EP4463466A1 - Verbesserte cystein produzierende stämme - Google Patents

Verbesserte cystein produzierende stämme

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Publication number
EP4463466A1
EP4463466A1 EP22712547.3A EP22712547A EP4463466A1 EP 4463466 A1 EP4463466 A1 EP 4463466A1 EP 22712547 A EP22712547 A EP 22712547A EP 4463466 A1 EP4463466 A1 EP 4463466A1
Authority
EP
European Patent Office
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crp
cysteine
gene
expression
strain
Prior art date
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Pending
Application number
EP22712547.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Andrea HEDLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie AG filed Critical Wacker Chemie AG
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01095—Phosphoglycerate dehydrogenase (1.1.1.95)
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    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0103—Serine O-acetyltransferase (2.3.1.30)

Definitions

  • the invention relates to a microorganism strain comprising a deregulated cysteine biosynthesis pathway, which is thereby suitable for the fermentative production of at least one substance selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine, characterized in that the relative expression of the crp Gene is reduced by mutation of the crp promoter sequence based on the expression of the crp gene with wild-type promoter sequence.
  • this microorganism strain forms an increased amount of a substance selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine compared to the corresponding microorganism strain with expression of the crp gene with wild-type promoter.
  • the invention therefore also provides a method for producing at least one compound selected from L-cysteine and its derivatives L-cystine and thiazolidine using this microorganism strain.
  • Cysteine abbreviated Cys or C
  • Cys is an ⁇ -amino acid with the side chain -CH2-SH. Since the naturally occurring enantiomeric form is L-cysteine and only this represents a proteinogenic amino acid, L-cysteine is meant in the context of this invention when the term cysteine is used without a descriptor. By oxidation of the sulfhydryl groups, two cysteine residues can form a disulfide bridge with one another, resulting in cystine, for which the same applies, i.e.
  • L-enantiomer or L-cystine, or (R,R) -3,3'-dithio-bis(2-aminopropionic acid)
  • L-cysteine is a semi-essential amino acid for humans because it can be formed from the amino acid methionine.
  • Thiazolidine refers to the compound 2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid, an adduct of cysteine and pyruvate (EP 0885 962 B1).
  • Cysteine occupies a key position in sulfur metabolism in all organisms and is involved in the synthesis of proteins, glutathione, biotin, lipoic acid, thiamine, taurine, methionine and other sulfur-containing metabolites.
  • L-cysteine serves as a precursor for the biosynthesis of coenzyme A.
  • cysteine has been studied in detail in bacteria, particularly in enterobacteria. A summary of cysteine biosynthesis can be found in Wada and Takagi, Appl. microbiol. biotech. (2006) 73:48-54.
  • the amino acid L-cysteine is of economic importance. It is used, for example, as a food additive (particularly in the baking industry), as a raw material in cosmetics, and as a starting product for the production of active pharmaceutical ingredients (particularly N-acetyl cysteine and S-carboxymethyl cysteine).
  • a process for the fermentative production of cysteine is also available.
  • the prior art relating to the fermentative production of cysteine with microorganisms is disclosed, for example, in EP 0858 510 B1, EP 0885 962 B1, EP 1382 684 B1, EP 1220 940 B2, EP 1769 080 B1, EP 2 138585 B1 and WO 2021/259491 .
  • Bacterial host organisms used include strains of the genus Corynebacterium and members of the Enterobacteriaceae family, e.g. E.g. Escherichia coli or Pantoea ananatis.
  • Wild-type host organisms that have not been modified further do contain a cysteine biosynthetic pathway (see, for example, the KEGG Pathway database: "Cysteine and methionine metabolism”), which is regulated in such a way that only as much cysteine is produced as is required for cell growth.
  • cysteine biosynthesis in WT strains is regulated by so-called feedback inhibition of key enzymes.
  • L-serine inhibits the SerA enzyme 3-phosphoglycerate dehydrogenase and L-cysteine inhibits the CysE enzyme serine O-acetyl transferase.
  • SerA and CysE are both enzymes of the cysteine biosynthetic pathway and their feedback inhibition by L-serine and L-cysteine, respectively, prevents the production of more cysteine than is needed by the cell.
  • Such wild-type strains do not produce any detectable cysteine, as disclosed, for example, in Table 2 of the present invention for the strain E. coli K12 W3110 and are therefore not suitable for the production of cysteine despite the presence of a cysteine biosynthetic pathway.
  • a wild-type microorganism strain becomes suitable for cysteine production by deregulating the cysteine biosynthetic pathway.
  • Various methods are available for the production of microorganism strains with deregulated cysteine biosynthesis, which are characterized by improved cysteine production. In addition to the classic approach of achieving improved cysteine producers through mutation and selection, targeted genetic modifications were also made to the strains in order to achieve effective cysteine overproduction.
  • O-Acetyl-L-Serine is formed from L-Serine and acetyl-CoA. Therefore, the provision of L-serine in sufficient quantity for cysteine production is of great importance.
  • This can be done by introducing a serA allele encoding a 3- Phosphoglycerate dehydrogenase with reduced feedback inhibition encoded by L-serine can be achieved.
  • 3-phospho-hydroxypyruvate a biosynthetic precursor of L-serine
  • Examples of such SerA enzymes are described in EP 0 620 853 B1 and EP 1496 111 B1. But also Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184 disclose modifications to the serA gene to deregulate enzyme activity.
  • L-cysteine is continuously withdrawn from the intracellular reaction equilibrium, with the result that the level of this amino acid in the cell is kept low and thus the feedback inhibition of sensitive enzymes by L-cysteine does not occur:
  • a cysteine production strain / microorganism strain capable of cysteine production / microorganism strain with deregulated cysteine biosynthetic pathway / microorganism strain with deregulated cysteine biosynthesis is characterized by at least one of the changes / characteristics selected from feedback-resistant SerA enzyme, feedback-resistant CysE enzyme and overexpression of one Cysteine Efflux Proteins.
  • cysteine yield in fermentation can be increased by weakening or destroying genes that code for cysteine-degrading enzymes, such as the tryptophanase TnaA or the cystathionine-ß-lyases MalY or MetC (EP 1571 223 Bl).
  • the optimization of the fermentation process ie the way in which the cells are cultivated, also plays an important role in the development of an efficient production process.
  • Various cultivation parameters such as the type and dosage of the carbon and energy source, the temperature, the supply of oxygen (EP 2 707 492 B1), the pH and the composition of the culture medium, the product yield and/or the product range in the fermentative affect production of cysteine.
  • the object of the present invention is to provide a microorganism strain for the fermentative production of cysteine, L-cystine and/or thiazolidine, with which higher yields of L -cysteine, L-cystine and/or thiazolidine can be achieved.
  • the task is solved by a microorganism strain comprising a deregulated cysteine biosynthesis pathway, which is thereby suitable for the fermentative production of at least one substance selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine, characterized in that the relative expression of the crp Gene is reduced by mutation of the crp promoter sequence based on the expression of the crp gene with wild-type promoter sequence.
  • Crp encoded by the crp gene, abbreviated to cyclic AMP (cAMP) receptor protein (or "catabolite repressor protein"), also known as CAP (catabolite activator protein), is a central transcription factor that is primarily known for this is to mediate the so-called catabolite repression, ie to regulate gene expression depending on the carbon (C) source.
  • C carbon
  • Crp is activated by binding of the signaling molecule cAMP (cyclic AMP) (referred to as Crp-cAMP).
  • Crp-cAMP As a Crp-cAMP, it affects the expression of target genes, which, in addition to the utilization of carbon sources, also regulates other cellular functions such as nitrogen fixation, biofilm formation, transport of the trace element iron or osmotic balancing. Hanamura and Aiba, Nucleic Acids Res. (1991) 19: 4413-4419 also report that Crp-cAMP can repress its own expression (negative auto-regulation).
  • transcriptome analyzes e.g. Gosset et al., J. Bacteriol. (2004) 186: 3516-3524
  • Crp Crp-cAMP
  • Crp Crp is part of a branched regulatory network of global transcription factors that influence each other (outlined in Fig. 1 by Frendorf et al., Comput. Structural Biotechnol. J. (2019) 17: 730-736) and dependent on the metabolic status of the cell influence the expression of their target genes.
  • the effect on metabolism, in particular on cysteine biosynthesis, due to altered expression of the crp WT gene as a result of a mutation of the crp promoter in a microorganism strain with a deregulated cysteine biosynthesis pathway was not examined in the prior art.
  • the present invention differs from the prior art in that it is preferably not the amino acid sequence of Crp that is changed but the nucleotide sequence of the crp promoter. That is, in the prior art, the amino acid sequence and thus the activity properties of the Crp protein as a transcription factor were changed. In contrast to this, the amino acid sequence and thus the activity properties of the Crp protein (wild-type Crp) preferably remain unchanged in the present invention, but the expression, i.e.
  • the mutation of the crp promoter sequence leads to a weakened crp expression, preferably by shortening the crp Promoter sequence or by a combination of insertion and shortening of the crp promoter sequence, with the crp cds particularly preferably remaining unchanged.
  • the weakened crp expression leads to an improved production of L-cysteine in a microorganism strain with a deregulated cysteine biosynthetic pathway.
  • the mutation of the crp promoter sequence results in no crp protein being expressed at all.
  • a method for the quantitative detection of the expression of the crp gene is required.
  • various known test methods are available for the quantitative detection of gene expression.
  • An immunological detection method is based on the binding of a specific antibody to the expressed Crp protein.
  • ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
  • Western blot enable the expressed protein to be quantitatively determined in this way by a color reaction which takes place via the bound Crp-specific antibody
  • Method of quantitative detection of gene expression is based on determining the gene-specific RNA of an expressed gene such as crp RNA in the total cellular RNA (total RNA).
  • the gene whose expression is to be examined is referred to as the target gene (e.g.
  • RNA-specific RNA e.g. crp-RNA
  • RT-PCR real-time PCR
  • qPCR quantitative PCR
  • An RT-PCR analysis can, for example, be carried out as follows: 1) The cells to be analyzed (e.g. E. coli cells from the
  • RNA-stabilizing reagent e.g. RNA-Protect® "Bacteria Reagent” from Qiagen
  • the total RNA extracted e.g. using the RNeasy RNA extraction kit from Qiagen
  • quantified e.g. using the "QubitTM RNA BR Assay Kit” from Thermo Fisher Scientific.
  • RNA of the strains is used to produce complementary DNA (cDNA) by means of reverse transcription (e.g. using the QuantiNovaTM Reverse Transcription Kit from Qiagen) and the cDNA is quantified (e.g. using the "QubitTM dsDNA HS Assay Kits" from Thermo Fisher Scientific) .
  • cDNA is then used according to the prior art in an RT-PCR reaction with gene-specific primers for the target gene crp) and gene-specific primers for a reference gene (eg the cysG gene).
  • Reagent kits for preparing RT-PCR reactions e.g. from Qiagen
  • devices for carrying out RT-PCR analyzes incl. Evaluation software is commercially available.
  • an RT-PCR device from Qiagen was used (RotorGene Q 2plex RT-PCR device, operated with the RotorGene Q control and evaluation software from the same manufacturer), with which the relative expression of the crp gene in strains with a modified crp promoter based on the comparison strain E.
  • relative gene expression is defined as expression of the crp gene in the microorganism strain of the invention with a deregulated cysteine biosynthetic pathway in which the crp promoter sequence has been mutated (e.g. the Cysteine production strains E. coli W3110-crp::kan-sacB x pCys, E. coli W3110-crpP-del x pCys, E. coli W3110-crp-Preg x pCys, E.
  • coli W3110-crp described in example 3 - Preg2 x pCys and E. coli W3110-crp-Preg3 x pCys) in relation to the expression of the crp gene in a corresponding reference strain (eg in the E. coli W3110 x pCys strain with WT crp promoter).
  • the RT-PCR analysis method used in Example 5 of the present invention is based on the analysis of relative gene expression by means of quantitative RT-PCR and the so-called 2 - ⁇ CT method described by Livak and Schmittgen, Methods (2001) 25: 402-408. This evaluation method is based on the RotorGene Q control and evaluation software of the RotorGene Q 2plex RT-PCR device from Qiagen.
  • CT value The basis for determining the relative gene expression is the so-called CT value (CT: "Cycle Threshold"), which is found in the RT-PCR of the cDNA of a strain both for the crp gene (CT crp ) and for a
  • CT crp The reference gene is used to standardize the RT-PCR and is selected from known, constitutively expressed genes which are not subject to any regulation.
  • CT cysG as a reference gene, which is known to change little in expression over the course of cultivation (Zhou et al., BMC Molecular Biology (2011) 12:18).
  • the ACT value is defined as the difference between the CT values for the crp gene and the reference gene (e.g. cysG reference gene) of a strain.
  • the AACT is defined as the difference between the ACT value of a strain with altered expression of the crp gene and the ACT value of the comparison strain with WT expression of the target gene (e.g. E. coli W3110 x pCys) .
  • AACT ACT - ACT W3110 x pCys .
  • 2 - ⁇ CT value The value 2 AACT is formed from the AACT value, which is a measure of the expression of the crp gene in a modified strain compared to the expression of the crp gene in the reference strain (e.g. E. coli W3110 x pCys) and is also referred to as relative expression of the target gene.
  • the 2 - ⁇ CT value for the reference strain has the
  • Metabolic product such as the production of the amino acid L-cysteine (cf. Examples 6 and 7).
  • the area of the DNA or RNA that begins with a start codon and ends with a stop codon and codes for the amino acid sequence of a protein is called the open reading frame (ORF, synonymous with cds, coding sequence).
  • the ORF is also referred to as the coding region or structural gene.
  • the section of DNA that contains all the basic information for the production of a biologically active RNA is called a gene.
  • a gene contains the DNA section from which a single-stranded RNA copy is produced by transcription and the expression signals involved in the regulation of this copying process.
  • the expression signals include, for example, at least one promoter, a transcription start, a translation start and a ribosome binding site. Furthermore, a terminator and one or more operators are possible as expression signals.
  • a nucleotide sequence which is upstream of the 5′ end of the cds and which enables the expression of a gene is referred to as a promoter.
  • the promoter is in front of the RNA coding region in the direction of synthesis.
  • the promoter contains regions of specific interaction with DNA-binding proteins that mediate the initiation of transcription of the gene by RNA polymerase and are termed transcription factors.
  • a mutation is a change in the genetic material, encompassing a change in the DNA sequence and, if protein-coding sequences are affected, also the amino acid sequence of proteins.
  • a mutation includes the replacement, insertion and/or deletion of one or more nucleotides or one or more amino acids.
  • An exchange denotes the exchange of one or more nucleotides for other nucleotides of a DNA or a or more amino acids against other amino acids of a protein.
  • the length of the DNA sequence or the protein sequence remains unchanged.
  • An insertion refers to the incorporation of additional nucleotides into a DNA or additional amino acids into a protein. The term insertion also includes elongations.
  • nucleotides or also parts of a nucleotide sequence are missing.
  • mutations also include the combination of replacement, deletion and insertion.
  • the proteins such as Crp begin with a capital letter, while the genes of these protein-encoding sequences are designated with a lower case letter (e.g. crp).
  • E. coli crp gene in SEQ ID NO: 1 from nucleotide 565-865 designates the promoter region of the crp gene and SEQ ID NO: 1 from nucleotide 866-1495 designates the cds of the crp gene from E. coli.
  • E. coli Crp denotes the protein encoded by this cds, given in SEQ ID NO: 2. The protein is the Crp protein.
  • WT designates the wild type.
  • the wild-type gene, wild-type promoter designates the form of the gene, promoter that has arisen naturally through evolution and is present in the wild-type genome.
  • the DNA sequence of wt genes, wt promoters is publicly available in databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information, US National Library of Medicine). Alleles are defined as the states of a gene that can be converted into one another by mutation, ie by changes in the nucleotide sequence of the DNA.
  • the gene that occurs naturally in a microorganism is referred to as the wild-type allele and the variants derived from it as mutated alleles of the gene.
  • homologous genes or homologous sequences mean that the DNA sequences of these genes or DNA sections are at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% identical.
  • the degree of DNA identity is determined by the "nucleotide blast” program found at http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, which is based on the blastn algorithm. Parameters for an alignment of two or more nucleotide sequences, the default parameters were used.
  • This program uses the blastp algorithm Algorithm parameters for an alignment of two or more protein sequences, the default parameters were used.
  • the relative expression of the crp gene is preferably reduced to a 2 - ⁇ CT value of at least 0.91, particularly preferably to a 2 - ⁇ CT , as a result of the mutation of the crp promoter sequence value of at least 0.5 and particularly preferably to a 2 - ⁇ CT value of 0.03, the expression of the crp gene in microorganisms having a wild-type promoter being normalized to a 2 - ⁇ CT value of 1.00.
  • the relative expression of the crp gene is preferably determined as described in example 5.
  • the crp gene expression of the microorganisms according to the invention is at least 0.91 reduced 2 - ⁇ CT value maximum 91%, with a 2- ⁇ CT value reduced to at least 0.5 maximum 50% and with a 2 - ⁇ CT value reduced to at least 0.03 maximum 3% of the expression of the crp- Gene with wild-type promoter.
  • the method is preferably characterized in that the crp expression of the microorganism strain with an altered crp promoter sequence is reduced by at least 9% compared to a corresponding microorganism strain with a Wt crp promoter sequence and the yield of L-cysteine in g/l is increased by at least 10% (w/v) when using the microorganism strain.
  • Compared to/in comparison to/related to the (corresponding) expression of the crp gene with wild-type promoter activity of the crp wild-type promoter or WT expression means in the context of this invention in comparison to the activity of the crp promoter which corresponds to the non-mutated form of the crp promoter from a microorganism, ie from the crp promoter which Co 12111/Reu arose naturally through evolution and is present in the wild-type genome of this microorganism.
  • microorganism strains suitable for the fermentative production of L-cysteine, L-cystine or thiazolidine include all microorganisms which contain a deregulated cysteine biosynthetic pathway which leads to the synthesis of cysteine, cystine or thiazolidine.
  • Such strains are disclosed, for example, in EP 0 885 962 B1, EP 1382 684 B1, EP 1220 940 B2, EP 1769 080 B1 and EP 2138 585 B1 and WO 2021/259491.
  • the microorganism strain with deregulated cysteine biosynthetic pathway is characterized by at least one of the following changes: a) The microorganism strain is characterized by a modified serA gene, coding for a 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA). a feedback inhibition by L-serine that is reduced by a factor of at least two compared to the corresponding wild-type enzyme (as described, for example, in EP 1950 287 B1), where the SerA enzyme activity can be determined photometrically by the SerA substrate 3 -Phospho-hydroxypyruvate dependent oxidation of NADH such as by McKitrick and Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141:235-245.
  • SerA enzyme activity can be determined photometrically by the SerA substrate 3 -Phospho-hydroxypyruvate dependent oxidation of NADH such as by McKitrick and Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141:235-245.
  • 3-phosphoglycerate dehydrogenase have a reduced by at least a factor of 5, particularly preferably by a factor of at least 10 and in an additionally preferred embodiment by a factor of at least 50 compared to the corresponding wild-type enzyme feedback inhibition by L-serine.
  • the microorganism strain contains an altered cysE gene, coding for a serine-O-acetyl-transferase (CysE) which, compared to the corresponding wild-type enzyme, has feedback inhibition that is reduced by a factor of at least two Has cysteine (as described, for example, in EP 0858 510 Bl or Nakamori et al.1998 (see above), in which case the CysE enzyme activity can be determined photometrically by the consumption of the CysE substrate acetyl-CoA as a result of the reaction with L-serine O-acetyl-L-serine, as described, for example, by Nakamori et al., 1998 (see above).
  • CysE serine-O-acetyl-transferase
  • particularly preferred variants of the serine-O-acetyl-transferase have a conversion by a factor of at least 5, particularly preferably by a factor of at least 10 and in an embodiment that is more preferred feedback inhibition by cysteine was reduced by a factor of at least 50.
  • the microorganism strain has a cysteine export from the cell which is increased by a factor of at least two by overexpression of an efflux gene compared to the corresponding wild-type cell, it being possible for the cysteine export to be determined by photometric measurement of the extracellular cys- tein content according to Gaitonde, Biochem. J.
  • an efflux gene preferably leads to a cysteine export from the cell that is increased by a factor of at least 5, particularly preferably by a factor of at least 10, particularly preferably by a factor of at least 20, compared to a wild-type cell.
  • the efflux gene preferably comes from the group ydeD (see EP 0885 962 B1), yfiK (see EP 1382 684 B1), cydDC (see WO 2004/113373 A1), bcr (see US 2005-221453 AA) and emrAB (see US 2005 -221453 AA) from E. coli or the corresponding homologous gene from another microorganism. and/or d) the microorganism strain can also be characterized in that at least one cysteine-degrading enzyme weakened to such an extent that the cell contains only a maximum of 50% of this enzyme activity compared to a wild-type cell.
  • the cysteine-degrading enzyme preferably comes from the group of tryptophanase (TnaA) and cystathionine-ß-lyase (MalY, MetC).
  • microorganism strains described in the previous sections which are suitable for the fermentative production of L-cysteine, L-cystine or thiazolidine, are so deregulated in their cysteine metabolism that they have an increased cysteine metabolism compared to the non-deregulated microorganism strain amount of L-cysteine.
  • a cysteine-producing strain or microorganism strain capable of cysteine production is characterized in that it has a deregulated cysteine biosynthetic pathway.
  • an increased amount preferably means any amount that exceeds 0.05 g/l L-cysteine measured in the culture mixture exceeds 24 hours of cultivation.
  • the amount of cysteine can be quantified, for example, using the colorimetric test of Gaitonde 1967 (see above), as described in Example 6 (cf. Table 2, strain W3110 and strain W3110 x pCys).
  • microorganism strain according to the invention with a deregulated cysteine biosynthetic pathway, mutated crp promoter sequence and thereby reduced relative expression of the crp gene forms compared to the corresponding microorganism strain, ie this is also characterized by a deregulated cysteine biosynthetic pathway, with expression of the crp gene with a wild-type promoter an increased amount of a substance selected from L-cysteine, L- Cystine and thiazolidine, which is a great benefit.
