EP4444104A1 - Wasserloesliches leguminosenprotein - Google Patents

Wasserloesliches leguminosenprotein

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Publication number
EP4444104A1
EP4444104A1 EP22856870.5A EP22856870A EP4444104A1 EP 4444104 A1 EP4444104 A1 EP 4444104A1 EP 22856870 A EP22856870 A EP 22856870A EP 4444104 A1 EP4444104 A1 EP 4444104A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
water
legume
protein
ultrafiltration
retentate
Prior art date
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Pending
Application number
EP22856870.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nico REINS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Emsland Staerke GmbH
Original Assignee
Emsland Staerke GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Emsland Staerke GmbH filed Critical Emsland Staerke GmbH
Publication of EP4444104A1 publication Critical patent/EP4444104A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A23J3/16—Vegetable proteins from soybean
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis

Definitions

  • the invention relates to water-soluble legume protein and methods for its production.
  • legume protein is understood as meaning protein mixtures which are obtained from legume fruit water.
  • Legume fruit water is the turbid aqueous solution that remains in solution when crushed legume seeds are slurried with water after the suspended solids and water-insoluble materials have been mechanically separated.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The invention is explained below using peas (pisum sativum), beans and lentils - but the method is just as suitable for other grain legume seeds, e.g. B. the
  • Phaseolus species Phaseolus species (Phaseolus ssp.):
  • Tepary bean Phaseolus acutifolius A. Gray
  • Fire bean makeup bean (Phaseolus coccineus L.), engl. scarlet runner bean, span, ayocote, port, feijäo-da-espanha/feijoca
  • Soybean (Glycine max'), engl. soybean, span, soy, port, soy
  • Pigeon pea (Cajanus cajan), engl. pigeon pea, span, guandul, port, guandu
  • Chickpea (Cicer arietinum), engl. chickpea, Spanish Garbanzo, port, Graeode- bico
  • Vigna species (Vigna ssp.)
  • Lupine species (Lupinus ssp.)
  • Species of only local importance are the New World jack bean (Canavalia ensiformis L.) and the Old World sword bean (Canavalia gladiata) in some tropical countries.
  • Helmet beans (Lablab purpureus) are grown in Africa, India and some countries cultivated in Southeast Asia.
  • the vetchling (Lathyrus sativus) is mainly of importance in India because it is considered to be very drought tolerant.
  • Ground beans (Macrotolyma geocarpum) are endemic only to West Africa and ripen in the soil substrate similar to peanuts.
  • horse bean Macrotolyma uniflorum
  • yam bean Pachyrhizus erosus
  • Goa or wing bean Psophocarpus tetragonobolus
  • tuber bean African yam bean
  • legume seeds are understood to mean grain legumes, such as peas, chickpeas, lentils, beans—such as field beans, mung beans, soybeans, and lupine seeds and the like.
  • the fruits of all grain legumes are characterized by a high protein content.
  • This protein is interesting for a wide variety of applications. It is usually desired that the protein behaves as much as animal protein - i.e. it should replace it in recipes - preferably it can be whipped, has an emulsifying effect, and forms a film and gel. Thanks to these properties, it can replace animal protein as a binding agent (e.g. in meat products), foaming agent in baking processes and in milk imitations that can be whipped by adding legume protein (e.g. like frothable milk or vegetable cream substitute). But legume proteins are also in demand in cosmetics and technology. They are also used as adhesives and adhesive starting materials, for example in photoresists or for glue substitute materials, flotation aids, emulsifiers.
  • separating the slurry into solids and an aqueous protein solution comprising water-soluble proteins by centrifugal forces or filtration - (methods known to those skilled in the art of recovering starch from natural products), where filtration also includes gel filtration and/or centrifugal force separation,
  • a conductivity of between 1.0 and 3.0 mS/cm is achieved here.
  • ultrafiltration retentate which forms smooth films, foams well, emulsifies and can be processed as such or into dried protein.
  • This ultrafiltration retentate can also be used as an aqueous solution or processed further - e.g. broken down into different protein types by fractionated thermal or pH precipitation. It can be added in dissolved form to other foods or cosmetics to give them the desired properties.
  • Conventional alkaline materials approved for use in food can be used as suitable materials for adjusting the pH value of the diafiltration water; for example, NaOH, KOH, Ca(OH) 2 , NH 4 OH, Mg(OH) 2 are suitable.
  • the production of the ultrafiltration retentate can be followed by a step of preserving the ultrafiltration retentate, selected from: drying, including lyophilization and/or cooling or freezing the solution or freeze-drying.
  • the ultrafiltration permeate can be used to recover salts, sugars and oligosaccharides, amino acids and small peptides, for which it can be subjected to reverse osmosis, which only allows salts and ions to permeate and carbohydrates and amino acids are retained. This also has the advantage of lower waste water pollution.
  • the invention comprises additional features which may be included individually or in various combinations as appropriate for a particular application.
  • water-soluble legume proteins which can be produced by: crushing peeled legume seeds, mixing the crushed, optionally defatted legume seeds with water to produce a legume slurry; adjusting the pH of the legume slurry to between pH 6.8 and 7.5; Separation of the legume slurry by centrifugal force or filters into starch and fibers, e.g.
  • aqueous protein solution adjusting the pH of the protein solution thus separated to a pH of between 7.2 and 8.5; ultrafiltration of the pH-adjusted protein solution; diafiltration of the ultrafiltration retentate with water adjusted to pH 7.5-8.2 selected from fresh water and demineralized water, recovery of the diafiltered ultrafiltration retentate; and drying or cooling or freezing the ultrafiltration retentate as water-soluble legume proteins in solution or as a dry matter.
  • the cooled protein solution can be used as such, but also, for example, for further separation into proteins of different molecular weights. However, separation by fractional isoelectric precipitation is also possible, since different protein groups have different isoelectric points.
  • the protein powder can be mixed into food or sold as such - the drying process is important for the functionality of the protein and should be carried out as gently as possible.
  • the UF retentate can be added to viscous products such as ice cream or TVPs that are sold semi-moist from the refrigerated display case or fresh.
  • the water-soluble legume proteins are converted into a completely water-soluble and storable powder by spray drying, freeze drying and lyophilization. It is useful to add adsorbents such as activated charcoal, flavonoid-adsorbing resins, silicates and other suitable adsorbents to the aqueous ultrafiltration-retentate protein solution for the purpose of removing anti-nutritional components (lectins, protease inhibitors, phytates, tannins, saponins, alkaloids, aldehydes) and improving the taste. as known to those skilled in the art, in particular to remove colorants and certain flavonoids, undesirable anti-nutritional substances.
  • adsorbents such as activated charcoal, flavonoid-adsorbing resins, silicates and other suitable adsorbents
  • Volatile components that negatively affect taste and smell such as aldehydes, alcohols, ketones (see C. Murat, M.-H. Bard, C. Dhalleine, N. Cayot, J. Food Research 2013, 53, 31-41). be removed or at least reduced by vacuum extraction, or by adsorption on known adsorbents.
  • Phytate present in the protein solution can, for example, be precipitated and removed in a manner known per se by precipitation with divalent ions, mostly calcium or magnesium cations, after the starch/fiber separation.
  • the water-soluble legume proteins i.e. the diafiltered ultrafiltration retentate
  • HTST treatment high temperature short time treatment
  • the cut-off of the ultrafiltration membrane can be between 1 and 100 kDa, with a compromise between yield and selectivity that can easily be determined by the person skilled in the art being made.
  • the leaching of salts, sugars, amino acids, and other components is beneficial to protein functionality, as shown in Figure 13, a graph of viscosity development upon heating and cooling protein solutions.
  • the samples are sorted according to their protein content (top left - pea fruit water with low protein content, bottom right - retentate VCR3, 2BV (protein according to the invention) with the highest protein content).
  • the abbreviation VCR volume concentration factor describes the concentration factor of the solution and is calculated from the quotient of volume (feed)/volume (retentate).
  • BV batch volume
  • the abbreviation BV is a measure of water addition during diafiltration.
  • the BV describes the volume that is circulating in the system at a certain point in time. The designation is given in diafiltration to express how much water has been added.
  • you start diafiltration with a retentate volume of 40 L at this point (1 BV 40 L).
  • the statement 2 BV Dia. means that 40 L of water were added twice in the batch.
  • the curves shown in FIG. 13 are as follows: The top, solid curve is a pea fruit water UF retentate washed with VCR3, 2BV, in which a clear increase in viscosity can be seen in the temperature range from about 70° C., which at 90° C reached a plateau.
  • the dotted curve underneath is the diafiltered UF retentate, which was also diafiltered with VCR3 with water pH 7.5, but was concentrated to a factor of 3 with only 1 BV. It can be seen that doubling the batch volume (BV) leads to a significant drop in viscosity over time or the achievable activation temperature. This can be significant in applications where the product is boiled or heated to a higher temperature.
  • the curve below shows the behavior of the UF retentate that was diafiltered with VCR 4.7 - you can see a further clear drop in the viscosity behavior or gelling behavior.
  • the dash-dotted line underneath is a UF retentate diaifiltered only with VCR3, which then shows an even lower tendency to gel.
  • the curve below shows that a VCR2 results in even less viscosity increase with temperature and the bottom curve is pea fruit water (long-dashed, double-dotted line) that was neither diafiltered nor concentrated. Almost no influence of the temperature treatment on the viscosity can be seen there and only a very small increase in viscosity is observed.
  • the viscosity profiles were recorded as follows: A 15%ds solution of the product in demineralized water was prepared. In the Anton Paar Physica MCR 301 (standard use, stirrer ST24-2D, 60 rpm), 35 mL of the solution were mixed according to the temperature profile (start: 25 °C, heating 6.5 °C/min, hold at 90 °C for 12 min , cooling at 4.3 °C/min, hold 10 min at 25 °C.
  • the water-soluble legume proteins according to the invention can be used as protein separation starting products and/or animal feed, in foods for protein supplementation, as emulsifiers, film formers, foam stabilizers, adhesives and adhesives. Upper starting materials, gelling agents, flocculants, fining agents are used.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the process steps for obtaining a water-soluble legume protein mixture according to example 1A;
  • FIG. 2 shows an SDS PAGE gel of the water-soluble pea protein according to Example 1A according to the invention and commercially available pea proteins;
  • Figure 3 shows an SDS PAGE gel of mung bean fruit water
  • FIG. 5 shows an SDS PAGE gel of various materials which are obtained during the ultrafiltration of broad bean and mung bean fruit water, including protein isolates and concentrates;
  • FIG. 1 This embodiment of a manufacturing method is shown schematically in FIG.
  • the supernatant adjusted in this way is now contacted with CaCh to precipitate phytate and with adsorber resin to separate off aldehydes, and the insoluble matter is centrifuged off.
