EP4408971A1 - Structuration d'un ensemble d'objets du type cellules et particules micrometriques par force acoustique - Google Patents

Structuration d'un ensemble d'objets du type cellules et particules micrometriques par force acoustique

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Publication number
EP4408971A1
EP4408971A1 EP22793163.1A EP22793163A EP4408971A1 EP 4408971 A1 EP4408971 A1 EP 4408971A1 EP 22793163 A EP22793163 A EP 22793163A EP 4408971 A1 EP4408971 A1 EP 4408971A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
objects
cavity
acoustic
fluid
cells
Prior art date
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Pending
Application number
EP22793163.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Chloé DUPUIS
Jean-Luc Aider
Jean-Michel Peyrin
Mauricio Hoyos
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Sorbonne Universite
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Sorbonne Universite
Universite Paris Cite
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI, Sorbonne Universite, Universite Paris Cite filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/20—Heating or cooling

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology and in particular to the structuring of cellular assemblies, for example with a view to reconstructing or modeling living tissues.
  • the invention is of particular but in no way limiting interest in the sectors of cell therapy, pharmacological modelling, the food industry, for example for the culture of meat, micro-algae or plants, or even aerospace, in particular for cell culture in microgravity conditions.
  • organ-on-a-chip in English
  • organoids organoids
  • the techniques most used for this purpose include the manipulation of cells within microfluidic devices and the formation of tissues by additive manufacturing.
  • Another known technique consists in structuring cells by acoustic levitation: Bouyer et al. A bio-Acoustic Levitational (BAL) Assembly Method for Engineering of Multilayered, 3D Brain-Like Constructs, Using Human Embryonic Stem Cell Derived Neuro-Progenitors, Adv. Mater. 2016, 28, 161-167.
  • BAL bio-Acoustic Levitational
  • a step of generating a standing acoustic wave in the cavity so as to produce an acoustic radiation force resulting in a displacement of the objects in the cavity said objects comprising: o first objects which present a positive acoustic contrast with respect to the fluid , and o second objects which present a negative acoustic contrast with respect to the fluid.
  • the propagation of a standing acoustic wave in the cavity makes it possible to form in the cavity, along the direction of propagation, one or more nodes, that is to say places where the pressure of the fluid is zero, and a or several bellies or anti-nodes, that is to say places where this pressure is maximum.
  • the first objects having an acoustic contrast that is to say a density-compressibility factor, positive with respect to the fluid, these will be transported by the acoustic radiation force towards a pressure node.
  • the invention thus makes it possible to form in the cavity one or more aggregates of first objects and one or more aggregates of second objects in the form of layers, or sheets, which follow one another along the direction of propagation, this extremely quickly - typically in seconds - and using hardware that is particularly simple to implement and inexpensive.
  • Such a layered structure resembles the structure of human organ tissues which typically include layers of cells separated by layers of extracellular matrix.
  • the epithelia in particular cardiac or pulmonary or endothelial, may comprise differentiated or non-differentiated layers which rest in a certain number of cases on basal laminae of a protein nature, for example epithelial or muscle cells.
  • the blood-brain barrier or the cerebral parenchyma typically comprise layers of interconnected neurons.
  • the invention makes it possible to maintain in acoustic levitation all the objects thus structured, under the action of the standing acoustic wave, the generation of which can be maintained for the required duration, for example several hours or days, in order to promote interactions between objects when they are alive, in particular when they are formed by biological cells.
  • the invention thus makes it possible to carry out a cell culture in acoustic levitation, by controlling the permeability and consequently the development of the connections and interactions between layers of cells forming the first objects, by a choice of second objects forming one or more layers of chosen porosity. .
  • This innovative approach also makes it possible to limit the contact of objects with walls or surfaces, thus preserving their mechanical and functional integrity.
  • an “object” designates a living or inert element preferably having a small size compared to the length of the acoustic wave generated in the cavity.
  • the objects can typically have a micrometric size, for example between 1 ⁇ m and 100 or several hundreds of ⁇ m.
  • said first objects are living elements such as biological cells, for example of the eukaryotic or prokaryotic type.
  • Said second objects can themselves be inert elements such as particles comprising a hydrogel, for example based on collagen, gelatin, or even fibrin and extracellular matrix protein.
  • the second objects can comprise a compressible elastomer, for example polydimethylsiloxane.
  • the invention can however be implemented with objects of different size, that is to say located outside the aforementioned range.
  • the objects or some of them may have a size of less than 1 ⁇ m, being for example formed by bacteria or viruses, and/or have a size of several hundreds of ⁇ m.
  • the objects in particular the first objects, or some of them, can be multi-cellular elements or artificially formed objects or else objects taken from an organ.
  • the fluid in which the objects are suspended is preferably a liquid which, depending on the application envisaged, can comprise water or form a culture medium.
  • the invention thus provides a simple solution for reconstituting artificial tissues for research purposes or even in the context of cell therapies.