  • L-cysteine or one of its derivatives selected from L-cystine or thiazolidine is always meant.
  • the amount of cysteine produced preferably means total cysteine, i.e. the sum of L-cysteine, L-cystine and thiazolidine produced.
  • L-cystine that is produced can be reduced to L-cysteine and then also included in the measurement of cysteine produced. If, for example, the colorimetric test by Gaitonde (see above) is used for the determination, this test cannot distinguish between L-cysteine and the condensation product of cysteine and pyruvate described in EP 0885 962 B1 under the strongly acidic reaction conditions.
  • the microorganism strain forms an increased amount of a substance selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine, preferably L-cysteine and L-cystine and particularly preferably L-cysteine.
  • the microorganism strain is preferably characterized in that the amino acid sequence of the Crp protein is not mutated.
  • the amino acid sequence of the Crp protein is the Wt sequence, which is given in SEQ ID NO:2.
  • the coding sequence of crp includes only so-called silent mutations or no mutation at all. Due to the degenerate genetic code, silent mutations are defined as changes in a cds that do not change the amino acid sequence derived from it. This means that the crp cds is the same as the wt DNA sequence available in the NCBI database for crp of the corresponding organism or only comprises silent mutations and for a non-mutated crp protein with the wt protein -Sequence encoded.
  • the promoter sequence of the crp gene of a microorganism strain is mutated.
  • mutations in the crp promoter sequence include changes in the way a) that the crp promoter sequence of the crp gene is partially or completely deleted and / or b) that the crp promoter sequence of the crp gene by a or several insertions or 5′ or 3′ elongations and/or c) that the crp promoter sequence of the crp gene contains one or more point mutations, with the result that the expression of the crp gene is reduced , ie weakened or completely suppressed.
  • reduced means that the crp gene expression of the microorganisms according to the invention preferably accounts for at most 91%, particularly preferably at most 50% and particularly preferably at most 3% of the expression of the crp gene with wild-type promoter. carries. In a particularly preferred embodiment, there is none crp gene expression can be detected in the microorganisms according to the invention.
  • the crp protein particularly preferably has no mutation, i.e. the amino acid sequence is unchanged compared to the wt.
  • any combination of the genetic modifications listed in a) to c) in the promoter of the crp gene is also possible within the meaning of the invention.
  • the expression of the crp gene is weakened or completely suppressed by changes in the crp promoter.
  • a weakening of the crp expression can also be achieved in that the crp promoter is completely or partially replaced by an alternative weak promoter.
  • the modification of the crp promoter in the strain according to the invention is particularly preferably based on complete or partial deletion of the crp promoter or modification of the crp promoter by one or more insertions or 5′ or 3′ elongations, or a combination from deletion and insertion.
  • the modification of the crp promoter in the strain according to the invention is particularly preferably based on a complete or partial deletion of the crp promoter.
  • the microorganism strain is preferably characterized in that the mutation in the crp promoter sequence comprises at least one deletion or insertion, particularly preferably at least one deletion.
  • the mutation in the crp promoter sequence which preferably comprises the sequence given in SEQ ID NO: 1 nt 565-865, is at least one deletion or insertion and the coding sequence of crp not mutated.
  • the microorganism strain is preferably characterized in that at least nt 565-624 of the crp promoter sequence given in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 is deleted.
  • the crp promoter sequence comprises at most nt 625-865 from SEQ ID NO: 1.
  • the microorganism strain is particularly preferably characterized in that the crp promoter sequence given in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 is completely deleted.
  • the microorganism strain is preferably characterized in that the microorganism strain is a strain from the Enterobacteriaceae or Corynebacteriaceae family, particularly preferably a strain from the Enterobacteriaceae family.
  • Such strains are commercially available, for example, from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (Braunschweig).
  • the microorganism strain is preferably selected from the group consisting of Escherichia coli, Pantoea ananatis and Corynebacterium glutamicum, particularly preferably from the group consisting of Escherichia coli and Pantoea ananatis.
  • the microorganism strain is particularly preferably a strain of the Escherichia coli species.
  • the E. coli strain is preferably selected from E. coli K12, particularly preferably E. coli K12 W3110.
  • Such strains are commercially available, for example, from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (Braunschweig), including E. coli K12 W3110 DSM 5911 (id. ATCC 27325) and Pantoea ananatis DSM 30070 (id. ATCC 11530).
  • the crp gene from E. coli K12 is accessible, for example, in the NCBI gene database as an entry in the E. coli Genbank Reference Sequence with the accession number NC_000913.3, nt 3485255 - nt 3486950 (SEQ ID NO: 1).
  • the crp gene from Pantoea ananatis is e.g. accessible in the NCBI gene database as an entry in the P. ananatis Genbank Reference Sequence with the accession number NC_017554.1, nt 430825 - nt 431818 (crp-cds: nt 430883 - nt 431515; gene identification number 57266449).
  • the microorganism strain is characterized in that the mutated crp promoter sequence is selected from the group consisting of the promoter sequences of the crp gene from Escherichia coli, the crp gene from Pantoea ananatis and one of these Sequences homologous sequence, where the definition given above applies to the term homologous sequence.
  • the crp gene is preferably the crp gene from E. coli with the promoter region given in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 and the crp cds given in SEQ ID NO: 1, nt 866-1495 , coding for a Crp protein with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2.
  • the microorganism strain is preferably characterized in that the expressed Crp protein is SEQ ID NO:2. That is, the Crp protein that is expressed has the Wt sequence (SEQ ID No:2), the mutation only affects the crp promoter sequence (SEQ ID NO: 1 nt 565-865).
  • the production strain according to the invention can be further optimized in order to further improve the cysteine production. The optimization can be carried out, for example, by genetic engineering by additionally expressing one or more genes which are suitable for improving the production properties. These genes can be expressed in a manner known per se as separate gene constructs or also combined as an expression unit (as a so-called operon) in the production strain.
  • the production strain can be optimized by inactivating, in addition to reducing the expression of the crp gene, other genes whose gene products have a negative effect on cysteine production.
  • optimization is also possible in a manner known per se by mutagenesis and selection of strains with improved cysteine production.
  • the weakening or complete suppression of the expression of the crp gene is achieved by adding an inhibitor, be it a chemical or protein inhibitor, with the inhibitor inhibiting the activity of the crp promoter and not on the activity of the Crp protein.
  • the starting strain can be subjected to mutagenesis in a known manner (eg chemically using mutagenic chemicals such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or physically using UV irradiation), with random mutations being generated in the genomic DNA and the desired mutant with altered crp promoter is then selected from the large number of mutants generated, eg, after isolation of the mutants, by quantitative determination of the crp protein (eg immunologically by Western blotting with a crp-specific antibody) or by quantitative determination of crp expression by eg RT-PCR. Only mutants with a modified crp promoter are selected in each case, while the crp cds remains unchanged and corresponds to the wild-type sequence.
  • mutagenic chemicals such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or physically using UV irradiation
  • the promoter of the crp gene can be specifically modified in a simpler manner, e.g. by the known mechanism of homologous recombination.
  • Cloning systems for targeted gene inactivation by means of homologous recombination are known to the person skilled in the art and are commercially available, as disclosed, for example, in the user manual for the "Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", based on the Red®/ET® technology from Gene Bridges GmbH ( see "Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012" and literature cited therein).
  • the crp promoter or part of the promoter can be isolated and a foreign DNA cloned into the crp promoter, thereby changing the sequence of the promoter.
  • a DNA construct suitable for the targeted modification of the crp promoter can therefore consist of a 5′ DNA section which is homologous to the genomic crp promoter, followed by a gene section comprising the foreign DNA and then connected to a 3′ DNA segment, which in turn is homologous to the genomic crp promoter.
  • the region of the crp promoter that is relevant for the homologous recombination cannot only include the sequence region of the promoter.
  • the region of interest may also include DNA sequences flanking the promoter, namely the 5' flanking sequence in front of the start of the crp promoter (eg nt 1-564 in SEQ ID NO: 1).
  • DNA sequences in the 3′ region of the crp promoter relate to the cds of the crp gene (crp cds, nt 866-1498 in SEQ ID NO: 1), it being ruled out that the cds of the crp gene altered by homologous recombination.
  • the foreign DNA is preferably a selection marker expression cassette, for example selected from the class of antibiotic resistance genes.
  • Another such system for targeted gene inactivation based on homologous recombination is a method for genetic modification known to the person skilled in the art and described in Examples 1 and 2, based on a combination of lambda-red recombination with counter-selection screening. This system is described, for example, in Sun et al., Appl. approx. microbiol. (2008) 74: 4241-4245.
  • a DNA construct is used to inactivate the crp promoter, for example, starting from the 5' end, consisting of a sequence homologous to the crp gene (comprising the 5' region of the crp promoter) followed by two Expression cassettes in any order, consisting of a) an expression cassette of the selection marker selected from the class of antibiotic resistance genes and b) an expression cassette of the sacB gene, coding for the enzyme levan sucrase and finally followed by another one homologous to the crp gene Sequence (including, e.g., sequences of the crp cds 3' flanking the crp promoter).
  • the DNA construct is transformed into the production strain and antibiotic-resistant clones are isolated.
  • the clones obtained are distinguished by the fact that they cannot grow on sucrose as a result of the sacB gene that was also included.
  • the two marker genes can be removed by replacing the two marker genes by homologous recombination with a suitable DNA fragment in a second step.
  • the clones obtained in this step can then grow again on sucrose and are then also sensitive to the antibiotic again.
  • This method is used in Examples 1 and 2 for the targeted shortening of the E. coll crp promoter (SEQ ID NO: 1, nt 565 - 865).
  • a DNA fragment suitable for this step comprises, starting from the 5' end, a sequence homologous to the target gene, for example the crp gene, of at least 20 nt in length, followed by a DNA section which contains the desired altered DNA
  • the sequence contains, for example, a shortened crp promoter and finally a further sequence which is at least 20 nt in length and is homologous to the target gene, for example the crp gene.
  • the DNA fragment can be produced chemically, for example, by gene synthesis or, as in example 2, from individual DNA fragments by the known so-called OE-PCR (overlap extension PCR, as described, for example, in Hilgarth and Lanigan, MethodsX (2020) 7: 100759 , https://doi.org/10.1016/j.mex.2019.12.001).
  • OE-PCR overlap extension PCR
  • E. coli strain is disclosed in the examples as an example of a strain according to the invention, which exhibits weakened crp expression due to a combination of insertion of the Kan-sacB cassette and deletion in the crp promoter: W3110-crp: :kan-sacB.
  • W3110-crp::kan-sacB the 3.2 kb Kan-sacB cassette is inserted in the crp promoter between nt 640 and nt 714 of SEQ ID NO: 1, thereby simultaneously 73 nt (SEQ ID NO: 1, nt 641 - nt 713) of the crp promoter were deleted (see Example 1).
  • E. coli strains are disclosed in the examples (Example 2) as examples of strains according to the invention which have weakened crp expression due to a shortening of the crp promoter:
  • W3110-crpP-del deletion nt 565 - nt 865 from SEQ ID NO: 1
  • W3110-crp-Preg deletion nt 565 - nt 713 from SEQ ID NO: 1
  • W3110-crp-Preg2 deletion nt 565 - nt 675 from SEQ ID NO: 1
  • W3110-crp-Preg3 deletion nt 565 - nt 624 from SEQ ID NO: 1
  • the relative expression of the crp gene in the strains transformed with the plasmid pCys was still the following fractions of the normalized to 1 expression of the strain W3110 x pCys with wild-type crp promoter (see example 5 , Tab. 1): In E. coli W3110-crpP-del x pCys with a completely deleted crp promoter (deletion nt 565 - nt 865 from SEQ ID NO: 1, the relative crp expression was still 0.03- times the wild-type crp promoter In E.
  • the crp promoter had been shortened by 149 nt (deletion nt 565-nt 713 from SEQ ID NO: 1). The relative crp expression was still 0.05 times that of the wild-type crp promoter.
  • the crp promoter had been shortened by 111 nt (deletion nt 565 - nt 675 from SEQ ID NO: 1 ). The relative crp expression was still 0.5 times that of the wild-type crp promoter.
  • E. coli W3110-crp-Preg2 x pCys the crp promoter had been shortened by 111 nt (deletion nt 565 - nt 675 from SEQ ID NO: 1 ). The relative crp expression was still 0.5 times that of the wild-type crp promoter.
  • E. coli W3110-crp-Preg2 x pCys the crp promoter had been shortened by 111 nt (deletion nt 565
  • the crp promoter had been shortened by 60 nt (deletion nt 565 - nt 624 from SEQ ID NO: 1). The relative crp expression was still 0.91 times that of the wild-type crp promoter.
  • deletion or a combination of insertion and deletion increases the relative expression of the value 1 crp gene for the wild-type crp promoter by at least 0.91-fold, more preferably at least 0.91-fold is attenuated to 0.5 times and more preferably to at least 0.33 times.
  • the strain of the invention characterized by altering the crp promoter in a manner that results in attenuation of crp expression, such as E.
  • coli strains W3110-crp::kan-sacB, W3110-crpP-del, W3110-crp -Preg, W3110-crp-Preg2 or W3110-crp-Preg3, can be produced by using the previously described combination of Lambda-Red recombination with a counter-selective screen for genetic modification (see e.g. Sun et al. 2008, see above) as disclosed in Examples 1 and 2.
  • strains are E. coli W3110-crp-Preg2 and E. coli W3110-crp-Preg3 (described in Example 2).
  • Another object of the invention is a method comprising the production of at least one compound selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine, characterized in that the microorganism strains according to the invention are used.
  • the method can be a cultivation of the microorganism strains according to the invention in a shake flask (laboratory scale) or fermenter (production scale), preference being given to a method in a fermenter (production scale).
  • a specific medium and pH is also specified for shake flask culture and cultivated in the presence of oxygen and with permanent movement (shaking), more defined conditions regarding the medium (e.g.
  • L-cysteine is formed as the primary product of the process according to the invention. Oxidation produces poorly soluble L-cystine according to equations (1) to (3), which accumulates as a precipitate during the fermentation (EP 0885 962 B1, EP 2 707 492 B1). Formation of an adduct with pyruvate results in thiazolidine, which accumulates in the culture supernatant (EP 0885 962 B1).
  • the method is preferably characterized in that the L-cysteine, L-cystine or thiazolidine formed is isolated.
  • the isolation of L-cysteine is disclosed in EP 2 699544 B1 and EP 1 958 933 B1.
  • Precipitated L-cystine can be separated from the remaining components, for example using a decanter, followed by dissolving the crude product with a mineral acid, clarifying the crude product solution by centrifugation or filtration, decolorizing the solution and precipitation crystallization (EP 2 707492 Bl ).
  • the yield of total cysteine is defined as the sum of the cysteine, cystine and thiazolidine produced. This is determined from the entire culture batch, as described in Example 7. It can be quantified, for example, using the Gaitonde colorimetric test (Gaitonde, M.K. (1967) Biochem. J. 104, 627-633).
  • the weakening of crp expression in a microorganism strain suitable for cysteine, cystine or thiazolidine production with deregulated cysteine biosynthesis is suitable in a fermentative process to significantly increase the yields of total cysteine, ie the sum of the cysteine, cystine and thiazolidine produced. In the prior art, this was totally unexpected.
  • the weakening of the expression of the crp gene by deletion or a combination of insertion and deletion in the crp promoter thus represents a new, useful measure for improving cysteine production in other cysteine-producing strains as well.
  • the expression of the crp gene is correspondingly weakened by deletion or a combination of insertion and deletion in the crp promoter and at the same time cysteine production is increased, with changing the crp-cds is excluded.
  • Example 7 proves that a strain capable of cysteine production with deregulated cysteine biosynthesis and weakened expression of the crp gene by deletion or a combination of insertion and deletion in the crp promoter achieves significantly higher cysteine yields in the fermentation than a strain ent - holding the WT promoter of the crp gene, the crp cds remaining unchanged in all strains according to the invention.
  • biomass of the production strain according to the invention and on the other hand cysteine and its oxidation product cystine are formed.
  • the formation of biomass and cysteine can correlate in time or be decoupled from each other in time.
  • Cultivation takes place in a manner familiar to a person skilled in the art.
  • cultivation can take place in shake flasks (laboratory scale) or in a fermenter (production scale).
  • the microorganism strain is characterized in that it is deregulated in the cysteine biosynthetic pathway and contains at least one mutation in the promoter of the crp gene. At the same time, the strain forms an increased amount of L-cysteine compared to the strain with the wild-type crp promoter.
  • the genetic modification in the promoter of the crp gene preferably leads to the expression of the crp gene being increased by at least 9% (2 - ⁇ CT value ⁇ 0.91), particularly preferably by at least 50% (2 ⁇ CT value ⁇ 0.5) and particularly preferably by at least 67% (2 ⁇ CT value ⁇ 0.33).
  • the method is preferably characterized in that the crp expression of the microorganism strain with a modified crp promoter sequence is increased by at least 9%, particularly preferably by at least 50% and particularly preferably by at least 9% compared to a corresponding microorganism strain with a Wt crp promoter sequence is reduced by at least 67% and the yield of a substance selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine in g/l when using the microorganism strain is reduced by at least 10% (w/v), particularly preferably by at least 20% (w /v) and particularly preferably increased by at least 50% (w/v).
  • the microorganism strain forms an increased amount of a substance selected from L-cysteine, L-cystine and thiazolidine, preferably L-cysteine and L-cystine and particularly preferably L-cysteine.
  • the total cysteine production (volume production in g/L), ie the cysteine, cystine and thiazolidine produced, is preferred to the reference strain with WT crp promoter when cultured in a shake flask or in a fermenter at least 10% (w/v), particularly preferably at least 20% (w/v) and particularly preferably at least 50% (w/v).
  • the volume production of the shake flask cultivation within 24 h is preferably at least 0.37 g/L (Tab. 2) and the volume production in the Fermentation within 48 hours preferably at least 15.9 g/L (Tab.
  • the method is preferably characterized in that the method is a fermentative method and the fermentation volume is at least 1 L. Particularly preferably greater than 10 L, particularly preferably greater than 1000 L and especially preferably greater than 10000 L.
  • the fermentative process is particularly preferably a process in the fermenter.
  • Cultivation media are familiar to a person skilled in the art from the practice of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source) and additives such as vitamins, salts and trace elements and a sulfur source (S source) through which cell growth and cysteine production be optimized.
  • C source carbon source
  • N source nitrogen source
  • S source sulfur source
  • C sources are those that can be used by the production strain for cysteine product formation.
  • C6 sugars hexoses
  • pentoses such as xylose, arabinose or ribose
  • di- and polysaccharides formed from them such as sucrose, lactose, maltose, maltodextrin, starch , or the monomers or oligomers released therefrom by hydrolysis (enzymatically
  • carbon sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or acetate salts derived therefrom), ethanol, glycerol, citric acid (and its salts) or pyruvate (and its salts).
  • gaseous C sources such as carbon dioxide or carbon monoxide are also conceivable.
  • Preferred carbon sources for growing the production strains are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose and arabinose, including particularly preferably glucose and sucrose and particularly preferably glucose.
  • N sources are those that can be used by the production strain to form biomass. This includes ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH4OH or its salts such as e.g. B. ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate. Furthermore, the known nitrate salts such as e.g. B. KNO3, NaNO 3 , ammonium nitrate, Ca (NO 3 ) 2 , Mg (NO 3 ) 2 and other N sources such as urea.
  • NH4OH ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH4OH or its salts such as e.g. B. ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate.
  • the known nitrate salts such as e.g. B. KNO3, NaNO 3 , ammonium
  • the N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or also dried as so-called CSD) as well as NZ amines and yeast nitrogen Base.
  • complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or also dried as so-called CSD) as well as NZ amines and yeast nitrogen Base.
  • a sulfur source either as a one-off addition in batch form or as a continuous feed, is required for the efficient production of cysteine and cysteine derivatives.
  • the continuous dosing can take place as a pure feed solution or in a mixture with another feed component such as glucose.
  • Suitable sources of sulfur are salts of sulfates, sulfites, dithionites, thiosulfates or sulfides, with the use of the respective acids also being conceivable with a given stability.
  • Preferred sulfur sources are salts of sulfates, sulfites, thiosulfates and sulfides, including particularly preferably salts of sulfates and thiosulfates and particularly preferably salts of thiosulfate, such as sodium thiosulfate and ammonium thiosulfate.
  • Cultivation can take place in the so-called batch mode, whereby the cultivation medium is inoculated with a starter culture of the production strain and the cell growth then takes place without further feeding of nutrient sources. Cultivation can also be done in the so-called fed-batch mode, after an initial phase of Additional nutrient sources are fed to growth in batch mode (feed) in order to balance their consumption.
  • the feed can consist of the C source, the N source, the sulfur source, one or more vitamins or trace elements important for production, or a combination of the above.
  • the feed components can be metered in together as a mixture or separately in individual feed sections. In addition, other media components and additives that specifically increase cysteine production can also be added to the feed.
  • the feed can be supplied continuously or in portions (discontinuously), or else in a combination of continuous and discontinuous feed. Fed-batch cultivation is preferred.
  • Preferred carbon sources in the feed are glucose, sucrose and plant hydrolyzates containing glucose or sucrose and mixtures of the preferred carbon sources in any mixing ratio.
  • a particularly preferred C source in the feed is glucose.
  • the C source is preferably added to the culture in such a way that the content of the carbon source in the fermenter does not exceed 10 g/L during the production phase.
  • a maximum concentration of 2 g/L is preferred, particularly preferably 0.5 g/L, particularly preferably 0.1 g/L.
  • N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH4OH and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, also urea, KNO 3 , NaNO 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids , corn steep liquor (corn steep liquor) and also NZ amines and yeast nitrogen base, including particularly preferably ammonia or ammonium salts, yeast extract, soy peptone or corn steep liquor (liquid or in dried form).
  • Preferred sources of sulfur in the feed are salts of sulfates, sulfites, thiosulfates and sulfides, including particularly preferably salts of sulfates and thiosulfates and particularly preferably salts of thiosulfate, such as sodium thiosulfate and ammonium thiosulfate.
