EP4429668A1 - Phytoecdysones et/ou dérivés de 20-hydroxyecdysone en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l'expression smn pour leur utilisation dans le traitement de l'amyotrophie spinale - Google Patents

Phytoecdysones et/ou dérivés de 20-hydroxyecdysone en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l'expression smn pour leur utilisation dans le traitement de l'amyotrophie spinale

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EP4429668A1
EP4429668A1 EP22813970.5A EP22813970A EP4429668A1 EP 4429668 A1 EP4429668 A1 EP 4429668A1 EP 22813970 A EP22813970 A EP 22813970A EP 4429668 A1 EP4429668 A1 EP 4429668A1
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EP
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seq
hydroxyecdysone
increase
production
phytoecdysone
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Pending
Application number
EP22813970.5A
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German (de)
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Inventor
Mathilde Latil
Cynthia BEZIER
Pierre Dilda
René LAFONT
Stanislas Veillet
Frederic Charbonnier
Olivier BIONDI
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Biophytis SA
Universite Paris Cite
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Biophytis SA
Universite Paris Cite
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Publication date
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Definitions

  • the invention relates to the use of phytoecdysones and/or hemisynthetic derivatives of 20-hydroxyecdysone, in combination with an active ingredient aimed at restoring the expression of the SMN protein, for the treatment of spinal muscular atrophy .
  • Neuromuscular diseases are characterized by an alteration in the functioning of motor units, made up of motoneurons, neuromuscular junctions and skeletal muscles. Whatever the origin of the disease, nervous as in spinal muscular atrophy or amyotrophic lateral sclerosis, or muscular, all cause an impairment of motor function in patients, ranging from disability to premature death when vital muscles are reached.
  • the motor deficit first spreads to the muscles of the lower limbs, then later to the muscles of the upper limbs, preferentially affecting the extensor muscles.
  • the gene responsible for SMA was identified in 1995 on chromosome 5 and named SMN for “survival of motor neurons” in Anglo-Saxon terminology (Lefebvre et al., 1995).
  • SMN2 presents 5 nucleotide differences with SMN1, including one at the level of exon 7, favoring its excision by splicing in 90% of the mRNAs produced by the SMN2 gene.
  • This alternative splicing leads to the production of a truncated and unstable SMNA7 protein.
  • SMN2 gene only 10% of the proteins produced by the SMN2 gene are complete and functional (Lefebvre et al., 1997; Vitte et al., 2007).
  • a link has been demonstrated between the number of copies of the SMN2 gene, their level of expression and the severity of the disease.
  • the first treatment to be authorized in SMA is Spinraza® (nusinersen).
  • This treatment received marketing authorization (AMM) in December 2016 in the United States and in June 2017 in Europe.
  • AAM marketing authorization
  • ASO antisense oligonucleotide
  • ASO antisense oligonucleotide
  • Sequences of antisense oligonucleotides having the capacity to modify the splicing of the SMN2 gene are given in applications W02007/002390 and WO2018/014041.
  • Zolgensma® Onascripogene abeparvovec or AVXS-101
  • AAV viral vector
  • Evrysdi® (Risdiplam or R07034067) was authorized even more recently (MA in August 2020 in the United States and in March 2021 in Europe). It is a small molecule that acts on the maturation of the SMN2 gene. It is administered daily by mouth or by feeding tube.
  • nusinersen must be administered by highly invasive intrathecal injection several times a year. This mode of administration is very difficult and sometimes impossible for patients who have undergone surgery for scoliosis, which excludes nusinersen as a therapeutic option for these patients.
  • intrathecal administration allows specific distribution to the central nervous system, which means that not all symptoms can be fully covered.
  • onakopogen has an advantage, because it is administered intravenously, and allows systemic distribution.
  • Risdiplam for its part, is a less invasive systemic therapy, by daily oral administration. However, because risdiplam targets the splicing machinery, it may also affect other transcriptions, leading to unknown and uncontrollable off-target side effects. Indeed, risdiplam has been described as appearing to have an effect on a regulator of cell division at high concentrations, raising concerns about oncogenic side effects (Ratni et al., 2018).
  • Phytoecdysones represent an important family of polyhydroxylated sterols. These molecules are produced by various species of plants (ferns, gymnosperms, angiosperms) and participate in their defense against insect pests. The major phytoecdysone in the plant kingdom is 20-hydroxyecdysone.
  • Patent FR 3 021 318 discloses that phytoecdysones, and more particularly 20-hydroxyecdysone (20E), have been the subject of numerous pharmacological studies. These studies have highlighted the antidiabetic and anabolic properties of this molecule. Its stimulating effects on protein synthesis in the muscles are observed in rats in vivo (Syrov et al., 2000; Tôth et al., 2008; Lawrence et al., 2012) and on murine C2C12 myotubes in vitro (Gorelick- Feldman et al., 2008). Some of the effects described above in animal models have been found in clinical studies, which are still few in number. Thus, 20E promotes an increase in muscle mass in young athletes (Simakin et al., 1988).
  • the present invention aims to provide a treatment for spinal muscular atrophy, said treatment being improved compared to existing treatments.
  • phytoecdysones in particular 20E and semi-synthetic derivatives thereof
  • an active ingredient having the ability to to increase the production of functional SMN protein, in mammals suffering from spinal muscular atrophy.
  • the use of phytoecdysones and/or of at least one hemi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, in combination with a treatment using an active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein improves by synergy of these elements motor and functional performance as well as survival and weight of animals with spinal muscular atrophy (SMA).
  • SMA spinal muscular atrophy
  • the present invention relates to at least one phytoecdysone and / or at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, and at least one active principle having the ability to increase the production of functional SMN protein, for their use in combination therapy in the treatment of spinal muscular atrophy.
  • the invention relates to at least one phytoecdysone and/or at least one hemisynthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, and at least one active ingredient having the ability to increase the production of functional SMN protein, for use in combination therapy in the treatment of motor neuron disease, said disease participating in SMA.
  • a first active agent is chosen from phytoecdysones or semi-synthetic derivatives of 20- hydroxyecdysone or is a composition comprising at least one phytoecdysones and/or at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, a second active agent being the active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein.
  • Combination therapy may comprise a single formulation or multiple formulations.
  • the co-administration can be carried out simultaneously or sequentially.
  • the co-administration can be effected by the same route of administration or by different routes of administration. It is considered a combination therapy as long as the effects of the two (or more) agents overlap in the subject to achieve additional, additive or synergistic clinical effects.
  • the invention also responds to the following characteristics, implemented separately or in each of their technically effective combinations.
  • said at least one phytoecdysone and/or said at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, and said at least one active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein are co-administered.
  • said at least one phytoecdysone and/or said at least one hemi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, and said at least one active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein are co-administered within the same composition.
  • said at least one phytoecdysone and/or said at least one hemi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone are administered orally or systemically to the mammal, and said at least one active principle having the ability to increase production of functional SMN protein is administered to the mammal orally and/or intrathecally and/or intravenously.
  • said at least one phytoecdysone and / or said at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone and / or the active principle having the ability to increase the production of functional SMN protein is preferably incorporated into an acceptable pharmaceutical formulation which can be administered orally.
  • the increase in the production of SMN protein can be obtained by gene therapy or by gene therapy.
  • the active principle having the capacity to increase the production of protein SMN aims to provide the SMN1 gene.
  • the active ingredient having the capacity to increase the production of SMN protein is either a small molecule which acts on the maturation of the SMN2 gene, or an antisense oligonucleotide (ASO) developed in the aim of increasing the production of functional SMN protein by acting on the splicing (maturation) of the SMN2 gene.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • the ASO modulates the splicing of SMN2 which makes it possible to increase the inclusion of exon 7 in the mRNA of SMN2 and thus makes it possible to increase the number of generated SMN proteins having the acids amines corresponding to exon 7 and therefore corresponding to a functional SMN protein.
  • the active principle has the capacity to increase the production of functional SMN protein by gene therapy or by gene therapy.
  • the active ingredient has the ability to increase the production of functional SMN protein by supplying the SMN1 gene.
  • the active ingredient has the ability to increase the production of functional SMN protein by acting on the maturation of the SMN2 gene.
  • the active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein is an antisense oligonucleotide (ASO).