  • the invention moreover provides a particularly precise solution in terms of positioning objects in space and which makes it possible, if necessary, to control the development of intercellular interactions.
  • the standing acoustic wave generated in the cavity has a wavelength less than twice a dimension of the cavity in a direction of propagation of the standing acoustic wave.
  • this wavelength is less than or equal to this dimension.
  • the standing acoustic wave has at least one antinode and at least one or two nodes.
  • hydrogel or compressible elastomer to form the second objects makes it possible to form a porous intermediate layer, allowing the development of interactions between the layers of first objects extending from either side of this intermediate layer, when the first objects comprise living cells.
  • the invention not only makes it possible to produce a cell culture in acoustic levitation but also, alternatively or additionally, to initiate or continue such a process by maintaining the objects in position using a matrix.
  • the method may comprise, after positioning the objects under the action of the acoustic radiation force, a step of introducing a substance into the cavity so as to form a matrix capable of supporting the first objects.
  • This substance is preferably a biocompatible active substance promoting the phase change of the medium constituted by the fluid.
  • This substance may comprise a hydrogel prepolymer or other element capable of forming a matrix in the form of a gel.
  • This substance may include a catalyst and/or a photoinitiator.
  • a matrix in the form of a gel makes it possible to adequately maintain the objects in position in space while being elastically deformable. Furthermore, it is preferred that the matrix be porous, whether it is in the form of a gel or in another form.
  • the porosity of the matrix makes it permeable and perfusable, so as to allow the development of cellular connections.
  • said substance comprises a photopolymerizable material
  • the method comprising, after introduction of the substance into the cavity, a step of light stimulation of the substance so as to polymerize it.
  • the invention thus makes it possible to sculpt a support matrix for the structured set of objects, in particular the first objects.
  • the method may comprise, after positioning the objects under the action of the acoustic radiation force, a step of incubating the objects.
  • the cavity and its contents can be placed in an incubator for this purpose.
  • Incubation promotes the differentiation, self-organization and maturation of cell layers.
  • the method comprises, after positioning the objects under the action of the acoustic radiation force, a step of heating the second objects so as to merge them.
  • the heating step can be carried out using a laser sheet.
  • Such a heating step is preferably carried out before forming this matrix.
  • the method comprises, after positioning the objects under the action of the acoustic radiation force, a step of encapsulating the first objects.
  • this encapsulation step comprises an introduction into the cavity of third objects having a positive acoustic contrast with respect to the fluid.
  • the third objects can thus be transported by the force of acoustic radiation towards a pressure node to form around the first objects which are there a protective shell.
  • the third objects can comprise hydrogel balls or another material making it possible to form a porous protective shell.
  • the encapsulation step is preferably implemented, but not necessarily, when the use of a support matrix is not resorted to.
  • the invention can also be implemented for cell therapy purposes, for example by in vivo injection of a culture or proto-culture produced using the principles described in this document.
  • Fig. 1 is a schematic view of a device comprising a cavity and a transducer able to generate a standing acoustic wave in the cavity, the cavity containing a fluid with objects in suspension which are distributed relatively homogeneously in the cavity before undergoing the acoustic wave effects;
  • Fig. 2 is a schematic view of the device of FIG. 1, in which the objects have been moved by an acoustic radiation force produced by the acoustic wave so as to be respectively aligned on a node or an antinode of this wave;
  • Fig. 3 is a schematic view illustrating a phenomenon of diffusion between layers of cells
  • Fig. 4 is a schematic view illustrating a phenomenon of development of cell extensions
  • Fig. 5 is a schematic view illustrating a cell migration phenomenon
  • Fig. 6 is a schematic view of the device of FIG. 2, the objects being maintained in the configuration of FIG. 2 using a gel matrix.
  • This device comprises on the one hand a receptacle which forms a cavity 1 capable of containing a fluid and/or various substances in the form, for example, of a liquid or else of a gel.
  • the cavity 1 extends along a direction Al, which in this example corresponds to a vertical direction.
  • Cavity 1 has along direction Al a dimension B1 which corresponds in this example to a height of cavity 1.
  • the cavity 1 here has a generally cylindrical shape.
  • the cavity 1 can have another geometry, for example a rectangular section.
  • the device of FIGS. 1 and 2 comprises an acoustic wave generation system.
  • this system comprises a piezoelectric transducer 2 arranged at the level of a first end of the cavity 1 in the direction Al, in this case vertically below the cavity 1, as well as an acoustic reflector 3 which delimits a second end of the cavity 1 in the direction Al, in this case being arranged vertically above the cavity 1.
  • This system is configured to be able to generate in the cavity 1 and to propagate in the fluid that it contains a standing acoustic wave 4, according to a direction of propagation which corresponds to the direction Al.
  • the standing wave 4 thus generated can have a frequency identical to the resonance frequency of the cavity 1, which consequently forms a resonator.
  • this standing wave 4 can have a different frequency from the resonant frequency of cavity 1.
