytes T mémoires, on choisira une première zone d’adhésion de type aCD45RO (« anticorps ciblant CD45RO ») délimitée à l’intérieur d’un cercle et une seconde zone d’adhésion de type aCD69 (« anticorps ciblant CD69 ») délimitée sur un anneau circulaire concentrique à la première zone.
Par exemple, pour un suivi d’activation des lymphocytes T mémoires, on choisira une première zone d’adhésion de type aCD45RO (« anticorps ciblant CD45RO ») mélangé à aCD3 et aCD28 pour faire adhérer tous les lymphocytes T mémoires ( exprimant toutes CD45RO) puis déclencher l’activation des cellules ayant adhéré( par CD3+CD28), la première zone étant encore délimitée à l’intérieur d’un cercle et la même seconde zone d’adhésion de type aCD69 ( « anticorps ciblant CD69 » ) délimitée sur un anneau circulaire concentrique à la première zone pour faire adhérer seulement les cellules lymphocytes T mémoires activées qui expriment spécifiquement CD69.
Le dispositif de l’invention peut donc de façon versatile être utilisé soit de façon statique pour un phénotypage de lymphocytes T mémoire activés, soit de façon dynamique pour le suivi d’activation de lymphocytes T mémoire naïfs en ajoutant à un anticorps d’adhésion commun à tous les lymphocytes T mémoire, un anticorps des lymphocytes T mémoire.
Un tel dispositif peut être adapté sans difficulté à tout type de cellules pouvant être activé.
Dans le mode considéré, on obtient ainsi un substrat sur lequel des lymphocytes T peuvent progresser et se déplacer, jusqu’à se fixer sur chaque première zone du motif répété périodiquement et adhérer, uniquement s’ils sont activés, sur chaque deuxième zone du motif répété périodiquement.
Il sera possible de faire varier la taille maximale de la première zone et/ou de la deuxième zone, en réalisant des essais de zone de diamètre illuminé variable sur un substrat. Cette taille est de l’ordre de quelques micromètres, par exemple de 4pm à 12,5pm pour provoquer l’adhésion d’une seule cellule immunitaire.
Comme déjà mentionné, on pourra choisir par exemple de déposer dans chaque première zone, l’anticorps CD45 ou un mélange CD45/CD3/CD28 d’anticorps dès l’instant qu’il provoque l’adhésion non spécifique de tout lymphocyte T, activé ou non activé, notamment des lymphocytes T mémoire.
On pourra choisir par exemple de déposer dans chaque deuxième zone, l’anticorps CD69 ou un mélange d’anticorps le contenant comme CD69+CD25 ou une troisième zone contiguë contenant CD25, dès l’instant qu’il provoque l’adhésion spécifique de tout lymphocyte T activés, notamment des lymphocytes T mémoire. Il sera aussi possible de ne déposer que CD25, pour observer une activation secondaire lymphocytes T plutôt qu’une activation primaire (i.e. précédant temporellement la secondaire) avec CD69 ou plutôt que les deux avec CD69+CD25. On pourra suivre la cinétique d’activation de façon connue en utilisant la microscopie IRM, les zones claires révélant une non-adhésion, ce qui implique que les lymphocytes T non-activés auront une première zone sombre et une deuxième zone d’autant plus claire que l’adhésion sera faible ou leur distance au substrat sera forte ou que leur activation sera faible. La forme de la zone imprimée ou déposée ou recouverte d’un anticorps pourra être contenue dans un cercle ou dans un anneau.
Par exemple, un motif adapté pour la première zone est un disque et un motif adapté pour la seconde zone est un anneau concentrique au disque, tous deux de dimension maximale égale à une dizaine de microns.
L’observation de l’adhésion des lymphocytes T sur le substrat dans les premières et secondes zones permet alors le dénombrement de lymphocytes activés précocement et le suivi cinétique de leur intensité d’activation comme fonction de leur intensité d’adhésion. Un enregistrement par caméra permet ainsi de suivre la cinétique de façon précise et quantitative à un stade précoce de l’activation des lymphocytes T, ce qui permet d’aider à un rendu rapide de résultat.