  • ASO antisense oligonucleotide
  • This ASO preferably has a sequence of 10 to 30 nucleotides, more preferably of 12 to 30 nucleotides, preferentially 12 to 25 nucleotides or even preferentially 15 to 20 nucleotides.
  • ASO has a sequence of 18 nucleotides.
  • ASO has the ability to induce the inclusion of exon 7 in the sequence of the SMN2 gene.
  • the ASO is complementary to at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, more preferably to at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably 98%, preferably 100%, of the sequence of the nucleic acid coding for the pre-mRNA of the human SMN2 gene.
  • the ASO is complementary to at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, more preferably to at least 80%, preferably to at least 90%, preferably at least 95%, preferably 98%, preferably 100%, of a sequence belonging to intron 6, to intron 7 or to a part of exon 7 and a part of an intron adjacent to exon 7, nucleic acid encoding the pre-mRNA of the human SMN2 gene.
  • exon 7 is included in the mRNA of SMN2, which makes it possible to obtain a functional SMN protein.
  • sequence of the nucleic acid coding for the pre-mRNA of the human SMN2 gene is available on Genbank under the reference NG_008728, version NG_008728.1.
  • the ASO is a sequence that is at least 50% identical or similar to the sequence SEQ ID NO: 1 given in the sequence listing filed with the present application (5'-TCACTTTCATAATGCTGG-3 '), preferably identical or similar to at least 60%, preferably at least 70%, more preferably to at least 80%, preferably to at least 90% and preferably identical or similar to 100%.
  • the sequence SEQ ID NO: 1 is complementary to 18 bases of intron 7 (bases 10 to 27) of the SMN2 gene.
  • the ASO has a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ
  • the ASO sequence When the ASO sequence has a percentage identity or similarity of less than 100% with respect to one of the sequences listed above, it may have insertions, deletions and/or substitutions with respect to this sequence of reference.
  • the percentage identity between two ASO sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the sequence of an ASO in the comparison window can thus include additions or deletions with respect to the reference sequence so as to obtain an optimal alignment between the two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of positions for which a nucleic base is identical in the two compared sequences, then by dividing this number of positions by the total number of positions in the comparison window, the number obtained being multiplied by one hundred.
  • the ASO is preferably composed of a phosphodiester skeleton. It may possess various modifications in its skeleton and/or its chemical structure in order to increase its stability and/or its affinity for RNA and/or to present a significant advantage in terms of pharmacokinetics.
  • the ASO comprises at least one modification chosen from:
  • phosphate group such as a phosphorothioate, or a methylphosphanate, or a phosphoroamidate
  • a chemical modification in the 2' position of the ribose such as a 2'0-methyl (2'OMe) or a 2'0-methoxyethyl (2'MOE) or a 2' Fluoro (2'F),
  • nucleobases such as pyrimidine methylation of the 5' methylcytosine, 5-methyluridine/ribothymidine or "G-clamp” type, - at least one substantial change in the structure of the sugar, leading to a variety of molecules, such as morpholinos (PMO for “phosphoroamidate morpholino oligomer” in English terminology) or peptide nucleic acids (PNA for “Peptide nucleic acid” in English terminology) Anglo-Saxon) or constrained type oligonucleotides (LNA for "locked nucleic acid” in Anglo-Saxon terminology or cEt for "2'-4'-constrained ethyl” in Anglo-Saxon terminology or tc-DNA for tricyclo-DNA).
  • PMO phosphoroamidate morpholino oligomer
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA constrained type oligonucleotides
  • LNA constrained type oligonucleotides
  • the ASO is of sequence identical or similar to at least 50% with the sequence SEQ ID NO: 23, preferably identical or similar to at least 60%, preferentially at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 90% and preferably the same or similar to 100%.
  • the sequence SEQ ID NO: 23 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 with 2'-O-methoxyethyl on the 2' carbon atom of the deoxyribose for each base, with a phosphorothioate skeleton, and with 5-methyl cytosines at instead of cytosines.
  • the phosphothioate skeleton advantageously improves the stability of the ASO
  • the 5-methyl cytosines advantageously make it possible to make the ASO less sensitive to nucleases
  • the 2'-O-methoxyethyl on the 2' carbon atom of the deoxyribose advantageously allows to reduce the immune response induced by the administration of ASO.
  • ASO is administered at a dose of between 0.01 and 10 mg per kilogram in humans. Preferably this dose is administered daily or weekly.
  • phytoecdysones and semi-synthetic derivatives of 20-hydroxyecdysone are advantageously purified to pharmaceutical grade.
  • a phytoecdysone that can be used according to the invention is, for example, 20-hydroxyecdysone.
  • said at least one phytoecdysone is 20-hydroxyecdysone.
  • 20-Hydroxyecdysone and its semi-synthetic derivatives are advantageously purified to pharmaceutical grade.
  • the 20-hydroxyecdysone used is preferably in the form of a plant extract rich in 20-hydroxyecdysone or of a composition comprising 20-hydroxyecdysone as active agent.
  • Plant extracts rich in 20-hydroxyecdysone are, for example, extracts of Stemmacantha carthamoides (also called Leuzea carthamoides), Cyanotis arachnoidea and Cyanotis vaga.
  • the extracts obtained are preferably purified to pharmaceutical grade.
  • the 20-hydroxyecdysone is in the form of a plant extract or of a plant part, said extract comprising at least 95%, and preferably at least 97%, of 20-hydroxyecdysone.
  • Said plant is preferably chosen from plants containing at least 0.5% of 20-hydroxyecdysone by dry weight of said plant.
  • Said extract is preferably purified to pharmaceutical grade.
  • Said extract is subsequently called BIO101. It remarkably contains between 0 and 0.5%, by dry weight of the extract, of impurities, such as minor compounds, likely to affect the safety, availability or effectiveness of a pharmaceutical application of said extract.
  • BIO101 is produced is preferably chosen from Stemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoidea and Cyanotis vaga.
  • the semi-synthetic derivatives of 20-hydroxyecdysone are obtained by semi-synthesis and can in particular be obtained in the manner described in European patent application No. EP 15732785.9.
  • the phytoecdysones are administered at a dose of between 3 and 15 milligrams per kilogram per day in humans.
  • Phytoecdysones are understood here to mean both phytoecdysones in general and 20-hydroxyecdysone (in particular in the form of an extract) and its semisynthetic derivatives.
  • the phytoecdysones are administered at a dose of 200 to 1000 mg/day, in one or more doses, in an adult human, and a dose of 5 to 350 mg/day, in one or more doses, in the human child or the infant.
  • Phytoecdysone is understood here to mean both phytoecdysone in general and 20-hydroxyecdysone (in particular in the form of an extract) and its semi-synthetic derivatives.
  • said at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone is chosen from: - a compound of general formula (I):
  • R 1 is chosen from: a (Ci-C6)W(Ci-Ce) group; a (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) group; a (Ci-C6)W(Ci-Ce)CO2(Ci-Ce) group; a (Ci-Ce)A group, A representing a heterocycle optionally substituted by a group of OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-Ce) type; a CH2Br group;
  • W being a heteroatom chosen from N, O and S, preferably O and even more preferably S;
  • (Ci-Ce) means any alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, linear or branched, in particular, methyl, ethyl, n-propyl, iso -propyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, n-hexyl.
  • it is a methyl, ethyl, iso-propyl or t-butyl group, in particular a methyl or ethyl group, more particularly a methyl group.
  • heterocycle preferably means a cycle comprising 5 or 6 atoms including one or two heteroatoms (O, S or N), the remaining atoms being carbon atoms.
  • R 1 is chosen from: a (Ci-C6)W(Ci-Ce) group; a (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) group; a (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6) group; a (Ci-Ce)A group, A representing a heterocycle optionally substituted by a group of OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-C 6 ) type;
  • W being a heteroatom chosen from N, O and S, preferably O and more preferably S.
  • said at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone is a compound chosen from the following compounds: No. 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13-dimethyl-17-(2-morpholinoacetyl)-2,3,4,5, 9,11,12,15,16,17-decahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-6-one, No.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising:
  • At least one active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein, for its use in the treatment of a neuromuscular disease in mammals, in particular spinal muscular atrophy.
  • composition can meet one or more of the characteristics described above with reference to the use in therapy combination of said at least one phytoecdysone and/or of at least one semi-synthetic derivative of 20-hydroxyecdysone, and of said at least one active principle having the capacity to increase the production of functional SMN protein.