  • the system is configured to be able to generate, in particular, a wave 4 having a wavelength A less than or equal to twice the height B1 of the cavity 1, in order to form along the direction Al at least a pressure node and at least one pressure belly.
  • the transducer 2 is a broadband transducer equipped with an ultrasonic source.
  • Such a transducer 2 makes it possible to modify the position of the node(s) of wave 4 along the direction Al and/or the distance between different nodes of wave 4, by varying the frequency of this wave 4.
  • the device which has just been described, or any similar device, is implemented in order to position objects of small size, typically of micrometric size, within the cavity 1 according to a spatial organization determined by one or more parameters of wave 4, in particular its frequency.
  • the cavity 1 is filled with a fluid 5 and objects 6 and 7 suspended in this fluid 5.
  • the objects 6 are biological cells
  • the fluid 5 forms a culture medium for these cells 6
  • the objects 7 are polydimethylsiloxane beads.
  • each of the objects 6 and 7 has a size between 1 ⁇ m and 100 ⁇ m and the height B1 of the cavity 1 is several centimeters.
  • each of the objects 6 has a density p 01 greater than the density p of the fluid 5.
  • each of the objects 7 has a density p 01 less than the density p of the fluid 5.
  • the objects 6 are also chosen so that the speed c 01 of propagation of an acoustic wave in these objects 6 is greater than the speed c of propagation of this acoustic wave in the fluid 5.
  • the objects 7 are chosen so that the speed c o2 of propagation of the acoustic wave in these objects 7 is lower than the speed c of propagation of this acoustic wave in the fluid 5.
  • the transducer 2 After placing the fluid 5 in the cavity 1 and the objects 6 and 7 suspended in the fluid 5 in the manner illustrated in Figure 1, the transducer 2 is actuated so as to generate a standing acoustic wave 4 in the cavity 1.
  • This wave 4 makes it possible to produce an acoustic radiation force which is exerted on the objects 6 and 7.
  • This acoustic radiation force FRA can in particular be described according to the following model, known per se, by K. Yosioka and Y. Kawasima:
  • v 0 is the speed of wave 4
  • k the wave number
  • F y a density-compressibility factor
  • z the position of the object 6 or 7 considered along the direction Al, c i.e. along the direction of propagation of wave 4.
  • the density-compressibility factor F y can be defined as follows: where p ox is the density p 01 or p o2 of the object 6, or respectively 7, considered, and c ox is the propagation speed c 01 or c o2 of wave 4 within object 6, or respectively 7, considered.
  • the objects 6 Given the respective density and the respective speed of propagation of the acoustic wave of the objects 6 and 7 with respect to the fluid 5, the objects 6 have a positive density-compressibility factor, or acoustic contrast, while that the objects 7 have a negative density-compressibility factor, or acoustic contrast.
  • the wave 4 has a wavelength A equal to the height B1 of the cavity 1, respectively forming along the direction Al a first node at a coordinate Cl, an antinode at a C2 coordinate and a second node at a C3 coordinate.
  • the invention thus makes it possible to spatially organize the objects 6 and 7 in the form of spaced layers along the direction Al and to keep them thus positioned in acoustic levitation, under the action of the wave 4.
  • the objects 7 form an intermediate layer, located at mid-height of the cavity 1, while the objects 6 form two layers extending on either side of the intermediate layer.
  • the objects 7 being polydimethylsiloxane beads, their aggregation or grouping in the form of a layer makes it possible to form a porous barrier which allows the development of interactions between the layers of cells 6, this without contact with the walls of the cavity 1.
  • the invention thus makes it possible to produce a cell culture in acoustic levitation.
  • the invention also makes it possible to control the interactions between layers of cells 6 since it is in particular possible to choose different materials, geometries and sizes for the objects 7, these parameters having a direct impact on the porosity of the barrier which they constitute under the action of the acoustic radiation force.
  • it is thus possible to trigger or authorize the diffusion of solutes or cell secretion 10 (FIG. 3), the development of cell extensions 11 of the neuronal axon type (FIG. 4), or even the migration of cells 6 (Figure 5).
  • the objects 7 comprise hydrogel particles which, after positioning under the action of the acoustic radiation force as described below, submerged by local heating, for example using a laser sheet.
  • the invention also makes it possible to continue the cell culture, or to initiate it after positioning the objects 6 and 7 in the manner described above, by producing in the cavity 1 a support matrix.
  • a substance based on hydrogel prepolymer can be introduced into the cavity 1.
  • Such a substance makes it possible to form a porous matrix 20 in the form of a gel, making it possible to support the layers of objects 6 and 7 (FIG. 6).
  • this substance also comprises a photopolymerizable material which is subjected, after introduction into the cavity 1, to a light stimulation resulting in the polymerization of the matrix.
  • the acoustic wave 4 can then be interrupted so that the cell culture occurs within such a matrix, for example by placing the container in an incubator.