L’interprétation de l’invention est particulièrement simple puisque l’adhésion sur l’anneau d’un motif est synonyme d’activation du lymphocyte T capturé sur le motif et l’absence d’adhésion sur l’anneau est caractéristique d’un lymphocyte T non activé. En employant l’IRM comme méthode d’obtention du contraste par exemple, l’apparition de l’anneau d’un motif est synonyme d’activation du lymphocyte T capturé sur le motif et l’absence d’apparition de l’anneau est caractéristique d’un lymphocyte T non activé.
On pourra en utilisant des repères optiques visibles déterminer pour chaque site contenant un premier et un second motif, si un lymphocyte T est présent et s’il est activé, sans recours à la fluorescence et donc sans manipulation.
De nombreuses variantes sont possibles sur le principe inventif général de l’invention qui est de déposer, dans une première zone micrométrique, un premier anticorps permettant l’adhésion de tout lymphocyte T, activé ou non-activé (i.e. un anticorps non spécifique des lymphocytes T activés) puis de déposer dans une deuxième zone micrométrique un deuxième anticorps permettant l’adhésion de tout lymphocyte T activé (i.e. un anticorps spécifique des lymphocytes T activés)
L’invention permet donc de suivre en temps réel, dès le début d’une infection ou d’une greffe, l’activation des fonctions immunitaires des lymphocytes T.
Pour des lymphocytes B on pourra utiliser notamment l’anticorps CD20 à la place de l’anticorps CD45RO.
Pour une famille de cellules données exprimant non spécifiquement CDx et exprimant spécifiquement CDy (avec y différent de x) dans un état particulier, il sera ainsi possible de déposer de façon contigüe pour une cellule ( au sens de s’étendant sur une longueur d’une cellule) c’est à dire sur un domaine cellulaire, aCDx et aCDy pour détecter les cellules dans l’état particulier ou les cellules progressant vers l’état particulier, en déposant de plus aCDz où CDz est exprimé lors de l’activation de l’état particulier. Chaque cellule pouvant occuper au plus un domaine, ou chaque domaine pouvant au plus accueillir une cellule, il sera ainsi possible de pratiquer des techniques quantitatives et qualitatives sur des populations de cellules selon l’enseignement de la présente demande.
Les géométries des zones décrites sont non limitatives et notamment, des zones non concentriques pourront être dans l’enseignement de la présente demande pour certains types de cellules.
La présente demande décrit ainsi un outil de large diffusion et facilement adaptable pour l’étude de cellules diverses et de leurs états, de façon quantitative et qualitative avec un test praticable avec seulement un microscope équipé pour l’IRM pour l’observation des résultats et des moyens classiques de préparation de cellules soit sans état particulier soit avec.
Cet outil est notamment utilisable à mesure que de nouveaux clusters de différenciation et leurs anticorps associés sont découverts.
L’invention est susceptible d’application industrielle dans le domaine des tests pour l’immunologie clinique et la cancérologie, dans le domaine des tests cellulaires pour la recherche pharmaceutique, et dans le domaine des tests cellulaires pour la recherche fondamentale.
Outre les modes présentés ci-dessus ayant fait la preuve du concept de l’invention, celle-ci peut être avantageusement utilisée pour de nombreuses autres applications.
Dans des modes de réalisation, l’invention a vocation à réaliser des tests de phénotypage cellulaire.
Dans un mode de réalisation pour le phénotypage des lymphocytes circulants, on pourra déposer un anticorps ciblant CD3 dans une première zone et un anticorps ciblant CD4 dans une deuxième zone, un anticorps ciblant CD8 dans une troisième zone, un anticorps ciblant CD 19 dans une quatrième zone, et un anticorps ciblant CD 16 en mélange avec un anticorps ciblant CD56 dans une cinquième zone.
Dans des modes de réalisation, l’invention a vocation à réaliser des tests d’activation cellulaire en réponse à des ligands moléculaires.