  • organic acids e.g. acetate, citrate
  • amino acids e.g. isoleucine
  • vitamins e.g. vitamin Bl, vitamin B6
  • the useful pH range is from pH 5 to pH 9.
  • a pH range from pH 5.5 to pH 8 is preferred.
  • a pH range from pH 6.0 to pH 7.5 is particularly preferred.
  • the preferred temperature range for growth of the production strain is 20°C to 40°C.
  • the temperature range from 25°C to 37°C is particularly preferred and from 28°C to 34°C is particularly preferred.
  • the growth of the production strain can optionally take place without the supply of oxygen (anaerobic cultivation) or with the supply of oxygen (aerobic cultivation). Aerobic cultivation with oxygen is preferred.
  • the oxygen saturation in the culture is regulated automatically via a combination of gas supply and stirring speed.
  • the oxygen supply is ensured by the introduction of compressed air or pure oxygen. Aerobic cultivation by introducing compressed air is preferred.
  • the useful range of compressed air supply in aerobic cultivation is 0.05 vvm to 10 vvm (vvm: entry of compressed air into the fermentation batch given in liters of compressed air per liter of fermentation volume per minute).
  • Preference is given to introducing compressed air from 0.2 vvm to 8 vvm, particularly preferably from 0.4 to 6 vvm and particularly preferably from 0.8 to 5 vvm.
  • the maximum stirring speed is 2500 rpm, preferably 2000 rpm and particularly preferably 1800 rpm.
  • the cultivation time is between 10 h and 200 h.
  • a cultivation time of 20 h to 120 h is preferred.
  • a cultivation time of 30 h to 100 h is particularly preferred.
  • Cultivation mixtures obtained by the method described above contain L-cystine in a precipitated form, which is formed from the primary product L-cysteine according to equations (1) to (3) (EP 0885 962 Bl, EP 2 707492 Bl) .
  • L-cysteine can also be the main product, which accumulates dissolved in the culture supernatant (EP 2 726625 B1).
  • the cysteine or cystine contained in the cultivation batches can either be used directly without further processing or can be isolated from the cultivation batch.
  • the method is preferably characterized in that the cysteine or cystine formed is isolated.
  • cysteine and cystine Process steps are available, including centrifugation, decantation, dissolving the crude product with a mineral acid, filtration, extraction, chromatography or crystallization, or precipitation. These process steps can be combined in any form in order to isolate the cysteine in the desired purity. The desired degree of purity depends on the further use. Processes for isolating L-cysteine are disclosed in EP 2 699544 B1 and EP 1958 933 B1. The procedure for isolating L-cystine is described in EP 2 707492 Bl.
  • the cystine obtained during processing can be reduced to cysteine for further use.
  • a method for reducing L-cystine to L-cysteine in an electrochemical process is disclosed in EP 0235 908.
  • the invention can also be used to produce improved microorganism strains for the fermentative production of compounds whose biosynthesis starts from 3-phosphoglycerate and leads via L-serine to L-cysteine and L-cystine.
  • This also includes microorganism strains for the fermentative production of derivatives of L-serine and L-cysteine, including phosphoserine, O-acetylserine, N-acetylserine and thiazolidine.
  • FIG. 1 shows the 6.3 kb vector pKD46 used in example 1 and example 2.
  • FIG. FIG. 2 shows the 5 kb vector pKan-SacB used in Example 1.
  • FIG. 3 shows the 7.1 kb vector pCys used in example 3.
  • bla gene conferring resistance to ampicillin (ß-lactamase)
  • kanR gene conferring resistance to kanamycin
  • araC araC gene (repressor gene)
  • P araC promoter of the araC gene
  • P araB promoter of the araB gene
  • Bet Lambda Phage Bet recombination gene
  • RepA gene for plasmid replication protein
  • a sacB levansucrase gene pr-f: binding site f for primer (forward)
  • pr-r binding site r for primer (reverse)
  • TetR gene conferring resistance to tetracycline
  • P15A LOCATION origin of replication serA317: serA (3-phosphoglycerate dehydrogenase gene coding for
  • ORF306 ydeD (cysteine efflux gene) cds
  • Example 1 Production of the strain E. coli W3110-crp ::kan-sacB
  • Escherichia coli K12 W3110 (commercially available under the strain number DSM 5911 from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) was used as the starting strain for the isolation of DNA and for strain development.
  • the target of the gene modification was the promoter region of the crp gene from E. coli.
  • the DNA sequence of the crp gene region comprising the cds of the divergently expressed yhfA gene, the crp promoter region and the cds of the crp gene from E. coli K12 (Genbank NCBI Reference Sequence NC_000913.3, nt 3485255 - nt 3486950 ) is disclosed in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotides 163-564 (designated E. coli yhfA) comprise the cds of the yhfA gene in reverse-complementary form.
  • Nucleotides 866-1495 (designated E. coli crp) comprise the cds of the crp gene encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the intergenic region between the divergently expressed genes yhfA and crp comprising nucleotides 565-865 in SEQ ID NO: 1, contains the promoter sequence of the crp gene. Analysis of the crp promoter region is described in Hanamura and Ajba 1991 (supra).
  • the strain E. coli W3110-crp::kan-sacB characterized by integration of the kan-sacB cassette in the crp promoter, was produced by using the combination of Lambda-Red recombination and a counterselection known to those skilled in the art. Screening for genetic modification (see e.g. Sun et al. 2008, see above).
  • E. coli W3110 was transformed with the plasmid pKD46 and transformants were plated on LBamp plates (10 g/L tryptone from GIBCOTM, 5 g/L yeast extract from BD Biosciences, 5 g/L NaCl, 1.5% agar, 100 mg/L ampicillin from Sigma-Aldrich). An ampicillin resistant clone was selected, which was named E. coli W3110 x pKD46.
  • the 6.3 kb plasmid pKD46 (so-called “Red Recombinase” plasmid, FIG. 1) is disclosed in the “GenBank” gene database under the accession number AY048746.1. 2.
  • the 3.2 kb Kan-sacB cassette was isolated from plasmid pKan-SacB by PCR with primers crp-9f (SEQ ID NO: 3) and crp-10r (SEQ ID NO: 4).
  • the 5 kb plasmid pKan-sacB (FIG. 2) contains expression cassettes both for the kanamycin (kanR) resistance gene and for the sacB gene, coding for the enzyme levansucrase.
  • the E. coli kanamycin resistance gene encoding an aminoglycoside phosphotransferase is disclosed in the NCBI database under accession number SH02_03400.
  • the B. subtilis sacB gene is disclosed in the NCBI database under accession number 936413.
  • the primer crp-9f contained 50 nt from the crp promoter region (nt 591-640 in SEQ ID NO: 1) followed by 20 nt specific for the plasmid pKan-SacB (designated “pr-f” in Fig. 2)
  • the primer crp-10r contained 51 nt from the crp promoter region (nt 714-764 in SEQ ID NO: 1, in reverse-complementary form) and connected thereto 21 nt specific for the plasmid pKan-SacB (designated as “pr -r” in Fig. 2).
  • coli W3110 x pKD46 was transformed with the 3.2 kb PCR product specific for the crp promoter region and kanamycin-resistant clones on LBkan plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract , 5 g/L NaCl, 1.5% agar, 15 mg/L kanamycin). 4. Kanamycin-resistant clones were plated on LBSC plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 7% sucrose, 1.5% agar and 15 mg/L kanamycin) inoculated. Clones with an integrated sacB gene produced toxic levan from sucrose, which led to growth inhibition. 5. From cells from the cultivation of kanamycin-resistant and sucrose-sensitive clones in LBkan medium (10 g/L tryptone,
  • Genomic DNA was prepared in a PCR reaction ("PhusionTM High-Fidelity" DNA polymerase, Thermo ScientificTM) with the primers crp-7f (SEQ ID NO: 5) and crp-8r (SEQ ID NO: 6) used to demonstrate the integration of the Kan-sacB cassette.
  • E. coli W3110 wild-type DNA yielded a DNA fragment of 1696 nt (corresponding to the sequence from SEQ ID NO: 1) in the PCR reaction, as expected for the intact gene structure of yhfA cds, crp promoter and crp cds.
  • kanamycin-resistant clones yielded a DNA fragment of approximately 4800 nt in the PCR reaction, as expected for the case that the 3.2 kb PCR product was present at the sites defined by the crp-9f and crp-10r primers had been integrated into the crp promoter.
  • W3110-crpP-del deletion nt 565 - nt 865 from SEQ ID NO: 1
  • W3110-crp-Preg deletion nt 565 - nt 713 from SEQ ID NO: 1
  • W3110-crp-Preg2 deletion nt 565 - nt 675 from SEQ ID NO: 1
  • W3110-crp-Preg3 deletion nt 565 - nt 624 from SEQ ID NO: 1
  • W3110 strains with a truncated crp promoter were generated by homologous recombination of the kan-sacB cassette of the
  • Strain W3110-crp::kan-sacB was replaced by a DNA fragment containing the altered promoter sequence.
  • DNA fragments with the modified promoter sequences were produced in a known manner by fusion PCR (so-called OE-PCR, abbreviated for "overlap extension PCR”) from two PCR products defining the modified promoter.
  • OE-PCR overlap extension PCR
  • overlap extension PCR overlap extension PCR
  • crp-13f (SEQ ID NO: 7): corresponds to nt 160 - 180 in SEQ ID NO: 1.
  • crp-14r (SEQ ID NO: 8): corresponds to nt 545 - 564 in SEQ ID NO: 1 ; in reverse-complementary form.
  • crp-17f (SEQ ID NO: 9): corresponds to nt 537 - 565 (nt 1 to 29 in crp-17f) and nt 866 - 885 (nt 30 to 49 in crp-17f) in SEQ ID NO: 1.
  • crp- 12r (SEQ ID NO: 10): corresponds to nt 1478 - 1498 in SEQ ID NO: 1; in reverse-complementary form.
  • crp-18f corresponds to nt 537 - 564 (nt 1 to 28 in crp-18f) and nt 714 - 734 (nt 29 to 49 in crp-18f) in SEQ ID NO: 1.
  • crp- 19f corresponds to nt 537 - 564 (nt 1 to 28 in crp-19f) and nt 676 - 700 (nt 29 to 53 in crp-19f) in SEQ ID NO: 1.
  • crp-20f corresponds to nt 537 - 564 (nt 1 to 28 in crp-20f) and nt 625 - 644 (nt 29 to 48 in crp-20f) in SEQ ID NO: 1.
  • PCR 1 A 0.4 kb PCR product was generated by PCR with genomic DNA from E. coli W3110 and the primers crp-13f and crp-14r.
  • PCR 2 A 0.65 kb PCR product was produced by PCR with genomic DNA from E. coli W3110 and the primers crp-17f and crp-12r.
  • PCR 3 A 0.8 kb PCR product was produced by PCR with genomic DNA from E. coli W3110 and the primers crp-18f and crp-12r.
  • PCR 4 A 0.8 kb PCR product was generated by PCR with genomic DNA from E. coli W3110 and the primers crp-19f and crp-12r.
  • PCR 5 A 0.8 kb PCR product was produced by PCR with genomic DNA from E. coli W3110 and the primers crp-20f and crp-12r.
  • fusion PCR products were produced by OE-PCR (overlap extension PCR), as described e.g. in Hilgarth and Lanigan, MethodsX (2020), 7: 100759:
  • PCR 6 1 kb fusion PCR product to generate strain E. coli W3110-crpP-del by OE-PCR of PCR 1 and PCR 2 and primers crp-13f and crp-12r.
  • PCR 7 1.2 kb fusion PCR product to generate strain
  • PCR 8 1.2 kb fusion PCR product to generate strain
  • PCR 9 1.2 kb fusion PCR product to generate strain E. coli W3110-crp-Preg3 by OE-PCR of PCR 1 and PCR 5 and primers crp-13f and crp-12r.
  • Transformation of E. coli W3110-crp::kan-sacB x pKD46 The fusion PCR products PCR 6, PCR 7, PCR 8 and PCR 9 were transformed into E. coli W3110-crp::kan-sacB x pKD46, respectively and clones selected on LBS plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 7% sucrose, 1.5% agar) without kanamycin. Only clones that no longer contained an active sacB gene could grow on LBS plates. These clones were inoculated onto LBkan plates in order to select those clones which also no longer contained an active Kan gene and whose growth was inhibited in the presence of kanamycin.
  • Clones with positive growth in the presence of sucrose and negative growth in the presence of kanamycin were selected and genomic DNA from cells grown in LB medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl) with a DNA - Won Isolation Kit (Qiagen). Genomic DNA was used in a PCR reaction ("PhusionTM High-Fidelity" DNA polymerase, Thermo ScientificTM) with the primers crp-7f and crp-8r were used to verify that the Kan-sacB cassette had been correctly replaced with the respective fusion PCR product. Clones with a PCR product of the expected size were each selected and the correct incorporation of the modified promoter sequence and the unmodified sequence of the crp-cds analyzed by DNA sequencing of the PCR products (Eurofins Genomics).
  • the PCR products had the following expected sizes:
  • E. coli strain W3110-crpP-del 1397 nt. Deletion nt 565 - nt 865 from SEQ ID NO: 1.
  • E. coli strain W3110-crp-Preg 1549 nt.
  • E. coli strain W3110-crp-Preg2 1587 nt deletion nt 565 - nt 675 from SEQ ID NO: 1.
  • E. coli strain W3110-crp-Preg3 1637 nt deletion nt 565 - nt 624 from SEQ ID NO: 1.
  • the cysteine-specific production plasmid pCys (FIG. 3) was used to produce cysteine production strains (strains with de-regulated cysteine biosynthesis).
  • pCys is a derivative of the plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 disclosed in EP 0885 962 B1.
  • the plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 contains the cysEX allele, which codes for a serine Q-acetyl transferase with reduced feedback inhibition by cysteine and the efflux gene ydeD (ORF306), whose expression is controlled by the constitutive GAPDH promoter.
  • pCys also contains, cloned behind the ydeD (QRF306) efflux gene, the serA317 gene fragment coding for the N- terminal 317 amino acids of the SerA protein (total length 410 amino acids).
  • serA317 is disclosed in Bell et al. 2002 (see above, referred to therein as "NSD:317" and encodes an anti-serine Feedback-resistant variant of 3-phosphoglycerate dehydrogenase Expression of serA317 is controlled by the serA promoter.
  • strains E. coli W3110, E. coli W3110-crp::kan-sacB, E. coli W3110-crpP-del, E. coli W3110-crp-Preg, E. coli W3110-crp-Preg2 and E. coli W3110-crp-Preg3 each transformed with the plasmid pCys.
  • plasmid-carrying transformants were carried out on LBtet agar plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 1.5% agar, 15 mg/L tetracycline). One clone was selected in each case.
  • the strains used in the following examples were given the following designations:
  • Preculture As a preculture for the cultivation in the shake flask, 3 ml LBtet medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl, 15 mg/L tetracycline) with the respective cysteine production strain from example 3 inoculated and incubated at 30° C. and 135 rpm for 16 h in a shaker (Infors) and the OD 600 /ml (optical density of the culture/ml of culture, measured at 600 nm) was determined.
  • 3 LBtet medium 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl, 15 mg/L tetracycline
  • Composition of the SMI medium 12 g/L K2HPO4, 3 g/L KH 2 PO 4 , 5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.3 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 0.015 g/L L CaCl 2 x 2 H 2 O, 0.002 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O, 0.1 g/L NaCl;
  • composition of the trace element solution 0.15 g/L Na 2 MoO 4 x 2 H 2 0, 2.5 g/LH 3 BO 3 , 0.7 g/L CoCl 2 x 6 H 2 0, 0.25 g/L CuSO 4 x 5 H 2 O, 1.6 g/L MnCl 2 x 4 H 2 0, 0.3 g/L ZnSO 4 x 7 H 2 0.
  • RNA for RT-PCR experiments To isolate RNA for RT-PCR experiments, the 30 ml batches were incubated at 30°C and 140 rpm to an OD 600 /ml of 0.5/ml (incubation period 4 - 5 h).
  • Example 6 For the comparative analysis of the cysteine production of a WT strain with non-deregulated cysteine biosynthesis in Example 6, the E. coli W3110 strain without plasmid pCys was grown in the same way, with all media being used in the culture of this strain with non-deregulated cysteine biosynthesis but did not contain tetracycline.
  • RNA-Protect® Bacteria Reagent, Qiagen
  • RNA-Protect® Bacteria Reagent, Qiagen
  • RNeasy Mini Kit RNA isolation kit
  • 8 to 10 pg RNA were isolated from 0.5 ml main culture.
  • the RNA concentration was determined with the Qubit 3.0 fluorometer from Thermo Fisher Scientific using the "QubitTM RNA BR Assay Kit” according to the manufacturer's instructions.
  • cDNA complementary DNA
  • RT-PCR A RotorGene Q 2plex RT-PCR device from Qiagen was used, operated with the RotorGene Q control and evaluation software from the same manufacturer. The QuantiNovaTM Sybr® Green PCR Kit for Real-Time PCR (Qiagen) was also used.
  • the expression of the crp gene and the cysG gene as a reference gene were analyzed.
  • the reference gene cysG served as an internal standard with little variable expression (Zhou et al. 2011 (see above)) against which the expression of the crp gene was compared.
  • crp gene primers crp-lf (SEQ ID NO: 14) and crp-2r (SEQ ID NO: 15).
  • cysG gene primers cysg-lf (SEQ ID NO: 16) and cysg-2r (SEQ ID NO: 17).
  • the cDNA from the shake flask cultivation of the six strains transformed with the plasmid pCys from example 4 was analyzed, with the crp expression in the strain W3110 x pCys serving as a reference point for the evaluation of the relative expression of the crp gene (comparative strain; crp expression from wild-type promoter), against which the crp expression of the other strains was compared.
  • Each RT-PCR reaction was carried out identically four times in replicates for statistical validation (quadruple determination).
  • the RT-PCR reactions for both the cysG reference gene and the crp gene to be determined were carried out simultaneously in one run, which corresponded to a total of 48 RT-PCR reactions when the expression of two genes per strain was determined four times .
  • RT-PCR batches An RT-PCR batch (final volume 20 ⁇ l) for analyzing the expression of the crp gene was composed of 10 ⁇ l H2O containing 20 ng cDNA and 14 pmol each of the crp-specific primers crp-lf and crp-2r and 10 pl QuantiNovaTMSybr® Green master mix for real-time PCR (Qiagen), containing DNA polymerase and the fluorescent dye Sybr® Green for detecting newly formed DNA.
  • Qiagen real-time PCR
  • An RT-PCR mixture (final volume 20 ⁇ l) for analyzing the expression of the cysG gene was composed of 10 ⁇ l H2O containing 20 ng cDNA and 14 pmol each of the cysG-specific primers cysg-lf and cysg-2r as well as 10 ⁇ l QuantiNo - vaTMSybr® Green master mix for real-time PCR (Qiagen), containing the DNA polymerase and the fluorescent dye Sybr® Green for the detection of newly formed DNA.
  • Qiagen real-time PCR
  • the RT-PCR program consisted of 40 cycles of 5 seconds at 95°C and 10 seconds at 60°C.
  • the fluorescence signal caused by the binding of Sybr® Green to newly formed double-stranded DNA was registered by a detector of the RT-PCR device and its time course was analyzed by the evaluation software.
  • CT CT crp - CT cysG
  • AACT ACT - ACT W3110 x pcys •
  • the value 2 - ⁇ CT was formed from the AACT value, which is a measure of the relative expression of the crp gene of a strain compared to the expression of the crp gene in the comparison strain W3110 x pCys (Wt crp promoter) Table 1 summarizes the relative crp expression of the strains examined in comparison with the expression of the reference strain W3110 ⁇ p
  • E. coli W3110 x pCys, W3110-crp::kan-sacB x pCys, W3110-crp-Preg2 x pCys and W3110-crp-Preg3 x pCys were compared on the production scale of fed-batch fermentation.
  • the strains E. coli W3110-crpP-del x pCys and W3110-crp-Preg x pCys with the lowest crp expression (Table 1) were not further investigated due to poor growth in the fermenter.
  • preculture 1 20 ml of LBtet medium were inoculated with the respective strain in a 100 ml Erlenmeyer flask and incubated for 7 h on a shaker (150 rpm, 30° C.).
  • SM1 medium supplemented with 5 g/L of glucose, 5 mg/L of vitamin B1 and 15 mg/L of tetracycline (composition of SM1 medium see example 4).
  • the cultures were shaken in Erlenmeyer flasks (1 L volume) at 30° C. for 17 h at 150 rpm (Infors chest shaker). After this incubation, the cell density OD 600 /ml was between 3 and 5.
  • the fermentation was carried out in a fermenter of the type “DASGIP® Parallel Bioreactor Systems for Microbiology” from Eppendorf. Culture vessels with a total volume of 1.8 l were used.
  • the fermentation medium (900 ml) contained 15 g/l Glucose, 10 g/L tryptone (Difco), 5 g/L yeast extract (Difco), 5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.5 g/L KH 2 PO 4 , 0.5 g/L NaCl , 0.3 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 0.015 g/L CaCl 2 x 2 H 2 O, 0.075 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O and 1 ml trace element solution (see example 6), 0.005 g/L vitamin Bl and 15 mg/L tetracycline.
  • the pH in the fermenter was initially adjusted to 7.0 by pumping in a 25% NH4OH solution. During the fermentation, the pH was kept at a value of 7.0 by automatic correction with 25% NH4OH.
  • vvm entry of compressed air into the fermentation batch given in liters of compressed air per liter fermentation volume per minute
  • the target value for the O 2 saturation during the fermentation was set to 30%. After the O 2 saturation had fallen below the target value, a regulation cascade was started in order to bring the O 2 saturation back up to the target value. First, the gas supply was continuously increased (to a maximum of 5 vvm) and then the stirring speed was continuously increased (to a maximum of 1,500 rpm).
  • the fermentation was carried out at a temperature of 30°C. After a fermentation time of 2 hours, a sulfur source in the form of a sterile 60% (w/v) stock solution of sodium thiosulfate ⁇ 5 H 2 O was fed in at a rate of 1.5 ml per hour.