  • the composition is incorporated into an acceptable pharmaceutical formulation that can be administered orally or intrathecally or systemically.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means that which is useful in the preparation of a pharmaceutical composition, which is generally safe, non-toxic and which is acceptable for veterinary as well as pharmaceutical use. human.
  • Figure 1 represents the curve of the weight change of SMA mice (Smn A7/A7 ; huSMN2 +/_ ) treated with BIO101 alone or with a mismatch ASO or with an ASO 10-27 alone, or with an ASO combination 10-27 + BIO101, from birth (PO) until death of mice.
  • P corresponds to the number of days after birth (post natal);
  • Figure 2 is a Kaplan-Meier representation of the survival curves of SMA mice (Smn A7/A7 ; huSMN2 +/_ ) treated with BIO101 alone or with a mismatch ASO or with an ASO 10-27 alone, or with an ASO 10-27 + BIO101 combination, from birth (PO);
  • figure 3 represents the motor performances (movement capacities) evaluated by the open field test of the SMA mice (Smn A7/A7 ; huSMN2 +/_ ) treated with BIO101 alone or with a mismatch ASO or with an ASO 10-27 alone, or with an ASO 10-27 + BIO101 combination, from birth (PO);
  • figure 4 represents the motor performance (muscle fatigability) evaluated by the grip test of SMA mice (Smn A7/A7 ; huSMN2 +/_ ) treated with BIO101 alone or with an ASO mismatch or with an ASO 10-27 alone, or with an ASO 10-27 + BIO101 combination, from birth (PO).
  • the antisense oligonucleotide (ASO) of sequence SEQ ID NO: 23 (5′-TCACTTTCATAATGCTGG-3′), reference ISIS 396443, also known as ISIS-SMNRx, and called ASO in the remainder of the description 10-27, complementary to 18 bases (bases 10-27) of intron 7 of the SMN2 gene (targeting a site in intron 7, called ISS-N1, which represses inclusion of exon 7 of the Pre-messenger RNA (pre-mRNA) of the SMN2 gene) having 2'-0-methoxyethyl modified nucleotides on the 2' deoxyribose carbon atom for each base, with a phosphorothioate backbone and 5-methyl cytosines and the ASO control (noted mismatch) of sequence SEQ ID NO: 24 (5'-TTAGTTTAATCACGCTCG-3') (Singh et al.
  • oligonucleotides are re-suspended at a concentration of 8 ⁇ g/ ⁇ L in 0.9% NaCl and stored at -20°C.
  • Newborn SMA mice receive a single dose of ASO 10-27 or ASO mismatch of 8 pg on postnatal day 1 (PO) by unilateral intracerebroventricular injection using a Hamilton syringe and a 32G needle.
  • the injection site is located 1 mm from the sagittal suture, between bregma and lambda, landmarks visible through the skin at PO.
  • the needle is positioned perpendicular to the injection site on the surface of the skin and inserted approximately 3mm deep to reach the lateral ventricle.
  • the complementary treatment BIO101 complexed with cyclodextrin is administered daily to young mice from the first postnatal day (PO) orally at a dose of 50 mg/kg using a pipette.
  • mice resulting from these crosses having the genotype “FVB/NRj-Smn A7/A7 huSMN2 7+ 2 copies” are described as “SMA” (Hsieh et al., 2000).
  • SMA mice were treated either with BIO101 alone or a mismatch ASO or ASO 10-27 alone, or with a combined ASO 10-27 + BIO101 treatment from PO. Survival ( Figure 1) and weight ( Figure 2) of the mice were analyzed daily.
  • the average lifespan of the pups (FIG. 1) treated with BIO101 alone (11 days) is substantially identical to that of the pups treated with the ASO mismatch (13 days).
  • treatment with ASO 10-27 alone at a dose of 8 pg significantly increases the average lifespan of SMA pups, with a median survival of 18 days (improvement of 38 % animal survival), versus a median survival of 13 days in the ASO mismatch control group.
  • the BIO101 treatment is administered in combination with ASO 10-27, the median survival increases to 22.5 days, i.e. a 73% improvement in animal survival.
  • the weight of the pups (FIG. 2) treated with BIO101 alone is comparable to that of the pups treated with ASO mismatch throughout their life.
  • the device used for the open-field test consists of a plastic box measuring 28 x 28 x 5 cm with a grid of the field divided into 16 squares measuring 7 cm x 7 cm.
  • the mice were tested individually and the evaluation device was washed after each session. Each mouse initially placed in the center of the field was allowed to move freely for 5 minutes with tail pinch stimulation every 15 seconds. Behavioral measurements are recorded by the experimenter during these 5 minutes and the total number of cross tiles is recorded.
  • the BIO101 treatment whether administered alone or in combination with ASO 10-27, accelerates the acquisition of walking with a tendency to increase the movement of the mice at P15 (1 10 ⁇ 18 squares i.e. +58% with BIO101 treatment alone, and 100 ⁇ 19 squares i.e. +44% with ASO 10-27 + BIO101 treatment) compared to the mice treated with ASO 10-27 alone (70 ⁇ 20 squares).
  • mice's forepaws were tested. The mice are suspended by their forepaws from a thin metal rod suspended horizontally in the air. The time spent hanging on is recorded. Each mouse was subjected to five successive attempts with a rest period of one minute between two tests. Only the best trial is kept for the evaluation of muscle functions.
  • the fatigue resistance of the young mice treated with ASO 10-27 alone is not improved compared to that of the young mice treated with the ASO mismatch.
  • the resistance to fatigue of young mice treated with BIO101 alone is improved by 19.3%.
  • the resistance to fatigue of the pups treated with ASO 10-27 alone and with BIO 101 alone are both higher (+7.7%) than that of the pups treated with the ASO mismatch.
  • a synergy operates between BIO101 and ASO 10-27 during the combined treatment so that the resistance to fatigue of the treated SMA animals increases by 26.3% at P7 and by 21.2% at P15. .
  • this combined therapy shows significant beneficial effects in a mouse model of SMA, in particular at the level of the weight of the animals, and even more importantly, at the level of the physical performance of these animals, whether it is whether the animal's ability to move or its resistance to fatigue.
  • Such ASOs are for example the ASOs of a sequence chosen from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29. [00102] These sequences are given in particular in table 1 below:
  • SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science, 345, 688-693.

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Abstract

L'invention concerne au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d'augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour leur utilisation en thérapie combinée dans le traitement de l'amyotrophie spinale chez le mammifère.

Description

Description
Titre de l'invention : Phytoecdysones et/ou dérivés de 20-hydroxyecdysone en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l’expression SMN pour leur utilisation dans le traitement de l’amyotrophie spinale
Domaine technique de l’invention
[0001 ] L’invention relève de l’utilisation de phytoecdysones et/ou de dérivés hémisynthétiques de 20-hydroxyecdysone, en combinaison avec un principe actif visant la restauration de l’expression de la protéine SMN, pour le traitement de l’amyotrophie spinale.
Technique antérieure
[0002] Les maladies neuromusculaires sont caractérisées par une altération du fonctionnement des unités motrices, composées de motoneurones, jonctions neuromusculaires et muscles squelettiques. Quelle que soit l’origine de la maladie, nerveuse comme dans l’amyotrophie spinale ou la sclérose latérale amyotrophique, ou musculaire, toutes provoquent une altération de la fonction motrice des patients, pouvant aller du handicap à la mort prématurée lorsque des muscles vitaux sont atteints.
[0003] Parmi ces maladies neuromusculaires, deux sont décrites comme affectant spécifiquement les motoneurones : les amyotrophies spinales infantiles (ou SMA), dont les symptômes apparaissent à l’enfance, et la sclérose latérale amyotrophique (ou SLA), dont les symptômes se déclarent à l’âge adulte. Ces deux maladies neurodégénératives, aux causes et aux manifestations cliniques différentes, ont en commun une dénervation musculaire progressive, responsable d’une amyotrophie (Al-Chalabi et Hardiman, 2013 ; Crawford et Pardo, 1996).