  • the supernatant from the centrifuge ie the remaining aqueous protein solution, is now separated into an aqueous protein solution as retentate and a salt/amino acid/sugar solution as permeate using an ultrafiltration system - here with a cut-off of 40 kDa.
  • the ultrafiltration retentate is now diafiltered/washed with tap water/demineralized water adjusted to a pH value of 7.5-8.0 until a conductivity of the permeate of at most 30% of the permeate from the ultrafiltration is reached.
  • a typical conductivity range is between 1 - 3 mS/cm. This washes out salts, sugars, glycoproteins and amino acids as well as part of the small proteins with a MW ⁇ 40 kDa and improves the protein content and the purity, ie the absence of other molecules. This ultrafiltration reten- tat protein solution is spray-dried to give a light-colored protein powder that is completely soluble in water.
  • peas were shelled, chopped up and slurried in water. The suspension is subjected to gravity separation (centrifugation) and the supernatant used as protein-rich amniotic fluid for protein recovery.
  • the proteinaceous solution is again centrifuged to remove fine particulate matter from the solution.
  • the cleaned protein-containing solution is adjusted to a pH of 7.0 to 8.0 and then ultrafiltered and diafiltered with demineralized water to an electrical conductivity of 1.5 to 3.0 mS/cm.
  • the protein according to the invention is obtained from the ultrafiltration retentate, while salts, sugars and amino acids remain in the ultrafiltration permeate.
  • the UF retentate is sterilized using HTS and then spray-dried.
  • the pea protein according to the invention forms gels (heat- or acid-induced) and has a strong emulsifying effect (see also FIG. 11). With a solubility of 94.7%, this is not a clear solution, but a completely dissolved cloudy solution.
  • FIG. 2 SDS-PAGE gels of pea proteins according to the invention are compared with commercially available pea proteins. It can be clearly seen that the pea protein according to the invention (lanes 2 and 3) from various comminuted peas has proteins with a MW between about 6 kDa and about 120 kDa.
  • the commercially available pea protein Pisane C9 (Cosucra) (lane 4) contains proteins of higher molecular weight; at Nurtralys S 85XF (track 5), Nutralys S 85 F (track 6) (Roquette), clear protein spectrum shifts in the direction of higher molecular weights or lower molecular weights can be seen.
  • the lane 9 pea protein produced by EMSLAND starch obtained according to German patent DE102006050619 B1 by means of isoelectric precipitation and temperature increase, shows proteins of medium and high molecular weight - a clear shift in the molecular weight ratios of the various pea proteins is visible.
  • SDS-PAGE gels are not a quantitative analysis and only statements about qualitative properties are possible, the data are relative.
  • Proteins with a MW > 120 kDa tend to precipitate out of the aqueous solution and have less pronounced emulsifying power and are therefore less suitable for many applications.
  • the pea protein solution according to Example 1 - i.e. the ultrafiltered retentate from the ultrafiltration and diafiltered with water - was separated in a denaturing SDS gel chromatography. It can be clearly seen that in the protein mixture according to the invention there are no bands for proteins with a molecular weight ⁇ 10 kDa and the proteins with a molecular weight above 150 kDa are also missing.
  • the pea proteins according to the invention have a molecular weight of 150 kDa to about 14 kDa and have proteins of a wide variety of molecular weights with a focus around 14, 40 and 97 kDa.
  • the comparison product Pisane C9 still contains many proteins with a molecular weight >116 kDa, which interfere with the solubility in water.
  • the Nutralys S 85 products also show these large proteins.
  • the Nutralys S85 Plus products have a molecular weight between 30 and about 3 kDa; Proteins of larger molecular weights are evidently only sparsely present.
  • the protein spectrum of the product according to DE102006050619A1 in turn has a higher proportion of proteins with a higher molecular weight.
  • FIG. 6 a thermally little stressed pea protein separation is examined.
  • the filtrate of the pea slurry was subjected to SDS-PAGE analysis.
  • Lanes 2 and 3 show the filtrate, lane 4 the retentate on the UF membrane, not diafiltered, lane 5 the diafiltered retentate, lanes 6 and 7 the thermally untreated product F-1140 produced according to the invention.
  • proteins with a MW >30 kDa only occur in the smallest amounts, while the proteins with a MW ⁇ 40 kDa are predominantly found.
  • 1 kg of dried mung beans are crushed and mixed with 3 kg of water to prepare a mung bean slurry.
  • the pH of the slurry is then adjusted to pH 6.8-7.2 with NaOH.
  • the mung bean slurry is sieved to remove shell residue and then the starch and fibers are removed in a centrifuge system. The supernatant from the centrifugation is again subjected to pH adjustment to between pH 7.5 and 8.2.
  • the supernatant adjusted in this way is treated with CaCCh to precipitate phytate and with adsorber resin, and the precipitated solid is separated off by centrifugation.
  • the remaining aqueous protein solution is now separated in an ultrafiltration system - here with a cut-off of 15 kDa - into a protein concentrate as retentate and a salt/amino acid/sugar solution with some smaller proteins (MW ⁇ 15 kDa).
  • This ultrafiltration retentate solution is now spray-dried to give a light-colored protein powder that is completely soluble in water.
  • FIG. 4 which is a comparison between mung bean proteins produced according to the invention (lane 2), field bean proteins (lane 3), and low molecular weight pea protein, produced according to DE202021102596.4 with thermal precipitation in lane 6 and in lane 9 a pea protein after isoelectric Precipitation according to DE102006050619B1 shows, it is obvious that proteins of specific molecular size ranges are obtained by precipitation or ultrafiltration, which, depending on their properties, can be used commercially.
  • mung bean proteins preparable according to Example 2B
  • field bean proteins preparable according to Example 4B
  • Pea proteins have a relatively lower amount of these proteins compared to proteins with a retention time of 15-25 min.
  • Example 2 B Preparation of Highly Water Soluble Mung Bean Protein
  • dried mung beans were dehulled, chopped up and slurried in water.
  • the suspension is subjected to gravity separation (centrifugation) and the supernatant used as protein-rich amniotic fluid for protein recovery.
  • the proteinaceous solution is adjusted to pH 7.0-8.0 and recentrifuged to remove fine particulate matter from the solution.
  • the cleaned protein-containing solution is ultrafiltered and diafiltered with demineralized water to an electrical conductivity of 1.5 to 3.0 mS/cm.
  • the protein according to the invention is obtained in the ultrafiltration retentate, while salts, sugars and amino acids remain in the ultrafiltration permeate.
  • the mung bean protein according to the invention forms gels (heat- or acid-induced) and has a strong emulsifying effect.
  • the supernatant adjusted in this way is contacted with CaCh to precipitate phytate and with aldehyde adsorber resin, and the precipitated solid is separated off by centrifugation.
  • the remaining aqueous protein solution is now separated into a protein solution as retentate and a salt/amino acid/sugar solution using an ultrafiltration system - here with a cut-off of 70 kDa.
  • the ultrafiltration retentate is water with a pH of 7 until the conductivity of the permeate is about 20% of the conductivity of the protein solution used in the ultrafiltration.
  • This ultrafiltration retentate is now treated with activated charcoal to adsorb dyes and off-flavors and then lyophilized to a light-colored protein powder that is completely soluble in water.
  • Example 4 A Production of fava bean protein
  • 1 kg of dried field beans is crushed and mixed with 3 kg of water to prepare a field bean slurry.
  • the pH of the slurry is then adjusted to pH 6.8-7.2 with NaOH.
  • the broad bean slurry is screened to remove shell residue and then the starch and fibers are removed in a centrifuge system.
  • the supernatant from the centrifugation is again subjected to pH adjustment to between pH 6.8 and 8.3.
  • the supernatant adjusted in this way is contacted with CaCh to precipitate phytate and with adsorber resin, and the precipitated solid is separated off by centrifugation.
  • the remaining aqueous protein solution is now separated into a protein concentrate as retentate and a salt/amino acid/sugar solution using an ultrafiltration system, here with a cut-off of 15 kDa.
  • the ultrafiltration retentate is washed with fresh water adjusted to pH 7.8 with NH4OH until a conductivity of less than 2 mS/cm is achieved.
  • This ultrafiltration retentate solution is now spray-dried to a light-colored protein powder that is completely soluble in water
  • Example 4B Preparation of highly water soluble faba bean protein
  • the proteinaceous solution is again centrifuged to remove fine particulate matter from the solution.
  • the cleaned protein-containing solution is adjusted to a pH of 7.0 to 8.0 and then ultrafiltered and diafiltered with demineralized water to an electrical conductivity of 1.5 to 3.0 mS/cm.
  • the protein according to the invention is obtained in the ultrafiltration retentate, while salts, sugars and amino acids remain in the ultrafiltration permeate.
  • the ultrafiltration retentate obtained by subsequent spray drying of the UF retentate showed:
  • the field bean protein according to the invention forms gels (heat- or acid-induced) and has a strong emulsifying effect.
  • FIG. 1 A HPLC analysis of field bean products occurring in the preparation of the protein mixture of the present invention is shown in FIG.
  • the filtered and centrifuged amniotic fluid can be clearly seen (dotted line).
  • the solid line is shown as the permeate of the UF, in which the ratio of the peaks between 10 - 15 min retention time and 15 - 25 min shifts drastically in the direction of the proteins with the longer retention times - those with shorter retention times are no longer detectable.
  • the field bean isolate - dashed line - on the other hand mainly shows the proteins with the molecular weight corresponding to 10 - 15 min retention time, which were already predominantly present in the filtrate.
  • the HPLC thus shows the successful separation of proteins with retention times >18 min using UF.
  • FIG. 7 shows an HPLC of mung bean protein isolate (dashed line, producible according to Example 2B), field bean isolate (continuous line, producible according to Example 4B) and pea protein according to the invention (dotted line). All proteins were analyzed using a 100 kDa UF membrane according to the method of the invention manufactured. It can be clearly seen that the mung bean and field bean isolate have a lot of protein with a molecular weight of about 10 - 15 min retention time, while pea protein UF retentate also has proteins with a retention time of 15 - 20 min.
  • FIG. 9 An HPLC diagram for mung bean protein is shown in FIG. 9, similar to that in FIG (short-dashed line) essentially only has proteins with a retention time of 18-27 min.
  • the HPLC diagram of the centrifuged mung bean fruit water (long dashed line) still contains clear bands from 18-27 min, while the peak at 10-15 min is smaller in relation to the other peaks.
  • the permeate (short-dashed line) mainly contains proteins in the molecular weight range of 20-30 minutes, which have been almost completely separated in the protein according to the invention.
  • FIG. 8 shows an HPLC diagram for field bean protein, similar to that of FIG. 10. There, too, there is a clear shift in the peak intensity of the field bean filtrate (dotted line) towards 10-15 min in the retentate (dash-dotted line). , while the permeate (solid line) essentially only has proteins with a retention time of 18-27 min.