Dans un mode de réalisation pour la quantification de l’activation des lymphocytes T, on pourra déposer un anticorps ciblant CD3 en mélange avec un anticorps ciblant CD28 dans une première zone, un anticorps ciblant CD4 dans une deuxième zone, un anticorps ciblant CD8 dans une troisième zone, un anticorps ciblant CD69 dans une quatrième zone. Dans une variante de ce mode, l’anticorps ciblant CD69 pourra être remplacé par un anticorps ciblant CD25 ou une cinquième zone pourra être ajoutée avec l’anticorps ciblant CD25.
Dans un mode de réalisation pour la quantification de l’activation des lymphocytes B, on pourra déposer un anticorps ciblant le fragment Fc des IgM et un anticorps ciblant CD69 dans une quatrième zone.
Dans un mode de réalisation pour la quantification de l’activation des lymphocytes NK, on pourra déposer un anticorps anti CD 16 dans une première zone, un anticorps ciblant CD56 dans une deuxième zone, et un anticorps ciblant CD 107 dans une troisième zone.
Dans un mode de réalisation pour la quantification de l’activation des monocytes, on pourra déposer un anticorps anti CD 16 dans une première zone, un anticorps ciblant CD 14 dans une deuxième zone, et un anticorps ciblant CD86 dans une troisième zone. Dans une variante de ce mode, l’anticorps ciblant CD16 pourra être remplacé par un anticorps ciblant CD32.
Dans un mode de réalisation pour la quantification de l’activation des lymphocytes T à récepteur à l’antigène chimérique (CAR T cells), on pourra déposer une protéine CD19 dans une première zone, et un anticorps ciblant CD69 dans une deuxième zone. Dans une variante de ce mode, l’anticorps ciblant CD69 pourra être remplacé par un anticorps ciblant CD25.
Dans un mode de réalisation pour la détection du phénotype fibrosant de fibroblastes, on pourra déposer de la fibronectine dans une première zone, un anticorps ciblant le collagène dans une deuxième zone. Dans une variante de ce mode, du TGF-P (TGF- beta) pourra être ajouté à la fibronectine dans la première zone.
Dans des modes de réalisation, l’invention a vocation à réaliser des tests d’activation cellulaire lors d’interactions intercellulaires.
Dans un mode de réalisation pour la détection de l’activation de lymphocytes T spécifique de l’antigène, on pourra déposer un anticorps anti CD 14 dans une première zone et un anticorps ciblant CD69 dans une deuxième zone. Dans une variante de ce mode, l’anticorps ciblant CD69 pourra être remplacé par un anticorps ciblant CD25.
Dans un mode de réalisation pour la détection de la cytotoxicité des lymphocytes NK, on pourra déposer CD 16, connu pour lier les cellules-cibles K562, dans une première zone et un anticorps ciblant CD 107 dans une deuxième zone.
Dans un mode de réalisation, on pourra imprimer un damier de zones de dimensions et de périodes subcellulaires contigües d’une protéine et d’un anticorps, et réaliser la mesure sur cellule unique à cheval sur au moins une zone de protéine et une zone d’anticorps en identifiant le contour de la cellule et en analysant l’adhésion dans chaque zone présente dans le domaine délimité par le contour. Dans toute la demande, les mots «dimensions subcellulaires » qualifieront:
- une zone inférieure en longueur à la dimension d’une cellule d’un type et d’une cellule de même type activée vers un état particulier, ou encore
- une zone inférieure en longueur à celle d’une zone à cheval sur une cellule d’un premier type et sur une cellule d’un second type et ne recouvrant pas les deux cellules lorsqu’elles sont en contact. Typiquement, la taille d’une cellule en suspension sera de l’ordre de 8 pm et peut s’étendre jusqu’à plus de 50 microns pour une cellule adhérente au substrat grâce à l’invention. Dans tous les modes de réalisation, on pourra compléter l’invention en ajoutant une ou plusieurs zones contenant chacune une protéine ciblant une molécule membranaire ou un anticorps ciblant une molécule membranaire d’un type de cellule sélectionné par les zones des modes décrits ci-dessus.