[0004] Les amyotrophies spinales représentent la cause la plus commune de mortalité infantile d’origine génétique avec une prévalence de 1/6000 à 1/10000 naissances (Crawford et Pardo, 1996). Trois types principaux de sévérité sont décrits, suivant l’âge d’apparition des symptômes et la progression des atteintes cliniques, allant du type 1 , le plus sévère, au type 3, dont l’espérance de vie peut être supérieure à 40 ans. Les patients atteints de SMA présentent une atteinte symétrique des muscles squelettiques par atrophie de fibres musculaires isolées ou regroupées en fascicules. La quasi-totalité des SMA sont à prédominance proximale, c’est- à-dire touchant les muscles du tronc et proches du tronc. Progressivement, le déficit moteur s’étend, dans un premier temps, aux muscles des membres inférieurs, puis dans un second temps, aux muscles des membres supérieurs, en affectant préférentiellement les muscles extenseurs. Le gène responsable de la SMA a été identifié en 1995 sur le chromosome 5 et a été nommé SMN pour « survival of motor neurons » en terminologie anglo- saxonne (Lefebvre et al., 1995).
[0005] Bien que présentant une grande hétérogénéité clinique, des analyses génétiques ont pu démontrer que toutes les formes de SMA sont causées par l’altération homozygote du gène télomérique SMN1 (Survival Of Motor Neurons), empêchant la production de la protéine Smn, induisant la dégénérescence des neurones moteurs, l’atrophie et la faiblesse musculaires. Dans le génome humain, il existe une copie centromérique inverse de ce gène, le gène SMN2, pouvant être retrouvé en plusieurs copies (Lorson et al., 1998), mais qui ne permet de compenser que partiellement la perte de fonction du gène SMN1 . En effet, SMN2 présente 5 différences nucléotidiques avec SMN1 , dont une au niveau de l’exon 7, favorisant son excision par épissage dans 90% des ARNm produits par le gène SMN2. Cet épissage alternatif conduit à la production d’une protéine SMNA7 tronquée et instable. Ainsi, seuls 10% des protéines produites par le gène SMN2 sont complètes et fonctionnelles (Lefebvre et al., 1997 ; Vitte et al., 2007). Un lien a été démontré entre le nombre de copies du gène SMN2, leur niveau d’expression et la sévérité de la maladie.
[0006] Plusieurs stratégies thérapeutiques, à différents stades de développement, sont explorées dans l’amyotrophie spinale proximale liée à SMN1. Certaines stratégies étudiées ont pour but d’augmenter la quantité de protéine SMN fonctionnelle, soit en modifiant la maturation de l'ARN messager de SMN2 pour qu'il réintègre l’exon 7 manquant (Nusinersen, Risdiplam, Branaplam), soit en apportant le gène SMN1 par thérapie génique (Zolgensma®). [0007] D’autres visent à ralentir l’évolution de la maladie en protégeant les motoneurones ou en améliorant le fonctionnement des jonctions neuromusculaires (Salbutamol, Pyridostigmine), ou les performances musculaires (SRK-015, entrainement physique). Néanmoins, la majorité des approches thérapeutiques testées dans la SMA visent à augmenter les niveaux d’expression de la protéine SMN, soit de manière localisée au niveau du système nerveux central et/ou de façon plus générale aux autres organes, de manière périphérique.
[0008] La thérapie génique pour apporter le gène SMN1 en utilisant des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) a montré des effets bénéfiques importants lors des études précliniques chez la souris, et dans les essais cliniques chez l’homme (Mendell et al. 2017 ; Passini et al., 2010 ; Lowes et al., 2018). D’autres approches se concentrant sur la modulation de l’épissage du SMN2 ont également prouvé leur efficacité (Naryshkin et al., 2014 ; Palacino et al., 2015 ; Finkel et al., 2016 ; Finkel et al., 2017). Ces résultats très positifs ont permis l’autorisation règlementaire de certaines molécules.
[0009] Trois traitements sont actuellement disponibles dans la SMA :
- Le premier traitement à avoir été autorisé dans la SMA est le Spinraza® (nusinersen). Ce traitement a reçu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en décembre 2016 aux Etats Unis et en Juin 2017 en Europe. Il s’agit d’un oligonucléotide antisens (ASO) développé dans le but d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle en agissant sur la maturation (l’épissage) du gène SMN2. Les oligonucléotides antisens ne traversant pas la barrière hémato-encéphalique, le nusinersen doit être administré de façon régulière par voie intrathécale, permettant une réexpression de la protéine SMN dans les motoneurones, avec un bénéfice clinique réel, mais d’importance variable selon le type de SMA et l’âge de début du traitement. Des séquences d’oligonucléotides antisens ayant la capacité de modifier l’épissage du gène SMN2 sont données dans les demandes W02007/002390 et WO2018/014041 .
- Plus récemment, le Zolgensma® (Onasemnogène abeparvovec ou AVXS-101 ), un produit de thérapie génique visant à apporter le gène SMN1 à l’aide d’un vecteur viral (AAV) a été autorisé (AMM en Mai 2019 aux Etats-Unis et une AMM conditionnelle en Mai 2020 en Europe). Son administration unique est plus aisée, car elle est réalisée par voie intraveineuse.
- Enfin, l’Evrysdi® (Risdiplam ou R07034067) a été autorisé encore plus récemment (AMM en Août 2020 aux Etats Unis et en Mars 2021 en Europe). Il s’agit d’une petite molécule qui agit sur la maturation du gène SMN2. Son administration se fait de manière quotidienne par voie orale ou par sonde d’alimentation.
[0010] Bien que la restauration du gène SMN ait permis une amélioration sans précédent au niveau des mesures fonctionnelles chez les patients ainsi que leur fonction motrice, d’importants déficits persistent chez les patients atteints de SMA après le traitement, et ce, même si l’intervention est précoce (Mercuri et al., 2018 ; Finkel et al., 2017 ; Baranello et al., 2018).
[001 1 ] Les études précliniques ont montré que ces déficits post-traitement se retrouvaient dans les modèles de souris SMA, où les animaux traités présentaient une espérance de vie réduite, un déficit au niveau du poids corporel et de la masse et de la fonction musculaires par rapport aux animaux sains (Passini et al., 2010 ; Hua et al, 2010, 201 1 ; Feng et al., 2016).
[0012] De plus, il subsiste malgré tout d’autres limites et des préoccupations importantes concernant ces traitements. Par exemple, le nusinersen doit être administré par injection intrathécale, très invasive, plusieurs fois par an. Ce mode d’administration est très difficile et parfois impossible pour des patients ayant subi des chirurgies pour des scolioses, ce qui exclut le nusinersen comme option thérapeutique pour ces patients. De plus, l’administration intrathécale permet une distribution spécifique au niveau du système nerveux central, ce qui signifie que tous les symptômes ne peuvent pas être entièrement couverts. Sur ce dernier aspect, l’onasemnogène bénéficie d’un avantage, car il est administré de manière intraveineuse, et permet une distribution systémique. Néanmoins, la question de la biodisponibilité du sérotype AAV9 est toujours ouverte, ainsi que le fait que l’expression transgénique à long terme devrait être limitée aux cellules postmitotiques comme les neurones (Chaytow et al., 2021 ). Bien que l’onasemnogène soit annoncé comme une thérapie ne nécessitant qu’une seule injection, il reste à savoir si le traitement durera tout au long de la vie des patients, ou si des rappels seront nécessaires.
[0013] Le risdiplam, quant à lui, est une thérapie systémique, moins invasive, par administration orale quotidienne. Cependant, dans la mesure où le risdiplam cible la machinerie d’épissage, il peut également affecter d’autres transcriptions, entraînant des effets secondaires non ciblés inconnus et incontrôlables. En effet, il a été décrit que le risdiplam semblait avoir un effet sur un régulateur de la division cellulaire à des concentrations élevées, faisant craindre des effets secondaires oncogéniques (Ratni et al., 2018).
[0014] Les phytoecdysones représentent une importante famille de stérols polyhydroxylés. Ces molécules sont produites pas diverses espèces de plantes (fougères, gymnospermes, angiospermes) et participent à leur défense contre les insectes ravageurs. La phytoecdysone majoritaire du règne végétal est la 20-hydroxyecdysone.
[0015] Le brevet FR 3 021 318 divulgue que les phytoecdysones, et plus particulièrement la 20-hydroxyecdysone (20E), ont fait l'objet de nombreuses études pharmacologiques. Ces études ont mis en avant les propriétés antidiabétiques et anabolisantes de cette molécule. Ses effets stimulants sur les synthèses protéiques dans les muscles sont observés chez le rat in vivo (Syrov et al., 2000 ; Tôth et al., 2008 ; Lawrence et al., 2012) et sur des myotubes murins C2C12 in vitro (Gorelick-Feldman et al., 2008). Certains des effets décrits ci-dessus dans des modèles animaux ont été retrouvés dans des études cliniques, encore peu nombreuses. Ainsi, la 20E favorise l’augmentation de la masse musculaire chez de jeunes sportifs (Simakin et al., 1988).