  • the fermentation time was 48 hours. Thereafter, samples were taken from the fermentation mixture and the content of L-cysteine and derivatives derived from it in the culture supernatant (mainly L-cysteine and thiazolidine) and in the precipitate (L-cystine) was determined separately.
  • the colorimetric test by Gaitonde 1967 was used for this purpose (see above).
  • the L-cystine present in the precipitate first had to be dissolved in 8% (v/v) hydrochloric acid before it could be analyzed in the same way could be quantified. Finally, the total amount of cysteine was determined as the sum of cysteine in the pellet and in the supernatant. As summarized in Table 3, the cell density OD 600 /ml of the strains examined was comparable.
  • Cysteine volume production (in g/L), on the other hand, was higher in W3110-crp::kan-sacB x pCys, W3110-crp-Preg2 x pCys and W3110-crp-Preg3 x pCys than in the control strain W3110 x pCys unmodified crp promoter.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg, der dadurch zur fermentativen Herstellung mindestens einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die relative Expression des crp-Gens durch Mutation der crp-Promotorsequenz bezogen auf die Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotorsequenz reduziert ist. Ein besonderer Vorteil ist, dass dieser Mikroorganismenstamm gegenüber dem entsprechenden Mikroorganismenstamm mit Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotor eine erhöhte Menge einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin bildet. Die Erfindung stellt daher auch ein Verfahren zur Herstellung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus L-Cystein und seiner Derivate L-Cystin und Thiazolidin unter Verwendung dieses Mikroorganismenstammes zur Verfügung.

Description

Verbesserte Cystein produzierende Stämme
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm umfassend ei- nen deregulierten Cystein-Biosyntheseweg, der dadurch zur fer- mentativen Herstellung mindestens einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin geeignet ist, dadurch ge- kennzeichnet, dass die relative Expression des crp-Gens durch Mutation der crp-Promotorsequenz bezogen auf die Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotorsequenz reduziert ist. Ein beson- derer Vorteil ist, dass dieser Mikroorganismenstamm gegenüber dem entsprechenden Mikroorganismenstamm mit Expression des crp- Gens mit Wildtyp-Promotor eine erhöhte Menge einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin bildet. Die Erfindung stellt daher auch ein Verfahren zur Herstellung min- destens einer Verbindung ausgewählt aus L-Cystein und seiner Derivate L-Cystin und Thiazolidin unter Verwendung dieses Mik- roorganismenstammes zur Verfügung.
Cystein, abgekürzt Cys oder C, ist eine α-Aminosäure mit der Seitenkette -CH2-SH. Da die natürlich vorkommende enantiomere Form L-Cystein ist und nur diese eine proteinogene Aminosäure darstellt, ist im Rahmen dieser Erfindung L-Cystein gemeint, wenn der Ausdruck Cystein ohne Deskriptor gebraucht wird. Durch Oxidation der Sulfhydrylgruppen können zwei Cysteinreste mitei- nander eine Disulfidbrücke bilden, womit Cystin entsteht, für das das gleiche gilt, d.h. ohne Deskriptor ist in dieser Erfin- dung das L-Enantiomer (oder L-Cystin, bzw. (R,R)-3,3'-Dithio- bis (2-aminopropionsäure)) gemeint. L-Cystein ist für den Men- schen eine semi-essenzielle Aminosäure, da sie aus der Amino- säure Methionin gebildet werden kann. Thiazolidin bezeichnet die Verbindung 2-Methyl-2,4-Thiazolidindicarbonsäure, ein Addukt aus Cystein und Pyruvat (EP 0885 962 Bl).
Cystein nimmt in allen Organismen eine Schlüsselposition im Schwefelmetabolismus ein und wird in der Synthese von Proteinen, Glutathion, Biotin, Liponsäure, Thiamin, Taurin, Me- thionin und anderen schwefelhaltigen Metaboliten verwendet. Zu- dem dient L-Cystein als Vorläufer für die Biosynthese von Coenzym A.
Die Biosynthese von Cystein wurde in Bakterien, insbesondere in Enterobakterien, detailliert untersucht. Eine Zusammenfassung über die Cystein-Biosynthese findet sich in Wada und Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 73: 48-54.
Die Aminosäure L-Cystein ist von wirtschaftlicher Bedeutung. Sie wird beispielsweise als Lebensmittelzusatzstoff (insbeson- dere in der Backmittelindustrie), als Einsatzstoff in der Kos- metik, sowie als Ausgangsprodukt für die Herstellung von Phar- mawirkstoffen (insbesondere N-Acetyl-Cystein und S-Carboxyme- thyl-Cystein) verwendet.
Neben der klassischen Gewinnung von Cystein mittels Extraktion aus keratinhaltigem Material wie Haaren, Borsten, Hörnern, Hu- fen und Federn, oder mittels Biotransformation durch enzymati- sche Umsetzung von Vorstufen, steht auch ein Verfahren zur fer- mentativen Herstellung von Cystein zur Verfügung. Der Stand der Technik bezüglich der fermentativen Gewinnung von Cystein mit Mikroorganismen ist z.B. in EP 0858 510 Bl, EP 0885 962 Bl, EP 1382 684 Bl, EP 1220 940 B2, EP 1769 080 Bl, EP 2 138585 Bl und WO 2021/259491 offenbart. Als bakterielle Wirtsorganis- men werden dabei u.a. Stämme der Gattung Corynebakterium sowie Vertreter aus der Familie der Enterobacteriaceae, wie z. B. E- scherichia coli oder Pantoea ananatis eingesetzt.
Nicht weiter veränderte Wildtyp-Wirtsorganismen enthalten zwar einen Cystein Biosyntheseweg (siehe z.B. die KEGG Pathway Da- tenbank: „Cysteine and methionine metabolism"), der jedoch so reguliert ist, dass nur so viel Cystein produziert wird, wie für das Zellwachstum erforderlich ist. Wie z.B. in einem Übersichtsartikel von Wada und Takagi 2006 (s.o.) beschrieben, wird in WT-Stämmen die Cystein-Biosynthese durch sogenannte Feedback-Hemmung von Schlüsselenzymen reguliert. So hemmt L-Se- rin das SerA-Enzym 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase und L-Cys- tein das CysE-Enzym Serin-O-Acetyl-Transferase. SerA und CysE sind beides Enzyme des Cystein-Biosynthesewegs und ihre Feed- back-Hemmung durch L-Serin, bzw. L-Cystein verhindert, dass mehr Cystein gebildet wird, als von der Zelle benötigt. Solche Wildtyp-Stämme produzieren kein nachweisbares Cystein, wie z.B. in Tabelle 2 der vorliegenden Erfindung für den Stamm E. coli K12 W3110 offenbart und sind somit trotz vorhandenem Cystein- Biosyntheseweg nicht zur Produktion von Cystein geeignet. Ge- eignet für die Cystein-Produktion wird ein Wildtyp-Mikroorga- nismenstamm, indem der Cystein-Biosyntheseweg dereguliert wird. Zur Herstellung von Mikroorganismenstämmen mit deregulierter Cystein-Biosynthese, die sich durch eine verbesserte Cystein- Produktion auszeichnen, stehen verschiedene Methoden zur Verfü- gung. Neben der klassischen Vorgehensweise, um durch Mutation und Selektion zu verbesserten Cystein-Produzenten zu gelangen, wurden auch gezielt genetische Veränderungen an den Stämmen vorgenommen, um eine effektive Cystein-Überproduktion zu errei- chen.
So führte das Einbringen eines cysE-Allels, das für eine Serin- O-Acetyl-Transferase mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein codiert, zu einer Steigerung der Cystein-Produktion (EP 0 858 510 Bl; Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611) . Durch ein Feedback-resistentes CysE-Enzym wird die Bildung von O-Acetyl-L-Serin, der direkten Vorstufe von Cys- tein, weitgehend vom Cystein-Spiegel der Zelle entkoppelt.
O-Acetyl-L-Serin wird aus L-Serin und Acetyl-CoA gebildet. Da- her ist die Bereitstellung von L-Serin in ausreichender Menge für die Cystein-Produktion von großer Bedeutung. Dies kann durch das Einbringen eines serA-Allels, das für eine 3- Phosphoglycerat-Dehydrogenase mit verminderter Feedback-Hemmung durch L-Serin codiert, erreicht werden. Dadurch wird die Bil- dung von 3-Phospho-Hydroxypyruvat, einer biosynthetischen Vor- stufe von L-Serin, weitgehend vom L-Serin-Spiegel der Zelle entkoppelt. Beispiele für derartige SerA-Enzyme sind in EP 0 620 853 Bl und EP 1496 111 Bl beschrieben. Aber auch Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184 offenbaren Verände- rungen am serA-Gen zur Deregulierung der Enzymaktivität.
Die Steigerung des Transports von Cystein aus der Zelle ist eine weitere Möglichkeit, um die Produktausbeute im Medium zu erhöhen. Dies kann durch Überexpression sogenannter Efflux-Gene erreicht werden. Diese Gene codieren für membrangebundene Pro- teine, die den Export von Cystein aus der Zelle vermitteln. Verschiedene Effluxgene für den Cystein-Export wurden beschrie- ben (EP 0885 962 Bl, EP 1382 684 Bl). Der Export von Cystein aus der Zelle in das Fermentationsmedium hat mehrere Vorteile:
1) L-Cystein wird kontinuierlich aus dem intrazellulären Reak- tionsgleichgewicht entzogen mit der Folge, dass der Spiegel dieser Aminosäure in der Zelle niedrig gehalten wird und somit die Feedback-Hemmung von sensitiven Enzymen durch L- Cystein unterbleibt:
(1) L-Cystein (intrazellulär) <-> L-Cystein (Medium)
2) Das in das Medium ausgeschiedene L-Cystein wird in Gegen- wart von Sauerstoff, der während der Kultivierung in das Medium eingebracht wird, zum Disulfid L-Cystin oxidiert (EP 0 885 962 Bl):
(2) 2 L-Cystein + 1/2 O2 -> L-Cystin + H2O
Da die Löslichkeit von L-Cystin in wässriger Lösung bei ei- nem neutralen pH-Wert im Vergleich zu Cystein nur sehr gering ist, fällt das Disulfid schon bei einer niedrigen Konzentration aus und bildet einen weißen Niederschlag:
(3) L-Cystin (gelöst) -> L-Cystin (Niederschlag)
Durch die Präzipitation von L-Cystin wird der Spiegel des im Medium gelösten Produkts abgesenkt, wodurch auch jeweils das Reaktionsgleichgewicht von (1) und (2) auf die Produkt- seite gezogen wird.
3) Der technische Aufwand für die Reinigung des Produkts ist bedeutend geringer, wenn die Aminosäure direkt aus dem Fer- mentationsmedium gewonnen werden kann, als wenn das Produkt intrazellulär akkumuliert und zuerst ein Zellaufschluss er- folgen muss.
Ein Cystein-Produktionsstamm/zur Cysteinproduktion befähigter Mikroorganismenstamm/Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein Biosyntheseweg/Mikroorganismenstamm mit deregulierter Cystein Biosynthese zeichnet sich durch mindestens eine der Veränderungen/Merkmale aus, ausgewählt aus Feedback-resistentem SerA-Enzym, Feedback-resistentem CysE-Enzym und Überexpression eines Cystein-Efflux Proteins.
Darüber hinaus ist bekannt, dass die Cystein-Ausbeute in der Fermentation dadurch erhöht werden kann, dass Gene abgeschwächt oder zerstört werden, die für Cystein-abbauende Enzyme codie- ren, wie z.B. die Tryptophanase TnaA oder die Cystathionin-ß- Lyasen MalY oder MetC (EP 1571 223 Bl).
Neben der gentechnischen Veränderung des Cystein-Produktions- stammes spielt bei der Entwicklung eines effizienten Produkti- onsprozesses auch die Optimierung des Fermentationsverfahrens, d.h. die Art und Weise der Kultivierung der Zellen, eine wich- tige Rolle. Dabei können verschiedene Kultivierungsparameter, wie z.B. die Art und Dosierung der Kohlenstoff- und Energie- quelle, die Temperatur, die Versorgung mit Sauerstoff (EP 2 707 492 Bl), der pH-Wert sowie die Zusammensetzung des Kulturmedi- ums die Produktausbeute und/oder das Produktspektrum bei der fermentativen Herstellung von Cystein beeinflussen.
Aufgrund laufend steigender Rohstoff- und Energiekosten besteht fortwährend der Bedarf, die Produktausbeute bei der Cystein- Herstellung zu steigern, um auf diese Weise die Wirtschaftlich- keit des Prozesses zu verbessern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Mikroorganis- menstamm zur fermentativen Herstellung von Cystein, L-Cystin und/oder Thiazolidin zur Verfügung zu stellen, mit dem im Ver- gleich zu bekannten Stämmen aus dem Stand der Technik in der Fermentation höhere Ausbeuten von L-Cystein, L-Cystin und/oder Thiazolidin erzielt werden können.
Gelöst wird die Aufgabe durch einen Mikroorganismenstamm umfas- send einen deregulierten Cystein-Biosyntheseweg, der dadurch zur fermentativen Herstellung mindestens einer Substanz ausge- wählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die relative Expression des crp- Gens durch Mutation der crp-Promotorsequenz bezogen auf die Ex- pression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotorsequenz reduziert ist.
Crp, codiert durch das crp-Gen, abgekürzt für cyclisches AMP (cAMP) Rezeptor Protein (oder auch „catabolite repressor pro- tein"), auch bekannt als CAP (Katabolit Aktivator Protein), ist ein zentraler Transkriptionsfaktor, der vor allem dafür bekannt ist, die sogenannte Katabolitrepression zu vermitteln, d.h. die Genexpression in Abhängigkeit der Kohlenstoff (C)-Quelle zu re- gulieren. So ist z.B. in E. coli Glucose die bevorzugte C- Quelle und die Expression von Genen zur Verstoffwechslung alternativer C-Quellen wird unterdrückt (reprimiert), solange Glucose verfügbar ist. Crp wird durch die Bindung des Signalmo- leküls cAMP (cyclisches AMP) aktiviert (bezeichnet als Crp- cAMP). Als Crp-cAMP wirkt es auf die Expression von Zielgenen ein, wodurch neben der Verwertung von C-Quellen auch andere zelluläre Funktionen wie z.B. Stickstofffixierung, Biofilmbil- dung, Transport des Spurenelements Eisen oder auch osmotischer Ausgleich reguliert werden. Hanamura und Aiba, Nucleic Acids Res. (1991) 19: 4413-4419 berichten darüberhinaus, dass Crp- cAMP seine eigene Expression reprimieren kann (negative Autore- gulation) .
Aus Transkriptomanalysen (z.B. Gosset et al., J. Bacteriol. (2004) 186: 3516-3524) ist bekannt, dass die Expression einer Vielzahl von Genen (>400 Gene) durch Crp, bzw. Crp-cAMP beein- flusst wird. Darüberhinaus ist Crp Teil eines verzweigten regu- latorischen Netzwerks globaler Transkriptionsfaktoren, die sich gegenseitig beeinflussen (skizziert in Fig. 1 von Frendorf et al., Comput. Structural Biotechnol. J. (2019) 17: 730-736) und abhängig vom metabolischen Status der Zelle Einfluss auf die Expression ihrer Zielgene nehmen.
Wird nun die Expression des crp-Gens verändert, kann einmal aufgrund der Vielzahl der durch Crp-cAMP regulierten Gene wie auch aufgrund der sich gegenseitig beeinflussenden globalen Transkriptionsfaktoren a priori keine Aussage darüber gemacht werden, wie sich eine verstärkte oder abgeschwächte crp-Expres- sion auf den zellulären Stoffwechsel generell, bzw. auf einen biosynthetischen Stoffwechselweg wie z.B. den des L-Cysteins auswirkt .
Frendorf et al. 2019 (s.o.) geben einen Überblick über die Vielzahl der bisher untersuchten Mutanten des Crp-Proteins. Da- bei handelt es sich ausschließlich um Veränderungen der Crp- Aminosäuresequenz, hervorgerufen durch Veränderung der crp-cds. EP 3 686214, EP 3 686215 und EP 3725 800 (jeweils CJ Corp., Korea) offenbaren ebenfalls Mutanten der Crp-Aminosäuresequenz und deren Verwendung zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbe- sondere von L-Threonin und L-Tryptophan.
Nicht untersucht wurde im Stand der Technik die Auswirkung auf den Stoffwechsel, insbesondere auf die Cystein-Biosynthese, durch eine veränderte Expression des crp-WT-Gens infolge einer Mutation des crp-Promotors in einem Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich vom Stand der Technik, indem bevorzugt nicht die Aminosäuresequenz von Crp verändert wird, sondern die Nuk- leotidsequenz des crp-Promotors. D.h. im Stand der Technik wurde die Aminosäuresequenz und somit die Aktivitätseigenschaf- ten des Crp-Proteins als Transkriptionsfaktor verändert. Im Ge- gensatz dazu bleiben in der vorliegenden Erfindung bevorzugt die Aminosäuresequenz und somit die Aktivitätseigenschaften des Crp-Proteins (Wildtyp-Crp) unverändert, jedoch wird durch Ver- änderung des crp-Promotors die Expression, d.h. die Protein- menge verändert. Anhand des Standes der Technik konnte nicht vorausgesagt werden, wie sich diese Maßnahme auf den zellulären Stoffwechsel allgemein und im Speziellen auf die Cystein-Bio- synthese in einem Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cys- tein-Biosyntheseweg auswirkt. Beispielsweise beschreiben Liu et al., J. Agric. Food Chem 2020, 68: 14928-14937, in Abb. 2 der Publikation den E. coli Stamm BW25113-pLH03, der gegenüber dem Stamm JM109-pLH03 sowohl eine erhöhte crp-Genexpression wie auch eine verbesserte L-Cystein-Produktion aufwies. Daher war es völlig unerwartet, dass die in der vorliegenden Erfindung offenbarte reduzierte Expression des crp-Gens in einem Mikroor- ganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg zur Ver- besserung der Cysteinproduktion führt.
Die Mutation der crp-Promotorsequenz führt zu einer abge- schwächten crp-Expression, bevorzugt durch Verkürzung der crp- Promotorsequenz oder durch eine Kombination aus Insertion und Verkürzung der crp-Promotorsequenz, wobei die crp-cds besonders bevorzugt unverändert bleibt. Die abgeschwächte crp-Expression führt in bisher nicht bekannter Weise zu einer verbesserten Produktion von L-Cystein in einem Mikroorganismenstamm mit de- reguliertem Cystein-Biosyntheseweg. In einer besonders bevor- zugten Ausführungsform führt die Mutation der crp-Promotorse- quenz dazu, dass gar kein Crp-Protein exprimiert wird.
Nachweis der crp-Genexpression:
Um die Expression des crp-Gens in verschiedenen Stämmen ver- gleichen zu können, ist ein Verfahren zum quantitativen Nach- weis der Expression des crp-Gens erforderlich. Allgemein stehen zum quantitativen Nachweis der Genexpression verschiedene be- kannte Testmethoden zur Verfügung. - Eine immunologische Nachweismethode beruht auf Bindung eines spezifischen Antikörpers an das exprimierte Crp-Protein. Die dem Fachmann bekannten Methoden ELISA („Enzyme-linked Immu- nosorbent Assay") und Western-Blot ermöglichen auf diese Weise die quantitative Bestimmung des exprimierten Proteins durch eine Farbreaktion, die über den gebundenen Crp-spezi- fischen Antikörper erfolgt. - Eine andere Methode des quantitativen Nachweises der Genex- pression beruht auf der Bestimmung der genspezifischen RNS eines exprimierten Gens wie der crp-RNS in der gesamten zel- lulären RNS (Gesamt-RNS). Im Rahmen der Erfindung wird das Gen, dessen Expression untersucht werden soll, als Zielgen bezeichnet (z.B. das crp-Gen). Die dem Fachmann bekannten Methoden sind Northern Blot zum direkten Nachweis einer gen- spezifischen-RNS und die bevorzugte Real-Time PCR (RT-PCR), auch bekannt als qPCR (quantitative PCR) zum indirekten Nachweis einer genspezifischen RNS (z.B. der crp-RNS).
Eine RT-PCR Analyse kann beispielsweise wie folgt durchge- führt werden: 1) Die zu analysierenden Zellen (z.B. E. coli-Zellen aus der
Anzucht (wie in Beispiel 4 beschrieben) der zu analysie- renden Stämme (Beispiele 3 und 5) werden nach der Ernte mit einem RNS-stabilisierenden Reagens (z.B. RNA-Protect® „Bacteria Reagent" der Fa. Qiagen) versetzt, die Gesamt- RNS extrahiert (z.B. mit dem RNeasy RNS-Extraktionskit der Fa. Qiagen) und quantifiziert (z.B. mittels des „Qubit™ RNA BR Assay Kits" der Fa. Thermo Fisher Scienti- fic) .
2) Die Gesamt-RNS der Stämme wird zur Herstellung von komplementärer DNS (cDNS) mittels reverser Transkription verwendet (z.B. unter Verwendung des QuantiNova™ Reverse Transcription Kit der Fa. Qiagen) und die cDNS quantifiziert (z.B. mittels des „Qubit™ dsDNS HS Assay Kits" der Fa. Thermo Fisher Scientific) .