  • the invention makes it possible to reconstruct and stimulate complex architectures comprising different layers of cells separated by a variety of objects making it possible to control the interactions between the cellular layers, using a method and a device that are particularly simple to implement.

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Abstract

L'invention se rapporte à une technique permettant de déplacer différents objets tels que des cellules (6) et des particules (7) d'hydrogel ou d'un matériau compressible, en suspension dans un fluide (5), de manière à former une structure en couches semblable à un tissu d'organe humain. Une onde acoustique stationnaire (4) est propagée dans le fluide (5), de manière à positionner les cellules (6) sur un nœud de pression et les particules (7) sur un ventre de pression. A cet effet, les cellules (6) ont un contraste acoustique positif par rapport au fluide (5), tandis que les particules (7) ont un contraste acoustique négatif par rapport au fluide (5).

Description

Description
Titre : Structuration d'un ensemble d'objets du type cellules et particules micrométriques par force acoustique
Domaine technique
L'invention se rapporte au domaine de la biotechnologie et en particulier de la structuration d'ensembles cellulaires, par exemple en vue de reconstruire ou de modéliser des tissus vivants.
L'invention présente un intérêt particulier mais nullement limitatif dans les secteurs de la thérapie cellulaire, de la modélisation pharmacologique, de l'agro-alimentaire par exemple pour la culture de viande, de micro-algues ou de végétaux, ou encore de l'aérospatial, notamment pour la culture cellulaire en conditions de microgravité.
État de la technique antérieure
Dans le contexte de la recherche portant sur la reconstruction et la modélisation d'organes sur puces (« organ-on-a-chip » en anglais) et d'organoïdes, un nombre croissant d'approches expérimentales visent à permettre la structuration d'ensembles cellulaires.
Les techniques les plus utilisées dans cet objectif incluent la manipulation de cellules au sein de dispositifs microfluidiques et la formation de tissus par fabrication additive.
Une autre technique, décrite dans le document suivant, connue consiste à structurer des cellules par lévitation acoustique : Bouyer et al. A bio-Acoustic Levitational (BAL) Assembly Method for Engineering of Multilayered, 3D Brain-Like Constructs, Using Human Embryonic Stem Cell Derived Neuro-Progenitors, Adv. Mater. 2016, 28, 161-167. Cette technique permet de structurer des cellules en couches dans l'objectif d'établir des connexions entre cellules de différentes couches mais ne permet pas toutefois pas de contrôler de manière satisfaisante le développement de telles connexions.
De manière générale, les techniques connues dans ce domaine sont complexes et coûteuses, peuvent nécessiter des durées importantes pour structurer et cultiver des cellules et, dans la mesure où elles sont mises en œuvre in vitro, peuvent entraîner la mort d'un grand nombre de cellules. Exposé de l'invention
Dans le but de surmonter les inconvénients précités, il est proposé dans le cadre de la présente invention un procédé de structuration d'un ensemble d'objets, comprenant :
- une étape de disposition dans une cavité d'un fluide et desdits objets en suspension dans le fluide, et
- une étape de génération d'une onde acoustique stationnaire dans la cavité de manière à produire une force de radiation acoustique entraînant un déplacement des objets dans la cavité, lesdits objets comprenant : o des premiers objets qui présentent un contraste acoustique positif par rapport au fluide, et o des deuxièmes objets qui présentent un contraste acoustique négatif par rapport au fluide.
La propagation d'une onde acoustique stationnaire dans la cavité permet de former dans la cavité, le long de la direction de propagation, un ou plusieurs nœuds, c'est-à-dire des endroits où la pression du fluide est nulle, et un ou plusieurs ventres ou anti-nœuds, c'est-à-dire des endroits où cette pression est maximale.
Les premiers objets présentant un contraste acoustique, c'est-à-dire un facteur de densité-compressibilité, positif par rapport au fluide, ceux-ci vont être transportés par la force de radiation acoustique vers un nœud de pression. Les deuxièmes objets présentant quant à eux un contraste acoustique, ou facteur de densité-compressibilité, négatif, ceux- ci vont être transportés par la force de radiation acoustique vers un ventre de pression.
L'invention permet ainsi de former dans la cavité un ou plusieurs agrégats de premiers objets et un ou plusieurs agrégats de deuxièmes objets sous forme de couches, ou feuillets, qui se succèdent le long de la direction de propagation, cela de manière extrêmement rapide - typiquement en quelques secondes - et à l'aide d'un matériel particulièrement simple à mettre en œuvre et peu coûteux.
Une telle structure en couches s'apparente à la structure de tissus d'organes humains qui comprennent typiquement des couches de cellules séparées par des couches d'une matrice extracellulaire. Par exemple, les épithéliums, notamment cardiaques ou pulmonaires ou endothéliaux, peuvent comprendre des couches différenciées ou non qui reposent dans un certain nombre de cas sur des lames basales de nature protéique, par exemple des cellules épithéliales ou musculaires. Pour autre exemple, la barrière hématoencéphalique ou le parenchyme cérébral comprennent typiquement des couches de neurones interconnectés entre elles.