[0016] Enfin, le brevet français FR 19 02726 décrit en outre l’utilisation de phytoecdysones et de dérivés hémi-synthétiques de celles-ci pour le traitement de maladies neuromusculaires en particulier l’amyotrophie spinale infantile et la sclérose latérale amyotrophique (Latil et al., 2020).
[0017] Les éléments ci-dessus indiquent que, même si les thérapies qui augmentent l’expression de la protéine SMN peuvent avoir des effets importants sur l’évolution de la maladie et la qualité de vie des patients, il reste utile de trouver des approches thérapeutiques complémentaires qui permettraient de réduire les doses d’administration des traitements déjà autorisés, ou leur fréquence d’administration ou enfin d’améliorer les gains fonctionnels afin de réduire davantage le fardeau de la maladie.
Présentation de l'invention
[0018] La présente invention a pour objectif de fournir un traitement de l’amyotrophie spinale, ledit traitement étant amélioré par rapport aux traitements existants.
[0019] Les inventeurs ont découvert de manière inattendue que les phytoecdysones (notamment la 20E et des dérivés hémi-synthétiques de celle-ci) avaient un effet bénéfique et synergique lorsqu’ils sont utilisés en thérapie combinée avec un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, chez des mammifères atteints d’une amyotrophie spinale. En effet, l’utilisation de phytoecdysones et/ou d’au moins un dérivé hémi-synthétique de la 20-hydroxyecdysone, en combinaison avec un traitement utilisant un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, améliore par synergie de ces éléments les performances motrices et fonctionnelles ainsi que la survie et le poids d’animaux atteints d’amyotrophie spinale (SMA).
[0020] A cet effet, la présente invention vise au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour leur utilisation en thérapie combinée dans le traitement de l’amyotrophie spinale.
[0021 ] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, l’invention vise au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour leur utilisation en thérapie combinée dans le traitement d’une affection des motoneurones, ladite affection participant à la SMA.
[0022] Dans le contexte de la présente demande, le terme "thérapie combinée" désigne la co-administration d’au moins deux agents biologiquement actifs. Dans le cas de la présente invention, un premier agent actif est choisi parmi les phytoecdysones ou les dérivés hémi-synthétiques de 20- hydroxyecdysone ou est une composition comprenant au moins une phytoecdysones et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone, un deuxième agent actif étant le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle. La thérapie combinée peut comprendre une seule formulation ou plusieurs formulations. La co-administration peut être effectuée de façon simultanée ou séquentielle. La co-administration peut être effectuée par la même voie d’administration ou par des voies d’administration différentes. Elle est considérée comme une thérapie combinée tant que les effets des deux (ou plus) agents se chevauchent chez le sujet pour obtenir des effets cliniques supplémentaires, additifs ou synergiques.
[0023] Dans des modes particuliers de réalisation, l’invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.
[0024] Dans des modes de réalisations particuliers, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone, et ledit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle sont coadministrés.
[0025] Dans des modes de réalisations particuliers, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone, et ledit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle sont coadministrés au sein d’une même composition.
[0026] Dans des modes de réalisations particuliers, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone sont administrés par voie orale ou systémique au mammifère, et ledit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle est administré au mammifère par voie orale et/ou intrathécale et/ou intraveineuse.
[0027] Pour les administrations par voie orale, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone et/ou le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, est de préférence incorporée à une formulation pharmaceutique acceptable pouvant être administrée par voie orale.
[0028] L’augmentation de la production de protéine SMN peut être obtenue par thérapie génique ou par thérapie du gène. Selon un mode de mise en oeuvre de thérapie génique, le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN vise à apporter le gène SMN1 . Selon un mode de mise en oeuvre d’une thérapie du gène le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN est soit une petite molécule qui agit sur la maturation du gène SMN2, ou un oligonucléotide antisens (ASO) développé dans le but d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle en agissant sur l’épissage (maturation) du gène SMN2. Dans ce dernier cas, l’ASO vient moduler l’épissage de SMN2 ce qui permet d’augmenter l’inclusion de l’exon 7 dans l’ARNm de SMN2 et ainsi permet d’augmenter le nombre de protéines SMN générées ayant les acides aminés correspondant à l’exon 7 et correspondant donc à une protéine SMN fonctionnelle.
[0029] Ainsi, dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par thérapie génique ou par thérapie du gène.
[0030] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par apport du gène SMN1 .
[0031 ] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par action sur la maturation du gène SMN2.
[0032] Dans des modes de réalisations particuliers, le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle est un oligonucléotide antisens (ASO). Cet ASO a de préférence une séquence de 10 à 30 nucléotides, encore de préférence de 12 à 30 nucléotides, préférentiellement 12 à 25 nucléotides ou encore préférentiellement 15 à 20 nucléotides. Selon des modes de réalisation préférés de la présente invention, l’ASO a une séquence de 18 nucléotides. [0033] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention, l’ASO a la capacité d’induire l’inclusion de l’exon 7 dans la séquence du gène SMN2.
[0034] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention, l’ASO est complémentaire à au moins 50%, de préférence au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90%, de préférence au moins 95%, de manière préférée 98%, préférentiellement 100%, de la séquence de l’acide nucléique codant pour le pré-ARNm du gène humain SMN2.
[0035] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention, l’ASO est complémentaire à au moins 50%, de préférence au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90%, de préférence au moins 95%, de manière préférée 98%, préférentiellement 100%, d’une séquence appartenant à l’intron 6, à l’intron 7 ou à une partie de l’exon 7 et une partie d’un intron adjacent à l’exon 7, de l’acide nucléique codant pour le pré- ARNm du gène humain SMN2. De cette manière l’exon 7 est inclus dans l’ARNm de SMN2 ce qui permet l’obtention d’une protéine SMN fonctionnelle.
[0036] La séquence de l’acide nucléique codant pour le pré-ARNm du gène humain SMN2 est disponible sur Genbank sous la référence NG_008728, version NG_008728.1.
[0037] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO est une séquence identique ou similaire à au moins 50% avec la séquence SEQ ID NO : 1 donnée dans le listage de séquence déposé avec la présente demande (5'-TCACTTTCATAATGCTGG-3'), de préférence identique ou similaire à au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90% et de préférence identique ou similaire à 100%. La séquence SEQ ID NO : 1 est complémentaire à 18 bases de l’intron 7 (bases 10 à 27) du gène SMN2.
[0038] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO a une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29. Ces séquences permettent à l’ASO de cibler l’intron 7 du gène SMN2.
[0039] Lorsque la séquence de l’ASO présente un pourcentage d’identité ou similarité inférieur à 100 % par rapport à une des séquences listées ci- avant, elle peut présenter des insertions, délétions et/ou substitutions par rapport à cette séquence de référence.
[0040] Le pourcentage d’identité entre deux séquences d’ASO est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence d’un ASO dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
[0041 ] Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles une base nucléique est identique dans les deux séquences comparées, puis en divisant ce nombre de positions par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, le nombre obtenu étant multiplié par cent.
[0042] L’ASO est de préférence composé d’un squelette phosphodiester. Il peut posséder diverses modifications au niveau de son squelette et/ou de sa structure chimique afin d’augmenter sa stabilité et/ou son affinité pour l’ARN et/ou de présenter un avantage significatif en termes de pharmacocinétique.
[0043] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO comporte au moins une modification choisie parmi :
- une modification au niveau du groupement phosphate tel qu’un phosphorothioate, ou un méthylphosphanate, ou un phosphoroamidate,
- une modification chimique en position 2’ du ribose, tel qu’un 2’0-méthyl (2’OMe) ou un 2’0-méthoxyéthyl (2’MOE) ou un 2’ Fluoro (2’ F),
- au moins une modification de nucléobases telle que la méthylation de pyrimidine de type 5’ methylcytosine, 5-methyluridine/ribothymidine, ou « G-clamp », - au moins un changement substantiel dans la structure du sucre, conduisant à une variété de molécules, telles que les morpholinos (PMO pour « phosphoroamidate morpholino oligomer » en terminologie anglosaxonne) ou les acides nucléiques peptidiques (PNA pour « Peptide nucleic acid » en terminologie anglosaxonne) ou les oligonucléotides de type contraint (LNA pour « locked nucleic acid » en terminologie anglosaxonne ou cEt pour « 2’-4’-constrained ethyl » en terminologie anglosaxonne ou les tc-DNA pour tricyclo-ADN).