3) Die cDNS wird dann entsprechend dem Stand der Technik in einer RT-PCR Reaktion mit für das Zielgen crp genspezifischen Primern) sowie genspezifischen Primern für ein Referenzgen (z.B. das cysG-Gen) eingesetzt. Reagentien-Kits zum Ansetzen von RT-PCR Reaktionen (z.B. von der Fa. Qi- agen) sowie Geräte zur Durchführung von RT-PCR Analysen incl . Software zur Auswertung sind kommerziell verfügbar. Für die in Beispiel 5 beschriebene Analyse der crp-Ex- pression wurde ein RT-PCR Gerät der Fa. Qiagen verwendet (RotorGene Q 2plex RT-PCR-Gerät, betrieben mit der Rotor- Gene Q Steuerungs- und Auswertungssoftware des gleichen Herstellers) , mit dem die relative Expression des crp- Gens in Stämmen mit verändertem crp-Promotor bezogen auf den Vergleichsstamm E. coli W3110 x pCys mit WT-crp- Promotor ermittelt wurde. Relative Expression: Im Rahmen der Erfindung ist relative Genexpression, bestimmt als 2-ΔΔCT-Wert, definiert als Ex- pression des crp-Gens im erfindungsgemäßen Mikroorganis- menstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg, in dem die crp-Promotorsequenz mutiert wurde (z.B. die in Bei- spiel 3 beschriebenen Cystein Produktionsstämme E. coli W3110-crp ::kan-sacB x pCys, E. coli W3110-crpP-del x pCys, E. coli W3110-crp-Preg x pCys, E. coli W3110-crp- Preg2 x pCys und E. coli W3110-crp-Preg3 x pCys) im Ver- hältnis zur Expression des crp-Gens in einem entsprechen- den Vergleichsstamm (z.B. im Stamm E. coli W3110 x pCys mit WT-crp-Promotor). Die im Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung verwendete RT-PCR Analysemethode beruht auf der von Livak und Schmittgen, Methods (2001) 25: 402-408 be- schriebenen Analyse der relativen Genexpression mittels quantitativer RT-PCR und der sog. 2-ΔΔCT Methode. Diese Auswertungsmethode liegt der RotorGene Q Steuerungs- und Auswertungssoftware des RotorGene Q 2plex RT-PCR-Geräts der Fa. Qiagen zugrunde.
CT-Wert: Grundlage zur Bestimmung der relativen Genex- pression ist der sogenannte CT-Wert (CT: „Cycle Threshold"), welcher in der RT-PCR der cDNS eines Stammes sowohl für das crp-Gen (CTcrp) wie für ein Referenzgen er- mittelt wird. Das Referenzgen dient zur Normierung der RT-PCR und wird ausgewählt aus bekannten, konstitutiv ex- primierten Genen, welche keiner Regulation unterliegen. Im Rahmen der Erfindung wurde in Beispiel 5 der CT-Wert für das cysG-Gen (CTcysG) als Referenzgen bestimmt, von dem bekannt ist, dass sich dessen Expression im Verlauf einer Kultivierung nur wenig ändert (Zhou et al., BMC Molecular Biology (2011) 12:18).
ACT-Wert: Der ACT-Wert ist im Rahmen der Erfindung defi- niert als Differenz aus den CT-Werten für das crp-Gen und das Referenzgen (z.B. cysG-Ref erenzgen) eines Stammes.
ACT CTcrp CTcycG .
AÄCT-Wert: Der AACT ist im Rahmen der Erfindung definiert als Differenz aus dem ACT-Wert eines Stammes mit verän- derter Expression des crp-Gens und dem ACT-Wert des Ver- gleichsstammes mit WT-Expression des Zielgens (z.B. E. coli W3110 x pCys) . AACT = ACT - ACTW3110 x pCys . 2-ΔΔCT-Wert: Aus dem AACT-Wert wird der Wert 2 AACT gebil- det, der ein Maß ist für die Expression des crp-Gens in einem veränderten Stamm im Vergleich zur Expression des crp-Gens im Vergleichsstamm (z.B. E. coli W3110 x pCys) und wird auch bezeichnet als relative Expression des Zielgens .
4) Soll die Expression des crp-Gens zwischen verschiedenen
Stämmen verglichen werden, so werden gleiche Mengen cDNS in der RT-PCR eingesetzt und die relative crp-Expression als 2-ΔΔCT-Wert für jeden Stamm ermittelt.
Der 2-ΔΔCT-Wert für den Vergleichsstamm hat dabei den
Wert 1. 2-ΔΔCT-Werte > 1 bezeichnen dabei eine verstärkte Expres- sion im Vergleich zum Vergleichsstamm. 2-ΔΔCT-Werte < 1 bezeichnen dabei eine abgeschwächte Ex- pression im Vergleich zum Vergleichsstamm.
Aus dem Vergleich der 2-ΔΔCT-Werte für die relative Expres- sion kann dann eine Aussage darüber getroffen werden, ob und wie stark eine Mutation in der Promotorsequenz des crp-Gens die Expression des crp-Gens verändert hat. Diese Veränderung der Genexpression (vgl. Beispiel 5) kann in Korrelation gesetzt werden mit veränderten Stammeigen- schaften wie z.B. Zellwachstum oder Ausbeuten eines
Stoffwechselprodukts wie z.B. der Produktion der Amino- säure L-Cystein (vgl. Beispiele 6 und 7) . Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeu- tend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Pro- teins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet.
Als Gen wird der DNS-Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinfor- mationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS-Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expres- sionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs be- teiligt sind. Zu den Expressionssignalen zählen z.B. mindestens ein Promotor, ein Transkriptions-, ein Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle. Des Weiteren sind als Expressions- signale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich.
Als Promotor wird eine stromaufwärts dem 5'-Ende der cds vorge- schaltete Nukleotid-Sequenz bezeichnet, welche die Expression eines Gens ermöglicht. Der Promotor liegt in Syntheserichtung vor dem RNA-codierenden Bereich. Der Promotor enthält Bereiche der spezifischen Wechselwirkung mit DNS-bindenden Proteinen, welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA- Polymerase vermitteln und als Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden.
Als Mutation wird eine Veränderung des Erbguts bezeichnet, um- fassend eine Veränderung der DNS-Sequenz und, sofern Protein- codierende Sequenzen betroffen sind, auch die Aminosäuresequenz von Proteinen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst eine Mutation den Austausch, die Insertion und/oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide bzw. einer oder mehrerer Amino- säuren. Ein Austausch bezeichnet den Austausch eines oder meh- rerer Nucleotide gegen andere Nucleotide einer DNS, bzw. einer oder mehrerer Aminosäuren gegen andere Aminosäuren eines Pro- teins. Dabei bleibt die Länge der DNS-Sequenz, bzw. der Pro- teinsequenz unverändert. Eine Insertion bezeichnet den Einbau von zusätzlichen Nukleotiden in eine DNS bzw. von zusätzlichen Aminosäuren in ein Protein. Unter den Begriff der Insertion fallen auch Elongationen. Bei einer Deletion fehlen ein oder mehrere Nukleotide oder auch Teile einer Nukleotidsequenz, bzw. eine oder mehrere Aminosäuren oder auch Teile einer Aminosäu- resequenz. Von einer Punktmutation spricht man, wenn durch die Veränderung nur ein einzelnes Nukleotid bzw. eine einzelne Ami- nosäure durch ein anderes Nukleotid bzw. eine andere Aminosäure ausgetauscht wurde. Mutationen umfassen auch die Kombination aus Austausch, Deletion und Insertion.
Im Rahmen dieser Erfindung beginnen die Proteine wie z.B. Crp mit einem Großbuchstaben, während die Gene dieser Proteine co- dierenden Sequenzen mit einem Kleinbuchstaben bezeichnet werden (z.B. crp).
Dementsprechend bezeichnet das E. coli crp-Gen in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 565-865 die Promotorregion des crp-Gens und SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 866-1495 die cds des crp-Gens aus E. coli. E. coli Crp bezeichnet das von dieser cds codierte Pro- tein, angegeben in SEQ ID NO: 2. Beim Protein handelt es sich um das Crp-Protein.
Die Abkürzung WT (Wt) bezeichnet den Wildtyp. Als Wildtyp-Gen, Wildtyp-Promotor wird die Form des Gens, Promotors bezeichnet, die natürlicherweise durch die Evolution entstanden und im Wildtyp-Genom vorhanden ist. Die DNS-Sequenz von Wt-Genen, Wt- Promotoren ist in Datenbanken wie NCBI (National Center for Bi- otechnology Information, U.S. National Library of Medicine) öf- fentlich zugänglich. Als Allele werden die Zustandsformen eines Gens definiert, die durch Mutation, d.h. durch Änderungen der Nucleotidsequenz der DNS ineinander übergeführt werden können. Dabei wird das natür- licherweise in einem Mikroorganismus vorkommende Gen als Wild- typ-Allel bezeichnet und die davon abgeleiteten Varianten als mutierte Allele des Gens.
Unter homologen Genen bzw. homologen Sequenzen ist zu verste- hen, dass die DNS-Sequenzen dieser Gene bzw. DNS-Abschnitte zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und besonders be- vorzugt zu mindestens 95% identisch sind.
Der Grad der DNS-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algo- rithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukle- otidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt.
Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target se- quences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear.
Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „pro- tein blast", auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, ge- nutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zu- rück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Ma- trix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Co 12111/Reu Compositional adjustments = Conditional compositional score ma- trix adjustment. Bei den erfindungsgemäßen Mikroorganismen mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg ist infolge der Mutation der crp-Promo- torsequenz die relative Expression des crp-Gens bevorzugt auf einen 2-ΔΔCT-Wert von mindestens 0,91 reduziert, besonders bevor- zugt auf einen 2-ΔΔCT-Wert von mindestens 0,5 und insbesondere bevorzugt auf einen 2-ΔΔCT-Wert von 0,03, wobei die Expression des crp-Gens in Mikroorganismen mit Wildtyp-Promotor auf einen 2-ΔΔCT-Wert von 1,00 normiert ist. Dabei wird die relative Ex- pression des crp-Gens bevorzugt bestimmt wie in Beispiel 5 be- schrieben. Wird die Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotor mit einem 2-ΔΔCT-Wert von 1,00 als 100 % Genexpression des crp-Gens festge- legt, dann beträgt die crp-Genexpression der erfindungsgemäßen Mikroorganismen mit einem mindestens auf 0,91 reduzierten 2-ΔΔCT- Wert maximal 91 %, mit einem mindestens auf 0,5 reduzierten 2- ΔΔCT-Wert maximal 50 % und mit einem mindestens auf 0,03 redu- zierten 2-ΔΔCT-Wert maximal 3 % der Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotor. D.h. das Verfahren ist bevorzugt dadurch ge- kennzeichnet, dass die crp-Expression des Mikroorganismenstam- mes mit veränderter crp-Promotorsequenz im Vergleich zu einem entsprechenden Mikroorganismenstamm mit Wt-crp-Promotorsequenz um mindestens 9% reduziert ist und die Ausbeute an L-Cystein in g/l bei Einsatz des Mikroorganismenstamms um mindestens 10% (w/v) erhöht ist. „Verglichen mit der/im Vergleich zur/bezogen auf die (entspre- chende) Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotor (Aktivität des crp-Wildtyp-Promotors, bzw. WT-Expression) bedeutet im Rah- men dieser Erfindung im Vergleich zur Aktivität des crp-Promo- tors, welche der nicht mutierten Form des crp-Promotors aus ei- nem Mikroorganismus entspricht, d.h. von dem crp-Promotor, der Co 12111/Reu natürlicherweise durch die Evolution entstanden und im Wildtyp- Genom dieses Mikroorganismus vorhanden ist. Zu den zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin oder Thiazolidin geeigneten Mikroorganismenstämmen zählen alle Mikroorganismen, die einen deregulierten Cystein-Biosyntheseweg enthalten, der zur Synthese von Cystein, Cystin oder Thiazoli- din führt. Derartige Stämme sind beispielsweise offenbart in EP 0 885 962 B1, EP 1382 684 B1, EP 1220 940 B2, EP 1769 080 B1 und EP 2138 585 B1 und WO 2021/259491. Dabei zeichnet sich der Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg durch mindestens eine der folgenden Ver- änderungen aus: a) Der Mikroorganismenstamm zeichnet sich durch eine veränder- tes serA-Gen aus, codierend für eine 3-Phosphoglycerat-De- hydrogenase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch L-Serin (wie beispielsweise beschrie- ben in EP 1950 287 B1), wobei die SerA-Enzymaktivität pho- tometrisch bestimmt werden kann durch die vom SerA-Substrat 3-Phospho-Hydroxypyruvat abhängige Oxidation von NADH wie z.B. von McKitrick und Pizer , J. Bacteriol. (1980) 141: 235 - 245 beschrieben. Besonders bevorzugte Varianten der 3-Phosphoglycerat Dehyd- rogenase (serA) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wild- typenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere be- vorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch L-Serin auf. und/oder b) Der Mikroorganismenstamm enthält ein verändertes cysE-Gen, codierend für eine Serin-O-Acetyl-Transferase (CysE), die im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtypenzym eine um mindes- tens den Faktor zwei verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein aufweist (wie beispielsweise beschrieben in EP 0858 510 Bl oder Nakamori et al.1998 (s.o.), wobei die CysE-En- zymaktivität photometrisch bestimmt werden kann durch den Verbrauch des CysE-Substrats Acetyl-CoA infolge der Reaktion mit L-Serin zu O-Acetyl-L-Serin, wie z.B. von Nakamori et al. 1998 (s.o.) beschrieben.
Besonders bevorzugte Varianten der Serin-O-Acetyl-Trans- ferase (cysE) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildty- penzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevor- zugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hin- ausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein auf. und/oder c) Der Mikroorganismenstamm weist einen durch Überexpression eines Effluxgens um mindestens den Faktor zwei erhöhten Cys- tein-Export aus der Zelle im Vergleich zu der entsprechenden Wildtypzelle auf, wobei der Cystein-Export bestimmt werden kann durch photometrische Messung des extrazellulären Cys- tein-Gehalts nach Gaitonde, Biochem. J. (1967) 104: 627 - 633 (umfassend Cystein, Cystin und das aus Cystein und Pyruvat gebildete Addukt 2-Methyl-Thiazolidin-2,4(R)-dicar- bonsaure), wie z.B. in EP 0885 962 Bl beschrieben.
Die Überexpression eines Effluxgens führt im Vergleich zu einer Wildtypzelle bevorzugt zu einem um mindestens den Fak- tor 5, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10, ins- besondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 erhöhten Cystein-Export aus der Zelle.
Das Effluxgen stammt vorzugsweise aus der Gruppe ydeD (siehe EP 0885 962 B1), yfiK (siehe EP 1382 684 Bl), cydDC (siehe WO 2004/113373 Al), bcr (siehe US 2005-221453 AA) und emrAB (siehe US 2005-221453 AA) von E. coli oder dem entsprechend homologen Gen aus einem anderen Mikroorganismus. und/oder d) Der Mikroorganismenstamm kann darüberhinaus dadurch gekenn- zeichnet sein, dass mindestens ein Cystein-abbauendes Enzym soweit abgeschwächt ist, dass in der Zelle nur noch maximal 50% dieser Enzym-Aktivität im Vergleich zu einer Wildtyp- zelle vorhanden ist. Das Cystein-abbauende Enzym stammt vor- zugsweise aus der Gruppe Tryptophanase (TnaA) und Cystathio- nin-ß-Lyase (MalY, MetC).
Derartige Stämme sind beispielsweise aus EP 0858 510 Bl und EP 0 885 962 Bl bekannt.
Die in den vorherigen Abschnitten beschriebenen Mikroorganis- menstämme, die zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L- Cystin oder Thiazolidin geeignet sind, sind in ihrem Cystein- stoffwechsel so dereguliert, dass sie im Vergleich zum im Cys- teinstoffwechsel nicht deregulierten Mikroorganismenstamm eine erhöhte Menge an L-Cystein bilden. Das bedeutet, dass ein Cys- tein-Produktionsstamm bzw. zur Cysteinproduktion befähigter Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet ist, dass er einen deregulierten Cystein-Biosyntheseweg aufweist. Da in den Zellen eines im Cysteinstoffwechsel nicht deregulierten Mikroorganis- menstamms die Menge an L-Cystein im Kulturansatz ungefähr 0 g/1 ist, ist mit erhöhter Menge bevorzugt jede Menge gemeint, die 0,05 g/1 L-Cystein gemessen im Kulturansatz nach 24-stündiger Anzucht übersteigt.
Die Menge an Cystein kann beispielsweise mit Hilfe des colori- metrischen Tests von Gaitonde 1967 (s.o.) quantifiziert werden, wie in Beispiel 6 beschrieben (vgl. Tab. 2, Stamm W3110 und Stamm W3110 x pCys).
Der erfindungsgemäße Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg, mutierter crp-Promotorsequenz und dadurch reduzierter relativer Expression des crp-Gens bildet im Vergleich zum entsprechenden Mikroorganismenstamm, d.h. auch dieser zeichnet sich durch einen deregulierten Cystein-Biosyn- theseweg aus, mit Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotor eine erhöhte Menge einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L- Cystin und Thiazolidin, was einen großen Vorteil darstellt. Wie in Tabelle 3 (Beispiel 7) belegt, führt eine zunehmende Muta- tion der crp-Promotorsequenz bis hin zur vollständigen Deletion des crp-Promotors, d.h. eine um 9% bis 100% reduzierte relative Expression des crp-Gens, in einem fermentativen Verfahren zu signifikant höheren Ausbeuten an Gesamtcystein, d.h. Summe des hergestellten Cysteins, Cystins und Thiazolidins. Der Vergleich erfolgt immer zwischen einem Mikroorganismenstamm mit mutierter Promotorsequenz des crp-Gens und dem entsprechenden Mikroorga- nismenstamm mit Wt-Promotorsequenz des crp-Gens, d.h. beide Mikroorganismenstämme sind in ihrem Cysteinstoffwechsel deregu- liert.
Wenn in der vorliegenden Erfindung Cystein erwähnt wird, ist dabei immer L-Cystein oder eines seiner Derivate ausgewählt aus L-Cystin oder Thiazolidin gemeint. Das bedeutet, dass die Menge an hergestelltem Cystein bevorzugt Gesamtcystein meint, d.h. die Summe des hergestellten L-Cysteins, L-Cystins und Thiazoli- dins. Beispielsweise kann entstandenes L-Cystin zu L-Cystein reduziert und anschließend von der Messung an hergestelltem Cystein mit erfasst werden. Wenn zur Bestimmung z.B. der colo- rimetrische Test von Gaitonde (s.o.) verwendet wird, kann die- ser Test unter den stark sauren Reaktionsbedingungen nicht zwi- schen L-Cystein und dem in EP 0885 962 Bl beschriebenen Kon- densationsprodukt von Cystein und Pyruvat, der 2-Methyl-thiazo- lidin-2,4-Dicarbonsäure (Thiazolidin), unterscheiden und auch Thiazolidin wird von der Messung an hergestelltem Cystein mit erfasst. Erfindungsgemäß bildet der Mikroorganismenstamm eine erhöhte Menge einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin, bevorzugt L-Cystein und L-Cystin und besonders bevorzugt L-Cystein.
Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Crp-Proteins nicht mutiert ist. D.h. die Aminosäuresequenz des Crp-Proteins ist die Wt-Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 angegeben ist. Um dieses zu erreichen, um- fasst die kodierende Sequenz von crp nur sogenannte stille Mu- tationen oder gar keine Mutation. Zurückzuführen auf den dege- nerierten genetischen Code sind stille Mutationen definiert als Veränderungen einer cds, welche die daraus abgeleitete Amino- säuresequenz nicht verändern. Das bedeutet, dass die crp-cds gleich der in der NCBI-Datenbank für crp des entsprechenden Or- ganismus verfügbaren Wt-DNS-Sequenz ist oder nur stille Mutati- onen umfasst und für ein nicht-mutiertes Crp-Protein mit der Wt-Protein-Sequenz codiert. In der vorliegenden Erfindung ist besonders bevorzugt nur die Promotorsequenz des crp-Gens eines Mikroorganismenstammes mutiert. Bevorzugt sind Mutationen der Promotorsequenz des crp-Gens aus E. coli, umfassend die Sequenz SEQ ID NO: 1, nt 565-865, während die crp-cds, umfassend die Sequenz SEQ ID NO: 1, nt 866-1498, nicht mutiert ist oder nur stille Mutationen umfasst und für ein Protein mit der Pro- teinsequenz SEQ ID NO: 2 codiert.
Im Sinne der Erfindung umfassen Mutationen in der crp-Promotor- sequenz Veränderungen in der Art, a) dass die crp-Promotorsequenz des crp-Gens teilweise oder ganz deletiert ist und/oder b) dass die crp-Promotorsequenz des crp-Gens durch eine oder mehrere Insertionen oder 5'-, bzw. 3'-Elongationen verän- dert ist und/oder c) dass die crp-Promotorsequenz des crp-Gens eine oder mehrere Punktmutationen enthält, mit der Folge, dass die Expression des crp-Gens reduziert, d.h. abgeschwächt oder völlig unterdrückt ist. Wie oben bereits be- schrieben, bedeutet reduziert, dass die crp-Genexpression der erfindungsgemäßen Mikroorganismen bevorzugt maximal 91 %, be- sonders bevorzugt maximal 50 % und insbesondere bevorzugt maxi- mal 3 % der Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotor be- trägt. In einer speziell bevorzugten Ausführungsform ist keine crp-Genexpression bei den erfindungsgemäßen Mikroorganismen nachweisbar .
Besonders bevorzugt weist in den genannten Fällen reduzierter crp-Genexpression das Crp-Protein keine Mutation auf, d.h. die Aminosäuresequenz ist unverändert im Vergleich zum Wt.
Im Sinne der Erfindung ist auch eine beliebige Kombination der in a) bis c) aufgeführten genetischen Veränderungen im Promotor des crp-Gens möglich. Zusammengefasst wird im Sinne der Erfin- dung die Expression des crp-Gens durch Veränderungen des crp- Promotors abgeschwächt oder völlig unterdrückt. Eine Abschwä- chung der crp-Expression kann auch dadurch erreicht werden, dass der crp-Promotor vollständig oder teilweise durch einen alternativen schwachen Promotor ersetzt wird.
Besonders bevorzugt beruht die Veränderung des crp-Promotors im erfindungsgemäßen Stamm auf vollständiger oder teilweiser Dele- tion des crp-Promotors oder Veränderung des crp-Promotors durch eine oder mehrere Insertionen oder 5'-, bzw. 3'-Elongationen, bzw. einer Kombination aus Deletion und Insertion.
Insbesondere bevorzugt beruht die Veränderung des crp-Promotors im erfindungsgemäßen Stamm auf vollständiger oder teilweiser Deletion des crp-Promotors.
Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in der crp-Promotorsequenz mindestens eine Deletion oder Insertion umfasst, besonders bevorzugt mindestens eine Deletion.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Mutation in der crp-Promotorsequenz, wobei diese bevor- zugt die in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 angegebene Sequenz umfasst, um mindestens eine Deletion oder Insertion und die kodierende Sequenz von crp ist nicht mutiert. Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet, dass von der crp-Promotorsequenz, die in SEQ ID NO: 1 nt 565- 865 angegeben ist, mindestens nt 565-624 deletiert ist. In die- sem Fall umfasst die crp-Promotorsequenz maximal nt 625-865 aus SEQ ID NO: 1.
Insbesondere bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch ge- kennzeichnet, dass die crp-Promotorsequenz, die in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 angegeben ist, vollständig deletiert ist.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen, umfassend Insertion, Deletion und Elongation, sind in den Beispielen gezeigt:
- zur vollständigen oder teilweisen Deletion der crp-Promotor- sequenz siehe Beispiel 2,
- zur Veränderung der crp-Promotorsequenz durch eine oder meh- rere Insertionen siehe Beispiel 1,
- zur Veränderung der crp-Promotorsequenz in einer Weise, die zur Schwächung, bzw. vollständigen Hemmung der Promotorakti- vität führt siehe Beispiel 5.
Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Mikroorganismenstamm um einen Stamm aus der Familie der Enterobacteriaceae oder Corynebacteriaceae, beson- ders bevorzugt um einen Stamm aus der Familie der Enterobacte- riaceae handelt. Solche Stämme sind unter anderem käuflich er- hältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men und Zellkulturen GmbH (Braunschweig).
Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Pantoea ananatis und Co- rynebacterium glutamicum, besonders bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli und Pantoea ananatis. Insbeson- dere bevorzugt handelt es sich beim Mikroorganismenstamm um ei- nen Stamm der Spezies Escherichia coli. Bevorzugt ist der E. coli-Stamm ausgewählt aus E. coli K12, besonders bevorzugt E. coli K12 W3110. Solche Stämme sind unter anderem käuflich er- hältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men und Zellkulturen GmbH (Braunschweig), darunter auch E. coli K12 W3110 DSM 5911 (id. ATCC 27325) und Pantoea ananatis DSM 30070 (id. ATCC 11530).
Das crp-Gen aus E. coli K12 ist z.B. zugänglich in der NCBI Gendatenbank als Eintrag in der E. coli Genbank Reference Se- quence mit der Zugangsnummer NC_000913.3, nt 3485255 - nt 3486950 (SEQ ID NO: 1). Das crp-Gen aus Pantoea ananatis ist z.B. zugänglich in der NCBI Gendatenbank als Eintrag in der P. ananatis Genbank Reference Sequence mit der Zugangsnummer NC_017554.1, nt 430825 - nt 431818 (crp-cds: nt 430883 - nt 431515; Gen-Identifikationsnummer 57266449).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismen- stamm dadurch gekennzeichnet, dass die mutierte crp-Promotorse- quenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Promo- tersequenzen des crp-Gens aus Escherichia coli, des crp-Gens aus Pantoea ananatis und einer zu diesen Sequenzen homologen Sequenz, wobei für den Begriff der homologen Sequenz die oben angegebene Definition gilt.
Beim crp-Gen handelt es sich bevorzugt um das crp-Gen aus E. coli mit der in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 angegebenen Promotorre- gion und der in SEQ ID NO: 1, nt 866-1495 angegebenen crp-cds, codierend für ein Crp-Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebe- nen Aminosäuresequenz.
Dementsprechend ist der Mikroorganismenstamm bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim exprimierten Crp-Protein um SEQ ID NO: 2 handelt. Das bedeutet, das Crp-Protein, das expri- miert wird, hat die Wt-Sequenz (SEQ ID No:2), die Mutation be- trifft nur die crp-Promotorsequenz (SEQ ID NO: 1 nt 565-865). Der erfindungsgemäße Produktionsstamm kann darüberhinaus noch weiter optimiert werden, um die Cystein Produktion noch zusätz- lich zu verbessern. Die Optimierung kann z.B. gentechnisch er- folgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expres- sionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. Der Produktionsstamm kann darüber hinaus dadurch opti- miert werden, dass neben der Reduktion der Expression des crp- Gens noch weitere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die Cystein Produktion auswirken. Die Optimie- rung ist jedoch auch in an sich bekannter Weise möglich durch Mutagenese und Selektion von Stämmen mit verbesserter Cystein Produktion .
In einem alternativen Ansatz ist es auch denkbar, dass die Ab- schwächung, bzw. vollständige Unterdrückung der Expression des crp-Gens durch Zugabe eines Inhibitors, sei es ein chemischer oder Proteininhibitor, erreicht wird, wobei sich der Inhibitor hemmend auf die Aktivität des crp-Promotors und nicht auf die Aktivität des Crp-Proteins auswirkt.
Zur Einführung von Veränderungen im Promotor des crp-Gens sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt. Im einfachsten Fall kann der Ausgangsstamm in bekannter Weise einer Mutagenese (z.B. chemisch durch mutagen wirkende Chemikalien wie N-Methyl- N '-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder physikalisch durch UV- Bestrahlung) unterzogen werden, wobei zufällig Mutationen in der genomischen DNS erzeugt werden und die gewünschte Mutante mit verändertem crp-Promotor dann aus der Vielzahl erzeugter Mutanten selektiert wird, z.B., jeweils nach Vereinzelung der Mutanten, durch quantitative Bestimmung des crp-Proteins (z.B. immunologisch durch Western Blot mit einem crp-spezifischen An- tikörper) oder durch quantitative Bestimmung der crp-Expression durch z.B. RT-PCR. Dabei werden jeweils nur Mutanten mit verän- dertem crp-Promotor selektiert, während die crp-cds unverändert bleibt und der Wildtyp-Sequenz entspricht.
Im Gegensatz zur aufwendigen, zufälligen Mutagenese und Selek- tion der gesuchten Mutante mit verändertem crp-Promotor kann der Promotor des crp-Gens in einfacherer Weise gezielt verän- dert werden, z.B. durch den bekannten Mechanismus der homologen Rekombination. Kloniersysteme zur gezielten Geninaktivierung mittels homologer Rekombination sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich, wie z.B. offenbart im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", basierend auf der Red®/ET®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Tech- nical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierter Literatur).
Dem Stand der Technik entsprechend kann der crp-Promotor oder ein Teil des Promotors isoliert und eine Fremd-DNS in den crp- Promotor kloniert werden, wodurch die Sequenz des Promotors verändert wird. Ein für die gezielte Veränderung des crp-Promo- tors geeignetes DNS-Konstrukt kann also aus einem 5'-DNS- Abschnitt, der zum genomischen crp-Promotor homolog ist, ge- folgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genabschnitt und da- ran angeschlossen einem 3'-DNS-Abschnitt, der wiederum zum ge- nomischen crp-Promotor homolog ist, bestehen.
Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des crp-Promotors kann dabei nicht nur den Sequenzbereich des Promotors umfassen. Der in Frage kommende Bereich kann auch den Promotor flankierende DNS-Sequenzen umfassen, nämlich die 5'- flankierende Sequenz vor Beginn des crp-Promotors (z.B. nt 1 - 564 in SEQ ID NO: 1). DNS-Sequenzen im 3'-Bereich des crp-Pro- motors betreffen die cds des crp-Gens (crp-cds, nt 866 - 1498 in SEQ ID NO: 1), wobei ausgeschlossen ist, dass sich die cds des crp-Gens durch die homologe Rekombination verändert. Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektionsmar- ker-Expressionskassette, z.B. ausgewählt aus der Klasse der An- tibiotikaresistenzgene .
Ein weiteres solches System zur gezielten Geninaktivierung auf Basis der homologen Rekombination ist eine dem Fachmann be- kannte und in den Beispielen 1 und 2 beschriebene Methode zur genetischen Modifikation, beruhend auf einer Kombination aus der Lambda-Red Rekombination mit einem Gegenselektions-Scree- ning. Dieses System ist z.B. beschrieben in Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245. Verwendet wird dabei ein DNS-Konstrukt zur Inaktivierung z.B. des crp-Promotors, begin- nend vom 5'-Ende, bestehend aus einer zum crp-Gen homologen Se- quenz (umfassend die 5'-Region des crp-Promotors) gefolgt von zwei Expressionskassetten beliebiger Reihenfolge, bestehend a) aus einer Expressionskassette des Selektionsmarkers, ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenzgene sowie b) einer Ex- pressionskassette des sacB-Gens, codierend für das Enzym Levan- sucrase und schließlich gefolgt von einer weiteren, zum crp-Gen homologen Sequenz (umfassend z.B. Sequenzen der den crp-Promo- tor 3'-flankierenden crp-cds).
In einem ersten Schritt wird das DNS-Konstrukt in den Produkti- onsstamm transformiert und Antibiotika-resistente Klone iso- liert. Die erhaltenen Klone zeichnen sich dadurch aus, dass sie infolge des mit-aufgenommenen sacB-Gens nicht auf Saccharose wachsen können. Durch das Prinzip der Gegenselektion können die beiden Markergene entfernt werden, indem in einem zweiten Schritt ein geeignetes DNS-Fragment die beiden Markergene durch homologe Rekombination ersetzt. Die in diesem Schritt erhalte- nen Klone können dann wieder auf Saccharose wachsen und sind dann auch wieder sensitiv gegen das Antibiotikum. Dieses Ver- fahren findet Anwendung in den Beispielen 1 und 2 zur gezielten Verkürzung des crp-Promotors von E. coll (SEQ ID NO: 1, nt 565 - 865). Ein für diesen Schritt geeignetes DNS-Fragment umfasst, beginnend vom 5'-Ende, eine zum Zielgen, z.B. dem crp-Gen, ho- mologe Sequenz von mindestens 20 nt Länge, gefolgt von einem DNS-Abschnitt, der die gewünschte veränderte DNS-Sequenz ent- hält, z.B. einen verkürzten crp-Promotor und schließlich eine weitere, zum Zielgen, z.B. dem crp-Gen homologe Sequenz von mindestens 20 nt Länge. Das DNS-Fragment kann z.B. chemisch hergestellt werden durch Gensynthese oder wie in Beispiel 2, aus einzelnen DNS-Fragmenten durch die bekannte sog. OE-PCR (Overlap Extension PCR, wie z.B. beschrieben in Hilgarth and Lanigan, MethodsX (2020) 7: 100759, https://doi.Org/10.1016/j .mex.2019.12.001).
Als Beispiel für einen erfindungsgemäßen Stamm, der aufgrund einer Kombination aus Insertion der Kan-sacB Kassette und Dele- tion im crp-Promotor eine abgeschwächte crp-Expression auf- weist, ist in den Beispielen folgender E. coli Stamm offenbart: W3110-crp ::kan-sacB. In W3110-crp::kan-sacB ist die 3,2 kb Kan- sacB Kassette im crp-Promotor zwischen die nt 640 und nt 714 von SEQ ID NO: 1 inseriert, wodurch gleichzeitig 73 nt (SEQ ID NO: 1, nt 641 - nt 713) des crp-Promotors deletiert wurden (siehe Beispiel 1). Als Folge dieser Veränderung des crp-Promo- tors betrug die relative Expression des crp-Gens in dem mit dem Plasmid pCys transformierten Stamm W3110-crp::kan-sacB x pCys noch das 0,33-fache, d.h. noch 33% der auf 1, bzw. 100% nor- mierten Expression des Stammes W3110 x pCys mit Wildtyp crp- Promotor (s. Beispiel 5, Tab. 1).
Als Beispiele für erfindungsgemäße Stämme, die aufgrund einer Verkürzung des crp-Promotors eine abgeschwächte crp-Expression aufweisen, sind in den Beispielen (Beispiel 2) folgende E. coli Stämme offenbart:
W3110-crpP-del : Deletion nt 565 - nt 865 aus SEQ ID NO: 1 W3110-crp-Preg: Deletion nt 565 - nt 713 aus SEQ ID NO: 1 W3110-crp-Preg2 : Deletion nt 565 - nt 675 aus SEQ ID NO: 1 W3110-crp-Preg3 : Deletion nt 565 - nt 624 aus SEQ ID NO: 1
Als Folge dieser Verkürzungen des crp-Promotors betrug die re- lative Expression des crp-Gens in den mit dem Plasmid pCys transformierten Stämmen noch folgende Bruchteile der auf 1 nor- mierten Expression des Stammes W3110 x pCys mit Wildtyp crp- Promotor (siehe Beispiel 5, Tab. 1): In E. coli W3110-crpP-del x pCys mit vollständig deletiertem crp-Promotor (Deletion nt 565 - nt 865 aus SEQ ID NO: 1 betrug die relative crp-Expres- sion noch das 0,03-fache des Wildtyp crp-Promotors. In E. coli W3110-crp-Preg x pCys war der crp-Promotor um 149 nt verkürzt worden (Deletion nt 565 - nt 713 aus SEQ ID NO: 1). Die rela- tive crp-Expression betrug noch das 0,05-fache des Wildtyp crp- Promotors. In E. coli W3110-crp-Preg2 x pCys war der crp-Promo- tor um 111 nt verkürzt worden (Deletion nt 565 - nt 675 aus SEQ ID NO: 1). Die relative crp-Expression betrug noch das 0,5-fa- che des Wildtyp crp-Promotors. In E. coli W3110-crp-Preg3 x pCys war der crp-Promotor um 60 nt verkürzt worden (Deletion nt 565 - nt 624 aus SEQ ID NO: 1). Die relative crp-Expression be- trug noch das 0,91-fache des Wildtyp crp-Promotors.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die relative Expression des crp- Gens einerseits durch zunehmende Verkürzung des crp-Promotors vom 0,91-fachen bis zum 0,03-fachen der Expression des Wt-Pro- motors reduziert oder durch eine Kombination aus Insertion und Deletion auf das 0,33-fache abgeschwächt werden konnte.
Für das E. coli crp-Gen ist es bevorzugt, dass durch Deletion oder eine Kombination aus Insertion und Deletion die relative Expression des crp-Gens vom Wert 1 für den Wildtyp crp-Promotor mindestens auf das 0,91-fache, besonders bevorzugt mindestens auf das 0,5-fache und insbesondere bevorzugt auf das mindestens 0,33-fache abgeschwächt wird. Der erfindungsgemäße Stamm, gekennzeichnet durch Veränderung des crp-Promotors in einer Weise, die zur Abschwächung der crp- Expression führt, wie beispielsweise die E. coli-Stämme W3110- crp::kan-sacB, W3110-crpP-del, W3110-crp-Preg, W3110-crp-Preg2 oder W3110-crp-Preg3, kann hergestellt werden durch Verwendung der bereits beschriebenen Kombination der Lambda-Red Rekombina- tion mit einem Gegenselektions-Screening zur genetischen Modi- fikation (siehe z.B. Sun et al. 2008, s.o.), wie in den Bei- spielen 1 und 2 offenbart.
Als Stämme besonders bevorzugt sind E. coli W3110-crp-Preg2 und E. coli W3110-crp-Preg3, (beschrieben in Beispiel 2).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren umfas- send die Herstellung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin, dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemäßen Mikroorganismenstämme eingesetzt werden. Beim Verfahren kann es sich um eine Kultivierung der erfindungsgemäßen Mikroorganismenstämme im Schüttelkolben (La- bormaßstab) oder Fermenter (Produktionsmaßstab) handeln, wobei ein Verfahren im Fermenter (Produktionsmaßstab) bevorzugt ist. Zwar wird auch bei der Schüttelkolbenkultur ein bestimmtes Me- dium und pH vorgegeben und in Gegenwart von Sauerstoff und un- ter permanenter Bewegung (Schütteln) kultiviert, aber definier- tere Bedingungen betreffend das Medium (z.B. Zuführung von Kom- ponenten oder Regulierung des Fermentervolumens durch teile- weise Ablassen von Fermenterbrühe), Temperatur, pH, Sauerstoff- zufuhr und Mediumsdurchmischung lassen sich im Fermenter ein- stellen und regulieren. D.h. sowohl die Kultur im Schüttelkol- ben als auch die Kultur im Fermenter werden als fermentative Verfahren bezeichnet und unterscheiden sich im Maßstab. Im fer- mentativen Verfahren wird der mikrobielle Produktionsstamm zum Wachstum und Produktion des Stoffwechselprodukts gebracht. Die Kultur in einem kleineren Maßstab kann auch als Vorkultur zum Animpfen einer Kultur im größeren Maßstab genutzt werden. Der Stand der Technik offenbart keine Verfahren oder Produkti- onsstämme, bei denen durch Abschwächung der crp-Expression durch Veränderung der crp-Promotorsequenz die Produktion von Cystein verbessert werden kann.
Als Primärprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird L-Cys- tein gebildet. Durch Oxidation entsteht schwer lösliches L-Cys- tin nach den Gleichungen (1) bis (3), welches während der Fer- mentation als Präzipitat akkumuliert (EP 0885 962 Bl, EP 2 707 492 Bl). Durch Bildung eines Addukts mit Pyruvat entsteht Thia- zolidin, welches im Kulturüberstand akkumuliert (EP 0885 962 Bl).
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete L-Cystein, L-Cystin oder Thiazolidin isoliert wird. Die Isolierung von L-Cystein ist in EP 2 699544 Bl und EP 1 958 933 Bl offenbart. Präzipitiertes L-Cystin kann von den restlichen Bestandteilen beispielsweise mit Hilfe eines Dekan- ters abgetrennt werden, gefolgt von Lösen des Rohprodukts mit einer Mineralsäure, Klären der Rohproduktlösung durch Zentrifu- gation oder Filtration, Entfärbung der Lösung und Fällungskris- tallisation (EP 2 707492 Bl).
Die Ausbeute an Gesamtcystein wird im Rahmen dieser Erfindung definiert als Summe des hergestellten Cysteins, Cystins und Thiazolidins. Diese wird aus dem gesamten Kulturansatz be- stimmt, wie in Beispiel 7 beschrieben. Sie kann beispielsweise mit Hilfe des colorimetrischen Tests von Gaitonde (Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633) quantifiziert werden.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist die Abschwächung der crp-Expression in einem zur Cystein-, Cys- tin- oder Thiazolidin-Produktion geeigneten Mikroorganismen- stamm mit deregulierter Cystein-Biosynthese dazu geeignet, in einem fermentativen Verfahren die Ausbeuten an Gesamtcystein, d.h. die Summe des hergestellten Cysteins, Cystins und Thiazo- lidins, signifikant zu steigern. Nach dem Stand der Technik war dies völlig unerwartet.
Es ist überraschend, dass die Fermentation von Mikroorganismen- stämmen mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg und reduzier- ter Expression des crp-Gens durch Mutation der crp-Promotorse- quenz bezogen auf die Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Pro- motorsequenz zu signifikant höheren Cystein-Ausbeuten führt. Als Beleg fasst Tabelle 3 des Beispiels 7 zusammen, dass in der Fermentation der Stämme E. coli W3110-crp::kan-sacB x pCys mit 0,33-facher relativer Expression des crp-Gens, W3110-crp-Preg2 x pCys mit 0,5-facher relativer Expression des crp-Gens und W3110-crp-Preg3 x pCys mit 0,91-facher relativer Expression des crp-Gens signifikant höhere Cystein Ausbeuten im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Stamm W3110 x pCys mit der relativen crp-Expression von 1 erzielt werden konnten. Entgegen dem Stand der Technik und für den Fachmann unerwartet, führte die Ab- schwächung der Expression des crp-Gens durch vollständige oder teilweise Deletion, bzw. einer Kombination aus Insertion und Deletion im crp-Promotor zu verbesserten Cystein-produzierenden Stämmen .
Diese neue und erfinderische Maßnahme zur Verbesserung Cystein- produzierender Stämme wurde bestätigt durch die in Tabelle 2 des Beispiels 6 zusammengefassten Ergebnisse, in denen die Ab- schwächung der Expression des crp-Gens durch Deletion, bzw. ei- ner Kombination aus Insertion und Deletion im crp-Promotor bereits in der Anzucht in Schüttelkolben zu verbesserten Cys- tein Ausbeuten führte. Tabelle 2 des Beispiels 6 verdeutlicht weiterhin, dass bei Stämmen mit stark abgeschwächter crp-Ex- pression wie z.B. W3110-crpP-del x pCys (0,03-fache relative crp-Expression verglichen mit W3110 x pCys) und W3110-crp-Preg x pCys (0,05-fache relative Expression verglichen mit W3110 x pCys) auch das Zellwachstum (OD600/ml in Tab. 2) beeinträchtigt war. Dennoch war die Cysteinproduktion deutlich verbessert, was sich noch ausgeprägter darstellte, wenn die Cysteinproduktion auf das Wachstum bezogen wurde (Cystein mg/OD in Tab. 2), ent- sprechend einer Steigerung um 285,5 %, bzw. um 360 %.
Für den Fachmann stellt die Abschwächung der Expression des crp-Gens durch Deletion, bzw. einer Kombination aus Insertion und Deletion im crp-Promotor somit eine neue nützliche Maßnahme dar, die Cystein-Produktion auch in anderen Cystein-produzie- renden Stämmen zu verbessern. Im erfindungsgemäßen, zur Cys- tein-Produktion geeigneten Mikroorganismenstamm mit deregulier- ter Cystein Biosynthese wird dementsprechend die Expression des crp-Gens durch Deletion, bzw. einer Kombination aus Insertion und Deletion im crp-Promotor abgeschwächt und gleichzeitig die Cystein-Produktion erhöht, wobei eine Veränderung der crp-cds ausgeschlossen ist.
Beispiel 7 belegt, dass ein zur Cystein-Produktion befähigter Stamm mit deregulierter Cystein Biosynthese und abgeschwächter Expression des crp-Gens durch Deletion, bzw. einer Kombination aus Insertion und Deletion im crp-Promotor in der Fermentation signifikant höhere Cystein Ausbeuten erzielt als ein Stamm ent- haltend den WT-Promotor des crp-Gens, wobei die crp-cds in al- len erfindungsgemäßen Stämmen unverändert bleibt.