Exemples :
Des protocoles pour la mise en œuvre de l’enseignement de la présente demande sont présentés ci-dessous, à titre d’exemples non limitatifs.
Exemple d’application 1 : Substrats sélectionnant des lymphocytes, sans activation par le substrat et avec lecture d’activation par le substrat.
Description du protocole : a- traitement de surface :
Sous hotte anti-poussière :
Mettre au plasma cleaner une lamelle de verre 22x22 Nexterion glass D Schott Minifab clean room cleaned (ref 1472309). Pression plasma cleaner 300mTor
Enclencher le plasma cleaner sur mode High pendant 30min.
Sortir les lames du plasma et déposer chaque lame dans une boite de Petri.
Faire une solution d’APTS (200pL/lame) : dans de l’eau milliQ + 1% (3 -aminopropyl) triethoxysilane (APTS) (ref A3648 Sigma-Aldrich) + 0.03% acide acétique 196pL eau milliQ + 2p acide acétique 3% + 2pL APTS
Déposer la solution sur les lamelles sous la hotte, incuber 2h à 4°C
Rinçage 3x la boite de Petri avec de l’eau milliQ Séchage de la lame sous flux d’azote sous la hotte Faire sécher sur la plaque chauffante à 95°C pdt 15 min Passer de l’azote pour enlever les éventuelles poussières Coller le film PDMS (250pm) Sous la hotte coller la lame de verre (colle UV) sur le fond d’une boîte de pétri trouée (par l’extérieur)
Mettre la boîte de Petri dans le cube UV (full surface, 1 min, laser à 100%)
Préparer solution PEG-SVA (10pL/ puit) : eau milliQ, lOmM de tampon carbonate à pH 8,5 et 23% de PEG-SVA (mPEG-SUCCINIMIDY VALERATE MW 5000Da, ref : 109681 INTERCE1IM). Pour 40pL de solution finale : 36pL eau milliQ, 4pL de tampon carbonate lOOmM et 0,0092g de PEG S VA
Déposer lOpL dans chaque puit
Incubation une nuit à 4°c
Rinçage 8mL/puits H2O milliQ b-Protocole impression
Repères (Pattern 1) :
BSA 4% 15min à RT (20pl/puit)
Rinçage 8ml/puit à 4ml/min
Dépôt 10pl/puit de PLPP
Impression à 3000mj/mm2 sous flux d’oxygène
Rinçage 8ml/puit à 4ml/min
Dépôt B S A-Fluorescéine incubation 5min à RT
Rinçage PB S 8ml/puit à 4ml/min
Passivation :
PEG-SVA 5% lOmM tampon carbonate 20pl/puit 5min à RT
Rinçage 8mL/puit H2O milliQ
BSA 4% 20pl/puit 15min à RT
Rinçage PB S 8ml/puit à 4ml/min
Impression de Ronds centraux de diamètre 10pm (Pattern 2) :
Dépôt 10pl/puit de PLPP
Impression à 3000mj/mm2 sous flux d’oxygène
Rinçage 8ml/puit à 4ml/min
Dépôt Anticorps Anti CD3-CD28 à respectivement 100pg/ml-100pg/ml-50pg/ml (volume final 20pl/puit) Pour un puit : 2pl de CD3 et CD28, Ipl CD45, 15pl de PB S
Incubation une nuit à 4°c.
Rinçage 8ml/puit à 4ml/min Passivation :
PEG-SVA 5% lOmM tampon carbonate 20pl/puit 5min à RT
Rinçage 8mL/puit H2O milliQ BSA 4% 20pl/puit 15min à RT Rinçage PBS 8ml/puit à 4ml/min
Impression de motifs périphériques (Pattern 3)
Dépôt 10pl/puit de PLPP
Impression à 3000mj/mm2 sous flux d’oxygène
Rinçage 8ml/puit à 4ml/min
Dépôt Anticorps Anti CD69 à lOOpg/ml (volume final 20pl/puit) Pour un puit : 4 pl de CD69 et 16pl de PBS
Incubation une nuit à 4°c.