  • FIG. 7 enables a comparison of the HPLC diagrams of peas (dotted line), broad bean (solid line) and mung bean protein isolates (dashed line) according to the invention. It can be seen that all of these legumes have similar protein peaks, with peas appearing to have relatively less protein peaking between 10-15 min per protein 17-25 min than broad beans or mung beans. In Fig. 11 experiments on the gelation behavior are shown.
  • the legume proteins according to the invention form gels which can be activated thermally, but also via the pH value, and which are elastic for a long time.
  • the properties of the gels were analyzed by means of texture analysis with the TA XT plus Texture Analyzer using the stamp (SMS P 05) (distance: 20 mm, forward, test and reverse speed: 1.0 mm/sec; release force: 20 g) examined at room temperature.
  • a differential scanning calorimetry analysis (DSC) (Fig. 12) showed, as is already known from SDS gels, that thermal treatment (HTST) no changed.
  • the DSC measurements were performed to investigate the thermal properties of the protein, which allows conclusions to be drawn about the denaturation state of the protein. Dry or liquid samples are heated and their heat absorption is measured over the temperature range under investigation.
  • the measurement was carried out on a DSC+ StaF system from Mettler Toledo® under a nitrogen atmosphere. A temperature range of 25 - 105 °C with a heating rate of 10 °C/min was examined. It can be seen in FIG. 12 that the pea protein according to the invention absorbs heat from a temperature of approx. 84° C., which corresponds to the start of denaturation (T onS et ). Heat absorption ends at around 98 °C, resulting in a denaturation peak temperature (TdPeak) of around 91 °C. This shows that the pea protein according to the invention has not previously been heat-treated and therefore still contains native proteins.
  • Emsland starch pea protein Empro E 86 HV coagulation by means of pH value adjustment and heat, as well as pasteurization
  • a higher denaturation temperature is usually due to larger and more complex proteins.
  • pea protein according to the invention By using the pea protein according to the invention, a gluten-free and protein-enriched pasta could be produced. Further advantages of using the pea protein according to the invention are a lighter color than the potato protein Empro K, which resulted in a darker color and a more pleasant, less bitter taste than the potato protein Empro K and the pea protein Empro E 86 HV (a denatured, temperature-treated pea protein from EMSLAND ST ⁇ RKE). By using different proteins in combination, you can achieve different textures/consistencies.
  • a vegan ice cream could be produced that had a creamy mouthfeel and a pleasant, slightly nutty taste.
  • the ice cream produced in this way is protein-enriched.
  • Example 8 vegan burgers
  • the shaped burger patties can be fried directly or frozen first and prepared at a later time.
  • the functionality of the protein according to the invention is retained even after the freeze-frying process.
  • the protein according to the invention contributes here to improving the product binding and firmness of the patty.
  • a plant-based sausage could be produced with the aid of the pea protein according to the invention.
  • the protein according to the invention By using the protein according to the invention, a greater protein concentration can be achieved than with other pea proteins, since it has a lower viscosity and there are advantages in terms of processability.

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Abstract

Die Erfindung betrifft grosstechnisch herstellbare wasserlösliche Leguminosenproteine, erhältlichr durch: Zerkleinerung von Leguminosensamen, ggf. Entfetten der zerkleinerten Leguminosensamen; Mischen der zerkleinerten Leguminosensamen mit Wasser unter Herstellung einer Leguminosenaufschlämmung; Einstellen des pH-Werts der Leguminosenaufschlämmung auf einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,5, bevorzugt zwischen 7,0 und 7,4; Separieren von Stärke und Fasern durch Zentrifugation oder Filtration unter Herstellung einer wässrigen Proteinlösung als Überstand; Einstellung des pH-Wertes der separierten Proteinlösung auf einen pH-Wert zwischen 7,2 und 8, Ultrafiltration der pH-eingestellten Proteinlösung; Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats mit Wasser, eines pH- Werts von 7,5 - 8,2 zu einer Leitfähigkeit des Diafiltrats von höchstens 30% der Leitfähigkeit des Permeats ohne Diafiltration, d.h. auf eine Leitfähigkeit von 1-3 mS/cm; Gewinnung des diafiltrierten Ultrafiltrationproteinretentats; und Trocknen, Kühlen oder Frieren des Ultrafiltrationsretentats sowie Verfahren zu seiner Herstellung

Description

Wasserlösliches Leguminosenprotein
1. Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf wasserlösliches Leguminosenprotein und Verfahren zu seiner Herstellung.
2. Hintergrund der Erfindung
Unter Leguminosenprotein werden im Zusammenhang mit dieser Anmeldung Proteingemische verstanden, die aus Leguminosenfruchtwasser gewonnen werden.
Leguminosenfruchtwasser ist die trübe wässrige Lösung, die bei Aufschlämmung von zerkleinerten Leguminosensamen mit Wasser nach mechanischem Abtrennen der Schwebstoffe und wasserunlöslichen Materialien in Lösung bleibt.
Für Leguminosenproteine bestehen verschiedenste Herstellungsverfahren, wie sie von Joyce in Food Res. Int. 2010, 43, 414 - 431 , Pulse proteins: Processing, characterization, functional properties and applications in food and feed, doi: 10.1016/j.foodres.2009.09.003 oder von Barac et. al. in Int. J. Mol. Sei. 2010, 11, 4973-4990, doi: 10.3390/ijms11124973 oder von Taherian in Food Res. Int. 2011 , 44, 2505 - 2514, Comparative study of functional properties erläutert wurden. Diese Herstellungs- und Extraktionsverfahren beeinflussen die für den Protein-Einsatz wichtigen Parameter: Löslichkeit, Emulgierfähigkeit, Schaumbildungsverhalten, Filmbildungsverhalten, Mundgefühl, Geschmack etc. grundlegend. M. C. Tulbek, R.
S. H Lam, et. al. haben in „Sustainable Protein Sources“ 2017, Kapitel 9, Seiten 145 - 164, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802778-3.00009-3 , beschrieben, dass hochfunktionelle Proteine als Emulgatoren, Schaumbildner, Gelbildner und Filmbildner gesucht sind. Auch von A. Singhai, A. C. Karaca, R. Tyler und M. Nickerson wurde 2015 eine gute Zusammenfassung der Körnerleguminosenproteine in „Grain Legumes“, Kapitel 3: „Pulse Proteins: From Processing to Structure-Function Relationships“, doi: 10.5772/61382 veröffentlicht.
ERSATZBLATT (REGEL 26) Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Erbsen (pisum sativum), Bohnen und Linsen erläutert - das Verfahren eignet sich aber genauso für andere Körnerleguminosensamen, z. B. die
Phaseolus-Arten (Phaseolus ssp.):
• Limabohne, Mondbohne (Phaseolus lunatus L.), engl. lima/butter bean, port, feijäo-de-lima
• Teparybohne (Phaseolus acutifolius A. Gray), engl. trepary bean
• Feuerbohne, Schminkbohne (Phaseolus coccineus L.), engl. scarlet runner bean, span, ayocote, port, feijäo-da-espanha/feijoca
• Gartenbohne (Phaseolus vulgaris L.): Gartenbohne engl. common bean, span, frijol, port, feijäo
• Sojabohne (Glycine max'), engl. soybean, span, soja, port, soja
• Straucherbse (Cajanus cajan), engl. pigeon pea, span, guandul, port, guandu
• Kichererbse (Cicer arietinum), engl. chickpea, span. Garbanzo, port, gräode- bico
• Linse (Lens culinaris), engl. lentil, span. Lenteja, port, lentilha
• Ackerbohne (Vicia faba), engl. field bean, span. Faba, port, fava
Vigna-Arten (Vigna ssp.)
• Augenbohne, (Vigna unguiculata), engl. cow pea, port, feijäo-fradinho
• Adzukibohne, (Vigna angularis), engl. azuki bean
• Mungbohne, (Vigna mungo), engl. mung bean
Lupinen-Arten (Lupinus ssp.)
• Weiße Lupine (Lupinus albus)
• Anden-Lupine (Lupinus mutabilis)
• Gelbe Lupine (Lupinus luteus)
• Blaue Lupine (Lupinus angustifolius)
• Vielblättrige Lupine (Lupinus polyphyllus)
Arten mit nur lokaler Bedeutung sind die neuweltliche Jackbohne (Canavalia ensifor- mis L.) und die altweltliche Schwertbohne (Canavalia gladiata) in einigen tropischen Ländern. Helmbohnen (Lablab purpureus) werden in Afrika, Indien und einigen Län- dern Südostasiens angebaut. Die Platterbse (Lathyrus sativus) ist vorwiegend in Indien von Bedeutung, da sie als sehr trockentolerant gilt. Erdbohnen (Macrotolyma geocarpum) kommen endemisch nur in Westafrika vor und reifen ähnlich wie Erdnüsse im Bodensubstrat. Weitere Pflanzen sind die Pferdebohne (Macrotolyma uniflo- rum), Yambohne (Pachyrhizus erosus), Goa- oder Flügelbohne (Psophocarpus tetra- gonobolus) und die Knollenbohne oder auch African Yam Bean (Sphenostylis steno- carpa).
Unter Leguminosensamen werden hier Körnerleguminosen, wie Erbsen, Kichererbsen, Linsen, Bohnen - wie Feldbohnen, Mungbohnen, Sojabohnen sowie Lupinensamen u. dgl. verstanden.
Die Früchte aller Körnerleguminosen zeichnen sich durch einen hohen Eiweißgehalt aus. Dieses Eiweiß ist für die verschiedensten Anwendungen interessant. Meist ist erwünscht, dass das Eiweiß sich möglichst wie tierisches Eiweiß verhält - d.h. es soll dieses in Rezepten ersetzen - bevorzugt ist es aufschlagbar, wirkt emulgierend, ist film- und gelbildend. Durch diese Eigenschaften kann es somit tierisches Eiweiß ersetzen als Bindemittel (bspw. in Fleischwaren), Schaumbildner bei Backvorgängen und bei Milchimitaten, die durch Zusatz von Leguminoseneiweiß aufschlagbar werden (z.B. wie aufschäumbare Milch oder vegetabiler Sahneersatz). Aber auch in der Kosmetik und Technik sind Leguminosen-Proteine gefragt. Ferner werden sie als Kleber und Kleberausgangsstoffe, bspw. in Photoresisten oder für Leimersatzmaterialien, Flotationshilfen, Emulgatoren eingesetzt.