Im betreffenden fermentativen Verfahren werden einerseits Bio- masse des erfindungsgemäßen Produktionsstammes und andererseits Cystein und sein Oxidationsprodukt Cystin gebildet. Die Bildung von Biomasse und Cystein kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht er- folgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die An- zucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch im Fermenter (Produktionsmaßstab). Der Mikroorganismenstamm ist dadurch gekennzeichnet, dass er im Cystein Biosyntheseweg dereguliert ist und mindestens eine Mu- tation im Promotor des crp-Gens enthält. Gleichzeitig bildet der Stamm im Vergleich zum Stamm mit Wildtyp-crp-Promotor eine erhöhte Menge an L-Cystein. Bevorzugt führt die genetische Ver- änderung im Promotor des crp-Gens dazu, dass die Expression des crp-Gens gegenüber dem Wildtyp-crp-Promotor (100 % Expression, 2-ΔΔCT-Wert = 1) um mindestens 9 % (2-ΔΔCT-Wert ≤ 0,91), besonders bevorzugt um mindestens 50 % (2-ΔΔCT-Wert ≤ 0,5) und insbesondere bevorzugt um mindestens 67 % (2-ΔΔCT-Wert ≤ 0,33) reduziert ist.
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die crp-Expression des Mikroorganismenstammes mit veränderter crp- Promotorsequenz im Vergleich zu einem entsprechenden Mikroorga- nismenstamm mit Wt-crp-Promotorsequenz um mindestens 9%, beson- ders bevorzugt um mindestens 50 % und insbesondere bevorzugt um mindestens 67 % reduziert ist und die Ausbeute an einer Sub- stanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin in g/1 bei Einsatz des Mikroorganismenstamms um mindestens 10% (w/v), besonders bevorzugt um mindestens 20 % (w/v) und insbesondere bevorzugt um mindestens 50 % (w/v) erhöht ist. Erfindungsgemäß bildet der Mikroorganismenstamm eine erhöhte Menge einer Sub- stanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin, be- vorzugt L-Cystein und L-Cystin und besonders bevorzugt L-Cys- tein.
Durch die verminderte crp-Expression wird die Gesamtcysteinpro- duktion (Volumenproduktion in g/L), d.h. des hergestellten Cys- teins, Cystins und Thiazolidins bei der Anzucht im Schüttelkol- ben oder im Fermenter gegenüber dem Vergleichsstamm mit WT-crp- Promotor bevorzugt um mindestens 10 % (w/v), besonders bevor- zugt um mindestens 20 % (w/v) und insbesondere bevorzugt um mindestens 50 % (w/v) gesteigert. Dabei beträgt die Volumenpro- duktion der Schüttelkolbenanzucht innerhalb 24 h bevorzugt min- destens 0,37 g/L (Tab. 2) und die Volumenproduktion in der Fermentation innerhalb 48 h bevorzugt mindestens 15,9 g/L (Tab.
3).
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Verfahren um ein fermentatives Verfahren handelt und das Fermentationsvolumen mindestens 1 L. Besonders bevorzugt grösser 10 L, insbesondere bevorzugt grösser 1000 L und im spe- ziellen bevorzugt grösser 10000 L beträgt. Besonders bevorzugt handelt es sich beim fermentativen Verfahren um ein Verfahren im Fermenter.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiel- len Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus ei- ner Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelemen- ten sowie einer Schwefelquelle (S-Quelle), durch die das Zell- wachstum und die Cystein Produktion optimiert werden.
C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Cystein- Produktbildung genutzt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker (Hexosen) wie z. B. Glucose, Mannose, Fructose oder Galactose sowie C5-Zucker (Pen- tosen) wie z.B. Xylose, Arabinose oder Ribose sowie alle denk- baren daraus gebildeten Di- und Polysaccharide, wie z.B. Sac- charose, Lactose, Maltose, Maltodextrin, Stärke, bzw. der dar- aus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzten Monomere oder Oligomere. Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. da- von abgeleitete Acetatsalze), Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze). Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmo- noxid denkbar.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose und Arabinose, darunter besonders bevorzugt Glucose und Saccharose und insbe- sondere bevorzugt Glucose.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomasse- bildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO3, NaNO3, Ammoniumnitrat, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Amino- säuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzex- trakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Zudosierung einer Schwefel-Quelle, entweder als einmalige Zugabe in Batch-Form oder als kontinuierlicher Feed, ist für die effiziente Produktion von Cystein und Cystein-Derivaten er- forderlich. Die kontinuierliche Zudosierung kann dabei als reine Feedlösung oder aber auch im Gemisch mit einer weiteren Feed-Komponente wie z.B. Glucose erfolgen. Geeignete Schwefel- Quellen sind Salze der Sulfate, Sulfite, Dithionite, Thiosul- fate oder Sulfide, wobei auch bei gegebener Stabilität der Ein- satz der jeweiligen Säuren denkbar ist. Bevorzugte Schwefel- quellen sind Salze der Sulfate, Sulfite, Thiosulfate und Sul- fide, darunter besonders bevorzugt Salze der Sulfate und Thio- sulfate und insbesondere bevorzugt Salze des Thiosulfats, wie z.B. Natriumthiosulfat und Ammoniumthiosulfat.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das An- zuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes in- okuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt. Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüt- tert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, der Schwefel- Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vita- minen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der Vor- genannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Ge- misch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudo- siert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die Cystein Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden, oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose sowie Glucose oder Saccharose enthaltende pflanzliche Hydrolysate so- wie Mischungen der bevorzugten C-Quellen in beliebigem Mi- schungsverhältnis. Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Glucose.
Bevorzugt wird die C-Quelle der Kultur so zudosiert, dass der Gehalt der Kohlenstoffquelle im Fermenter während der Produktionsphase 10 g/L nicht übersteigt. Bevorzugt ist eine maximale Konzentration von 2 g/L, besonders bevorzugt von 0,5 g/L, insbesondere bevorzugt von 0,1 g/L.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Am- moniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO3, NaNO3 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwas- ser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base, darunter besonders bevorzugt Ammoniak, bzw. Ammonium- salze, Hefeextrakt, Sojapepton oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form). Bevorzugte Schwefelquellen im Feed sind Salze der Sulfate, Sul- fite, Thiosulfate und Sulfide, darunter besonders bevorzugt Salze der Sulfate und Thiosulfate und insbesondere bevorzugt Salze des Thiosulfats, wie z.B. Natriumthiosulfat und Ammonium- thiosulfat .
Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d. h. in pM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zuge- setzt werden. Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Ace- tat, Citrat), Aminosäuren (z.B. Isoleucin) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6) dem Medium zugesetzt werden.
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die Cystein Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 9. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 8. Besonders be- vorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7,5.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produkti- onsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 37°C und insbesondere bevorzugt von 28°C bis 34°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauer- stoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die ae- robe Kultivierung mit Sauerstoff.
Bei der aeroben Kultivierung des erfindungsgemäßen Stammes zur Cystein-Produktion wird eine Sättigung des Sauerstoff-Gehalts von mindestens 10% (v/v), bevorzugt von mindestens 20% (v/v) und besonders bevorzugt von mindestens 30% (v/v) eingestellt. Die Regulation der Sauerstoff-Sättigung in der Kultur erfolgt dabei entsprechend dem Stand der Technik automatisch über eine Kombination aus Gaszufuhr und Rührgeschwindigkeit.
Die Sauerstoffversorgung wird durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet. Bevorzugt ist die aerobe Kul- tivierung durch Eintrag von Pressluft. Der nützliche Bereich der Pressluftzufuhr bei der aeroben Kultivierung beträgt 0,05 vvm bis 10 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermentati- onsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentations- volumen pro Minute). Bevorzugt ist ein Presslufteintrag von 0,2 vvm bis 8 vvm, besonders bevorzugt von 0,4 bis 6 vvm und insbe- sondere bevorzugt von 0,8 bis 5 vvm.
Die maximale Rührgeschwindigkeit beträgt 2500 rpm, bevorzugt 2000 rpm und besonders bevorzugt 1800 rpm.
Die Kultivierungsdauer beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevor- zugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten L-Cystin in präzipitierter Form, welches nach Gleichung (1) bis (3) aus dem Primärprodukt L-Cys- tein gebildet wird (EP 0885 962 Bl, EP 2 707492 Bl). Abhängig von den Fermentationsbedingungen kann auch L-Cystein das Haupt- produkt sein, welches gelöst im Kulturüberstand akkumuliert (EP 2 726625 Bl). Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene Cys- tein, bzw. Cystin kann entweder ohne weitere Aufarbeitung di- rekt weiterverwendet oder aber aus dem Kultivierungsansatz iso- liert werden.
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete Cystein, bzw. Cystin isoliert wird. Zur Isolierung des Cysteins und Cystins stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifugation, De- kantierung, Lösen des Rohprodukts mit einer Mineralsäure, Filt- ration, Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder belie- bigen Form kombiniert werden, um das Cystein in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei angestrebte Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung. Verfahren zur Isolierung von L-Cystein sind offenbart EP 2 699544 Bl und EP 1958 933 Bl. offenbart. Das Vorgehen zur Isolierung von L-Cystin ist beschrieben in EP 2 707492 Bl.
Das bei der Aufarbeitung erhaltene Cystin kann für die weitere Verwendung zu Cystein reduziert werden. Ein Verfahren zur Re- duktion von L-Cystin zu L-Cystein in einem elektrochemischen Prozess ist in EP 0235 908 offenbart.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quanti- fizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des Cystein, bzw. Cystin Produkts sind verfügbar, darunter Spektralphotometrie, NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie, Gravimetrie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Mit der Erfindung können auch verbesserte Mikroorganismenstämme zur fermentativen Herstellung von Verbindungen, deren Biosyn- these von 3-Phosphoglycerat ausgeht und über L-Serin zu L-Cys- tein und L-Cystin führt, hergestellt werden. Dies umfasst auch Mikroorganismenstämme zur fermentativen Herstellung von Deriva- ten des L-Serins und L-Cysteins, darunter Phosphoserin, O-Ace- tylserin, N-Acetylserin und Thiazolidin.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide.
Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 und Beispiel 2 verwendeten 6,3 kb großen Vektor pKD46. Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 5 kb großen Vektor pKan-SacB .
Fig. 3 zeigt den in Beispiel 3 verwendeten 7,1 kb großen Vektor pCys.
In den Figuren verwendete Abkürzungen: bla: Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht (ß-Lacta- mase) kanR: Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht araC: araC-Gen (Repressorgen)
P araC: Promotor des araC-Gens
P araB: Promotor des araB-Gens
Garn: Lambda Phage Gam-Rekombinationsgen
Bet: Lambda Phage Bet-Rekombinationsgen
Exo: Lambda Phage Exo-Rekombinationsgen
ORI101: Temperatur-sensitiver Replikationsursprung
RepA: Gen für das Plasmid-Replikationsprotein A sacB: Levansucrase-Gen pr-f: Bindungsstelle f für Primer (vorwärts) pr-r: Bindungsstelle r für Primer (revers)
OriC: Replikationsursprung C
TetR: Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht
P15A ORT: Replikationsursprung serA317: serA (3-Phosphoglycerat Dehydrogenase-Gen, codiert für
Aminosäure 1 bis 317) cds cysE X: cysE (Serin-O-Acetyltransferase-Gen, Feedback-re- sistent) cds
ORF306: ydeD (Cystein Efflux-Gen) cds
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu- tert, ohne durch sie eingeschränkt zu werden: Beispiel 1: Herstellung des Stammes E. coli W3110-crp ::kan- sacB
Als Ausgangsstamm für die Isolierung von DNS sowie für die Stammentwicklung wurde Escherichia coii K12 W3110 verwendet (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
Ziel der Genveränderung war die Promotor-Region des crp-Gens aus E. coli. Die DNS-Sequenz des crp-Genregion, umfassend die cds des divergierend exprimierten yhfA-Gens, die crp Promotor- region und die cds des crp-Gens aus E. coli K12 (Genbank NCBI Reference Sequence NC_000913.3, nt 3485255 - nt 3486950) ist offenbart in SEQ ID NO: 1.
Die Nukleotide 163 - 564 (bezeichnet mit E. coli yhfA) umfas- sen, in revers-komplementärer Form die cds des yhfA-Gens.
Die Nukleotide 866 - 1495 (bezeichnet mit E. coli crp) umfassen die cds des crp-Gens, codierend für ein Protein mit der Amino- säuresequenz von SEQ ID NO: 2.
Der intergenische Bereich zwischen den divergierend exprimier- ten Genen yhfA und crp, umfassend die Nucleotide 565 - 865 in SEQ ID NO: 1, enthält die Promotor-Sequenz des crp-Gens. Die Analyse der crp-Promotorregion ist beschrieben in Hanamura und Ajba 1991 (s.o.).
Der Stamm E. coli W3110-crp::kan-sacB, gekennzeichnet durch In- tegration der kan-sacB-Kassette im crp-Promotor, wurde herge- stellt durch Verwendung der dem Fachmann bekannten Kombination aus Lambda-Red Rekombination und einem Gegenselektions-Scree- ning zur genetischen Modifikation (siehe z.B. Sun et al. 2008, s.o.).
Es wurde verfahren wie folgt: 1. E. coli W3110 wurde mit dem Plasmid pKD46 transformiert und Transformanten auf LBamp-Platten (10 g/L Trypton von GIBCO™, 5 g/L Hefeextrakt von BD Biosciences, 5 g/L NaCl, 1,5 % Agar, 100 mg/L Ampicillin von Sigma-Aldrich) selek- tiert. Ein Ampicillin-resistenter Klon wurde ausgewählt, der die Bezeichnung E. coli W3110 x pKD46 erhielt.
Das 6,3 kb große Plasmid pKD46 (sog. „Red Recombinase" Plasmid, Fig. 1) ist offenbart in der „GenBank" Gendaten- bank unter der Zugangsnummer AY048746.1. 2. Die 3,2 kb Kan-sacB-Kassette wurde vom Plasmid pKan-SacB durch PCR mit den Primern crp-9f (SEQ ID NO: 3) und crp-10r (SEQ ID NO: 4) isoliert.
Das 5 kb große Plasmid pKan-sacB (Fig. 2) enthält Expressi- onskassetten sowohl für das Kanamycin (kanR) Resistenzgen wie für das sacB Gen, codierend für das Enzym Levansucrase. Das E. coli Kanamycin Resistenzgen, codierend für eine Ami- noglycosid-Phosphotransferase, ist offenbart in der NCBI Datenbank unter der Zugangsnummer SH02_03400. Das B. subti- lis sacB-Gen ist offenbart in der NCBI Datenbank unter der Zugangsnummer 936413.
Der Primer crp-9f enthielt 50 nt aus der crp-Promotorregion (nt 591-640 in SEQ ID NO: 1) und daran angeschlossen 20 nt spezifisch für das Plasmid pKan-SacB (bezeichnet als „pr-f" in Fig. 2). Der Primer crp-10r enthielt 51 nt aus der crp- Promotorregion (nt 714-764 in SEQ ID NO: 1, in revers kom- plementärer Form) und daran angeschlossen 21 nt spezifisch für das Plasmid pKan-SacB (bezeichnet als „pr-r" in Fig. 2). 3. E. coli W3110 x pKD46 wurde mit dem für die crp-Promotorre- gion spezifischen 3,2 kb PCR-Produkt transformiert und Ka- namycin-resistente Klone auf LBkan-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 1,5 % Agar, 15 mg/L Ka- namycin) isoliert. 4. Kanamycin-resistente Klone wurden auf LBSC-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar und 15 mg/L Kanamycin) überimpft. Klone mit integriertem sacB-Gen produzierten aus der Saccharose toxisches Levan, was zur Wachstumshemmung führte. 5. Aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten und Sac- charose-sensitiven Klonen in LBkan-Medium (10 g/L Trypton,
5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Kanamycin) wurde ge- nomische DNS mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) iso- liert. 6. Genomische DNS wurde in einer PCR-Reaktion („Phusion™ High- Fidelity" DNS-Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Pri- mern crp-7f (SEQ ID NO: 5) und crp-8r (SEQ ID NO: 6) einge- setzt, um die Integration der Kan-sacB-Kassette nachzuwei- sen.
E. coli W3110 Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 1696 nt (entsprechend der Sequenz aus SEQ ID NO: 1), wie für die intakte Genstruktur aus yhfA-cds, crp-Promotor und crp-cds erwartet. Kanamycin-resistente Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS- Fragment von ca. 4800 nt, wie für den Fall erwartet, dass das 3,2 kb PCR-Produkt an den durch die Primer crp-9f und crp-10r definierten Stellen im crp-Promotor integriert wor- den war. Durch Integration der 3,2 kb Kan-sacB Kassette an den durch die Primer crp-9f und crp-10r definierten Stel- len, bestätigt durch DNS-Sequenzierung des 4800 nt PCR- Produkts, wurden 74 Nucleotide aus dem crp-Promotor ent- fernt (SEQ ID NO: 1, nt 641 - nt 713). 7. Ein Klon mit integrierter Kan-sacB Kassette wurde ausge- wählt und erhielt die Bezeichnung W3110-crp::kan-sacB x pKD46. 8. Durch Inkubation bei 42°C wurde das temperatursensitive Plasmid pKD46 entfernt. Klone ohne das pKD46 Plasmid waren Ampicillin sensitiv und konnten auf LBamp-Platten nicht mehr wachsen. Ein Ampicillin-sensitiver Klon wurde ausge- wählt und erhielt die Bezeichnung W3110-crp::kan-sacB. Beispiel 2: Herstellung von W3110-Stämmen mit unterschied- lieh verkürztem crp-Promotor
Folgende W3110-Stämme mit verkürztem crp-Promotor wurden herge- stellt:
W3110-crpP-del : Deletion nt 565 - nt 865 aus SEQ ID NO: 1
W3110-crp-Preg: Deletion nt 565 - nt 713 aus SEQ ID NO: 1
W3110-crp-Preg2 : Deletion nt 565 - nt 675 aus SEQ ID NO: 1
W3110-crp-Preg3 : Deletion nt 565 - nt 624 aus SEQ ID NO: 1
W3110-Stämme mit verkürztem crp-Promotor wurden hergestellt, indem durch homologe Rekombination die kan-sacB-Kassette des
Stammes W3110-crp::kan-sacB durch ein DNS-Fragment ersetzt wurde, welches die veränderte Promotorsequenz enthielt. DNS- Fragmente mit den veränderten Promotorsequenzen wurden in be- kannter Weise durch Fusions-PCR (sog. OE-PCR, abgekürzt für „Overlap Extension PCR") aus zwei, den veränderten Promotor de- finierenden PCR-Produkten hergestellt. Zur Herstellung der im Folgenden beschrieben PCR-Produkte wurde jeweils die „Phusion™ High-Fidelity" DNS-Polymerase (Thermo Scientific™) entsprechend den Angaben des Herstellers eingesetzt.
Folgende Primer wurden verwendet: crp-13f (SEQ ID NO: 7): entspricht nt 160 - 180 in SEQ ID NO: 1. crp-14r (SEQ ID NO: 8): entspricht nt 545 - 564 in SEQ ID NO: 1; in revers-komplementärer Form. crp-17f (SEQ ID NO: 9): entspricht nt 537 - 565 (nt 1 bis 29 in crp-17f) und nt 866 - 885 (nt 30 bis 49 in crp-17f) in SEQ ID NO: 1. crp-12r (SEQ ID NO: 10): entspricht nt 1478 - 1498 in SEQ ID NO: 1; in revers-komplementärer Form. crp-18f (SEQ ID NO: 11): entspricht nt 537 - 564 (nt 1 bis 28 in crp-18f) und nt 714 - 734 (nt 29 bis 49 in crp-18f) in SEQ ID NO: 1. crp-19f (SEQ ID NO: 12): entspricht nt 537 - 564 (nt 1 bis 28 in crp-19f) und nt 676 - 700 (nt 29 bis 53 in crp-19f) in SEQ ID NO: 1. crp-20f (SEQ ID NO: 13): entspricht nt 537 - 564 (nt 1 bis 28 in crp-20f) und nt 625 - 644 (nt 29 bis 48 in crp-20f) in SEQ ID NO: 1.
Folgende PCR-Produkte wurden hergestellt:
PCR 1: Durch PCR mit genomischer DNS von E. coli W3110 und den Primern crp-13f und crp-14r wurde ein 0,4 kb PCR-Produkt herge- stellt.
PCR 2: Durch PCR mit genomischer DNS von E. coli W3110 und den Primern crp-17f und crp-12r wurde ein 0,65 kb PCR-Produkt her- gestellt.
PCR 3: Durch PCR mit genomischer DNS von E. coli W3110 und den Primern crp-18f und crp-12r wurde ein 0,8 kb PCR-Produkt herge- stellt.
PCR 4: Durch PCR mit genomischer DNS von E. coli W3110 und den Primern crp-19f und crp-12r wurde ein 0,8 kb PCR-Produkt herge- stellt.
PCR 5: Durch PCR mit genomischer DNS von E. coli W3110 und den Primern crp-20f und crp-12r wurde ein 0,8 kb PCR-Produkt herge- stellt.
Durch OE-PCR (Overlap Extension PCR), wie z.B. beschrieben in Hilgarth and Lanigan, MethodsX (2020), 7: 100759 wurden fol- gende Fusions-PCR-Produkte hergestellt:
PCR 6: 1 kb Fusions-PCR-Produkt zur Herstellung des Stammes E. coli W3110-crpP-del durch OE-PCR von PCR 1 und PCR 2 und den Primern crp-13f und crp-12r. PCR 7: 1,2 kb Fusions-PCR-Produkt zur Herstellung des Stammes
E. coli W3110-crp-Preg durch OE-PCR von PCR 1 und PCR 3 und den Primern crp-13f und crp-12r.
PCR 8: 1,2 kb Fusions-PCR-Produkt zur Herstellung des Stammes
E. coli W3110-crp-Preg2 durch OE-PCR von PCR 1 und PCR 4 und den Primern crp-13f und crp-12r.
PCR 9: 1,2 kb Fusions-PCR-Produkt zur Herstellung des Stammes E. coli W3110-crp-Preg3 durch OE-PCR von PCR 1 und PCR 5 und den Primern crp-13f und crp-12r.