De surcroît, l'invention permet de maintenir en lévitation acoustique l'ensemble des objets ainsi structuré, sous l'action de l'onde acoustique stationnaire dont la génération peut être maintenue pendant la durée requise, par exemple plusieurs heures ou jours, afin de favoriser les interactions entre objets lorsque ceux-ci sont vivants, en particulier lorsqu'ils sont formés par des cellules biologiques.
L'invention permet ainsi de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique, en contrôlant la perméabilité et par suite le développement des connexions et interactions entre couches de cellules formant les premiers objets, par un choix de deuxièmes objets formant une ou plusieurs couches de porosité choisie.
Cette approche innovante permet aussi de limiter le contact des objets avec des parois ou surfaces, en préservant ainsi leur intégrité mécanique et fonctionnelle.
Dans la présente description, un « objet » désigne un élément vivant ou inerte ayant de préférence une taille petite par rapport à la longueur de l'onde acoustique générée dans la cavité.
A titre d'exemple non limitatif, les objets peuvent typiquement avoir une taille micrométrique, par exemple comprise entre 1 pm et 100 ou plusieurs centaines de pm.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré mais nullement limitatif, lesdits premiers objets sont des éléments vivants tels que des cellules biologiques, par exemple du type eucaryotes ou prokaryotes.
Lesdits deuxièmes objets peuvent quant à eux être des éléments inertes tels que des particules comprenant un hydrogel, par exemple à base de collagène, de gélatine, ou encore de fibrine et de protéine de matrice extracellulaire. En variante non limitative, les deuxièmes objets peuvent comprendre un élastomère compressible, par exemple du polydiméthylsiloxane.
L'invention peut toutefois être mise en œuvre avec des objets de taille différente, c'est-à-dire située en-dehors de la plage précitée.
Ainsi, les objets ou certaines d'entre eux peuvent avoir une taille inférieure à 1 pm, en étant par exemple formés par des bactéries ou des virus, et/ou avoir une taille de plusieurs centaines de pm.
Les objets, notamment les premiers objets, ou certains d'entre eux, peuvent être des éléments muli-cellulaires ou des objets formés artificiellement ou encore des objets prélevés sur un organe.
Le fluide dans lequel les objets sont en suspension est de préférence un liquide qui, selon l'application envisagée, peut comprendre de l'eau ou former un milieu de culture.
L'invention fournit ainsi une solution simple pour reconstituer des tissus artificiels à des fins de recherche ou encore dans le cadre de thérapies cellulaires.
L'invention fournit par ailleurs une solution particulièrement précise en termes de positionnement des objets dans l'espace et qui permet le cas échéant de contrôler le développement d'interactions intercellulaires.
La simplicité et la précision de cette technique tiennent notamment au nombre limité de paramètres de contrôle, à savoir la masse volumique et la vitesse de propagation d'onde sonore respectives du fluide et des objets, ainsi que la vitesse et la fréquence de l'onde acoustique.
Bien entendu, de nombreuses variantes peuvent être mises en œuvre sur la base du principe décrit ci-dessus.
Par exemple, d'autres objets peuvent être injectés dans le fluide après positionnement des premiers et deuxièmes objets, de manière à former par exemple des agrégats supplémentaires ou complémentaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'onde acoustique stationnaire générée dans la cavité a une longueur d'onde inférieure au double d'une dimension de la cavité selon une direction de propagation de l'onde acoustique stationnaire.
De préférence, cette longueur d'onde est inférieure ou égale à cette dimension.
Il est préféré que l'onde acoustique stationnaire présente au moins un ventre et au moins un ou deux nœuds.
Cela permet, dans le cadre d'une variante de réalisation privilégiée, de former deux couches de premiers objets séparés par une couche de deuxièmes objets.
Notamment dans le cadre d'une telle variante, l'utilisation d'hydrogel ou d'élastomère compressible pour former les deuxièmes objets permet de constituer une couche intermédiaire poreuse, autorisant le développement d'interactions entre les couches de premiers objets s'étendant de part et d'autre de cette couche intermédiaire, lorsque les premiers objets comprennent des cellules vivantes.
L'invention permet non seulement de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique mais aussi, de manière alternative ou complémentaire, d'initier ou de poursuivre un tel processus en maintenant les objets en position à l'aide d'une matrice.
Notamment, le procédé peut comprendre, après positionnement des objets sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape d'introduction dans la cavité d'une substance de manière à former une matrice apte à soutenir les premiers objets.
Cette substance est de préférence une substance active biocompatible favorisant le changement de phase du milieu constitué par le fluide.
Cette substance peut comprendre un prépolymère d'hydrogel ou un autre élément apte à former une matrice sous forme de gel.
Cette substance peut comprendre un catalyseur et/ou un photoinitiateur.