[0044] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO est de séquence identique ou similaire à au moins 50% avec la séquence SEQ ID NO : 23, de préférence identique ou similaire à au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90% et de préférence identique ou similaire à 100%. La séquence SEQ ID NO : 23 correspond à la séquence SEQ ID NO :1 avec 2'-O- méthoxyéthyl sur l’atome de carbone 2’ du désoxyribose pour chaque base, avec un squelette phosphorothioate, et avec des 5-méthyl cytosines à la place des cytosines. Le squelette phosphothioate améliore avantageusement la stabilité de l’ASO, les 5-méthyl cytosines permettent avantageusement de rendre l’ASO moins sensible aux nucléases et le 2'- O-méthoxyéthyl sur l’atome de carbone 2’ du désoxyribose permet de manière avantageuse de diminuer la réponse immune induite par l’administration de l’ASO.
[0045] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, l’ASO est administré à une dose comprise entre 0,01 et 10 mg par kilogramme chez l’humain. De préférence cette dose est administrée par jour ou par semaine.
[0046] Pour leur utilisation dans la présente invention, les phytoecdysones et les dérivés hémi-synthétiques de 20-hydroxyecdysone sont avantageusement purifiés au grade pharmaceutique.
[0047] Une phytoecdysone utilisable selon l’invention est par exemple la 20- hydroxyecdysone.
[0048] À cet effet, selon des modes particuliers de réalisation de la présente invention, ladite au moins une phytoecdysone est la 20-hydroxyecdysone. [0049] La 20-hydroxyecdysone et ses dérivés hémi-synthétiques sont avantageusement purifiés au grade pharmaceutique.
[0050] La 20-hydroxyecdysone utilisée est de préférence sous forme d’un extrait de végétaux riches en 20-hydroxyecdysone ou d’une composition comportant à titre d’agent actif la 20-hydroxyecdysone. Des extraits de végétaux riches en 20-hydroxyecdysone sont par exemple des extraits de Stemmacantha carthamoides (aussi appelée Leuzea carthamoides), Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga.
[0051 ] Les extraits obtenus sont de préférence purifiés au grade pharmaceutique.
[0052] Dans un mode de réalisation la 20-hydroxyecdysone est sous forme d’extrait de plante ou d’une partie de plante, ledit extrait comportant au moins 95%, et de préférence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. Ladite plante est de préférence choisie parmi les végétaux contenant au moins 0,5% de 20-hydroxyecdysone en poids sec dudit végétal. Ledit extrait est de préférence purifié au grade pharmaceutique.
[0053] Ledit extrait est appelé par la suite BIO101 . Il comporte de façon remarquable entre 0 et 0.5 %, en poids sec de l’extrait, d’impuretés, comme des composés mineurs, susceptibles d’affecter l’innocuité, la disponibilité ou l’efficacité d’une application pharmaceutique dudit extrait.
[0054] La plante à partir de laquelle est produit BIO101 est de préférence choisie parmi Stemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga.
[0055] Les dérivés hémi-synthétiques de 20-hydroxyecdysone sont obtenus par hémisynthèse et peuvent notamment être obtenus de la façon décrite dans la demande de brevet européenne n° EP 15732785.9.
[0056] Dans un mode de réalisation particulier, les phytoecdysones sont administrées à une dose comprise entre 3 et 15 milligrammes par kilogramme par jour chez l’humain. On entend ici par phytoecdysones, aussi bien les phytoecdysones de manière générale que la 20- hydroxyecdysone (notamment sous forme d’extrait) et ses dérivés hémisynthétiques.
[0057] De préférence, les phytoecdysones sont administrées à une dose de 200 à 1000 mg/jour, en une ou plusieurs prises, chez un humain adulte, et une dose de 5 à 350 mg/jour, en une ou plusieurs prises, chez l’humain enfant ou le nourrisson. On entend ici par phytoecdysone, aussi bien les phytoecdysones de manière générale que la 20-hydroxyecdysone (notamment sous forme d’extrait) et ses dérivés hémi-synthétiques.
[0058] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone est choisi parmi : - un composé de formule générale (I) :
[Chem. 1 ] dans laquelle :
R1 est choisi parmi : un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce)CO2(Ci- Ce); un groupement (Ci-Ce)A, A représentant un hétérocycle éventuellement substitué par un groupement de type OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-Ce) ; un groupement CH2Br ;
W étant un hétéroatome choisi parmi N, O et S, de préférence O et encore plus préférentiellement S ; et,
- un composé étant de formule (II) :
[Chem. 2]
[0059] Dans le cadre de la présente invention on entend par « (Ci-Ce) », tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaire ou ramifié, en particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso- butyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s’agit d’un groupe méthyle, éthyle, iso-propyle ou t-butyle, en particulier d'un groupe méthyle ou éthyle, plus particulièrement d’un groupe méthyle.
[0060] Dans le cadre de la présente invention on entend par hétérocycle de préférence un cycle comprenant 5 ou 6 atomes dont un ou deux hétéroatomes (O, S ou N), les atomes restants étant des atomes de carbone.
[0061 ] Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, dans la formule générale (I) :
R1 est choisi parmi : un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce) ; un groupement (Ci- C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6); un groupement (Ci-Ce)A, A représentant un hétérocycle éventuellement substitué par un groupement de type OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci- C6) ;
W étant un hétéroatome choisi parmi N, O et S, de préférence O et de préférence encore S.
[0062] Dans des modes particuliers de réalisation de la présente invention ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone est un composé choisi parmi les composés suivants : n° 1 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13-diméthyl-17- (2-morpholinoacétyl)-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one, n° 2 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(3- hydroxypyrrolidin-1 -yl)acétyl]- 10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17- décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 3 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(4-hydroxy-1 - pi péridyl)acétyl]-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 4 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-[4-(2- hydroxyéthyl)-1 -pipéridyl]acétyl]- 10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17- décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 5 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-diméthylaminopropyl (méthyl)amino)acétyl]-2,3,14-trihydroxy-10,13-diméthyl-
2, 3, 4, 5, 9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 6 : 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13- diméthyl-6-oxo-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-17-yl]éthyl]sulfanylacétate d’éthyle; n° 7 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-éthylsulfanylacétyl)-2,3,14- trihydroxy-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 8 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(2- hydroxyéthylsulfanyl)acétyl]-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17- décahydro-1 H cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one.
[0063] Selon un autre aspect, la présente invention vise une composition comprenant :
- au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone,
- au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour son utilisation dans le traitement d’une maladie neuromusculaire chez le mammifère, notamment une amyotrophie spinale.
[0064] Cette utilisation de la composition peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence à l’utilisation en thérapie combinée de ladite au moins une phytoecdysone et/ou d’au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone, et dudit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle.
[0065] Dans des modes de réalisation la composition est incorporée à une formulation pharmaceutique acceptable pouvant être administrée par voie orale ou par voie intrathécale ou par voie systémique.
[0066] Dans le cadre de la présente invention on entend par « pharmaceutique acceptable >> ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique, qui est généralement sûr, non toxique et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine.
Brève description des figures
[0067] L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent :
[0068] [Fig. 1 ] la Figure 1 représente la courbe de l’évolution pondérale de souris SMA (SmnA7/A7; huSMN2+/_) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10-27 seul, ou avec une combinaison ASO 10- 27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO) jusqu’à la mort des souris. Ici et dans la suite de la description, P correspond au nombre de jours après la naissance (post natal) ;
[0069] [Fig. 2] la figure 2 est une représentation de Kaplan-Meier des courbes de survie des souris SMA (SmnA7/A7; huSMN2+/_) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10-27 seul, ou avec une combinaison ASO 10-27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO) ;
[0070] [Fig. 3] la figure 3 représente les performances motrices (capacités de déplacement) évaluées par le test open field des souris SMA (SmnA7/A7; huSMN2+/_) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10-27 seul, ou avec une combinaison ASO 10-27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO) ;
[0071 ] [Fig. 4] la figure 4 représente les performances motrices (fatigabilité musculaire) évaluées par le grip-test des souris SMA (SmnA7/A7; huSMN2+/_ ) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10- 27 seul, ou avec une combinaison ASO 10-27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO).