Transformation von E. coli W3110-crp::kan-sacB x pKD46: Die Fusions-PCR-Produkte PCR 6, PCR 7, PCR 8 und PCR 9 wurden jeweils in E. coli W3110-crp::kan-sacB x pKD46 transformiert und Klone auf LBS-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar) ohne Kanamycin selektiert. Auf LBS- Platten konnten nur Klone wachsen, die kein aktives sacB-Gen mehr enthielten. Diese Klone wurden auf LBkan-Platten über- impft, um solche Klone zu selektieren, die auch kein aktives Kan-Gen mehr enthielten und deren Wachstum in Gegenwart von Ka- namycin gehemmt wurde. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und durch Inkubation bei 42°C das temperatursensitive Plasmid pKD46 entfernt. Klone ohne das pKD46 Plasmid waren Ampicillin sensi- tiv und konnten auf LBamp-Platten nicht mehr wachsen. Die je- weiligen Klone erhielten die Bezeichnung E. coli W3110-crpP- del, E. coli W3110-crp-Preg, E. coli W3110-crp-Preg2, bzw. E. coli W3110-crp-Preg3.
PCR-Analyse der Transformanten:
Klone mit positivem Wachstum in Gegenwart von Saccharose und negativem Wachstum in Gegenwart von Kanamycin wurden ausgewählt und aus Zellen der Anzucht in LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl) genomische DNS mit einem DNS- Isolierungskit (Qiagen) gewonnen. Genomische DNS wurde in einer PCR-Reaktion („Phusion™ High-Fi- delity" DNS-Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern crp-7f und crp-8r eingesetzt, um zu überprüfen, ob die Kan-sacB Kassette korrekt durch das jeweilige Fusions-PCR-Produkt er- setzt worden war. Klone mit einem PCR-Produkt von der erwarte- ten Größe wurden jeweils ausgewählt und der korrekte Einbau der veränderten Promotorsequenz sowie die nicht veränderte Sequenz der crp-cds durch DNS-Sequenzierung der PCR-Produkte (Eurofins Genomics) analysiert.
Die PCR-Produkte hatten die folgenden erwarteten Größen:
Stamm E. coli W3110-crpP-del: 1397 nt. Deletion nt 565 - nt 865 aus SEQ ID NO: 1.
Stamm E. coli W3110-crp-Preg: 1549 nt. Deletion nt 565 - nt 713 aus SEQ ID NO: 1.
Stamm E. coli W3110-crp-Preg2: 1587 nt Deletion nt 565 - nt 675 aus SEQ ID NO: 1.
Stamm E. coli W3110-crp-Preg3: 1637 nt Deletion nt 565 - nt 624 aus SEQ ID NO: 1.
Beispiel 3: Herstellung von Cystein Produktionsstämmen
Zur Herstellung von Cystein-Produktionsstämmen (Stämmen mit de- regulierter Cystein-Biosynthese) wurde das Cystein-spezifische Produktionsplasmid pCys (Fig. 3) verwendet. pCys ist ein Derivat des in EP 0885 962 Bl offenbarten Plas- mids pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306.
Das Plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 enthält neben dem Rep- likationsursprung und einem Tetracyclin-Resistenzgen (Aus- gangsvektor pACYC184) das cysEX-Allel, das für eine Serin-Q- Acetyl-Transferase mit einer verminderten Feedback-Hemmung durch Cystein codiert sowie das Effluxgen ydeD (ORF306), dessen Expression durch den konstitutiven GAPDH Promotor gesteuert wird. pCys enthält darüberhinaus, kloniert hinter das ydeD (QRF306) Efflux Gen, noch das serA317 Genfragment, codierend für die N- terminalen 317 Aminosäuren des SerA Proteins (Gesamtlänge 410 Aminosäuren) . Das E. coli serA Gen ist offenbart in der „Gen- Bank" Gendatenbank mit der Gene ID 945258. serA317 ist offen- bart in Bell et al. 2002 (s.o., darin bezeichnet als „NSD:317" und codiert für eine gegen Serin Feedback-resistente Variante der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase. Die Expression von serA317 wird gesteuert durch den serA-Promotor.
Es wurden die Stämme E. coli W3110, E. coli W3110-crp::kan- sacB, E. coli W3110-crpP-del, E. coli W3110-crp-Preg, E. coli W3110-crp-Preg2 und E. coli W3110-crp-Preg3 jeweils mit dem Plasmid pCys transformiert.
Die Selektion von Plasmid-tragenden Transformanten erfolgte auf LBtet-Agarplatten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 1,5% Agar, 15 mg/L Tetracyclin). Es wurde jeweils ein Klon ausgewählt. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Stämme erhielten folgende Bezeichnungen:
E. coli W3110 x pCys,
E. coli W3110-crp::kan-sacB x pCys
E. coli W3110-crpP-del x pCys
E. coli W3110-crp-Preg x pCys
E. coli W3110-crp-Preg2 x pCys
E. coli W3110-crp-Preg3 x pCys
Beispiel 4: Anzucht im Schüttelkolben
Vorkultur: Als Vorkultur für die Kultivierung im Schüttelkolben wurden 3 ml LBtet-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl, 15 mg/L Tetracyclin) mit dem jeweiligen Cystein Pro- duktionsstamm aus Beispiel 3 beimpft und bei 30°C und 135 rpm für 16 h in einem Schüttler (Infors) inkubiert und die OD600/ml (optischen Dichte der Anzucht/ml Kultur, gemessen bei 600 nm) bestimmt . Hauptkultur: Anschließend wurden 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml SMl-Medium, enthaltend 15 g/L Glucose, 5 mg/L Vitamin Bl, 2 g/L Na-Thiosulfat und 15 mg/L Tetracyclin, mit einem Volumen der Vorkultur beimpft, sodass eine OD600/ml von 0,05 resultierte.
Zusammensetzung des SMl-Mediums: 12 g/L K2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 5 g/L (NH4)2SO4, 0,3 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,015 g/L CaCl2 x 2 H2O, 0,002 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H2O, 0,1 g/L NaCl;
1 ml/L Spurenelementlösung.
Zusammensetzung der Spurenelementlösung: 0,15 g/L Na2MoO4 x 2 H20, 2,5 g/L H3BO3, 0,7 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuSO4 x 5 H2O, 1,6 g/L MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/L ZnSO4 x 7 H20.
Zur Isolierung von RNA für RT-PCR Versuche wurden die 30 ml-An- sätze bei 30°C und 140 rpm bis zu einer OD600/ml von 0,5/ml in- kubiert (4 - 5 h Inkubationsdauer).
Zur Bestimmung der Cystein-Produktion wurden die 30 ml-Ansätze für 24 h bei 30°C und 140 rpm inkubiert.
Zur vergleichenden Analyse der Cysteinproduktion eines WT- Stammes mit nicht-deregulierter Cystein-Biosynthese in Beispiel 6 erfolgte die Anzucht des Stammes E. coli W3110 ohne Plasmid pCys auf gleiche Weise, wobei bei der Kultur dieses Stammes mit nicht-deregulierter Cystein-Biosynthese alle Medien jedoch kein Tetracyclin enthielten.
Beispiel 5: Analyse der crp-Expression durch RT-PCR
1) Isolierung von RNS: 0,5 ml Hauptkultur mit einer OD600/ml von 0,5/ml aus Beispiel 4 wurde zur Stabilisierung der RNS mit 1 ml RNA-Protect® („Bacteria Reagent", Qiagen) versetzt. RNS wurde aus den Proben mit Hilfe des RNeasy RNA-Isolierungskits (RNeasy Mini Kit, Qiagen) entsprechend den Angaben des Herstellers isoliert. Je nach Stamm wurden aus 0,5 ml Hauptkultur 8 bis 10 pg RNS isoliert. Die Bestimmung der RNS-Konzentration erfolgte mit dem Qubit 3.0 Fluorometer der Fa. Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit™ RNA BR Assay Kits" nach Angaben des Herstellers .
2) Herstellung von komplementärer DNS (cDNS): 1,5 pg isolierte RNS wurden durch reverse Transkription mit dem QuantiNova™ Re- verse Transcription Kit (Qiagen) zu cDNS umgesetzt. Die Bestim- mung der cDNS-Konzentration erfolgte mit dem Qubit 3.0 Fluoro- meter der Fa. Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit™ dsDNS HS Assay Kits" nach Angaben des Herstellers. Die cDNS-Ausbeute aus 1,5 pg RNS betrug 350 - 390 ng.
3) RT-PCR: Verwendet wurde ein RotorGene Q 2plex RT-PCR-Gerät der Fa. Qiagen, betrieben mit der RotorGene Q Steuerungs- und Auswertungssoftware des gleichen Herstellers. Verwendet wurde weiterhin der QuantiNova™Sybr® Green PCR Kit für Real-Time PCR (Qiagen).
Analysiert wurden die Expression des crp-Gens sowie des cysG- Gens als Referenzgen. Das Referenzgen cysG diente zur Normie- rung als interner Standard mit wenig veränderlicher Expression (Zhou et al. 2011 (s.o.)), gegen den die Expression des crp- Gens verglichen wurde.
Folgende Primer wurden verwendet: crp-Gen: Primer crp-lf (SEQ ID NO: 14) und crp-2r (SEQ ID NO: 15). cysG-Gen: Primer cysg-lf (SEQ ID NO: 16) und cysg-2r (SEQ ID NO: 17).
Analysiert wurde cDNS aus der Schüttelkolbenanzucht der sechs mit dem Plasmid pCys transformierten Stämme aus Beispiel 4, wo- bei die crp-Expression im Stamm W3110 x pCys für die Auswertung der relativen Expression des crp-Gens als Bezugspunkt diente (Vergleichsstamm; crp-Expression vom Wildtyp-Promotor), gegen den die crp-Expression der anderen Stämme verglichen wurde. Jede RT-PCR Reaktion wurde zur statistischen Absicherung in Replikaten gleichzeitig viermal identisch durchgeführt (Vier- fachbestimmung) . Für die cDNS der sechs Stämme wurden sowohl für das cysG-Referenzgen wie für das zu bestimmende crp-Gen die RT-PCR Reaktionen gleichzeitig in einem Lauf durchgeführt, was bei einer Vierfachbestimmung der Expression von zwei Genen je Stamm insgesamt 48 RT-PCR Reaktionen entsprach.
RT-PCR Ansätze: Ein RT-PCR-Ansatz (Endvolumen 20 pl) zur Ana- lyse der Expression des crp-Gens war zusammengesetzt aus 10 pl H2O, enthaltend 20 ng cDNS und je 14 pmol der crp-spezifischen Primer crp-lf und crp-2r sowie 10 pl QuantiNova™Sybr® Green Mastermix für Real-Time PCR (Qiagen), enthaltend die DNS- Polymerase und den Fluoreszenzfarbstoff Sybr® Green zur Detek- tion neu gebildeter DNS. Ein RT-PCR-Ansatz (Endvolumen 20 pl) zur Analyse der Expression des cysG-Gens war zusammengesetzt aus 10 pl H2O, enthaltend 20 ng cDNS und je 14 pmol der cysG- spezifischen Primer cysg-lf und cysg-2r sowie 10 pl QuantiNo- va™Sybr® Green Mastermix für Real-Time PCR (Qiagen), enthaltend die DNS-Polymerase und den Fluoreszenzfarbstoff Sybr® Green zur Detektion neu gebildeter DNS.
Das RT-PCR Programm bestand, nach einer ersten Inkubation von 2 min 95°C, aus 40 Zyklen von je 5 see 95°C und 10 see 60°C. Das durch Bindung von Sybr® Green an neu gebildete Doppelstrang-DNS hervorgerufene Fluoreszenzsignal wurde von einem Detektor des RT-PCR-Geräts registriert und dessen zeitlicher Verlauf durch die Auswertungssoftware analysiert.
4) Auswertung der RT-PCR: Die Auswertungssoftware ermittelte die crp-Expression eines Stammes relativ zur crp-Expression des Vergleichsstammes W3110 x pCys. Der Analyse zugrunde lag das sog. 2-ΔΔCT-Verfahren, dessen mathematische Herleitung von Livak und Schmittgen 2001 (s.o.) beschrieben wurde. Für den Ver- gleichsstamm ergab sich aus dieser Analyse ein 2-ΔΔCT-Wert von 1. Werte > 1 bedeuten demnach eine verstärkte crp-Expression, Werte < 1 entsprechend eine verringerte crp-Expression.
Aus dem zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzsignals ermittelte die Auswertungssoftware für jede vierfach-bestimmte Probe den Mittelwert des sog. CT-Werts (CT „Cycle Threshold") und daraus wurde in einem ersten Schritt für jeden Stamm die Differenz ACT aus den CT-Werten des crp-Gens und des cysG-Referenzgens als ACT = CTcrp - CTcysG gebildet. In einem zweiten Schritt wurde die Differenz AACT aus dem ACT-Wert eines zu analysierenden Stammes und dem ACT-Wert des Vergleichsstamm W3110 x pCys gebildet als AACT = ACT - ACTW3110 x pcys • In einem dritten Schritt wurde aus dem AACT-Wert der Wert 2-ΔΔCT gebildet, der ein Maß für die re- lative Expression des crp-Gens eines Stammes im Vergleich zur Expression des crp-Gens im Vergleichsstamm W3110 x pCys (Wt- crp-Promotor) darstellte. Tabelle 1 fasst die relative crp-Ex- pression der untersuchten Stämme im Vergleich zur Expression des Vergleichsstammes W3110 x pCys (Expression normiert auf den Wert 1) zusammen. **) ΔΔCT: ΔCT - ΔCT(Vergleichsstamm W3110 x pCys)
Beispiel 6: Bestimmung des Cysteinproduktion aus Überstän- den der Schüttelkolbenanzucht
Von den Hauptkulturen aus Beispiel 4 wurden nach 24 h Anzucht Proben entnommen und die Zelldichte OD600/ml sowie der Ge- samtcystein-Gehalt im Kulturüberstand bestimmt, wobei zur quan- titativen Bestimmung von Cystein der colorimetrische Test von Gaitonde 1967 (s.o.) verwendet wurde. 20 pl Kulturüberstand wurden in 2 ml Testansatz eingesetzt. Dabei ist zu berücksich- tigen, dass dieser Test unter den stark sauren Reaktionsbedin- gungen nicht zwischen Cystein und dem in EP 0885 962 Bl be- schriebenen Kondensationsprodukt von Cystein und Pyruvat, der 2-Methyl-thiazolidin-2,4-Dicarbonsäure (Thiazolidin), unter- scheidet. L-Cystin, das entsprechend Gleichung (2) durch Oxida- tion zweier Cystein-Moleküle entsteht, wird im Test durch Re- duktion mit Dithiothreitol in verdünnter Lösung bei pH 8,0 ebenfalls als Cystein nachgewiesen.
Tab. 2 enthält die Zelldichte (OD600/ml) und den Cysteingehalt (Cystein mg/ml) der Hauptkulturen, sowie zusätzlich die auf die Zelldichte bezogene spezifische Cysteinproduktion (Cystein mg/OD) und die spezifische Cysteinproduktion (Cystein % von W3110 x pCys) in Prozent bezogen auf den Vergleichsstamm W3110 x pCys (=100 %).
Tab. 2: Cysteinproduktion im Schüttelkolben von W3110-Stäm- men mit verändertem crp-Promotor
Beispiel 7: Cystein-Produkt!on im Fermenter
Verglichen wurden E. coli W3110 x pCys, W3110-crp::kan-sacB x pCys, W3110-crp-Preg2 x pCys und W3110-crp-Preg3 x pCys im Pro- duktionsmaßstab der Fed-Batch Fermentation. Die Stämme E. coli W3110-crpP-del x pCys und W3110-crp-Preg x pCys mit der ge- ringsten crp-Expression (Tab. 1) wurden aufgrund schlechten Wachstums im Fermenter nicht weiter untersucht.
Vorkultur 1: 20 ml LBtet-Medium wurden in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit dem jeweiligen Stamm beimpft und 7 h auf einem Schüttler (150 rpm, 30°C) inkubiert.
Vorkultur 2:
Anschließend wurden die jeweiligen Vorkulturen 1 vollständig in 100 ml SMl-Medium, supplementiert mit 5 g/L Glucose, 5 mg/L Vi- tamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin (Zusammensetzung SMl-Medium siehe Beispiel 4), überführt.
Die Kulturen wurden in Erlenmeyerkolben (1 L Volumen) bei 30°C für 17 h bei 150 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Nach dieser Inkubation lag die Zelldichte OD600/ml zwischen 3 und 5.
Hauptkultur :
Die Fermentation wurde in einem Fermenter des Typs „DASGIP® Pa- rallel Bioreactor Systems für die Mikrobiologie" der Firma Ep- pendorf durchgeführt. Es wurden Kulturgefäße mit 1,81 Gesamt- volumen verwendet. Das Fermentationsmedium (900 ml) enthielt 15 g/L Glucose, 10 g/L Trypton (Difco), 5 g/L Hefeextrakt (Difco), 5 g/L (NH4)2SO4, 1,5 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 0,3 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,015 g/L CaCl2 x 2 H2O, 0,075 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H2O und 1 ml Spurenelementlösung (siehe Beispiel 6), 0,005 g/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin.
Der pH-Wert im Fermenter wurde zu Beginn durch Zupumpen einer 25% NH4OH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit 25% NH4OH auf einem Wert von 7,0 gehalten.
Zum Animpfen wurden 100 ml der Vorkultur 2 in das Fermenterge- fäß gepumpt. Das Anfangsvolumen betrug somit etwa 1 L. Die Kul- turen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Belüf- tungsrate von 2 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermen- tationsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentationsvolumen pro Minute) mit einer über einen Steril- filter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingun- gen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sät- tigung kalibriert worden.
Der Soll-Wert für die O2-Sättigung während der Fermentation wurde auf 30% eingestellt. Nach Absinken der O2-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die O2-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit (auf max. 1.500 rpm) kontinuierlich gesteigert.
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 30°C durchge- führt. Nach 2 h Fermentationsdauer erfolgte die Zufütterung ei- ner Schwefelquelle in Form einer sterilen 60% (w/v) Stammlösung von Natrium-Thiosulfat x 5 H2O mit einer Rate von 1,5 ml pro Stunde.
Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 15 g/L auf ca. 2 g/L abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zu- dosierung einer 56% (w/w) Glucose-Lösung. Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glucosekonzentration im Fermen- ter 2 g/L fortan nicht mehr überstieg. Die Glucose-Bestimmung erfolgte mit einem Glucoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA).
Die Fermentationsdauer betrug 48 h. Danach wurden Proben vom Fermentationsansatz entnommen und der Gehalt von L-Cystein und den davon abgeleiteten Derivaten im Kulturüberstand (v.a. L- Cystein und Thiazolidin) und im Niederschlag (L-Cystin) jeweils getrennt voneinander bestimmt. Zu diesem Zweck wurde jeweils der colorimetrische Test von Gaitonde 1967 verwendet (s.o.).
Das im Niederschlag befindliche L-Cystin musste zuerst in 8% (v/v) Salzsäure aufgelöst werden, bevor es auf dieselbe Art quantifiziert werden konnte. Schließlich wurde die Gesamtmenge Cystein als Summe aus Cystein im Pellet und im Überstand be- stimmt. Wie in Tabelle 3 zusammengefasst, war die Zelldichte OD600/ml der untersuchten Stämme vergleichbar. Die Cystein-Volumenpro- duktion (in g/L) hingegen war sowohl in W3110-crp::kan-sacB x pCys, W3110-crp-Preg2 x pCys und W3110-crp-Preg3 x pCys höher als im Kontrollstamm W3110 x pCys mit unverändertem crp-Promo- tor.

Claims

Patentansprüche
1. Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosynthese- weg, der dadurch zur fermentativen Herstellung mindestens einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thia- zolidin geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die re- lative Expression des crp-Gens durch Mutation der crp-Pro- motorsequenz bezogen auf die Expression des crp-Gens mit Wildtyp-Promotorsequenz reduziert ist.
2. Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich- net, dass die Aminosäuresequenz des Crp-Proteins nicht mu- tiert ist.
3. Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in der crp-Promotorsequenz mindestens eine Deletion oder Inse- rtion umfasst.
4. Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass von der crp-Pro- motorsequenz, die in SEQ ID NO: 1 nt 565-865 angegeben ist, mindestens nt 565-624 deletiert ist.
5. Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die crp-Promotor- sequenz vollständig deletiert ist.
6. Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Mik- roorganismenstamm um einen Stamm aus der Familie der Enterobacteriaceae oder Corynebacteriaceae handelt.
7. Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismenstamm ausgewählt ist aus der Gruppe beste- hend aus Escheri chia coli , Pantoea anana ti s und Corynebac teri um gl utami cum .
8 . Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet , dass es sich beim Mik- roorganismenstamm um einen Stamm der Spezies Escheri chia coli handelt .
9 . Mikroorganismenstamm gemäß einem oder mehreren der Ansprü- che 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet , dass es sich beim ex- primierten Crp-Protein um SEQ ID NO : 2 handelt .
10 . Verfahren zur Herstellung mindestens einer Verbindung aus- gewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin, dadurch gekennzeichnet , dass ein Mikroorganismenstamm nach einem der Ansprüche 1 bis 9 eingesetzt wird .
11 . Verfahren gemäß Anspruch 10 , dadurch gekennzeichnet , dass das gebildete L-Cystein, L-Cystin oder Thiazolidin isoliert wird .
12 . Verfahren gemäß Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet , dass die crp-Expression des Mikroorganismenstammes mit veränder- ter crp-Promotorsequenz im Vergleich zu einem entsprechen- den Mikroorganismenstamm mit Wt-crp-Promotorsequenz um min- destens 9% reduziert ist und die Ausbeute an einer Substanz ausgewählt aus L-Cystein, L-Cystin und Thiazolidin in g/ 1 bei Einsatz des Mikroorganismenstamms um mindestens 10% (w/v) erhöht ist .
13 . Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis
12 , dadurch gekennzeichnet , dass es sich beim Verfahren um ein fermentatives Verfahren handelt und das Fermentations- volumen mindestens 1 L beträgt .
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