Bisher scheiterte der Einsatz vieler Leguminosenproteine daran, dass sie noch Nebenprodukte umfassen - wie Flavonoide, Aldehyde, Ketone und Alkohole, was sowohl zu Geschmacks-, als auch zu Löslichkeitsproblemen führt. Dadurch sind die Ausbeute und der Reinheitsgrad des mit technischen Verfahren erhältlichen löslichen Eiweisses verbesserungsfähig und die Qualität bisheriger aus Leguminosensamen gewonnener Proteine entsprach häufig nicht den Anforderungen der Lebensmittelindustrie in Hinblick auf Filmbildung, Emulgierfähigkeit, Aufschlagbarkeit, Geldbildungsvermögen. Ein weiteres Problem ist, dass manche Leguminosensamen einen recht hohen Fettgehalt aufweisen, der u.a. die Löslichkeit der Proteine beeinflusst. Daher werden bei diesen Leguminosensamen Entfettungsverfahren eingesetzt- wie von Soja bekannt. Das Entfetten von Leguminosensamen mit verschiedenen Lösemitteln ist dem Fachmann geläufig. Da besonders Proteine mit hoher Funktionalität gewünscht sind - d.h. solche, die wenig oder nicht denaturiert sind und somit eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen, wurde versucht, industrielle Verfahren zu finden, dies zu erreichen. Leider gelang es bisher nicht im industriellem Maßstab Leguminosenproteine in vollständig wasserlöslicher Form in hoher Ausbeute durch ein industriell einsetzbares einfaches Verfahren zu gewinnen.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, vollständig wasserlösliche Leguminosenproteine in industriellem Maßstab mit hoher Funktionalität in hoher Ausbeute zu gewinnen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch wasserlösliche Leguminosenproteine mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren nach Anspruch 10. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Leguminosenproteine sind herstellbar durch:
Zerkleinerung von geschälten Leguminosensamen, ggf. Entfetten der zerkleinerten Leguminosensamen; Mischen der so zerkleinerten und ggf. entfetteten Leguminosensamen mit Wasser unter Einstellen des pH-Werts der Leguminosenaufschlämmung auf einen pH Wert zwischen 6,8 und 7,5 zu einer Leguminosenaufschlämmung;
Separieren der Aufschlämmung in Feststoffe und eine wässrige Proteinlösung, die wasserlösliche Proteine aufweist, durch Zentrifugalkräfte oder Filtration - (dem Fachmann auf dem Gebiet der Stärkegewinnung aus Naturprodukten bekannte Methoden), wobei Filtern auch Gelfiltration und/oder Zentrifugalkrafttrennung umfasst,
Einstellung des pH-Wertes des Filtrats oder Zentrifugenüberstandes auf einen pH- Wert zwischen 7,2 und 8,5, bevorzugt 7,5 bis 8,3
Ultrafiltration der so separierten Proteinlösung;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats mit auf pH-Wert von 7,5 - 8,2 eingestelltem Wasser, ausgewählt aus Frischwasser und demineralisiertem Wasser bis das Diafilt- rat eine Leitfähigkeit aufweist, die weniger als 30% des Permeats ohne Diafiltration beträgt. Hier wird - je nach Ausgangsmaterial - eine Leitfähigkeit zwischen 1.0 und 3.0 mS/cm erreicht.
Gewinnung der diafiltrierten Ultrafiltrationsretentatlösung mit einem Feststoffgehalt von >90% Protein (nach Kjeldahl).
Durch Reinigungsschritte ohne thermische Belastung entsteht als Ultrafiltrationsreten- tat eine voll-lösliche, trübe Proteinlösung, welche glatte Filme ausbildet, gut schäumt, emulgiert und als solche oder zu getrocknetem Protein verarbeitet werden kann. Dieses Ultrafiltrationsretentat kann auch als wässrige Lösung eingesetzt oder weiterverarbeitet werden - bspw. durch fraktionierte thermische oder pH-Fällung in verschiedene Proteintypen zerlegt werden. Es kann anderen Lebensmitteln oder Kosmetik in gelöster Form zugesetzt werden, um diesen die erwünschten Eigenschaften zu verleihen. Wichtig für die Qualität ist insbesondere die Diafiltration mit pH-Wert- eingestelltem, demineralisiertem Wasser, die störende Ionen, Oligosac-charide, Zucker und Aminosäuren entfernt. Als geeignete Materialien zur pH-Wert-Einstellung des Diafiltrationswassers können übliche alkalische, für den Lebensmitteleinsatz zugelassene Materialien eingesetzt werden, so eignen sich bspw. NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH4OH, Mg(OH)2.
An die Herstellung des Ultrafiltrationretentats, dessen Feststoffe einen Proteingehalt von 90% und mehr aufweisen, kann sich ein Konservierungsschritt des Ultrafil- trationsretentats, ausgewählt aus: Trocknen, eingeschlossen Lyophilisieren und/oder Kühlen oder Einfrieren der Lösung bzw. Gefriertrocknen, anschließen. Das Ultrafiltrations-Permeat kann zur Gewinnung von Salzen, Zuckern und Oligoscchariden, Aminosäuren und kleinen Peptiden genutzt werden, wobei es dazu einer Umkehrosmose unterworfen werden kann, welche nur Salze und Ionen permeieren lässt und Kohlenhydrate und Aminosäuren zurückhält. Dies hat auch den Vorteil einer geringeren Abwasserbelastung.
Durch die schonende Behandlung der Proteine bei der Extraktion werden hochfunktionelle, vollständig wasserlösliche Proteine erhalten, die weiterer Verwendung zugeführt werden können. Dazu gehört eine weitere Auftrennung der Proteine oder Protein-Direktverarbeitung und -Vermarktung - z.B. in Getränken. Unter „hochfunktionell“ werden im Gebiet der Proteine solche mit hoher Wasserlöslichkeit und Wasserbindevermögen sowie guter Emulgationsfähigkeit verstanden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung zusätzliche Merkmale, die einzeln oder in verschiedenen Kombinationen je nach Eignung für eine bestimmte Anwendung eingeschlossen sein können.
Sie betrifft also wasserlösliche Leguminosenproteine, herstellbar durch: Zerkleinerung von geschälten Leguminosensamen, Mischen der zerkleinerten, ggf. entfetteten Leguminosensamen mit Wasser unter Herstellung einer Leguminosenaufschläm-mung; Einstellen des pH-Werts der Leguminosenaufschlämmung auf einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,5; Separieren der Leguminosenaufschlämmung durch Zentrifugalkraft oder Filter in Stärke und Fasern, bspw. durch Separatoren, Dekanter, Zentrifugen, Hydrozyklone, Filterzentrifugen oder Vakuumdrehfilter/Druckdrehfilter, Press- Filter, Filterpressen, Beutelfilter, Kerzenfilter, Schichtenfilter - wie dem Fachmann geläufig - und eine wässrige Proteinlösung; Einstellung des pH-Wertes der so separierten Proteinlösung auf einen pH-Wert zwischen 7,2 und 8,5; Ultrafiltration der pH- Wert-eingestellten Proteinlösung; Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats mit auf pH- Wert 7,5 - 8,2 eingestelltem Wasser, ausgewählt aus Frischwasser und demine- ralisiertem Wasser, Gewinnung des diafiltrierten Ultrafiltrationsretentats; und Trocknen oder Kühlen oder Gefrieren des Ultrafiltrationsretentats als wasserlösliche Leguminosenproteine in Lösung oder als Trockenmaterial.
Die gekühlte Proteinlösung kann als solche, aber auch bspw. zur weiteren Auftrennung in Proteine verschiedener Molekulargewichte verwendet werden. Aber auch eine Auftrennung durch fraktionierende isoelektrische Fällung ist möglich, da verschiedene Proteingruppen andere isoelektrische Punkte haben. Als Trockenprotein kann das Proteinpulver in Nahrungsmittel gemischt oder als solches in den Handel gebracht werden - dabei ist das Trocknungsverfahren wichtig für die Funktionalität des Proteins und sollte möglichst schonend erfolgen. Nass bzw. feucht kann das UF- Retentat viskosen Produkten wie Eiscreme oder TVPs zugesetzt werden, die halbfeucht aus der Kühltheke oder frisch verkauft werden.
Für viele Einsatzzwecke werden die wasserlöslichen Leguminoseproteine per Sprühtrocknen, Gefriertrocknen, Lyophilisierung in ein vollständig wasserlösliches und lagerfähiges Pulver umgewandelt. Es ist sinnvoll, die wässrige Ultrafiltrationsretentat-Proteinlösung zwecks Entfernung antinutritiver Bestandteile (Lektine, Protease-Inhibitoren, Phytate, Tannine, Saponine, Alkaloide, Aldehyde) und zur Geschmacksverbesserung mit Adsorptionsmitteln, wie Aktivkohle, Flavonoid-adsorbierenden Harzen, Silikaten und anderen geeigneten Adsorptionsmitteln, wie sie dem Fachmann bekannt sind, zu behandeln, insbesondere um Farbstoffe und bestimmte Flavonoide, unerwünschte antinutritive Stoffe, zu entfernen. Flüchtige, den Geschmack und Geruch negativ beeinflussende Bestandteile, wie Aldehyde, Alkohole, Ketone (siehe C. Murat, M.-H. Bard, C. Dhalleine, N. Cayot, J. Food Research 2013, 53, 31-41) können auch durch Vakuumextraktion, oder aber durch Adsorption an bekannten Adsorptionsmitteln entfernt oder zumindest verringert werden. In der Proteinlösung anwesendes Phytat kann bspw. durch Ausfällen mit zweiwertigen Ionen, meist Calcium- oder Magnesium-Kationen, nach der Stärke- /Faser-Abtrennung in an sich bekannter Weise gefällt und entfernt werden.
Die wasserlöslichen Leguminoseproteine, d.h. das diafiltrierte Ultrafi Itrationsretentat, kann zwecks Haltbarkeit auch einer HTST-Behandlung (Hochtemperatur-Kurzzeitbehandlung) oder einem anderen konservierenden Schritt unterworfen werden.
Der cut-off der Ultrafiltrations-Membran kann zwischen 1 und 100 kDa liegen, wobei ein für den Fachmann leicht zu ermittelnder Kompromiss zwischen Ausbeute und Trennschärfe durchgeführt wird. Die Auswaschung von Salzen, Zuckern, Aminosäuren, und anderen Bestandteilen ist von Vorteil für die Proteinfunktionalität, wie in Fig 13 als Diagramm der Viskositätsausbildung beim Erhitzen und Abkühlen von Proteinlösungen dargestellt. Die Proben sind nach ihrem Proteingehalt sortiert (oben links - Erbsenfruchtwasser mit geringem Proteingehalt, unten rechts - Retentat VCR3, 2BV (erfindungsgemäßes Protein) mit dem höchsten Proteingehalt). Die Abkürzung VCR (volume concentration factor) beschreibt dabei den Konzentrationsfaktor der Lösung und berechnet sich aus dem Quotienten von Volumen(Feed)/Volumen(Retentat). Bei einer Filtration mit einem Zulaufvolumen von 300 L und einem Retentat von 100 L würde sich demnach VCR = 3 ergeben. Die Abkürzung BV (batch volume) ist ein Maß die Wasserzugabe bei der Diafiltration zu erfassen. Das BV beschreibt das Volumen, welches zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Anlage zirkuliert. Die Bezeichnung wird bei der Diafiltration angegeben, um auszudrücken wie viel Wasser hinzugegeben worden ist. Angenommen man starte mit der Diafiltration mit einem Retentat-Volumen von 40 L zu diesem Zeitpunkt (1 BV = 40 L). Dann bedeutet die Angabe 2 BV Dia., dass zweimal 40 L Wasser im Batch zugegeben wurden. Dies sind Laborwerte, die das Verhalten des Retentats zeigen - im großtechnischen Prozess werden diese Informationen nur benötigt, um einen kontinuierlichen Prozess zu optimieren.