[0072] Pour chacune des figures, les résultats sont présentés en moyenne ± SEM avec *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 et ****p<0.0001 .
[0073] Dans la suite de la description, n correspond à la taille de l’échantillon et p correspond à la « p-valeur >> utilisée pour quantifier la significativité statistique d’un résultat. De plus, p=ns indique la non-significativité de la p- valeur.
Description des modes de réalisation
[0074] L’invention sera décrite ci-après dans le contexte particulier d’un de ses domaines d’application préférés, non limitatif.
[0075] 1 . Description et injection de l’oligonucléotide antisens (ASO)
[0076] L’oligonucléotide antisens (ASO) de séquence SEQ ID NO : 23 (5'- TCACTTTCATAATGCTGG-3'), de référence ISIS 396443, aussi connu sous le nom ISIS-SMNRx, et appelé dans la suite de la description ASO 10- 27, complémentaire à 18 bases (bases 10 à 27) de l’intron 7 du gène SMN2 (ciblant un site de l’intron 7, appelé ISS-N1 , qui réprime l’inclusion de l’exon 7 de l’ARN pré-messager (pré-ARNm) du gène SMN2) possédant des nucléotides modifiés 2'-0-methoxyethyl sur l’atome de carbone 2’ du désoxyribose pour chaque base, avec un squelette phosphorothioate et des 5-methyl cytosines et l’ASO contrôle (noté mismatch) de séquence SEQ ID NO : 24 (5'-TTAGTTTAATCACGCTCG-3') (Singh et al. 2006 ; Williams et al. 2009), ont été synthétisés et purifiés tel que décrit précédemment (Baker et al. 1997, Hua et al. 2008 ; Passini et al., 201 1 ). Les oligonucléotides sont re-suspendus à la concentration de 8pg/uL dans du NaCI 0,9% et conservés à -20°C.
[0077] Le jour de l’injection, la solution stock d’ASO est diluée à la concentration de 2pg/pL dans du NaCI 0,9%. Du bleu de méthylène 0,04% est ajouté dans la solution comme témoin d’injection. Les souriceaux SMA nouveau-nés reçoivent une dose unique d’ASO 10-27 ou d’ASO mismatch de 8pg au 1 er jour postnatal (PO) par injection intra-cérébro-ventriculaire unilatérale à l’aide d’une seringue Hamilton et d’une aiguille 32G. Le site d’injection est situé à 1 mm de la suture sagittale, entre bregma et lambda, points de repères visibles à travers la peau à PO. L’aiguille est positionnée perpendiculairement au site d’injection à la surface de la peau et insérée à environ 3mm de profondeur pour atteindre le ventricule latéral.
[0078] 2. Co-administration de BIO1 Q1
[0079] Le traitement complémentaire BIO101 complexé à la cyclodextrine est administré quotidiennement aux souriceaux dès le premier jour post-natal (PO) par voie orale à la dose de 50mg/kg à l’aide d’une pipette.
[0080] 3. Activité biologique de BIO1 Q1 en combinaison avec l’ASO
[0081 ] a. Analyse des effets du traitement combiné ASO 10-27 + BIO101 sur le poids et la survie
[0082] Un modèle de souris SMA sévère a été utilisé sur fond génétique FVB/NRj, caractérisé par l’invalidation de l’exon 7 du gène murin Smn et exprimant deux copies du transgène humain SMN2 (SmnA7/A7 ; huSMN2-/+) (Hsieh et al., 2000). Les souris issues de ces croisements ayant le génotype « FVB/NRj-SmnA7/A7 huSMN27+ 2 copies >> sont décrites comme « SMA >> (Hsieh ét al., 2000). Les souris SMA ont été traitées soit avec BIO101 seul ou un ASO mismatch ou un ASO 10-27 seul, ou avec un traitement combiné ASO 10-27 + BIO101 à partir de PO. La survie (Figure 1 ) et le poids (Figure 2) des souris ont été analysés quotidiennement.
[0083] La durée de vie moyenne des souriceaux (Figure 1 ) traités avec BIO101 seul (1 1 jours) est sensiblement identique à celle des souriceaux traités avec l’ASO mismatch (13 jours). Tel que décrit en 201 1 par Passini et al., le traitement avec l’ASO 10-27 seul à la dose de 8pg augmente significativement la durée de vie moyenne des souriceaux SMA, avec une médiane de survie de 18 jours (amélioration de 38% de la survie des animaux), contre une médiane de survie de 13 jours dans le groupe contrôle ASO mismatch. Lorsque le traitement BIO101 est administré en combinaison avec l’ASO 10-27 la médiane de survie augmente à 22,5 jours, soit une amélioration de 73% de la survie des animaux.
[0084] Le poids des souriceaux (Figure 2) traités avec BIO101 seul est comparable à celui des souriceaux traités avec l’ASO mismatch tout au long de leur vie.
[0085] Le traitement avec l’ASO 10-27 seul n’augmente pas le poids moyen des souriceaux SMA par rapport au traitement contrôle avec l’ASO mismatch à P7, mais il l’augmente significativement de 9,9% à P8 et 13,9% à P9. La combinaison ASO 10-27 + BIO101 induit un effet synergique sur le poids des souriceaux SMA avec une augmentation significative de 1 1 ,3% à P7, 16,5% à P8 et 24,9% à P9.
[0086] A P10, le traitement avec l’ASO 10-27 seul augmente significativement le poids moyen des souriceaux SMA (+16%) par rapport au traitement contrôle avec l’ASO mismatch. En combinaison avec l’ASO 10-27, BIO101 induit un effet synergique sur le poids des souriceaux SMA avec une augmentation significative de +30,9% à P10 (p<0.05), soit quasiment 2 fois plus élevée que celle observée avec l’ASO 10-27 seul.
[0087] Cette augmentation du poids corporel des souriceaux traités avec l’ASO 10- 27 + BIO101 par rapport à celui des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul continue jusqu’à leur mort, avec notamment une augmentation significative de 33% à P15 (p<0.05), de 49,4% à P20 (p<0.05), de 57,6% à P25 (p<0.01 ).
[0088] b. Analyse des effets fonctionnels du traitement combiné ASO 10-27 + BIO101
[0089] Nous avons effectué des analyses phénotypiques des souris SMA sévère de type 2 traitées avec BIO101 seul ou un ASO mismatch ou un ASO 10- 27 seul, ou avec un traitement combiné ASO 10-27 + BIO101 à partir de PO. Nous avons effectué un suivi longitudinal des capacités motrices des souris. Nous avons, d’une part, évalué les capacités de déplacement par le test open-field (Figure 3), ainsi que la fatigabilité musculaire par grip-test (Figure 4), tels que décrits précédemment (Biondi et al., 2008 ; Branchu et al., 2013 ; Chali et al., 2016).
[0090] Le dispositif utilisé pour test en open-field est constitué d'une boîte en plastique de 28 x 28 x 5 cm avec un quadrillage du champ divisé en 16 carreaux de 7 cm x 7 cm. Les souris ont été testées individuellement et le dispositif d’évaluation a été lavé après chaque session. Chaque souris initialement placée au centre du champ a pu se déplacer librement pendant 5 minutes avec une stimulation par pincement de la queue toutes les 15 secondes. Les mesures comportementales sont enregistrées par l'expérimentateur pendant ces 5 minutes et le nombre total de carreaux croisés a été relevé. [0091 ] Le traitement BIO101 , qu’il soit administré seul ou en combinaison avec l’ASO 10-27, accélère l’acquisition de la marche avec une tendance à l’augmentation du déplacement des souriceaux à P15 (1 10±18 carreaux soit +58% avec le traitement BIO101 seul, et 100±19 carreaux soit + 44% avec le traitement ASO 10-27 + BIO101 ) par rapport aux souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul (70±20 carreaux).
[0092] À partir de P23, les capacités de déplacement des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 + BIO101 tendent à être augmentées par rapport à celles des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul (+51 ,3%, p=ns), et sont significativement augmentées à P25 (+38,4%, p<0.05), ou encore à P27 (+44,9%, p<0.01 ) (Figure 3).