Rinçage 8ml/puit à 4ml/min
Références Anticorps:
Ac anti hCD45: ref NBP2-34804, clone SPM570, NovusBio
Ac anti hCD3: Ultra leaf purified, ref 300438, clone UCHT1, Biolegend
Ac anti hCD28: Ultra leaf purified, ref 302933, clone CD28.2, Biolegend
Ac anti hCD69: ref MAB2359, clone 298633, R&D system.
Exemple d’ application 2 : Substrats sélectionnant et identifiant des lymphocytes T mémoires, avec activation par le substrat et lecture d’activation par le substrat.
Dans cet exemple, le même protocole sera suivi que pour l’exemple 1, en remplaçant CD3- CD28 par CD45RO.
Exemple d’application 3 : Mesures d’activation de lymphocytes T
La figure 3 donne un exemple de mesure dans un dispositif doté de micropatterns conçus pour accueillir des cellules T uniques et pour détecter leur activation par le complexe TCR. Ces motifs étaient composés de deux zones distinctes, chacune ayant une fonction spécifique : la zone centrale contenait de l'anticorps anti-CD3 et de l’anticorps anti-CD28 pour sélectionner et activer les cellules T, et la zone latérale contenait de l'anticorps anti-CD69 pour lire l'expression du CD69 des cellules activées. La lecture interférométrique est présentée dans la figure3B, droite. On peut voir que certaines zones anti-CD69 sont sombres, ce qui signifie que ces cellules T capturées sont activées dans cette expérience (confirmé par immunofluorescence). Cet exemple illustre le concept de substrats "intelligents" comportant plusieurs anticorps, qui est très flexible et adaptable à différentes applications et types de cellules en choisissant les anticorps imprimés en conséquence.
Exemple d’application 4 : Autres possibilités d’applications
La technologie décrite dans la présente invention permet des essais fonctionnels permettant une utilisation personnalisée des nouvelles immunothérapies en surveillant l'activation des cellules immunitaires. L'évaluation de l'efficacité des immunothérapies et la stratification des patients en tant que répondeurs potentiels peuvent optimiser l'utilisation de ces traitements coûteux. Il s'agit là d'un enjeu médical important. Les explorations fonctionnelles sont le plus souvent trop lentes et trop complexes pour être traduites dans des contextes cliniques où les coûts de la manipulation humaine et de l'expertise sont très contraignants, et restent le fait de la recherche académique. La technologie mise au point par les inventeurs de substrats "intelligents" avec de multiples micropatterns fonctionnels permet de mesurer l'activation des leucocytes en quelques heures et peut répondre efficacement à un besoin non satisfait de développement d'essais fonctionnels rapides et cliniquement acceptés.
L'un des principaux atouts de cette technologie est qu'elle peut être adaptée pour mesurer diverses fonctions de différents types de leucocytes. Pour adapter la technique à une nouvelle fonction spécifique et à un nouveau type de leucocyte, il suffit de changer la nature de l'anticorps dans les micropatterns. Les inventeurs ont identifié une série (non exhaustive) d'anticorps et de molécules à imprimer afin de réaliser les fonctions de sélection/identification, de déclenchement de l'activation et de lecture de l'expression des cellules pour différentes cellules immunitaires (tableau 1). Pour la plupart des types de cellules et des fonctions, les modèles reposent sur l'impression d'un anticorps. Dans certains cas, par exemple pour les cellules CAR-T, il est important d'imprimer le CD 19 comme cible d'activation et le CD 19 n'est pas un anticorps. Dans tous les cas, l’adaptation de la technologie à de nouvelles applications repose sur le même type de chimie et physico-chimie de surface, et il s’agit seulement de changer le type d’anticorps dans les protocoles de préparation déjà éprouvés pour réaliser de nouveaux dispositifs fonctionnels.