In Fig. 13 zeigen die dargestellten Kurven wie folgt: Die oberste, durchgezogene Kurve ist ein mit VCR3, 2BV gewaschenes Erbsenfruchtwasser UF-Retentat, bei dem man eine deutliche Zunahme der Viskosität im Temperaturbereich ab ca 70°C erkennt, die bei 90°C ein Plateau erreicht. Die darunterliegende, gepunktete Kurve ist das diafiltrierte UF-Retentat, das zwar auch mit VCR3 mit Wasser pH 7,5 diafiltriert wurde, aber nur mit 1 BV auf den Faktor 3 eingeengt wurde. Man erkennt, dass die Verdoppelung des Batch-Volumens (BV) zu einem deutlichen Viskositätsabfall über die Zeit bzw. der erzielbaren Aktivierungstemperatur führt Das kann bei Anwendungen, bei denen das Produkt gekocht oder höher erhitzt wird, wesentlich sein. Die Kurve darunter (langgestrichelte Linie) zeigt das Verhalten des UF-Retentats, das mit VCR 4,7 diafiltriert wurde - man sieht einen weiteren deutlichen Abfall des Viskositätsverhaltens bzw. Gelierungsverhaltens. Die darunterliegende strichpunktierte Linie ist ein nur mit VCR3 diaifiltriertes UF-Retentat, das dann eine noch geringere Gelierungstendenz zeigt. Die darunterliegende Kurve (kurzgestrichelte Linie) zeigt, dass ein VCR2 zu noch geringerem Viskositätsanstieg mit der Temperatur führt und die unterste Kurve ist Erbsenfruchtwasser (langgestrichelte, doppeltpunktierte Linie), das weder diafiltriert, noch konzentriert wurde. Dort ist fast kein Einfluss der Temperaturbehandlung auf die Viskosität zu erkennen und es wird nur ein sehr geringerer Viskositätszuwachs beobachtet.
Die Viskositätsprofile wurden dabei wie folgt aufgenommen: Es wurde eine 15%ds Lösung des Produkts in demineralisiertem Wasser hergestellt. Im Anton Paar Physica MCR 301 (Standard-Einsatz, Rührer ST24-2D, 60 U/min) wurden 35 mL der Lösung nach dem Temperaturprofil (Start: 25 °C, Heizen 6.5 °C/min, 12 min bei 90 °C halte, Kühlen mit 4.3 °C/min, 10 min halten bei 25 °C.
Alle Erbsenproteinmuster wurden mit Leitungswasser hergestellt. Das Verfahren wurde mit demineralisiertem Wasser nochmals verifiziert. Qualitativ konnten keine Unterschiede festgestellt werden.
Die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Leguminosenproteine können als Proteinseparationsausgangsprodukte und/oder Futtermittel, in Nahrungsmitteln zur Proteinergänzung, als Emulgatoren, Filmbildner, Schaumstabilisatoren, Kleber und Kle- berausgangsmaterialien, Gelbildner, Flockungsmittel, Schönungsmittel eingesetzt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung sowie von Beispielen, auf die sie keineswegs eingeschränkt ist, beschrieben. Darin zeigt:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Verfahrensschritte zum Erhalt einer wasserlöslichen Leguminosen-Proteinmischung nach Beispiel 1 A;
Fig. 2 ein SDS PAGE Gel des erfindungsgemäßen wasserlöslichen Erbsenproteins nach Beispiel 1 A und handelsüblicher Erbsenproteine;
Fig. 3 ein SDS PAGE Gel von Mungbohnenfruchtwasser;
Fig. 4 ein SDS PAGE Gel eines wasserlöslichen Proteins aus Ackerbohnenisolat, niedermolekulares Erbsenprotein und Erbsenproteinisolat nach DE 102006050619A1 ;
Fig. 5 ein SDS PAGE Gele verschiedener Materialien, die bei der Ultrafiltration von Ackerbohnen- und Mungbohnenfruchtwassser anfallen, inklusive Protein-Isolate und -Konzentrate;
Fig. 6 ein SDS-PAGE Gel wasserlöslicher Proteine aus Erbsenfruchtwasser;
Fig. 7 HPLC von erfindungsgemäßen Mungbohnen-, Ackerbohnen- und Erbsenproteinen;
Fig. 8 HPLC von Ackerbohnenproteinlösungen verschiedener Vorbehandlung;
Fig. 9 HPLC von Mungbohnenproteinen mit verschiedener Vorbehandlung;
Fig. 10 HPLC von Erbsenproteinen mit verschiedenen Vorbehandlungen;
Fig. 11 Texturmessungen an Erbsenproteinen mit oder ohne thermische Behandlung bei verschiedenen pH-Werten; Fig. 12 DSC-Diagramme für thermisch behandelte und thermisch unbehandelte Erbsenproteine. und
Fig. 13 Viskositätsmessungen unterschiedlich diafiltrierter erfindungsgemäßer Erb- senprotein-Ultrafiltrationsretentate
Nachfolgend wird die Erfindung anhand verschiedener Körnerleguminosen, insbesondere Mungbohnen-, Ackerbohnen- und Erbsenproteinen, näher erläutert:
Beispiel 1 : Herstellung von wasserlöslichem Erbsenprotein
Beispiel 1 A
Diese Ausführungsform eines Herstellungsverfahrens ist schematisch in Fig. 1 gezeigt.
1 kg getrocknete Erbsen werden zerkleinert und mit 2,5 kg Wasser unter Herstellung einer Erbsenaufschlämmung vermischt. Der pH-Wert der Aufschlämmung wird mit NaOH auf pH 6,8 - 7,2 eingestellt. Die so eingestellte Erbsenaufschlämmung wird zur Entfernung von Schalenresten gesiebt und dann über eine Zentrifugenanlage (Hydrozyklone) von Stärke und Fasern befreit. Der Überlauf/ Überstand der Zentrifugati- on/Hydrozyklontrennung wird wiederum einer pH-Wert-Einstellung auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 mit NaOH unterworfen.
Der so eingestellte Überstand wird nun mit CaCh zur Ausfällung von Phytat und mit Adsorberharz für die Abtrennung von Aldehyden kontaktiert und das Unlösliche abzentrifugiert. Der Zentrifugenüberstand, d.h. die verbleibende wässrige Proteinlösung, wird nun über eine Ultrafiltrationsanlage - hier mit einem cut-off von 40 kDa - in eine wässrige Proteinlösung als Retentat und eine Salz-/Aminosäure-/Zucker-Lösung als Permeat getrennt. Das Ultrafiltrationsretentat wird nun mit auf pH-Wert 7,5 - 8,0 eingestelltem Leitungswasser/demineralisietem Wasser diafiltriert/gewaschen, bis eine Leitfähigkeit des Permeats von höchstens 30% des Permeats der Ultrafiltration erreicht ist. Ein typischer Leitfähigkeitsbereich liegt zwischen 1 - 3 mS/cm. Dadurch werden Salze, Zucker, Glycoproteine und Aminosäuren sowie ein Teil der kleinen Proteine mit einem MG < 40 kDa ausgewaschen und der Proteingehalt und die Reinheit, d.h. Abwesenheit von anderen Molekülen, verbessert. Diese Ultrafiltrationsreten- tat-Proteinlösung wird sprühgetrocknet, sodass ein helles Proteinpulver, das vollständig in Wasser löslich ist, erhalten wird.
Beispiel 1 B:
Zur Herstellung von hochwasserlöslichem Erbsenprotein wurden getrocknete Palerbsen enthülst, zerkleinert und in Wasser aufgeschlämmt. Die Suspension wird einer Schwerkrafttrennung (Zentrifugation) unterworfen und der Überstand als proteinreiches Fruchtwasser für die Proteingewinnung weiterverwendet.
Die proteinhaltige Lösung wird abermals zentrifugiert, wobei feine Schwebstoffe aus der Lösung entfernt werden. Die gereinigte proteinhaltige Lösung wird auf einen pH- Wert von 7,0 bis 8,0 eingestellt und dann ultrafiltriert, sowie mit demineralisiertem Wasser bis zu einer elektrischen Leitfähigkeit von 1 ,5 bis 3,0 mS/cm diafiltriert. Das erfindungsgemäße Protein wird aus dem Ultrafiltrationsretentat gewonnen, während Salze, Zucker und Aminosäuren im Ultrafiltrationspermeat verbleiben. Dazu wird das UF-Retentat mittels HTS entkeimt und danach sprühgetrocknet. Eine Analyse des so hergestellten, hellen Proteinpulvers ergab:
Das erfindungsgemäße Erbsenprotein bildet Gele (hitze- oder säureinduziert) und wirkt stark emulgierend (siehe auch Fig. 11). Bei einer Löslichkeit von 94,7% handelt es sich hierbei zwar um keine klare Lösung, jedoch um eine vollständig gelöste trübe Lösung.
In Fig. 2 sind SDS-PAGE Gele erfindungsgemäßer Erbsenproteine handelsüblichen Erbsenproteinen gegenüber gestellt. Deutlich erkennt man, dass das erfindungsgemäße Erbsenprotein (Spuren 2 und 3) aus verschiedenen zerkleinerten Erbsen Proteine mit einem MG zwischen etwa 6 kDa bis etwa 120 kDa aufweist. Bei dem auf dem Markt erhältlichen Erbsenprotein Pisane C9 (Cosucra) (Spur 4) sind Proteine höheren Molekulargewichts enthalten; bei Nurtralys S 85XF (Spur 5), Nutralys S 85 F (Spur 6) (Roquette) sind deutliche Proteinspektrums-Verschiebungen in Richtung höherer Molekulargewichte bzw. niedrigerer Molekulargewichte zu erkennen. Das von EMSLAND Stärke hergestellte Erbsenprotein der Spur 9, erhalten nach dem deutschen Patent DE102006050619 B1 mittels isoelektrischer Fällung und Temperaturerhöhung, zeigt Proteine mittleren und höheren Molekulargewichts - es ist eine deutliche Verschiebung der Molekulargewichtsverhältnisse der verschiedenen Erbsenproteine sichtbar. Da es sich bei SDS-PAGE-Gelen aber nicht um eine quantitative Analyse handelt, sondern nur Aussagen über qualitative Eigenschaften möglich sind, handelt es sich um relative Angaben.