[0093] Pour évaluer la fatigabilité musculaire, la force de préhension des pattes antérieures des souris a été testée. Les souris sont suspendues par leurs pattes antérieures à une fine tige métallique suspendue en l’air, de manière horizontale. Le temps passé à s'accrocher est relevé. Chaque souris a été soumise à cinq tentatives successives avec une période de repos d’une minute entre deux tests. Seul le meilleur essai est conservé pour l’évaluation des fonctions musculaires.
[0094] A P7 la résistance à la fatigue des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul n’est pas améliorée par rapport à celle des souriceaux traités avec l’ASO mismatch. La résistance à la fatigue des souriceaux traités avec BIO101 seul est quant à elle améliorée de 19,3%. A P15 les résistances à la fatigue des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul et avec BIO 101 seul sont toutes les deux supérieures (+7,7%) à celle des souriceaux traités avec l’ASO mismatch. De manière étonnante et avantageuse, une synergie opère entre BIO101 et l’ASO 10-27 lors du traitement combiné de sorte que la résistance à la fatigue des animaux SMA traités augmente de 26,3% à P7 et de 21 ,2% à P15.
[0095] A partir de P19, la résistance à la fatigue des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 + BIO101 tend à augmenter par rapport à celle des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul. Cette différence devient évidente à partir de P21 (+54% dans le groupe traité avec la combinaison ASO 10-27 + BIO101 par rapport à l’ASO 10-27 seul, p=ns), puis à P23 (+159,2%, p<0,05), à P25 (+337,7%, p<0.05) ou encore à P27 (+296,7%, p=0,07). Ces différences importantes sont maintenues jusqu’à P35. A partir de P39, ces différences sont moins marquées mais le groupe de souris traitées en combinaison ASO 10-27 + BIO101 conserve néanmoins une résistance à la fatigue supérieure à celle observée dans le groupe traité à l’ASO 10-27 seul (Figure 4).
[0096] 4. Conclusion
[0097] Ces résultats démontrent l’intérêt de l’utilisation du traitement BIO101 , en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l’expression de la protéine SMN, en particulier grâce à une approche thérapeutique à l’aide d’ASOs ayant pour effet de restaurer l’expression de la protéine SMN.
[0098] En effet, cette thérapie combinée montre des effets bénéfiques importants dans un modèle murin de SMA, en particulier au niveau du poids des animaux, et de manière encore plus importante, au niveau des performances physiques de ces animaux, qu’il s’agisse des capacités de déplacement ou de la résistance à la fatigue de l’animal.
[0099] La combinaison de traitement ASO 10-27 + BIO101 , au-delà d’améliorer les performances obtenues par le traitement d’un ASO 10-27 en monothérapie, possèdent incontestablement un effet synergique.
[00100] De manière plus générale, il est à noter que les modes de mise en oeuvre et de réalisation de l’invention considérés ci-dessus ont été décrits à titre d’exemples non limitatifs et que d’autres variantes sont par conséquent envisageables.
[00101 ] Notamment, l’invention a été décrite en considérant principalement l’ASO 10-27 de séquence SEQ ID NO : 23. Rien n’exclut cependant, dans d’autres types de réalisation, de considérer d’autres principes actifs ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN comme d’autres ASO ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN. De tels ASO sont par exemple les ASO de séquence choisie parmi : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29. [00102] Ces séquences sont notamment données dans le tableau 1 ci-dessous :
[Table 1]
[00103] Bibliographie
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Claims

28/34 Revendications Revendication 1 . Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour leur utilisation dans le traitement de l’amyotrophie spinale chez le mammifère. Revendication 2. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon la revendication 1 , pour leur utilisation dans le traitement d’une affection des motoneurones responsable de l’amyotrophie spinale. Revendication 3. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon la revendication 2, dans laquelle l’affection des motoneurones est une altération de la fonction des motoneurones ou leur dégénérescence. Revendication 4. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par thérapie génique ou par thérapie du gène. Revendication 5. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par apport du gène SMN1 ou par action sur la maturation du gène SMN2. Revendication 6. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle est un oligonucléotide antisens. Revendication 7. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon la revendication 6, dans laquelle l’oligonucléotide antisens comporte de 10 à 30 nucléotides. Revendication 8. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 7, dans laquelle l’oligonucléotide antisens est complémentaire à au moins 90%, de préférence au moins 95%, de manière préférée au moins 98%, préférentiellement 100%, de la séquence de l’acide nucléique codant pour le pré-ARNm du gène humain SMN2. Revendication 9. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle l’oligonucléotide antisens est complémentaire à au moins 90%, de préférence au moins 95%, de manière préférée 98%, préférentiellement 100%, d’une séquence appartenant à l’intron 6, à l’intron 7 ou à l’exon 7 de l’acide nucléique codant pour le pré-ARNm du gène humain SMN2. Revendication 10. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l’oligonucléotide antisens est une séquence identique ou similaire à au moins 50% avec la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence identique ou similaire à au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90% et de préférence identique ou similaire à 100%. Revendication 1 1. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l’ASO a une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29. Revendication 12. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 11 , dans laquelle l’ASO comporte au moins une modification choisie parmi : - une modification au niveau du groupement phosphate tel qu’un phosphorothioate, ou un méthylphosphanate, ou un phosphoroamidate, - une modification chimique en position 2’ du ribose, tel qu’un 2’0-méthyl (2’OMe) ou un 2’0-méthoxyéthyl (2’MOE) ou un 2’ Fluoro (2’ F), - au moins une modification de nucléobases telle que la méthylation de pyrimidine de type 5’ methylcytosine, 5-methyluridine/ribothymidine, ou « G- clamp » , - au moins un changement substantiel dans la structure du sucre, conduisant à une variété de molécules, telles que les morpholinos ou les acides nucléiques peptidiques ou les oligonucléotides de type contraint. Revendication 13. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l’oligonucléotide antisens est une séquence identique ou similaire à au moins 50% avec la séquence SEQ ID NO : 23, de préférence identique ou similaire à au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90% et de préférence identique ou similaire à 100%. Revendication 14. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle ladite au moins une phytoecdysone est la 20-hydroxyecdysone. Revendication 15. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon la revendication 14, dans laquelle la 20-hydroxyecdysone est sous forme d’extrait de plante ou d’une partie de plante, ledit extrait comportant au moins 95%, et de préférence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. Revendication 16. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, dans laquelle ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone est choisi parmi : - un composé de formule générale (I) :
[Chem. 1 ] dans laquelle :
R1 est choisi parmi : un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce) ; un groupement (Ci- C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6); un groupement (Ci-Ce)A, A représentant un hétérocycle éventuellement substitué par un groupement de type OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci- Ce) ; un groupement CH2Br ;
W étant un hétéroatome choisi parmi N, O et S, de préférence O et encore plus préférentiellement S ; et,
- un composé étant de formule (II) :
[Chem. 2]
Revendication 17. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon la revendication 16, dans laquelle dans la formule générale (I) : R1 est choisi parmi : un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce) ; un groupement (Ci- C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6); un groupement (Ci-Ce)A, A représentant un hétérocycle éventuellement substitué par un groupement de type OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-Ce) ;
W étant un hétéroatome choisi parmi N, O et S, de préférence O et de préférence encore S.
Revendication 18. Au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 16 à 17, dans laquelle au moins un composé de formule générale (I) est choisi parmi : n° 1 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13-diméthyl-17-(2- morpholinoacétyl)-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one, n° 2 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(3- hydroxypyrrolidin-1 -yl)acétyl]- 10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17- décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 3 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(4-hydroxy-1 - pi péridyl)acétyl]-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 4 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-[4-(2- hydroxyéthyl)-1 -pipéridyl]acétyl]- 10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17- décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 5 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-diméthylaminopropyl
(méthyl)amino)acétyl]-2,3,14-trihydroxy-10,13-diméthyl-
2, 3, 4, 5, 9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 6 : 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13- diméthyl-6-oxo-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-17-yl]éthyl]sulfanylacétate d’éthyle; n° 7 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-éthylsulfanylacétyl)-2,3,14- trihydroxy-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 8 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(2-hydroxyéthyl sulfanyl)acétyl]-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one.
Revendication 19. Composition comprenant :
- au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone,
- au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour son utilisation dans le traitement de l’amyotrophie spinale chez le mammifère.
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