Tableau 1 : Anticorps et protéines pertinents pour des micropattems capables de réaliser des fonctions spécifiques (identification, sélection, activation, stimulation, lecture de réponse) avec différents types cellulaires.
Par exemple, on peut être intéressé par l'évaluation des propriétés d'activation des cellules CAR T lors de l'engagement avec une cible chimérique CD 19, ou des cellules NK contre une cible Rituximab (voir figure 4 et 5). Dans cet exemple, pour réaliser les impressions de protéines, des lames de verre (SCHOTT Nexterion) sont traitées au plasma pendant 15 minutes et montées avec un moulage en PDMS (P olydiméthyl siloxane, Sylgard 184) de façon à obtenir des canaux. Une solution d’ APTES ((3- Aminopropyl)triethoxysilane, Sigma) diluée à 1% dans de l’eau milliQ avec 0.03% d’acide acétique est incubée sur le verre pendant 2h à 4°C. La surface est ensuite rincée à l’eau et placée pendant 15 minutes à 95°C. Une solution de PEG-SVA (MW : 5000 Da, INTERCHIM) dans un tampon carbonaté (NaHCO3) à 10 mM est alors incubée sur le verre pendant 12h à 4°C. Le canal est ensuite rincé à l’eau et une solution de PLPP (15,5 mg.mL-1, Alveole) est introduite dans les canaux et agitée à l’aide d’un pousse seringue (NEMESYS, Cetoni) avec un flux de 4pL.s-1 pendant toute l’insolation. La surface est insolée avec une dose d’UV de 3000 mJ.mnr 2 pour réaliser le pattern d’ accroche et ce via la plateforme PRIMO (Alveole), puis incubée avec
50pg.mL-l de 6-x anti-His Tag (Life Technologies) pendant Ih à température ambiante. La solution est ensuite rincée et la surface bloquée pendant 15 minutes à l’aide de BSA 4% (Bovin Serum Albumin, Sigma). Une solution de CD19-His-tag (Life Technologies) à 20pg.mL-l est ensuite incubée pendant 12h à 4°C. La surface est alors à nouveau bloquée à l’aide de BSA 4% pendant 20 minutes puis la surface est à nouveau insolée avec des UV pour réaliser un pattern périphérique de lecture de l’activation. Enfin, la surface est incubée pendant Ih à température ambiante à l’aide d’anti CD69 humain (Bio Techne, R&D Systems). Les cellules sont ensuite introduites, dans le canal pendant 10 minutes, puis rincées de façon à n’avoir des cellules que sur les patterns. La lecture est réalisée après 3h d’incubation des cellules dans le dispositif.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif caractérisé en qu’il comprend un substrat comprenant une première zone (1) sur laquelle est adsorbée une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire et comprenant une deuxième zone (2) sur laquelle est adsorbé un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire, dans lequel la première zone et la deuxième zone s’étendent ensemble en longueur sur une dimension comparable à la longueur d’une cellule.
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la première molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un premier type de cellules et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un sous-type du premier type de cellules.
3. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la première molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un premier type de cellules et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un état particulier du premier type de cellules.
4. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la première molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un premier type de cellules et dans lequel la deuxième molécule membranaire est une molécule membranaire commune à un deuxième type de cellules apte à interagir avec le premier type de cellules.
5. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel la protéine est un anticorps ciblant CD4 et l’anticorps est un anticorps ciblant CD8.
6. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel la protéine est un anticorps ciblant CD3.
7. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel la protéine est CD 19.
8. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel l’anticorps est un anticorps ciblant CD69.
9. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel l’anticorps est un anticorps ciblant CD 107.
10. Procédé caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
- adsorber sur un substrat une protéine apte à se lier à une première molécule membranaire, dans une première zone du substrat de dimensions subcellulaires,
- adsorber sur un substrat un anticorps ciblant une deuxième molécule membranaire, dans une deuxième zone du substrat de dimensions subcellulaires.
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