Une matrice sous forme de gel permet de maintenir adéquatement les objets en position dans l'espace tout en étant élastiquement déformable. Par ailleurs, il est préféré que la matrice soit poreuse, que celle-ci soit sous forme de gel ou sous une autre forme.
La porosité de la matrice rend celle-ci perméable et perfusable, de manière à autoriser le développement de connexions cellulaires.
Dans une variante de réalisation, ladite substance comprend un matériau photopolymérisable, le procédé comprenant, après introduction de la substance dans la cavité, une étape de stimulation lumineuse de la substance de manière à la polymériser.
L'invention permet ainsi de sculpter une matrice de soutien de l'ensemble structuré des objets, en particulier des premiers objets.
Dans le cadre des différentes variantes de réalisation qui viennent d'être décrites, le procédé peut comprendre, après positionnement des objets sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape d'incubation des objets.
Par exemple, la cavité et son contenu peuvent à cet effet être placés dans un incubateur.
L'incubation permet de favoriser la différenciation, l'auto-organisation et la maturation de couches cellulaires.
Dans un mode de réalisation, le procédé comprend, après positionnement des objets sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape de chauffage des deuxièmes objets de manière à les fusionner.
L'étape de chauffage peut être réalisée à l'aide d'une nappe laser.
Lorsqu'il est recouru à une matrice de soutien telle que décrite ci-dessus, une telle étape de chauffage est de préférence réalisée avant formation de cette matrice.
Dans un mode de réalisation, le procédé comprend, après positionnement des objets sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape d'encapsulation des premiers objets. De préférence, cette étape d'encapsulation comprend une introduction dans la cavité de troisièmes objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide.
Les troisièmes objets peuvent ainsi être transportés par la force de radiation acoustique vers un nœud de pression pour former autour des premiers objets qui s'y trouvent une coque de protection.
A titre d'exemple, les troisièmes objets peuvent comprendre des billes d'hydrogel ou un autre matériau permettant de former une coque de protection poreuse.
L'étape d'encapsulation est de préférence mise en œuvre, mais non obligatoirement, lorsqu'il n'est pas recouru à l'utilisation d'une matrice de soutien.
L'invention peut aussi être mise en œuvre à des fins de thérapie cellulaire, par exemple par injection in vivo d'une culture ou proto-culture réalisée à l'aide des principes décrits dans ce document.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée, non limitative, qui suit.
Brève description des dessins
La description détaillée qui suit fait référence aux dessins annexés sur lesquels :
Fig. 1 est une vue schématique d'un dispositif comprenant une cavité et un transducteur apte à générer une onde acoustique stationnaire dans la cavité, la cavité contenant un fluide avec des objets en suspension qui sont distribués de manière relativement homogène dans la cavité avant de subir les effets de l'onde acoustique ;
Fig. 2 est une vue schématique du dispositif de la figure 1, dans laquelle les objets ont été déplacés par une force de radiation acoustique produite par l'onde acoustique de sorte à être respectivement alignés sur un nœud ou un ventre de cette onde ;
Fig. 3 est une vue schématique illustrant un phénomène de diffusion entre couches de cellules ; Fig. 4 est une vue schématique illustrant un phénomène de développement d'extensions cellulaires ;
Fig. 5 est une vue schématique illustrant un phénomène de migration de cellules ;
Fig. 6 est une vue schématique du dispositif de la figure 2, les objets étant maintenus dans la configuration de la figure 2 à l'aide d'une matrice de gel.
Description détaillée de modes de réalisation
Il est représenté sur les figures 1 et 2 un dispositif permettant de mettre l'invention en œuvre.
Ce dispositif comprend d'une part un récipient qui forme une cavité 1 apte à contenir un fluide et/ou différentes substances sous forme par exemple de liquide ou encore de gel.
De manière générale, la cavité 1 s'étend le long d'une direction Al, qui correspond dans cet exemple à une direction verticale. La cavité 1 présente le long de la direction Al une dimension B1 qui correspond dans cet exemple à une hauteur de la cavité 1.
La cavité 1 a ici une forme globalement cylindrique. Bien entendu, la cavité 1 peut avoir une autre géométrie, par exemple une section rectangulaire.
D'autre part, le dispositif des figures 1 et 2 comprend un système de génération d'ondes acoustiques.
Dans cet exemple, ce système comprend un transducteur piézoélectrique 2 disposé au niveau d'une première extrémité de la cavité 1 selon la direction Al, en l'occurrence verticalement en-dessous de la cavité 1, ainsi qu'un réflecteur acoustique 3 qui délimite une deuxième extrémité de la cavité 1 selon la direction Al, en étant en l'occurrence disposé verticalement au-dessus de la cavité 1.
Ce système est configuré pour pouvoir générer dans la cavité 1 et propager dans le fluide qu'elle contient une onde acoustique stationnaire 4, selon une direction de propagation qui correspond à la direction Al. L'onde stationnaire 4 ainsi générée peut avoir une fréquence identique à la fréquence de résonance de la cavité 1, laquelle forme par conséquent un résonateur.