Proteine eines MG > 120 kDa neigen zum Ausfallen aus der wässrigen Lösung und haben weniger ausgeprägtes Emulgiervermögen und sind daher für viele Anwendungen weniger geeignet. Die Erbsenproteinlösung nach Beispiel 1 - d.h. das ultrafiltrierte und mit Wasser diafi Itrierte Retentat der Ultrafiltration - wurde in einer denaturierenden SDS-Gel-Chromatographie aufgetrennt. Deutlich erkennt man, dass beim erfindungsgemäßen Proteingemisch keine Banden für Eiweiße mit einem Molekulargewicht <10 kDa auftreten und auch die Proteine mit einem Molekulargewicht oberhalb von 150 kDa fehlen. Die erfindungsgemäßen Erbsenproteine haben ein Molekulargewicht von 150 kDa bis etwa 14 kDa und haben Proteine verschiedenster Molekulargewichte mit Schwerpunkten um 14, 40 und 97 kDa. Beim Vergleichsprodukt Pisa- ne C9 sind dagegen noch viele Proteine mit einem Molekulargewicht >116 kDa enthalten, welche die Löslichkeit in Wasser stören. Auch die Nutralys S 85 Produkte zeigen diese großen Proteine. Dagegen besitzen die Nutralys S85 Plus Produkte ein Molekulargewicht zwischen 30 und etwa 3 kDa; Proteine größerer Molekulargewichte sind offensichtlich nur wenig vorhanden.
Das Proteinspektrum des Produkts nach dem DE102006050619A1 wiederum weist einen höheren Anteil an Proteinen höheren Molekulargewichts auf.
Es wird davon ausgegangen, dass die Proteine mit einem Molekulargewicht >120 kDa nur unvollständig in Wasser löslich sind, dies trifft auch auf Pisane und Nutralys S85 zu. Nutralys S85 wiederum lässt darauf schliessen, dass dort Erbsenproteine mit einem Molekulargewicht von >30 kDa zu Lasten der Proteinausbeute fehlen - d.h. es handelt sich um eine andere Fraktion von Erbsenproteinen. Somit ist festzustellen, dass das erfindungsgemäße wasserlösliche Proteingemisch ein ande- res, neues Proteinspektrum aufweist, als die auf dem Markt erhältlichen Produkte - was auf das erfindungsgemäße schonende Isolationsverfahren zurückzuführen ist.
Ein Geschmackstest hinterließ beim erfindungsgemäßen Eiweiß einen neutralen, gelartigen Geschmack bzw. Mundgefühl.
In Fig. 6 wird eine thermisch wenig belastete Erbsenproteinauftrennung untersucht. Dazu wurde das Filtrat der Erbsenaufschlämmung einer SDS-PAGE-Analyse unterworfen. In Spur 2 und 3 ist das Filtrat gezeigt, in Spur 4 das Retentat auf der UF- Membran, nicht diafiltriert, in Spur 5 das diafiltrierte Retentat, in den Spuren 6 und 7 das hergestellte erfindungsgemäße, thermisch unbehandelte Produkt F-1140. Deutlich erkennt man, dass im Permeat der 100 kDa Membran (Spur 8) Proteine mit einem MG >30 kDa nur noch in geringsten Mengen vorkommen, während die Proteine mit einem MG <40 kDa überwiegend gefunden werden. Auch hier zeigt sich, dass die thermische Behandlung des Permeats (Sprühtrocknung) zu aggregierten oder koagulierten Proteinen höherer Molekulargewichte führt (Spur 9), während das nicht thermisch behandelte Permeat in Spur 8 (hohe Verdünnung) derartige Proteine kaum aufweist. Es ist zu beachten, dass die Nachweisgrenzen bei SDS-PAGE bei ca 1g/l liegen und die Verdünnung der Probe zu einem Gel, dessen Banden nur knapp über der Nachweisgrenze sind, führt.
Die Analysebedingungen der Figur 6 lassen sich aus der nachfolgenden Tabelle entnehmen
Beispiel 2A: Herstellung von Mungbohnenprotein
1 kg getrocknete Mungbohnen werden zerkleinert und mit 3 kg Wasser unter Herstellung einer Mungbohnenaufschlämmung vermischt. Der pH-Wert der Aufschlämmung wird sodann mit NaOH auf pH 6,8 - 7, 2 eingestellt. Die Mungbohnenaufschläm- mung wird zur Entfernung von Schalenresten gesiebt und dann über eine Zentrifugenanlage von Stärke und Fasern befreit. Der Überstand der Zentrifugation wird wiederum einer pH-Wert-Einstellung auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,2 unterworfen.
Der so eingestellte Überstand wird mit CaCCh zur Ausfällung von Phytat und mit Adsorberharz behandelt und der ausgefällte Feststoff mittels Zentrifugation abgetrennt. Die verbleibende wässrige Proteinlösung wird nun über eine Ultrafiltrationsanlage - hier mit einem cut-off von 15 kDa - in ein Proteinkonzentrat als Retentat und eine Salz-/Aminosäure-/Zucker-Lösung mit einigen kleineren Proteinen (MG <15 kDa) getrennt. Das Ultrafiltrationsretentat wird mit demineralisiertem Wasser mit pH=8 gewaschen, bis eine Leitfähigkeit von unter 2 mS/cm erzielt wird. Diese Ultrafiltrationsre- tentat-Lösung wird nun sprühgetrocknet zu einem hellen Proteinpulver, das vollständig in Wasser löslich ist.
Ein SDS-PAGE-Gel der so erhaltenen Proteinmischung ist in Fig. 5 Spuren 8 und 9 gezeigt. Demzufolge haben die meisten wasserlöslichen Proteine ein Molekulargewicht zwischen 40 kDa und 55 kDa, während Proteine anderer Molekulargewichte weniger häufig auftreten.
Auch aus Fig. 4, die einen Vergleich zwischen erfindungsgemäß hergestellten Mung- bohnenproteinen (Spur 2), Ackerbohnenproteinen (Spur 3), sowie niedermolekularen Erbsenprotein, hergestellt nach dem DE202021102596.4 mit thermischer Fällung in Spur 6 und in Spur 9 ein Erbsenprotein nach isoelektrischer Fällung gemäß der DE102006050619B1 zeigt, ist offensichtlich, dass durch Fällung oder Ultrafiltration Proteine spezifischer Molekulargrößenbereiche erhalten werden, die je nach ihren Eigenschaften kommerziell nutzbar sind. Die HPLC von Mungbohnenproteinen und Erbsenproteinen sowie Ackerbohnenproteinen in Fig. 6 zeigt ebenfalls dieses Verhalten: Mungbohnenproteine (herstellbar nach Beispiel 2B) und Ackerbohnenproteine (herstellbar nach Beispiel 4B) haben größere Mengen an Proteinen im Bereich 10 - 15 min Retentionszeit, während erfindungsgemäß über Membran isolierte Erbsenproteine eine im Verhältnis geringere Menge dieser Proteine im Vergleich zu Proteinen mit einer Retentionszeit von 15 - 25 min aufweisen.
Beispiel 2 B: Herstellung von hochwasserlöslichem Mungbohnenprotein Zur Herstellung von hochwasserlöslichem Mungbohnenprotein wurden getrocknete Mungbohnen enthülst, zerkleinert und in Wasser aufgeschlämmt. Die Suspension wird einer Schwerkrafttrennung (Zentrifugation) unterworfen und der Überstand als proteinreiches Fruchtwasser für die Proteingewinnung weiterverwendet.
Die proteinhaltige Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,0 bis 8,0 eingestellt und abermals zentrifugiert, wobei feine Schwebstoffe aus der Lösung entfernt werden. Die gereinigte proteinhaltige Lösung wird ultrafiltriert, sowie mit demineralisiertem Wasser bis zu einer elektrischen Leitfähigkeit von 1,5 bis 3,0 mS/cm diafiltriert. Das erfindungsgemäße Protein wird im Ultrafiltrationsretentat gewonnen, während Salze, Zucker und Aminosäuren im Ultrafiltrationspermeat verbleiben.
Das Ultrafiltrationsretentat mit anschließender Sprühtrocknung wies auf:
Das erfindungsgemäße Mungbohnenprotein bildet Gele (hitze- oder säureinduziert) und wirkt stark emulgierend.
Beispiel 3: Herstellung von Linsenprotein
1 kg getrocknete, zerkleinerte und entfettete Linsen werden mit 2,6 kg Wasser unter Herstellung einer Linsenaufschlämmung vermischt. Der pH-Wert der Aufschlämmung wird sodann mit NaOH auf pH 6,8 - 7,2 eingestellt. Die Linsenaufschlämmung wird zur Entfernung von Schalenresten gesiebt und dann über eine Zentrifugenanlage von Stärke und Fasern befreit. Der Überstand der Zentrifugation wird wiederum einer pH- Wert-Einstellung mit KOH auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,2 unterworfen.
Der so eingestellte Überstand wird mit CaCh zur Ausfällung von Phytat und mit Aldehyd-Adsorberharz kontaktiert und der gefällte Feststoff mittels Zentrifugation abgetrennt. Die verbleibende wässrige Proteinlösung wird nun über eine Ultrafiltrationsanlage - hier mit einem cut-off von 70 kDa - in eine Proteinlösung als Retentat und eine Salz-/Aminosäure/Zucker-Lösung getrennt. Das Ultrafiltrationsretentat wird mit Lei- tungswasser eines pH 7 diafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Permeats etwa 20% der Leitfähigkeit der in der Ultrafiltration eingesetzten Proteinlösung beträgt. Dieses Ultra- filtrationsretentat wird nun mit Aktivkohle zwecks Adsorption von Farbstoffen und off- Flavors behandelt und dann zu einem hellen Proteinpulver, das vollständig in Wasser löslich ist, lyophilisiert.
Beispiel 4 A: Herstellung von Ackerbohnenprotein
1 kg getrocknete Ackerbohnen werden zerkleinert und mit 3 kg Wasser unter Herstellung einer Ackerbohnenaufschlämmung vermischt. Der pH-Wert der Aufschlämmung wird sodann mit NaOH auf pH 6,8 - 7,2 eingestellt. Die Ackerbohnenaufschlämmung wird zur Entfernung von Schalenresten gesiebt und dann über eine Zentrifugenanlage von Stärke und Fasern befreit. Der Überstand der Zentrifugation wird wiederum einer pH-Wert-Einstellung auf einen pH-Wert zwischen 6,8 und 8,3 unterworfen. Der so eingestellte Überstand wird mit CaCh zur Ausfällung von Phytat und mit Adsorberharz kontaktiert und der ausgefällte Feststoff mittels Zentrifugation abgetrennt. Die verbleibende wässrige Proteinlösung wird nun über eine Ultrafiltrationsanlage, hier mit einem cut-off von 15 kDa, in ein Proteinkonzentrat als Retentat und eine Salz-/Aminosäure-/Zucker-Lösung getrennt. Das Ultrafiltrationsretentat wird mit mit NH4OH auf einen pH 7,8 eingestelltem Frischwasser gewaschen, bis eine Leitfähigkeit von unter 2 mS/cm erzielt wird. Diese Ultrafiltrationsretentat-Lösung wird nun sprühgetrocknet zu einem hellen Proteinpulver, das vollständig in Wasser löslich ist
Beispiel 4B: Herstellung hochwasserlöslichen Ackerbohnenproteins
Zur Herstellung von hochwasserlöslichem Ackerbohnenprotein wurden getrocknete Ackerbohnen enthülst, zerkleinert und in Wasser aufgeschlämmt. Die Suspension wird einer Schwerkrafttrennung (Zentrifugation) unterworfen und der Überstand als proteinreiches Fruchtwasser für die Proteingewinnung weiterverwendet.