Alternativement, cette onde stationnaire 4 peut avoir une fréquence différente de la fréquence de résonance de la cavité 1.
Dans tous les cas, le système est configuré pour pouvoir générer, notamment, une onde 4 ayant une longueur d'onde A inférieure ou égale au double de la hauteur B1 de la cavité 1, afin de former le long de la direction Al au moins un nœud de pression et au moins un ventre de pression.
Dans cet exemple, le transducteur 2 est un transducteur à large bande équipé d'une source ultrasonore.
Un tel transducteur 2 permet de modifier la position du ou des nœuds de l'onde 4 le long de la direction Al et/ou la distance entre différents nœuds de l'onde 4, en jouant sur la fréquence de cette onde 4.
Dans le cadre de l'invention, le dispositif qui vient d'être décrit, ou tout dispositif analogue, est mis en œuvre afin de positionner des objets de petites tailles, typiquement de taille micrométrique, au sein de la cavité 1 selon une organisation spatiale déterminée par un ou plusieurs paramètres de l'onde 4, notamment sa fréquence.
A cet effet, la cavité 1 est remplie d'un fluide 5 et d'objets 6 et 7 en suspension dans ce fluide 5.
Dans cet exemple non limitatif, les objets 6 sont des cellules biologiques, le fluide 5 forme un milieu de culture pour ces cellules 6 et les objets 7 sont des billes de polydiméthylsiloxane.
A titre indicatif, chacun des objets 6 et 7 a une taille comprise entre 1 pm et 100 pm et la hauteur B1 de la cavité 1 est de plusieurs centimètres.
Dans cet exemple, chacun des objets 6 présente une masse volumique p01 supérieure à la masse volumique p du fluide 5. A contrario, chacun des objets 7 présente une masse volumique p01 inférieure à la masse volumique p du fluide 5. Les objets 6 sont en outre choisis de sorte que la vitesse c01 de propagation d'une onde acoustique dans ces objets 6 soit supérieure à la vitesse c de propagation de cette onde acoustique dans le fluide 5. A contrario, les objets 7 sont choisis de sorte que la vitesse co2 de propagation de l'onde acoustique dans ces objets 7 soit inférieure à la vitesse c de propagation de cette onde acoustique dans le fluide 5.
Après disposition du fluide 5 dans la cavité 1 et des objets 6 et 7 en suspension dans le fluide 5 de la manière illustrée à la figure 1, le transducteur 2 est actionné de manière à générer une onde acoustique stationnaire 4 dans la cavité 1.
La génération de cette onde 4 permet de produire une force de radiation acoustique qui s'exerce sur les objets 6 et 7.
Cette force de radiation acoustique FRA peut notamment être décrite selon le modèle suivant, connu en soi, de K. Yosioka et Y. Kawasima :
TT
FRA = — Of VQ k d3 F, sin(fc z)
8 1 y où v0 est la vitesse de l'onde 4, k le nombre d'onde, Fy un facteur de densité- compressibilité et z la position de l'objet 6 ou 7 considéré le long de la direction Al, c'est- à-dire le long de la direction de propagation de l'onde 4.
Le facteur de densité-compressibilité Fy peut être défini de la manière suivante : où pox est la masse volumique p01 ou po2 de l'objet 6, ou respectivement 7, considéré, et cox est la vitesse de propagation c01 ou co2 de l'onde 4 au sein de l'objet 6, ou respectivement 7, considéré.
Compte tenu de la masse volumique respective et de la vitesse respective de propagation de l'onde acoustique des objets 6 et 7 par rapport au fluide 5, les objets 6 présentent un facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique, positif, tandis que les objets 7 présentent un facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique, négatif.
Dans l'exemple des figures 1 et 2, l'onde 4 a une longueur d'onde A égale à la hauteur B1 de la cavité 1, formant respectivement le long de la direction Al un premier nœud à une coordonnée Cl, un ventre à une coordonnée C2 et un deuxième nœud à une coordonnée C3.
Compte tenu des propriétés respectives précitées du fluide 5 et des objets 6 et 7, à partir de la configuration de la figure 1 dans laquelle les objets 6 et 7 sont distribués de manière relativement homogène dans l'ensemble de la cavité 1, la force de radiation acoustique produite par l'onde 4 entraîne ainsi un déplacement des objets 6 vers les nœuds de l'onde 4 et un déplacement des objets 7 vers le ventre de l'onde 4, de manière à atteindre une configuration telle que celle illustrée à la figure 2.
L'invention permet ainsi d'organiser spatialement les objets 6 et 7 sous forme de couches espacées le long de la direction Al et de les maintenir ainsi positionnés en lévitation acoustique, sous l'action de l'onde 4.
Dans cet exemple, les objets 7 forment une couche intermédiaire, située à mi- hauteur de la cavité 1, tandis que les objets 6 forment deux couches s'étendant de part et d'autre de la couche intermédiaire.