Die proteinhaltige Lösung wird abermals zentrifugiert, wobei feine Schwebstoffe aus der Lösung entfernt werden. Die gereinigte proteinhaltige Lösung wird auf einen pH- Wert von 7,0 bis 8,0 eingestellt und dann ultrafiltriert, sowie mit demineralisiertem Wasser bis zu einer elektrischen Leitfähigkeit von 1 ,5 bis 3,0 mS/cm diafiltriert. Das erfindungsgemäße Protein wird im Ultrafiltrationsretentat gewonnen, während Salze, Zucker und Aminosäuren im Ultrafiltrationspermeat verbleiben. Das Ultrafiltrationsretentat, gewonnen durch anschließende Sprühtrocknung des UF-Retentats, wies auf:
Das erfindungsgemäße Ackerbohnenprotein bildet Gele (hitze- oder säureinduziert) und wirkt stark emulgierend.
Eine HPLC-Analyse von Ackerbohnenprodukten, die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Proteinmischung auftreten, ist in Fig. 8 gezeigt. Deutlich erkennt man das filtrierte und zentrifugierte Fruchtwasser (gepunktete Linie). Als Permeat der UF wird die durchgezogene Linie gezeigt, bei der das Verhältnis der Peaks zwischen 10 - 15 min Retentionszeit und 15- 25 min sich drastisch in Richtung der Proteine mit den längeren Retentionszeiten verschiebt - solche mit kürzeren Retentionszeiten sind nicht mehr nachweisbar. Das Ackerbohnenisolat - gestrichelte Linie - dagegen weist hauptsächlich die Proteine mit dem Molekulargewicht entsprechend 10 - 15 min Retentionszeit auf, die bereits im Filtrat überwiegend vorhanden waren. Die HPLC zeigt also die erfolgreiche Abtrennung von Proteinen mit Retentionszeiten >18 min mittels der UF.
Erfindungsgemäße Leguminosenproteine sowie Zwischen- und Nebenprodukte der Proteingewinnung aus Ackerbohnen und Mungbohnen wurden mittels SDS-PAGE untersucht (Fig. 5). Es zeigte sich, dass das Fruchtwasser dieser Bohnen (Spur 2 = Ackerbohnenfruchtwasser; Spur 6 = Mungbohnenfruchtwasser) nach der erfindungsgemäßen Diafiltration über einer UF-Membran UF-Retentate (Spur 4 und 5 für Ackerbohnen und Spur 8 und 9 für Mungbohnen) lieferte, die keine Banden unter ca. 40 kDa aufwiesen. Das UF-Permeat einer 100 kDa Ultrafiltrationsmembran zeigte (Spur 3 für Ackerbohne und Spur 7 Mungbohnen) nur sehr schwache Banden besonders im Bereich >40 kDa.
In Fig. 7 findet sich eine HPLC von Mungbohnenproteinisolat (gestrichelte Linie, herstellbar nach Beispiel 2B) Ackerbohnenisolat (durchgezogene Linie, herstellbar nach Beispiel 4B) und erfindungsgemäßes Erbsenprotein (gepunktete Linie). Alle Proteine wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einer 100 kDa UF-Membran hergestellt. Deutlich erkennt man, dass das Mungbohnen- und Ackerbohnenisolat viel Protein mit einem Molekulargewicht von ca 10 - 15 min Retentionszeit haben, während Erbsenprotein-UF-Retentat zusätzlich Proteine mit einer Retentionszeit von 15 - 20 min aufweist.
Auch eine Analyse der Erbsenproteinherstellung mittels HPLC in Fig. 10 zeigte, dass im erfindungsgemäßen Erbsenprotein (gepunktete Linie) nur noch Proteine mit Retentionspeaks im Bereich von 9-19 min auftreten, während durch die Ultrafiltration die Proteine mit darüber liegenden Retentionszeiten abgetrennt werden. So zeigt das Permeat (durchgezogene Linie) nur Proteine im Bereich von 18 - 26 min aufweist. Hier zeigt sich die Trennschräfe der UF-Membran, da das erfindungsgemäße Erbsenprotein (gepunktete Linie), hervorgehend aus dem UF-Retentat, hauptsächlich Proteine bis zu einer Retentionszeit von 20 min enthält.
In Fig. 9 ist ein HPLC-Diagramm für Mungbohnenprotein gezeigt, ähnlich dem der Fig. 10. Auch dort ist eine deutliche Verschiebung der Peak-Intensität in Richtung 10 - 15 min im UF-Retentat (gepunktete Linie) zu finden, während das Permeat (kurzgestrichelte Linie) im Wesentlichen nur noch Proteine mit einer Retentionszeit von 18 - 27 min aufweist. Das HPLC-Diagramm des zentrifugierten Mungbohnenfruchtwassers (langgestrichelte Linie) beinhaltet noch deutliche Banden von 18 - 27 min, während der Peak bei 10 - 15 min in Relation zu den anderen Peaks kleiner ist. Im Permeat (kurzgestrichelte Linie) finden sich hauptsächlich Proteine im Molekulargewichtsbereich 20 - 30 min., welche im erfindungsgemäßen Protein fast vollständig abgetrennt worden sind.
In Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm für Ackerbohnenprotein gezeigt, ähnlich dem der Fig. 10. Auch dort ist eine deutliche Verschiebung der Peak-Intensität des Ackerbohnenfiltrats (gepunktete Linie) in Richtung 10 - 15 min im Retentat (strichpunktierte Linie) zu finden, während das Permeat (durchgezogene Linie) im Wesentlichen nur noch Proteine mit einer Retentionszeit von 18 - 27 min aufweist.
Fig. 7 ermöglicht einen Vergleich der HPLC-Diagramme von erfindungsgemäßen Erbsen (gepunktete Linie), Ackerbohnen- (durchgezogene Linie) und Mungbohnen- protein-lsolaten (gestrichelte Linie). Man erkennt, dass alle diese Leguminosen ähnliche Proteinpeaks aufweisen, wobei Erbsen verhältnismäßig weniger Protein im Peak zwischen 10 - 15 min pro Protein 17 - 25 min zu haben scheint, als Ackerbohnen oder Mungbohnen. In Fig. 11 sind Versuche über das Gelbildungsverhalten gezeigt. Die erfindungsgemäßem Leguminosenproteine bilden thermisch - aber auch über den pH-Wert - aktivierbare Gele, die lange elastisch sind. Die Eigenschaften der Gele wurden mittels Texturanalyse mit dem TA XT plus Texture Analyzer unter Verwendung des Stempels (SMS P 05) (Weg: 20 mm, Vor-, Test-, und Rückgeschwindigkeit: 1 ,0 mm/sec; Auslösekraft: 20 g) bei Raumtemperatur untersucht.
• Vorbereitung von 2 Proben: Protein (6 g bzw. 12 g Produkt) vorlegen und de- min. H2O (34 g bzw. 68 g) zugeben, Rühren bis zur Lösung des Proteins
• 30 mL der Probenlösung in ein Anton Paar Rheometer mit Metallzylinder mit Loch (H-CC27-D) geben
• Aufkochen der Probenlösung: Starttemperatur von 25 °C, Heizphase: Erhitzen auf 90 °C mit einer Heizrate von 6,5 °C/min, Haltezeit bei 90 °C für 15 min, Kühlphase: Abkühlen auf 25 °C mit einer Kühlrate von 4,0 °C, Haltezeit bei 25 °C für 10 min
• aufgekochte Probenlösung für 24 h bei Raumtemperatur lagern
• Texturanalyse mit dem TA XT plus Texture Analyzer
Bei der Messmethode wird ein Stempel langsam in die vorbereitete Probenlösung gedrückt, was dem ersten Peak entspricht. Beim Hineinfahren des Stempels in das Gel muss solange eine Kraft aufgebracht werden, bis der Stempel vollständig in das Gel eingedrungen ist. Die negative Kraft entspricht anschließend dem Zurückfahren des Stempels und dem elastischen Nachziehen des Gels. Danach wird der Vorgang wiederholt und der Stempel dringt ein zweites Mal in das Gel ein. Die Maximalkraft ist bei dem zweiten Vorgang meist geringer, da die Gelfestigkeit durch den ersten Vorgang noch beeinträchtigt ist. Je ähnlicher die Peaks sich dabei sind, desto größer ist die Elastizität des Gels. Deutlich erkennt man, dass unterschiedliche Kräfte zum Durchstoßen des Gels notwendig sind - wobei die Gelfestigkeit stark pH-Wert- abhängig ist. Während die Gelfestigkeit durch Acidifizierung auf einen pH-Wert von 6 gesteigert wird, nimmt diese durch weitere Verringerung der pH-Wertes ab. Dies lässt sich deutlich aus Figur 11 erkennen: dort bedeutet die durchgezogene Linie - erfindungsgemäße Erbsenproteinlösung ohne pH-Wert-Erniedrigung (pH = 7,6); gestrichelte Linie - pH = 6; strichpunktierte Linie - pH = 5 und gepunktete Linie - pH = 4.
Eine Differential-Scanning-Calorimetry-Analyse (DSC) (Fig. 12) zeigte, wie auch schon aus SDS-Gelen bekannt, dass eine thermische Behandlung (HTST) die Protei- ne veränderte. Die DSC-Messungen wurden durchgeführt, um die thermischen Eigenschaften des Proteins zu untersuchen, was Rückschlüsse auf den Denaturierungszustand des Proteins zulässt. Dabei werden trockene oder flüssige Proben erhitzt und deren Wärmeaufnahme über den untersuchten Temperaturbereich gemessen. Für die Messung wurde eine 50%ige Lösung des erfindungsgemäßen Proteins ohne Sterilisation sowie von denaturiertem EMPRO E86 HV, eines im Handel befindlichen, thermisch behandelten, pasteurisierten, vor der Sprühtrocknung auf einen pH- Wert von 8.2 - 9.2 eingestellten Proteins nach DE102006050619A1 , in demineralisier- tem Wasser hergestellt und in einen 100 pl Aluminium-Tiegel gefüllt. Die Messung wurde an einem DSC+ StaF System von Mettler Toledo® unter Stickstoff-Atmosphäre durchgeführt. Dabei wurde ein Temperaturbereich von 25 - 105 °C mit einer Heizrate von 10 °C/min untersucht. In Fig. 12 ist dabei erkennbar, dass das erfindungsgemäße Erbsenprotein ab einer Temperatur von ca. 84 °C Wärme aufnimmt, was dem Beginn der Denaturierung (TonSet) entspricht. Die Wärmeaufnahme endet bei ca. 98 °C, sodass sich eine Denaturierungs-Peak-Temperatur (TdPeak) von etwa 91 °C ergibt. Dadurch zeigt sich, dass das erfindungsgemäße Erbsenprotein zuvor nicht Hitzebehandelt worden ist und deshalb noch native Proteine enthält. Im Vergleich dazu zeigt die denaturierte Probe der Emsland-Stärke Erbsenprotein Empro E 86 HV (Koagulation mittels pH-Wert-Anpassung und Wärme, sowie Pasteurisierung) Akeinerlei Wärmeaufnahme, da dieses Protein bereits thermisch denaturiert ist. Eine höhere Denaturierungstemperatur ist in der Regel auf größere und komplexere Proteine zurückzuführen.
Nachfolgend sind weitere Anwendungsbeispiele angegeben, die Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Proteine zeigen - weitere Anwendungen sind dem Fachmann offensichtlich.
Beispiel 5: Protein-angereichterte Pasta
Herstellung: 1 . Alle trockenen Zutaten gut vermischen
2. Kaltes Leitungswasser zugeben, bis eine Feuchtigkeit von etwa 30-34% erreicht wurde
3. Mischen/Kneten mit der Haussier® Nudelmaschine PN300 VXS für etwa 15 min
4. Mit einem single screw Extruder kombinieren und formen
5. Trocknung bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt < 13%
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Erbsenproteins konnte eine Glutenfreie und Protein-angereicherte Pasta hergestellt werden. Weitere Vorteile der Verwendung des erfindungsgemäßen Erbsenproteins sind eine hellere Farbe als bei dem Kartoffel protein Empro K, bei dem eine dunklere Farbe entstand und ein angenehmerer, weniger bitterer Geschmack als bei dem Kartoffel protein Empro K und dem Erbsenprotein Empro E 86 HV (einem denaturierten, temperaturbehan-delten Erbsenprotein von EMSLAND STÄRKE). Durch die Verwendung verschie-dener Proteine in Kombination, kann man unterschiedliche Texturen/Konsistenzen erreichen.
Beispiel 6: Schneidbares, veganes Käseimitat:
Verschiedene Geschmacksrichtungen erhältlich, z.B. "Cheddar-Käse-Geschmack"
1 . Alle T rockenstoffe mischen
2. Wasser und Fett wurden in einen beheizbaren Rührkessel gegeben und bei niedriger Drehzahl (300 U/rnin) auf 50 °C erwärmt, um das Fett zu schmelzen 3. Trockenmischung hinzufügen und unter Rühren (ca. 500 ll/min) auf 80-85 °C erwärmen, Temperatur für 5 min halten
4. In Formen gießen und bei 6-8 °C für 5 Tage kühl lagern
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Erbsenproteins konnte ein schneidfähiges Käseimitat erzeugt werden, dessen Protein-Gehalt dem von Milch-Käse sehr viel näher angeglichen ist.
Beispiel 7: Vegane Eiscreme
1. Wasser und Milch in einen Thermomix® geben
2. Trockenstoffe mischen und bei Stufe 4 einrühren, nach einer Minute auf Stufe 3,5 verringern
3. Glukosesirup in der Mikrowelle erwärmen (2 min, 800 W)
4. Kokosfett mit dem zuvor erwärmten Glucosesirup in einem Kochtopf auf dem Herd schmelzen und bis zur vollständigen Auflösung verrühren
5. Mischung in den Topf geben, 1 min rühren
6. Auf 90 °C aufheizen und diese Temperatur für 10 min halten
7. Mischung mit einem Wasserbad auf 15 °C abkühlen
8. Aromen hinzugeben, über Nacht kühl lagern (6 °C)
9. Verarbeitung in der Eismaschine
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Erbsenproteins konnte eine vegane Eiscreme erzeugt werden, die ein cremiges Mundgefühl und einen angenehmen leicht nussigen Geschmack aufwies. Zusätzlich ist die so hergestellte Eiscreme Pro- tein-angereichert. Beispiel 8: Vegane Burger
1. Hydrieren der TVPs 2. Bei Bedarf zerkleinern der TVPs
3. Zugabe aller weiteren Inhaltsstoffe und mischen aller Zutaten
4. Burger Patties formen
Die geformten Burger Patties können direkt gebraten werden oder zunächst eingefroren werden und erst zu einem späteren Zeitpunkt zubereitet werden. Auch nach dem Gefrier-Brat-Prozess bleibt die Funktionalität des erfindungsgemäßen Proteins erhalten. Das erfindungsgemäße Protein trägt hier zu einer Verbesserung der Produktbindung und Festigkeit des Patties bei.
Beispiel 9: Vegane Wurst
1. Alle trockenen Inhaltsstoffe mischen
2. Nassextrudat zerkleinern
3. Die vermischten Inhaltsstoffe zu Wasser und Essig zugeben und alles vermischen
4. Zerkleinertes Nassextrudat zugeben und vermischen
5. Mischung in eine Wursthülle füllen
6. Erhitzen der veganen Wurst in einem Konvektomaten bei 90 °C für 1.5 h
7. Auf 7 °C abkühlen und bei dieser Temperatur für ca. 48 h lagern
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Erbsenproteins konnte eine pflanzenbasierte Wurst hergestellt werden. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins kann eine größere Proteinanreicherung als mit anderen Erbsenproteinen erreicht werden, da es eine geringere Viskosität aufweist und sich so Vorteile hinsichtlich der Verarbeitbarkeit ergeben.
Die Beschreibung der Offenbarung ist lediglich beispielhafter Natur und daher sollen Beispiele, die nicht vom Inhalt der Offenbarung abweichen, im Umfang der Offenbarung liegen. Solche Beispiele sind nicht als Abweichung vom Geist und Umfang der Offenbarung anzusehen. Die breiten Lehren der Offenbarung können in einer Vielzahl von Formen implementiert werden. Obwohl diese Offenbarung bestimmte Beispiele enthält, sollte der wahre Umfang der Offenbarung daher nicht darauf beschränkt sein, da andere Modifikationen beim Studium der Zeichnung, der Beschreibung und der folgenden Ansprüche offensichtlich werden.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Wasserlösliche Leguminosenproteine, herstellbar durch:
Zerkleinerung von Leguminosensamen, ggf. Entfetten der zerkleinerten Leguminosensamen
Mischen der zerkleinerten Leguminosensamen mit Wasser unter Herstellung einer Leguminosenaufschlämmung;
Einstellen des pH-Werts der Leguminosenaufschlämmung auf einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,5, bevorzugt zwischen 7,0 und 7,4;
Separieren von Stärke und Fasern durch Zentrifugation oder Filtration unter Herstellung einer wässrigen Proteinlösung als Überstand;
Einstellung des pH-Wertes der separierten Proteinlösung auf einen pH-Wert zwischen 7,2 und 8,5; bevorzugt 7,5 - 8,3;
Ultrafiltration der pH-eingestellten Proteinlösung;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats mit Wasser, ausgewählt aus Frischwasser und demineralisiertem Wasser eines pH-Werts von 7,5 - 8,2 zu einer Leitfähigkeit des Diafiltrats von höchstens 30% der Leitfähigkeit des Permeats ohne Diafiltration, d.h. auf eine Leitfähigkeit von 1-3 mS/cm.
Gewinnung des diafiltrierten Ultrafiltrationproteinretentats; und
Trocknen, Kühlen oder Frieren des Ultrafiltrationsretentats.
2. Wasserlösliche Leguminoseproteine nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Trocknen ausgewählt ist aus Sprühtrocknen, Gefriertrocknen, Lyophilisierung.
3. Wasserlösliche Leguminosenproteine nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Ultrafiltrationsretentat mit einem Adsorptionsmittel, ausgewählt aus Aktivkohle, Silikaten und Adsorberharzen, behandelt ist.
4. Wasserlösliche Leguminosenproteine nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass eine Phytatfällung nach der Abtrennung von Stärke und Fasern in der Protein-Lösung durchgeführt wird.
5. Wasserlösliche Leguminoseproteine nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Leguminosen ausgewählt sind aus Bohnen, auch Mungbohnen, Erbsen, Kichererbsen, Lupinen, Linsen.
6. Wasserlösliche Leguminoseproteine nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultrafiltrationsretentat temperaturbehandelt, ausgewählt aus UHT, HTST ist.
7. Wasserlösliche Leguminoseproteine nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass der cut-off der Ultrafiltrations-Membran zwischen 5 und 100 kDa liegt.
8. Wasserlösliche Leguminosenproteine nach einem der Ansprüche 1 - 7, die Ausgangsprodukte und/oder Fertigprodukte für Futtermittel, und/oder Emulgatoren, und/oder Filmbildner, und/oder Schaumstabilisatoren und/oder Lebensmittel bzw. -zusätze für die menschliche und tierische Ernährung, Kleberausgangsmaterial oder Schönungsmittel für Fruchtsäfte und daraus hergestellte Getränke sind.
9. Verfahren zur Herstellung löslicher Leguminosenproteine nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit den Schritten:
Vorlegen zerkleinerter Leguminosensamen, ggf. Entfetten der zerkleinerten Leguminosensamen
Mischen der zerkleinerten Leguminosensamen mit Wasser unter Herstellung einer Leguminosenaufschlämmung; Einstellen des pH-Werts der Leguminosenaufschlämmung auf einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,5, bevorzugt zwischen 7,0 und 7,4;
Separieren von Stärke und Fasern durch Zentrifugation oder Filtration unter Herstellung einer wässrigen Proteinlösung als Überstand;
Einstellung des pH-Wertes der wässrigen Proteinlösung auf einen pH-Wert zwischen 7,2 und 8,5; bevorzugt 7,5 - 8,3;
Ultrafiltration der pH-eingestellten Proteinlösung;
Diafiltration des Ultrafiltrationsretentats mit Wasser, ausgewählt aus Frischwasser und demineralisiertem Wasser eines pH-Werts von 7,5 - 8,2 bis zu einer Leitfähigkeit des Diafiltrats von höchstens 30% der Leitfähigkeit des Permeats ohne Diafiltration;
Gewinnung des diafiltrierten Ultrafiltrationproteinretentats;
Ggf. HTST-Behandlung des UF-Retentats und
Trocknen, Kühlen oder Frieren des Ultrafiltrationsretentats. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch Einsatz einer UF- Membran mit einen cut-off von 10 - 100 kDa.
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