Les objets 7 étant des billes de polydiméthylsiloxane, leur agrégation ou regroupement sous forme de couche permet de constituer une barrière poreuse qui autorise le développement d'interactions entre les couches de cellules 6, cela sans contact avec les parois de la cavité 1.
L'invention permet ainsi de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique.
L'invention permet aussi de contrôler les interactions entre couches de cellules 6 puisqu'il est notamment possible de choisir différents matériaux, géométries et tailles pour les objets 7, ces paramètres ayant une incidence directe sur la porosité de la barrière qu'ils constituent sous l'action de la force de radiation acoustique. A titre d'exemple, il est ainsi possible de déclencher ou autoriser la diffusion de solutés ou secrétât 10 de cellules (figure 3), le développement d'extensions cellulaires 11 du type axones neuronaux (figure 4), ou encore la migration de cellules 6 (figure 5).
Dans une variante de réalisation, les objets 7 comprennent des particules d'hydrogel qui, après positionnement sous l'action de la force de radiation acoustique tel que décrit ci-dessous, sous fusionnées par chauffage local, par exemple à l'aide d'une nappe laser.
Il est ainsi possible de constituer une couche continue d'hydrogel interposée entre deux couches de cellules 6.
L'invention permet aussi de poursuivre la culture cellulaire, ou de l'initier après positionnement des objets 6 et 7 de la manière décrite ci-dessus, en produisant dans la cavité 1 une matrice de soutien.
Pour ce faire, une fois les objets 6 et 7 positionnés selon la configuration de la figure 2 ou selon une configuration analogue, une substance à base de prépolymère d'hydrogel peut être introduite dans la cavité 1.
Une telle substance permet de constituer une matrice 20 poreuse sous forme de gel, permettant de soutenir les couches d'objets 6 et 7 (figure 6).
Dans un mode de réalisation, cette substance comprend aussi un matériau photopolymérisable qui est soumis, après introduction dans la cavité 1, à une stimulation lumineuse entraînant la polymérisation de la matrice.
L'onde acoustique 4 peut ensuite être interrompue de sorte que la culture cellulaire se produise au sein d'une telle matrice, en disposant par exemple le récipient dans un incubateur.
Dans une variante de réalisation, à partir de la configuration de la figure 2, il est introduit dans la cavité 1 d'autres objets (non représentés) tels que des billes d'hydrogel à contraste acoustique positif. Sous l'action de la force de radiation acoustique résultant de l'onde 4, ces billes ou tous autres objets à contraste acoustique positif vont se déplacer vers les nœuds de pression de manière à envelopper les couches formées par les objets 6.
Il est ainsi possible d'encapsuler les couches d'objets 6 à l'aide d'une coque de porosité contrôlée par les propriétés des objets qui la forment, par exemple pour des applications de thérapie cellulaire in vivo.
Il découle de la description non limitative qui précède que l'invention permet de reconstruire et de stimuler des architectures complexes comportant différentes couches de cellules séparées par une variété d'objets permettant de contrôler les interactions entre les couches cellulaires, à l'aide d'un procédé et d'un dispositif particulièrement simples à mettre en œuvre.

Claims

Revendications
1. Procédé de structuration d'un ensemble d'objets (6,7), comprenant :
- une étape de disposition dans une cavité (1) d'un fluide (5) et desdits objets (6, 7) en suspension dans le fluide (5), et
- une étape de génération d'une onde acoustique stationnaire (4) dans la cavité (1) de manière à produire une force de radiation acoustique entraînant un déplacement des objets (6, 7) dans la cavité (1), caractérisé en ce que lesdits objets (6, 7) comprennent :
- des premiers objets (6) qui présentent un contraste acoustique positif par rapport au fluide (5), et
- des deuxièmes objets (7) qui présentent un contraste acoustique négatif par rapport au fluide (5), et en ce que l'onde acoustique stationnaire (4) est maintenue de manière à maintenir les objets (6, 7) ainsi déplacés en lévitation acoustique.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'onde acoustique stationnaire (4) générée dans la cavité (1) a une longueurd'onde inférieure au double d'une dimension (Bl) de la cavité (1) selon une direction de propagation (Al) de l'onde acoustique stationnaire (4), de préférence inférieure ou égale à cette dimension (Bl).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape d'introduction dans la cavité (1) d'une substance de manière à former une matrice (20) apte à soutenir les premiers objets (6).
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ladite substance comprend un prépolymère d'hydrogel.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la matrice (20) est poreuse.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel ladite substance comprend un matériau photopolymérisable, le procédé comprenant, après introduction de la substance dans la cavité (1), une étape de stimulation lumineuse de la substance de manière à la polymériser.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape d'incubation des objets (6, 7).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape de chauffage des deuxièmes objets (7) de manière à les fusionner.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l'action de la force de radiation acoustique, une étape d'encapsulation des premiers objets (6), cette étape comprenant une introduction dans la cavité (1) de troisièmes objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide (5).
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